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課題

組合抗体ライブラリー及びその使用の提供。

解決手段

ヒト生殖細胞系セグメントから組合せ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する。また、VL鎖をコードする生殖細胞系セグメントから集められた核酸分子ライブラリー及びVH鎖をコードする核酸分子ライブラリー及び得られた抗体ライブラリーも提供する。前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供される。標的タンパク質抗原に対する抗体ライブラリーをスクリーニングする方法及び同定又は選択される抗体を提供する。

概要

背景

多くの治療用及び診断用モノクローナル抗体(MAbs)が、癌及び自己免疫疾患などのヒト疾患治療及び診断するため臨床現場で使用される。例えば、例示的な診断用抗体は、リツキサンリツキシマブ)、ハーセプチントラスツズマブ)、アバスチンベバシズマブ)及びレミケードインフリキシマブ)を含む。抗体治療薬の設計において、例えば、目標物機能的活性を調節する抗体、並びに/又はより高い特異性及び/又は親和性を伴う抗体といった改良された抗体、並びに/又は特に細胞又は組織環境において、更に生物学的に利用可能で、安定性があり又は可溶性である抗体を生成するのが望ましい。

抗体治療薬を生成するため利用可能な方法は限られている。現行の方法は、in vitroで望ましい性質を伴う変異体タンパク質を選択するため抗体ライブラリーを使用することを含む。ライブラリーは、標的法及び非標的法(例えば、Marks et al.、 J. Mol. Biol. (1991) 222、581−597、Winters et al. (1994) Annu Rev. Immunol. 12:433−55、Rosok et al. (1996) J. Biol. Chem.、271:22611−22618、Kim et al. (2005) Mol. Cells 20:17−29、Mondon et al. (2008) Frontiers in Bioscience、 13:1117−1129、Benhar et al. (2007) Expert Opin. Biol. Ther.、 7:763−779及び Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol.、296:57−86)によって変異的多様性を含むよう生成される。これらの各抗体ライブラリーには、その限界がある。従って、本明細書の対照物においては、抗体ライブラリーを作製する方法及び前記方法によって産生される抗体を提供する。

概要

組合せ抗体ライブラリー及びその使用の提供。ヒト生殖細胞系セグメントから組合せ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する。また、VL鎖をコードする生殖細胞系セグメントから集められた核酸分子のライブラリー及びVH鎖をコードする核酸分子ライブラリー及び得られた抗体ライブラリーも提供する。前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供される。標的タンパク質抗原に対する抗体ライブラリーをスクリーニングする方法及び同定又は選択される抗体を提供する。なし

目的

ヒト生殖細胞系セグメントから組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

i) 各VL鎖が、VK及びJKヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントインフレームで連結されて、ii) 各VH鎖が、ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント並びにVH及びJH生殖細胞系セグメントの間のあらゆるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結され、a)抗原結合部位を形成するため、各メンバー抗体が可変軽(VL)鎖及び可変重(VH)鎖又はその十分な部分を含み、並びにb) ヒト組み合わせ抗体ライブラリーは、少なくとも凡その或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む、複数の抗体を含有する前記ライブラリー

請求項2

VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びVH鎖をコードする核酸分子のJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結され、並びにVL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl 生殖細胞系セグメントは、Vkセグメントが、Jkセグメントへ5’であり、又はVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項1に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー

請求項3

VH及びJH生殖細胞系セグメントの間のヌクレオチド配列が、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のヌクレオチド長において、又は凡そ5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のヌクレオチド長である、請求項1に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項4

VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列がペプチド模倣物をコードする、請求項1−3のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項5

i) 各VL鎖が、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結されて、ii) 各VH鎖は、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又ははその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される、a)抗原結合部位を形成するため、各メンバー抗体が、修飾可変軽(VL)鎖及び/又は修飾可変重(VH)鎖或いはその十分な部分を含み、並びにb)VL鎖及び/又はVH鎖が、アミノ酸CDR置換又は挿入することにより修飾される、複数の抗体を含有するヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項6

CDRが、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3から選択される、請求項5に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項7

CDRがCDRH3である、請求項6に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項8

挿入又は置換されるアミノ酸がペプチド模倣物に対応する、請求項5−7のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項9

ペプチド模倣物が、TPO、EPO、G-CSFIL-5、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド(hBNP-32)、エキセンディン4、GLP-1、GLP-2、グルカゴン、PACAP-38、CD209L、TNF、VEGF、MMP阻害剤又はCTLA-4ペプチド模倣物から選択される、請求項4又は請求項8に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項10

ペプチド模倣物が、更に、カルボキシ及び/又はN-末端においてフランキング配列を含む、請求項4又は請求項5に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項11

フランキング配列がグリシン又はプロリンである、請求項6に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項12

ペプチド模倣部物が、配列識別番号:891、987−1014から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項4‐7のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項13

VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列が、ヒトDHセグメント又はその縮重コドンをである、請求項1に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項14

i)各VL鎖が、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結されて、ii)各VH鎖が、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される、a)抗原結合部位を形成するため、各メンバー抗体が、可変軽(VL)鎖及び可変重(VH)鎖或いはその十分な部分を含み、並びにb)ヒト組合せ抗体ライブラリーが、少なくとも大体の或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む、複数の抗体を含有する前記ライブラリー。

請求項15

アドレス可能なライブラリーである、請求項1−14に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項16

各アドレス内の抗体が同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なる、請求項15に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項17

VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJHセグメントは、VHセグメントがDHセグメントへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結され、並びにVL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、或いはVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項13−16に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項18

複数の核酸分子がVH鎖をコードし、複数の核酸分子がVL鎖をコードして、並びにVH鎖及びVL鎖をコードする複数の核酸分子は、少なくとも大体或いは50又は100の異なる抗体を生成するのに十分である、請求項1−17のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項19

全て又は一部の生殖細胞系VHセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系JHセグメントと連結される全て又は一部のDHセグメントと連結され、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成し、及び全て又は一部の生殖系Vkセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Jkセグメントと連結され、若しくは全て又は一部の生殖細胞系Vlセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Jlセグメントに連結され、VL鎖をコードする複数の核酸分子を生成する、請求項18に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項20

VH生殖細胞系列セグメントが、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−19のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項21

VHが配列識別番号10−238のいずれかから選択される、請求項20に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項22

DHセグメントが、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項9−21に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項23

DHが配列識別番号:239−272のいずれかから選択される、請求項22に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項24

JHが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−23のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項25

JHが配列識別番号:273−285のいずれかから選択される、請求項24に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項26

VHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するためV−D結合部で追加又は除去される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−25のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項27

VHヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項26に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項28

ヌクレオチドが、VHとDHの間でヌクレオチドを追加するVHヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項27に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項29

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項28に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項30

DH配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D結合部及び/又はD−J結合部で挿入及び欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−29のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項31

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、DHの親水性最大化するため選択される、請求項30に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項32

DHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項30又は請求項31に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項33

DHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項30−32のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項34

ヌクレオチドが、DH及びJHであるヌクレオチドを追加するため、DH配列の3’末端で挿入される、請求項30−32のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項35

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項34に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項36

JHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、D−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−35のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項37

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、JHのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項31に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項38

JHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項31又は請求項32に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項39

JHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項20−33のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項40

Vk が、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−39のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項41

Vk が、配列識別番号:286−355及び868のいずれかから選択される、請求項40に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項42

Jkが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−41のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項43

Jkが、配列識別番号:356−364のいずれかから選択される、請求項42に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項44

Vkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−43のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項45

Vkヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項44に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項46

ヌクレオチドが、VkとJkの間でヌクレオチドを追加するため、Vkヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項44に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項47

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項46に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項48

Jkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入または欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−47のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項49

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jkのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項48に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項50

Jkの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項48又は請求項49に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項51

Vlが、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−39のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項52

Vlが、配列識別番号:365−441のいずれかから選択される、請求項51に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項53

Jlが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びに遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項1−39、51及び52のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項54

Jlが、配列識別番号:442−451のいずれかから選択される、請求項53に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項55

Vlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−34及び51−54のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項56

Vlヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項55のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項57

ヌクレオチドが、VlとJlの間でヌクレオチドを追加するため、Vlヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項55に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項58

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項57に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項59

Jlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項1−39及び51−58のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項60

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jlのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項59に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項61

Jlの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項54又は請求項55に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項62

VH鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項1−61のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項63

VH鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項62に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項64

VH鎖をコードする複数の核酸分子が、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各VH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーからの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のVH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項62に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項65

VH遺伝子ファミリーが、IGHV1-18、 IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及び IGHV7-81から選択され、DH遺伝子ファミリーが、IGHD1-1、IGHD1-14、IGHD1-20、IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及び IGHD7-27から選択され、並びにJH遺伝子ファミリーが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択される、請求項64に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項66

VL鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項1−65のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項67

VL鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項66に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項68

VH鎖でコードする複数の核酸分子が、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のVk及び/又はJk若しくはVl及び/又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び/又はJk若しくはVl及び/或いはJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項66に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項69

Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、 IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 iGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41、及びIGKV1-3から選択され、Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、 IGLV1-40、 IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びにJl 遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、請求項68に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項70

VH鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項1−69のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項71

VL鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項1−69のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項72

VH鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号:1059−1410のいずれか、若しくはその一部、及びVL鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号:1411−1422、1424−1439及び1441−1471のいずれか、若しくはその一部から選択される、請求項1−71のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項73

VH鎖が、配列番号:1475−1826のいずれか、又はその一部から選択されるアミノ酸配列を有し、及びVL鎖が、配列番号:1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項1−72のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項74

ライブラリーの各メンバー抗体が、重鎖及び軽鎖会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を更に含む、請求項1−73のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項75

ライブラリーの各メンバー抗体が、完全長抗体から、或いは抗原結合部位を形成するのに十分なそのフラグメント又は部分から選択される、請求項1−74のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項76

フラグメント又はその部分が、Fab、Fab'、F(ab’)2、単一鎖Fvs(scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、Fd及びFd’フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、scFvフラグメント及びscFabフラグメントから選択される、請求項75に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項77

ライブラリーの各メンバー抗体がFabである、請求項1−76のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項78

大体或いは50、102、103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104、105、106、107、108、109又はそれ以上の異なるメンバーを含む、請求項1−77のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項79

103、2 x 103、3 x 103、4 x 103、5 x 103、6 x 103、7 x 103、8 x 103、9 x 103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104又はそれ以上の異なるメンバーを含む、請求項1−78のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項80

アドレス可能な抗体が、空間アレイで配列される、請求項1−79のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項81

空間アレイがマルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が様々な抗体メンバーに対応する、請求項80に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項82

様々な抗体メンバーが、プレートのウェルの表面に固定化される、請求項81に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項83

様々な抗体メンバーが溶液中に存在する、請求項76に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項84

アドレス可能な抗体が、固体支持体に付着される、請求項1−79のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項85

固体支持体が、フィルターチップスライドビード又はセルロースで、及び様々な抗体メンバーが、その表面に固定化される、請求項84に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項86

固体支持体がBiacoreチップである、請求項85に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項87

抗体が同定可能に標識化される、請求項80−86のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項88

標識が、有色、発色性発光性化学的蛍光性又は電子的である、請求項87に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項89

各VL鎖が、インフレームで連結されるVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によってコードされ、並びに各アドレス内の核酸分子が同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる、可変の軽(VL)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む核酸分子のライブラリー。

請求項90

VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、VlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項89に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項91

全て又は一部の生殖細胞系Vkセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系Jkセグメントと連結され、或いは全て又は一部の生殖細胞系Vlセグメントが全て又は一部の生殖細胞系Jlセグメントに連結され、VL鎖をコードする複数の核酸分子を生成する、請求項90に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項92

Vkが、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項89−91のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項93

Vkが、配列識別番号:286−355及び868のいずれかから選択される、請求項92に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項94

Vkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−93のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項95

Vkヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項94に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項96

ヌクレオチドが、VkとJkの間でヌクレオチドを追加するため、Vkヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項94に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項97

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項96に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項98

Jkが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項89−97のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項99

Jk が、配列識別番号:356−364のいずれかから選択される、請求項98に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項100

Jkの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−99のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項101

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jkのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項100に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項102

Jkの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項100又は請求項101に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項103

Vlが、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子の中から選択される、請求項89−91のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項104

Vlが、配列識別番号:365−441のいずれかから選択される、請求項98に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項105

Vlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−91及び103−104のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項106

Vlのヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項105に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項107

ヌクレオチドが、VlとJlの間でヌクレオチドを追加するため、Vlヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項105に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項108

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項107に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項109

Jlが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項89−91及び105−108のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項110

Jlが、配列識別番号:442−451のいずれかから選択される、請求項109に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項111

Jlの配列が、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項89−91及び105−110のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項112

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、Jlのリーディングフレームを維持するため選択される、請求項111に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項113

Jlの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項111又は請求項107に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項114

VL鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群、亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項89−113のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項115

VL 鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項114に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項116

VL鎖をコードする複数の核酸分子が、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のVk及び/又はJk若しくはVl及び/又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び/又はJk若しくはVl及び/又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項66に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項117

Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 iGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41、及びIGKV1-39から選択され、Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、IGLV1-40、IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びにJl 遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、請求項116に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項118

VL鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項89−117のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項119

VH鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号:1411−1422、1424−1439及び1411−1471のいずれか、若しくはその一部から選択される、請求項89−118のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項120

ライブラリーの各ベクターが様々な核酸分子を含む、請求項89−119にのいずれかに記載の核酸分子を含有するアドレス可能なベクターのライブラリー。

請求項121

ライブラリーの各細胞が様々なベクターを含む、請求項120のベクターを含有するアドレス可能な細胞のライブラリー。

請求項122

各VH鎖が、インフレームで連結されるVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によりコードされ、及び各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる、可変の重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む核酸分子のライブラリー。

請求項123

VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、DHセグメントへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結される、請求項122に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項124

全て又は一部の生殖細胞系VHセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系JHセグメントと連結される全て又は一部の生殖細胞系DHセグメントと連結され、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成する、請求項123に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項125

VHが、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項122−124のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項126

VHが、配列識別番号:10−238のいずれかから選択される、請求項125に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項127

VHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D結合部で追加又は除去される1つのヌクレオチドを有する、請求項122−126のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項128

VHヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項127に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項129

ヌクレオチドが、VH及びDHの間でヌクレオチドを追加するため、VHヌクレオチド配列の3’末端で挿入される、請求項127に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項130

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項129に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項131

DHが、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項122−130のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項132

DHが、配列識別番号:239−272のいずれかから選択される、請求項131に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項133

DHの配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D結合部及び/又はD−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項122−132のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項134

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、DHの親水性を最大化するため選択される、請求項133に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項135

DHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項133又は請求項134に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項136

DHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項133−135のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項137

ヌクレオチドが、DH配列の3’末端で挿入され、DH及びJHであるヌクレオチドを追加する、請求項133−136のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項138

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項137に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項139

JHが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項122−139のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項140

JHが、配列認識番号:273−285のいずれかから選択される、請求項139に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項141

JH配列が、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、D−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する、請求項122−140のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項142

ヌクレオチドの挿入又は欠失が、JHのリーディングフレームを維持するために選択される、請求項141に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項143

JHの5’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項141又は請求項142に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項144

JHの3’末端からヌクレオチドが欠失される、請求項141−143のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項145

VH鎖をコードする複数の核酸分子が、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される、請求項122−145のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項146

VH鎖をコードする複数の核酸分子が、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である、請求項145に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項147

遺伝子ファミリーに基づいて選択されるVH鎖をコードする複数の核酸分子が選択され、それによってVH、DH及び/又はJHの各遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVH、DH及び/又はJHの遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項145に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項148

VH遺伝子ファミリーは、IGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81から選択され、DH遺伝子ファミリーは、IGHD1-1、IGHD1-14、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6 及びIGHD7-27から選択され、並びにJH遺伝子ファミリーは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択される、請求項147に記載の核酸分子のライブラリー。

請求項149

VH鎖をコードする核酸分子が、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾される、請求項122−149のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項150

VH鎖をコードする複数の核酸分子が、配列番号:1059−1410又はその一部のいずれかから選択される、請求項122−149のいずれかに記載の核酸分子のライブラリー。

請求項151

ライブラリーの各ベクターが様々な核酸分子を含む、請求項122−150のいずれかに記載の核酸分子を含有するアドレス可能なベクターのライブラリー。

請求項152

ライブラリーの各細胞が様々なベクターを含有する、請求項151に記載のベクターを含むアドレス可能な細胞のライブラリー。

請求項153

各VL鎖が、インフレームで連結されるVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はVl及びJl生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によってコードされ、各VH鎖が、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によってコードされ、各位置が、VH鎖をコードする核酸分子及びVL鎖をコードする核酸分子を含み、並びに各アドレス内のVH核酸分子及びVL核酸分子の組合せが、他の全てのアドレスの核酸分子の組み合せとは異なる、可変軽(VL)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子及び可変重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む核酸分子のライブラリー。

請求項154

a)VH鎖又をコードする核酸分子の配列又はその部分を生成するVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組み合わせることと、b)VH鎖をコードする核酸分子の配列又はその部分を生成するVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はそぼ部分、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組み合わせることと、段階a)及びb)において、VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJl の各部分が、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL又はその部分を含む抗体又はその部分を産生するのに十分であり、c)複数の異なる核酸分子の配列を生成するため、段階a)及びb)を数回繰り返すことと、d)第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、並びに第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む2つのライブラリーを作るため核酸分子を合成することと、e)各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からのVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子を細胞に導入し、これを数回繰り返して細胞のライブラリーを作ることと、並びにf)ライブラリーの各抗体又はその部分が、様々な組合せのVH及びVL鎖又はその十分な部分を含み、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成し、複数の抗体又はその部分を産生して、各細胞の抗体又はその部分を発現する細胞を成長させることとを含む、ヒト組合せ抗体ライブラリーを産生する方法。

請求項155

段階d)において、第一のアドレス指定された核酸ライブラリー及び第二のアドレス指定されたライブラリーを生成する、合成された核酸配列が個々にアドレス指定され、段階e)において、細胞がアドレス指定され、各位置が、細胞のアドレス指定されたライブラリーにおける他の全部の細胞から、様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含有する細胞を含み、並びに段階f)において、複数の抗体又はその部分がアドレス指定され、ライブラリーのそれぞれの位置における抗体又はその部分が同じ抗体で、他のそれぞれの位置及び他の全ての位置でこれらは異なり、並びに抗体又はその部分の同定が、そのアドレスによって知られる、ライブラリーがアドレス可能なライブラリーである、請求項154に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項156

段階a)において、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分が、VHセグメントは、DHへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう組み合わされ、並びに段階b)において、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl 生殖細胞系セグメント又はその部分が、VkセグメントはJkセグメントに5’で、或いはVlセグメントはJlセグメントへ5’であるよう連結される、請求項154又は請求項155に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項157

段階a)−b)が、アルゴリズムを実行するようコンピュータプログラムされることによって行われる、請求項154−156のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項158

段階a)が、i) VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、ii) DH生殖細胞系セグメントの親水性を最大化するため、1つ又はそれ以上の核酸の挿入又は欠失でVH及び/又はDHの生殖細胞系配列を修飾することによるV−D結合部を生成することと、iii)JHのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上の核酸の挿入又は欠失でDH及び/又はJHの生殖細胞系配列を修飾することによるD−J結合部を生成することと、iv)VH鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVH、DH及びJHを組み合わせることとを含む、請求項154−157のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項159

V−D結合部が、DHの5’末端からヌクレオチドを欠失することによって生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項160

V−D結合部が、VHの3’末端からヌクレオチドを欠失することによって生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項161

V−D結合部が、DHの5’末端でヌクレオチドを挿入することによって生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項162

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項161に記載の方法

請求項163

D−J結合部が、JHの5’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項164

D−J結合部が、DHの3’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項165

D−J結合部が、DHの5’末端でヌクレオチドを挿入することにより生成される、請求項158に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項166

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項165に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項167

段階b)が、i)Vk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、ii) Jkのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失でVk又はJkの生殖細胞系配列を修飾することにより、或いはJlのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失でVl又はJl の生殖細胞系配列を修飾することにより、V−J結合部を生成することと、並びにiii)VL鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVk及びJk又はVl及びJlを組み合わせることとを含む、請求項154−157のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項168

V−J結合部が、Jk又はJlの5’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項167に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項169

V−J結合部が、Vk又はVlの3’末端からヌクレオチドを欠失することにより生成される、請求項167に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項170

V−J結合部が、Jk又はJlの5’末端でヌクレオチドを挿入することにより生成される、請求項167に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項171

ヌクレオチドがグアニン(G)である、請求項170に記載の方法。

請求項172

段階a)を数回繰り返すことが、N1、N2及びN3は、全て又は一部のVH、DH又はJH生殖細胞系セグメントであり得る多数の生殖細胞系セグメントであり、並びにN1、N2及びN3が、同じ又は異なり得て、N1の異なるVH生殖細胞系セグメントを選択することと、N2の異なるDH生殖細胞系セグメントを選択することと、N3の異なるJH生殖細胞系セグメントを選択することとを含み、並びにVH鎖をコードするN1 x N2 x N3の異なる核酸配列を生成するため、全ての可能なVH、DH及びJHの組合せを組合せる、請求項154−171のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項173

VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−172のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項174

VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:10−238から選択される、請求項173に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項175

DH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びにその遺伝子又はその対立遺伝子から選択される、請求項157−172のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項176

DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:239−272のいずれかから選択される、請求項175に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項177

JH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−172のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項178

JH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:273−285のいずれかから選択される、請求項177に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項179

一部の生殖細胞系セグメントが、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される、請求項172−178のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項180

一部の生殖細胞系セグメントが遺伝子ファミリーに基づいて選択される、請求項179に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリー。

