図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2016年7月14日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題

修飾された免疫グロブリン重鎖配列を有する非ヒト動物を提供すること。

解決手段

再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウスまたはラットが提供される。再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、重鎖または軽鎖定常領域核酸配列作動可能に連結され得る。また、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結され得る、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物も記載される。また、重鎖の不在下で抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得するための方法も提供される。

概要

背景

二重特異性抗体は、2つの別個抗原決定基に結合することができる抗原結合部位を含む多機能性抗体であり、癌を含む多くの疾患を治療するための主要な治療用生物製剤のうちの1つとして現れた。近年、二重の抗原結合特性を有する多様な二重特異性抗体が開発されてきたが、従来の二重特異性抗体では、重鎖かまたは軽鎖かのいずれかの可変ドメインのみが各抗原決定基への結合に寄与しているのに対し、標準的な抗体では、軽鎖と重鎖との両方の可変領域が同一の抗原決定基への結合に寄与することができるため、従来の二重特異性抗体における免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変ドメイン特異性及び親和性は、ある程度犠牲にされなければならなかった。それに加えて、所望のレベルの有効性の達成において、治療用抗体、例えば、二重特異性治療用抗体は、インビボでのそれらの限定されたリサイクリング可能性のため、高用量または複数回用量の抗体を必要とすることが多い。

現在開発されている2つの抗原またはエピトープを標的化する大部分の抗原結合タンパク質は、2つの抗原結合アーム、(i)第1の抗原またはエピトープへの結合に寄与する免疫グロブリン重−軽鎖可変ドメイン対を含む第1の抗原結合アームと、(ii)第2の抗原またはエピトープへの結合に寄与する第2の重−軽鎖可変ドメイン対を含む第2の抗原結合アームと、を含む。これらの抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質全体という文脈においては二重特異性であるが、各抗原結合アームの内部では必ずしも二重特異性ではなく、例えば、三重特異性抗原結合タンパク質などの多重特異性フォーマットにおける抗原結合タンパク質の使用を限定する。本明細書に開示されるように、ユニバーサルな重鎖可変ドメインを発現する非ヒト動物は、抗原結合タンパク質の多くの異なるフォーマットにおける使用のための抗原結合タンパク質を作製するための一般的なツールとして採用することができる。

概要

修飾された免疫グロブリン重鎖配列を有する非ヒト動物を提供すること。再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物、例えば、哺乳動物、例えば、マウスまたはラットが提供される。再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、重鎖または軽鎖定常領域核酸配列作動可能に連結され得る。また、軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結され得る、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物も記載される。また、重鎖の不在下で抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得するための方法も提供される。なし

目的

追加の態様は、
(1)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(2)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

本明細書に記載の発明。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に援用される、2013年2月20日に出願された米国仮特許出願第61/766,765号、及び2013年9月18日に出願された米国仮特許出願第61/879,338号に対する優先権の利益を主張する。

0002

配列リスト
テキストファイル形式の配列リスト(「1270WO_SL.txt」と題され、2014年2月20日に作成され、87,000バイトのサイズである)が、参照によりその全体が本明細書に援用される。

0003

発明の分野
定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列(即ち、再構成された重鎖VDJ配列)を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物、例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物。幾つかの実施形態では、動物は、免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変領域(VDJ配列)核酸配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有するように、遺伝子的に改変され、VDJ配列は、ヒトVDJ配列であり、定常領域遺伝子配列は、ヒトまたは非ヒトである。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含有する非ヒト動物は、(1)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列と、(2)ヒトまたは非ヒト軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列と、を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、再構成された重鎖可変ドメインは、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖V遺伝子セグメント(VH)配列を含み、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む。そのゲノム中に(i)定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、(ii)1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物、例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物が提供される。そのゲノム中に(i)定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列と、(ii)1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、可変領域遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変領域遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジン残基をコードする。本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物を作製する方法が、提供される。重鎖の不在下で抗原に結合することができ、ならびに/または再構成された重鎖可変ドメインに関連付けられ、及び/もしくはpH依存性抗原結合特徴を示すことができる、免疫グロブリン軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)可変領域配列を産生するための方法が提供され、これは、二重特異性抗体を産生するために有用である。

背景技術

0004

二重特異性抗体は、2つの別個抗原決定基に結合することができる抗原結合部位を含む多機能性抗体であり、癌を含む多くの疾患を治療するための主要な治療用生物製剤のうちの1つとして現れた。近年、二重の抗原結合特性を有する多様な二重特異性抗体が開発されてきたが、従来の二重特異性抗体では、重鎖かまたは軽鎖かのいずれかの可変ドメインのみが各抗原決定基への結合に寄与しているのに対し、標準的な抗体では、軽鎖と重鎖との両方の可変領域が同一の抗原決定基への結合に寄与することができるため、従来の二重特異性抗体における免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変ドメインの特異性及び親和性は、ある程度犠牲にされなければならなかった。それに加えて、所望のレベルの有効性の達成において、治療用抗体、例えば、二重特異性治療用抗体は、インビボでのそれらの限定されたリサイクリング可能性のため、高用量または複数回用量の抗体を必要とすることが多い。

0005

現在開発されている2つの抗原またはエピトープを標的化する大部分の抗原結合タンパク質は、2つの抗原結合アーム、(i)第1の抗原またはエピトープへの結合に寄与する免疫グロブリン重−軽鎖可変ドメイン対を含む第1の抗原結合アームと、(ii)第2の抗原またはエピトープへの結合に寄与する第2の重−軽鎖可変ドメイン対を含む第2の抗原結合アームと、を含む。これらの抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質全体という文脈においては二重特異性であるが、各抗原結合アームの内部では必ずしも二重特異性ではなく、例えば、三重特異性抗原結合タンパク質などの多重特異性フォーマットにおける抗原結合タンパク質の使用を限定する。本明細書に開示されるように、ユニバーサルな重鎖可変ドメインを発現する非ヒト動物は、抗原結合タンパク質の多くの異なるフォーマットにおける使用のための抗原結合タンパク質を作製するための一般的なツールとして採用することができる。

課題を解決するための手段

0006

抗原特異性及び親和性が、専らもしくは主に免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン多様性からもたらされ、及び/または、専らもしくは主に免疫グロブリン軽鎖可変ドメインの多様性に属する、免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列を生成する必要が当該技術分野に存在する。かかる配列は、各可変ドメインが、別個の抗原特異的結合に別々に貢献する抗原結合タンパク質、例えば、二重特異性抗体の設計において極めて有用であろう。本明細書に記載される種々の態様及び実施形態は、再構成された重鎖可変遺伝子配列(例えば、再構成された重鎖VDJ配列)によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、この必要を満たすことができるという驚くべき発見に部分的に基づく。再構成された免疫グロブリン重鎖可変ドメイン(即ち、ユニバーサル重鎖可変ドメイン)をコードする非ヒト動物は、抗体の多様化メカニズムを再構成されていない(即ち、多様化可能な)抗体軽鎖可変ドメイン(単数または複数)に集中させる。非ヒト動物としては、例えば、哺乳動物、また特定の実施形態では、齧歯動物(例えば、マウス、ラット、またはハムスター)が含まれる。

0007

関心の抗原による刺激に際して、専らまたは主に抗体軽鎖可変ドメイン内に存在する抗原結合特異性を有する抗体を産生する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。軽鎖抗体可変ドメインアミノ酸及び対応する核酸配列は、かかる遺伝子的に修飾された動物によって産生される抗体から特定することができ、また配列は、重鎖可変ドメインから独立して(また、十分な特異性及び親和性を伴って)抗原決定基に結合する軽鎖可変ドメインを発生させるような組み換え抗体または他の抗原結合タンパク質において利用することができる。さらに、再構成された重鎖可変ドメインを含む(即ち、予め構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む)遺伝子的に修飾された動物の実用性は、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、多様なゲノムコンテクスト、例えば、
異なる免疫グロブリン遺伝子座中に定置することによって適用することができる。再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、再構成された重鎖可変ドメイン配列が、ヒトかまたは非ヒトかのいずれかの重鎖または軽鎖定常配列に作動可能に連結されることができるように、重鎖遺伝子座または軽鎖遺伝子座に標的化されることができる。再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列は、ヒト、非ヒト、または混合ヒト/非ヒト免疫グロブリン定常領域配列との作動可能な連結において、ゲノム中のどこにでも定置することができる。さらに、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む非ヒト動物は、免疫グロブリン遺伝子座の追加の遺伝子修飾と組み合わせる(例えば、免疫グロブリン遺伝子座の追加の遺伝子修飾を含む動物と異種交配する)ことができる。例えば、軽鎖遺伝子座に標的化される再構成された重鎖可変ドメイン遺伝子配列によって付与される集中された多様化は、重鎖遺伝子座内に挿入される軽鎖可変ドメイン遺伝子配列と対にされることができ、それによって、選択されるゲノムコンテクストのタイミング及び多様化(例えば、重鎖遺伝子座の多様化メカニズム)を完全に利用する動物を生成して、選択される抗体可変遺伝子配列(例えば、抗体軽鎖可変遺伝子配列)の多様性を増加させることができる。それに加えて、制限された(限定された)軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー(例えば、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを上述の単一の再構成された重鎖配列と組み合わせて含む、制限された数の軽鎖可変遺伝子配列)を有するマウスを利用することによって、免疫グロブリン重鎖可変ドメインとより効率的に対を成すことができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを産生することができる。

0008

したがって、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域(即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、即ち、再構成された重鎖VDJ配列)を含む免疫グロブリン遺伝子座を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物(例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物)が、提供される。

0009

種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって発現されるゲノム重鎖可変ドメインコード核酸配列のみが、再構成された重鎖可変ドメインである。したがって、遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生される抗体重鎖可変ドメインの多様性は、極めて制限される。

0010

幾つかの実施形態では、そのゲノム中に、その可変領域配列が単一の再構成されたヒト重鎖可変領域から本質的に成るように遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が、提供される。かかる遺伝子的に修飾された非ヒト動物内の異なる細胞は、(例えば、複製エラー体細胞超変異、または他のメカニズムのため)単一の再構成されたヒト重鎖可変領域内に完全に同一の配列を必ずしも有していない場合があるが、それにも関わらず、かかる遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、再構成されていない重鎖可変配列を有する動物、及び/またはそのゲノムが複数の重鎖可変領域遺伝子セグメント(例えば、特に再構成されていない場合、複数のV、D、及び/またはJセグメント)を含む動物と比較して、劇的に制限された抗体重鎖可変ドメインの多様性を示すことが理解される。

0011

種々の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む(即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む)遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。種々の態様では、それがコードする再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列及び再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトV、D、及びJ遺伝子セグメントに由来する。種々の態様では、それがコードする再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列及び再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトVH遺伝子及びヒトJHセグメントに由来する。種々の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。種々の態様では、再構成されたヒト免疫
グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域領域遺伝子配列に作動可能に連結される。種々の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列中に存在する。種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、軽鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結において軽鎖遺伝子を形成するように再構成することが可能な再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントの完全な補体を含む。他の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、複数であるが完全な補体より少ない(即ち、野生型より少ない数)の再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントを含む。種々の態様では、再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントは、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の態様では、非ヒト動物は、齧歯動物、例えば、マウス、ラット、またはハムスターである。別の態様では、本明細書に記載されるように、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む(即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列、即ち、予め再構成された重鎖VDJ配列を含む)核酸構築物が提供される。

0012

再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する(即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する)、遺伝子的に修飾された非ヒト動物の多数の変形が、本明細書に開示される。各変形は、抗体の多様化のメカニズムを免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列に集中させる能力を有する。

0013

種々の態様では、再構成された重鎖可変ドメイン(即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメイン)をコードするヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列(例えば、IgMIgDIgAIgEIgG、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列)に作動可能に連結される。例えば、(a)第1のヌクレオチド配列が、再構成された重鎖可変ドメインをコードし(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、第1のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト(または混合ヒト/非ヒト)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結され、(b)第2のヌクレオチド配列が、軽鎖可変ドメインをコードし(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)、第2のヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、免疫グロブリン遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。

0014

別の態様では、修飾された非ヒト動物であって、該動物は、重鎖可変ドメインをコードする再構成されたヌクレオチド配列を含み、重鎖可変ドメインは、スペーサーを介して重鎖Jセグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖可変(VH)配列を含み、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基をコードする、修飾された非ヒト動物が提供される。

0015

別の態様では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む(即ち、再構成された重鎖可変ドメインをコードする核酸配列、即ち、再構成された重鎖VDJ配列を含む)遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物であって、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座が、非ヒト動物の生殖系列中に存在する、非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、重鎖遺伝子座である。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖遺伝子座である。

0016

別の態様では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリンゲノム遺伝子座、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト
動物(例えば、マウス、ラット、またはハムスターなどの齧歯動物)であって、ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。

0017

別の態様では、(a)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、(b)ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列(例えば、IgM、IgD、IgA、IgE、IgG、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする重鎖定常領域遺伝子配列)に作動可能に連結される再構成されていないヒトまたは非ヒト軽鎖(例えば、κまたはλ軽鎖)可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。

0018

別の態様では、
(a)第1の対立遺伝子であって、
(i)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、及び
(ii)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)、を含む、第1の対立遺伝子と、
(b)第2の対立遺伝子であって、
(i)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、軽鎖可変ドメインをコードする第3のヌクレオチド配列(即ち、第3のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ヌクレオチド配列である)、及び
(ii)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第4のヌクレオチド配列(即ち、第4のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)、を含む、第2の対立遺伝子と、を含む免疫グロブリン遺伝子座を有する、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。

0019

種々の態様では、再構成されていない軽鎖可変領域遺伝子配列または遺伝子座を有する遺伝子的に修飾された非ヒト動物が、提供される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、野生型の数(即ち、全てまたは実質的に全て)のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(即ち、配列)を含む。他の態様では、本明細書に記載される非ヒト動物は、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、(i)1つ、2つ、またはそれ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメント、及び(ii)1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントを含む。重鎖核酸配列及び/または軽鎖セグメントは、例えば、導入遺伝子中に、または内在性免疫グロブリン遺伝子座に存在してもよい。

