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技術 形質転換体の製造方法、形質転換体、および単座組込み用ベクターキット

出願人 AGC株式会社
発明者 田中崇之小谷哲也原太志
出願日 2014年11月20日 (4年10ヶ月経過) 出願番号 2014-236021
公開日 2016年4月28日 (3年4ヶ月経過) 公開番号 2016-063802
状態 特許登録済
技術分野 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学
主要キーワード リンゴ酸濃度 組込型 酵母培養培地 下流端側 ピークエリア 酵素電極法 人工合成遺伝子 乳酸生産速度
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年4月28日)のものです。
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図面 (20)

課題

シゾサッカロミセスポンベ染色体中の特定の遺伝子組込み座に相同組換えを利用して外来遺伝子組込む形質転換体の製造方法、該製造方法により製造された形質転換体、および、該遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットの提供を目的とする。

解決手段

シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする、形質転換体の製造方法である。

概要

背景

S.ポンベをはじめとするシゾサッカロミセス属酵母は、出芽酵母サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)とは進化系統的に全く異なる酵母である。すでに、染色体構造ゲノム複製機構RNAスプライシング機構、転写機構翻訳後修飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動物細胞と類似していることが知られている。このため真核生物モデルとして広く用いられている(非特許文献1参照)。特にS.ポンベはその様々な特徴から、より高等動物細胞に近い単細胞真核生物であると位置づけられ、外来遺伝子、特に高等動物由来遺伝子の発現宿主として非常に有用な酵母であると考えられる。特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適していることが知られている。

相同組換えを利用して外来遺伝子を染色体組込むことにより、該外来遺伝子を安定的に発現する形質転換体を製造できる。一般的に、S.ポンベを宿主とする場合には、leu1遺伝子座およびその近傍を標的部位とする相同組換えにより外来遺伝子が挿入されている。その他、特許文献1では、S.ポンベにマロニルCoAレダクターゼ遺伝子等の外来遺伝子を組込んで3−ヒドロキシプロピオン酸発酵産生させる酵母を製造しており、その際に外来遺伝子を、S.ポンベのgpd1遺伝子座に組込んでいる。

概要

シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中の特定の遺伝子組込み座に相同組換えを利用して外来遺伝子を組込む形質転換体の製造方法、該製造方法により製造された形質転換体、および、該遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットの提供を目的とする。シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする、形質転換体の製造方法である。なし

目的

本発明の目的は、S.ポンベの染色体中の特定の遺伝子組込み座に相同組換えを利用して外来遺伝子を組込む形質転換体の製造方法、該製造方法により製造された形質転換体、および、該遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomycespombe)の染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子組込むことを特徴とする、形質転換体の製造方法。

請求項2

さらに、染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に外来遺伝子を組込む、請求項1に記載の形質転換体の製造方法。

請求項3

該外来遺伝子が、同種のプロモーターによって支配されている、請求項1または2に記載の形質転換体の製造方法。

請求項4

シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子が組込まれていることを特徴とする、形質転換体。

請求項5

さらに、染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子が組込まれている、請求項4に記載の形質転換体。

請求項6

該外来遺伝子が、同種のプロモーターによって支配されている、請求項4または5に記載の形質転換体。

請求項7

シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するef1a−a遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のeno101遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するeno101遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のeno102遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するeno102遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のfba1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するfba1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のgpd3遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するgpd3遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のgpm1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するgpm1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のhht2遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するhht2遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のpgk1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するpgk1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のtpi1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するtpi1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のubi4遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するubi4遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のura4遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するura4遺伝子座組込み用ベクターと、からなる群より選択される1種以上のベクターを含むことを特徴とする、単座組込み用ベクターキット

請求項8

さらに、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するleu1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のgpd1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するgpd1遺伝子座組込み用ベクターと、からなる群より選択される1種以上のベクターを含む、請求項7に記載の単座組込み用ベクターキット。

請求項9

2以上のベクター中のシゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターが、同種のプロモーターである、請求項7または8に記載の単座組込み用ベクターキット。

技術分野

0001

本発明は、シゾサッカロミセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(以下、S.ポンベともいう)の染色体中の特定の遺伝子組込み座に外来遺伝子組込むことにより形質転換体を製造する方法、該方法により製造された形質転換体、およびS.ポンベの染色体中の特定の遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットに関する。

背景技術

0002

S.ポンベをはじめとするシゾサッカロミセス属酵母は、出芽酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)とは進化系統的に全く異なる酵母である。すでに、染色体構造ゲノム複製機構RNAスプライシング機構、転写機構翻訳後修飾等の諸機構が他の酵母と大きく異なり、その一部は動物細胞と類似していることが知られている。このため真核生物モデルとして広く用いられている(非特許文献1参照)。特にS.ポンベはその様々な特徴から、より高等動物細胞に近い単細胞真核生物であると位置づけられ、外来遺伝子、特に高等動物由来遺伝子の発現宿主として非常に有用な酵母であると考えられる。特にヒトを含む動物細胞由来の遺伝子の発現に適していることが知られている。

0003

相同組換えを利用して外来遺伝子を染色体に組込むことにより、該外来遺伝子を安定的に発現する形質転換体を製造できる。一般的に、S.ポンベを宿主とする場合には、leu1遺伝子座およびその近傍を標的部位とする相同組換えにより外来遺伝子が挿入されている。その他、特許文献1では、S.ポンベにマロニルCoAレダクターゼ遺伝子等の外来遺伝子を組込んで3−ヒドロキシプロピオン酸発酵産生させる酵母を製造しており、その際に外来遺伝子を、S.ポンベのgpd1遺伝子座に組込んでいる。

0004

国際公開第2013/137277号

先行技術

0005

Giga-Hama and Kumagai, eds., Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe, Springer-Verlag, (1997).

発明が解決しようとする課題

0006

相同組換えを利用して染色体に外来遺伝子をコードするDNA断片を挿入する場合、組込むDNA断片が長くなりすぎると相同組換えの効率が低下し、かつ組込まれたDNA断片が脱落するおそれがある。特に、同種のプロモーターターミネーターを用いた2以上の発現カセットを含むDNA断片を組込んだ場合には、該DNA断片中のプロモーター同士またはターミネーター同士で相同組換えが生じ、いずれかの発現カセットが脱落しやすい。

0007

このため、一般的には、一の標的部位に一の発現カセットを組込む。したがって、一の宿主細胞に多数の外来遺伝子を導入するためには、染色体中に外来遺伝子を組込むことが可能な箇所が多数存在することが好ましい。

0008

一方で、染色体に外来遺伝子を組込んだ場合、細胞生存性や増殖性が損なわれたり、外来遺伝子が充分に発現しない場合がある。このため、外来遺伝子を安定的に発現させ得る形質転換体を製造するためには、外来遺伝子の挿入によって細胞の生存性および増殖性等が過度に損なわれず、かつ挿入された外来遺伝子が充分に発現可能な領域を標的として外来遺伝子を組込む必要がある。

0009

そこで本発明の目的は、S.ポンベの染色体中の特定の遺伝子組込み座に相同組換えを利用して外来遺伝子を組込む形質転換体の製造方法、該製造方法により製造された形質転換体、および、該遺伝子組込み座に外来遺伝子を組込むための単座組込み用ベクターを含むキットを提供することにある。