請求項181

VH遺伝子ファミリーが、IGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81から選択され、DH遺伝子ファミリーが、IGHD1-1、IGHD1-14、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及びIGHD7-27から選択され、並びにJH遺伝子ファミリーが、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択され、各々のVH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、一部のVH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメント或いは一部のVH、DH及び/又はJH遺伝子から1つの生殖細胞系セグメントが選択される、請求項180に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリー。

請求項182

段階b)を数回繰り返すことが、N1、N2、N3及びN4が、全て又は一部のVl、Jl、Vk、Jk生殖細胞系セグメントになり得る生殖細胞系セグメントの数であり、並びにN1、N2、N3及びN4が、同じ又は異なり得て、N1(数)の異なるVl生殖細胞系セグメントを選択すること及びN2の異なるJl 生殖細胞系セグメントを選択することと、又はN3の異なるVk生殖細胞系セグメントを選択すること及びN4の異なるJk生殖細胞系セグメントを選択することと、並びにVL鎖をコードするN1 x N2の異なる核酸分子を生成するため、全ての可能なVl又はJlの組み合わせを組み合わせ、或いはVL鎖をコードするN3 x N4の異なる核酸分子を生成するため、全ての可能なVk及びJkを組み合わせることとを含む、請求項154−171のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項183

Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項184

Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:365‐441から選択される、請求項183に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項185

Jl生殖細胞系セグメントが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び請求項182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項186

Jl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:442−451から選択される、請求項185に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項187

Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びにその遺伝子及び対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項188

Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:283−355及び868から選択される、請求項187に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項189

Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部のIGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びにその遺伝子又は対立遺伝子から選択される、請求項157−171及び182のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項190

Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:356−364から選択される、請求項189に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項191

一部の生殖細胞系セグメントが、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、組成、CDR長さ又は組成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される、請求項182−190のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項192

Vk遺伝子ファミリーが、IGKV1-12、IGKV1-12 、IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 IGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41及びIGKV1-39から選択され、Jk遺伝子ファミリーが、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5から選択され、Vl遺伝子ファミリーが、IGLV1-36、IGLV1-40 、IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49から選択され、並びにJl遺伝子ファミリーが、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される、各Vk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl 遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞セグメントが選択され、或いは一部のVk及び/又はJk若しくはVl及び/又はJl遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、生殖細胞系セグメントが、遺伝子ファミリーに基づいて選択される、請求項191に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項193

生殖細胞系セグメントが、ユーザ作成データベースで示される、請求項154−192のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項194

データベースのJH、Jk及びJl生殖細胞系セグメントの配列が、それらの正しいリーディングフレームで示される、請求項193に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項195

更に、段階a)及び/又は段階b)において、あらゆる停止コドンを除去することにより、VH鎖又はその部分及び/又はVL鎖又はその部分をコードする核酸分子を修飾することを含む、請求項154−194のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項196

停止コドンTAAが、TATに修飾され、停止コドンTAGがTATに修飾され、及び停止コドンTGAがTCAに修飾される、請求項195に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項197

段階a)及び/又は段階b)において、あらゆる制限酵素部位を除去することにより、VH鎖をコードする核酸分子又はその部分及び/若しくはVL鎖をコードする核酸分子又はその部分を修飾することを更に含む、請求項154−196のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項198

制限酵素部位が、大腸菌K12でコドン使用を最大にするため修飾される、請求項197に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項199

VH鎖をコードする複数の異なる核酸分子間及び核酸分子中における配列の類似性並びに/又はVL鎖をコードする複数の異なる核酸分子間又は核酸分子中における配列の類似性を決定することを更に含む、請求項154−198のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項200

配列の類似性に基づいて、最も類似する又は最も異なるVH鎖をコードする一部の核酸配列及び/又はVL鎖をコードする一部の核酸配列を選択する、請求項199に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項201

ライブラリーの合成された核酸配列がベクターで含まれる、請求項154−200のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項202

ベクターが、更に、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を含む、請求項201に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項203

細胞が原核細胞又は真核細胞である、請求項154−202のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項204

細胞が大腸菌細胞である、請求項154−203のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項205

アドレス指定された細胞が、空間アレイで配列される、請求項155−204のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項206

空間アレイが、マルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が、細胞のアドレス指定されたライブラリーで、他の全ての細胞から様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含む細胞に対応する、請求項205に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項207

発現される抗体が、完全長の抗体、又は抗原結合部位を形成するのに十分なフラグメントまたはその部分である、請求項154−206のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項208

発現される抗体がFabである、請求項154−206のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項209

抗体又はその部分を更に精製する、請求項154−208のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項210

ライブラリーの精製された抗体又はその部分が、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度である、請求項209に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項211

精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、並びに各アドレス内の抗体が同じ抗体であり及び他の全てのアドレスの抗体とは異なる、請求項209又は請求項210に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項212

請求項154−211のいずれかに記載の方法によって生成される、ヒト組み合わせ抗体ライブラリー。

請求項213

VH鎖が、配列識別番号:1475−1826又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、並びにVL鎖が、配列識別番号:1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項212に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリー。

請求項214

a) 請求項1−88、212又は213のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを提供することと、b) 前記ライブラリーの抗体又はその一部を標的タンパク質と接触することと、c) 抗体又はその部分の標的タンパク質との結合及び/若しくは抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価することと、並びにd) 標的タンパク質に結合する及び/若しくは標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を同定し、同定された抗体又はその部分がHITであることとを含む、標的タンパク質に対する結合又は活性のヒト組み合わせ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法。

請求項215

ヒト組み合わせ抗体ライブラリーが、アドレス可能なライブラリーで、HITの同定がそのアドレスによって知られるよう、接触はアドレス可能なアレイで行われる、請求項214に記載の方法。

請求項216

標的タンパク質が、膜結合性タンパク質細胞表面受容体(CSR)又はCSRリガンドである、請求項214及び請求項215に記載の方法。

請求項217

膜結合性タンパク質又はCSRが、サイトカイン受容体受容体キナーゼ受容体ホスファターゼ細胞間相互作用関与する受容体、及び細胞接着分子から選択される、請求項216に記載の方法。

請求項218

標的タンパク質が、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、癌細胞表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEMLT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリンインテグリン、CD52及びCD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF及びEPOから選択される、請求項214−217のいずれかに記載の方法。

請求項219

抗体又はその部分の標的タンパク質への結合を評価することを含む、請求項213−218のいずれかに記載の方法。

請求項220

抗体又はその部分が、標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうか評価することを含む、請求項213−218に記載の方法。

請求項221

機能的活性が、細胞増殖リンパ種のアポトーシス走化性、癌細胞の浸潤マトリゲル内皮増殖、管形成及びシグナル伝達から選択される、請求項220に記載の方法。

請求項222

結合が細胞で評価され、及び/又は機能的活性が細胞ベースアッセイで評価され、及び細胞が標的タンパク質を発現する、請求項214−221のいずれかに記載の方法。

請求項223

細胞が、一時的又は安定的に標的タンパク質をコードする核酸分子で発現される、請求項222に記載の方法。

請求項224

第二のライブラリーが、a) 同定されるHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性によって関連付けられるVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを選択し、並びに様々なVH鎖又はその部分を各々コードする複数の核酸分子の配列を生成するため、全ての可能なVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合せることと、b) 同定されるHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性によって関連付けられるVk及びJk又はVl及びVlヒト生殖細胞系セグメントを選択し、並びに様々なVL鎖又はその部分を各々コードする複数の核酸分子の配列を生成するため、全ての可能なVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いは全ての可能なVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合せることと、段階a)及びb)において、VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJlの各部分が、抗原に結合するのに十分であるVH又はVL若しくはその部分を含む抗体を産生するのに十分であり、c) 第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、並びに第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む、二つのライブラリーを産生する核酸分子を合成することと、d) 各細胞が、細胞のライブラリーにおける他の全ての細胞とは異なるVH及びVLの組合せをコードする核酸分子を含む、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子を前記細胞に導入し、細胞のライブラリーを産生するためこれを数回繰り返すことと、並びにe) ライブラリー内の抗体又はその部分が、ライブラリー内の他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、VH及びVL鎖又はその十分な部分の異なる組合せを含む、複数の抗体又はその部分を産生して、各細胞で抗体を発現する細胞を成長させることと、f)第二のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成するため、抗体又はその部分を更に精製し、ライブラリー内の抗体又はその部分を標的タンパク質と接触して、抗体又はその部分と標的タンパク質との結合及び/又は抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価し、並びに標的タンパク質に結合する、及び/若しくは同定される抗体又はその部分が更にHITである標的タンパク質の活性を調節する、抗体又はその部分を同定することとを含む方法によって生成される、同定されたHITに基づいて第二の組合せ抗体ライブラリーを提供することを更に含む、請求項214−223のいずれかに記載の方法。

請求項225

配列類似性が、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上、或いは約60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上である、請求項224に記載の方法。

請求項226

第二のライブラリーが、a)同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVH、DH又はJHヒト生殖細胞系セグメントを含むVH鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、b) 同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVk及びJk又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含むVL鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、c)VHをコードする複数の核酸分子からの核酸分子及びVLをコードする複数の核酸分子からの核酸分子を細胞に導入し、各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、細胞ライブラリーを産生するため、これを数回繰り返すことと、並びにd) ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、ライブラリーの各抗体又はその部分が、VH及びVL鎖又はその十分な部分の様々な組合せを含む複数の抗体又はその部分を産生する、各細胞の抗体を発現するため細胞を成長させることと、並びにe)ライブラリーの抗体又はその部分を標的タンパク質と接触する抗体又はその部分を更に精製し、抗体又はその部分を標的タンパク質と結合して、及び/若しくは抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価し、並びに標的タンパク質に結合し、及び/若しくは同定された抗体又はその部分が更にHITである標的タンパク質の活性を調節する、抗体又はその部分を同定することとを含む方法により生成される、同定されたHITに基づいて第二の組合せ抗体ライブラリーを提供することを更に含む、請求項214−223のいずれかに記載の方法。

請求項227

第二のヒト組合せライブラリーが、アドレス可能なライブラリーで、それによって、精製された抗体又はその部分はアドレス指定され、各アドレス内の精製された抗体は同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なり、接触はアドレス可能なアレイで行われ、並びに更なるHITの同定がそのアドレスによって知られる、請求項224−226のいずれかに記載の方法。

請求項228

第二の組合せ抗体ライブラリーの各抗体メンバー又はその部分が、一次配列の1つ又はそれ以上のアミノ酸変異によって同定された「HIT」と異なり、第二のライブラリーが、複数の抗体又はその部分を産生するため、アミノ酸変異を「HIT」に導入することによって生成される同定されたHITに基づいて第二の組合せ抗体ライブラリーを提供することと、ライブラリーの抗体又はその部分の標的タンパク質と接触することと、抗体又はその部分の標的タンパク質との結合、及び/或いは抗体又はその部分が標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価することと、並びに標的タンパク質に結合し、及び/若しくは同定された抗体又はその部分が、更にHITである標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を同定することとを更に含む、請求項214-223のいずれかに記載の方法。

請求項229

アミノ酸変異が、同定されたHITの相補性決定領域(CDR)においてである、請求項228に記載の方法。

請求項230

「HIT」が、標的タンパク質に対し最適化される結合親和性を有すること及び/又はこの方法の以前の反復で、前回の「HIT」と比較して標的タンパク質に対し最適化される活性を有することが更に同定されるまで反復的に繰り返される、請求項224-229のいずれかに記載の方法。

請求項231

前記方法が、(a)利用可能な全ヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースを評価することと、(b)重鎖(5’-VH-DH-JH-3’)をコードする可能な組み換えされた完全長のあらゆる核酸配列の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、(c)カッパ軽鎖(5’-Vk-Jk-3’)をコードする可能な組み換えされた全長のあらゆる核酸配列及び/又はラムダ軽鎖(5’-Vl-Jl-3’)をコードする可能な組み換えされた完全長の全核酸配列の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、(d) 得られた核酸配列がインフレームであるよう、(b)の核酸配列のV-D及び/又はD-J結合部において並びに(c)の核酸配列のV−J結合部ににおいてヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、(e)不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、(f)各々の組み換えられた核酸配列をアドレス可能な構成の固有の位置に割り当てることと、並びに(g) 各々の組み換えられた核酸配列のアドレスを識別する出力ファイルを生成することとの段階を含む、ヒト生殖細胞系セグメントを組合せるの方法を実行するためのコンピュータデバイスによって実行できるコンピュータ読み取り可能な指示を含む、コンピュータシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体

請求項232

前記方法が、(h) 段階(e)の後、制限酵素によって認識される配列を含む組み換えられた核酸配列の5’及び3’末端においてヌクレオチドを追加することと、(i)制限酵素によって認識される内部ヌクレオチドを除去するため、ヌクレオチド置換によって組み換えされた核酸配列を修飾することとの段階を更に含む、請求項231に記載のコンピューターシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。

請求項233

前記方法が、細菌発現のコドン使用を最適化する組み換えの核酸配列を修飾することを更に含む、請求項231又は請求項232に記載のコンピューターシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。

請求項234

段階(f)の前に、前記方法が、配列の類似性又は相違性に基づいて、組み換えされた核酸配列のライブラリーからの組み換えの核酸配列を選択し、及び選択された配列が、段階(f)で割り当てられる、請求項231−233のいずれかに記載のコンピューターシステム又はコンピュータ読み取り可能な媒体。

請求項235

組合せヒト生殖細胞系セグメントの方法が、(a)利用可能な全てのヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、(b)重鎖(5’-VH-DH-JH-3’)をコードする可能なあらゆる組み換えの完全長核酸配列の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、(c)カッパ軽鎖(5’-Vk-Jk-3’)をコードする可能なあらゆる組み換えの完全長核酸配列及び/又はラムダ軽鎖(5’-Vl-Jl-3’)をコードする可能なあらゆる組み換えの完全長核酸配列の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、(d) 得られた核酸配列がインフレームであるよう、(b)の核酸配列のV-D及び/又はD−J結合部で、並びに(c)の核酸配列のV−J結合部でヌクレオチドを修飾するため、アルゴリズムを適用することと、(e)不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、(f)各々の組み換えされた核酸配列をアドレス可能な構成の固有の位置へ割り当てることと、(g) 各々の組み換えれた核酸配列のアドレスを識別する出力ファイルを生成することとの段階を含む、コンピュータデバイスによる組合せヒト生殖細胞系セグメントの方法を行うコンピュータ読み込み可能な指示の実行を含む方法。

請求項236

重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び/又はラムダ軽鎖をコードする組み換えの核酸配列、又は重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び/又はラムダ軽鎖をコードする一部の組み換えの核酸配列を合成することを更に含む、請求項235に記載の方法。

請求項237

a)各メンバー抗体が、抗原結合部位を形成するため、可変の軽(VL)鎖及び可変の重(VH)鎖又はその十分な部分を含み、i)各VL鎖が、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾された形態、或いは、Vl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾された形態を含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントがインフレームで連結され、ii)各VH鎖は、ヒトVH及びヒトVH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾された形態並びにVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を含む核酸分子によりコードされ、それによって前記セグメントがインフレームで連結され、b)ライブラリーは、少なくとも大体或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む、複数の抗体から成るヒト組み換え抗体ライブラリー。

請求項238

VH鎖をコードする核酸の、VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’であり、それはJHセグメントへ5’であるよう、直接的又は間接的に連結され、並びに、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、又はVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう、直接的又は間接的に連結される、請求項237に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項239

VH及びJHの間のヌクレオチド配列並びにJH生殖細胞系が、D−J結合部でペプチドリンカーにより間接的に連結される、請求項238に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項240

ペプチドリンカーがSYである、請求項239に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項241

VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその縮重コドンである、請求項237−240のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項242

VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンであり又は反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項237−241のいずれかに記載のヒト組合せ抗体。

請求項243

DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:239−272のいずれかから選択される、請求項242に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項244

反転DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:3462−3488のいずれかから選択される、請求項242に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項245

DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項237−244のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項246

JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾を含む、請求項237−245のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項247

修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:3450−3455のいずれかにで示すヌクレオチド配列を有する、請求項246に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項248

VH鎖をコードする核酸分子が、配列識別番号:2070−2759又はその一部のいずれかから選択され、並びにVLをコードする核酸分子が、配列識別番号:1411−1422、1424−1439及び1441−1471又はその一部のいずれかから選択される、請求項237−247のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項249

VH鎖が、配列識別番号:2760−3449又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有し、並びにVL鎖が、配列識別番号:1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する、請求項237−248のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項250

ライブラリーの各メンバー抗体が、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を更に含む、請求項237−249のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項251

ライブラリーの各メンバー抗体が、抗原結合部位を形成するのに十分な完全長抗体或いはフラグメント又はその部分から選択される、請求項237−250のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項252

フラグメント又はその部分が、Fab、Fab'、F(ab’)2、単一鎖Fvs (scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、Fd及びFd’フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、scFvフラグメント及びscFabフラグメントから選択される、請求項251に記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項253

ライブラリーの各メンバー抗体がFabである、請求項237−252のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項254

大体の又は50、102、103、104、2 x 104、3 x 104、 4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104、105、106、107、 108、109又はそれ以上の異なるメンバーを含む、請求項237−253のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項255

103、2 x 103、3 x 103、4 x 103、5 x 103、 6 x 103、7 x 103、8 x 103、9 x 103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、 5 x 104、6 x 104、7 x 104、 8 x 104、9 x 104 又はそれ以上の異なるメンバーを含む、請求項237−254のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項256

抗体ライブラリーがアドレス可能である、請求項237−255のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項257

各VH鎖が、インフレームで連結される、ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン又はその修飾形態並びにVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされ、並びに各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスにおける核酸分子とは異なる、可変の重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含む、核酸分子ライブラリー。

請求項258

VH鎖をコードする核酸分子のVH生殖細胞セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列、JH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントが、VHとJHの間のヌクレオチド配列は5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう、直接的又は間接的に連結される、請求項257に記載の核酸分子ライブラリー。

請求項259

VHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、D−J結合部でペプチドリンカーをコードするヌクレオチドによって間接的に連結される、請求項257又は請求項258に記載の核酸分子ライブラリー。

請求項260

ヌクレオチドがSYであるペプチドリンカーをコードする、請求項259に記載の核酸分子ライブラリー。

請求項261

VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその縮重コドンである、請求項257−260のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項262

VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンであり、或いは反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項257−261のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項263

DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:239−272のいずれかから選択される、請求項257−262のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項264

反転DH生殖細は胞系セグメントが、配列識別番号:3462−3488のいずれかから選択される、請求項257−263のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項265

DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項257−264のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項266

JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾体を含む、請求項257−265のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項267

修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:3450−3455のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する、請求項266に記載の核酸分子ライブラリー。

請求項268

配列識別番号:2070−2759又はその一部のいずれかから選択されるVH鎖をコードする複数の核酸分子を含む、請求項257−267のいずれかに記載の核酸分子ライブラリー。

請求項269

ライブラリーの各ベクターが、異なる核酸分子を含む、請求項257−268のいずれかに記載の核酸分子から成る、アドレス可能ベクターのライブラリー。

請求項270

ライブラリーの各細胞が、様々なベクターを含有し、請求項269に記載のベクターを含む、アドレス可能な細胞のライブラリー。

請求項271

a)ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態、並びにVH鎖又はその部分をコードする核酸分子配列を生成するため、インフレームでVH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列を組合せることと、b)VL鎖又はその部分をコードする核酸分子配列を生成するため、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態をインフレームで組合せることと、段階a)及びb)において、VHの各部分、VH及びJH生殖細胞系セグメント間のあらゆるヌクレオチド配列、JH、Vk、Jk、Vl又はJlが、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL又はその部分を含む抗体又はその部分を産生するのに十分であり、並びに、セグメントは、VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びVH鎖をコードする核酸分子のJH生殖細胞系セグメントが、直接的又は間接的に連結されるよう直接的又は間接的に組合わされ、VHセグメントは、VHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’で、それはJHセグメントへ5’であり、c)複数の様々な核酸分子配列を生成するため、段階a)及びb)を数回繰り返すことと、d) 第一のライブラリーが、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、及び第二のライブラリーが、VL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む、2つのアドレス可能なライブラリーを生成することと、e)第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子をアドレス指定された細胞に導入し、各細胞が、細胞ライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む、アドレス指定された細胞のライブラリーを生成するため、これを数回繰り返すことと、並びにf)ライブラリーの各抗体又はその部分が、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するため、VH及びVL鎖の様々な組合せ又はその十分な部分を含み、複数の抗体又はその部分がアドレス指定され、並びに各位置における抗体又はその部分が同じ抗体で、他のそれぞれの位置及びあらゆる位置の抗体とは異なり、抗体又はその部分の同定は、そのアドレスで知られる、複数の抗体又はその部分を産生する、各細胞の抗体又はその部分を発現する細胞を成長させることとを含む、ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項272

VH及びVHとJHの間のヌクレオチド配列、並びに/又はVH及びJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、V−D及び/又はD−J結合部でペプチドリンカーをコードするヌクレオチドによって間接的に連結される、請求項271に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項273

VH及びVHとJHの間のヌクレオチド配列、並びに/又はVHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントが、停止コドンを除去するために修飾される、請求項271又は請求項272に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項274

VH生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:10−238から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−273に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項275

VH生殖細胞系セグメントが、IGHV3-23*01又はその部分、その縮重コドンまたはその修飾形態である、請求項274に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項276

VHとJHの間のヌクレオチド配列が、DH生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン或いは反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項271−275のいずれかに記載のヒト組合せライブラリーを生成する方法。

請求項277

DH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:239−272又はその部分、その縮重コドン又はその修飾形態のいずれかから選択され、或いはその反転DH生殖細胞系セグメントである、請求項271−276のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項278

反転DH生殖細胞系セグメントは、配列識別番号:3462−3488のいずれかから選択される、請求項271−277のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項279

DH生殖細胞系セグメント又は反転DH生殖細胞系セグメントが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D又はD−J結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する、請求項271−278のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項280