0020

種々の態様では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物であって、該動物の全ての免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、同一の再構成された可変重鎖遺伝子配列に由来し、該可変ドメインは、少なくとも1つ、2つ、または3つ以上のVL遺伝子セグメント及び少なくとも1つ、2つ、または3つ以上のJL遺伝子セグメントのうちの1つに由来する軽鎖可変ドメインと同起源で発現される、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。それに加えて、そのゲノム中に、(i)ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、(ii)ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(例えば、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つ以上のヒトJκ遺伝子セグメント)を含む免疫グ
ロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物(例えば、マウス及びラットなどの齧歯動物)が、提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。

0021

別の態様では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質を発現し、重鎖アミノ酸配列は、重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む遺伝子的に修飾された重鎖遺伝子座に由来する。特定の態様では、軽鎖アミノ酸配列は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメント及び(ii)2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントを含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に由来する。

0022

スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖V遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列をそのゲノム中に含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物であって、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸(例えば、2つのアミノ酸、3つのアミノ酸、または4つのアミノ酸)及び/または修飾されたD遺伝子セグメントをコードする、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。種々の実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される。種々の実施形態では、非ヒト動物は、そのゲノム中に、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント、例えば、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つ以上のヒトJκ遺伝子セグメントを含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。

0023

本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物を作製及び使用する方法も、提供される。再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を、免疫グロブリン重鎖または軽鎖定常領域核酸配列との作動可能な連結において、非ヒト動物のゲノム中に定置するための方法が提供される。

0024

別の態様では、重鎖可変領域アミノ酸配列から独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列を獲得するための方法が、提供される。

0025

別の態様では、本明細書に記載される方法のいずれかによって獲得可能な遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座が提供される。

0026

種々の態様では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって産生されるか、またはそれに由来する、抗原結合タンパク質(例えば、抗体)が提供される。多重特異性(例えば、二重特異性または三重特異性)抗原結合タンパク質を含む、抗原結合タンパク質を作製するための方法も提供される。エフェクター軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを作製するための方法も提供される。

0027

別の態様では、本明細書に記載される種々のゲノム修飾を含む非ヒト動物に由来する、多能性細胞誘導多能性、または全能性幹細胞が提供される。例えば、前核注入によって細胞内に導入される修飾など、本明細書に記載される遺伝子修飾を含有する核を含む細胞も提供される。

0028

種々の態様では、そのゲノムが、定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む細胞を含む、非ヒト動物が提供される。特定の態様では、非ヒト動物胚は、軽鎖定常領域核酸配列に作動
可能に連結される、2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座をさらに含む。

0029

重鎖可変ドメインから独立して抗原またはそのエピトープに結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列をコードする核酸配列を作製するための方法であって、(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列、を含む、免疫付与することと、(b)非ヒト動物に免疫応答を開始させることと、(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法も提供される。種々の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、及びB細胞を含むがそれらに限定されない、リンパ球である。種々の実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。

0030

重鎖可変ドメインから独立して抗原またはそのエピトープに結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列をコードする核酸配列を作製するための方法であって、(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫付与することと、(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法も提供される。種々の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、及びB細胞を含むがそれらに限定されない、リンパ球である。種々の実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。

0031

重鎖可変ドメインから独立して抗原またはそのエピトープに結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変領域(VL)アミノ酸配列をコードする核酸配列を作製するための方法であって、(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法も提供される。種々の実施形態では、細胞は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、及びB細胞を含むがそれらに限定されない、リンパ球である。種々の実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させることをさらに含む。

0032

抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される構成されていないヒト免疫グロブリン
軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(c)の核酸配列を、第2の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。

0033

抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(c)の核酸配列を、第2の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。

0034

抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(c)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(c)の核酸配列を、第2の抗原またはそのエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(c)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法も提供される。

0035

種々の態様では、その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。幾つかの実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される齧歯動物。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列に関してホモ接合性である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、Fcをコードする。特定の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物であり、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、及びヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列をコードする。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に存在する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖(VL)遺伝子セグメント及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖J遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列をさらに含む。特定の実施形態では、再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメント(VL)及び再構成されていない軽鎖(JL)遺伝子セグメントをコードするヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、齧歯動物及びヒト定常領域遺伝子配列から選択される。またより特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。特定の実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖(VL)遺伝子セグメント及び再構成されていないヒト免疫グロブリン(JL)遺伝子セグメントは、内在性齧歯動物遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。

0036

追加の態様では、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、非ヒト生殖細胞中の非ヒト免疫グロ
ブリン重鎖遺伝子座であって、定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座が提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。

0037

追加の態様では、非ヒト動物を作製するための方法であって、
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である非ヒト動物であって、非ヒト動物は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を優勢的に免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、非ヒト動物が提供される。

0038

追加の態様では、
(a)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(b)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物が提供される。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロ
ブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、及びヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する。特定の実施形態では、ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列中に存在する。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。

0039

追加の態様は、
(1)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(2)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座を提供する。
幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である。

0040

追加の態様は、修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法で
あって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)ゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
(ii)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、を定置することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変ドメインをコードする。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。

0041

スペーサーを介して重鎖Jセグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖Vセグメント(VH)配列を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物であって、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、非ヒト動物も提供される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする。幾つかの実施形態では、VH配列及びJH配列は、ヒトVH遺伝子セグメント及びヒトJH遺伝子セグメントに由来する。特定の実施形態では、ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトVH遺伝子セグメントは、VH3−23またはその多型変異体である。幾つかの実施形態では、スペーサーは、ヒトD遺伝子セグメントに由来する配列をコードする。特定の実施形態では、ヒトD遺伝子セグメントは、
D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、スペーサーは、D4−4またはその多型変異体の配列をコードする。特定の実施形態では、ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。特定の実施形態では、ヒトJHセグメントは、JH4−4またはその多型変異体である。幾つかの実施形態では、再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントは、非ヒト動物の免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、非ヒト動物は、そのゲノムの異所性遺伝子座に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。

0042

追加の態様は、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基をコードする、非ヒト動物の生殖系列中の免疫グロブリン重鎖遺伝子座を提供する。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン遺伝子座は、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。

0043

追加の態様では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)ゲノム中に、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、方法が提供される。
幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。特定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、修飾された重鎖遺伝子座は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。幾つかの実施形態では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。

0044

追加の態様は、そのゲノム中に、
(a)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(b)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、修飾された非ヒト動物を提供する。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。特定の実施形態では、哺乳動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、IgM、IgD、IgG、IgE、IgA、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする齧歯動物定常領域配列である。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、齧歯動物κまたはλ定常領域核酸配列である。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列VHセグメント、ヒト生殖系列Dセグメント、及びヒト生殖系列JHセグメントから選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、内在性遺伝子座において定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、内在性遺伝子座において軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、2つ以下のヒト免疫グロブリン非再構成VL遺伝子セグメントと、1つ、2つ、または3つ以上のヒト非再構成JL遺伝子セグメントとを含む。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択されるヒト生殖系列VH遺伝子セグメントに由来する。特定のでは、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列VH3−23遺伝子セグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域核酸配列は、VH3−23/X1X2/Jの配列をコードし、X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である。特定の実施形態では、X1は、Glyであり、X2は、Tyrである。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む。特定の実施形態では、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方は、内在性Adam6遺伝子である。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方をゲノムの異所性遺伝子座に含む。幾つかの実施形態では、ヒト可変領域VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む。特定の実施形態では、遺伝子セグメントは、生殖系列遺伝子セグメントである。特定の実施形態では、非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの
少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、VL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する。幾つかの実施形態では、ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現し、抗原結合タンパク質は、ヒトVL及びJL遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含み、抗原結合タンパク質は、ヒトVL遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも1つのヒスチジン残基を含む、請求項107に記載の非ヒト動物。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、抗原に応答して抗原結合タンパク質の集団を発現し、集団内の全ての抗原結合タンパク質は、(a)再構成されたヒト可変領域核酸配列に由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、(b)非ヒト動物のゲノム中のヒトVL遺伝子セグメント及びJL遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、を含み、ヒトVL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。

0045

追加の態様は、修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び/またはJH遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)非ヒト動物の修飾されたゲノム中に、
(i)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、ならびに
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、またはハムスターである。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列ならびにヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、野生型非ヒト動
物の対応するヌクレオチド配列またはその付近に定置される。幾つかの実施形態では、再構成された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域核酸配列ならびにヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、ゲノム中の異所性遺伝子座に定置される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、内在性Adam6a遺伝子,Adam6b遺伝子、またはその両方を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、Adam6a遺伝子,Adam6b遺伝子、またはその両方をゲノムの異所性遺伝子座に含む。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列は、ラットまたはマウスCκ定常領域核酸配列である。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードすることが可能である。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。特定の実施形態では、非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、VL遺伝子セグメントのうちのすくなくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する。特定の実施形態では、ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントのものであり、3つの非ヒスチジンコドン置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。特定の実施形態では、置換は、ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される。

0046

追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類FACS)ま
たはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。

0047

追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供する。
ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Fc受容体である。またより特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。

0048

追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。

0049

追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)免疫付与された非ヒト動物から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)細胞から、抗原に結合することができる軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法を提供する。
幾つかの実施形態では、単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される。幾つかの実施形態では、抗原に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞は、リンパ球である。特定の実施形態では、リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む。幾つかの実施形態では、方法は、(c)’リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む。特定の実施形態では、癌細胞は、骨髄腫細胞である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である。幾つかの実施形態では、重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である。幾つかの実施形態では、(d)の核酸配列は、動物のゲノム中の再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む。

0050

追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域
核酸配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供した。
ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Fc受容体である。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。