課題を解決するための手段

0010

本発明に係る形質転換体の製造方法は、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4(オロチジン5’−リン酸デカルボキシラーゼ)遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする。
該形質転換体の製造方法としては、さらに、染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に外来遺伝子を組込むことが好ましい。
また、該形質転換体の製造方法において、該外来遺伝子が、同種のプロモーターによって支配されていることが好ましい。

0011

本発明に係る形質転換体は、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする。
該形質転換体としては、さらに、染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子が組み込まれていることが好ましい。
該形質転換体としては、該外来遺伝子が、同種のプロモーターによって支配されているものが好ましい。

0012

本発明に係る単座組込み用ベクターキットは、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するef1a−a遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のeno101遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するeno101遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のeno102遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するeno102遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のfba1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するfba1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のgpd3遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するgpd3遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のgpm1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するgpm1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のhht2遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するhht2遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のpgk1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するpgk1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のtpi1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するtpi1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のubi4遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するubi4遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のura4遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するura4遺伝子座組込み用ベクターと、からなる群より選択される1種以上のベクターを含むことを特徴とする。
該単座組込み用ベクターキットとしては、さらに、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するleu1遺伝子座組込み用ベクターと、シゾサッカロミセス・ポンベの染色体中のgpd1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位、ならびに、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトを有するgpd1遺伝子座組込み用ベクターと、からなる群より選択される1種以上のベクターを含むことが好ましい。
また、該単座組込み用ベクターキットに含まれる2以上のベクター中のシゾサッカロミセス・ポンベ内で機能するプロモーターが、同種のプロモーターであることが好ましい。

発明の効果

0013

本発明において外来遺伝子の組込みに用いられるS.ポンベの染色体中の11個の遺伝子組込み座は、外来遺伝子の挿入によって細胞の生存性および増殖性等が過度に損なわれず、かつ挿入された外来遺伝子が充分に発現し得る。このため、本発明は、特に、S.ポンベに安定的に複数の外来遺伝子を発現させるための形質転換体の製造に好適である。

図面の簡単な説明

0014

図1は、ef1a−a遺伝子座組込み用ベクターpSEの構造の模式図である。
図2は、gpm1遺伝子座組込み用ベクターpSMの構造の模式図である。
図3は、eno101遺伝子座組込み用ベクターpSNの構造の模式図である。
図4は、gpd3遺伝子座組込み用ベクターpSDの構造の模式図である。
図5は、hht2遺伝子座組込み用ベクターpSHの構造の模式図である。
図6は、ubi4遺伝子座組込み用ベクターpSUbの構造の模式図である。
図7は、ura4遺伝子座組込み用ベクターpSUの構造の模式図である。
図8は、クローニングベクターpSXxxの構造の模式図である。
図9は、eno102遺伝子座組込み用ベクターpSN2の構造の模式図である。
図10は、fba1遺伝子座組込み用ベクターpSFの構造の模式図である。
図11は、gpd1遺伝子座組込み用ベクターpSGの構造の模式図である。
図12は、pgk1遺伝子座組込み用ベクターpSPの構造の模式図である。
図13は、tpi1遺伝子座組込み用ベクターpSTの構造の模式図である。
図14は、実施例2において、各形質転換体の相対GFPOD660(SL−EGFP株のGFP/OD660を1とした場合の相対値)の算出結果を示した図である。
図15は、実施例3において、各形質転換体のEGFPの相対分泌量(SL−P3EGFP株のEGFP分泌量を1とした場合の相対値)の算出結果を示した図である。
図16は、実施例4において、各形質転換体のD−乳酸生産速度(g/(L・h))の(SL−DLDH株のD−乳酸生産速度を1とした場合の相対値)の算出結果を示した図である。
図17は、実施例5において、各形質転換体のL−乳酸生産速度(g/(L・h))の(SL−LLDH株のL−乳酸生産速度を1とした場合の相対値)の算出結果を示した図である。
図18は、実施例6において、各形質転換体の変異型hTFの相対分泌量(SU−hPDI(abx)hTF株の変異型hTF分泌量を1とした場合の相対値)の算出結果を示した図である。
図19は、実施例6において、各形質転換体の変異型hTF遺伝子の相対mRNA転写量(SU−hPDI(abx)hTF株の変異型hTF遺伝子のmRNA転写量を1とした場合の相対値)の算出結果を示した図である。
図20は、単座組込み用ベクターpSLhの構造の模式図である。
図21は、単座組込型組換えベクターpSMhの構造の模式図である。
図22は、野生株グルコース濃度(g/L)、エタノール濃度(g/L)、およびリンゴ酸の濃度(g/L)の経時的変化を示した図である。
図23は、ASP4964株(Δpdc2,Δmae2,+ScePYC,+DacMDH)のグルコース濃度(g/L)、エタノール濃度(g/L)、およびリンゴ酸の濃度(g/L)の経時的変化を示した図である。
図24は、pSM−HsLDHベクターの構造の模式図である。
図25は、pSN−HsLDHベクターの構造の模式図である。

0015

本発明に係る形質転換体の製造方法は、S.ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、ならびにura4遺伝子座およびその近傍からなる群より選択される1以上に、外来遺伝子を組込むことを特徴とする。ef1a−a遺伝子等の11個の遺伝子は、いずれも発現量の高い遺伝子である。該11個の遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むことにより、細胞の生存性および増殖性等が過度に損なわれることなく、かつ挿入された外来遺伝子が充分に発現できる形質転換体を製造できる。本発明に係る形質転換体の製造方法において外来遺伝子を組込む遺伝子組込み座としては、形質転換効率が比較的高いことから、ef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、またはura4遺伝子座およびその近傍が好ましく、外来遺伝子の発現効率が高い形質転換体が得られやすいことから、ef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、またはura4遺伝子座およびその近傍がより好ましい。

0016

<宿主>
宿主とするS.ポンベは、野生型であってもよく、用途に応じて特定の遺伝子を欠失または失活させた変異型であってもよい。特定の遺伝子を欠失または失活させる方法としては、公知の方法を用いられる。具体的には、Latour法(Nucleic AcidsResearch誌、第34巻、e11ページ、2006年;国際公開第2007/063919号パンフレット等に記載)を用いることにより遺伝子を欠失させられる。また、変異剤を用いた突然変異分離法(酵母分子遺伝学実験法、1996年、学会出版センター)や、PCRポリメラーゼ連鎖反応)を利用したランダム変異法(PCR Methods Application誌、第2巻、28-33ページ、1992年)等により遺伝子の一部に変異を導入することにより該遺伝子を失活させられる。特定遺伝子を欠失または失活させたシゾサッカロミセス属酵母宿主としては、たとえば、国際公開第2002/101038号、国際公開第2007/015470号等に記載されている。
また、特定の遺伝子の削除または不活性化を行う部分はORF(オープンリーディングフレーム)部分であってもよく、発現調節配列部分であってもよい。特に好ましい方法は、構造遺伝子のORF部分をマーカー遺伝子置換するPCR媒介相同組換え法(Yeast誌、第14巻、943-951ページ、1998年)による削除または不活性化の方法である。