JH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:273−285から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−279のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項281

JH生殖細胞系セグメントが、1つ又はそれ以上のヌクレオチド修飾体を含む、請求項280に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項282

修飾されたJH生殖細胞系セグメントが、配列識別番号:3450−3455のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する、請求項281に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項283

Vl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:365−441又はその部分から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−282のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項284

Jl生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:442−451から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−283のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項285

Vk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:286−355及び868から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−284のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項286

Jk生殖細胞系セグメントが、全て又は一部の配列識別番号:356−364から選択される、或いはその部分、その縮重コドン又はその修飾形態である、請求項271−285のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項287

第一のライブラリーのVH鎖又はその部分をコードする核酸分子が、発現ベクターで含有され、そこで各核酸分子は、別の発現ベクターで含有され、並びに、第二のライブラリーのVH鎖又はその部分をコードする核酸分子が、発現ベクターで含有され、そこで核酸分子は、別の発現ベクターで含有される、請求項271−286のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項288

ベクターが、更に、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な全て又は一部の定常領域を含む、請求項287に記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項289

細胞が、原核細胞又は真核細胞である、請求項271−288のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項290

細胞が大腸菌細胞である、請求項271−289のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項291

アドレス指定された細胞が、空間アレイで配列される、請求項271−290のいずれかに記載のヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項292

空間アレイが、マルチウェルプレートであり、前記プレートの個々の位置が、アドレス指定された細胞のライブラリーで他の全ての細胞から様々な組合せのVH及びVLをコードする核酸分子を含む細胞に対応する、請求項291に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項293

発現される抗体が、完全長の抗体、又は抗原結合部位を形成するのに十分なフラグメントまたはその部分である、請求項271−292のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項294

発現される抗体がFabである、請求項3271−293のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項295

抗体又はその部分を更に精製する、請求項271−294のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項296

ライブラリーにおける精製された抗体又はその部分が、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度である、請求項295に記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを生成する方法。

請求項297

請求項271−296のいずれかに記載の方法によって産生されるヒト組合せ抗体ライブラリー。

請求項298

a)請求項237−256又は請求項297のいずれかに記載のヒト組み合わせ抗体ライブラリーを提供することと、b)前記ライブラリーの抗体又はその部分を細胞又は標的タンパク質と接触することと、c)細胞又は標的タンパク質と抗体又はその部分の結合及び/或いは抗体又はその部分が細胞又は標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうかを評価することと、並びにd)細胞又は標的タンパク質に結合する及び/或いは細胞又は標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を同定し、そこで同定された抗体又はその部分がHITであることとを含む、結合又は標的タンパク質に対する活性のヒト組み合わせ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法。

請求項299

ヒト組み合わせ抗体ライブラリーが、アドレス可能なライブラリーで、HITの同定がそのアドレスによって知られるよう、接触がアドレス可能なアレイで行われる、請求項298に記載の方法。

請求項300

標的タンパク質が、膜結合性タンパク質、細胞表面受容体(CSR)又はCSRリガンドである、請求項298又は請求項299に記載の方法。

請求項301

膜結合性タンパク質又はCSRが、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞間相互作用に関与する受容体、及び細胞接着分子から選択される、請求項300に記載の方法。

請求項302

標的タンパク質が、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、癌細胞表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEM、LT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリン、インテグリン、CD52及びCD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF及びEPOから選択される、請求項298−301のいずれかに記載の方法。

請求項303

抗体又はその部分の標的タンパク質又は細胞への結合を評価することを含む、請求項298−302のいずれかに記載の方法。

請求項304

抗体又はその部分が、細胞又は標的タンパク質の機能的活性を調節するかどうか評価することを含む、請求項298−303に記載の方法。

請求項305

機能的活性が、細胞増殖、リンパ種のアポトーシス、走化性、癌細胞の浸潤、マトリゲル、内皮増殖、管形成及びシグナル伝達から選択される、請求項304に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願
2008年11月7日に出願された米国仮出願シリアル番号第61/198、764号、発明の名称組合抗体ライブラリー及びその使用」、並びに2009年3月25日に出願された米国仮出願シリアル番号第61/211、204号、発明の名称「組合せ抗体ライブラリー及びその使用」に対し、優先権の利益を主張する。上記出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。
本出願はまた、米国仮出願番号第61/198、764号及び米国仮出願番号第61/211、204号に対する優先権を主張する、本明細書と同日に出願された国際PCT出願番号(代理人整理番号3800016−00087/703PC)、発明の名称「抗DLL4抗体及びその使用」に関する。
本出願は、本明細書と同日に出願された米国仮出願番号(代理人整理番号3800016−00004/p702)、発明の名称「親和性成熟に基づく抗体の最適化の方法」にも関する。
上記に関する各出願の主題は、容認されるなら、参照によってそのまま援用される。

0002

電子的に提供される配列表の参照による援用
電子バージョンの配列表は、本明細書で提出されており、その内容は、参照によってそのまま援用される。電子フィルのサイズは2.92メガバイトで、タイトルは701seq.PC1.txtである。

0003

ヒト生殖細胞系セグメントから組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法を提供する。また、VL鎖をコードする生殖細胞系セグメントから蓄積された核酸分子ライブラリー及びVH鎖をコードする核酸分子のライブラリー、並びに得られた抗体のライブラリーも提供される。前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供される。標的タンパク質抗原に対する抗体ライブラリーをスクリーニングする方法、及び同定される又は選択される抗体を提供する。

背景技術

0004

多くの治療用及び診断用モノクローナル抗体(MAbs)が、癌及び自己免疫疾患などのヒト疾患治療及び診断するため臨床現場で使用される。例えば、例示的な診断用抗体は、リツキサンリツキシマブ)、ハーセプチントラスツズマブ)、アバスチンベバシズマブ)及びレミケードインフリキシマブ)を含む。抗体治療薬の設計において、例えば、目標物機能的活性を調節する抗体、並びに/又はより高い特異性及び/又は親和性を伴う抗体といった改良された抗体、並びに/又は特に細胞又は組織環境において、更に生物学的に利用可能で、安定性があり又は可溶性である抗体を生成するのが望ましい。

0005

抗体治療薬を生成するため利用可能な方法は限られている。現行の方法は、in vitroで望ましい性質を伴う変異体タンパク質を選択するため抗体ライブラリーを使用することを含む。ライブラリーは、標的法及び非標的法(例えば、Marks et al.、 J. Mol. Biol. (1991) 222、581−597、Winters et al. (1994) Annu Rev. Immunol. 12:433−55、Rosok et al. (1996) J. Biol. Chem.、271:22611−22618、Kim et al. (2005) Mol. Cells 20:17−29、Mondon et al. (2008) Frontiers in Bioscience、 13:1117−1129、Benhar et al. (2007) Expert Opin. Biol. Ther.、 7:763−779及び Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol.、296:57−86)によって変異的多様性を含むよう生成される。これらの各抗体ライブラリーには、その限界がある。従って、本明細書の対照物においては、抗体ライブラリーを作製する方法及び前記方法によって産生される抗体を提供する。

0006

本明細書では、ヒト生殖細胞系セグメントの再編成によって生成されるヒト組合せ抗体ライブラリーを提供する。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーにおいて、ライブラリーの各メンバー抗体は、抗原結合部位を形成するため、可変軽(VL)鎖及び可変重(VH)鎖又はその十分な部分を含む、複数の抗体を含有するライブラリーを含む。ライブラリーにおける抗体の各VL鎖は、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、前記セグメントインフレームで連結される。ライブラリーにおける抗体の各VH鎖は、ヒトVH及びヒトJH生殖細胞系セグメント並びにVH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチドのあらゆる配列を含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される。ヒト組合せ抗体ライブラリーは、少なくとも大体の、或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む。ライブラリーの各メンバーは、抗原結合部位を含み、機能的及び生産的な抗体である。

0007

ヒト組合せ抗体ライブラリーのこうした例で、VH鎖をコードする核酸分子における、VH生殖細胞系セグメント、VHとJHの間のヌクレオチド配列及びJH生殖細胞系セグメントは、VHセグメントがVHとJHの間のヌクレオチド配列へ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結され、並びにVL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、或いはVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される。VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列は、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のヌクレオチド長において、或いは約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90又は100のヌクレオチド長である。いくつかの例において、VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチド配列は、ペプチド模倣物をコードする。

0008

本明細書では、各メンバー抗体が修飾された可変軽(VL)鎖及び/又は修飾された可変重(VH)鎖或いはその十分な部分を含み、抗原結合部位を形成する複数の抗体を含有するヒト組合せ抗体ライブラリーも提供する。各ライブラリーのVL鎖は、セグメントがインフレームで連結される、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされる。ライブラリーにおける抗体の各VH鎖は、セグメントがインフレームで連結される、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又は縮重コドンを含む核酸分子によってコードされる。VL鎖及びVH鎖の得られたタンパク質は、アミノ酸置換又はCDRへのアミノ酸の挿入によって修飾される。前記CDRは、CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2又はCDRL3のどれか1つ若しく全CDRを含むそれ以上のCDR、例えばCDRH3になり得る。挿入又は置換し得るアミノ酸は、ペプチド模倣物に対応する。

0009

上記の全例において、ペプチド模倣物は、TPO、EPO、G−CSFIL−5、ヒト脳ナトリウム利尿ペプチド(hBNP−32)、エキセンディン4、GLP−1、GLP−2、グルカゴン、PACAP−38、CD209L、TNF、VEGF、MMP阻害剤又はCTLA−4ペプチド模倣物であり得る。特にペプチド模倣物は、その受容体のEpo活性模倣する模倣物である。ペプチド模倣物は、更に、アミノ酸などのカルボキシ及び/又はN−末端においてフランキング配列を含むことが可能である。例えば、フランキング配列は、グリシン又はプロリンを含み得る。例示的なペプチド模倣物は、配列識別番号:891及び987−1014のいずれかで示されるどれかである。

0010

上記で提供されるライブラリーにおいて、VH及びJH生殖細胞系セグメント間のヌクレオチドは、ヒト生殖細胞系DHセグメント又はその縮重コドンである。従って、本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーは、各メンバー抗体が、可変軽(VL)鎖及び可変重(VH)鎖又はその十分な部分を含み、抗原結合部位を形成する複数の抗体を含有するライブラリーを含む。ライブラリーにおける抗体の各VL鎖は、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドン、或いはVl及びJlヒト生殖細胞系セグメント又はその縮重コドンを含む核酸分子によってコードされ、それによって前記セグメントはインフレームで連結される。ライブラリーにおける抗体の各VH鎖は、VH、DH、JH生殖細胞系セグメントを含む核酸分子によりコードされ、そによって前記セグメントは、インフレームで連結される。ヒト組合せ抗体ライブラリーは、少なくとも大体の、或いは50又は100又はそれ以上の異なるメンバーを含む。ヒト組合せ抗体ライブラリーのこうした例において、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJHセグメントは、VHセグメントがDHセグメントへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう連結され、並びにVL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk並びにVl及びJl生殖細胞系セグメントは、VkセグメントがJkセグメントへ5’であり、或いはVlセグメントがJlセグメントへ5’であるよう連結される。

0011

本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーの全てにおいて、前記ライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供することができる。こうしたアドレス可能なライブラリーにおいて、各アドレス内の抗体は、同じ抗体であり、他の全てのアドレスの抗体とは異なる。例えば、ライブラリーのアドレス可能な抗体は、空間アレイで配列される。空間アレイは、マルチウェルプレートであり得、前記プレートのそれぞれの各位置は様々な抗体メンバーに対応する。抗体メンバーは、プレートのウェルの表面に固定化され得、又は溶液中に存在し得る。別の例において、アドレス可能な抗体は、固体支持体に付着される。こうした例において、固体支持体は、フィルターチップスライドビード又はセルロースで、及び様々な抗体メンバーが、その表面に固定化される。いくつかの例において、固体支持体は、Biacoreチップである。本明細書で提供されるアドレス可能なあらゆるライブラリーをおいて、メンバーは同定可能に標識化される。例えば、標識は、有色、発色性発光性化学的蛍光性又は電子的であり得る。

0012

本明細書で提供されるヒト組合せライブラリーは、VH鎖及びVL鎖をコードする複数の核酸分子が、少なくとも大体の、或いは50又は100の異なる抗体を生成するのに十分であるよう、複数の核酸分子がVH鎖をコードし、並びに複数の核酸分子がVL鎖をコードするメンバーを含む。従って、本明細書で提供されるライブラリーで、VH鎖をコードする核酸分子において、全て又は一部の生殖細胞系VHセグメントは、全て又は一部のDHセグメントと連結され、それは全て又は一部の生殖細胞系JHセグメントと連結され、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成し、並びにVL鎖をコードする核酸分子において、全て又は一部の生殖細胞系Vkセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Jkセグメントと連結され、或いは全て又は一部の生殖細胞系Vlセグメントは、全て又は一部の生殖細胞系Jlセグメントへ連結され、VL鎖をコードする複数の核酸分子を生成する。

0013

本明細書で提供されるライブラリーにおいて、ライブラリーのVH鎖は、ヒトVH生殖細胞系セグメント、DH生殖細胞系セグメント及びJH生殖細胞系セグメントを接合することにより組合わせれた再編成の核酸配列によってコードされる。ヒトVH生殖細胞系セグメントは、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6又はIGHV7並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:10−238のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、VH遺伝子セグメントは、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、VH鎖をコードする核酸分子のV−D結合部で追加又は除去される1つのヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドは、VHとDHの間でヌクレオチドを追加するため、VHヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、それがグアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。DHセグメントは、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6又はIGHD7及び遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:239−272のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合わせ抗体ライブラリーの例において、DH遺伝子セグメントは、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、VH鎖をコードする核酸のV−D結合部及び/又はD−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有することができる。ヌクレオチドの挿入又は欠失が、DHの親水性最大化するため選択される。例えば、DHの5’末端からヌクレオチドが欠失され、及び/又はDHの3’末端からヌクレオチドが欠失される。別の例において、ヌクレオチドは、DHとJHの間でヌクレオチドを追加するため、DH配列の3’末端で挿入される。追加されたヌクレオチドは、特にグアニン(G)といったいずれかのヌクレオチドであり得る。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5又はIGHJ6並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号273−285のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーの例において、JH遺伝子セグメントは、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、VH鎖をコードする核酸配列のD−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、JHのリーディングフレームを維持するため選択される。1つの例を挙げると、JHの5’末端からヌクレオチドが欠失される。他の例を挙げると、JHの3’末端からヌクレオチドが欠失される。

0014

本明細書で提供されるライブラリーにおいて、ライブラリーにおけるメンバーのVL鎖は、ヒトV k生殖細胞系セグメント及びJ k生殖細胞系セグメントを接合することにより、組合わされたカッパ軽鎖をコードする再編成された核酸によってコードされ、又はヒトVl生殖細胞系セグメント及びJl生殖細胞系セグメントを接合することにより、組合わされたラムダ軽鎖をコードする再編成された核酸配列によってコードされる。ヒトVkは、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びに遺伝子又はその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:286−355及び868のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Vk遺伝子セグメントは、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VL鎖をコードする核酸分子のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有することができる。例えば、ヌクレオチドはVkの3’末端で欠失される。別の例において、ヌクレオチドは、VkとJkの間でヌクレオチドを追加するため、Vkヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、それがグアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトJkは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4又はIGKJ5並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:356−364のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Jk遺伝子セグメントは、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VL鎖をコードする核酸配列のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Jkのリーディングフレームを維持するため選択される。いくつかの例を挙げると、Jkの5’末端からヌクレオチドが欠失される。ヒトVlは、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10又はIGLV11並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:365−441のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Vlは、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VLをコードする核酸配列のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有する。例えば、Vlヌクレオチド配列の3’末端からヌクレオチドは欠失される。別の例において、VlとJlの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドが、Vlヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。ヒトJlは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6又はIGLJ7並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:442−451のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーの例において、Jlは、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VL鎖をコードする核酸配列のV−J結合部で挿入又は欠失される1つのヌクレオチドを有する。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、Jlのリーディングフレームを維持するため選択され得る。例えば、Jlの5’末端からのヌクレオチドは欠失される。

0015

ヒト組合せ抗体ライブラリーは、VH鎖をコードする複数の核酸分子及びVL鎖をコードする複数の核酸分子によって各々コードされる複数メンバーを含む。複数の核酸分子は、全ての組合せ或いは再配列された生殖細胞系セグメント又はその一部の置換に対応することができる。一般的に、本明細書で提供されるライブラリーは、50、102、103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104、105、106、107、108、109又はそれ以上の異なるメンバー、或いは約50、102、103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104、105、106、107、108、109の又はそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。例えば、本明細書に提供されるライブラリーは、103、2 x 103、3 x 103、4 x 103、5 x 103、6 x 103、4 x 103、7 x 103、8 x 103、9 x 103、104、2 x 104、3 x 104、4 x 104、5 x 104、6 x 104、7 x 104、8 x 104、9 x 104又はそれ以上の異なるメンバーを含有するライブラリーを含む。

0016

例えば、VH鎖をコードする複数の核酸は、配列の類似性又は相違性遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。1つの例を挙げると、VH鎖をコードする複数の核酸分子は、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である。別の例を挙げると、VH鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各VH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーからの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のVH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、VH遺伝子ファミリーは、IGHV1−18、IGHV1−2 IGHV1−24、 IGHV1−3、 IGHV1−45、 IGHV1−46、 IGHV1−58、 IGHV1−69、 IGHV1−8、 IGHV2−26、 IGHV2−5、 IGHV2−70、 IGHV3−11、 IGHV3−13、 IGHV3−15、 IGHV3−16、 IGHV3−20、 IGHV3−21、 IGHV3−23、 IGHV3−30、 IGHV3−33、 IGHV3−35、 IGHV3−38、 IGHV3−43、 IGHV3−48、 IGHV3−49、 IGHV3−53、 IGHV3−64、 IGHV3−66、 IGHV3−7、 IGHV3−72、 IGHV3−73、 IGHV3−74、 IGHV3−9、 IGHV4−28、 IGHV4−31、 IGHV4−34、 IGHV4−39、 IGHV4−4、 IGHV4−59、 IGHV4−61、 IGHV5−51、 IGHV6−1及びIGHV7−81から選択され、DH遺伝子ファミリーは、IGHD1−1、IGHD1−14、 IGHD1−20、 IGHD1−26、 IGHD1−7、 IGHD2−15、 IGHD2−2、 IGHD2−21、 IGHD2−8、 IGHD3−10、 IGHD3−16、 IGHD3−22、 IGHD3−3、 IGHD3−9、 IGHD4−11、 IGHD4−17、 IGHD4−23、 IGHD4−4、 IGHD5−12、 IGHD5−18、 IGHD5−24、 IGHD5−5、 IGHD6−13、 IGHD6−19、 IGHD6−25、 IGHD6−6及び IGHD7−27;から選択され、並びにDH遺伝子ファミリーは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6から選択される。

0017

例えば、VL鎖をコードする複数の核酸分子は、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。1つの例を挙げると、VL鎖をコードする複数の核酸分子は、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である。別の例を挙げると、VH鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各Vk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のVk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl遺伝子ファミリーからの1つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、Vk遺伝子ファミリーは、IGKV1−12、IGKV1−12及びIGKV1−39から選択され、Jk遺伝子ファミリーは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4、 IGKV1−16、 IGKV1−17、 IGKV1−27、 IGKV1−33、 IGKV1−37、 IGKV1−39、 IGKV1−5、 IGKV1−6、 IGKV1−8、 IGKV1−9、 IGKV1−NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D−12、 IGKV1D−13、 IGKV1D−16、 IGKV1−D−17、 IGKV1D−33、 IGKV1D−37、 IGKV1D−39、 IGKV1D−42、 IGKV1D−43、 IGKV1D−8、 IGKV2−24、 IGKV2−28、 IGKV2−29、 IGKV2−30、 IGKV2−30、 IGKV2−40、 IGKV2D−24、 IGKV2D−26、 IGKV2D−28、 IGKV2D−29、 IGKV2−D−30、 IGKV2D−40、 IGKV3−11、 IGKV3−15、 IGKV3−20、 IGKV3−7、 IGKV3−NL1、 IGV3−NL2、 IGKV3−NL3、 IGKV3−NL4、 IGKV3−NL5、 IGKV3/OR2−268、 IGKV3D−11、 IGKV3D−15、 IGKV3D−20、 iGKV3D−7、 IGKV4−1、 IGKV5−2、 IGKV6−21、 IGKV6D−21、 IGKV6D−41及びIGKJ5から選択され、Vl遺伝子ファミリーは、IGLV1−36、IGLV1−40、 IGLV1−41、 IGLV1−44、 IGLV1−47、 IGLV1−50、 IGLV1−51、 IGLV10−54、 IGLV11−55、 IGLV2−11、 IGLV2−14、 IGLV2−18、 IGLV2−23、 IGLV2−33、 IGLV2−8、 IGLV3−1、 IGLV3−10、 IGLV3−12、 IGLV3−16、 IGLV3−19、 IGLV3−21、 IGLV3−22、 IGLV3−25、 IGLV3−27、 IGLV3−32、 IGLV3−9、 IGLV4−3、 IGLV4−60、 IGLV4−69、 IGLV5−37、 IGLV5−39、 IGLV5−45、 IGLV5−8、 IGLV5−52、 IGLV6−57、 IGLV7−43、 IGLV7−46、 IGLV8−61、 IGLV8−61及びIGLV9−49から選択され、並びにJl 遺伝子ファミリーは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7から選択される。

0018

本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかにおいて、ライブラリーの各抗体メンバーは、生産的及び機能的である。従って、いくつかの例において、ライブラリーのメンバー抗体は、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾される核酸分子によってコードされるVH鎖及び/又はVL鎖を含む。