0051

追加の態様は、重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)非ヒト動物に、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)非ヒト動物から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)(c)の細胞から、第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を獲得することと、
(e)(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が(d)の核酸によってコードされ、重鎖から独立して第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法を提供した。
ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖
系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする。幾つかの実施形態では、第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する。特定の実施形態では、細胞表面受容体は、Fc受容体である。特定の実施形態では、Fc受容体は、FcRnである。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する。幾つかの実施形態では、第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する。幾つかの実施形態では、第1の抗原は、Fc受容体であり、第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、抗原結合タンパク質は、非ヒト動物のゲノム中のVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む。
本発明の好ましい実施形態では、例えば、以下が提供される。
項目1)
その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物。
(項目2)
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目3)
前記哺乳動物は、齧歯動物である、項目2に記載の非ヒト動物。
(項目4)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目3に記載の非ヒト動物。
(項目5)
前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列に関してホモ接合性である、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目6)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目7)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、Fcをコードする、項目6に記載の非ヒト動物。
(項目8)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目7に記載の非ヒト動物。
(項目9)
前記非ヒト動物は、齧歯動物であり、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目10)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される、項目6〜9のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目11)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目12)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、及びヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する、項目11に記載の非ヒト動物。
(項目13)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列をコードする、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目14)
実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目15)
前記非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、異所的に存在する、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目16)
前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目17)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目18)
前記非ヒト動物は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖V遺伝子セグメント(VL)及び再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖J遺伝子セグメント(JL)をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目19)
前記再構成されていない軽鎖V遺伝子セグメント(VL)及び前記再構成されていない軽鎖(JL)遺伝子セグメントをコードする前記ヌクレオチド配列は、免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目18に記載の非ヒト動物。
(項目20)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、齧歯動物及びヒト定常領域遺伝子配列から選択される、項目19に記載の非ヒト動物。
(項目21)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される、項目20に記載の非ヒト動物。
(項目22)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖(VL)遺伝子セグメント及び前記再構成されていないヒト免疫グロブリン(JL)遺伝子セグメントは、内在性齧歯動物遺伝子座において、齧歯動物免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目18に記載の非ヒト動物。
(項目23)
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目24)
重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、非ヒト生殖細胞のゲノム中の非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座であって、前記定常領域遺伝子配列は、非ヒト配列、ヒト配列、またはそれらの組み合わせを含む、非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目25)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目24に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目26)
前記内在性非ヒト免疫グロブリン定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目25に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目27)
非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)前記ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含む、方法。
(項目28)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目27に記載の方法。
(項目29)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される、項目27に記載の方法。
(項目31)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目27に記載の方法。
(項目32)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目27に記載の方法。
(項目33)
前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目27に記載の方法。
(項目34)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目27に記載の方法。
(項目35)
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目27に記載の方法。
(項目36)
項目24に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である非ヒト動物であって、前記非ヒト動物は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を優勢的に前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から発現する、非ヒト動物。
(項目37)
(a)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(b)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物。
(項目38)
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目39)
前記哺乳動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目38に記載の非ヒト動物。
(項目40)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目41)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目42)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目43)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目44)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目45)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列である、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目46)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目44または45のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目47)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目48)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン遺伝子配列を含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目49)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖VH遺伝子セグメント、ヒト重鎖D遺伝子セグメント、及びヒト重鎖JH遺伝子セグメントに由来する、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目50)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト生殖系列重鎖VHセグメント、ヒト生殖系列重鎖Dセグメント、ヒト生殖系列重鎖JHセグメントに由来する、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目51)
前記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目52)
前記ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目53)
前記ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目49に記載の非ヒト動物。
(項目54)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目55)
前記遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記非ヒト動物の前記生殖系列中に存在する、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目56)
実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目57)
前記非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、前記軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目58)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目59)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目60)
前記遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目37に記載の非ヒト動物。
(項目61)
(1)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と、
(2)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列と、を含む、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子座。
(項目62)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目61に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
(項目63)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目61に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
(項目64)
前記軽鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット軽鎖定常領域遺伝子配列である、項目61に記載の遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座。
(項目65)
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖V、D、及びJ遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖V及びJ遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)前記ゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、及び
(ii)重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列、を定置することと、含む、方法。
(項目66)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、κ軽鎖可変ドメインをコードする、項目65に記載の方法。
(項目67)
前記再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、λ軽鎖可変ドメインをコードする、項目65に記載の方法。
(項目68)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列である、項目65に記載の方法。
(項目69)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目68または69に記載の方法。
(項目71)
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目65に記載の方法。
(項目72)
前記修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目65に記載の方法。
(項目73)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目65に記載の方法。
(項目74)
スペーサーを介して重鎖Jセグメント(JH)配列に作動可能に連結される重鎖Vセグメント(VH)配列を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物であって、前記スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、非ヒト動物。
(項目75)
前記非ヒト動物は、齧歯動物である、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目76)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目75に記載の非ヒト動物。
(項目77)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目78)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット定常領域遺伝子配列である、項目77に記載の非ヒト動物。
(項目79)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目80)
前記重鎖定常領域遺伝子配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列をコードする、項目77〜79のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
(項目81)
前記VH配列及び前記JH配列は、ヒトVH遺伝子セグメント及びヒトJH遺伝子セグメントに由来する、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目82)
前記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目83)
前記ヒトVH遺伝子セグメントは、VH3−23またはその多型変異体である、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目84)
前記スペーサーは、ヒトD遺伝子セグメントに由来する配列をコードする、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目85)
前記ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目84に記載の非ヒト動物。
(項目86)
前記スペーサーは、D4−4またはその多型変異体の配列をコードする、項目84に記載の非ヒト動物。
(項目87)
前記ヒトJH遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目88)
前記ヒトJHセグメントは、JH4−4またはその多型変異体である、項目81に記載の非ヒト動物。
(項目89)
前記再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目90)
実質的に全ての内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の前記免疫グロブリン重鎖可変遺伝子座から欠失させられるか、または非機能性にされる、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目91)
前記非ヒト動物は、内在性機能性VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にする修飾を含み、前記非ヒト動物は、そのゲノムの異所性遺伝子座に、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目92)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる重鎖可変ドメインは、前記非ヒト動物に対して免疫原性ではない、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目93)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目74に記載の非ヒト動物。
(項目94)
スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含み、前記スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基をコードする、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目95)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目94に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目96)
前記非ヒト重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目95に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目97)
前記免疫グロブリン遺伝子座は、前記再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目94に記載の免疫グロブリン重鎖遺伝子座。
(項目98)
修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法であって、
(a)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及びJH遺伝子セグメントを欠失させるか、または非機能性にするように、非ヒト動物のゲノムを修飾することと、
(b)前記ゲノム中に、スペーサーを介して重鎖J遺伝子セグメント(JH)に作動可能に連結される重鎖可変遺伝子セグメント(VH)を含む再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を定置することと、を含み、前記スペーサーは、少なくとも1つのアミノ酸残基を含む、方法。
(項目99)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖ヌクレオチド配列は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目98に記載の方法。
(項目100)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子配列は、マウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列である、項目99に記載の方法。
(項目101)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の内在性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に定置される、項目98に記載の方法。
(項目102)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に存在する、項目98に記載の方法。
(項目103)
前記修飾された重鎖遺伝子座は、前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む、項目98に記載の方法。
(項目104)
前記非ヒト動物は、マウス、ラット、またはハムスターから成る群から選択される齧歯動物である、項目98に記載の方法。
(項目105)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目98に記載の方法。
(項目106)
前記修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する、項目98に記載の方法。
(項目107)
そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む、免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントを含む、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、修飾された非ヒト動物。
(項目108)
前記非ヒト動物は、哺乳動物である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目109)
前記哺乳動物は、齧歯動物である、項目108に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目110)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから成る群から選択される、項目109に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目111)
前記重鎖定常領域核酸配列は、IgM、IgD、IgG、IgE、IgA、及びそれらの組み合わせから選択される免疫グロブリンアイソタイプをコードする齧歯動物定常領域配列である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目112)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、齧歯動物κまたはλ定常領域核酸配列である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目113)
前記再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、ヒト生殖系列VHセグメント、ヒト生殖系列Dセグメント、及びヒト生殖系列JHセグメントから選択される、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目114)
前記再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列は、内在性遺伝子座において前記定常領域核酸配列に作動可能に連結される、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目115)
前記1つ以上であるが前記野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、内在性遺伝子座において前記軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目116)
前記非ヒト動物は、2つ以下のヒト免疫グロブリン非再構成VL遺伝子セグメントと、1つ、2つ、または3つ、または3つ以上のヒト非再構成JL遺伝子セグメントとを含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目117)
前記ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−30−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される、項目113に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目118)
前記ヒト生殖系列VH遺伝子セグメントは、VH3−23遺伝子セグメントである、項目113に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目119)
前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目120)
前記再構成された重鎖可変領域核酸配列は、VH3−23/X1X2/Jの配列をコードし、X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目121)
X1は、Glyであり、X2は、Tyrである、項目120に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目122)
前記免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目123)
前記Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方は、内在性Adam6遺伝子である、項目122に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目124)
前記修飾された非ヒト動物は、前記ゲノムの異所性遺伝子座にAdam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目125)
前記ヒト可変領域VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目126)
前記免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目127)
前記遺伝子セグメントは、生殖系列遺伝子セグメントである、項目126に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目128)
前記非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む、項目126に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目129)
2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目130)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目131)
前記VL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目132)
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する、項目131に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目133)
前記ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、前記ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、前記ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目134)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目135)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目136)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目137)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目133に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目138)
前記非ヒト動物は、関心の抗原による刺激に際して、前記抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質を発現し、前記抗原結合タンパク質は、前記ヒトVL及びJL遺伝子セグメントに由来するアミノ酸配列を含み、前記抗原結合タンパク質は、前記ヒトVL遺伝子セグメントによってコードされるアミノ酸位置に、少なくとも1つのヒスチジン残基を含む、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目139)
前記非ヒト動物は、抗原に応答して抗原結合タンパク質の集団を発現し、前記集団内の全ての抗原結合タンパク質は、(a)前記再構成されたヒト可変領域核酸配列に由来するヒト重鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン重鎖と、(b)前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記ヒトVL遺伝子セグメント及び前記JL遺伝子セグメントの再構成に由来する免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む免疫グロブリン軽鎖と、を含み、前記ヒトVL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、前記対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目107に記載の修飾された非ヒト動物。
(項目140)
修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物を作製するための方法であって、
(a)非ヒト動物のゲノムを、
(i)内在性機能性免疫グロブリン重鎖VH、D、及び/またはJH遺伝子セグメント、ならびに
(ii)内在性機能性免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を欠失させるか、または非機能性にするように修飾することと、
(b)前記非ヒト動物の前記修飾されたゲノム中に、
(i)免疫グロブリン重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、ならびに
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されている1つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメント、を定置することと、を含む、方法。
(項目141)
前記非ヒト動物は、齧歯動物である、項目140に記載の方法。
(項目142)
前記齧歯動物は、マウス、ラット、またはハムスターである、項目141に記載の方法。
(項目143)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、項目140に記載の方法。
(項目144)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列ならびに前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、前記野生型非ヒト動物の対応するヌクレオチド配列またはその付近に定置される、項目140に記載の方法。
(項目145)
前記再構成された免疫グロブリンヒト重鎖可変領域核酸配列ならびに前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、前記ゲノム中の異所性遺伝子座に定置される、項目140に記載の方法。
(項目146)
前記非ヒト動物は、内在性Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、項目140に記載の方法。
(項目147)
前記非ヒト動物は、Adam6a遺伝子、Adam6b遺伝子、またはその両方を前記ゲノムの異所性遺伝子座に含む、項目140に記載の方法。
(項目148)
前記再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列(配列番号137)をコードする、項目140に記載の方法。
(項目149)
前記免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列は、ラットまたはマウスCκ定常領域核酸配列である、項目140に記載の方法。
(項目150)
前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VL及びJL遺伝子セグメントは、ヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを再構成及びコードすることが可能である、項目140に記載の方法。
(項目151)
前記非ヒト動物は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む、項目140に記載の方法。
(項目152)
前記非ヒト動物は、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む、項目151に記載の方法。
(項目153)
2つ以上、3つ以上、4つ以上、または5つ以上のヒトVL遺伝子セグメント、及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントが、内在性軽鎖遺伝子座に存在する、項目140に記載の方法。
(項目154)
前記ヒト免疫グロブリン軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目140に記載の方法。
(項目155)
前記VL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、ヒスチジンコドンの付加、または前記対応するヒト生殖系列VLセグメント配列によってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、ヒスチジンコドンでの置換を含む、項目140に記載の方法。
(項目156)
前記付加または置換されるヒスチジンコドンは、CDR3中に存在する、項目155に記載の方法。
(項目157)
前記ヒトVL遺伝子セグメントは、ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントであり、前記ヒトVκ1−39及びVκ3−20遺伝子セグメントの各々は、対応するヒト生殖系列VL遺伝子セグメントによってコードされる少なくとも1つの非ヒスチジンコドンの、前記ヒスチジンコドンでの前記置換を含む、項目155に記載の方法。
(項目158)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目159)
前記置換は、前記ヒトVκ1−39遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、108位、及び111位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目160)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの3つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目161)
前記置換は、前記ヒトVκ3−20遺伝子セグメントの4つの非ヒスチジンコドンのものであり、前記置換は、105位、106位、107位、及び109位にてヒスチジンを発現するように設計される、項目157に記載の方法。
(項目162)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、関心の抗原またはその免疫原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
(項目163)
単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目162に記載の方法。
(項目164)
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目162に記載の方法。
(項目165)
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む、項目164に記載の方法。
(項目166)
前記方法は、(c)’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目162に記載の方法。
(項目167)
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目166に記載の方法。
(項目168)
前記(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目162に記載の方法。
(項目169)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目162に記載の方法。
(項目170)
前記重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目162に記載の方法。
(項目171)
前記(d)の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目162に記載の方法。
(項目172)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び、
(ii)免疫グロブリン軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)前記非ヒト動物から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)前記(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)前記(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記(d)の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
(項目173)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目172に記載の方法。
(項目174)
前記第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目172に記載の方法。
(項目175)
前記細胞表面受容体は、Fc受容体である、項目174に記載の方法。
(項目176)
前記Fc受容体は、FcRnである、項目175に記載の方法。
(項目177)
前記第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目172に記載の方法。
(項目178)
前記第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目172に記載の方法。
(項目179)
前記第1の抗原は、Fc受容体であり、前記第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記VL遺伝子セグメントに由来する1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目172に記載の方法。
(項目180)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域核酸配列を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
(項目181)
単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目180に記載の方法。
(項目182)
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目180に記載の方法。
(項目183)
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む、項目182に記載の方法。
(項目184)
前記方法は、(c)’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目180に記載の方法。
(項目185)
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目184に記載の方法。
(項目186)
前記(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目180に記載の方法。
(項目187)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目180に記載の方法。
(項目188)
前記重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目180に記載の方法。
(項目189)
前記(d)の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目180に記載の方法。
(項目190)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することが可能な免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン(VL)をコードする核酸配列を獲得するための方法であって、
(a)非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域核酸配列、及び(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結されるヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、免疫応答を開始させることと、
(c)前記免疫付与された非ヒト動物から、前記抗原に結合することができる軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記細胞から、前記抗原に結合することができる前記軽鎖可変ドメイン(VLドメイン)をコードする核酸配列を獲得することと、を含む、方法。
(項目191)
単離するステップ(c)は、蛍光活性化細胞分類(FACS)またはフローサイトメトリーを介して実行される、項目190に記載の方法。
(項目192)
前記抗原に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を含む前記細胞は、リンパ球である、項目190に記載の方法。
(項目193)
前記リンパ球は、ナチュラルキラー細胞、T細胞、またはB細胞を含む、項目192に記載の方法。
(項目194)
前記方法は、(c)’前記リンパ球を癌細胞と融合させることをさらに含む、項目190に記載の方法。
(項目195)
前記癌細胞は、骨髄腫細胞である、項目194に記載の方法。
(項目196)
前記(d)の核酸配列は、免疫グロブリン定常領域核酸配列をコードする核酸配列と融合される、項目190に記載の方法。
(項目197)
前記軽鎖定常領域核酸配列は、ヒトカッパ配列またはヒトラムダ配列である、項目190に記載の方法。
(項目198)
前記重鎖定常領域核酸配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択されるヒト配列である、項目190に記載の方法。
(項目199)
前記(d)の核酸配列は、前記動物の前記ゲノム中の前記再構成されていないVL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジンコドン置換または挿入を含む、項目190に記載の方法。
(項目200)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)前記非ヒト動物から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)前記(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)前記(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記(d)の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
(項目201)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目200に記載の方法。
(項目202)
前記第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目200に記載の方法。
(項目203)
前記細胞表面受容体は、Fc受容体である、項目202に記載の方法。
(項目204)
前記Fc受容体は、FcRnである、項目203に記載の方法。
(項目205)
前記第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目200に記載の方法。
(項目206)
前記第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目200に記載の方法。
(項目207)
前記第1の抗原は、Fc受容体であり、前記第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記VL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目200に記載の方法。
(項目208)
重鎖可変ドメインから独立して抗原に結合することができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、
(a)遺伝子的に修飾された非ヒト動物を、第1のエピトープまたはその免疫原性部分を含む第1の抗原で免疫付与することであって、前記非ヒト動物は、そのゲノム中に、
(i)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列、及び
(ii)重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメント(VL及びJL)、を含む、免疫付与することと、
(b)前記非ヒト動物に、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に対する免疫応答を開始させることと、
(c)前記非ヒト動物から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する軽鎖可変ドメインをコードする核酸配列を含む細胞を単離することと、
(d)前記(c)の細胞から、前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に特異的に結合する前記軽鎖可変ドメインをコードする前記核酸配列を獲得することと、
(e)前記(d)の核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列に融合される、発現構築物において採用することと、
(f)前記(d)の核酸配列を、第2の抗原またはエピトープに特異的に結合するヒト免疫グロブリン重鎖を発現する産生細胞株の中に発現させて、その軽鎖が前記(d)の核酸によってコードされ、前記重鎖から独立して前記第1のエピトープまたはその免疫原性部分に結合し、またその重鎖が前記第2の抗原またはエピトープに特異的に結合する、抗原結合タンパク質を形成することと、を含む、方法。
(項目209)
前記ヒト軽鎖VLまたはJL遺伝子セグメントのうちの少なくとも1つは、対応するヒト生殖系列軽鎖可変遺伝子セグメントによってはコードされない1つ以上のヒスチジンコドンをコードする、項目208に記載の方法。
(項目210)
前記第1のエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目208に記載の方法。
(項目211)
前記細胞表面受容体は、Fc受容体である、項目210に記載の方法。
(項目212)
前記Fc受容体は、FcRnである、項目211に記載の方法。
(項目213)
前記第2の抗原またはエピトープは、可溶性抗原に由来する、項目208に記載の方法。
(項目214)
前記第2の抗原またはエピトープは、細胞表面受容体に由来する、項目208に記載の方法。
(項目215)
前記第1の抗原は、Fc受容体であり、前記第2の抗原は、可溶性タンパク質であり、前記抗原結合タンパク質は、前記非ヒト動物の前記ゲノム中の前記VL遺伝子セグメントに由来する、1つ以上のヒスチジン置換及び挿入を含む、項目208に記載の方法。