0017

さらに宿主として使用するS.ポンベには、形質転換体を選択するためのマーカーを有するものを用いることが好ましい。たとえば、ある遺伝子が欠落していることにより特定の栄養成分が生育に必須である宿主を使用することが好ましい。目的遺伝子配列を含むベクターにより形質転換をして形質転換体を作製する場合、ベクターにこの欠落している遺伝子(栄養要求性相補マーカー)を組込んでおくことにより、形質転換体では宿主の栄養要求性が消失する。宿主と形質転換体の栄養要求性の相違により、両者を区別して形質転換体を得ることができる。
たとえば、ura4遺伝子が欠失または失活してウラシル要求性となっているS.ポンベを宿主とし、ura4遺伝子(栄養要求性相補マーカー)を有するベクターにより形質転換した後、ウラシル要求性が消失したものを選択することにより、ベクターが組込まれた形質転換体を得ることができる。宿主において欠落により栄養要求性となる遺伝子は、形質転換体の選択に用いられるものであればura4遺伝子には限定されず、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(leu1遺伝子)等であってもよい。

0018

<遺伝子組込み座>
本発明および本願明細書において、「X遺伝子座」は、染色体中のX遺伝子の転写領域を意味する。また、「X遺伝子座およびその近傍」とは、染色体中のX遺伝子のORFの上流端(すなわち、開始コドンの1文字目塩基)から上流10kbp(10000bp)から、該ORFの下流端(すなわち、終止コドンの3文字目の塩基)から下流10kbpまでの範囲内である領域を意味する。

0019

なお、「ORFの上流端から上流Ybp」とは、ORFの上流側の塩基であって、開始コドンの1文字目(A)から数えてY塩基目の塩基を意味し、「ORFの上流Ybp」と略することがある。また、「ORFの下流端から下流Zbp」とは、ORFの下流側の塩基であって、終止コドンの3文字目から数えてZ塩基目の塩基を意味し、「ORFの下流Zbp」と略することがある。

0020

本発明に係る形質転換体の製造方法では、外来遺伝子を含むDNA断片(組換え用DNA断片)を宿主とするS.ポンベに導入し、該DNA断片と染色体との間で相同組換えを起こすことにより、該DNA断片を染色体中に組込むことにより行う。「X遺伝子座およびその近傍」に外来遺伝子を組込む場合、該DNA断片と相同組換えを起こすための染色体中の標的部位のうち、染色体中の位置が上流側のもの(上流側標的部位)と染色体中の位置が下流側のもの(下流側標的部位)は、染色体中で隣接していてもよく、離れていてもよい。標的部位の設定は、相同組換えによる遺伝子導入技術において公知の手法により適宜行うことができる。また、上流側標的部位と下流側標的部位は、両標的部位で挟まれた領域に、X遺伝子座のみを含んでいてもよく、X遺伝子座に隣接する他の遺伝子座の一部又は全部を含んでいてもよい。

0021

S.ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のef1a−a遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流端から該ORFの下流2kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0022

S.ポンベの染色体中のeno101遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のeno101遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流端から該ORFの下流2kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0023

S.ポンベの染色体中のeno102遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のeno102遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの下流端から該ORFの下流7kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0024

S.ポンベの染色体中のfba1遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のfba1遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流5kbpから該ORFの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

0025

S.ポンベの染色体中のgpd3遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のgpd3遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流端から該ORFの下流2kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0026

S.ポンベの染色体中のgpm1遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のgpm1遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流端から該ORFの下流2kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0027

S.ポンベの染色体中のhht2遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のhht2遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流端から該ORFの下流2kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0028

S.ポンベの染色体中のpgk1遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のpgk1遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流5kbpから該ORFの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

0029

S.ポンベの染色体中のtpi1遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のtpi1遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流5kbpから該ORFの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

0030

S.ポンベの染色体中のubi4遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のubi4遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流端から該ORFの下流2kbpまでの範囲内に設計されることが好ましい。

0031

S.ポンベの染色体中のura4遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む場合、相同組換えのための標的部位は、染色体中のura4遺伝子のORFの上流10kbpから該ORFの下流10kbpまでの範囲内に設計され、該ORFの上流5kbpから該ORFの下流5kbpまでの範囲内に設計されることが好ましく、該ORFの上流3kbから該ORFの上流端までの範囲内に設計されることが好ましい。

0032

<組換え用DNA断片>
本発明に係る形質転換体の製造方法においては、外来遺伝子を含む組換え用DNA断片を宿主とするS.ポンベに導入し、染色体と相同組換えさせる。該組換え用DNA断片の両端には、S.ポンベの染色体中の遺伝子組込み座に設定した標的部位と相同組換えを起こすための組換え部位を設ける。該組換え用DNA断片の一方の端には、染色体中の上流側標的部位との組換え部位(上流側組換え部位)を設け、該組換え用DNA断片の他方の端には、染色体中の下流側標的部位との組換え部位(下流側組換え部位)を設ける。

0033

該組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は70%以上とすることが必要である。また、組換え部位の塩基配列と標的部位の塩基配列との相同性は、相同組換えが起きやすくなる点から、90%以上とすることが好ましく、95%以上であることがより好ましい。

0034

上流側組換え部位と下流側組換え部位の長さ(塩基数)は、それぞれ、20〜2000bpであることが好ましい。組換え部位の長さが20bp以上であれば、相同組換えが起きやすくなる。また、組換え部位の長さが2000bp以下であれば、組換え用DNA断片が長くなりすぎて相同組換えが起き難くなることを防ぎやすい。上流側組換え部位と下流側組換え部位の長さは、100bp以上であることがより好ましく、300bp以上であることがさらに好ましい。また、上流側組換え部位と下流側組換え部位の長さは、1500bp以下であることがより好ましく、800bp以下であることがさらに好ましい。

0035

<発現カセット>
外来遺伝子が蛋白質をコードする構造遺伝子の場合には、該組換え用DNA断片は、外来遺伝子を発現させるための発現カセットを含む。発現カセットとは、目的の蛋白質を発現するために必要なDNAの組み合わせであり、目的の蛋白質をコードする構造遺伝子と宿主内で機能するプロモーターとターミネーターを含む。本発明において用いられる発現カセットは、外来遺伝子と、S.ポンベ内で機能するプロモーターとS.ポンベ内で機能するターミネーターとを含む。該発現カセットは、5’−非翻訳領域、3’−非翻訳領域のいずれか1つ以上が含まれていてもよい。さらに、前記栄養要求性相補マーカーが含まれていてもよい。1の発現カセットには、1の外来遺伝子が存在していてもよく、複数の外来遺伝子が存在していてもよく、1または複数の外来遺伝子と、栄養要求性相補マーカー遺伝子(たとえば、leu1遺伝子)や選抜マーカー遺伝子とが存在していてもよい。

0036

発現カセットに含める外来遺伝子の遺伝子配列としては、天然型がコードする遺伝子をそのまま用いてもよく、宿主として用いるS.ポンベ内での発現量を増大させるために、天然型の遺伝子配列を、S.ポンベにおいて使用頻度の高いコドン改変してもよい。