0019

本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかにおいて、VH鎖は、配列識別番号:1059−1410又はその一部のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされ、並びにVL鎖は、配列識別番号:1411−1422、1424−1439及び1441−1471又はその一部のいずれかで示されるヌクレオチド配列を有する核酸分子によってコードされる。本明細書で提供される抗体ライブラリーは、VH鎖が、配列識別番号:1475−1826又はその一部のいずれかで示されるアミノ酸配列を有し、並びにVL鎖が、配列識別番号:1827−1838、1840−1855及び1857−1888又はその一部のいずれかで示されるアミノ酸配列を有するメンバーを含有するライブラリーを含む。

0020

本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーは、完全長抗体或いは抗体のフラグメント又はその部分であるメンバーを有するものを含み、抗体のフラグメント又は一部は抗原結合部位を形成するのに十分である。こうして、本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーのいずれかは、定常領域の一部が、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分であるよう、全て又は一部の定常領域を更に含むことが可能である。本明細書で提供されるライブラリーの抗体メンバーのフラグメント又は部分で含まれるのは、Fab、Fab’、F(ab’)2、単一鎖Fvs(scFv)、Fv、dsFv、二重特異性抗体、Fd及びFd’フラグメント、Fabフラグメント、Fdフラグメント、scFvフラグメント及びscFabフラグメントである。例えば、本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーは、ライブラリーの抗体メンバーがFabのFabライブラリーである。

0021

本明細書では、可変の軽(VL)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む。こうしたライブラリーにおいて、各VL鎖は、インフレームで連結されるVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、それによって、各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる。各核酸メンバーは、VkセグメントがJkセグメントへ5’で、又はVlセグメントがJlセグメントへ5’で、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントが連結されるよう生殖細胞系セグメントの組合せから形成される。ライブラリーは、生殖細胞系セグメントの全ての組合せの全置換を含み得る複数の核酸メンバーを含む。いくつかの例を挙げると、複数の核酸メンバーは、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成するため、一部の生殖細胞系Vkセグメントが、全て又は一部のJkセグメントと連結されるよう一部の全生殖細胞系セグメント、或いは全ての又は一部の生殖細胞系Vlセグメントが、全て又は一部の生殖細胞系Jlセグメントに連結されるよう、一部の全生殖細胞系セグメントを含む。

0022

本明細書で提供されるVL核酸ライブラリーにおいて、VL鎖をコードされた核酸分子は、ヒトVk生殖細胞系セグメント及びJ k生殖細胞系セグメントを接合することにより組合わされる再編成の核酸配列によって生成される。Vkは、IGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5又はIGKV6並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:286−355及び868のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子メンバーで含有されるVk生殖細胞系セグメントで含まれるのは、Vkが、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VLをコードする核酸分子のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。例えば、Vkヌクレオチド配列の3’末端で1つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、1つ又はそれ以上のヌクレオチドは、Vk及びJk生殖細胞セグメント間でヌクレオチドを追加するため、Vkヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。Jk生殖細胞系セグメントは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:356−364のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるJk生殖細胞系セグメントで含まれるのは、Jkが、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、V−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、J kのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Jkの5’末端からの1つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。

0023

いくつかの例において、本明細書で提供されるVL核酸ライブラリーは、VL鎖をコードする核酸分子が、ヒトVl生殖細胞系セグメント及びJl生殖細胞系セグメントを結合することによって組合わされる再編成の核酸配列により生成される。Vl生殖細胞系セグメントは、IGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:365−441のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるVl生殖細胞系セグメントにおいて含まれるのは、Vlが、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VLをコードする核酸分子のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。例えば、1つ又はそれ以上のヌクレオチドは、Vlヌクレオチド配列の3’末端から欠失される。別の例において、1つ又はそれ以上のヌクレオチドは、VlとJlの間でヌクレオチドを追加するため、Vlヌクレオチド配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドは、特に、グアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。Jl生殖細胞系セグメントは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:442−451のいずれかで示されるどれかである。
本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるJl生殖細胞系セグメントにおいては、Jlが、VL鎖のリーディングフレームを維持するため、VLをコードする核酸分子のV−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかである。挿入又は欠失は、一般的に、Jlのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、Jlの5’末端からヌクレオチドは欠失される。

0024

本明細書で提供されるライブラリーのVL鎖をコードする複数の核酸分子のいずれかは、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成される。例えば、VL鎖をコードする複数の核酸分子は、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である。別の例において、VL鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって、各々のVk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、Vk 生殖細胞系セグメントは、IGKV1−12、IGKV1−12、 IGKV1−16、 IGKV1−17、 IGKV1−27、 IGKV1−33、 IGKV1−37、 IGKV1−39、 IGKV1−5、 IGKV1−6、 IGKV1−8、 IGKV1−9、 IGKV1−NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D−12、 IGKV1D−13、 IGKV1D−16、 IGKV1−D−17、 IGKV1D−33、 IGKV1D−37、 IGKV1D−39、 IGKV1D−42、 IGKV1D−43、 IGKV1D−8、 IGKV2−24、 IGKV2−28、 IGKV2−29、 IGKV2−30、 IGKV2−30、 IGKV2−40、 IGKV2D−24、 IGKV2D−26、 IGKV2D−28、 IGKV2D−29、 IGKV2−D−30、 IGKV2D−40、 IGKV3−11、 IGKV3−15、 IGKV3−20、 IGKV3−7、 IGKV3−NL1、 IGV3−NL2、 IGKV3−NL3、 IGKV3−NL4、 IGKV3−NL5、 IGKV3/OR2−268、 IGKV3D−11、 IGKV3D−15、 IGKV3D−20、 IGKV3D−7、 IGKV4−1、 IGKV5−2、 IGKV6−21、 IGKV6D−21、 IGKV6D−41、 又はIGKV1−39遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、Jk生殖細胞系セグメントは、IGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、Vl生殖細胞系セグメントは、IGLV1−36、IGLV1−40、 IGLV1−41、 IGLV1−44、 IGLV1−47、 IGLV1−50、 IGLV1−51、 IGLV10−54、 IGLV11−55、 IGLV2−11、 IGLV2−14、 IGLV2−18、 IGLV2−23、 IGLV2−33、 IGLV2−8、 IGLV3−1、 IGLV3−10、 IGLV3−12、 IGLV3−16、 IGLV3−19、 IGLV3−21、 IGLV3−22、 IGLV3−25、 IGLV3−27、 IGLV3−32、 IGLV3−9、 IGLV4−3、 IGLV4−60、 IGLV4−69、 IGLV5−37、 IGLV5−39、 IGLV5−45、 IGLV5−8、 IGLV5−52、 IGLV6−57、 IGLV7−43、 IGLV7−46、 IGLV8−61、 IGLV8−61及びIGLV9−49遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントを含み得、並びに/或いはJl生殖細胞系セグメントは、IGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞刑セグメントを含み得る。

0025

本明細書で提供されるVL鎖をコードする全ての核酸ライブラリーにおいて、VL鎖をコードする核酸分子は、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾されることが可能である。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子の例は、配列識別番号:1411−1422、1424−1439及び1441−1471のいずれか或いはその一部を含む。

0026

本明細書では、可変軽(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む。こうしたライブラリーにおいて、各VH鎖は、インフレームで連結されるVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、それによって、各アドレス内の核酸分子は同じで、他の全てのアドレスの核酸分子とは異なる。各核酸メンバーは、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントが連結され、VHセグメントがDHセグメントへ5’で、それはJHセグメントへ5’であるよう生殖細胞系セグメントの組合せから形成される。ライブラリーは、生殖細胞系セグメントの全組合せの全ての置換を含有できる複数の核酸メンバーを含む。いくつかの例において、複数の核酸メンバーは、VH鎖をコードする複数の核酸分子を生成するため、一部の生殖細胞系VHセグメントが、全て又び一部の生殖細胞系DHセグメントと連結され、それは全て又は一部の生殖細胞系JHセグメントと連結されるよう、全生殖細胞系セグメントの一部を含む。

0027

本明細書で提供されるVH核酸ライブラリーにおいて、VH鎖をコードする核酸分子は、ヒトVH、DH及びJH生殖細胞系セグメントを結合することによって組合わされる再編成の核酸配列により生成される。VHは、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6及びIGHV7並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:10−238のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーを含有するVH生殖細胞系セグメントにおいて、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、VHは、VHをコードする核酸分子のV−D結合部で追加又は除去される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。例えば、VHヌクレオチド配列の3’末端で1つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、1つ又はそれ以上のヌクレオチドは、VH及びDH生殖細胞系セグメント間でヌクレオチドを追加するため、VHヌクレオチド配列の3’末端で挿入又は追加される。ヌクレオチドは、特にグアニン(G)であるいずれかのヌクレオチドであり得る。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6及びIGHD7並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:239−272のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるDH生殖細胞系セグメントにおいては、DHが、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、V−D及び/又はD−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。ヌクレオチドの挿入又は欠失は、あらゆるヌクレオチドであり得るが、一般的に、DHの親水性を最大化するため選択される。例えば、DHの5’末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。他の例において、DHの3’末端からヌクレオチドが欠失される。更なる例において、DHとJHの間でヌクレオチドを追加するため、ヌクレオチドがDH配列の3’末端で挿入される。ヌクレオチドはあらゆるヌクレオチドであり得るが、一般的に、グアニン(G)である。生殖細胞系セグメントは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6並びに遺伝子及びその対立遺伝子で、例えば、配列識別番号:273−285のいずれかで示されるどれかである。本明細書で提供されるライブラリーの核酸メンバーで含有されるJH生殖細胞系セグメントにおいて、JHは、VH鎖のリーディングフレームを維持するため、D−J結合部で挿入又は欠失される1つ又はそれ以上のヌクレオチドを有するいずれかを含む。通常、ヌクレオチドの挿入又は欠失は、JHのリーディングフレームを維持するため選択される。例えば、JHの5’末端からの1つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。別の例において、JHの3’末端からの1つ又はそれ以上のヌクレオチドが欠失される。

0028

本明細書で提供されるライブラリーのVH鎖をコードする複数の核酸分子のいずれかは、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され得る。例えば、VH鎖をコードする複数の核酸分子は、CDRに基づいて選択される一部の生殖細胞系セグメントから生成され、前記CDRはCDR3である。
別の例を挙げると、VH鎖をコードする複数の核酸分子は、遺伝子ファミリーに基づいて選択され、それによって各VH、DH及び/又はDH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、若しくは一部のVH、DH及び/又はDH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択される。こうした例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1−18、IGHV1−2、 IGHV1−24、 IGHV1−3、 IGHV1−45、 IGHV1−46、 IGHV1−58、 IGHV1−69、 IGHV1−8、 IGHV2−26、 IGHV2−5、 IGHV2−70、 IGHV3−11、 IGHV3−13、 IGHV3−15、 IGHV3−16、 IGHV3−20、 IGHV3−21、 IGHV3−23、 IGHV3−30、 IGHV3−33、 IGHV3−35、 IGHV3−38、 IGHV3−43、 IGHV3−48、 IGHV3−49、 IGHV3−53、 IGHV3−64、 IGHV3−66、 IGHV3−7、 IGHV3−72、 IGHV3−73、 IGHV3−74、 IGHV3−9、 IGHV4−28、 IGHV4−31、 IGHV4−34、 IGHV4−39、 IGHV4−4、 IGHV4−59、 IGHV4−61、 IGHV5−51、 IGHV6−1及びIGHV7−81遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、DH生殖細胞系セグメントは、IGHD1−1、IGHD1−14、IGHD1−20、 IGHD1−26、 IGHD1−7、 IGHD2−15、 IGHD2−2、 IGHD2−21、 IGHD2−8、 IGHD3−10、 IGHD3−16、 IGHD3−22、 IGHD3−3、 IGHD3−9、 IGHD4−11、 IGHD4−17、 IGHD4−23、 IGHD4−4、 IGHD5−12、 IGHD5−18、 IGHD5−24、 IGHD5−5、 IGHD6−13、 IGHD6−19、 IGHD6−25、 IGHD6−6及びIGHD7−27遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得、並びに/或いはJH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6遺伝子ファミリーから1つ又はそれ以上の生殖細胞系セグメントのいずれかを含み得る。

0029

本明細書で提供されるVH鎖をコードする全ての核酸ライブラリーにおいて、VH鎖をコードする核酸分子は、停止コドン及び/又は制限酵素部位を除去するため修飾され得る。本明細書で提供されるライブラリーの核酸分子の例は、配列識別番号:1059−1410のいずれか又はその一部を含む。

0030

本明細書では、可変軽(VL)鎖又は可変重(VH)鎖をコードする上記核酸分子のいずれかを含有するアドレス可能なベクターのライブラリーも提供する。また、本明細書では、ライブラリーの各細胞が、上記の異なるベクターのいずれかを含む、アドレス可能な細胞も含む。

0031

本明細書では、可変軽(VL)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子及び可変重(VH)鎖をコードする複数のアドレス可能な核酸分子を含有する核酸分子のライブラリーを含む(対を成す核酸ライブラリー)。こうしたライブラリーにおいて、各VL鎖は、インフレームで連結されるVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント或いはVl及びJl生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされ、並びに各VH鎖は、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを含有する核酸分子によってコードされる。VL鎖をコードする核酸分子の得られた核酸メンバーは、本明細書で提供されるいずれかであり得、VH鎖をコードする核酸分子は、本明細書で提供されるいずれかであり得る。こうしたアドレス可能なライブラリーにおいて、各位置で対を成す核酸分子が異なるなど、各アドレス内のVH核酸分子及びVL核酸分子の組合せが、他の全てのアドレスにおける核酸分子の組合せと異なるよう、各位置は、VH鎖をコードする核酸分子及びVL鎖をコードする核酸分子を含む。

0032

本明細書では、ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法を含む。前記方法は、a)VH鎖又はその部分をコードする核酸分子の配列を生成するため、VH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることと、b)VL鎖又はその部分をコードする核酸分子の配列を生成するため、Vk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いはVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることとの段階を含む。本明細書で提供される方法において、段階a)及びb)におけるVH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJlの各部分は、十分な抗原結合部位を形成するVH又はVL或いはその部分を含有する抗体又はその部分を産生するのに十分である。前記方法において、段階a)及びb)は、複数の異なる核酸分子の配列を生成するために数回繰り返される。核酸分子は、2つのライブラリーを産生するため合成され、それによって、第一のライブラリーは、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含み、第二のライブラリーはVL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む。前記方法において、第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子は、細胞に導入される(例えば、同時形質転換によってなどと共に)。核酸を細胞へ導入する段階は、第一のライブラリー及び第二のライブラリーから対を成す異なる核酸分子で数回繰り返し、結果的に、核酸分子が、他のあらゆる細胞からVH鎖及びVL鎖の様々な組合せをコードするよう、VH鎖をコードする核酸分子並びにVL鎖をコードする核酸分子を含む。細胞は、各細胞で抗体又はその部分を発現するよう成長させ、それによって複数の抗体又はその部分を産生する。産生された複数の抗体又はその部分は、VH又はVL或いはその十分な部分を含有し、抗原結合部位を形成して、抗体又はその部分は、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分のものと異なる。

0033

本明細書で提供される方法によって産生されるヒト組合せライブラリーは、アドレス可能なライブラリーとして提供され得る。こうした方法において、様々な各段階は、前記方法の段階を通して、生殖細胞系セグメントの同一性組み換えられた核酸配列及び/或いは産生された抗体又はその部分が、それらのアドレスによってわかるよう、アドレス指定された構成で実行することが可能である。例えば、合成された核酸は、個々にアドレス指定され、それによって、第一のアドレス指定された核酸ライブラリー及び第二のアドレス指定された核酸ライブラリーを生成する。核酸分子は、アドレス指定された細胞に導入することが可能で、各位置は、細胞のアドレス指定されたライブラリーの他の全ての細胞からVH及びVLの様々な組合せをコードする核酸分子を含む細胞を含有する。抗体の発現において、アドレス指定された抗体が産生され、それによって各位置は、抗原結合部位を形成するのに十分なVH鎖及びVL鎖又はその部分を含有する抗体を含む。各位置の抗体又はその部分は同じで、他の各位置及び他の全ての位置のものとは異なる。こうして、抗体又はその部分の同一性は、そのアドレスによってわかる。

0034

本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、段階a)で、VH鎖をコードする核酸分子のVH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分は、VHセグメントがDHセグメントへ5'で、それはJHセグメントへ5'であるよう組合わされ、並びに段階b)で、VL鎖をコードする核酸分子のVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分は、VkセグメントがJkセグメントへ5'で、或いはVlセグメントがJlセグメントへ5'であるよう連結される。段階a)及び/又はb)は、手作業で行うことが可能で、又はヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実行するアルゴリズムに基づいたコンピューター読み込み可能な指示を実行することができる若しくは実行するようプログラムされたコンピュータ又はコンピュータシステムなど、コンピュータによって実行することが可能である。

0035

ヒト組合わせ抗体ライブラリーの生成に対し本明細書で提供される方法において、段階a)は、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、DH生殖細胞系セグメントの親水性を最大化するため1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によってVH及び/又はDH生殖細胞系セグメントの生殖細胞系配列を修飾することによりV−D結合部を生成することと、JHのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によりDH及び/又はJH生殖細胞系セグメントの生殖細胞系配列を修飾することによってD−J結合部を生成することと、並びにVH鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVH、DH及びJHを組合わせることとの段階を含む。こうした方法において、V−D結合部は、DH生殖細胞系セグメントの5'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、1つのヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、V−D結合部は、VH生殖細胞系セグメントの3'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することによって生成され得る。更なる例において、V−D結合部は、DH生殖細胞系セグメントの5'末端で1つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入することによって生成され得る。例えば、挿入又は追加されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり得、特にグアニン(G)である。更に、D−J結合部は、JHの5'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、D−J結合部は、DH生殖細胞系セグメントの3'末端からヌクレオチドを挿入することにより生成される。挿入又は追加されるヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり得、特にグアニン(G)である。

0036

ヒト組合わせ抗体ライブラリーの生成に対し本明細書で提供される方法において、段階b)は、Vk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分を選択することと、Jk、のリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によってVk又はJkの生殖細胞系配列を修飾することにより、又はJlのリーディングフレームを維持するため、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの挿入又は欠失によりVl又はJlの生殖細胞系配列を修飾することによりV−J結合部を生成することと、並びにVL鎖をコードする核酸分子の配列を生成するため、得られたVk及びJk又はVl及びJlを組合わせることとの段階を含む。こうした方法において、V−J結合部は、例えば、Jk及びJl生殖細胞系セグメントの5'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチド、例えば、1つのヌクレオチドの欠失によって生成され得る。別の例において、V−J結合部は、Vk又はVl生殖細胞系セグメントの3'末端から1つ又はそれ以上のヌクレオチドを欠失することにより生成され得る。更なる例を挙げると、V−J結合部は、Jk又はJl生殖細胞系セグメントの5'末端で1つ又はそれ以上のヌクレオチドを挿入することにより生成され得る。例えば、挿入された又は追加されたヌクレオチド又は複数のヌクレオチドは、あらゆるヌクレオチドであり、特にグアニン(G)である。

0037

本明細書で提供される組合わせライブラリーを生成する方法において、段階a)及びb)を数回繰り返す。段階a)を数回繰り返すことは、様々なVH生殖細胞系セグメントのN1(第1数など)を選択することと、様々なDH生殖細胞系セグメントのN2(第2数など)を選択することと、及び様々なJH配列のN3(第3数など)を選択することとを含む。N1、N2及びN3の数は同じ又は異なり得、全ての個々の生殖細胞系セグメント又はその一部を含み得る。一般的に、N1、N2及びN3は、それぞれ、VH、DH又はJH生殖細胞系セグメントの全て又は一部であり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階a)を数回繰り返す方法において、VH、DH及びJH組合わせの可能な全ての組み合わせは、VH鎖をコードするN1 x N2 x N3の様々な核酸配列を生成するため構成される。

0038

例えば、本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法において、VH生殖細胞系セグメント(N1の異なるVH生殖細胞系セグメントを含む)は、IGHV1、IGHV2、IGHV3、IGHV4、IGHV5、IGHV6又はIGHV7の全て又はその一部並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号10−238のいずれかで示されるVH生殖細胞系セグメントから選択され得る。DH生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGHD1、IGHD2、IGHD3、IGHD4、IGHD5、IGHD6又はIGHD7並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号:239−272のいずれかで示されるDH生殖細胞系セグメントから選択され得る。JH生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5又はIGHJ6並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号:273−285のいずれかで示されるJH生殖細胞系セグメントから選択され得る。

0039

上記の例のいずれかにおいて、前記方法は、段階a)で、配列の類似性又は相異性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて一部の生殖細胞系セグメントを選択することを含み得る。例えば、一部の生殖細胞系セグメントは、遺伝子ファミリーに基づいて選択し得る。前記方法において、各々のVH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVH、DH及び/又はJH遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択されるよう、生殖細胞系セグメントが選択され得る。VH遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGHV1-18、IGHV1-2、 IGHV1-24、 IGHV1-3、 IGHV1-45、 IGHV1-46、 IGHV1-58、 IGHV1-69、 IGHV1-8、 IGHV2-26、 IGHV2-5、 IGHV2-70、 IGHV3-11、 IGHV3-13、 IGHV3-15、 IGHV3-16、 IGHV3-20、 IGHV3-21、 IGHV3-23、 IGHV3-30、 IGHV3-33、 IGHV3-35、 IGHV3-38、 IGHV3-43、 IGHV3-48、 IGHV3-49、 IGHV3-53、 IGHV3-64、 IGHV3-66、 IGHV3-7、 IGHV3-72、 IGHV3-73、 IGHV3-74、 IGHV3-9、 IGHV4-28、 IGHV4-31、 IGHV4-34、 IGHV4-39、 IGHV4-4、 IGHV4-59、 IGHV4-61、 IGHV5-51、 IGHV6-1及びIGHV7-81遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。DH遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGHD1-1、IGHD1-14、 、 IGHD1-20、 IGHD1-26、 IGHD1-7、 IGHD2-15、 IGHD2-2、 IGHD2-21、 IGHD2-8、 IGHD3-10、 IGHD3-16、 IGHD3-22、 IGHD3-3、 IGHD3-9、 IGHD4-11、 IGHD4-17、 IGHD4-23、 IGHD4-4、 IGHD5-12、 IGHD5-18、 IGHD5-24、 IGHD5-5、 IGHD6-13、 IGHD6-19、 IGHD6-25、 IGHD6-6及びIGHD7-27遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。JH遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGHJ1、IGHJ2、IGHJ3、IGHJ4、IGHJ5及びIGHJ6遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。