図面の簡単な説明

0052

ヒトVH3−23プロモータ(配列番号139)に作動可能に連結される、再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4、配列番号136)及びJH4のイントロン(配列番号140)を含む、再構成された重鎖可変ドメインミニ遺伝子座(mini−locus)(「UHCミニ遺伝子座」)を構築するためのスキーム例証する。UHCミニ遺伝子座は、5’及び3’においてマウス相同アームに隣接する。ステップ1(I−CeuI/SpeIライゲーション(Amp+Spec))では、pJSh0038(UHCミニ遺伝子座;)を生成するために、スペクチノマイシン選択カセットが、I−CeuI及びSpeI部位の間でプロモータの上流に導入された。
(A)MAID1115BACクローンの5’末端(2.BHR(Hyg+Kan))中へのハイグロマイシン選択カセット(EM7−HYG)の標的化、及び(B)VI432BACクローン(3.BHR(Spec+Hyg))中のIgM遺伝子座の上流へのUHCミニ遺伝子座(pJSh0038)の標的化のためのスキームを例証する。
(A)5’〜3’に、Adam6a遺伝子(3’〜5’方向に存在する)、FRT部位に隣接するネオマイシンカセット(3’〜5’方向に存在する)、Adam6b遺伝子(3’〜5’方向に存在する)、遺伝子間制御領域1(IGCR1、keyV(D)J組み換え調節領域)、及びスペクチノマイシンカセット(5’〜3’方向に存在する)を含む、VI421クローンの3’末端中へのクロラムフェニコールカセットを含むpDBa0049構築物の標的化(4.BHR(Cm+Kan))、ならびに(B)I−CeuI及びAscI部位の間の制限消化及びライゲーション(5.I−CeuI/AscIライゲーション(Hyg+Kan))を介した、Adam6a及び6b遺伝子を含有するVI444BACクローンのゲノム遺伝子座の、VI443BACクローンのユニバーサル重鎖(UHC)ゲノム遺伝子座の上流への標的化と、のためのスキームを例証する。
(A)1661ヘテロ接合性のマウスから単離されたES細胞中への最終構築物(MAID6031BAC DNA)の標的化のためのスキームを例証し、(B)スクリーニングアッセイにおいて使用されるプローブ及びプライマーのゲノムの場所を示す。
UHCCDR3配列(AKDYSNYYFDY、配列番号143)に類似のCDR3配列を含有する、Regeneron PharmaceuticalsのASAPデータベース内の抗体のリストを示す。
6031細菌人工染色体(BAC)DNA及び6031ヘテロ接合性ES細胞のゲノム構成、ならびにスクリーニングアッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブのゲノムの場所を例証する。
スクリーニングアッセイにおいて対立遺伝子の減少(LOA)、対立遺伝子の増加(GOA)、または親対立遺伝子(parental)を確認するために使用される、プライマー及びプローブのリストを示す。
スクリーニングアッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブの配列を示す。
標的化される対立遺伝子の1つのコピーを含有する、遺伝子的に修飾されたF0マウスの免疫グロブリン重鎖遺伝子座のゲノム構造を例証する(Adam6a/6b遺伝子及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(hVH3−23(D)JH4、を含む)。(A)MAID6031het:選択カセットを伴う遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むヘテロ接合性のF0マウス、及び(B)MAID6032het:選択カセットを伴わない遺伝子的に修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むヘテロ接合性のF0マウス。
野生型または6032ヘテロ接合性マウスから単離された骨髄細胞の蛍光活性化細胞分類(FACS)分析の結果を示す。上パネル:野生型またはF0 6032ヘテロ接合性のマウスから単離された骨髄細胞を、シングレットゲートし、CD19発現(B細胞マーカー)及びCD3発現(T細胞マーカー)に基づいて分類した。下パネル:CD19+ゲートB細胞を、IgMb抗体(野生型対立遺伝子から産生される抗体、B6対立遺伝子)またはIgMa抗体(再構成された重鎖可変ドメイン(hVH3−23(D)JH4)をコードする遺伝子的に修飾された対立遺伝子(129対立遺伝子)から産生される抗体)の存在に基づいて分類した。
野生型または6032ヘテロ接合性マウスから単離された脾臓細胞のFACS分析の結果を示す。上パネル:野生型またはF0 6032ヘテロ接合性のマウスから単離された脾臓細胞を、シングレットにゲートし、CD19発現(B細胞マーカー)及びCD3発現(T細胞マーカー)に基づいて分類した。下パネル:CD19+ゲートB細胞を、IgMb抗体(野生型対立遺伝子から産生される抗体、B6対立遺伝子)またはIgMa抗体(再構成された重鎖可変ドメイン(hVH3−23(D)JH4)をコードする遺伝子的に修飾された対立遺伝子(129対立遺伝子)から産生される抗体)の存在に基づいて分類した。
野生型または6032ヘテロ接合性のマウスから単離された血液細胞のFACS分析の結果を示す。上パネル:野生型またはF0 6032ヘテロ接合性のマウスから単離された血液細胞を、シングレットにゲートし、CD19発現(B細胞マーカー)及びCD3発現(T細胞マーカー)に基づいて分類した。下パネル:CD19+ゲートB細胞を、IgMb抗体(野生型対立遺伝子から産生される抗体、B6対立遺伝子)またはIgMa抗体(再構成された重鎖可変ドメイン(hVH3−23(D)JH4)をコードする遺伝子的に修飾された対立遺伝子(129対立遺伝子)から産生される抗体)の存在に基づいて分類した。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウス(6032HO)からの、採取された脾臓からのCD19+B細胞未熟B細胞(CD19+IgDintIgMhi)及び成熟B細胞(CD19+IgMloIgDhi)の総数のFACS分析の結果を示す。上パネル:野生型またはF2 6032ホモ接合性のマウスから単離された脾臓細胞を、シングレットにゲートし、CD19発現(B細胞マーカー)及びCD3発現(T細胞マーカー)に基づいて分類した。下パネルは、CD19+にゲートされ、免疫グロブリンD(IgD)及び免疫グロブリンM(IgM)に関して染色された、野生型マウス(WT)及び再構成された重鎖ヒト免疫グロブリン可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの脾細胞の代表的な等高線図を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
野生型(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中の、B細胞(CD19+)、成熟B細胞(CD19+IgDhiIgMlo)、及び未熟B細胞(CD19+IgDintIgMhi)の総数を示す。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウス(6032HO)からの、CD19+にゲートされたIgλ+及びIgκ+脾細胞の代表的な等高線図を示す。
野生型(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中のB細胞(CD19+)、Igκ+B細胞(CD19+Igκappa+)、及びIgλ+B細胞(CD19+Igラムダ+)の総数を示す。
野生型マウス及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスにおける末梢B細胞発生を示す。等高線図の1列目(左)は、未熟及び成熟B細胞を示すCD19+にゲートされたCD93+及びB220+脾細胞を示す。等高線図の2列目(中央)は、T1(IgD−IgM+CD21loCD23−)、T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+)、及びT3B細胞集団を示す未熟B細胞内のIgM+及びCD23+発現を示す。等高線図の3列目(右)は、辺縁帯B細胞を生じさせるより小さい第1の集団と濾胞性(FO)B細胞を生じさせる第2の集団とを示す、成熟B細胞のCD21+(CD35+)及びIgM+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄内の細胞の絶対数(左)、細胞の総数(中央)、及びB(CD19+)細胞の総数(右)を示す。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、免疫グロブリンM(IgM)及びB22に関して染色されたシングレットにゲートされた、骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄内の細胞の総数及び成熟B(B220hiIgM+)及び未熟B(B220intIgM+)を示す。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、免疫グロブリンM(IgM)及びB220に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)及び再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(VH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された、Igκ及びIgλ発現に関して染色された未熟(B220intIgM+)及び成熟(B220hiIgM+)B細胞にゲートされた、骨髄の代表的な等高線図を示す。
足蹠免疫付与後、第15日及び第24日のマウス血清(野生型または6031HET F0及びF1)中の抗原特異的mIgGのレベルを示す。
hVH3−23(D4−4_リーディングフレーム3)JH6(配列番号145)のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
hVH3−23(D4−4_リーディングフレーム2)JH6(配列番号146)のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
hVH3−23(D4−4_リーディングフレーム3)JH4(配列番号147)のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
hVH3−23(D4−4_リーディングフレーム2)JH4(配列番号148)のコドン最適化ヌクレオチド配列及び推定アミノ酸配列を示す。
2つの遺伝子的に修飾された二重軽鎖(dual light chain)(DLC)遺伝子座の例を示す。上の遺伝子座(DLC−5J)は、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する改変されたヒトDNA断片を含有する。下の遺伝子座(DLC−1J)は、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つのヒトJκ遺伝子セグメントを含有する改変されたヒトDNA断片を含有する。各遺伝子座は、内在性軽鎖定常領域(例えば、Cκ)に作動可能に連結されるヒトVκ領域を形成するように再構成することが可能である。全て、Frt組み換え部位を含有するネオマイシンカセットに(5’)上流に隣接する、免疫グロブリンプロモータ(P、遺伝子座の上の白矢印)、リーダーエクソン(L、短い白矢印)、及び2つのヒトVκ遺伝子セグメント(長い白矢印)が示される。ヒト遺伝子セグメント(Vκ及びJκ)の各々を用いて改変された組み換えシグナル配列は、各遺伝子セグメントと並ぶ白楕円によって示される。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメント(Jκ5)、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図21Dは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図21Eは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメント(Jκ5)、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図21Dは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図21Eは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメント(Jκ5)、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図21Dは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図21Eは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメント(Jκ5)、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図21Dは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図21Eは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメント(Jκ5)、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図21Dは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図21Eは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列(配列番号82)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図22Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列(配列番号82)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図22Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列(配列番号82)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図22Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び1つのヒトJκセグメントを含む免疫グロブリンκ遺伝子座の改変された部分のヌクレオチド配列(配列番号82)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図22Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図23Cは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図23Dは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図23Cは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図23Dは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図23Cは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図23Dは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメント、ならびにマウスエンハンサー及びIgκCアームを含む、免疫グロブリンカッパ遺伝子座の改変のための標的化ベクターの構築のための一般的な戦略を示す。図23Cは、この標的化ベクターのES細胞内への導入及びそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図23Dは、FLP酵素を使用したES細胞内の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列(配列番号83)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図24Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列(配列番号83)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図24Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列(配列番号83)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図24Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
2つのヒトVκセグメント(hVκ1−39及びhVκ3−20)及び5つのヒトJκセグメントを含む改変された免疫グロブリンκ遺伝子ヌクレオチド配列(配列番号83)を示し、ヌクレオチド配列は、改変されたヒト配列にわたり、5’及び3’末端の両方にて100塩基対の内在性マウス配列を含む。図24Dの下側は、種々の配列を描写するために使用される異なるフォントを説明する。
上パネルでは、野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、CD19+にゲートされ、ckit+及びCD43+に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレB細胞が、下パネルの等高線図上に記される。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)の大腿骨から採取された骨髄中のプロ(CD19+CD43+ckit+)及びプレ(CD19+CD43−ckit−)B細胞の数を示す。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、免疫グロブリンM(IgM)及びB220に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)の大腿骨から単離された骨髄中のB(CD19+)、未熟B(B220intIgM+)、及び成熟B(B220hiIgM+)細胞の総数を示す。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、免疫グロブリンM(IgM)及びB220に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)の大腿骨から単離された、Igκ及びIgλ発現に関して染色された未熟(B220intIgM+)及び成熟(B220hiIgM+)B細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
上パネルでは、野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、シングレットにゲートされ、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、CD19+にゲートされ、免疫グロブリンD(IgD)及び免疫グロブリンM(IgM)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟(WTに関して54、DLC−5Jに関して56.9)及び移行(WTに関して23.6、DLC−5Jに関して25.6)B細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)から採取された脾臓中のCD19+B細胞、移行B細胞(CD19+IgMhiIgDlo)、及び成熟B細胞(CD19+IgMloIgDhi)の総数を示す。
野生型マウス(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)からの、CD19+にゲートされたIgλ+及びIgκ+脾細胞の代表的な等高線図を示す。
野生型(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)から採取された脾臓中のB細胞(CD19+)、Igκ+B細胞(CD19+Igκ+)、及びIgλ+B細胞(CD19+Igλ+)の総数を示す。
2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウスにおける末梢B細胞発生を示す。第1の(左端)等高線図は、未熟(39.6)及び成熟(57.8)B細胞を示すCD19+にゲートされたCD93+及びB220+脾細胞を示す。第2の(上中央)等高線図は、T1(33.7、IgD−IgM+CD21loCD23−)、T2(21.2、IgDhiIgMhiCD21midCD23+)、及びT3(29.1)B細胞集団を示す未熟B細胞中のIgM+及びCD23+発現を示す。第3の(下中央)等高線図は、辺縁帯B細胞を生じさせる小集団(14.8)と、濾胞性(FO)B細胞を生じさせる第2の集団(70.5)とを示す、成熟B細胞のCD21+(CD35+)及びIgM+発現を示す。第4の(上右)等高線図は、辺縁帯(90.5、MZ)及び辺縁帯前駆体(7.3、IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B細胞集団を示す、成熟B細胞中のB220+及びCD23+発現を示す。第5の(下右)等高線図は、FO−I(79.0、IgDhiIgMloCD21midCD23+)及びFO−II(15.1、IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B細胞集団を示す、成熟B細胞中のIgD+及びIgM+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
野生型マウスにおける末梢B細胞発生を示す。第1の(左端)等高線図は、未熟(31.1)及び成熟(64.4)B細胞を示すCD19+にゲートされたCD93+及びB220+脾細胞を示す。第2の(上中央)等高線図は、T1(28.5、IgD−IgM+CD21loCD23−)、T2(28.7、IgDhiIgMhiCD21midCD23+)、及びT3(30.7)B細胞集団を示す未熟B細胞中のIgM+及びCD23+発現を示す。第3の(下中央)等高線図は、辺縁帯B細胞を生じさせる小集団(7.69)と、濾胞性(FO)B細胞を生じさせる第2の集団(78.5)とを示す、成熟B細胞のCD21+(CD35+)及びIgM+発現を示す。第4の(上右)等高線図は、辺縁帯(79.9、MZ)及び辺縁帯前駆体(19.4、IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B細胞集団を示す成熟B細胞中のB220+及びCD23+発現を示す。第5の(下右)等高線図は、FO−I(83.6、IgDhiIgMloCD21midCD23+)及びFO−II(13.1、IgDhiIgMhiCD21midCD23+)B細胞集団を示す成熟B細胞中のIgD+及びIgM+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