0037

S.ポンベ内で機能するプロモーターまたはターミネーターとしては、S.ポンベが本来有するプロモーター(転写開始活性が高いものが好ましい)またはターミネーターや、S.ポンベが本来有しないプロモーターまたはターミネーター(ウイルス由来のプロモーターまたはターミネーター等)を使用できる。なお、プロモーターまたはターミネーターは、S.ポンベの染色体に組込まれる組換え用DNA断片中に2種以上存在していてもよい。

0038

S.ポンベが本来有するプロモーターとしては、たとえば、アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子プロモーター、チアミンの代謝に関与するnmt1遺伝子プロモーターグルコースの代謝に関与するフルクトース−1、6−ビスホスファターゼ遺伝子プロモーター、カタボライト抑制に関与するインベルターゼ遺伝子のプロモーター(国際公開第99/23223号パンフレット参照)、熱ショック蛋白質遺伝子プロモーター(国際公開第2007/26617号パンフレット参照)等が挙げられる。
S.ポンベが本来有しないプロモーターとしては、たとえば、特開平5−15380号公報、特開平7−163373号公報、特開平10−234375号公報に記載されている動物細胞ウイルス由来のプロモーターが挙げられ、hCMVプロモーターSV40プロモーターが好ましい。
S.ポンベ内で機能するターミネーターとしては、たとえば、特開平5−15380号公報、特開平7−163373号公報、特開平10−234375号公報に記載されているヒト由来のターミネーターが挙げられ、ヒトリコルチンIのターミネーターが好ましい。

0039

<ベクター>
該組換え用DNA断片は、ベクターに組込んだ状態でS.ポンベに導入できる。該ベクターは、環状DNA構造または線状DNA構造を有するベクターに、該組換え用DNA断片を組込むことにより製造できる。該ベクターは、線状DNA構造であり、かつARSを有していないものとして、宿主細胞へ導入されることが好ましい。たとえば、該ベクターは、線状DNAからなるベクターであってもよく、宿主への導入時に、線状DNAに切り開くための制限酵素認識配列を備える環状DNA構造のベクターであってもよい。該ベクターがARSを有するプラスミドの場合、ARS部分を削除して線状DNA構造、またはARS部分を開裂させることによりARSの機能を失活させた線状DNA構造とした後、宿主へ導入できる。

0040

該ベクターが通常用いられるプラスミドDNA等の環状DNA構造であり、制限酵素でベクターを線状に切り開いた後にS.ポンベの細胞に導入する場合には、環状DNA構造を有するベクターを切り開く位置は、組換え部位内とする。これにより、切り開かれたベクターの両端にそれぞれ組換え部位が部分的に存在することとなり、相同組換えによりベクター全体が染色体の標的部位に組込まれる。
ベクターは、両端それぞれに組換え部位の一部が存在するような線状DNA構造とすることができれば、環状DNA構造を有するベクターを切り開く方法以外の方法で構築してもよい。

0041

該ベクターは、形質転換体を選択するためのマーカーを有することが好ましい。該マーカーとしては、たとえば、栄養要求性相補マーカーである、オロチジンリン酸デカルボキシラーゼ遺伝子(ura4遺伝子)、イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子(leu1遺伝子)が挙げられる。

0042

該ベクターは、前記組換え用DNA断片以外に他のDNA領域を有していてもよい。たとえば、大腸菌内での複製のために必要な「ori」と呼ばれる複製開始領域抗生物質耐性遺伝子ネオマイシン耐性遺伝子等)が挙げられる。これらは大腸菌を使用してベクターを構築する場合に通常必要とされる遺伝子である。ただし、前記複製開始領域は後述のようにベクターを宿主の染色体に組込む際には除去されることが好ましい。

0043

ベクターとしては、たとえば、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19等の大腸菌由来のプラスミドを好適に用いることができる。
この場合、相同組換えに用いる際のプラスミドベクターは、大腸菌内での複製のために必要な「ori」と呼ばれる複製開始領域が除去されていることが好ましい。これにより、上述したベクターを染色体に組込む際に、その組込み効率を向上させることができる。
複製開始領域が除去されたベクターの構築方法は特に限定されないが、特開2000−262284号公報に記載されている方法を用いることが好ましい。すなわち、組換え部位内の切断箇所に複製開始領域が挿入された前駆体ベクターを構築しておき、前述のように線状DNA構造とすると同時に複製開始領域が切り出されるようにする方法が好ましい。これにより、簡便に複製開始領域が除去されたベクターを得ることができる。
また、特開平5−15380号公報、特開平7−163373号公報、国際公開第96/23890号パンフレット、特開平10−234375号公報等に記載された発現ベクターやその構築方法を適用して、発現カセットおよび組換え部位を有する前駆体ベクターを構築し、さらに通常の遺伝子工学的手法で該前駆体ベクターから複製開始領域を除去して相同組換えに用いるベクターを得る方法であってもよい。

0044

形質転換方法
S.ポンベ宿主に該組換え用DNA断片または該単座組込み用ベクターを導入して相同組み換え法で形質転換する方法としては、公知の相同組み換え法を使用できる。該形質転換方法としては、たとえば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法スフェロプラスト法、ガラスビーズ法等の従来周知の方法や、特開2005−198612号公報記載の方法が挙げられる。また、市販の酵母形質転換用キットを用いてもよい。

0045

形質転換体の製造では、通常、相同組換えを行った後、得られた形質転換体を選択する。選択する方法としては、たとえば、該外来遺伝子が構造遺伝子の場合には、以下に示す方法が挙げられる。前記栄養要求性マーカーにより形質転換体を選択できる培地によりスクリーニングし、得られたコロニーから複数を選択する。次に、それらを別々に液体培養した後、それぞれの培養液における該外来遺伝子がコードする蛋白質の発現量を調べ、該蛋白質の発現量がより多い形質転換体を選択する。それら選択した形質転換体に対してパルスフィールドゲル電気泳動法によるゲノム解析を行うことにより、染色体に組込まれたベクターの数や発現カセットの数を調べられる。
染色体に組込まれるベクターの数は組込み条件等を調整することによりある程度は調整できる。ベクターの大きさ(塩基数)や構造により、組込み効率や組込み数も変化すると考えられる。

0046

<複数の外来遺伝子を導入した形質転換体の製造>
本発明に係る形質転換体の製造方法では、一のS.ポンベ宿主に、1種類の外来遺伝子を組込んでもよく、複数種類の外来遺伝子を組込んでもよい。複数種類の外来遺伝子を組込む際には、外来遺伝子ごとに染色体中の異なる遺伝子組込み座に組込める。これにより、組み込んだ発現カセットが脱落する危険性を抑えつつ、同種のプロモーターで制御された外来遺伝子を複数個染色体に組込んだ形質転換体を製造できる。

0047

また、本発明に係る形質転換体の製造方法では、前記の11個の遺伝子組込み座のうちの1以上に加えて、1または複数の公知の遺伝子組込み座にも外来遺伝子が組込まれた形質転換体を製造してもよい。該の公知の遺伝子組込み座としては、S.ポンベの染色体中のleu1遺伝子座およびその近傍、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍が挙げられる。

