図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2016年5月23日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (2)

課題

タバコに含まれる化学物質は、分子量が小さいために血液脳関門を通過する。しかし、これらの化学物質により大きな分子量の物が結合すれば、血液脳関門を通過できず、化学物質の影響を抑制することが可能になる。

解決手段

本発明は、タバコ抽出液抗原として雌性鳥類に免疫する工程と、前記雌性鳥類が産卵した卵黄から抗体を得る工程を含むことを特徴とするタバコ抗体の製造方法を提供する。本発明によって製造される抗タバコダチョウ抗体は、有害な化学物質に結合し、化学物質の血液脳関門通過を抑制するので、タバコによる依存性緩和することができる。

概要

背景

タバコおよびタバコの煙には多くの化学物質が含まれており、発ガン性物質とされるものもあるとされている。これらの化学物質は、分子量が小さい。そのため、喫煙によって血中に移行すると、脳の血液脳関門(Blood−Brain Barrier)を通過し、神経細胞にさまざまな生理活性作用を与える。これがさまざまな中毒発展する。

このようなタバコ中の化学物質を検知し、無力化しようとする提案はすでにされている。特許文献1には、アフラトキシンベンゾピレンと特異的に結合するモノクロナール抗体で、これらのトキシンを無力化することが開示されている。

概要

タバコに含まれる化学物質は、分子量が小さいために血液脳関門を通過する。しかし、これらの化学物質により大きな分子量の物が結合すれば、血液脳関門を通過できず、化学物質の影響を抑制することが可能になる。本発明は、タバコ抽出液抗原として雌性鳥類に免疫する工程と、前記雌性鳥類が産卵した卵黄から抗体を得る工程を含むことを特徴とするタバコ抗体の製造方法を提供する。本発明によって製造される抗タバコダチョウ抗体は、有害な化学物質に結合し、化学物質の血液脳関門通過を抑制するので、タバコによる依存性緩和することができる。

目的

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたもので、タバコに含まれる複数の化学物質に結合するタバコ抗体と、そのようなタバコ抗体を大量に製造する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

タバコ抽出液抗原として雌性鳥類に免疫する工程と、前記雌性鳥類が産卵した卵黄から抗体を得る工程を含むことを特徴とするタバコ抗体の製造方法。

請求項2

前記鳥類がダチョウであることを特徴とする請求項1に記載されたタバコ抗体の製造方法。

請求項3

請求項1または2に記載の製造方法で得た抗体。

請求項4

請求項3の抗体を有するタバコフィルター

請求項5

請求項3の抗体を有するマスク

請求項6

請求項3の抗体を用いた検査キット

請求項7

請求項3の抗体を用いた飲み薬。

請求項8

請求項3の抗体を用いた注射薬

請求項9

請求項3の抗体を用いたガム

請求項10

請求項3の抗体を用いた歯磨剤

技術分野

0001

タバコ抽出液に含まれるニコチンベンゾピレンメチルエチルニトロソアミンタールを含むタバコ抽出液に含まれる低分子化合物に結合する抗体とその製造方法に関する。

背景技術

0002

タバコおよびタバコの煙には多くの化学物質が含まれており、発ガン性物質とされるものもあるとされている。これらの化学物質は、分子量が小さい。そのため、喫煙によって血中に移行すると、脳の血液脳関門(Blood−Brain Barrier)を通過し、神経細胞にさまざまな生理活性作用を与える。これがさまざまな中毒発展する。

0003

このようなタバコ中の化学物質を検知し、無力化しようとする提案はすでにされている。特許文献1には、アフラトキシン、ベンゾピレンと特異的に結合するモノクロナール抗体で、これらのトキシンを無力化することが開示されている。

先行技術

0004

特表2003−516723号公報

発明が解決しようとする課題

0005

タバコに含まれる化学物質は、分子量が小さいために血液脳関門を通過する。しかし、これらの化学物質により大きな分子量の物が結合すれば、血液脳関門を通過できず、化学物質の影響を抑制することが可能になる。

0006

ここで、タバコの化学物質に結合するものとして抗体は非常に効果的であると考えられる。しかし、特許文献1に開示されているようなモノクロナール抗体では、タバコに含まれる多くの化学物質を対象とすることは難しい。また、モノクロナール抗体を大量に作製するには大規模設備が必要となる。

