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技術 免疫原、それを用いた抗体の製造方法、及び、そのモノクローナル抗体

出願人 パナソニックIPマネジメント株式会社
発明者 中山浩
出願日 2015年1月6日 (5年10ヶ月経過) 出願番号 2015-000670
公開日 2016年7月11日 (4年4ヶ月経過) 公開番号 2016-124835
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 生物学的材料の調査,分析 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード コレクタ装置 ガスクロマトグラフ質量分析 検出作業 アスピレータ イオナイザ ウェル注入 赤外線スペクトル 微粉末状
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年7月11日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (2)

課題

合成カンナビノイドを検出するために必要なモノクローナル抗体、及びその作製方法の提供。

解決手段

合成カンナビノイドに対して特異的な抗体の製造するために有用なハプテンが下記式とキャリヤータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンが結合した免疫原を準備。免疫原を動物マウスウサギなど)に免疫し、特異的な抗体を作製する。

概要

背景

合成カンナビノイドを検出するためには、通常迅速にかつ正確に検出作業を行うことが要請される。また上記合成カンナビノイドの検出においては、微量成分の分析を行うことも要請される。

従来、合成カンナビノイドを検出する方法として、ガスクロマトグラフ質量分析GC−MS)や液体クロマトグラフ質量分析(LC−MS)あるいは、特許文献1に開示されているイオナイザコレクタ装置による測定方法があった。

概要

合成カンナビノイドを検出するために必要なモノクローナル抗体、及びその作製方法の提供。合成カンナビノイドに対して特異的な抗体の製造するために有用なハプテンが下記式とキャリヤータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンが結合した免疫原を準備。免疫原を動物マウスウサギなど)に免疫し、特異的な抗体を作製する。

目的

さらに、前記免疫原を動物(マウス、ウサギなど)に免疫し、特異的な抗体を作製することができるモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

請求項1に記載の免疫原を接種する段階を有することを特徴とするモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法

請求項3

請求項2に記載のモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法により作製され、前記化合物に結合能を有するモノクローナル抗体を産生する細胞ラインである、下記のうちのいずれかのモノクローナル抗体産生細胞ライン、寄託番号NITEBP−01955として寄託された細胞ライン、寄託番号NITEBP−01956として寄託された細胞ライン、寄託番号NITEBP−01957として寄託された細胞ライン。

請求項4

請求項3に記載の細胞ラインにより産生されるモノクローナル抗体であって、前記化合物と反応することを特徴とするモノクローナル抗体。

技術分野

0001

本発明は、法的管理および健康管理などの産業分野において、合成カンナビノイドの検出するために必要な抗体、その作製方法、及び免疫原に関する。

背景技術

0002

合成カンナビノイドを検出するためには、通常迅速にかつ正確に検出作業を行うことが要請される。また上記合成カンナビノイドの検出においては、微量成分の分析を行うことも要請される。

0003

従来、合成カンナビノイドを検出する方法として、ガスクロマトグラフ質量分析GC−MS)や液体クロマトグラフ質量分析(LC−MS)あるいは、特許文献1に開示されているイオナイザコレクタ装置による測定方法があった。

先行技術

0004

特表2007−515619号公報

発明が解決しようとする課題

0005

従来法であるGC−MSやLC−MSの感度は約ppmオーダーであり、さらには不純物が存在した場合には、著しく感度低下を引き起こす課題があった。

0006

そのため、前処理としてある程度の不純物を除去する必要があり、結果として測定時間も長時間(30分以上)かかるという問題があった。

課題を解決するための手段

0007

前記従来の課題を解決するために、本発明の免疫原(合成カンナビノイド免疫原)は、構造式(化1)の構造を有した化合物キャリヤータンパク質であるキーホールリンペットヘモシアニンと結合したものである。

0008

さらに、前記免疫原を動物マウスウサギなど)に免疫し、特異的な抗体を作製することができるモノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法を提供することができる。

0009

また、前記モノクローナル抗体産生細胞ライン作製方法により、前記化合物に結合能を有するモノクローナル抗体を産生する細胞ラインである、下記のうちのいずれかのモノクローナル抗体産生細胞ラインを提供することができる。寄託番号NITEBP−01955として寄託された細胞ライン、寄託番号NITE BP−01956として寄託された細胞ライン、寄託番号NITE BP−01957として寄託された細胞ライン。

0010

さらに、前記記載の細胞ラインにより産生される前記化合物と反応するモノクローナル抗体。

発明の効果

0011

本発明の合成カンナビノイド誘導体および抗体作製法より高性能な抗体を作製することが可能となる。また、上記抗体を用いることにより合成カンナビノイドを迅速にかつ正確に分析できる。