野生型(WT)ならびに2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)の採取された脾臓中の、移行、辺縁帯、及び濾胞性B細胞集団の総数を示す。
ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメント(Hκ)(VELOCIMMUNE(登録商標)マウスのヒト軽鎖)での内在性Vκ及びJκ遺伝子セグメントの置き換えに関してホモ接合性のマウス、野生型マウス(WT)、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)、ならびに2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−1J)における、Vκ3−20またはVκ1−39遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的PCRアッセイにおける、Vκ3−20由来及びVκ1−39由来軽鎖の骨髄(y軸)中の相対mRNA発現を示す。シグナルは、マウスCκの発現に正規化される。ND:検出無し。
ヒトVκ及びJκ遺伝子セグメント(Hκ)(VELOCIMMUNE(登録商標)マウスのヒト軽鎖)での内在性Vκ及びJκ遺伝子セグメントの置き換えに関してホモ接合性のマウス、野生型マウス(WT)、2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−5J)、ならびに2つのヒトVκ遺伝子セグメント及び1つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(DLC−1J)における、Vκ3−20またはVκ1−39遺伝子セグメントに特異的なプローブを使用した定量的PCRアッセイにおける、Vκ3−20由来及びVκ1−39由来軽鎖の全脾臓(y軸)中の相対mRNA発現を示す。シグナルは、マウスCκの発現に正規化される。ND:検出無し。
図34は、4つのヒスチジン残基をヒトVκ1−39及びVκ3−20軽鎖配列のCDR3へと改変するために使用される、選択される突然変異生成プライマーの配列及び特性(%GC含有量、N、%不整合、Tm)を示す。配列リスト内で使用されるこれらのプライマーに対する配列番号は、下の表に含まれる。F=順プライマー、R=逆プライマー
4つのヒスチジン残基及び5つのヒトJκで各々置換された2つのヒトVκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのES細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図35Bは、FLPo酵素を使用したES細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
4つのヒスチジン残基及び5つのヒトJκで各々置換された2つのヒトVκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのES細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図35Bは、FLPo酵素を使用したES細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
3つのヒスチジン残基をヒトVκ1−39及びVκ3−20軽鎖配列のCDR3へと改変するために使用される、選択される突然変異生成プライマーの配列及び特性(%GC含有量、N、%不整合、Tm)を示す。配列リスト内で使用されるこれらのプライマーに対する配列番号は、下の表に含まれる。F=順プライマー、R=逆プライマー。
3つのヒスチジン残基及び5つのヒトJκで各々置換された2つのヒトVκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのES細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図37Bは、FLPo酵素を使用したES細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
3つのヒスチジン残基及び5つのヒトJκで各々置換された2つのヒトVκ軽鎖セグメントを含む標的化ベクターのES細胞への導入、ならびにそれを有するヘテロ接合性マウスの生成を示し、図37Bは、FLPo酵素を使用したES細胞中の選択カセットの欠失を示す。ほとんどの実施形態では、別段に指示されない限り、黒塗りの形状及び実線は、マウス配列を表し、白い形状及び二重線は、ヒト配列を表す。図は、縮尺通りに提示されてはいない。
CDR3配列(上配列)中で3つのヒスチジン残基で各々置換された、2つのVカッパセグメント(Vκ3−20及びVκ1−39)を含むマウスにおいて発現されるIgM軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Vκ3−20配列(下配列)によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、整列は、生殖系列配列内に導入された3つ全てのヒスチジン置換を保持したマウスにおいて発現されるIgMカッパ鎖可変配列を示す。図38Bは、CDR3配列(各整列内の上配列)中で3つのヒスチジン残基で各々置換された、2つのVカッパセグメント(Vκ3−20及びVκ1−39)を含むマウスにおいて発現されるIgM軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Vκ1−39配列(各整列内の下配列)によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、上の整列は、生殖系列配列内に導入された3つ全てのヒスチジン修飾を保持したマウスにおいて発現されるIgMカッパ鎖可変配列を示し、下の整列は、生殖系列配列内に導入された3つのヒスチジン修飾のうちの2つを保持したマウスにおいて発現されるIgMカッパ鎖可変配列を示す。幾つかの実施形態では、Vκの最後の位置に導入されるヒスチジンは、V−J再構成中に失われる場合がある。
CDR3配列(上配列)中で3つのヒスチジン残基で各々置換された、2つのVカッパセグメント(Vκ3−20及びVκ1−39)を含むマウスにおいて発現されるIgM軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Vκ3−20配列(下配列)によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、整列は、生殖系列配列内に導入された3つ全てのヒスチジン置換を保持したマウスにおいて発現されるIgMカッパ鎖可変配列を示す。図38Bは、CDR3配列(各整列内の上配列)中で3つのヒスチジン残基で各々置換された、2つのVカッパセグメント(Vκ3−20及びVκ1−39)を含むマウスにおいて発現されるIgM軽カッパ鎖可変配列の例示的なアミノ酸翻訳を有するヒト生殖系列Vκ1−39配列(各整列内の下配列)によってコードされるアミノ酸配列の整列を示し、上の整列は、生殖系列配列内に導入された3つ全てのヒスチジン修飾を保持したマウスにおいて発現されるIgMカッパ鎖可変配列を示し、下の整列は、生殖系列配列内に導入された3つのヒスチジン修飾のうちの2つを保持したマウスにおいて発現されるIgMカッパ鎖可変配列を示す。幾つかの実施形態では、Vκの最後の位置に導入されるヒスチジンは、V−J再構成中に失われる場合がある。
重鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列を含み(MAID6032、「UHCマウス」)、2つのヒトVκ遺伝子セグメント(例えば、ヒトVκ1−39及びヒトVκ3−20遺伝子セグメント)及び5つのヒトJκ遺伝子セグメント(hJκ1−5、DLC−5J)を含有する遺伝子的に改変された軽鎖遺伝子座をさらに含む(MAID1912HO)、遺伝子的に修飾されたF2マウスのゲノム構造を例証する。
上パネルでは、遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメント(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)に関してホモ接合性のマウスとからの、シングレットにゲートされ、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。下パネルは、遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメント(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)に関してホモ接合性のマウスからの、CD19+にゲートされ、免疫グロブリンD(IgD)及び免疫グロブリンM(IgM)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟及び未熟B細胞が、等高線図の各々に記される。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とから採取された脾臓中の、CD19+B細胞、成熟B細胞(CD19+IgMloIgDhi)、及び未熟B細胞(CD19+IgMhiIgDint)の総数を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とからの、CD19+にゲートされたIgλ+及びIgκ+脾細胞の代表的な等高線図を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とから採取された脾臓中の、B細胞(CD19+)、Igκ+B細胞(CD19+Igκ+)、及びIgλ+B細胞(CD19+Igλ+)の総数を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とから採取された脾臓中のB細胞上のIgM表面発現のフローサイトメトリー分析を示す。細胞は、IgMに対する蛍光(PE−Cy7共役型)抗体を用いて染色された。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とにおける、末梢B細胞発生を示す。第1の(左端)等高線図は、未熟及び成熟B細胞を示すCD19+にゲートされたCD93+及びB220+脾細胞を示す。第2の(中)等高線図は、T1(IgD−IgM+CD21loCD23−)、T2(IgDhiIgMhiCD21midCD23+)、及びT3B細胞集団を示す未熟B細胞中のIgM+及びCD23+発現を示す。第3の(右)等高線図は、辺縁帯B細胞を生じさせる第1のより小さい集団と、濾胞性(FO)B細胞を生じさせる第2のより大きい集団とを示す、成熟B細胞のCD21+(CD35+)及びIgM+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とにおける末梢B細胞発生を示す。第1の(左)等高線図は、辺縁帯B細胞を生じさせる小集団と濾胞性(FO)B細胞を生じさせる第2の集団とを示す、成熟B細胞のCD21+(CD35+)及びIgM+発現を示す。第2の(中央)等高線図は、辺縁帯(MZ)及び辺縁帯前駆体(IgMhiIgDhiCD21hiCD23+)B細胞集団を示す、成熟B細胞中のB220+及びCD23+発現を示す。第3の(右)等高線図は、FO−I(IgDhiIgMintCD21intCD23+)及びFO−II(IgDhiIgMintCD21intCD23+)B細胞集団を示す、成熟B細胞中のIgD+及びIgM+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とからの、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)との大腿骨から採取された骨髄中のリンパ球の割合、細胞/大腿骨の総数、及びCD19+B細胞の数を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とからの、CD19+にゲートされ、ckit+及びCD43+に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレB細胞が、等高線図上に示される。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)との大腿骨から採取された骨髄中の、プレ(CD19+CD43−ckit−)及びプロ(CD19+CD43+ckit+)B細胞の数を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)とからの、免疫グロブリンM(IgM)及びB220に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)との大腿骨から単離された骨髄中の、細胞/大腿骨の総数、未熟B(B220intIgM+)、及び成熟B(B220hiIgM+)細胞の数を示す。
遺伝子的に修飾された対照マウス(VI3、1293HO1460HO)と、重鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列ならびに軽鎖遺伝子座中の2つのヒトVκ及び5つのヒトJκ遺伝子セグメントに関してホモ接合性のマウス(MAID1912HO6032HO、DLC×UHC)との大腿骨から単離された、Igλ及びIgκ発現に関して染色された未熟(B220intIgM+)及び成熟(B220hiIgM+)B細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
足蹠免疫付与前、足蹠免疫付与の第1のラウンドの23日後、足蹠免疫付与の第1のラウンドの5週後、及び足蹠免疫付与の第2のラウンド後の、マウス血清(野生型または1912HO6031HET(ホモ接合性DLC×ヘテロ接合性UHC))中の抗原特異的mIgGのレベルを示す。
図49は、カッパ軽鎖遺伝子座中に再構成された重鎖可変領域核酸配列(即ち、カッパ軽鎖定常核酸配列に作動可能に連結される再構成された重鎖VDJ配列)を含有する遺伝子的に修飾されたF1マウスのゲノム構造を例証する。
上パネルでは、野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、CD19+にゲートされ、ckit+及びCD43+に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレB細胞が、下パネルの等高線図上に記される。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から採取された骨髄中の、プロ(CD19+CD43+ckit+)及びプレ(CD19+CD43−ckit−)B細胞の数を示す。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、免疫グロブリンM(IgM)及びB220に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄中の、B(CD19+)及びプロ/プレB(IgM−B220+)細胞の総数を示す。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された骨髄中の、未熟B(B220intIgM+)及び成熟B(B220hiIgM+)細胞の数を示す。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの大腿骨から単離された、Igλ及びIgκ発現に関して染色された未熟(B220intIgM+)及び成熟(B220hiIgM+)B細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
上パネルでは、野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、シングレットにゲートされ、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。下パネルは、野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスからの、CD19+にゲートされ、免疫グロブリンD(IgD)及び免疫グロブリンM(IgM)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟(WTに関して56.9、カッパ上のhVH3−23/D/JH4に関して43)及び移行(WTに関して26.8、カッパ上のhVH3−23/D/JH4に関して34)B細胞が、等高線図の各々に記される。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中のCD19+B細胞、成熟B細胞(CD19+IgMloIgDhi)、及び移行B細胞(CD19+IgMhiIgDint)の総数を示す。
野生型マウス(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)からの、CD19+にゲートされたIgλ+及びIgκ+脾細胞の代表的な等高線図を示す。
野生型(WT)及びカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスから採取された脾臓中のB細胞(CD19+)、Igκ+B細胞(CD19+Igκ+)、及びIgλ+B細胞(CD19+Igλ+)の総数を示す。
野生型マウスと比較した、カッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列(hVH3−23/D/JH4)に関してホモ接合性のマウスの脾臓区画内の末梢B細胞発生を示す。第1の(左)等高線図は、未熟及び成熟B細胞を示す、CD19+にゲートされたCD93+及びB220+脾細胞を示す。第2の(中央)等高線図は、T1、T2、及びT3B細胞集団を示す、未熟B細胞中のIgM+及びCD23+発現を示す。第3の(右)等高線図は、辺縁帯B細胞を生じさせる第1のより小さい小集団と濾胞性(FO)B細胞を生じさせる第2のより大きい集団とを示す、成熟B細胞のCD21+(CD35+)及びIgM+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。
カッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性(MAID6079HO、ホモ接合性「カッパ上UHCマウス(UHC on kappa mouse)」)、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性(MAID1994HO、重鎖上カッパ(kappa on heavy)(「KoH」)マウス)の遺伝子的に修飾されたF2マウスのゲノム構造を例証する。
上パネルでは、VELOCIMMUNE(登録商標)(VI3)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウスからの、B及びT細胞(それぞれ、CD19+及びCD3+)に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。下パネルは、VELOCIMMUNE(登録商標)(VI3)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウスからの、CD19+にゲートされ、ckit+及びCD43+に関して染色された骨髄の代表的な等高線図を示す。プロ及びプレB細胞が、下パネルの等高線図上に記される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)の大腿骨から採取された骨髄中の、B細胞(CD19+)の総数ならびにプロ(CD19+CD43+ckit+)及びプレ(CD19+CD43−ckit−)B細胞の数を示す。数は、1大腿骨当たりの細胞の絶対数と細胞の割合との両方として提示される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)からの、免疫グロブリンM(IgM)及びB220に関して染色されたシングレットにゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。未熟、成熟、及びプロ/プレB細胞が、等高線図の各々に記される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)の大腿骨から単離された骨髄中の、未熟B(B220intIgM+)及び成熟B(B220hiIgM+)細胞の数を示す。数は、1大腿骨当たりの細胞の絶対数と細胞の割合との両方として提示される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)の大腿骨から単離された、Igλ及びIgκ発現に関して染色された未熟(B220intIgM+)及び成熟(B220hiIgM+)B細胞にゲートされた骨髄の代表的な等高線図を示す。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(VI3、1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)からの、CD19+にゲートされ、免疫グロブリンD(IgD)及び免疫グロブリンM(IgM)に関して染色された脾細胞の代表的な等高線図を示す。成熟及び移行/未熟B細胞が、等高線図の各々に記される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)から採取された脾臓中の、CD19+B細胞、成熟B細胞(CD19+IgMloIgDhi)、及び移行B細胞(CD19+IgMhiIgDlo)の総数を示す。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及び重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)から採取された脾臓中の、B細胞(CD19+)、Igκ+B細胞(CD19+Igκ+)、及びIgλ+B細胞(CD19+Igλ+)の総数を示す。数は、絶対細胞数とリンパ球の細胞割合との両方として提示される。
VELOCIMMUNE(登録商標)マウス(1242HO1640HO)、ならびにカッパ軽鎖遺伝子座中の再構成された重鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性、及びまた重鎖遺伝子座中のカッパ軽鎖可変領域核酸配列に関してホモ接合性のマウス(1994HO6079HO)の脾臓区画内の末梢B細胞発生を示す。上の等高線図は、未熟及び成熟B細胞を示すCD19+にゲートされた、CD93+及びB220+脾細胞を示す。下の等高線図は、T1、T2、及びT3B細胞集団を示す未熟B細胞中のIgM+及びCD23+発現を示す。各ゲート領域内の細胞の割合が示される。