0048

本発明に係る形質転換体の製造方法においては、複数の遺伝子組込み座に、同種の外来遺伝子を組込んでもよい。たとえば、ef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、eno102遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、hht2遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、tpi1遺伝子座およびその近傍、ubi4遺伝子座およびその近傍、leu1遺伝子座およびその近傍、ura4遺伝子座およびその近傍、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍の合計13の遺伝子組込み座の中から適宜選択して同一の発現カセットを組込むことにより、1〜13の間でコピー数を制御した形質転換体を製造できる。

0049

<形質転換体の培養方法
本発明に係る形質転換体の製造方法により製造された形質転換体は、天然のシゾサッカロミセス属酵母と同様に培養できる。
該形質転換体の培養のための培養液には、公知の酵母培養培地を用いることができ、シゾサッカロミセス属酵母が資化しうる炭素源窒素源無機塩類等を含有し、シゾサッカロミセス属酵母の培養を効率良く行えるものであればよい。培養液としては、天然培地を用いてもよく、合成培地を用いてもよい。

0050

炭素源としては、たとえば、グルコース、フルクトース、スクロース等の糖が挙げられる。
窒素源としては、たとえば、アンモニア塩化アンモニウム酢酸アンモニウム等の無機酸または無機酸のアンモニウム塩ペプトンカザミノ酸が挙げられる。
無機塩類としては、たとえば、リン酸マグネシウム硫酸マグネシウム塩化ナトリウムが挙げられる。
具体的には、YPD培地等の栄養培地(M.D.Rose et al.,"MethodsIn Yeast Genetics",Cold Spring Harbor LabolatoryPress(1990) )またはMB培地等の最少培地(K.Okazaki et al.,Nucleic AcidsRes.,18,6485-6489(1990))等を使用できる。

0051

培養には公知の酵母培養方法を用いることができ、たとえば振盪培養攪拌培養等により行うことができる。
また、培養温度は、23〜37℃であることが好ましい。また、培養時間は適宜決定できる。
また、培養は、回分培養であってもよく、連続培養であってもよい。

0052

<組込み用ベクター>
特定の遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込んだ形質転換体を製造するために用いられる、外来遺伝子を含む組換え用DNA断片を組込んだベクターは、S.ポンベの染色体中の標的部位(標的の遺伝子座およびその近傍の部位)と相同組換えを行わせる組換え部位と、外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトとを有する組込み用ベクターに、外来遺伝子を組込むことにより容易に製造できる。該組込み用ベクターとしては、該組換え部位と、S.ポンベ内で機能するプロモーターと、該プロモーターの下流に位置しかつ該プロモーターによって支配される外来遺伝子を組込むためのクローニングサイトと、S.ポンベ内で機能し得るターミネーターとを有するものが好ましい。該ベクター、該プロモーター、該ターミネーター、該組換え部位としては、前記と同様のものが挙げられる。

0053

該組込み用ベクターが備えるクローニングサイトは、組込み用ベクター中、該クローニングサイトにのみ存在する制限酵素部位である。該組込み用ベクターが備えるクローニングサイトは制限酵素部位を1のみ有していてもよく、2以上の制限酵素部位を有するマルチクローニングサイトであってもよい。該マルチクローニングサイトとしては、公知のクローニングベクターや組込み用ベクターが備えるマルチクローニングサイトをそのまま使用でき、また、公知のマルチクローニングサイトを適宜改変したものを使用できる。その他、該組込み用ベクターは、クローニングサイト内の下流端側領域、若しくは該クローニングサイトの下流に、終始コドンを備えていてもよい。

0054

該組込み用ベクターのうち、ef1a−a遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをef1a−a遺伝子座組込み用ベクターといい、eno101遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをeno101遺伝子座組込み用ベクターといい、eno102遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをeno102遺伝子座組込み用ベクターといい、fba1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをfba1遺伝子座組込み用ベクターといい、gpd3遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをgpd3遺伝子座組込み用ベクターといい、gpm1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをgpm1遺伝子座組込み用ベクターといい、hht2遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをhht2遺伝子座組込み用ベクターといい、pgk1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをpgk1遺伝子座組込み用ベクターといい、tpi1遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをtpi1遺伝子座組込み用ベクターといい、ubi4遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをubi4遺伝子座組込み用ベクターといい、ura4遺伝子座およびその近傍を標的とする相同組換えを行わせる組換え部位を含むものをura4遺伝子座組込み用ベクターという。

0055

本発明に係る単座組込み用ベクターキットは、ef1a−a遺伝子座組込み用ベクター、eno101遺伝子座組込み用ベクター、eno102遺伝子座組込み用ベクター、fba1遺伝子座組込み用ベクター、gpd3遺伝子座組込み用ベクター、gpm1遺伝子座組込み用ベクター、hht2遺伝子座組込み用ベクター、pgk1遺伝子座組込み用ベクター、tpi1遺伝子座組込み用ベクター、ubi4遺伝子座組込み用ベクター、およびura4遺伝子座組込み用ベクターからなる群より選択される1種以上のベクターを含む。該単座組込み用ベクターキットを用いることにより、S.ポンベの染色体の複数個所に外来遺伝子が組込まれた形質転換体の製造が容易になる。該単座組込み用ベクターキットには、さらに、leu1遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むためのleu1遺伝子座組込み用ベクター、ならびにgpd1遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込むためのgpd1遺伝子座組込み用ベクターからなる群より選択される1種以上のベクターを含んでいてもよい。

0056

本発明に係る単座組込み用ベクターキットが2以上の組込み用ベクターを含む場合、該単座組込み用ベクターキットに含まれる2以上の組込み用ベクターが、S.ポンベ内で機能するプロモーターとして同種のプロモーターを有することが好ましい。該単座組込み用ベクターキットを用いることによって、S.ポンベに同種のプロモーターにより制御された複数の外来遺伝子を組込んだ形質転換体を製造できる。

0057

leu1遺伝子座組込み用ベクターおよびgpd1遺伝子座組込み用ベクターとしては、それぞれの遺伝子座およびその近傍に外来遺伝子を組込む際に従来使用されている標的部位に対して相同組換えが起こるように設計したものを用いることができる。

0058

以下、実施例等を示して本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の記載によっては限定されない。

0059

[実施例1]
新規なS.ポンベ染色体単座組込みベクターpSE、pSM、pSN、pSD、pSH、pSUb、pSU、pSN2、pSF、pSG、pSP、およびpSTを製造した。

0060

<ef1a−a遺伝子座組込み用ベクターpSEの製造>
S.ポンベの染色体中の上流側標的部位と相同組換えを行う上流側組換え部位、hCMVプロモーター、S.ポンベ由来ura4遺伝子、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、およびS.ポンベの染色体中の下流側標的部位と相同組換えを行う下流側組換え部位を備えるef1a−a遺伝子座組込み用ベクターpSEベクター(7180bp、配列番号1)を製造した。図1に、pSEベクターの構造を示す。該上流側組換え部位(図1中、「ef1up」)は、f1a−a遺伝子の開始コドン1文字目より1048bpから1447bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図1中、「ef1dw」)は、f1a−a遺伝子のORFの下流44bpから482bpの領域を下流側標的部位とした。