0040

本明細書で提供される組合わせライブラリーを生成する方法において、段階a)及びb)を数回繰り返す。段階b)を数回繰り返すことは、異なるVl生殖細胞系セグメントのN1(第1数など)を選択すること及び異なるJl生殖細胞系セグメントのN2(第2数など)を選択し、或いは異なるVk生殖細胞系セグメントのN3(第3数など)を選択して及び異なるJk 生殖細胞系セグメントのN4(第4数など)を選択することを含む。N1、N2、N3及びN4の数は同じ又は異なり得、並びにそれぞれの全ての生殖細胞系セグメント又はその一部を含み得る。一般的に、N1、N2、N3及びN4は、それぞれ、全て又は一部のVl、Jl、Vk、Jk生殖細胞系セグメントであり得る生殖細胞系セグメントの数である。段階b)を数回繰返す方法において、Vl、Jl、Vk、Jkの組合わせの可能な全べての組合わせは、VL鎖をコードするN1 x N2又はN3 x N4の異なる核酸配列を生成するため構成される。

0041

例えば、本明細書で提供されるヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する方法において、Vl生殖細胞系セグメント(N1の異なるVl生殖細胞系セグメントを含む)は、全て又は一部のIGLV1、IGLV2、IGLV3、IGLV4、IGLV5、IGLV6、IGLV7、IGLV8、IGLV9、IGLV10及びIGLV11並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号:365−441のいずれかで示されるVl生殖細胞系セグメントから選択され得る。Jl生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGLJ1、IGLJ2、IGLJ3、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号:442−451のいずれかで示されるJl生殖細胞系セグメントから選択され得る。Vk生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGKV1、IGKV2、IGKV3、IGKV4、IGKV5及びIGKV6並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号:286−355及び868のいずれかで示されるVk生殖細胞系セグメントから選択され得る。Jk生殖細胞系セグメントは、全て又は一部のIGKJ1、IGKJ2、IGKJ3、IGKJ4及びIGKJ5並びに遺伝子及びその対立遺伝子、例えば、配列識別番号:356−364のいずれかで示されるJk生殖細胞系セグメントから選択され得る。

0042

上記の例のいずれかにおいて、前記方法は、段階b)において、配列の類似性又は相違性、遺伝子ファミリー、長さ、構成、CDR長さ又は構成、種類、機能性、特異性、群又は亜群に基づいて一部の生殖細胞系セグメントを選択することを含み得る。例えば、一部の生殖細胞系セグメントは、遺伝子ファミリーに基づいて選択され得る。前記方法において、各々のVk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl 遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択され、或いは一部のVk及び/又はJk或いはVl及び/又はJl 遺伝子ファミリーから1つの生殖細胞系セグメントが選択されるよう、生殖細胞系セグメントは選択され得る。Vk遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGKV1-12、IGKV1-12、 IGKV1-16、 IGKV1-17、 IGKV1-27、 IGKV1-33、 IGKV1-37、 IGKV1-39、 IGKV1-5、 IGKV1-6、 IGKV1-8、 IGKV1-9、 IGKV1-NL1、 IGKV1/OR2、 IGKV1D-12、 IGKV1D-13、 IGKV1D-16、 IGKV1-D-17、 IGKV1D-33、 IGKV1D-37、 IGKV1D-39、 IGKV1D-42、 IGKV1D-43、 IGKV1D-8、 IGKV2-24、 IGKV2-28、 IGKV2-29、 IGKV2-30、 IGKV2-30、 IGKV2-40、 IGKV2D-24、 IGKV2D-26、 IGKV2D-28、 IGKV2D-29、 IGKV2-D-30、 IGKV2D-40、 IGKV3-11、 IGKV3-15、 IGKV3-20、 IGKV3-7、 IGKV3-NL1、 IGV3-NL2、 IGKV3-NL3、 IGKV3-NL4、 IGKV3-NL5、 IGKV3/OR2-268、 IGKV3D-11、 IGKV3D-15、 IGKV3D-20、 IGKV3D-7、 IGKV4-1、 IGKV5-2、 IGKV6-21、 IGKV6D-21、 IGKV6D-41 及びIGKV1-39遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。Vl遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含有するIGLV1-36、IGLV1-40、 IGLV1-41、 IGLV1-44、 IGLV1-47、 IGLV1-50、 IGLV1-51、 IGLV10-54、 IGLV11-55、 IGLV2-11、 IGLV2-14、 IGLV2-18、 IGLV2-23、 IGLV2-33、 IGLV2-8、 IGLV3-1、 IGLV3-10、 IGLV3-12、 IGLV3-16、 IGLV3-19、 IGLV3-21、 IGLV3-22、 IGLV3-25、 IGLV3-27、 IGLV3-32、 IGLV3-9、 IGLV4-3、 IGLV4-60、 IGLV4-69、 IGLV5-37、 IGLV5-39、 IGLV5-45、 IGLV5-8、 IGLV5-52、 IGLV6-57、 IGLV7-43、 IGLV7-46、 IGLV8-61、 IGLV8-61及びIGLV9-49遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。Jl遺伝子ファミリーは、遺伝子及びその対立遺伝子を含むIGLJ1、IGLJ2、IGLJ4、IGLJ5、IGLJ6及びIGLJ7遺伝子ファミリーを含むが、それらに制限されるものではない。

0043

ヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成する上記の方法のいずれかにおいて、生殖細胞系セグメントは、ユーザ作成データベースで含まれ得、例えば、こうした配列に便利にアクセスできる。前記方法の実行において、データベースのJH、Jk及びJl 生殖細胞系セグメントの配列は、それらの的確なリーディングフレームで示される(例えば、表13で示されるなど)。

0044

本明細書で提供される方法は、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を修飾すること及び/又はVL鎖又はその部分をコードする核酸配列を修飾することの段階a)及び/又はb)後の段階を更に含み得る。例えば、核酸配列は、あらゆる内部停止コドンを除去することにより修飾されることができる。一般的に、停止コドンの修飾は、核酸配列へ1つ又は2つのヌクレオチドのみを変えることにより行う。停止コドンに対するコドントリプレットは、アミノ酸をコードする他の全てのコドントリプレットに変えることが可能である。例えば、停止コドンTAAは、TATに修飾することができ、停止コドンTAGは、TATに修飾することができ、停止コドンTGAは、TCAに修飾することが可能である。別の例において、核酸配列は、あらゆる内部制限部位を除去することによって修飾され得る。制限酵素によって識別されるヌクレオチドは、目的の制限酵素によって識別されない配列と同様の長さの他の全てのヌクレオチド配列に修飾され得る(後続クローニング段階で使用されるものなど)。一般的に、1つ又は2つヌクレオチドのみを変える。通常、制限部位の修飾は、大腸菌におけるコドンの使用を最大化するため行われる。

0045

本明細書で提供されるヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、VH鎖をコードする複数の核酸配列は、配列識別番号:1059−1410のいずれか又はその一部で示されるどれかを含むが、それらに制限されるわけではない。VL鎖をコードする複数の核酸配列は、配列識別番号:1411−1422、1424−1439及び1441−1471のいずれか又はその一部で示されるどれかを含むが、それらに制限されるわけではない。

0046

ヒト組合せ抗体ライブラリーを生成する本明細書で提供される方法のいずれかにおいて、VH鎖をコードする複数の核酸配列及び/又はVL鎖をコードする複数の核酸配列を位置づけできる。例えば、前記配列は、配列の類似性に基づいて位置づけできる(配列アライメント或いは当業者に周知の及び本明細書に記載の他の方法によって実行など)。VH鎖をコードする複数の異なる核酸分子の間で及びその中での配列類似性、並びに/或いはVL鎖をコードする複数の異なる核酸分子の間で及びその中での配列類似性を決定できる。VH鎖及び/又はVL鎖をコードする一部の核酸配列は、選択された配列が、最も類似する配列又は選択された他の配列と最も異なる配列を含むよう選択され得る(例えば、合成及び後続の発現に対し)。

0047

組合せ抗体ライブラリーを生成するため本明細書で提供される方法において、アドレス指定されたライブラリーの合成された核酸配列は、ベクターで含有される。従って、VH鎖をコードする核酸配列を含む第一のベクターライブラリーからのベクター及びVL鎖をコードする核酸配列を含む第二のベクターライブラリーからのベクターは、ライブラリーの抗体メンバーの生成及び産生に対し、アドレス指定された細胞に導入される。前記ベクターは、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な定常領域の全て又は部分を更に含むことが可能である。例えば、前記ベクターは、得られたコードされる抗体がFabであるよう、CH1及びCLを含み得る。本明細書で提供される方法において、細胞は、原核生物の細胞又は真核生物の細胞を含む。例えば、細胞は、大腸菌細胞を含む。本明細書で提供される組合せ抗体ライブラリーを生成する方法において、アドレス指定される細胞は、空間アレイで配列することが可能である。空間アレイは、例えば、細胞のアドレス指定されたライブラリーで他の全ての細胞と比較し、前記プレートの各個々の位置が、VH及びVLの異なる組合せをコードする核酸分子を含む細胞に対応するよう、マルチウェルプレートを含む。

0048

本明細書で提供される方法で発現される抗体及びその部分は、抗原結合部位を形成するのに十分な完全長抗体或いはフラグメント又はその部分を含む。例えば、発現される抗体はFabである。本明細書で提供される方法は、更に、抗体又はその部分を精製する段階を含むことができる。ライブラリーの抗体又はその部分は、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の純度のものを含む。従って、アドレス可能なライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定されるよう、精製される抗体メンバーを含み、各アドレス内の抗体は、同じ抗体で、ライブラリーの他の全てのアドレスの他の全ての抗体とは異なる。

0049

また、本明細書で提供されるのは、組合せ抗体ライブラリーを生成する本明細書で提供される方法により生成されるアドレス可能な組合せ抗体ライブラリーである。こうした抗体ライブラリーは、配列識別番号:1475−836のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するVH鎖、及び配列識別番号:1827−1838、1840−1855及び1857−1888のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有するVL鎖を各々含有するメンバーを含む。

0050

本明細書では、標的タンパク質に結合する抗体又はその部分を同定し、及び/又は標的タンパク質の活性を修飾するため、結合又は標的タンパク質に対する活性に対し、ヒト組合せ抗体ライブラリーをスクリーニングする方法を提供している。こうした方法において、ヒト組合せ抗体ライブラリーが提供される。前記ライブラリーは、本明細書で提供されるあらゆるヒト組合せ抗体ライブラリー、又は本明細書で提供される方法で産生されるあらゆるヒト組合せ抗体ライブラリーを含む。こうした方法において、ライブラリーの抗体又はその部分は、標的タンパク質と接触し、抗体又はその部分と標的タンパク質との結合及び/又はライブラリーの抗体又はその部分による機能的活性の修飾を評価する。標的タンパク質に結合し、及び/又は標的タンパク質の活性を修飾する抗体またはその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を「HIT」として示す。こうした方法において、例えば、ヒト組合せ抗体ライブラリーは、「HIT」の同定がそのアドレスによってわかるよう、アドレス可能なライブラリーであり、アドレス可能なアレイで接触を行う。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートなどの空間アレイで行う。

0051

本明細書で提供されるスクリーニング法において、標的タンパク質は、膜結合性タンパク質、細胞表面受容体(CSR)又はCSRリガンドである。膜結合性タンパク質又はCSRは、サイトカイン受容体受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ細胞間相互作用関与する受容体、又は細胞接着分子を含むが、それらに制限されるものではない。例えば、標的タンパク質は、VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、癌細胞表皮増殖因子受容体(EGFR)、ErbB-2、ErbB-3、IGF-R1、C-Met、TNF-R1、TNF-R2、BTLA、HVEMLT-βR、CD20、CD3、CD25、NOTCH、DLL4、G-CSF-R、GM-CSF-R、EPO-R、カドヘリンインテグリン、CD52及びCD44、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、PIGF、EGF、HGF、TNF-α、LIGHT、リンフォトキシン(LT)、IgE、G-CSF、GM-CSF及びEPOを含むが、それらに制限されるものではない。

0052

いくつかの例において、標的タンパク質への抗体又はその部分の結合を評価する。他の例では、抗体又はその部分により標的タンパク質の機能的活性の調節を評価する。機能的活性は、細胞増殖リンパ種のアポトーシス走化性、癌細胞の浸潤マトリゲル内皮増殖、管形成及びシグナル伝達を含むが、それらに制限されるものではない。

0053

本明細書で提供されるスクリーニング法において、結合は、細胞で評価することが可能で、及び/又は機能的活性は細胞ベースの活性で評価できる。こうした例において、細胞は、一般的に、膜結合又は細胞外受容体、リガンド若しくは接着タンパク質としてそれらの表面上で、標的タンパク質を発現する。例えば、細胞は、一時的又は安定的に標的タンパク質をコードする核酸分子で発現することができる。

0054

本明細書では、「HIT」を同定した後に含むスクリーニング法を提供し、例えば、上記で提供されるスクリーニング法の前回の反復において、第二のライブラリーの組合せ抗体ライブラリーを提供する。こうした例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、同定された「HIT」に基づいている。例えば、同定されたHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性と関連するVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに異なるVH鎖又はその部分をそれぞれコードする複数の核酸分子の配列を生成するため、可能な全てのVH、DH及びJHヒト生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることと、及び同定されたHITの生殖細胞系セグメントとの配列類似性と関連するVk及びJk又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを選択することと、並びに異なるVL鎖又はその部分をそれぞれコードする複数の核酸分子の配列を生成するため、可能な全てのVk及びJkヒト生殖細胞系セグメント又はその部分、或いは可能な全てのVl及びJl生殖細胞系セグメント又はその部分をインフレームで組合わせることとによって、第二のライブラリーが生成される。VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl又はJlの一部は、抗原に結合するのに十分なVH又はVL又はその部分を含む抗体を産生するのに十分である。生殖細胞系セグメントの組合わせにおいて、核酸分子は、VH鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む第一のライブラリー、及びVL鎖又はその部分をコードする核酸分子を含む第二のライブラリーを生成するため合成する。第一のライブラリー及び第二のライブラリーからの核酸分子は、細胞に導入し、並びに各細胞が、細胞のライブラリーにおける他の全ての細胞からVH及びVLの異なる組合わせをコードする核酸分子を含有するよう、細胞のライブラリーを産生するため前記の段階を数回繰り返す。細胞は、各細胞で抗体を発現するため成長させ、ライブラリーにおける生成された各抗体又はその部分が、VH及びVL鎖又はその十分な部分の異なる組合わせを含み、ライブラリーにおける他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成するよう、複数の抗体又はその部分を産生する。前記抗体は、第二のヒト組合わせ抗体ライブラリーを生成するため、更に精製される。こうした例において、第二のヒト組合わせ抗体ライブラリーは、関連の生殖細胞系セグメント間及び関連の生殖細胞においての配列類似性が、60%、65%7、0%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上である、或いは大体そうであるよう生成される。

0055

別の例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVH、DH又はJHヒト生殖細胞系セグメントを含むVH鎖をコードする複数の核酸分子を選択することと、並びに同定されたHITをコードする核酸分子で含有されるのと同じVk及びJk又はVl及びJlヒト生殖細胞系セグメントを含むVL鎖をコードする複数の核酸分子を選択することとによって生成され、提供される。VLをコードする複数の核酸分子からの核酸分子及びVHをコードする複数の核酸分子からの核酸分子を細胞に導入し、細胞を成長させる。これは数回繰り返されて細胞ライブラリーを生成し、各細胞は、ライブラリーの他の全ての細胞と異なる組合せのVH鎖及びVL鎖をコードする核酸分子を含む。各細胞の抗体の発現において、複数の抗体又はその部分が産生される。ライブラリーの各抗体又はその部分は、VH及びVL鎖又はその十分な部分の異なる組合せを含み、ライブラリーの他の全ての抗体又はその部分から抗原結合部位を形成する。抗体又はその部分は、第二の組合せ抗体ライブラリーを生成するため精製する。

0056

更なる例において、第二の組合せライブラリーは、複数の抗体又はその部分を生成するため、アミノ酸変異を「HIT」に導入することによって生成される同定されたHITに基づいて提供する。第二の組合せ抗体ライブラリーの核抗体メンバー又はその部分は、その一次配列における1つ又はそれ以上のアミノ酸変異により、同定された「HIT」とは異なる。こうした例において、アミノ酸変異は、同定されたHITの相補性決定領域(CDR)にある。

0057

上記の各方法において、第二のヒト組合せライブラリーは、標的タンパク質と接触し、抗体及びその部分の標的タンパク質との結合及び/又はライブラリーの抗体又はその部分による機能的活性の調節を評価する。標的タンパク質に結合し、及び/又は標的タンパク質の活性を調節する抗体又はその部分を調節する抗体又はその部分を同定し、同定された抗体又はその部分を更なる「HIT」として表す。いくつかの例において、第二の組合せ抗体ライブラリーは、精製された抗体又はその部分がアドレス指定され、それぞれのアドレス内の精製された各抗体は同じ抗体で、他の全てのアドレスの抗体とは異なる、アドレス可能なライブラリーである。こうした例において、接触は、アドレス可能なアレイで行われ、「HIT」の同定は、そのアドレスによってわかる。例えば、スクリーニングは、マイクロウェルプレートといった空間アレイで行われる。

0058

上記で提供されるスクリーニングの例のいずれかにおいて、前記方法は、その方法の以前の反復法における前回の「HIT」と比較して、標的タンパク質の最適化された結合親和性を有し、及び/又は標的タンパク質に対し最適化される活性を有し、更なる「HIT」を同定するまで、その方法を反復的に繰り返す。
本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVH鎖、並びにVk及びJk又はVl及びJl生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVL鎖を含む抗DLL4抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1及びIGHV5又はIGHV6或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6及びIGHD5又はIGHD3或いは遺伝子及びその対立遺伝子で、並びにJH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又はIGHJ4或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Vk生殖細胞系セグメントはIGKV3で、並びにJκはIGKJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子で、Vl生殖細胞系セグメントはIGLV8又はIGLV5で、並びにJl生殖細胞系セグメントは、IGLJ1又はIGLJ4或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗DLL4抗体は、DLL4を結合し、及び/又はDLL4の活性を調節する。

0059

いくつかの例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02又はIGHV1-46*03或いはIGHV6-1*01又はIGHV6-1*02である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6-6*01、IGHD5-18*01、IGHD3-3*01又はIGHD3-3*02である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1*01、IGHJ4*01、IGHJ4*02又はIGHJ4*03である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGKV3-11*01又はIGKV3-11*02である。Jκ生殖細胞系セグメントは、IGKJ1*01である。Vλ生殖細胞系セグメントは、IGLV8-61*01、IGLV8-61*02、IGLV8-61*03又はIGLV5-48*01である。Jλ生殖細胞系セグメントは、IGLJ1*01又はIGLJ4*01である。例えば、本明細書で提供される抗DLL4抗体は、IGHV1-46*01、
IGHD6-6*01及びIGHJ1*01から蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGKV3-11*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖、IGHV5-51*03、IGHD5-18*01及びIGHJ4*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH並びにIGLV8-61*01及びIGLJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖、或いはIGHV6-1*01及びIGHD3-3*01及びIGHJ4*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGLV5-48*01及びIGLJ4*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含む抗体又はその部分である。本明細書で提供される抗DLL4抗体は、配列識別番号:1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1850で示されるアミノ酸を有するVL鎖、配列識別番号:1803で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1881で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖、或いは配列識別番号:1812で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1884で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含有する抗体を含むが、それらに限定されるわけではない。例えば、本明細書で提供される抗DLL4抗体の例は、配列識別番号:1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1850で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含む抗体である。抗DLL4に結合する十分な抗原結合部位を形成し、及び/又はDLL4の活性を調節する、上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含むいずれかの抗体も提供される。

0060

本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖及びVk及びJk生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含有する抗EpoR抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6又はIGHD3或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。Vk生殖細胞系セグメントは、IGKV4である。Jκは、IGKJ1である。本明細書で提供される抗EpoR抗体は、EpoRを結合し、及び/又はEpoRの活性を調節する。

0061

いくつかの例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02又はIGHV1-46*03である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6-6*01、IGHD3-10*01又はIGHD3-10*02である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1*01、IGHJ4*01、IGHJ4*02又はIGHJ4*03である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGKV4-1*01である。Jκ生殖細胞系セグメントは、IGKJ1*01である。例えば、本明細書で提供される抗EpoR抗体は、IGHV1-46*01、IGHD3-10*01及びIGHJ4*01から蓄積されるヌクレオチド配列によってコードされるVH鎖並びにIGKV4-1*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含み、或いはIGHV1-46*01、IGHD6-6*01及びIGHJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGKV4-1*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含む。抗本明細書で提供される抗EpoR抗体は、配列識別番号:1509で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖並びに配列識別番号:1838で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖、或いは配列識別番号:1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1838で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含有する抗体を含むが、それらに制限されるわけではない。抗EpoRに結合し、及び/又はEpoRの活性を調節する十分な抗原結合部位を形成する上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含有するいずれかの抗体も提供する。