実施例

0053

本発明は、記載される特定の方法及び実験条件に限定されず、したがって方法及び条件は変動する場合がある。本明細書に使用される専門用語は、単に特定の実施形態を説明する目的のためのみのものであり、本発明の範囲は特許請求の範囲によって定義されるため、限定的であることを意図されないことも理解されるべきである。

0054

別段に定義されない限り、本明細書に使用される全ての用語及び語句は、別段に明確に指示されるか、または用語または語句が使用される文脈から明らかでない限り、その用語及び語句が当該技術分野において獲得している意味を含む。本明細書に記載されるものと類似または等価の任意の方法及び材料を本発明の実践及び試験において使用することができるが、特定の方法及び材料をここに説明する。言及される全ての出版物は、参照により本明細書に援用される。

0055

用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、ジスルフィド結合によって相互に接続される4つのポリペプチド鎖、2つの重(H)鎖、及び2つの軽(L)鎖を含む、免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変ドメイン及び重鎖定常領域(CH)を含む。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、及びCH3を含む。各軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び軽鎖定常領域(CL)を含む。重鎖及び軽鎖可変ドメインは、フレームワーク領域(FR)と称されるより保存された領域が組み入れられた、相補性決定領域(CDR)と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。各重鎖及び軽鎖可変ドメインは、以下の順序アミノ末端からカルボキシ末端に構成される3つのCDR及び4つのFRを含む:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4(重鎖CDRは、HCDR1、HCDR2、及びHCDR3と略される場合があり、軽鎖CDRは、LCDR1、LCDR2、及びLCDR3と略される場合がある)。用語「高親和性」抗体とは、その標的エピトープに対して、約10−9M以下(例えば、約1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、または約1×10−12M)のKDを有する抗体を指す。1つの実施形態では、KDは、例えば、BIACORE(商標)などの表面プラズモン共鳴によって測定され、別の実施形態では、KDは、ELISAによって測定される。

0056

語句「二重特異性抗体」は、2つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な抗
体を含む。二重特異性抗体は概して、2つの非同一の重鎖を含み、各重鎖は、異なる分子(例えば、2つの異なる免疫原上の異なるエピトープ)上か、または同一の分子(例えば、同一の免疫原上の異なるエピトープ)上かのいずれかで、異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が、2つの異なるエピトープ(第1のエピトープ及び第2のエピトープ)を選択的に結合することが可能な場合、第1のエピトープに対する第1の重鎖の親和性は、概して、第2のエピトープに対する第1の重鎖の親和性よりも少なくとも1〜2、または3、または4桁以上小さく、逆もまた同様となる。二重特異性抗体によって特異的に結合されるエピトープは、同一または異なる標的上(例えば、同一または異なるタンパク質上)であることができる。例示的な二重特異性抗体としては、腫瘍抗原に特異的な第1の重鎖と、細胞毒性マーカー、例えば、Fc受容体(例えば、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIなど)、またはT細胞マーカー(例えば、CD3、CD28など)に特異的な第2の重鎖とを有するものが挙げられる。さらに、第2の重鎖可変ドメインは、異なる所望の特異性を有する重鎖可変ドメインで置換されることができる。例えば、腫瘍抗原に特異的な第1の重鎖と毒素に特異的な第2の重鎖とを有する二重特異性抗体は、毒素(例えば、サポリンビンカアルカロイドなど)を腫瘍細胞送達するように対にされることができる。他の例示的な二重特異性抗体としては、活性化受容体(例えば、B細胞受容体、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcαRI、T細胞受容体など)に特異的な第1の重鎖と、抑制性受容体(例えば、FcγRIIB、CD5、CD22、CD72、CD300aなど)に特異的な第2の重鎖とを有するものが挙げられる。かかる二重特異性抗体は、細胞活性化(例えば、アレルギー及び喘息)に関連付けられる治療条件のために構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同一または異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列と融合させることができ、かかる配列は、免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞中に発現させることができる。典型的な二重特異性抗体は、3つの重鎖CDR、及びそれに続く(N末端からC末端へ)CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを各々有する2つの重鎖と、エピトープ結合特異性を付与しないが、各重鎖に関連することができるか、または各重鎖に関連することができ、重鎖エピトープ結合領域によって結合されるエピトープのうちの1つ以上に結合することができるか、または各重鎖に関連することができ、重鎖のうちの一方または両方の一方または両方のエピトープへの結合を可能にする免疫グロブリン軽鎖とを有する。同様に、用語「三重特異性抗体」は、3つ以上のエピトープを選択的に結合することが可能な抗体を含む。

0057

用語「細胞」は、組み換え核酸配列を発現するために好適な任意の細胞を含む。細胞としては、原核生物及び真核生物単細胞または多細胞)の細胞、細菌細胞(例えば、大腸菌バチルス属種、ストレプトマイセス属種の株など)、マイコバクテリウム細胞真菌細胞酵母細胞(例えば、出芽酵母分裂酵母、P.パストリス、P.メタノリカなど)、植物細胞昆虫細胞(例えば、SF−9、SF−21、バキュロウイルス感染昆虫細胞、キンウワバなど)、非ヒト動物細胞ヒト細胞、または、例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合が挙げられる。幾つかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、真核性であり、以下の細胞から選択される:CHO(例えば、CHO K1、DXB−11 CHO、Veggie−CHO)、COS(例えば、COS−7)、網膜細胞、Vero、CV1、腎臓(例えば、HEK293、293EBNA、MSR293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC5、Colo205、HB8065、HL−60、(例えば、BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮性)、CV−1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS−0、MMT060562、Sertoli細胞、BRL3A細胞、HT1080細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述の細胞に由来する細胞株。幾つかの実施形態で
は、細胞は、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞(例えば、PER.C6(商標)細胞)など、1つ以上のウイルス遺伝子を含む。

0058

語句「相補性決定領域」、または用語「CDR」は、通常(即ち、野生型動物において)免疫グロブリン分子(例えば、抗体またはT細胞受容体)の軽鎖または重鎖の可変領域内の2つのフレームワーク領域間出現する有機体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。CDRは、例えば、生殖系列配列、または再構成されたもしくは再構成されていない配列によって、また例えば、未感作もしくは成熟したB細胞もしくはT細胞によって、コードされることができる。CDRは、体細胞変異される(例えば、動物の生殖系列でコードされる配列と異なる)、ヒト化される、及び/またはアミノ酸置換、付加、もしくは欠失で修飾されることができる。ある環境では(例えば、CDR3に関して)、CDRは、例えば、配列のスプライシングまたは接続(例えば、重鎖CDR3を形成するようなV−D−J組み換え)の結果、連続していない(例えば、再構成されていない核酸配列内で)が、B細胞核酸配列内で連続している2つ以上の配列(例えば、生殖系列配列)によって、コードされることができる。

0059

用語「保存」は、保存アミノ酸置換を説明するために使用されるとき、類似の化学的特性(例えば、電荷または疎水性)を有する側鎖R基を有する別のアミノ酸残基による、アミノ酸残基の置換を含む。概して、保存アミノ酸置換は、例えば、所望の親和性で標的エピトープに特異的に結合する可変領域の能力など、タンパク質の関心の機能性特性を実質的に変化させないであろう。類似の化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例としては、脂肪族側鎖、例えば、グリシンアラニンバリンロイシン、及びイソロイシンなど、脂肪族ヒドロキシル側鎖、例えば、セリン及びトレオニンなど、アミド含有側鎖、例えば、アスパラギン及びグルタミンなど、芳香族側鎖、例えば、フェニルアラニンチロシン、及びトリプトファンなど、塩基性側鎖、例えば、リジンアルギニン、及びヒスチジンなど、酸性側鎖、例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸など、ならびに硫黄含有側鎖、例えば、システイン及びメチオニンなどが挙げられる。保存アミノ酸置換基としては、例えば、バリン/ロイシン/イソロイシン、フェニルアラニン/チロシン、リジン/アルギニン、アラニン/バリン、グルタメートアスパルテート、及びアスパラギン/グルタミンが挙げられる。幾つかの実施形態では、保存アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング突然変異生成において使用される、タンパク質内の任意の天然の残基のアラニンでの置換であることができる。幾つかの実施形態では、参照により本明細書に援用されるGonnet et al.(1992)Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database,Science 256:1443−45に開示される、PAM250対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する保存置換が作製される。幾つかの実施形態では、置換は、置換が、PAM250対数尤度マトリックスにおいて非負の値を有する中程度の保存置換である。

0060

幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖中の残基位置は、1つ以上の保存アミノ酸置換だけ異なる。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能性断片(例えば、例えば、B細胞からの、発現及び分泌を可能にする断片)中の残基位置は、そのアミノ酸配列が本明細書に記載されているが1つ以上の保存アミノ酸置換だけ異なる軽鎖と、同一ではない。

0061

語句「エピトープ結合タンパク質」は、少なくとも1つのCDRを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えば、約1マイクロモル以下(例えば、約1×10−6M、1×10−7M、1×10−9M、1×10−9M、1×10−10M、1×10−11M、または約1×10−12MのKD)のKDでエピトープに結合することが可能なタンパク質を含む。治療用エピトープ結合タンパク質(例えば、治療用抗体)は、ナノ
モルまたはピコモル範囲内のKDを要することが多い。

0062

語句「機能性断片」は、発現され、分泌され、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲内のKDでエピトープに特異的に結合することができる、エピトープ結合タンパク質の断片を含む。特定の認識としては、少なくともマイクロモル範囲、ナノモル範囲、またはピコモル範囲内のKDを有することが挙げられる。

0063

語句「重鎖」、または「免疫グロブリン重鎖」は、任意の有機体からの、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む免疫グロブリン重鎖配列を含む。

0064

語句「重鎖」、または「免疫グロブリン重鎖」は、任意の有機体からの、免疫グロブリン重鎖定常領域配列を含む、免疫グロブリン重鎖配列を含む。重鎖可変ドメインは、別段に特定されない限り、3つの重鎖CDR及び4つのFR領域を含む。重鎖の断片としては、CDR、CDR及びFR、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメイン(N末端からC末端へ)の次に、CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、及びCH3ドメインを有する。重鎖の機能性断片は、エピトープを特異的に認識する(例えば、マイクロモル、ナノモル、またはピコモル範囲内のKDでエピトープを認識する)ことが可能であり、細胞から発現及び分泌することが可能であり、少なくとも1つのCDRを含む、断片を含む。重鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するVH、DH、及びJHセグメントのレパートリーに由来するVH、DH、及びJHセグメントを含む、可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の有機体に関するV、D、及びJ重鎖セグメントに関する配列、場所、及び述語体系は、IMGTデータベース、www.imgt.orgに見出すことができる。

0065

用語「同一性」は、配列と併せて使用されるとき、当該技術分野において既知である、ヌクレオチド及び/またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用することができる異なるアルゴリズムの数によって決定される同一性を含む。本明細書に記載される幾つかの実施形態では、同一性は、10.0の開放ギャップペナルティ(open gap penalty)、0.1の延長ギャップペナルティ(extend gap penalty)を採用するClustalW v.1.83(slow)整列を使用して、及びGonnet類似度マトリックス(MACベクター(商標)10.0.2、MacVector Inc.、2008)を使用して決定される。配列の同一性に関して比較される配列の長さは、具体的な配列に依存することになるが、軽鎖定常ドメインの場合、長さは、標準的な軽鎖定常ドメインを形成するような自己会合が可能な、例えば、例えば、ベータストランドを含む2つのベータシートを形成することが可能であり、また少なくとも1つのヒトまたはマウスのCH1ドメインと相互作用することが可能である、軽鎖定常ドメインへ折り畳むのに十分な長さの配列を含有するべきである。CH1ドメインの場合、配列の長さは、ベータストランドを含む2つのベータシートを形成することが可能であり、少なくとも1つのマウスまたはヒトの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なCH1ドメインへと折り畳むのに十分な長さの配列を含有するべきである。

0066

語句「免疫グロブリン分子」は、2つの免疫グロブリン重鎖及び2つの免疫グロブリン軽鎖を含む。重鎖は、同一であっても異なっていてもよく、また軽鎖は、同一であっても異なっていてもよい。

0067

語句「軽鎖」は、任意の有機体からの免疫グロブリン軽鎖配列を含み、また別段に特定されない限り、ヒトカッパ及びラムダ軽鎖ならびにVpreB、ならびに代替軽鎖を含む。軽鎖可変ドメインは、別段に特定されない限り、典型的には3つの軽鎖CDR及び4つのフレームワーク(FR)領域を含む。概して、全長軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、FR1−CDR1−FR2−CDR2−FR3−CDR3−FR4を含む可変
ドメイン、及び軽鎖定常領域を含む。軽鎖可変ドメインは、概して、生殖系列中に存在するV及びJセグメントのレパートリーに由来するVL及びJLセグメントを含む、軽鎖可変領域遺伝子配列によってコードされる。種々の有機体に関するV及びJ軽鎖セグメントに関する配列、場所、及び述語体系は、IMGTデータベース、www.imgt.orgに見出すことができる。軽鎖としては、例えば、その中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される第1かまたは第2かのいずれかのエピトープを、選択的に結合しないものが挙げられる。軽鎖としてはまた、その中にそれらが出現するエピトープ結合タンパク質によって選択的に結合される1つ以上のエピトープに結合及び認識するか、または重鎖がそれらに結合及び認識するのを助けるものが挙げられる。共通のまたはユニバーサルな軽鎖としては、ヒトVκ1−39Jκ5遺伝子またはヒトVκ3−20Jκ1遺伝子に由来するものが挙げられ、またそれらの体細胞変異された(例えば、親和性成熟された)バージョンが挙げられる。二重軽鎖(DLC)としては、2つ以下のヒトVκセグメント、例えば、ヒトVκ1−39遺伝子セグメント及びヒトVκ3−20遺伝子セグメントを含む軽鎖遺伝子座に由来するものが挙げられ、またそれらの体細胞変異された(例えば、親和性成熟された)バージョンが挙げられる。