0061

pSEベクターは、大腸菌内での増殖・維持に必要となるoriおよびアンピシリン耐性遺伝子配列を有するori−Amp含有DNA断片(3620bp、配列番号2)と、S.ポンベの染色体中のef1a−a遺伝子座に組込まれるpSE導入部位含有DNA断片(3599bp、配列番号3)とをライゲーション反応により連結することにより製造できる。ori−Amp含有DNA断片とpSE導入部位含有DNA断片は、それぞれDNA合成によりDNA断片として製造できる。

0062

具体的には、ori−Amp含有DNA断片を制限酵素PmeIで消化した後に、Alkaline Phosphatase,Calf Intest(CIAP)により脱リン酸化を行い、pSE導入部位含有DNA断片を制限酵素PmeIで消化し、両者をライゲーション反応により連結することにより、pSEベクターが製造できる。

0063

<gpm1遺伝子座組込み用ベクターpSMの製造>
pSE導入部位含有DNA断片に代えて、pSM導入部位含有DNA断片(3582bp、配列番号4)を用いた以外はpSEベクターの製造と同様にして、gpm1遺伝子座組込み用ベクターpSM(7162bp、配列番号5)を製造できる。図2に、pSMベクターの構造を示す。
pSM導入部位含有DNA断片は、上流側組換え部位、hCMVプロモーター、ura4遺伝子、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、および下流側組換え部位を備えるDNA断片であり、DNA合成により製造できる。該上流側組換え部位(図2中、「gpm1up」)は、gpm1遺伝子の開始コドン1文字目より535bpから938bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図2中、「gpm1dw」)は、gpm1遺伝子のORFの下流282bpから700bpの領域を下流側標的部位とした。

0064

<eno101遺伝子座組込み用ベクターpSNの製造>
pSE導入部位含有DNA断片に代えて、pSN導入部位含有DNA断片(3571bp、配列番号6)を用いた以外はpSEベクターの製造と同様にして、eno101遺伝子座組込み用ベクターpSN(7151bp、配列番号7)を製造できる。図3に、pSNベクターの構造を示す。
pSN導入部位含有DNA断片は、上流側組換え部位、hCMVプロモーター、ura4遺伝子、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、および下流側組換え部位を備えるDNA断片であり、DNA合成により製造できる。該上流側組換え部位(図3中、「eno101up」)は、eno101遺伝子の開始コドン1文字目より1221bpから1620bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図3中、「eno101dw」)は、eno101遺伝子のORFの下流282bpから688bpの領域を下流側標的部位とした。

0065

<gpd3遺伝子座組込み用ベクターpSDの製造>
pSE導入部位含有DNA断片に代えて、pSD導入部位含有DNA断片(3588bp、配列番号8)を用いた以外はpSEベクターの製造と同様にして、gpd3遺伝子座組込み用ベクターpSD(7168bp、配列番号9)を製造できる。図4に、pSDベクターの構造を示す。
pSD導入部位含有DNA断片は、上流側組換え部位、hCMVプロモーター、ura4遺伝子、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、および下流側組換え部位を備えるDNA断片であり、DNA合成により製造できる。該上流側組換え部位(図4中、「gpd3up」)は、gpd3遺伝子の開始コドン1文字目より807bpから1208bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図4中、「gpd3dw」)は、gpd3遺伝子のORFの下流181bpから606bpの領域を下流側標的部位とした。

0066

<hht2遺伝子座組込み用ベクターpSHの製造>
pSE導入部位含有DNA断片に代えて、pSH導入部位含有DNA断片(3596bp、配列番号10)を用いた以外はpSEベクターの製造と同様にして、hht2遺伝子座組込み用ベクターpSH(7177bp、配列番号11)を製造できる。図5に、pSHベクターの構造を示す。
pSH導入部位含有DNA断片は、上流側組換え部位、hCMVプロモーター、ura4遺伝子、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、および下流側組換え部位を備えるDNA断片であり、DNA合成により製造できる。該上流側組換え部位(図5中、「hht2up」)は、hht2遺伝子の開始コドン1文字目より327bpから746bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図5中、「hht2dw」)は、hht2遺伝子のORFの下流317bpから730bpの領域を下流側標的部位とした。

0067

<ubi4遺伝子座組込み用ベクターpSUbの製造>
pSE導入部位含有DNA断片に代えて、pSUb導入部位含有DNA断片(3608bp、配列番号12)を用いた以外はpSEベクターの製造と同様にして、ubi4遺伝子座組込み用ベクターpSUb(7188bp、配列番号13)を製造できる。図6に、pSUbベクターの構造を示す。
pSUb導入部位含有DNA断片は、上流側組換え部位、hCMVプロモーター、ura4遺伝子、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、および下流側組換え部位を備えるDNA断片であり、DNA合成により製造できる。該上流側組換え部位(図6中、「ubi4up」)は、ubi4遺伝子の開始コドン1文字目より931bpから1355bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図6中、「ubi4dw」)は、ubi4遺伝子のORFの下流188bpから605bpの領域を下流側標的部位とした。

0068

<ura4遺伝子座組込み用ベクターpSUの製造>
大腸菌内での増殖・維持に必要となるoriおよびカナマイシン耐性遺伝子配列を有するori−Kan含有DNA断片(1795bp、配列番号14)と、S.ポンベの染色体中のura4遺伝子座に組込まれるpSU導入部位含有DNA断片(6073bp、配列番号15)とをライゲーション反応により連結することにより、ura4遺伝子座組込み用ベクターpSU(7832bp、配列番号16)を製造できる。図7に、pSUベクターの構造を示す。

0069

pSU導入部位含有DNA断片は、上流側組換え部位、hCMVプロモーター、マルチクローニングサイト、LPIターミネーター、ura4プロモーター、ura4遺伝子、ura4ターミネーター、および下流側組換え部位を備えるDNA断片であり、DNA合成により製造できる。該上流側組換え部位(図7中、「ura4up」)は、ura4遺伝子のORFの上流2186bpから1128bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図7中、「ura4dw」)は、ura4遺伝子のORFの上流1078bpから572bpの領域を下流側標的部位とした。

0070

具体的には、ori−Kan含有DNA断片を制限酵素BsiWIで消化した後に、CIAPにより脱リン酸化を行い、またpSU導入部位含有DNA断片を制限酵素BsiWIで消化し、両者をライゲーション反応により連結することにより製造できる。

0071

<クローニングベクターpSXxxの製造>
クローニングベクターpSXxxは、ura4マーカー、oriおよびアンピシリン耐性遺伝子を有しており、アンピシリン耐性遺伝子とhCMVプロモーター間およびura4遺伝子と複製起点間にマルチクローニングサイトを備えるクローニングベクターである。
具体的には、pSEベクターを鋳型とし、5’末端にBglIIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号17)と5’末端にSmaIおよびNheIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号18)との組み合わせ、ならびに5’末端にSmaI、XbaI、PmeI,PmaCIおよびNotIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号19)と5’末端にBglII、PvuII、PmaCI、PmeI、およびNotIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号20)との組み合わせによりそれぞれPCRを行い、hCMVプロモーターおよびura4遺伝子を含む配列の5’末端にBglIIの制限酵素認識部位を、3’末端にSmaIおよびNheIの制限酵素認識部位を有するPCR産物と、複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含む配列の5’末端にSmaI、XbaI、PmeI,PmaCIおよびNotIの制限酵素認識部位を、3’末端にBglII、PvuII、PmaCI、PmeI、およびNotIの制限酵素認識部位を有するPCR産物を得た。両PCR産物を制限酵素BglIIおよびSmaIで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをクローニングベクターpSXxx(配列番号21)とした。pSXxxベクターの構造を図8に示す。