0062

本明細書では、VH、DH及びJH生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖及びVk及びJk生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖を含む抗ErbB2抗体を提供する。VH生殖細胞系セグメントは、IGHV4又はIGHV1或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6及びIGHD1或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1又はIGHJ2或いは遺伝子及びその対立遺伝子である。Vk生殖細胞系セグメントは、IGKV3又はIGKV4である。Jκは、IGKJ1又は遺伝子及びその対立遺伝子である。本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、ErbB2を結合し、及び/又はErbB2の活性を調節する。

0063

いくつかの例において、VH生殖細胞系セグメントは、IGHV1-46*01、IGHV1-46*02又はIGHV1-46*03或いはIGHV4-31*01、IGHV4-31*02、IGHV4-31*03、IGHV4-31*04、IGHV4-31*05、IGHV4-31*06、IGHV4-31*07、IGHV4-31*08、IGHV4-31*09、IGHV4-31*10である。DH生殖細胞系セグメントは、IGHD6-6*01又はIGHD1-26*01である。JH生殖細胞系セグメントは、IGHJ1*01又はIGHJ2*01である。Vκ生殖細胞系セグメントは、IGHV3-20*01、IGHV3-20*02又はIGKV4-1*01である。Jκ生殖細胞系セグメントは、IGKJ1*01である。例えば、本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、IGHV4-31*02、IGHD1-26*01及びIGHJ2*01から蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH鎖並びにIGKV3-20*01及びIGKJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVL鎖、或いはIGHV1-46*01、IGHD6-6*01及びIGHJ1*01生殖細胞系セグメントから蓄積されるヌクレオチド配列によりコードされるVH並びに配列によりコードされるVL鎖を含む。本明細書で提供される抗ErbB2抗体は、配列識別番号:1760で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1833で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖、又は配列識別番号:1513で示されるアミノ酸配列を有するVH鎖及び配列識別番号:1838で示されるアミノ酸配列を有するVL鎖を含有する抗体を含むが、それらに制限されるものではない。抗ErbB2に結合する及び/又はErbB2の活性を調節する十分な抗原結合部位を形成する上記抗体のどれか一部を含む抗体も提供する。また、本明細書で提供される抗体のいずれかに比べ、配列において保存アミノ酸の変化を含むいずれかの抗体も提供される。

0064

本明細書で提供される抗体のいずれかは、重鎖及び軽鎖の会合を可能にするのに十分な定常領域又は一部の定常領域を更に含むことが可能である。例えば、本明細書で提供される抗体は、Fab抗体を含む。更に、本明細書で提供される抗体のいずれかは、10-6M、10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M又は10-12M又はそれ未満である、或いは大体そうである結合親和性を有する抗体を含む。例を挙げると、本明細書で提供される抗体のいずれかは、1 x 10-9M、2 x 10-9M、3 x 10-9M、4 x 10-9M、5 x 10-9M、6 x 10-9M、7 x 10-9M、8 x 10-9M、9 x 10-9M、1 x 10-10M、2 x 10-10M、3 x 10-10M、4 x 10-10M、5 x 10-10M、6 x 10-10M、7 x 10-10M、8 x 10-10M、9 x 10-10M又はそれ未満である、或いは大体そうである結合親和性を有する。

0065

本明細書では、本明細書で提供されるスクリーニング法で同定される抗体のいずれかを含む、本明細書で提供される抗体のいずれかを使用する処理方法を提供する。こうした抗体は、標的タンパク質の発現及び/又は活性と関連する疾患又は障害の治療に用いることができる。一例を挙げると、本明細書では、DLL4の発現及び/又は活性と関連する疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗DLL4抗体のいずれかを用いて、治療法或いは薬剤の扱い又は処方の用途を提供する。他の例において、本明細書では、EpoRの発現及び/又は活性と関連する疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗EpoR抗体のいずれかを用いて、治療法或いは薬剤の扱い又は処方の用途を提供する。更なる例において、本明細書では、ErbB2の発現及び又は活性と関連するし疾患又は障害を治療するため本明細書で提供される抗ErbB2抗体を使用する治療法を提供する。

0066

本明細書では、ヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実施するコンピュータデバイスによって実行可能で、コンピューターに読み込み可能な指示を含む、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体を含む。ヒト生殖細胞系セグメントの組合せ方法は、(a)利用可能な全ヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、(b)重鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列の集まり(5’-VH-DH-JH-3’)を生成するためアルゴリズムを適用することと、(c)カッパ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vk-Jk-3’)及び/又はラムダ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vl-Jl-3’)の集まりを生成するためアルゴリズムを適用することと、(d)得られた核酸配列がインフレームであるよう(b)の核酸配列のV−D及び/又はD−J結合部並びに(c)の核酸配列のV−J結合部でヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、(e)不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、(f)アドレス可能な構成の固有の位置に組み換えられた各核酸配列を割り当てることと、並びに(g)組み換えられた各核酸配列のアドレスを同定する出力ファイルを生成することとの段階を含む。コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体で実行される方法は、(h)段階(e)の後、制限酵素によって認識される配列を含む組み換えられた核酸配列の5'及び3'末端でヌクレオチドを追加することと、並びに(i)制限酵素によって認識される内部ヌクレオチドを除去するため、ヌクレオチドの置換によって組み換えられた核酸配列を修飾することとを更に含むことができる。前記方法は、細菌発現に対するコドン使用を最適化するため、組み換えられた核酸配列を更に修飾することができる。いくつかの例において、コンピュータシステム又はコンピュータ読み込み可能な媒体により実行される方法は、段階(f)の前に、配列の類似性及び相違性に基づいて、組み換えられた核酸配列のライブラリーから組み換えられた核酸配列を選択すること及び段階(f)のアドレス可能な構成における位置へ選択された配列のみを割り当てることを含み得る。

0067

本明細書では、コンピュータデバイスによってヒト生殖細胞系セグメントを組合わせる方法を実行するため、コンピュータ読み込み可能な指示の実行を含む方法を提供し、前記方法は、(a)利用可能な全てのヒト抗体生殖細胞系セグメント(VH、DH、JH、Vk、Jk、Vl及びJl)のユーザ作成のコンピュータによるデータベースにアクセスすることと、(b)重鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-VH-DH-JH-3’)の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、(c)カッパ軽鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vk-Jk-3’)及び/又はラムダ経鎖をコードする可能な全ての組み換えられた完全長の核酸配列(5’-Vl-Jl-3’)の集まりを生成するため、アルゴリズムを適用することと、(d)得られた核酸配列がインフレームであるよう、(b)の核酸配列のV−D及び/又はD−J結合部並びに(c)の核酸配列のV−J結合部においてヌクレオチドを修飾するためアルゴリズムを適用することと、(e)不注意に生成されたあらゆる停止コドンを除去するため、(d)の核酸配列を修飾することと、(f)アドレス可能な構成の固有の位置に組み換えられた各核酸配列を割り当てることと、並びに(g)組み換えられた各核酸配列のアドレスを同定する出力ファイルを生成することとの段階を含む。前記方法は、重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び/又はラムダ経鎖をコードする、組み換えられた核酸配列のDNA合成、或いは、重鎖をコードする、カッパ軽鎖をコードする、及び/又はラムダ経鎖をコードする、一部の組み換えられた核酸配列のDNA合成を更に含む。

図面の簡単な説明

0068

抗体の多様性を生成する方法の模式図。図1は、抗体の多様性がどうやって、組み合わせの多様性、様々組み合わせ、接合の多様性を含むんでいます。
抗体検出の反復法の模式図。図2aは、様々な可変重鎖および軽鎖をエンコードした拡散の列を生み出す重鎖及び軽鎖セグメントを組み合わせた1)のメソッド描写です。3)重鎖と軽鎖の表現関係性によって抗体の多元性を生み出す。抗体を純化する事で(ピッコロFLPC浄化を使用するなど)そして活動の為の(例えば束縛もしくは機能的な活動)抗体のスクリーニングをする事で抗体の精製を生み出します。図2bは、最適化されている、または活動の改善HITSアルゴリズムを識別するために識別される”HITS”に基づいてメソッドを繰り返し含むその他の関連抗体を識別するために反復法の描写です。
ベクトルマッププラスミド。図3は、プラスミドAの提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
プラスミドDのベクトルマップ。図4は、プラスミド開発、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
プラスミドCのベクトルマップ。図5は、プラスミドのC、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
プラスミドEベクターマップ。図6はプラスミドメール、提供し、ここで詳細に説明するの例示ベクトル地図です。
DNA塩基配列編集ソフトウェアの模式図モジュール。図7はDNA塩基配列編集ソフトウェア内に含まれている10モジュールを示しています。示すように、GUIグラフィカルユーザーインターフェイス)は、GUIコントロールコンパイルルールNCBIのツールを含む4つの層があります。加えて、モジュール間の関連が示されている。
アルゴリズム重鎖および軽鎖の組み合わせ。図8は、生殖細胞のセグメントのエンコーディングから、可変重鎖または可変軽鎖組換え核酸配列を生成するためのアルゴリズムの模式図である。
シーケンスをコンパイルするためのアルゴリズム。図9は、組換え核酸配列のエンコード機能可変重鎖または可変軽鎖変更するためのフローチャートである。
ランキングシーケンスのためのアルゴリズム。図10はラン組換え変数の多様性のスコアクラスタ情報に基づいて、重鎖および軽鎖のためのフローチャートである。
シーケンスデータベースファイル形式の模式図。図11は、配列データベースファイルの形式を示しています。財経部I制限部位(配列番号:1900)は、:図解はVH1 - 18(配列番号10)、 VH1-2 (配列番号:13)、 IGHD1-1*01 (配列番号:239)、 IGHJ1*01 (配列番号:273)、AI(配列番号:330)、 A10 (配列番号:354)、 IGKJ1*01 (配列番号:356)、 V1-11 (配列番号:365)、 V1-13 (配列番号:366)、 IGLJ1*01 (配列番号:442)、 IGLJ2*01 (配列番号:443)、を含む、典型的なシーケンスです。
DNA塩基配列編集ソフトウェアの初期起動画面。図12は、DNA塩基配列編集ソフトウェアの最初の起動画面を示しています。イラストは、5'末端配列CCATGGCA(配列番号:1901)、5'端シーケンスCCATGGCG(配列番号:1902)、3'端シーケンスCTAGC(配列番号:1903)および3'端シーケンスGTACT(配列番号番号:1904)。
DNA塩基配列編集ソフトウェアのスプラッシュ画面。図13は、アプリケーション起動時に表示されるスプラッシュ画面を示しています。
DNA塩基配列編集ソフトウェア96ウェルプレート画面。図14は、コンパイルされた配列を含むモデルを96ウェルプレートの画面を示しています。 Gnl・Fabrus・V3を- 4_IGLJ7 * 01(配列番号:1906)のシーケンスは、シーケンス情報]ボックスに示されています。
DNA塩基配列編集ソフトウェア軽鎖マニュアル編集画面。図15は、ユーザーがいずれかのカッパまたはラムダ軽鎖をコンパイルすることができますモデルマニュアルコンパイル画面を示しています。 VLのシーケンスボックスで選択されV1が- 11(配列番号:365)。 JLのシーケンスボックスで選択して、IGLJ1 * 01(:442配列番号)です。全長配列(配列番号:1914)のDNA配列のボックスに示されています。
DNA塩基配列編集ソフトウェア重鎖マニュアル編集画面。図16は、重鎖をコンパイルすることができますモデルマニュアルコンパイル画面を示しています。 VHのシーケンスボックスで選択されVH1 - 18(配列番号:10)。 DHのシーケンスボックスで選択して、IGHD1 - 1 * 01(:239配列番号)です。公団シーケンスボックスで選択して、IGHJ1 * 01(:373配列番号)です。全長配列(配列番号:1915)のDNA配列のボックスに示されています。
DNA塩基配列編集ソフトウェア軽鎖自動コンパイル画面。図17は、モデルの軽鎖の自動コンパイル画面を示しています。イラストは、配列番号:1880 - 1881年、1883年、1905年から1913年と1916年から1940年に記載され可変軽鎖の典型的なシーケンスです。
ライトチェーンBLASTグリッド。図18は、軽鎖配列のモデルBLASTのグリッドを示しています。イラストは、配列番号:1880 - 1881年、1883年、1905年から1913年、1916年から1939年に記載され可変軽鎖の典型的なシーケンスです。
DNA塩基配列編集ソフトウェア重鎖の自動コンパイル画面。図19は、モデルの重鎖の自動コンパイル画面を示しています。 1556、1760、1769、1821、1941年から1973年:図解は、配列番号933に設定された変数の重鎖の典型的なシーケンスです。
重鎖BLASTのグリッド。図20は、重鎖配列のBLASTのグリッドのモデルを示しています。図はSEQID NOS: 1530、1539、1974-1995の前にある様々な重鎖の典型的な列です。詳細な説明

0069

概要

0070

A定義
B.概観

0071

1アドレス指定可能な組合せ抗体コレクションを生成する方法
2結果としてのライブラリー
3ライブラリの応用
C.抗体
1抗体ポリペプチド
2抗体の構造と機能ドメイン
3抗体配列と特異
Dコンビナトリアル抗体ライブラリの生成メンバーのメソッド
1機能組換え生殖細胞の可変領域の製造方法
A可変遺伝子セグメント
i.生殖細胞セグメント
II変更された生殖細胞の種類別セグメント
B選択生殖細胞の種類別セグメントまたは変更されたセグメント及び
c.シーケンス編集
d.再結合された核酸分子のさらなるシーケンス変更
i.コドン使用
II制限酵素のサイトの追加または削除
IIIリンカー
IVタグまたは検出可能な部分
対変異の多様性
VI監督ペプチド
e大腸菌生成可変重鎖および軽鎖配列および核酸分子
i.貯蓄収集
II収集の決定配列の多様性
核酸アミノ酸配列
III核酸分子の生成
a)合成
b)組換え技術
f.表現およびその抗体または一部またはライブラリ内のメンバーの結果によるメンバーフラグメント
2オートメーション
a.使用者作成データベース
b.シーケンス編集
c.タンパク質の発現および精製の自動化
Eライブラリ
1 VHの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
2 VLの核酸ライブラリとベクトルのライブラリ等及び
3ペア核酸ライブラリまたはベクトルライブラリ等及び
4抗体ライブラリ
5アドレス指定可能なフォーマット
Aマルチウェルプレートプレート
B固体サポート
6その他の表示方法
Aセル表示
Bファージディスプレイ
c.mRNAの表示とリボソームディスプレイ
d. DNAの表示
F抗体の生産.メソッド
1ベクトル
2細胞発現システム
A原核生物の発現
B酵母
c昆虫
d哺乳動物細胞
e植物
3精製
Gアプリケーションとライブラリの使用
1結合分析
2機能活動
a分化
b遺伝子表現の交代
c細胞毒性活性
3ターゲット
膜結合タンパク質、受容体とリガンドより
iノッチとノッチのリガンド
a)ノッチタンパク質
b)DLL4
IErbBファミリー
上皮成長因子受容体(EGFR)
b)ヒト上皮成長因子受容体2(HER2/neu)
IIIIGF - R1が(インスリン様成長因子1受容体)
IV c - Met
VCD20 -Bリンパ球抗原
VIIエリスロポエチン受容体(Epo- R)
VIIIカドヘリン
a)P -カドヘリン(P-cad/CDH3)
IX CD44
4反復スクリーニング
5指向進化
aランダム突然変異誘発
i飽和突然変異誘発
IIエラーしやすいPCR
III細胞
IVDNAシャフリング/抗体鎖シャッフリング
VCDRワーキング
VIフレームワークの安定化
6エピトープマッピング
7同定された体内での試験
8製造/キット記事
9製剤/主管および抗体およびポリペプチドの使用
H例

0072

A定義
定義されている場合を除き、すべての技術および科学用語は、発明に属す芸術スキルによって理解されているのと同じ意味を有する。すべての特許、特許出願、公開されたアプリケーションや出版物遺伝子銀行シーケンス、データベース、ウェブサイトやその他の出版物、全体の開示はここで呼ばれます。イベントではこのセクションでは、これらが優先、ここでの情報開示全体を通じて言及されたその他出版された物、その他はそれら全体に言及により結合された。用語の定義が複数存在するイベントにおいて、このセクションは開示される。参照URLまたはそのような他の識別子またはアドレスにあった場合には、そのような識別子は変更することができますしインターネット上の特定の情報の行き来する事ができます、しかし同等の情報はインターネットを検索して見つけることができます。リファレンスはこのような情報の利用可能性をして公開普及を証拠としている。

0073

ここで使用されるように、”コンビナトリアルライブラリには、”ビルディングブロックの組み合わせに基づいて化合物のコレクションを生成するために交換可能な化学”ビルディングブロック”のさまざまな組み合わせを反応させることにより形成される化合物のコレクションを指します。抗体コンビナトリアルライブラリーについては、ビルディングブロックは、コンポーネントV、D、およびそこから抗体が形成されているJの領域(または変更されたフォームのもの)から出来ている。目的のためにここでは、”ライブラリ”または”コレクション”は同じ意味で使用されます。

0074

ここで使用されるように、結合抗体ライブラリーは、抗体のコレクション(またはファブなどその一部)であり、その抗体は、V、DおよびJ遺伝子セグメント、特にヒューマンV、DおよびJ生殖セグメントの組み合わせによって生成される核酸分子によってコードされています。結合ライブラリーここに典型的に約50の異なった抗体、(または抗体部分またはフラグメント)のメンバーまたは50、100、500、103、2× 103、3 × 103 4 × 103 5 × 103、6 × 103、7 × 103、8 × 103 9 × 103、1 × 104 2 × 104 3 × 104 4 × 104 5 × 104、6 × 104 7 × 104、8 × 104 9 × 104、 1 × 105 2 × 105、3 × 105倍105 5 × 105、6 × 105 7 × 105 8 × 105 9 × 105、106、107、108、109、1010、またはそれ以上の異なるメンバーを含んでいる。結果のライブラリーまたは抗体もしくはその一部のまたは全部のコレクションは、その標的タンパク質や変調機能活動の調整にバインドするためのスクリーニングされることができる。

0075

ここで使用されるように、人間の組み合わせ抗体ライブラリーは、抗体もしくはその一部の集まりで、それにより各メンバーがVLとVH鎖またはヒト生殖細胞のセグメントを含む核酸によってコードされる抗原結合部位を形成するためにまたはその十分な部分を含んでいます。

0076

ここで使用されるように、遺伝子のセグメント(Ig)の可変(V)、多様性(D)と接合部(J)または定数(C)の遺伝子を生殖細胞からのエンコード免疫グロブリン重鎖または軽(カッパとラムダ)鎖免疫グロブリンを参照してください。生殖細胞の中には複数のV、D、JおよびC遺伝子セグメントがあり、しかし遺伝子再構成結果それぞれの機能再編成の遺伝子で発生する唯一の1つのセグメントになる。たとえば、機能的に再編成の重鎖は、1つのV、1つのDと1つのJと機能的に再構成されたVとJを含む軽鎖遺伝子を配置した機能的なVとDを含んでいるそして1つのJそして機能的に配置された軽鎖。ここで、これらの遺伝子のセグメントは、生殖細胞で運ばれるそして機能遺伝子になるまで重鎖と軽鎖に移すことができない。。骨髄B細胞の分化中に、これらの遺伝子のセグメントがランダムに1010以上の種類を生み出す事ができる特異遺伝子システムの中からシャッフルされます。ここでの目的として、遺伝子のセグメントは組み合わせ、または個々の生殖細胞のセグメントのコンパイルによって試験管内で再配置されます。

0077

B変数生殖セグメントに言及すると、V、DとJのグループサブグループ、遺伝子や対立遺伝子そのに関連付けられています。遺伝子断片配列が知られているデータベースからアクセス可能で(例えば、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)、国際的免疫情報システム(R)(IMGT)、KabatデータベースとトムリンソンのVBaseデータベース(Lefranc(2003)核酸解像度、31: 307〜310; Martinら、治療用抗体、ワイリーVCHのハンドブック抗体工学のためのバイオインフォマティクスツール(2007)、頁104から107)表3-5リストは典型的な人間の変数生殖セグメントです。典型的な配列VH、DH、JH、V、J、VおよびまたはJ、生殖細胞のセグメントは、

0078

SEQID NOS:10-451と868の前にあります。その目的の為にここで、生殖細胞のセグメントは修正された配列を含む生殖細胞、そしてそれは方法の練習をする為に編集の列の法則とともに一致するよう修正された。例えば、生殖細胞の遺伝子セグメントは1つのアミノ酸欠如またはSEQ ID NOS:10-451, 868の前に置かれた核酸のどんな配列と比べても5'または3'への挿入を含んでいる。

0079

ここで使用されるように、ヌクレオチドの配列に言及される生殖細胞セグメントを参照して変更されたフォームは、例えば、ヒト生殖細胞のセグメントの配列の中にある配列と比べて2,3,4,5,6,7,8,9,または10核酸と異なっているように、1つもしくはちょっとした核酸の相違を含む核酸の配列を除く(例えばVH、DH、JH、Vk、Jk、VlそしてJl)ヒューマン生殖細胞セグメントのヌクレオチドの配列と大体同じような核酸の配列に言及されている。いくつかの例では、変更された生殖細胞系列は、終止コドン制限酵素サイトを削除、リーディング構造を維持する為に追加または削除されたヌクレオチドを移動させる法則を一致させるために修正されている。

0080

ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントのヌクレオチドを参照して反転シーケンスは、遺伝子のセグメントは、逆のヌクレオチドの基準シーケンス補数であるヌクレオチドの配列を有することを意味します。ここで目的のために、ヌクレオチドの基準シーケンスは生殖細胞のセグメントは、通常のDH生殖セグメントです。