図面の簡単な説明

0012

3種類のモノクローナル抗体のELISAによる結合能評価図

実施例

0013

以下本発明の実施の形態について、図面を参照しながら説明する。

0014

以下実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。

0015

以下、カルボキシル基所有した合成カンナビノイド誘導体の作製方法及びこの抗体を用いた合成カンナビノイドの検出方法について説明する。

0016

(1)合成カンナビノイド誘導体の合成
2.5Mエチルマグネシウムブロミド(1.65mmol)を1.1mlエーテル溶媒中に添加し、しばらく0℃で撹拌した。この溶液に、あらかじめ1.1mlエーテル溶媒で溶解したインドール(1.3mmol)を徐々に添加し、添加終了後30分間、室温で撹拌した。

0017

撹拌しながら、予め1mlエーテル溶媒で溶解した1−ナフトイルクロライド(1.46mmol)を徐々に添加した。その反応液は1.5時間、室温で撹拌しながら放置した。その後、飽和塩アンモニウム水溶液を反応液と同体積添加することにより反応を停止させると共に、微粉末状になるまで撹拌を続けた。この粉末をろ過し、適当量の水で洗浄した後に適当量のエーテルで洗浄した。粉末を1mlメタノールで溶解した後に、1ml水酸化ナトリウム水溶液(0.4g/ml)を添加し、室温で18時間撹拌した。沈殿物をろ過後に適当量のメタノール、水、エーテルで洗浄した。その後、100℃真空下で乾燥させ、0.25gの3−(1−ナフトイル)インドール混合物を得た。この混合物を精製することなく次の合成ステップに利用した。

0018

0.2g3−(1−ナフトイル)インドール混合物を1.5mlジメチルスルフォキシドDMSO)で溶解した後に、0.6g水酸化カリウムを添加した。この反応液に1−ブロモヘプタン酸(5.5mmol)を徐々に添加し、85℃で18時間撹拌した。反応液を適量の水で希釈した後に、適量の酢酸エチルで3度抽出した。抽出物濃縮後、クロマトグラフィーシリカ担体溶出液石油エーテル/=7/1)により精製し、0.1g1−ヘプタン酸−3−(1−ナフトイル)インドール(収率:41%)を得ることができた。

0019

得られた反応生成物の構造は、赤外線スペクトル及びNMRデータにより上記式(化1)であることを同定した。

0020

(2)免疫原の合成
10mg合成カンナビノイド誘導体を1mlのDMSOに溶解後、5mgエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド(EDC)を添加し、1時間、室温で撹拌した。その溶液を、予め100mgのキーホールリンペットヘモシアニン(KLH)を5mlの生理食塩水を含むリン酸緩衝液[(pH7.4)PBSバッファ]に溶解した溶液に、撹拌しながら徐々に添加した。その後、更に8時間、室温で撹拌した。

0021

この溶液を予め、0.25μmフィルターで沈殿物を除去した後に、セファデックスG−25カラム(溶出液:PBSバッファ)により未反応物の合成カンナビノイド誘導体を除去することにより、免疫原である合成カンナビノイド誘導体−KLH(濃度:1mg/ml)を得た。

0022

(3)免疫
上記で作製した1mg/mL免疫原に同体積のアジュバント(ヒト結核死菌合有完全フロイントアジュバント和光純薬製、H37Rv)を添加し、よくホモジナイザ(1000rpm)で乳化した。生後約8週のマウスに、免疫原を含むアジュバントエマルジョンを100μlずつ10箇所に注射した。

0023

2週間後、1mg/mL免疫原に同体積の不完全フロイントアジュバントをホモジナイザで乳化し、このエマルジョンをマウスに100μlずつ10箇所に注射したその後、4、6、8週間後に再度 免疫原を含む不完全フロイントアジュバントエマルジョンを同様に注射した。注射後、1週間目採血し、以下に示す抗体産生を確認した。

0024

(4)血清評価
採取した血清を、酵素免疫測定法(ELISA)により抗体産生の確認をした。固相として0.1mg/mL・BSA−PBS−Az(0.04重量%ナトリウムアジドPBS溶液ウシ血清アルブミン(以下BSAという)を0.1mg/mLの濃度で溶解したもの)で調製した2.5μg/mL合成カンナビノイド誘導体−BSAを100μl/ウェルずつ使用した。第二抗体としてペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体またはペルオキシダーゼ標識抗マウスIgM抗体を使用した。その結果、合成カンナビノイド誘導体抗体の産生が認められるとともに、IgGIgM比が100以上ありクラススイッチが起こっていることを確認した。

0025

(5)細胞融合
免疫したマウスの中で特に力価の高かった2匹の脾臓肥大させるために、ブースト(弱い免疫原の注射)をした。免疫原は、1mg/mL合成カンナビノイド誘導体−KLH溶液をアジュバントを、加えずにそのまま用いた。ブースト後3日を経過したマウスの脾臓細胞摘出し、平均分子量1,500のポリエチレングリコールを用いた常法により、マウス骨髄腫由来細胞ライン(P3X63−Ag8.653)と融合した。フィーダー成長因子を供給する細胞)として同じマウスの脾臓細胞を用い、96ウェルプレート2枚の上で15重量%のウシ胎児血清(以下、FCS)を含むイシコフ培地で1日間培養した後(100μl/ウェル)、2倍濃度のヒポキサンチンアミノブテリンチミジンHAT)培地を100μl/ウェル添加してCO2インキュベータCO2濃度:5体積%、温度:37℃、湿度:95%)内で1週間培養した。その後、培養上清を除いた後、15重量%のFCSを含むヒポキサンチン/チミジン(HT)培地(250μl/ウェル)と交換した。