0072

<eno102遺伝子座組込み用ベクターpSN2の製造>
pSXxxベクターのPvuII−BglII間およびSmaI−XbaI間のそれぞれに、S.ポンベの染色体のeno102遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、eno102遺伝子座組込み用ベクターpSN2(4504bp、配列番号22)を製造した。図9に、pSN2ベクターの構造を示す。該上流側組換え部位(図9中、「eno102up」)は、eno102遺伝子のORFの下流3963bpから4367bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図9中、「eno102dw」)は、eno102遺伝子のORFの下流4368bpから4807bpの領域を下流側標的部位とした。

0073

具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株、ATCC38366、972h−相当)由来のゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマー(配列番号23)および5’末端にBamHIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号24)を用いたPCRによって、eno102遺伝子のORFの下流3963bpから4367bpの領域の3’末端にBamHIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(eno102upフラグメント)を得、フォワードプライマー(配列番号25)および5’末端にNheIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号26)を用いたPCRによって、eno102遺伝子のORFの下流4368bpから4807bpの領域の3’末端にNheIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(eno102dwフラグメント)を得た。
該eno102upフラグメントを制限酵素BamHIで消化し、またpSXxxを制限酵素PvuIIおよびBglIIで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素SmaIおよびXbaIで二重消化し、またeno102dwフラグメントを制限酵素NheIで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSN2ベクターとした。

0074

<fba1遺伝子座組込み用ベクターpSFの製造>
pSXxxベクターのPvuII−BglII間およびSmaI−XbaI間のそれぞれに、S.ポンベの染色体のfba1遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、fba1遺伝子座組込み用ベクターpSF(4451bp、配列番号27)を製造した。図10に、pSFベクターの構造を示す。該上流側組換え部位(図10中、「fba1up」)は、fba1遺伝子のORFの上流3339bpから3735bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図10中、「fba1dw」)は、fba1遺伝子のORFの上流3736bpから4130bpの領域を下流側標的部位とした。

0075

具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマー(配列番号28)および5’末端にBamHIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号29)を用いたPCRによって、fba1遺伝子のORFの上流3339bpから3735bpの領域の3’末端にBamHIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(fba1upフラグメント)を得、フォワードプライマー(配列番号30)および5’末端にNheIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号31)を用いたPCRによって、fba1遺伝子のORFの上流3736bpから4130bpの領域の3’末端にNheIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(fba1dwフラグメント)を得た。
該fba1upフラグメントを制限酵素BamHIで消化し、またpSXxxを制限酵素PvuIIおよびBglIIで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素SmaIおよびXbaIで二重消化し、またfba1dwフラグメントを制限酵素NheIで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSFベクターとした。

0076

<gpd1遺伝子座組込み用ベクターpSGの製造>
pSXxxベクターのPvuII−BglII間およびSmaI−XbaI間のそれぞれに、S.ポンベの染色体のgpd1遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、gpd1遺伝子座組込み用ベクターpSG(4553bp、配列番号32)を製造した。図11に、pSGベクターの構造を示す。該上流側組換え部位(図11中、「gpd1up」)は、gpd1遺伝子のORFの上流2704bpから2300bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図11中、「gpd1dw」)は、gpd1遺伝子のORFの上流2299bpから1811bpの領域を下流側標的部位とした。

0077

具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマー(配列番号33)および5’末端にBamHIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号34)を用いたPCRによって、gpd1遺伝子のORFの上流2704bpから2300bpの領域の3’末端にBamHIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(gpd1upフラグメント)を得、フォワードプライマー(配列番号35)および5’末端にNheIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号36)を用いたPCRによって、gpd1遺伝子のORFの上流2299bpから1811bpの領域の3’末端にNheIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(gpd1dwフラグメント)を得た。
該gpd1dwフラグメントを制限酵素NheIで消化し、またpSXxxを制限酵素SmaIおよびXbaIで二重消化し、両者をライゲーションンし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素PvuIIおよびBglIIで二重消化し、またgpd1upフラグメントを制限酵素BamHIで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSGベクターとした。

0078

<pgk1遺伝子座組込み用ベクターpSPの製造>
pSXxxベクターのPvuII−BglII間およびSmaI−XbaI間のそれぞれに、S.ポンベの染色体のgpd1遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、pgk1遺伝子座組込み用ベクターpSP(4475bp、配列番号37)を製造した。図12に、pSPベクターの構造を示す。該上流側組換え部位(図12中、「pgk1up」)は、pgk1遺伝子のORFの上流2307bpから1935bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図12中、「pgk1dw」)は、pgk1遺伝子のORFの上流1934bpから1492bの領域を下流側標的部位とした。

0079

具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマー(配列番号38)および5’末端にBamHIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号39)を用いたPCRによって、pgk1遺伝子のORFの上流2307bpから1935bpの領域の3’末端にBamHIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(pgk1upフラグメント)を得、フォワードプライマー(配列番号40)および5’末端にNheIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号41)を用いたPCRによって、pgk1遺伝子のORFの上流1934bpから1492bpの領域の3’末端にNheIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(pgk1dwフラグメント)を得た。
該pgk1upフラグメントを制限酵素BamHIで消化し、またpSXxxを制限酵素PvuIIおよびBglIIで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素SmaIおよびXbaIで二重消化し、またpgk1dwフラグメントを制限酵素NheIで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSPベクターとした。

0080

<tpi1遺伝子座組込み用ベクターpSTの製造>
pSXxxベクターのPvuII−BglII間およびSmaI−XbaI間のそれぞれに、S.ポンベの染色体のtpi1遺伝子座およびその近傍に相同組換えさせるために必要な上流側組換え部位と下流側組換え部位を挿入し、tpi1遺伝子座組込み用ベクターpST(4535bp、配列番号42)を製造した。図13に、pSTベクターの構造を示す。該上流側組換え部位(図13中、「tpi1up」)は、tpi1遺伝子のORFの上流1618bpから1173bpの領域を上流側標的部位とし、該下流側組換え部位(図13中、「tpi1dw」)は、tpi1遺伝子のORFの上流1172bpから743bpの領域を下流側標的部位とした。

0081

具体的には、S.ポンベの野生株(ARC032株)由来のゲノムDNAを鋳型とし、フォワードプライマー(配列番号43)および5’末端にBamHIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号44)を用いたPCRによって、tpi1遺伝子のORFの上流1618bpから1173bpの領域の3’末端にBamHIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(tpi1upフラグメント)を得、フォワードプライマー(配列番号45)および5’末端にNheIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号46)を用いたPCRによって、tpi1遺伝子のORFの上流1172bpから743bpの領域の3’末端にNheIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(tpi1dwフラグメント)を得た。
該tpi1upフラグメントを制限酵素BamHIで消化し、またpSXxxを制限酵素PvuIIおよびBglIIで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドを制限酵素SmaIおよびXbaIで二重消化し、またtpi1dwフラグメントを制限酵素NheIで消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをpSTベクターとした。