0081

ここで、”編集”、”コンパイル”、”結合”、”組み合わせ”、”配置”、”転位”、または他の類似の用語や文法バリエーションを使用されるように、そのどのによる生殖細胞セグメントは核酸配列表現遺伝子に注文されるか組み立てられる。たとえば、変数の重鎖の生殖細胞のセグメントはVHのセグメントが5 で、DHセグメントが5で、JHセグメントにつながっている、それをコードする核酸配列VHのチェーンに行き着く。可変軽鎖の生殖細胞のセグメントは、核酸配列をコードするVL鎖の結果、VLのセグメントはJLのセグメントに5'である。。一定の遺伝子セグメントまたはセグメントもコードする核酸VHまたはVL鎖の3'末端に組み立てることができます。

0082

ここで使われたように、”結合した”もしくは”結合”もしくは他の文法上の分類は、それゆえ生殖細胞、そして生殖細胞への参加に言及される。リンケージは、直接または間接的にすることができます。生殖細胞系列のセグメントはセグメントと追加的なヌクリオイドまたは追加的なヌクリオタイドが枠組内セグメント全体に影響を与える為加えられたか、ヌクリオタイドが枠組みセグメントの結果を受けて消去されることがありうる。これは、リンカのヌクレオチドの選択は、結果の核酸分子はインフレームになるように、機能と生産性抗体をエンコードしたことが理解される。

0083

ここで使われたように、”フレーム内”や人間の生殖細胞のセグメントの結合を参照した”リンクされた枠”は、5コドン(ATG)ヌクリオタイド酸分子枠とそれにより作られた”生産的な”また機能的な十分な長さのポリペタイドお組み合わせによるヌクリオタイド生殖細胞セグメントの中にあります。ヌクレオチドの選択は、様々なVD、DJやVJのセグメントを結合するジョイント特に生殖細胞のセグメント、またV(D)接合にメソッドを与える規則と共に生殖細胞セグメントから挿入または消去される。たとえば、生殖細胞のセグメントはVHセグメント5からDH5セグメントへ、そしてそこからJHセグメントへ送られる。VHセグメント、例えば接合されたVDJセグメントが5開始コドン(ATG)とフレームであるようなJHセグメントに挿入または消去される。

0084

例えば生殖セグメントはVHセグメント5からDHセグメント5DHへそして、そこからJHセグメントのように送られる。
ここでは”機能的な抗体”または”生産性抗体”を使用しているように本明細書中で説明するコードする核酸抗体またはその一部抗体またはその一部はFabなどの方法によって生成される。機能や生産性の抗体では、V(D)J組生殖細胞のセグメント(つまり、並べ替え)のようなエンコードされた抗体またはその部分は切り捨てられていない/又はアミノ酸の配列が出て枠の外にないものはコンパイルされます。これは、核酸分子が内部終始コドンを含んでいない結果、タンパク質の翻訳機構の結果が途中でタンパク質の集合を終了することにつながる。
ここで使用されるように、抗体の一部は、結合部位の抗原を形成するのに十分なアミノ酸が含まれています。
ここで使用されるように、リーディングフレームは、連続と非オーバーラップの三塩基コドンのDNAまたはRNAの重複を指します。三コドンが1つのアミノ酸をエンコードするために、フレーム1、2または3読んで、特定の塩基配列の3つのリーディングフレームが存在しています。たとえば、シーケンスACTGGTCAはフレーム1を読むことでACTGGTCAになる、AC TGG TCAを読み取る事でフレーム2に、そしてACT GGTCAを読む事でフレーム3になります。

0085

ここで使用されるように、終止コドンは、翻訳中のタンパク質合成の停止を通知する三塩基配列、または黄色の停止を含むシーケンスは(コードするDNA配列のRNAの終止コドン配列など)は任意のシーケンスのエンコーディングを参照するために使用されるコドン(UAGを結またはTAG))、黄土色の終止コドン(UAAもしくはTAA))とオパール終止コドン(UGAまたはTGA))を含む。それは必要がないことをすべてのセルまたはすべての生物の翻訳の終止コドンの信号が止まるという意味で重要ではない。たとえば、少なくともいくつかの時間の1つ以上の終止コドン(アンバーサプレッサー株のオレンジ色の終止コドンなど)を通じて、オレンジ色抑制系統と部分的なアンバーサプレッサー株、翻訳の進行などの抑制ひずみ宿主細胞インチ

0086

抗体の可変ドメインを構成するポリペプチド鎖を参照する変数、(VH)鎖または可変光(VL)チェーン(VHのドメインまたはVLドメインとも呼ばれている)を参照し、様々なドメインの抗体を作ります。ここでの目的は、重鎖生殖セグメントはVH、DHおよびVHチェーンをエンコードした核酸の結果作られる。軽鎖の生殖細胞のセグメントは、VLまたはJLをとして指定され、カッパ及びラムダ軽鎖を含む(VkとJk;VlとJl)とコンパイル、その結果をコードする核酸のVL鎖により作られる。軽鎖チェーンはいずれかのカッパまたはラムダ軽鎖であることを理解され、しかしVkとJlのコンパイルの効果により、カッパ、ラムダのを含まない。
ここで使用されるように、”縮重コドン”親の塩基配列のコドンと同じアミノ酸を指定する3塩基のコドンを意味する。当業者の一つは、遺伝コードの縮重に精通しているコドンの縮退識別することができます。

0087

ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照した”グループ”とは、変数(V)遺伝子、多様性(D)遺伝子、結合(J)遺伝子または定数(C)をコードする遺伝子、すなわち免疫グロブリンからコアコーディング領域を参照にしている。生殖セグメントグループの例としては、VH、DH、JH、Vk、Jk、VlおよびJlが含まれています。

0088

ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照した”サブグループ”は、”塩基配列の類似性またはアイデンティティで定義されている列の集合を意味する。一般的に、サブグループは、特定の種で同じグループが[V、D、JまたはC]に属する遺伝子のセット、および共有している塩基配列レベルで少なくとも75%遺伝子配列です。サブグループは、IMGT命名法に基づいて分類されます(imgt.cines.fr;例えば、ラフランク(2008)バイオインフォマテクスブリーフィング、9:263-275)。一般的に、サブグループは多重遺伝子族を表します。

0089

ここで使用されるように、遺伝子の対立遺伝子は配列多型をコード領域内の1つまたは複数のヌクレオチドの違いリファレンス遺伝子配列(例えば置換、挿入または削除)と比較してのためにしている配列を生殖細胞を参照してください。したがって、同じサブグループに属しているIGの配列は、非常にそのコード配列で同様のことができるにもかかわらず高多型を示す。サブグループの対立は、2つの図の番号が続くアスタリスク(*)が付いてIMGT命名法に基づいて分類されます。例としては対立表3-5に記載されているVH、DH、JH、Vkは、Jk、VlおよびJlのセグメント生殖細胞の典型的な対立遺伝子。

0090

ここで使用されるように、生殖細胞のセグメントを参照して”家族”はアミノ酸配列の類似性またはアイデンティティで定義されている生殖セグメント配列のセットを指します。一般的に、生殖細胞の家族は、遺伝子のすべての対立遺伝子が含まれています。

0091

ここで使用されるように、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90または100ヌクレオチドの長さのヌクレオチドの任意の配列を意味する”指定されたDHセグメント”です。ヌクレオチドの配列は、VH鎖のCDR3領域の一部のコードには十分です。

0092

ここで使用されるように、V、Dまたは”生殖細胞のセグメントに由来する”J遺伝子セグメントへの参照は、組換えイベントによっては、V、DまたはJ生殖細胞の遺伝子に由来するVHまたはVLの核酸配列の対応するヌクレオチドをと一致します 。

0093

ここで使用されるように、抗体またはその一部またはその断片のV領域、D領域またはJ領域に言及される事で、対応するV、DまたはJの生殖細胞の種類別セグメントの遺伝子から派生し組換えのイベントによりヌクリオタイドにエンコードされたアミノ酸に一致する。
ここで使われたように、コレクション内の一意のメンバーの数を指し、ここでコレクション内のメンバーに対して”多様性”を使用している。したがって、多様性は、そのコレクションの類似ポリペプチドメンバーの間で、それぞれ異なるアミノ酸配列または核酸配列、の数を指します。たとえば、104の多様性を有するポリヌクレオチドのコレクションは、類似のポリヌクレオチドのメンバーの間で104の異なる核酸配列が含まれています。一例では、ポリヌクレオチドのコレクションを提供する/またはポリペプチドは、少なくともまたは102、103、104、105、106、107、108、109、1010以上の多様性を持っています。
ここで使用されるように、”多様性比は、”ライブラリの総数以上のライブラリ内の別のメンバー数の割合を指します。したがって、他のライブラリよりも多様性比のライブラリには、総数ごとに別のメンバー、全メンバーごとにこのように多くの多様性が含まれています。提供されているライブラリは、ライブラリが約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、0.91、0.92、0.93、0.94、0.95、0.96、0.97、0.98、または0.99のような、1に近い多様性比などの高度な多様性比を含みます。

0094

ここで使用されるように、”配列の多様性”は、核酸配列の類似性の表現を参照して配列アライメント、多様性のスコア、および/またはシーケンスクラスタリングを使用して決定されます。任意の二つの配列は、配列をサイドバイサイドを敷設し、配列の長さに沿ってすべての位置でヌクレオチド以内に違いを解析することにより、整列することができます。配列アライメントは、基本的なローカル配列検索ツールブラスト)、核酸を比較するためのNCBIのツールおよび/またはタンパク質配列使用してインスリコで評価することができる。配列アライメントのブラストの使用は、当業者に知られている。 ブラスト検索アルゴリズムは、2つのシーケンスを比較し、それぞれの統計的有意性が一致して計算されます(ブラストによる)。ほとんどお互いに類似しているシーケンスが最も低ブラスコアを持って変化させ配列に対し、高いブラストスコアが高くなります。

0095

ここで使用されるように、抗体は、自然にまたは部分的または完全に合成、そのような組換えとして、任意の部分は、その抗原を形成するのに十分な免疫グロブリン分子の可変領域の少なくとも一部を含有するものを含む、生産かどうかを、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの部分を指す結合部位。したがって、抗体またはその部分は、免疫グロブリンの抗原結合部位と相同または実質的に結合ドメインを有する任意のタンパク質が含まれています。たとえば、抗体は、(これはHとHを示すことができる')は、2つの重鎖を含む抗体を意味すると2つの軽鎖(示すことができるLとL')、各重鎖はフルレングスの免疫グロブリンできる場所重鎖またはその部分は、抗原結合部位を形成するのに十分な(しかし、重鎖を含む例えば、VHは、これらに限定されない、チェーン電圧VH - CH1の鎖とVH - CH1の- CH2の- CH3の鎖)、および各軽鎖はすることができますフルレングスの軽鎖またはprotionその(ただし、軽鎖を含む、例えば、VLの鎖とVL - CLは鎖に限定されない)抗原結合部位を形成するのに十分な。各重鎖(HとH')一軽鎖(LとLさんとペアのそれぞれ)。通常、抗体は、最小限の全部又は少なくとも(VH)が鎖および/または可変光(VL)の鎖可変重の部分が含まれています。抗体はまた、すべての定数または領域の一部を含めることができます。

0096

目的のためにここでは、抗体という用語は、完全長抗体およびその一部のような抗体フラグメントを含み、Fab、Fab'、F(ab')2、単鎖Fvs(scFv)、Fv、dsFv 、diabody、FDおよびFd、'Fabフラグメント、FdフラグメントおよびscFvフラグメントを断片化します。その他の既知の断片は、scFab断片ハストら、BMCバイオテクノロジー(2007)、7:14)に限定されていないものも含みます。抗体は、IgGIgMIgAIgDおよびIgEを含む任意の免疫グロブリンのクラスのメンバーを含んでいます。

0097

ここで使用されるように、完全長抗体は、2つのフルレングスの軽鎖(例えばVH - CH1- CH2- CH3のまたVH - CH1- CH2の- CH3- CH4)そして、2つのフルレングスの重鎖を有する抗体(VL- Cl)とB細胞と合成生産されて同じドメインを有する抗体を分泌する抗体によって生成されるヒト抗体などのヒンジ領域。

0098

ここで使用されるように、抗体フラグメントまたは抗体部分は、完全な長さよりも小さいですが、抗体いずれかまたは複数の例えば抗原結合部位を形成するのに十分なの可変領域の少なくとも一部が含まれている完全長抗体の任意の部分を参照して(例えば、1つまたはそれ以上のCDR)およびこのようにして結合特異性および/または完全長抗体の活性を保持し、抗体フラグメントは、例えば、全長抗体酵素処理によって生成される抗体誘導体だけでなく、総合的に含まれて組換え誘導体を作り出した。抗体フラグメントの例としては、以下のものだけに限られないが、Fab、Fab'、F(ab')2、単鎖Fvs(scFv)、Fv、dsFv、diabody、FDとFd'フラグメント(参照、例えば、メソッドの分子生物学、巻207:がん治療の方法とプロトコル(2003)のための組換え抗体、第1章p 3-25、キプリノグ)。フラグメントは、このようなジスルフィド結合ペプチドリンカーそして/またはペプチドリンカーとして一緒にリンクされている複数のチェーンを含めることができます。抗体フラグメントは、一般的に含まれている50アミノ酸および典型的な、少なくとも200アミノ酸を含んでいます。

0099

ここで使用されるように、Fvを抗体フラグメントは、1つの変数重いドメイン(VH)と一つの変数の光非共有結合相互作用によってリンクされている(VL)のドメインで構成されています。

0100

ここで使用されるように、dsFvは、VH - VLのペアを安定化させる人工分子間ジスルフィド結合とFvを指します。

0101

ここで使用されるように、FDのフラグメントは、可変ドメイン(VH)と抗体の重鎖のいずれかの定常領域ドメイン(CH1)の含有する抗体の断片である。

0102

ここで使用されるように、”Fab断片”は完全長抗体の一部を含む抗体フラグメントされていることなど、総合的に生産されている同じ構造を持つパパインとの完全な長さの免疫グロブリン、またはその断片の消化からの結果による組換えによるものです。 Fab断片は、(VLとCLの部分を含む)の軽鎖と様々なドメインの重鎖(VH)と重鎖(CH1)のいずれかの定常領域のドメイン部分から可変ドメインを含む別のチェーンが含まれている。;それは組換え製造されることができる。

0103

ここで使用されるようには、F(ab')2フラグメントは、総合的にpHが4.0から4.5、またはでペプシンと免疫グロブリンの消化の結果から、例えば、その抗体フラグメントである組換え、抗体と同じ構造を持って製作。のF(ab')2フラグメントは、2つのFabフラグメントが、ここで、各重鎖部分は、2つのフラグメントを結合ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含む追加のいくつかのアミノ酸が含まれ、それが組換え製造することができる。

0104

Fab'フラグメントはF(ab’)2フラグメントのひとつの重鎖の部分のの含有断片である。

0105

ここで使用されるように、scFVフラグメントは、共有結合を任意の順序でポリペプチドリンカによって接続された可変軽鎖(VL)および可変重鎖(VH)を含む抗体フラグメントを参照する。リンカーは、長さ2の可変ドメインは、実質的な干渉を受けることなくつながれているようです。典型的なリンカーは(グリシン-セリン)からいくつかのグルタミン酸またはLys残基が溶解度を高めるために分散したn個の残基である。

0106

ここで使用されるように、ダイアボディ二量体scFvです。ダイアボディは、通常、scFvsより短いペプチドリンカーを持っており、それらは優先的に二量体になります。

0107

本書で使用されるように、hsFvはヘテオダイメリックコイルドコイルドメイン((2001)Jモルバイオル7:312: 221-228参照)、に代用されてきた通常Fab断片中に存在する抗体断片に言及される。

0108

ここで使用されるように、ポリペプチドのドメインは構造的および/または機能的に区別や定義されていること(3つ以上のシーケンス、通常5または7またはそれ以上のアミノ酸)、は構造的に、そして/または機能的に分類、または定義づけできます。典型的なポリペプチドドメインはポリペプチドに一部であり、1つまたは複数の構造モチーフαヘリックスの例の組み合わせおよび/またはβ鎖ループ領域で接続)および/から成るポリペプチド内で独立して折返し構造を形成することができるまたはポリペプチドの一部で酵素活性や抗原結合などの特定の機能活動によって認識される。ポリペプチドは、1つ、通常1つ以上持つことができます。例えば、ポリペプチドは、1つまたは複数の構造ドメインと1つまたは複数の機能ドメインを持つことができます。単一のポリペプチドドメインは構造と機能に基づいて区別することができます。ドメインは、アミノ酸の連続した直線配列包含することができます。また、ドメインは非ポリペプチドのアミノ酸のリニアシーケンスに沿って連続している非連続するアミノ酸の部分は、複数の包含することができます。典型的には、ポリペプチドは、ドメインの複数含まれています。たとえば、各重鎖および抗体分子の軽鎖は、(Ig)のドメインは、長さ各約110個のアミノ酸免疫グロブリンの複数含まれています。

0109

ここで使用されるように、免疫グロブリンドメインの構造によって区別されるアートによって認識されているドメイン、それはそれぞれに逆平行βストランド2つのβ-プリーツシートが含まれ、免疫グロブリンは、(Ig)の折りと呼ばれるアミノ酸のループによって接続されています。イグ倍の2つのβシート疎水性相互作用と保存内鎖ジスルフィド結合によって一緒に挟まれています。抗体チェーン内の個々の免疫グロブリンドメインは、さらに機能に基づいて区別することができます。重鎖は、1つの変数領域のドメイン(VH)と3つまたは4つの定常領域ドメイン(CH)を含んでいますが例えば、軽鎖は、1つの可変領域ドメイン(VL)および一定常領域ドメイン(CL)は含まれています。各VL、CLは、VHの、およびCHドメインは免疫グロブリンドメインの例です。
ここで使用されるように、抗体を参照した”変数のドメイン”は別の抗体の間で変化するアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖の特定の免疫グロブリンのドメインです。各軽鎖と、各重鎖(VL、VH)を一つの変数領域のドメインを持っています。可変ドメインは、抗原特異性を提供するため、抗原認識に関与している。各変数の領域は抗原結合部位のドメインとフレームワーク領域(FRS)の一部であるCDRを含んでいます。

0110

ここで、”可変領域”、”HV”、”相補性決定領域”と”CDR”と”CDR抗体が”一緒に抗原が結合形成する各変数の領域内の複数の部分のいずれかを参照するために交換可能に使用される使用されるように抗体のサイトです。各可変領域ドメインがCDR1、CDR2および、CDR3という名前の3つのCDRが含まれています。3つのCDRは、ノンリニアのアミノ酸配列に沿って連続しているが、折りたたまれたポリペプチドに近接している。 CDRは可変ドメインのβシートの並列鎖を結合ループ内に位置しています。

0111

ここで使用されるように、フレームワーク領域(FRS)は、βシート内にある抗体可変領域ドメイン内のドメインです。FRの領域は超可変領域よりも、そのアミノ酸配列の用語では、比較的多く保存されています。

0112

ここで使用されるように、定常領域のドメインは、比較的多くの可変領域ドメインよりも抗体の間で保存されているアミノ酸の配列が含まれている抗体の重鎖または軽鎖のドメインです。各軽鎖は、各重鎖は、CH1、CH2、CH3とCH4、1つまたは複数の重鎖定常領域(CH)のドメインを含む単一の軽鎖定常領域(CL)をドメインとしています。IgEおよびIgM抗体は、CH1、CH2のCH3とCH4が含まれている中にフルレングスIgA、IgDおよびIgG抗体アイソタイプは、CH1の、CH2のCH3およびヒンジ領域が含まれています。 CH1とのCLのドメインがこのように抗原と回転抗体腕のとの相互作用に貢献し、抗体分子のFabアーム拡張します。抗体の定常領域は、例えば、様々な細胞、生体分子組織との相互作用を介して特別に結合する抗体である病原体毒素の抗原の消失のような、とはいうものの、に限ったことではないがに効果的な昨日を持っている。

0113

ここで使用されるように、ヒト化抗体は、ヒトへの投与に、免疫応答を引き起こすしないようにアミノ酸の”ヒューマン”シーケンスを含むように変更される抗体を参照にしている。このような抗体の調製方法が知られている。たとえば、抗体は、非可変領域のアミノ酸組成物は、ヒト抗体に基づくことができます。コンピュータプログラムは、そのような領域を識別するために設計されています。
ここで使用されるように、”抗原結合部位”は1つ以上の相補性決定領域(可変領域と呼ばれるCDR)によって形成されたインターフェイスに関連付けられています。それぞれの抗原結合部位は重鎖可変領域から3つのCDRと軽鎖可変領域から3つのCDRが含まれています。抗体分子は、2つの抗原サイトと、重鎖可変領域および軽鎖可変領域の部分の各々を含む部分サイトを持っています。結合抗原はCDRに加えて、可変領域ドメインの他の部分を含めることができます。

0114

ここで使用されるように、”抗原結合部位を形成するのに十分である抗体または部分”への参照する事は、抗体またはその部分が、少なくとも全6CDRを含む対応する完全長抗体の結合特異性の少なくとも一部を保持する少なくとも1、2、3、4、5または6 CDRのVHとVLが含まれていることを意味します。一般的には、少なくとも十分な抗原結合部位は重鎖(CDRH3)のCDR3が必要です。これは、通常より軽鎖(CDRL3)のCDR3が必要です。ここで説明するように、当業者の一人はKabatまたはChothiaの番号に基づいてCDRを識別することができる事を知っている。(例、Kabat、EAら等(1991)シーケンス免疫インタレスト、第5版、米国保健局との蛋白質のヒューマンサービス、NIHの公報91から3242、およびChothiaの、C.ら(1987)j.Mol.Biol.196:901-917を参照)。たとえば、Kabatの番号に基づいて、CDRは- LIは残りL24を- L34に対応しています。CDRは- L3は、残りL89 - L97に対応しています;CDR - L2は残りL50と- L56に対応しCDR - H1は残りH31 - H35、35aや35b等長さに応じて対応しています;CDR- H2は、残基にH50 - H65を対応し、CDR - H3が残基H95 - H102に対応しています。