0026

(6)細胞選別
HT培地と交換1週間後、培養上清を200μl/ウェルずつ取り出した。15重量%のFCSを含むHT培地(200μl/ウェル)を添加し、3日間培養し後培養上清を200μl/ウェルずつ取り出した。合計で培養上清を400μl/ウェルを得ることができた。この培養上清を用いて以下に示すELISA法により合成カンナビノイド誘導体−BSAに対する結合能を測定した。固相として0.1mg/mLBSA・PBS・Azで調整した2.5μg/mL合成カンナビノイド誘導体−BSA溶液を100μl/ウェルずつ使用した。抗体液として細胞培養上清を使用した。この結果、合成カンナビノイド誘導体−BSAに対して結合能を示したものは3ウェルあった。

0027

(7)クローニング
上記3ウェルの細胞についてウェルあたり1ケの細胞が含まれる濃度に希釈(限界希釈)し、96ウェルのマイクロプレート3枚に分注した。フィーダーとして生後5週のマウス(Balb/c)の線細胞を用いて初期増殖を促した。プレートのサイズを上げながら培養を進め、適時上清についてELISA法によるスクリーニングを繰り返し、合成カンナビノイド誘導体−BSAに対して高い力価を示し、かつ良好な増殖を示している細胞ラインを最終的に選別し、200ml中で5×105細胞/mLの濃度に至るまで培養を進めた。最終的に、合成カンナビノイド誘導体−BSAに対して結合能を示した3株を選定した。

0028

これらの細胞ラインは、寄託番号NITEBP−01955、寄託番号NITE BP−01956、寄託番号NITE BP−01957として、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託された。受託日(原寄託日)は、2014年10月27日である。

0029

(8)細胞の保存
最終的に選別された細胞ラインは、上清を遠心分離し、5×106 細胞/mLの濃度でFCS:ジメチルスルフォキシド=9:1(体積比)の溶液1mLに浮遊させ、−80℃で凍結した後、−135℃に移して長期保存状態にした。

0030

(9)抗体の精製
採取した培養液を遠心分離より単離した後に、その上清についてプロティン結合ゲル(プロティンAセファロースCL−4B、ファルマシア製)を用いたアフィニティークロマトグラフィにより、細胞培養上清からモノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体はSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により、標準蛋白との比較から、精製抗体は分子量約50,000のH鎖と約25,000のL鎖からなるIgGであることを確認した。

0031

(10)抗体の評価
上記のアフィニティクロマトグラフィにより精製したモノクローナル抗体について以下に示す酵素免疫測定法(ELISA法)で抗体評価を行った。

0032

ELISA法
(A)抗原コーティング
予め合成カンナビノイド誘導体と牛血清アルブミン(BSA)とを結合させた2.5μg/mL合成カンナビノイド誘導体—BSAをマイクロプレート(塩化ビニル製96ウェルプレートコスター社製)に抗原溶液を100μl/ウェル注入し、20度で一晩保存した。実験直前に、アスピレータで抗原溶液を除去した。

0033

(B)ブロッキング
BSA−PBS−Azを200μl/ウェル注入し、30分間室温で放置した。その後、アスピレータでBSA−PBS−Azを除去した。即日に以降の実験を行わないときは、この状態で、水で湿したろ紙と共に4度で保存した。

0034

(C)抗体の反応
1重量%BSA−PBS−Azで希釈した抗体溶液希釈倍率:100〜1000000倍)を100μl/ウェル振とうしながら加えた。常温で3時間保存した後、アスピレータで抗体溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、アスピレータで残存するPBSを除去した。

0035

(D)第2抗体の反応
0.2μg/mLのペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体ヤギ由来(KPL社製)を1重量%BSAのPBS溶液に溶解したもの、または0.2μg/mLのペルオキシダーゼ標識抗マウスIgM抗体ヤギ由来(KPL社製)を1重量%BSAのPBS溶液に溶解したものを50μl/ウェル注入し、常温で30分放置した。アスピレータで除去し、PBSで3回洗浄し、さらにアスピレータで残存するPBSを除去した。

0036

(E)基質の反応と停止
O−フェニレンジアミン生化学用)40mgを10mLのクエン酸一リン酸バッファー(pH5)に溶解し、使用直前に30重量%過酸化水素水4μLを加えた溶液(基質溶液)を100μl/ウェル注入し、室温放置した。5分後、4N硫酸を25μl/ウェル注入して反応を停止した。

0037

(F)測定
東洋ソーダマイクロプレートリーダを用いて492nmの吸光度を測定した。

0038

本発明は、法的管理および健康管理などの産業分野において、利用されうる。

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