0068

語句「体細胞超変異された」は、クラススイッチされたB細胞中の免疫グロブリン可変領域の核酸配列(例えば、重鎖可変ドメインをコードするか、または重鎖CDRまたはFR配列を含むヌクレオチド配列)が、例えば、クラススイッチを受けたB細胞とクラススイッチを受けていないB細胞との間でのCDRまたはフレームワーク核酸配列の差異など、クラススイッチ以前のB細胞中の核酸配列と同一ではない、クラススイッチを受けたB細胞からの核酸配列への言及を含む。「体細胞変異された」は、親和性成熟されていないB細胞中の対応する免疫グロブリン可変領域配列(即ち、生殖系列細胞のゲノム中の配列)と同一ではない親和性成熟されたB細胞からの核酸配列への言及を含む。語句「体細胞変異された」はまた、核酸配列が、関心のエピトープへのB細胞の曝露以前の対応する核酸配列と異なる、関心のエピトープへのB細胞の曝露後のB細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含む。語句「体細胞変異された」は、免疫原攻撃に応答して、例えば、ヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスなどの動物において生成され、またかかる動物において本来作動する選択プロセスから得られる抗体からの配列を指す。

0069

用語、核酸配列に関して「再構成されていない」は、動物細胞の生殖系列中に存在する核酸配列を含む。

0070

語句「可変ドメイン」は、配列内に(別段に指示のない限り)N末端からC末端へ以下のアミノ酸領域を含む、(所望により修飾された)免疫グロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を含む:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。

0071

用語「作動可能に連結される」は、作動可能に連結される成分がその意図される様式で機能する関係性を指す。一例では、タンパク質をコードする核酸配列は、適切な転写調節を保持するように、調節配列(例えば、プロモータ、エンハンサー、サイレンサー配列など)に作動可能に連結されてもよい。一例では、免疫グロブリン可変領域(またはV(D)Jセグメント)の核酸配列は、免疫グロブリン重鎖または軽鎖配列への配列間の適切な組み換えを可能にするように、免疫グロブリン定常領域の核酸配列に作動可能に連結されてもよい。

0072

「機能性」は、例えば、機能性ポリペプチドに関して、本明細書で使用されるとき、通常は天然タンパク質に関連付けられる少なくとも1つの生物学的活性を保持するポリペプチドを含む。別の例では、機能性免疫グロブリン遺伝子セグメントは、再構成された免疫グロブリン遺伝子配列を生成するような生産的な再構成が可能な可変遺伝子セグメントを
含んでもよい。

0073

中性pH」は、約7.0〜約8.0の間のpH、例えば、約7.0〜約7.4の間のpH、例えば、約7.2〜約7.4の間、例えば、生理的pHを含む。「酸性pH」は、6.0以下のpH、例えば、約5.0〜約6.0の間のpH、約5.75〜約6.0の間のpH、例えば、エンドソームまたはリソソーム区画のpHを含む。

0074

用語「多型変異体」は、本明細書で使用されるとき、1つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸が、与えられた配列と比較して異なるヌクレオチドまたはアミノ酸によって置換されている配列を含む。ヒト免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメント(VH遺伝子)の多型対立遺伝子は、主に遺伝子セグメントの挿入/欠失、及びコード領域内での単一のヌクレオチドの差異の結果であり、そのどちらも、免疫グロブリン分子における機能的な帰結を有する可能性を有する。一般的なヒト免疫グロブリンVH遺伝子の多型対立遺伝子の例は、当該技術分野において周知である(例えば、参照によりその全体が本明細書に援用される、US第13/653,456号を参照)。

0075

用語「実質的」または「実質的に全て」は、遺伝子セグメントの量に関して使用されるとき(例えば、「実質的に全て」のV、D、またはJ遺伝子セグメント)は、機能性及び非機能性遺伝子セグメントの両方を含み、また種々の実施形態では、例えば、全てのV、D、またはJ遺伝子セグメントの80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上を含む。種々の実施形態では、「実質的に全ての」遺伝子セグメントは、機能性(即ち、非偽遺伝子)遺伝子セグメントの、例えば、少なくとも95%、96%、97%、98%、または99%を含む。

0076

再構成された重鎖可変領域遺伝子配列、及び任意追加的に、再構成されていない軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリーを含む非ヒト動物
二重の抗原結合特性を有する多様な二重特異性抗体が開発されてきたが、従来の二重特異性抗体では、重鎖かまたは軽鎖かのいずれかの可変領域のみが各別々の抗原決定基の結合に寄与しているのに対し、標準的な抗体では、軽鎖と重鎖との両方の可変領域が同一の抗原決定基の結合に寄与することができるため、従来の二重特異性抗体における軽鎖または重鎖可変領域の特異性及び親和性は、ある程度犠牲にされなければならなかった。

0077

したがって、重鎖可変領域から独立して抗原に結合する能力を有する軽鎖可変領域の生成は、抗原結合分子(例えば、VLと融合される(例えば、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される)重鎖定常領域を含む二重特異性結合分子)、特に、同一または類似の重鎖定常領域を有するが、異なる特異性及び/または親和性を伴うVLを有するヘテロ二量体を含む、重鎖可変ドメインを含まないものにおける使用のための軽鎖可変ドメイン(VL)を作製するのに有用であることができる。

0078

重鎖可変領域から独立して抗原に結合することができるかかる軽鎖可変ドメインを産生するための1つのアプローチは、軽鎖(VL)の可変領域またはドメインをコードするヌクレオチド配列に選択的圧力印加して、より多様な抗原結合レパートリーを有する軽鎖CDR3を生成することである。本明細書に開示されるように、これは、そのゲノム中に再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する遺伝子的に修飾された非ヒト動物を生成することによって達成することができる。重鎖配列は、これらの動物において共通のまたはユニバーサルな(即ち、同一または極めて類似の)配列に制限されるため、軽鎖可変領域ヌクレオチド配列(即ち、遺伝子)は、重鎖可変領域から独立して抗原決定基に結合することができる、より多様で効率的な抗原結合特性を有する軽鎖CDR3を作製せざるを得ないであろう。さらに、本明細書に開示されるように、生殖系列可変領域遺伝子セグメントの正確な置き換えは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を部分
的に有する動物(例えば、マウス)を(例えば、相同的組み換え媒介遺伝子の標的化によって)作製することを可能にする。何故なら、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座は、正常に再構成、超変異、及び体細胞変異(例えば、クラススイッチ)するため、部分的なヒト免疫グロブリン遺伝子座は、ヒト可変領域を含む動物において抗体を生成する。これらの動物は、野生型動物に実質的に類似の体液性免疫系を示し、−動物が、ヒト可変領域遺伝子セグメントの完全なレパートリーを欠損している場合であっても−正常な細胞集団及び正常なリンパ器官構造を見せる。これらの動物(例えば、マウス)を免疫付与することは、可変遺伝子セグメント利用の幅広い多様性を見せる強固な体液性応答をもたらす。可変領域をコードするヌクレオチド配列は、特定及びクローン化され、次に、例えば、特定の使用に好適な任意の免疫グロブリンアイソタイプなどの任意の選択された配列と(例えば、インビトロステムにおいて)融合されることができ、ヒト配列に完全に由来する抗体または抗原結合タンパク質をもたらすことができる。

0079

それに加えて、制限された(限定された)軽鎖可変領域遺伝子セグメントレパートリー、例えば、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメントを含む制限された軽鎖可変セグメントレパートリー(例えば、二重軽鎖または「DLC」、米国特許出願公開第2013/0198880号、その全体は本明細書に援用される)を有する動物(例えば、マウスまたはラット)を、上述の再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列と組み合わせて利用することによって、免疫グロブリン重鎖可変ドメインとより効率的に対を成すことができる免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを産生することができる。さらに、ヒスチジンコドンを、例えば、1つ以上のヒスチジンコドンの付加またはヒスチジンコドンでの1つ以上の非ヒスチジンコドの置換を介して、上述の非ヒト動物のゲノム中の限定された軽鎖可変遺伝子セグメントへ導入することによって、改善されたpH依存性リサイクル可能性を抗原結合タンパク質(例えば、二重特異性または三重特異性抗体)に付与することができる軽鎖可変領域アミノ酸配列を生成することができる。

0080

幾つかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、同時に多様性を限定しながら抗体のより大きい収率を提供し、それによって、単一の再構成された軽鎖可変領域を含む非ヒト動物(例えば、ユニバーサル軽鎖(「ULC」)マウス、例えば、参照により本明細書に援用される米国付与前公開(U.S.pre−grant publication)第2013/0185821号を参照)において生成された重鎖との、軽鎖の成功した対形成の可能性を増加させる。幾つかの実施形態では、軽鎖は、それ自体で抗原結合特性を示すことができる。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、その軽鎖内に存在する抗原特異性を示す抗原結合タンパク質を産生するように誘発されることができる(例えば、マウスまたはラットの重鎖遺伝子座を、単一の再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子座で置き換えることによってなど、例えば、マウスまたはラットの免疫グロブリン重鎖レパートリーを限定することによって)。幾つかの実施形態では、かかる動物において産生される抗原結合タンパク質(例えば、抗体)は、その軽鎖結合を通して、特定の第1のエピトープ(例えば、エフェクター抗原、細胞毒性分子、Fc受容体、毒素、活性化または抑制性受容体、T細胞マーカー、免疫グロブリン輸送体など)に特異的であろう。これらの非ヒト動物に由来するかかるエピトープ特異的ヒト軽鎖は、例えば、ULCマウスまたはラットなどの限定された軽鎖レパートリーを有するマウスに由来するヒト重鎖と共発現されてもよく、重鎖は、第2のエピトープ(例えば、異なる抗原上の第2のエピトープ)に結合するその能力に基づいて選択される。

0081

種々の態様では、その生殖系列ゲノム中に、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(即ち、再構成された重鎖VDJ配列)を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、非ヒト動物が、提供される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト
免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされる免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、重鎖定常ドメインに作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメインの2つのコピー、3つのコピー、4つのコピー、またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含むように、修飾される。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードする。例えば、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の少なくとも1つ、2つ、3つ、4つ、5つのコピーをコードすることができる。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のコピーをコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子座は、重鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。

0082

他の態様では、ヒトまたは非ヒト軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される再構成された重鎖可変ドメインをコードする免疫グロブリン軽鎖遺伝子座(即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む軽鎖遺伝子座)を含有するように遺伝子的に改変された、非ヒト動物が提供される。例えば、幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列(即ち、予め設計されたVDJ領域、即ち、共通またはユニバーサルな重鎖配列)は、再構成された重鎖配列を、カッパかまたはラムダかのいずれかの、マウスまたはラット軽鎖遺伝子座中へ標的化することによって、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されることができる。したがって、幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された非ヒト動物によって発現される再構成された重鎖可変ドメインは、非ヒト動物に対して免疫原性ではない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の2つのコピー、3つのコピー、4つのコピー、またはそれ以上をコードするヌクレオチド配列を含むように、修飾される。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーをコードすることができる。例えば、ヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のコピーをコードする。幾つかの実施形態では、遺伝子座は、軽鎖定常ドメイン遺伝子配列に作動可能に連結される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列の複数のコピーを含む。

0083

種々の態様では、本明細書に記載される非ヒト動物の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、非ヒト軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される、軽鎖可変遺伝子セグメントの限定されたレパートリー、例えば、1つ以上であるが野生型より少ない数のヒトVL遺伝子セグメントと、1つ以上のヒトJL遺伝子セグメントとを含む。したがって、そのゲノム中に、(i)ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む、遺伝子的に修飾された非ヒト動物が提供される。幾つかの実施形態では、軽鎖定常領域は、ラットまたはマウス定常領域、例えば、ラットまたはマウスCκ定常領域である。幾つかの実施形態では、ヒト可変領域遺伝子セグメントは、抗体のヒト可変ドメインを再構成及びコードすることが可能であり、非ヒト動物は、内在性VL遺伝子セグメントを含まない。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、5つのヒトJκ遺伝子セグメント、例え
ば、Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、及びJκ5遺伝子セグメントを含む。幾つかの実施形態では、免疫グロブリン軽鎖遺伝子座は、2つのヒトVL遺伝子セグメント、Vκ1−39及びVκ3−20を含む。幾つかの実施形態では、1つ以上(例えば、2、3、4、または5つ)のヒトVL遺伝子セグメント及び2つ以上のヒトJL遺伝子セグメントは、内在性軽鎖遺伝子座に、例えば、内在性カッパ軽鎖遺伝子座に存在する。幾つかの実施形態では、マウスは、機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、マウスは、非機能性λ軽鎖遺伝子座を含む。幾つかの実施形態では、1つ以上のヒトVH、1つ以上のヒトDH、及び1つ以上のヒトJH遺伝子セグメントは、マウスまたはラット重鎖定常領域配列に作動可能に連結される。