0115

ここで使用されるように、”ペプチド模倣”はポリペプチドの活性を模倣するペプチドである。たとえば、エリスロポエチン(EPO)はペプチド模倣は、このようなEPOの受容体と結合活性化のためにEPOの活性を模倣するペプチドである。

0116

ここで使用されるように、最適化された抗体は、抗体、またはその一部、およびリファレンス抗体と比較して/または改善された機能的活性を標的タンパク質のための改良結合親和性を有するに関連付けられています。典型的には、抗体は、1つまたはそれ以上のアミノ酸の変更(アミノ酸の欠失、置換または挿入)は、1つまたは複数のアミノ酸の変更を含むまない親抗体と比較によって最適化されています。一般的に、活動や結合親和性は(例。変更を含んでいないヒット生殖細胞等)親抗体の結合調和と比較され約1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8、9、10倍倍-、20倍の倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、200倍、300、400倍倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1000倍以上に増加しています。

0117

ここで使用されるように、対応した残りに言及した対応、たとえば、”対応するアミノ酸残基”は、(例。対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体など)連続した関係である2つのポリペプチド間で比較残基に参考した。ポリペプチドの間で対応する残基を識別することが容易にできる芸術の中にあるスキルです。たとえば、ガイドとして保存された同一のアミノ酸を使用して、対応する残基を識別することができる当業者のいずれかでエンコードされた領域の配列を整列があります。当業者の一つは、手動またはシーケンスを整列させることができる多数の整列プログラムを用意し(例えば、BLAST)のいずれかを使用することができます。したがって、アミノ酸残基またはお互いに対応する位置は、指定された基準ポリペプチドと/または構造アラインメントに基づいて対応するように決定されるそれらの残基があります。

0118

ここで使用されるように、コンセンサス配列は、(例。対立遺伝子変異体、同じファミリーの遺伝子、種の変異体など)に関連する配列の複雑性提携したとき、各位置に、最も頻繁に発生する残基である残基を含む統計配列です。したがって、コンセンサス配列は、ほとんどのそれぞれの位置でアライメントの豊富な残基を表しています。目的のためにここでは、例えば、生殖細胞の配列、またはその一部は、コンセンサス生殖細胞系配列を生成するために整列することができます。

0119

ここで使用されるように、ライブラリ内の軌跡はメンバーまたはライブラリのメンバーを含めることができる場所や位置に関連付けられています。位置が物理的な位置にする必要はありません。たとえば、コレクションが固体支持体上に配列として提供されている場合、支持体は配列のメンバーを表すことができる場所を含みます。

0120

ここで使用されるように、アドレスは、アドレスのメンバーが(例、抗体など)を識別することができる一意のコレクション内の各遺伝子座の識別子に関連付けられています。アドレス部分は、その軌跡や場所のおかげで識別することができるものです。アドレッシングは、このようなウェルのマイクロプレートのように、表面上の位置で行うことができる。たとえば、マイクロウェーブプレートのたんぱく質の為のアドレスはF9であり、それはマイクロウェルプレートでの列9に配置されていることを意味します。アドレッシングはバーコードやその他の記号、化学タグ、電子、このようなRFタグカラータグ、他のそのような識別子を使用してエンコードされたタグなど、他の識別子で行うことができる事にも対応する。

0121

ここで使用されるように、配列は3つ以上のメンバを含む抗体などの要素のコレクションを指します。

0122

ここで使用されるように、”空間的配列は、”メンバーが区切られている、または配列内の異なる領域を占めている配列です。したがって、空間的配列は、アドレス指定可能な配列の型があります。空間配列の例としては、プレートの各ウェルには、配列内のアドレスでマイクロタイタープレートが含まれています。例えば、空間配列は前記異なる複数の分子を任意の配置が含まれているような異なった分子の複雑性の中に配列された中に含まれます。配列は48ウェル、96ウェル、144ウェル、192ウェル、240ウェル、288ウェル、336ウェル、384ウェル、432ウェル、480ウェル、576を含めることができます - また、672ウェル、768ウェル、864ウェル、960ウェル、1056ウェル、1152ウェル、1248ウェル、1344ウェル、1440ウェル、または1536ウェルプレート、チューブ、スライド、チップ、フラスコ、または他の適当な実験装置などのマイクロタイタープレートプレートを含みます。

0123

ここで使用されるように、アドレス指定可能なライブラリは、コレクションの各メンバは、そのアドレスの美徳によって識別された抗体などの核酸分子または蛋白質剤などの分子の集合です。

0124

ここで使用されるように、アドレス指定可能な配列は、配列のメンバの美徳、またはそのようなもマイクロタイタープレート、固相支持体上に自分のアドレス、空間配列内の位置によって識別される色、蛍光電気信号(すなわち、高周波、実質的に関心のある分子の相互作用を変更しない電子レンジや他の周波数)、バーコードやその他の記号、化学的又は他のそのようなラベルとして識別または検出可能なラベルです。
したがって、一般的には配列のメンバは、固相の表面上に特定の遺伝子座で配置されている直接または間接的にリンクされているもしくは微小粒子又はその他のサポート貼付されてなど(以下と呼ばれるビーズ)を、溶液中で休止し、又は表面に広がる添付物のような特定のラベルに関連付けられている。

0125

ここで使用されるように”アドレスの組み合わせ抗体ライブラリー”は空間配列内の位置などのまたは固体支持体、または化学または識別子、抗体のコレクションを参照するRFタグでのような抗体同一で特定されるのと同じと確認できるすべての抗体です。”アドレスアレイの組み合わせ抗体ライブラリー”への参照は、抗体のメンバーは、配列で扱われることを意味します。

0126

ここで使用されるように、サポート(行列のサポートマトリックス不溶性担体または固体支持体ともいう)は任意の固体又は半固体または不溶性のサポートを参照して興味のある分子は、通常生体分子、有機分子生体特異的リガンドはリンクされているか、結合した。このような材料は、親和性マトリックスとして使用されているか、化学、生体分子の合成などの分析のためにサポートしていますが、これらに限定されない任意の素材が含まれている:ポリスチレンポリカーボネートポリプロピレンナイロンガラスデキストランキチン、砂、軽石アガロース多糖類デンドリマーバッキーボールポリアクリルアミドシリコンゴム、固相合成、親和性の分離と精製、ハイブリダイゼーション反応イムノアッセイ等の用途のための担体として使用される他の材料。ここでは母体は、微粒子やマイクロタイタープレート皿・くぼみガラススライドシリコンチップニトロセルロースシートナイロンメッシュ、または他のそのような材料などの連続的な表面の形態にすることができます。ときに、通常の粒子が5から10ミリメートルの範囲以下の少なくとも1つのディメンションを持っています。このような粒子は、”ビーズ”と言われ、しばしば、必ずではないですが、球形をしていますこのような参照は、しかし、ランダムな形状、針、繊維を含む、任意の形状とすることができる行列のジオメトリを、制約されず、伸長した。特に、大体球状の”ビーズ”は、液相中で使用することができ、注目されている。 “ビーズは”磁石を使用して分離するために、追加のコンポーネントとして長いメソッドと分析本と干渉しないように(例。ダイナビーズ(R)(ダイナル、オスロ、ノルウェー)などを参照してください)磁性または常磁性粒子のような追加のコンポーネントを含めることができます。

0127

ここで使用されるように、行列やサポート粒子は離散的な粒子の形態であるマトリックス材料を意味する。粒子は、任意の形状と寸法が、通常は100ミリメートル以下、50ミリメートル以下、10 mm以下、1mm以下、100μm以下、50μm以下、そして典型的なサイズは100立方ミリメートル以下、50立方ミリメートル以下、10立方ミリメートル以下、1立方ミリメートル以下、100μm3以下の大きさであり、立方ミクロン命令することができます。このような粒子は、総称して”ビーズ”と呼ばれます。

0128

ここで使用されているように、研究と実験を参照したシリコは、コンピュータを使用して実行を行った。 シリコでの方法は、以下に分子モデリング研究を、生体分子のドッキング実験、分子構造仮想表現、そして/または、プロセス、分子間相互作用などに限定されない。目的のためにここでは、ライブラリの抗体のメンバーは、コンピュータにそれらの入力の中から成分V、DおよびJの生殖細胞のセグメントを選択し、合成出力するには、フレームに核酸分子のリストを表示して、それらを結合するコンピュータプログラムを使用して設計することができる。したがって、コレクションまたはここて与えられたライブラリ中の抗体のコンポーネントの再結合がそうするための規則が含まれているソフトウェアと一致して、各ビルディングブロックの塩基配列を組み合わせることにより、シリコ内で行うことができる。プロセスは、コンピュータを使わずに手動で実行されるがコンピュータは速度の利便性を提供しています。

0129

ここで使用されるように、データベースはデータ項目のコレクションに関連付けられています。ここでの目的は、データベースの参照は抗体遺伝子配列の配列と構造情報の収集を提供する抗体のデータベースを参照しています。典型的な抗体のデータベースが含まれ、IMGT(R)、国際的な免疫情報システム(imgt.cines.fr例。レフランクその他(2008)、バイオインフォマティクスのブリーフィング、9:263-275を参考。)、ナシナルセンターバイオテクノロジー情報(NCBI)、カバットデータベースとトムリンソンのVベースデータベース(レフランク(2003)核酸研究所、31:307-310;マーティンら、治療用抗体、ワイリー-VCH(2007),ページ104-107)。データベースは、任意の配列を含むようにユーザーが作成することができます。データベースは、配列は、所望の形式で入力されるように作成することができます。(特にリーディングフレームの例;終止コドンを欠けている。シグナル配列を欠いている。)データベースはまた、抗体の配列に加えて、配列を含むように作成することができます。

0130

ここで使用されるように、”コンピュータベースのシステム”とは、ハードウェア、ソフトウェアを参照してデータ記憶媒体とメソッドは、生殖細胞のセグメントを再結合に使用されます。コンピュータベースのシステムの最小ハードウェアは、ここでは、中央処理装置(CPU)、入力の平均は、出力手段と記憶手段にデータが含まれて提供されます。熟練の方法およびシステムで使用するために適切なコンピュータベースのシステムを選択することができる職人はここで提供されます。

0131

ここで使用されるように、”記録”はコンピュータ読み取り可能な媒体に情報を格納するためのプロセスを参照にします。熟練した当業者は容易に配列の画像データをコンピュータ読み取り可能な媒体に情報を記録するための現在知られているのいずれかの方法を採用することができます。データストレージ構造の選択は、一般的にメディアプラットフォーム格納されている情報にアクセスするために選択に基づいて作成できます。また、データ処理プログラムや様々なフォーマットは、コンピュータ可読媒体上の羅列イメージ情報を格納するために使用することができます。画像情報は、マイクロソフトワード(R)、グラフィックファイルまたはASCIIファイルの形で表されているもの、DB2 (R)、Sybase(R)、Oracle (R)などのデータベースアプリケーションに格納され次のような市販のソフトウェアでフォーマットされたワープロテキストファイルで表すことができます。熟練した当業者は、情報や指示は、ここに記載記録されたその上を有するコンピュータ可読媒体を得るために、形式(例、テキストファイルまたはデータベース)構造化データプロセッサの任意の数を調整することができます。

0132

ここで使用されるように、”スクリーニング”がコレクションまたは抗体のライブラリーおよび/またはその部分で、アクティビティまたはプロパティ抗体またはその一部の決定に基づいています。スクリーニングは、例えばターゲットタンパク質の活性の変調を評価する機能評価試験により抗体からターゲットプロテインの評価に直接結びつく(例。結合親和性)抗体の結合を評価します。

0133

ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および/または標的タンパク質の機能活性の変調、または標的タンパク質に向かった抗体の活動を反映する他の尺度に関連付けられています。
ここで使用されるように、標的タンパク質に対する活性は、結合特異性および/または標的タンパク質の機能活性の変調、または他の測定標的タンパク質その向かって抗体またはその一部の活動を反映するに関連付けられています。

0134

ここで使用されるように、期間評価はここで抗体またはその標的タンパク質の割合のおよび/または変調標的タンパク質の活性の抗体まとの結合の絶対値を取得するという意味での定量的および定性的な判断を含むものとする評価用語を使用されるように、インデックス、比、割合、視覚的またはその他の値を結合または活動のレベルの他の価値評価を量的にまた質的に決めることを含む事を意図しています。評価は、直接または間接的にすることができます。たとえば、束縛は直接検出可能なラベルとその抗体またはその一部のラベルを貼ることによって、あるいは自分自身にラベルが付いていることが二次抗体を用いて決定することができます。加えて、機能の活動は当業者に知られている評価の種々のいずれかを使用して決定することができ、例えば、増殖、細胞毒性そして、ここで説明され不在対存在下で標的タンパク質の活性の比較があります。

0135

ここで使用されるように、”標的タンパク質”は抗体もしくはプローションの理由により調整された活動そして/または特に抗体もしくはその部分の認識されるタンパク質やペプチドに言及されます。標的タンパク質は、任意のペプチドまたはタンパク質抗体の認識エピトープが含まれているものが含まれています。標的タンパク質が病気や障害の発現または活性のおかげでの病因に関与するタンパク質が含まれています。典型的な標的蛋白質はここに記載されています。

0136

ここで使用されるように”ヒット”はスクリーニング評価の中で活動しているとして認識または選ばれた抗体またはその一部を参照にします。

0137

ここで使用されるように、スクリーニングに続く”繰り返し”がその活動を最適化されるか、もしくは前の繰り返しと比べ改善されると分かるまで、2、3、4、5回以上繰り返されます。

0138

ここで使用されるように、”高い情報処理”は大規模な方法、もしくは大きな数の分子を巧みに扱い、一般的に構成の10、100、1000を構成する事を許可する過程に言及されます。
たとえば、精製およびスクリーニングの方法は、高スループットレンダリングすることができます。ハイスループット法は、手動で実行することができます。しかし、一般に、高スループットの方法は自動化、ロボットやソフトウェアを含みます。

0139

ここで使用されるように、”構造/活性関係SAR)”は構造と機能分子の間の関係を指します。目的のためにここで、構造体は、例えば、ヌクレオチドのエンコーディングの配列抗体は、配列を参照しています。ライブラリメンバをアドレスのおかげで、そのアドレスに基づいて知られており、そのシーケンスで各抗体を識別します。したがって、構造が知られている特定のアクティビティに関連付けることができます。したがって、SARは活性構造の変化の影響を評価するために使用することができます。

0140

ここで使用されるように、”機能的活動が”ポリペプチド(標的タンパク質など)またはその全長(完全)タンパク質に関連付けられている部分の活動を参照します。機能の活動には、以下に具体的には、生物学的活性触媒や酵素活性、抗原性(抗ポリペプチド抗体に結合するためのポリペプチドと競合するかに結合する能力)、免疫原性多量体を形成する能力、能力に限定されていない受容体またはリガンドポリペプチドおよびシグナリングと下流のエフェクター機能にバインドします。目的のためにここで、ライブラリ、その中の抗体またはその一部のポリペプチドの機能活性の変調(すなわち、活性化や抑制)本ポリペプチドの機能活性が変更されていること、または抗体の存在下で、変更がない場合と比較して意味抗体またはその部分として、ここでは”調節”や”変調”と、その抗体の効果やその一部、標的タンパク質の機能活性誘導または活性の増強などの活動の増加を意味するのを参照して他の様々な文法形式を使用しても標的タンパク質の1つまたは複数の活動を阻害するとしています。したがって、変調は、アクティビティ(つまり、アップ規制アゴニスト活性)活性の低下(すなわち、ダウン規制や抑制)や周期、周波数の変化などの活動(任意のその他の変更の増加を含めることができる時間、速度、またはその他のパラメータ)を含んでいます。変調には文脈に依存した、典型的に変調を意味のある文章と比較されることができ、例えば、野生型の蛋白質、構成状態のタンパク質、またはタンパク質が指定されたセルの種類や状態に表される。抗体またはその部分によって標的タンパク質の機能活性の活動に比べて10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%以上で調整することができます。

0141

ここで使用されるように、”アゴニスト”、または誘導するそれ以外の場合は、シグナル伝達活性または受容体の他の機能活性を増強する、抗体またはその部分のシグナル伝達や増強による受容体の他の機能活性を調節ように関連付けられています。アゴニストは、可能な信号伝達又は単独で使用するだけで配位子と比較して受容体によるシグナル伝達を強化する受容体または他の受容体刺激天然リガンドの存在下でのシグナル伝達やその他の機能活性を変更することができる他の機能活性を調節します。

0142

ここで使用されるように、”アンタゴニスト”は、抗体またはその一部をブロックしたり減少しシグナル伝達活性または受容体の他の機能活性することによってシグナル伝達や受容体の他の機能活性を調節するを参照します。

0143

ここで使用されるように、ラベルはラベルを添付するか、または分子またはこれに準ずるに直接または間接的にリンクされている検出可能なマーカーです。検出方法は、当技術分野で知られている任意のメソッドを指定できます。

0144

ここで使用されるように、結合活性は、例えば、分子の特性を参照にしています。ポリペプチドは、1つまたは複数の結合パートナーをバインドするかどうか、および方法について説明します。バインディングの活動は結合パートナーに結合する能力を含め、(例。高い親和性など)結合パートナーに結合する親和性であり、結合パートナーとの結合の強さ及び拘束力パートナーと結合する特異性を含んでいます。

0145

ここで使用されるように、”親和性”または”結合親和性”とは、抗体分子またはその部分を、標的タンパク質または抗原上のエピトープに結合する強さを指します。親和性は、しばしば定数(KA)を、または平衡解離(KD)を一定の平衡協会によって測定されます。低親和性抗体 - 抗原相互作用が弱く、分子が高親和性抗体- 抗原結合を強いている間分子は長い時間にバインドされたまま、急速に解離する傾向があります。高い抗体親和性抗体は、具体的に平衡結合定数を使用してターゲット蛋白質に結合することを意味する(KA)を大きいか等しい106 M-1, 大きいか等しい 107 M-1, 大きいか等しい 108 M-1, or大きいか等しい109 M-1, 1010 M-1, 1011 M-1 or 1012 M-1.抗体はまた平衡解離定数(KD)によって特徴付けられ、例えば10-4 M, 10-5 M, 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-10 M, 10-11 M or 10-12 M かそれ以下です。一般的に、抗体は、定数が高親和性抗体とみなされるナノモルまたはサブナノモルディソシエーションを有します。このような親和性は容易にこのような平衡透析により、従来の技術を用いて決定することができます。ラジオイムノアッセイ放射性標識を使用して、ターゲット抗原;または当業者に知られている別の方法でメーカーの説明一般的な手順を使用して、ビアコア2000装置を用いています。親和性のデータがスキャッチャードらの方法により、分析することができます。例。アンニューヨークAcad。SCL、51:660(1949)。

0146

ここで使用されるように、”エピトープは”抗原またはタンパク質抗体により認識されるの表面にローカライズされた領域を表します。ペプチドエピトープは、連続エピトープまたは不連続エピトープているものが含まれます。エピトープは、一般的に線形のアミノ酸配列とは対照的にタンパク質の立体構造によって決定されます。

0147

ここで使用されるように、”エピトープマッピング”は、抗体 -抗原認識の分子決定因子の同定のプロセスです。

0148

ここで使用されるように、基本的なローカル配列検索ツール(BLAST)は、例えばアイデンティティの列の上に基づき、それぞれ検索たんぱく質やDNAデータベースにアルスチュルら(1990)によって調査されたものです。例えば、ブラストンは、塩基配列データベース(遺伝子銀行の例)に対して塩基問合せ配列を比較するプログラムです。 ブラストピーは、蛋白質配列データベースに対してアミノ酸問合せ配列を比較するプログラムです。

0149

ここで使用されるように、BLASTのビットスコアはギャップと各整列順序に関連付けられている置換数から算出した値です。スコアが高いほど、より重要な位置にあります。

0150

ここで使用されるように、人間のタンパク質は、そのすべての対立遺伝子変異保守的なバリエーションを含むヒトのゲノム中に存在するDNAなどの核酸分子によってコードされる一つです。変更は、野生型や人間のタンパク質の顕著な配列に基づいている場合はバリアントまたは修正は蛋白質のヒトタンパク質です。

0151

ここで使用されているように”自然に生じるアミノ酸”はポリペプチドで発生する20 L -アミノ酸を参照にしています。残基はヒューマンの中のその同族mRNAのコドンとtRNAの分子の特異的認識による蛋白質に組み込まれている自然の中で発見された20のα-アミノ酸である。

0152

ここで使われているように、非天然アミノ酸が遺伝的にエンコードされていないアミノ酸を参照に発生して、使用することはできません。たとえば、非天然アミノ酸は構造を天然アミノ酸に似ている構造と反応性天然アミノ酸を模倣する構造的に変更されている有機化合物です。非天然アミノ酸はこのように、例えば、アミノ酸または20個の自然発生アミノ酸以外のアナログアミノ酸を含みますが、これだけのアミノ酸は、D −イソタレノマーに限定されません。含まれて発生する典型的な非天然アミノ酸は、当業者に知られています。

0153

ここで使用されるように、核酸、ペプチド核酸(PNA)とそれらの混合物を含む、そのDNA、RNA、および類似体が含まれています。核酸は、単一の二重鎖することができます。プローブまたはプライマー、必要に応じてラベル付けされて、このような蛍光灯放射性単一分子が意図されている本などの検出可能なラベルと同じように参照する場合塾考されます。このような分子は、ターゲットが統計的に一意になるように、またはプローブやライブラリをプライミング用の低コピー数(通常5以下、一般的に3未満)の通常の長さのものです。一般的にプローブまたはプライマーは配列の少なくとも14、16または30の連続ヌクレオチド相補的な、または関心のある遺伝子と同じが含まれています。プローブおよびプライマーは、10、20、30、50、100以上の核酸の長さになることがあります。

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