課題を解決するための手段

0007

本発明は上記の課題に鑑みて想到されたもので、タバコに含まれる複数の化学物質に結合するタバコ抗体と、そのようなタバコ抗体を大量に製造する方法を提供する。

0008

より具体的に本発明に係るタバコ抗体の製造方法は、タバコ抽出液を抗原として雌性鳥類に免疫する工程と、前記雌性鳥類が産卵した卵黄から抗体を得る工程を含むことを特徴とする。

発明の効果

0009

本発明に係るタバコ抗体の製造方法は、タバコ抽出液を抗原としてダチョウを含む雌性鳥類に免疫し、産卵された卵の卵黄から抗体(IgY)を得る。したがって、均質で大量の抗体を得ることができる。また、得られた抗体はポリクロナール抗体であって、タバコ抽出液中の複数の化学物質に結合することができる。

0010

したがって、タバコ中の化学物質を検知し、取り去ることができる。また後述するように本発明に係るタバコ抗体が結合した化学物質は、血液脳関門の通過を抑制されるので、タバコの脳への影響を抑制することが可能となる。

図面の簡単な説明

0011

免疫前ダチョウ抗体と抗タバコダチョウ抗体が結合したニコチンの血液脳関門の通過量を測定したグラフである。

0012

以下本発明に係る抗体について説明する。なお、以下の説明は本発明の一実施形態を示すものであり、本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、以下の実施形態および実施例は改変されてもよい。

0013

本発明はタバコの抽出液を抗原として用いる。この抽出液中には、多くの化学物質が含まれている。したがって、この抗原から得られる抗体は、複数の化学物質に対して結合することができると考えられる。ここでは、ニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミン、タールについて効果が確認された。

0014

ニコチンは、タバコの依存性を高めるものとして知られている。これはタバコの煙中にも残存し、副流による受動喫煙によっても体内に取り込まれる。また、タールは、PM2.5と呼ばれるエアロゾル中にも含まれる。PM2.5は、空気中に浮遊する粒子エアロゾル)の中で大きさが2.5μm以下のものを指す。

0015

ベンゾピレンは5つのベンゼン環が結合した多環芳香族炭化水素で、発癌性があると言われている。メチルエチルニトロソアミンも発癌性があると言われている。

0016

雌性鳥類に対して免疫する工程では、公知の方法を利用することができる。免疫の際は、抗原とともに各種アジュバンドを利用することができる。また、免疫も初回免疫の後、追加免疫してもよい。

0017

利用できる鳥類としては、ウズラニワトリ、ダチョウ等が利用できる。特に、体の大きなダチョウが好適に利用できる。タバコの抽出液は、基本的に毒性を有するので、体型の小さな鳥類は、免疫した際に死亡する場合もあるからである。

0018

免疫後の鳥類から得られた卵から抗体(IgY)を回収する工程では、公知の方法で抗体を回収することができる。回収された抗体は、タバコの抽出液中の化学物質に結合する。この結合によってタバコ中の化学物質を検知し、捕獲することができる。また、タバコ抗体が結合した化学物質は血液脳関門の通過が抑制される。したがって、これらの化学物質の脳への生理活性を抑制することができる。

0019

得られたタバコ抗体は、タバコのフィルタ、飲み薬、注射薬ガム歯磨剤混入させることができる。また、タバコの葉自体に混入させておいてもよい。タバコ抗体は、いわゆるフィルタ付き巻きたばこのフィルタに含ませておくことで、喫煙時に体内に流れる煙中の化学物質を捕獲することができる。

0020

また、飲み薬や注射薬にすることで、体内に取り込まれたタバコの化学物質が脳内の神経細胞に作用することを抑制することができる。また、ガムや歯磨剤に混入させることで、喫煙後口腔内残留した化学物質に結合し、これらの物質が脳内の神経細胞に作用することを抑制する。

0021

さらに、タバコの葉自体に混入させると、フィルタ無し(いわゆる両切りタバコ)を喫煙する場合であっても、化学物質の体内への取り込みを抑制することができる。

0022

<抗原>
市販のフィルタ無しタバコの1本から、タバコの葉のみを取り出し、1mlのPBSで十分にホモジネートし、40,000RPMで30分遠心分離後、上澄みを回収した。得られた液をタバコ抽出液とした。