0084

幾つかの実施形態では、そのゲノム中に(i)ヒトまたは非ヒト重鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される再構成されたヒト重鎖可変領域核酸配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座と、(ii)軽鎖定常領域核酸配列に作動可能に連結される2つ以上であるが野生型より少ない数のヒト免疫グロブリン軽鎖可変VL及びJL遺伝子セグメントを含む免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、を含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウス、またはその免疫グロブリン遺伝子座の他の修飾を含有するマウス(即ち、遺伝子的に修飾された対照マウス、例えば、マウスの体液性免疫系が野生型マウスのものと同様に機能する、VELOCIMMUNE(登録商標)マウス)において観察される数と、実質的に同一のCD19+B細胞数及び成熟B細胞数を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓中の未熟B細胞数の増加を示す。特定の実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓中の未熟B細胞数の約2倍、約3倍、約4倍、または約5倍以上の増加を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスはまた、脾臓B細胞中でのカッパ及びガンマ軽鎖利用に関して、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された対照マウスに実質的に類似する。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓B細胞における増加された表面IgM(即ち、1細胞当たりのより多いIgM表面発現)を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、脾臓区画内のB細胞発生の種々の段階を通して、例えば、未熟、T1、及び/または辺縁帯B細胞の増加などの、変更された末梢B細胞発生を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスにおいて示される数に実質的に類似の骨髄区画内のCD19+B細胞の数を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、より少ない骨髄中のプロB細胞を示す。特定の実施形態では、骨髄区画内のプロB細胞の数は、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、約2倍、約5倍、約10倍、約15倍、約20倍、約25倍、またはそれ以上低減される。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、約2倍、約3倍、約4倍、約5倍などのより少ない骨髄中の未熟及び/または成熟B細胞を示す。幾つかの実施形態では、かかるマウスは、遺伝子的に修飾された対照マウスと比較して、ラムダ軽鎖遺伝子の利用に関して、骨髄区画内の僅かな偏向(例えば、2倍の増加)を示す。

0085

別の態様では、(a)再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列(即ち、第1のヌクレオチド配列は、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第1のヌクレオチド配列は、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第1のヌクレオチド配列と、(b)ヒト軽鎖可変ドメインをコードする第2のヌクレオチド配列(即ち、第2のヌクレオチド配列は、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列である)であって、第2のヌクレオチド配列は、重鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される、第2のヌクレオチド配列と、を含む、遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む、非ヒト動物が提供される。例えば、幾つかの実施形態では、予め設計されたVDJ領域からの再構成された重鎖(即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列、即ち、共
通またはユニバーサルな重鎖配列)は、再構成された重鎖配列を、カッパかまたはラムダかのいずれかの、マウス軽鎖遺伝子座中へ標的化することによって、軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結されることができる。したがって、他の実施形態でのように、この遺伝子的に改変された免疫グロブリン遺伝子座は、非ヒト動物の生殖系列ゲノム中に存在する。重鎖定常領域遺伝子配列との作動可能な連結においてヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む遺伝子的に修飾された非ヒト動物は、参照により本明細書に援用される米国付与前公開第2012/0096572号に記載される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、κ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、ヒトκ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、λ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、マウスまたはラットλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインをコードする第1のヌクレオチド配列は、ヒトλ軽鎖定常領域遺伝子配列に作動可能に連結される。

0086

幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列(例えば、カッパ軽鎖遺伝子)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウス、または免疫グロブリン遺伝子座に他の修飾を有する遺伝子的に修飾されたマウス(即ち、遺伝子的に修飾された対照マウス、例えば、マウスの体液性免疫系が野生型マウスのものと同様に機能する、VELOCIMMUNE(登録商標)マウス)と比較して、変更された骨髄中のCD19+及びプレB細胞頻度を提示する。特定の実施形態では、骨髄中のCD19+B細胞及びプレB細胞数は、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、2倍低い、3倍低い、4倍低い、または5倍低い。特定の実施形態では、骨髄中の未熟B細胞の数は、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、2倍少ない、3倍少ない、4倍少ない、または5倍少ない。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列(例えば、カッパ軽鎖遺伝子)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、骨髄細胞中にラムダ軽鎖遺伝子を発現しないか、または本質的に発現しない。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列(例えば、カッパ軽鎖遺伝子)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、低減されたレベルの脾臓B細胞を有する。特定の実施形態では、脾臓B細胞及び成熟B細胞のレベルは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、2倍少ない、3倍少ない、4倍少ない、または5倍少ない。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列(例えば、カッパ軽鎖遺伝子)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、脾臓B細胞中にラムダ軽鎖遺伝子を発現しないか、または本質的に発現しない。特定の実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含有する免疫グロブリン軽鎖遺伝子座と、再構成されていないヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン配列(例えば、カッパ軽鎖遺伝子)を含有する免疫グロブリン重鎖遺伝
子座とを含む遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスまたは遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座対照マウスと比較して、脾臓中のT1相における増加された細胞の頻度を有する。

0087

幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。本明細書では、マウスにおける再構成されたヒト重鎖可変ドメイン(即ち、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス)を採用する実施形態が、広範囲に述べられているが、再構成されたヒト重鎖可変ドメインをコードする遺伝子的に修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む他の非ヒト動物も、提供される。かかる非ヒト動物としては、本明細書に開示される再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を発現するように遺伝子的に修飾されることができるもののいずれかが挙げられ、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギブタウシ属(例えば、雌牛、雄水牛)、シカヒツジヤギニワトリネコイヌフェレット霊長類(例えば、マーモセットアカゲザル)などが挙げられる。例えば、好適な遺伝子的に修飾可能なES細胞が容易に利用可能ではないこれらの非ヒト動物に関しては、遺伝子修飾を含む非ヒト動物を作製するために、他の方法が採用される。かかる方法としては、例えば、非ES細胞ゲノム(例えば、線維芽細胞または誘導多能性細胞)を修飾すること、及び体細胞核移植(SCNT)を採用して、遺伝子的に修飾されたゲノムを好適な細胞、例えば、除核卵母細胞へ移植し、胚を形成するのに好適な条件下で、修飾された細胞(例えば、修飾された卵母細胞)を非ヒト動物内で温めることが挙げられる。非ヒト動物ゲノム(例えば、ブタ、雌牛、齧歯動物、ニワトリなどのゲノム)を修飾するための方法としては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を採用して、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含むようにゲノムを修飾することが挙げられる。

0088

幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、小型の哺乳動物、例えば、トビネズミまたはネズミ上科のものである。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された動物は、齧歯動物である。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。幾つかの実施形態では、齧歯動物は、ネズミ上科から選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾された動物は、カンガルーハムスター科(例えば、マウス様ハムスター)、キヌゲネズミ科(例えば、ハムスター、新世界ラット及びマウス、ハタネズミ)、ネズミ科トゥルーマウス及びラット(true mice and rat)、アレチネズミトゲネズミ、タテガミネズミ(crested rat))、アシナガマウス科(キノボリマウス(climbing mice)、イワマウス(rock mice)、ウィテールドラット(with−tailed rat)、マダガスカルラット及びマウス)、トゲヤマネ科(例えば、トゲヤマネ)、及びメクラネズミ科(例えば、モールレート、タケネズミ、及びモグラネズミ)から選択される科に由来する。特定の実施形態では、遺伝子的に修飾された齧歯動物は、トゥルーマウスまたはラット(ネズミ科)、アレチネズミ、トゲネズミ、及びタテガミネズミから選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾されたマウスは、ネズミ科のメンバーに由来する。幾つかの実施形態では、動物は、齧歯動物である。特定の実施形態では、齧歯動物は、マウス及びラットから選択される。幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、マウスである。

0089

幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6N、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、及びC57BL/Olaから選択されるC57BL系のマウスである齧歯動物である。別の実施形態では、マウスは、129系である。幾つかの実施形態では、129系は、129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例えば、129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、12
9S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(例えば、Festing et al.(1999)Revised nomenclature for strain
129 mice,Mammalian Genome 10:836を参照、同様にAuerbach et al.(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv− and C57BL/6−Derived Mouse Embryonic Stem Cell Linesも参照)から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、遺伝子的に修飾されたマウスは、前述の129系と前述のC57BL系(例えば、C57BL/6系)との混合である。別の実施形態では、マウスは、前述の129系の混合、または前述のC57BL/6系の混合である。幾つかの実施形態では、混合の129系は、129S6(129/SvEvTac)系である。別の実施形態では、マウスは、129/SvEv由来系とC57BL/6由来系との混合である。特定の実施形態では、マウスは、Auerbach et al.2000 BioTechniques 29:1024−1032に記載されるように、129/SvEv由来系とC57BL/6由来系との混合である。別の実施形態では、マウスは、BALB系、例えば、BALB/c系である。別の実施形態では、マウスは、BALB系(例えば、BALB/c系)と前述の別の系との混合である。

0090

幾つかの実施形態では、非ヒト動物は、ラットである。幾つかの実施形態では、ラットは、Wistarラット、LEA系、Sprague Dawley系、Fischer系、F344、F6、ACI、及びDark Agouti(DA)から選択される。幾つかの実施形態では、ラット系は、Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6、ACI、及びDark Agouti(DA)から成る群から選択される系のうちの2つ以上の混合である。

0091

幾つかの実施形態では、その生殖系列ゲノム中に再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列を含む免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型マウスと比較して本質的に正常な脾臓成熟及び未熟B細胞集団を生成する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、脾臓B細胞中で、野生型と比較して僅かな軽鎖ラムダ遺伝子配列の利用の減少を有する。特定の実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、脾臓B細胞中で、野生型より2倍、3倍、4倍、または5倍低い頻度で軽鎖ラムダ遺伝子配列を使用する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型と比較して、T1集団脾臓B細胞の僅かな減少及び辺縁帯脾臓B細胞の増加を有する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、骨髄中に正常に近いB細胞集団を有する。幾つかの実施形態では、かかる遺伝子的に修飾されたマウスは、野生型においてラムダ遺伝子配列が使用される頻度の半分または半分未満の頻度でラムダ遺伝子配列を使用する。

0092

種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、再構成された重鎖可変ドメイン(例えば、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列)は、ヒトV、D、及びJ遺伝子配列またはセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインは、ヒト生殖系列Vセグメント、ヒト生殖系列Dセグメント、及びヒト生殖系列Jセグメントに由来する。幾つかの実施形態では、ヒトVHセグメントは、ヒト集団において観察される変異体に対応する。

0093

種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトV遺伝子セグメントは、VH1−2、VH1−3、VH1−8、VH1−18、VH1−24、VH1−45、VH1−46、VH1−58、VH1−69、VH2−5、VH2−26、VH2−70、VH3−7、VH3−9、VH3−11、VH3−13、VH3−15、VH3−16、VH3−20、VH3−21、VH3−23、VH3−30、VH3−30−3、VH3−3
0−5、VH3−33、VH3−35、VH3−38、VH3−43、VH3−48、VH3−49、VH3−53、VH3−64、VH3−66、VH3−72、VH3−73、VH3−74、VH4−4、VH4−28、VH4−30−1、VH4−30−2、VH4−30−4、VH4−31、VH4−34、VH4−39、VH4−59、VH4−61、VH5−51、VH6−1、VH7−4−1、VH7−81、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトVセグメントは、VH3−23またはその多型変異体である。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトD遺伝子セグメントは、D1−1、D1−7、D1−14、D1−20、D1−26、D2−2、D2−8、D2−15、D2−21、D3−3、D3−9、D3−10、D3−16、D3−22、D4−4、D4−11、D4−17、D4−23、D5−12、D5−5、D5−18、D5−24、D6−6、D6−13、D6−19、D6−25、D7−27、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、ヒトまたは非ヒト動物重鎖定常領域配列は、CH1、ヒンジ、CH2、CH3、及びそれらの組み合わせから選択される配列を含む。特定の実施形態では、定常領域配列は、CH1、ヒンジ、CH2、及びCH3を含む。種々の実施形態では、本明細書に記載されるように、ヒトJ遺伝子セグメントは、JH1、JH2、JH3、JH4、JH5、JH6、及びそれらの多型変異体から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、ヒトVH3−23/GY/JH4−4の配列をコードする(配列番号137)。幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列によってコードされ、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列から発現される再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトVH3−23/X1X2/Jの配列を含む(X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である)。幾つかの実施形態では、X1は、Glyであり、X2は、Tyrである。幾つかの実施形態では、再構成された重鎖可変ドメインは、ヒトVH3−23/X1X2/JH4−4の配列を含む(X1は、任意のアミノ酸であり、X2は、任意のアミノ酸である)。幾つかの実施形態では、X2は、フェニル基を含むアミノ酸である。特定の実施形態では、X2は、Tyr及びPheから選択される。

0094

幾つかの実施形態では、再構成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域ヌクレオチド配列は、動物において自己反応性でない(非免疫原性)ヒトDセグメントを含む。幾つかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、マウスの成熟B細胞の重鎖可変配列中に発現されることが可能なヒトDセグメントを含む。幾つかの実施形態では、Dセグメントは、ヒトVH、ヒトD、及びヒトJHセグメントを含むヒト化された免疫グロブリン遺伝子座を含むマウスにおいて発現されたセグメントである。

0095

種々の実施形態は、VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスに由来する特徴または配列情報を利用または包括する。VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスは、内在性遺伝子座における、マウス免疫グロブリン重鎖(IgH)及び免疫グロブリン軽鎖(例えば、κ軽鎖、Igκ)の生殖系列可変領域の、対応するヒト免疫グロブリン可変領域での正確で大規模な置き換えを含有する(例えば、その全内容が参照により本明細書に援用される米国6,596,541号及び米国8,502,018号を参照)。総じて、約6のマウス遺伝子座のメガ塩基対が、約1.5のヒトゲノム配列のメガ塩基対で置き換えられる。この正確な置き換えは、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する重鎖及び軽鎖を作製するハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスをもたらす。マウスVH−D−JH及びVκ−Jκセグメントの正確な置き換えは、ハイブリッド免疫グロブリン遺伝子座において隣接するマウス配列を無傷で機能性のまま残す。マウスの体液性免疫系は、野生型マウスのものと同様に機能する。B細胞発生は、いかなる顕著な点に関しても妨げられず、ヒト可変領域の豊富な多様性が、抗原攻撃に際してマウスにおいて生成される。さらに、VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスは、免疫付与に対して、本質的に正常な野生型応答を見せ、それは、ただ1つの顕著な点においてのみ野
生型と異なる−免疫付与に応答して生成される可変領域は、完全にヒトである。VELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスは、重鎖及びκ軽鎖に関する免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒト及びマウスにおいて類似して再構成するため、可能である。遺伝子座は、同一ではないが十分に類似しており、その結果、重鎖可変遺伝子遺伝子座のヒト化は、全てのVH、D、及びJH遺伝子セグメントを含有する約3百万の塩基対の連続したマウス配列を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座からの基本的に等価の配列をカバーする約百万の塩基の連続したヒトゲノム配列で置き換えることによって達成することができる。例えば、幾つかの実施形態では、Dセグメントは、抗原で免疫付与されたVELOCIMMUNE(登録商標)ヒト化マウスの成熟B細胞中に発現される重鎖に由来し、Dセグメントは、2つ以下のアミノ酸を重鎖CDR3配列に送る。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