0023

<抗体の製造方法>
成熟したメス(ダチョウ、ニワトリ、ウズラ)を用いた。タバコ抽出液(原液)0.2mLをそれぞれフロイント完全アジュバント0.2mLと混和し、ダチョウ、ニワトリ、ウズラに初回免疫した。各抗原を個別に5羽のダチョウ、5羽のニワトリ、5羽のウズラに接種した。したがって、ダチョウもニワトリもウズラも同量の抗原を接種したことになる。初回免疫後、2週目と4週目に0.2mLの各抗原とフロイントの不完全アジュバント混和液を、各鳥に追加免疫した。ダチョウは全羽生存したが、鶏は途中で4羽死亡、ウズラも4羽死亡した。

0024

初回免疫後8週目に得られた各鳥からの卵の卵黄より卵黄抗体(IgY)を精製した。得られた卵黄抗体の反応性ELISAにより検証した。具体的には、まず、得られた卵の卵黄に5倍量のTBS(20mMのTris−HCl、0.15MのNaCl、0.5%NaN3)と同量の10%デキストラン硫酸/TBSを加え20分攪拌した。

0025

次に1MのCaCl2/TBSを卵黄と同量加え攪拌し、12時間静置した。その後、15000rpmで20分遠心上清を回収した。そして、最終濃度が40%になるように硫酸アンモニウムを加え4℃で12時間静置した。

0026

12時間の静置後、15000rpmで20分遠心し、沈殿物を回収した。最後に、卵黄と同量のTBSに再懸濁し、TBSにて透析した。以上の方法で、各卵から純度90%の抗体(IgY)が回収できた。

0027

ELISA法
各卵黄から得られたタバコ抗体のタバコの化学物質に対する反応性はELISAにより検証した。具体的には、まず96穴ELISAプレートの各穴にニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミン、タールをそれぞれ別々に5μgを固層化した(室温で4時間)。

0028

その後、ダチョウ抗体(各5羽のダチョウ)、ニワトリ抗体(生存した1羽のニワトリ)、ウズラ抗体(生存した1羽のウズラ)の段階希釈液(原液は2mg/mL)を各穴に滴下し、室温で1時間反応させた。洗浄後、各抗体に対するHRP標識2次抗体を室温で1時間反応させた。十分な洗浄後、ペルオキシダーゼ用発色キット(S−Bio SUMILON)を用いてプレートリーダーにて吸光度(450nm)を測定した。免疫前の各鳥種の卵黄抗体の2倍以上の吸光度値を示す最大希釈倍率をELISA値として示した。結果を表1に示す。

0029

0030

ダチョウ、ニワトリ、ウズラにおいて、ニコチン、ベンゾピレン、メチルエチルニトロソアミンに対する卵黄抗体が作製されることが判明した。特に、各鳥種類には同量の抗原を免疫したのにもかかわらず、巨大なダチョウが最も反応性が高い抗体が産生されていた。これは、ダチョウを使うことで、少量の抗原でも高感度の抗体が産生できることを示している。

0031

次に、タバコ抽出液を免疫して作製したダチョウ抗体(抗タバコダチョウ抗体)を用いて、ニコチンの脳内拡散防止の効果について確認した。

0032

血液脳関門のin vitroモデルとしては、ファーマコセル社製BBBキット(以下単に「BBBキット」と呼ぶ。)を用いた。

0033

まず、BBBキットのwell上層部にニコチン(最終濃度300μg/mL)と免疫前ダチョウ抗体(最終濃度1mg/mL)を37℃1時間反応させたものを添加した。2日後にwellの下部チャンバー下層)に透過したニコチン量液クロマトグラフィーにて測定した。免疫前ダチョウ抗体とは、タバコ抽出液を免疫する前のダチョウが産卵した卵の卵黄から上記に示した方法で得た抗体(IgY)である。

実施例

0034

一方で、ニコチン300μg/mLに抗タバコダチョウ抗体(最終濃度1mg/mL)を1時間37℃反応させたものも別wellに添加し、同様に下層に透過したニコチン量を測定した。結果を図1に示す。図1は、横軸に免疫前ダチョウ抗体と抗タバコダチョウ抗体を示す。また縦軸は、BBBキットによるニコチン透過量(μg/mL)を示す。図1を参照して、抗タバコダチョウ抗体はニコチンの脳血管関門の通過を抑制することが判明した。このことは、ニコチンの脳内拡散を防止することが可能であることを示す。

0035

本発明に係る抗タバコダチョウ抗体は、検査キットを始め、タバコのフィルタ、飲み薬、注射薬、ガムや歯磨きとともに利用することができる。

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