0082

[実施例2]
<EGFP発現ベクターの製造>
実施例1で製造した単座組込み用ベクターのうち、pSE、pSM、pSN、pSD、pSF、pSG、pSP、pST、pSU、および公知の単座組込み用ベクターpSL6(Alimjan et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, vol.85, pp.667−677)にそれぞれEGFP遺伝子を組込み、EGFP発現ベクターを製造した。pSL6ベクターは、hCMVプロモーターおよびLPIターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。

0083

(pSL−EGFP、pSU−EGFP、およびpSE−EGFP)
単座組込み用ベクターpSL6、pSU、およびpSEの各マルチクローニングサイトに、EGFPをコードする構造遺伝子を挿入したGFP発現ベクターpSL−EGFP、pSU−EGFP、およびpSE−EGFPをそれぞれ製造した。
具体的には、まず、EGFPをコードする人工合成遺伝子(配列番号47)を鋳型とし、5’末端にNcoIの制限酵素認識部位を備えるフォワードプライマー(配列番号48)および5’末端にPstIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号49)とを用いたPCRによって、EGFP遺伝子のORF全長の5’末端にNcoIの制限酵素認識部位を、3’末端にPstIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(EGFPフラグメント)を得た。
該EGFPフラグメントを、制限酵素NcoIおよびPstIで二重消化した。pSL6およびpSUをそれぞれ制限酵素AarIおよびPstIで、pSEを制限酵素PciIおよびSbfIで二重消化し、それぞれ二重消化したEGFPフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、GFP発現ベクターpSL−EGFP、pSU−EGFP、およびpSE−EGFPとした。

0084

(pSM−EGFP、pSN−EGFP、およびpSD−EGFP)
単座組込みベクターpSM、pSNおよびpSDの各マルチクローニングサイトに、EGFPの構造遺伝子および該遺伝子上流にhCMVプロモーターを配したhCMV+EGFPフラグメントを挿入したGFP発現ベクターpSM−EGFP、pSN−EGFPおよびpSD−EGFPをそれぞれ製造した。
具体的には、まず、pSE−EGFPを制限酵素EcoRVおよびSbfIで二重消化してhCMV+EGFPフラグメントを得た。pSM、pSNおよびpSDそれぞれを制限酵素EcoRVおよびSbfIで二重消化し、それぞれ二重消化したhCMV+EGFPフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、GFP発現ベクターpSM−EGFP、pSN−EGFPおよびpSD−EGFPとした。

0085

(pSF−EGFP、pSG−EGFP、pSP−EGFPおよびpST−EGFP)
単座組込みベクターpSF、pSG、pSPおよびpSTの各マルチクローニングサイトに、EGFPの構造遺伝子および該遺伝子上流にhCMVプロモーターを、下流にLPIターミネーターを配したEGFP発現カセットを挿入したGFP発現ベクターpSF−EGFP、pSG−EGFP、pSP−EGFPおよびpST−EGFPをそれぞれ製造した。
具体的には、まず、pSL−EGFPを制限酵素SpeIで消化した後に平滑化処理を行い、更に制限酵素BlnIで消化してEGFP発現カセットフラグメントを回収した。pSF、pSG、pSPおよびpSTそれぞれを制限酵素BlnIおよびSmaIで二重消化し、それぞれ消化したEGFP発現カセットフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれ、GFP発現ベクターpSF−EGFP、pSG−EGFP、pSP−EGFPおよびpST−EGFPとした。

0086

<宿主>
宿主として、S.ポンベのロイシン要求株ARC001(遺伝子型:h−、leu1−32)およびウラシル要求株ARC136(遺伝子型:h−、ura4−D18)を用いた。

0087

<形質転換体の製造>
ARC001株およびARC136株をYES(0.5%酵母エキス、3%グルコース、0.25mg/mL SPサプリメント)培地でそれぞれ1.0〜2.0×107細胞数/mLになるまで生育させた。生育させた菌体を集菌して洗浄した後、2.0×109細胞数/mLになるように0.1M酢酸リチウム(pH5.0)にそれぞれ懸濁した。その後、ARC001株の懸濁液100μLにEGFP発現ベクターpSL−EGFPを制限酵素NotIで消化したもの約1μgを、ARC136株の懸濁液100μLにGFP発現ベクターpSU−EGFP、pSF−EGFP、pSG−EGFP、pSP−EGFPまたはpST−EGFPを制限酵素NotIで消化したもの、pSE−EGFP、pSM−EGFP、pSN−EGFPまたはpSD−EGFPを制限酵素PmeIで消化したもの約1μgをそれぞれ加え、更に50%(w/v)ポリエチレングリコール(PEG4000)水溶液をそれぞれに260μL加えてよく撹拌した後、30℃で30分間インキュベートし、43μLのDMSOを添加した後に更に42℃で5分間インキュベートした。遠心分離処理によりPEG4000を除去し、洗浄した後の菌体を150μLの滅菌水に懸濁し、最少寒天培地に塗布した。各菌体を塗布した寒天培地を3〜5日培養した後、形質転換体を得た。

0088

pSL−EGFP、pSU−EGFP、pSE−EGFP、pSM−EGFP、pSN−EGFP、pSD−EGFP、pSF−EGFP、pSG−EGFP、pSP−EGFPおよびpST−EGFPを用いて得た形質転換体をそれぞれ、SL−EGFP株、SU−EGFP株、SE−EGFP株、SM−EGFP株、SN−EGFP株、SD−EGFP株、SF−EGFP株、SG−EGFP株、SP−EGFP株およびST−EGFP株とした。

0089

培養菌体のGFP蛍光強度測定
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の5mLのEMM培地(MP BIOMEDICALS社製、米国)に植菌し、32℃で3日間培養した。培養後の各培養液の菌体密度(OD660)およびGFP蛍光強度励起波長490nm、蛍光波長530nm)をMTP−810Lab(コロナ電気社製、日本)により測定して、各形質転換体のOD660当りのGFP蛍光強度(GFP/OD660、細胞当りのEGFP生産量を反映)を算出し、SL−EGFP株のGFP/OD660を1として各形質転換体のGFP/OD660を相対比較した。

0090

培養後の各培養液は、どの形質転換体もGFPの蛍光を示しており、EGFPを生産していることがうかがえた。各形質転換体の相対GFP/OD660の算出結果を図14に示す。染色体に組込まれた発現カセットは同じであったにもかかわらず、各株のGFP/OD660は異なっており、発現カセットを組込む部位によってGFP/OD660が変動することがわかった。SL−EGFP株が最も高いGFP/OD660を示し、SU−EGFP株はSL−EGFP株の約80%のGFP/OD660を、SE−EGFP株、SM−EGFP株、SN−EGFP株およびSD−EGFP株はSL−EGFP株の約50%のGFP/OD660を、SF−EGFP株、SG−EGFP株、SP−EGFP株およびST−EGFP株はSL−EGFP株の約25%のGFP/OD660を示した。該結果から、ef1a−a遺伝子座およびその近傍、eno101遺伝子座およびその近傍、fba1遺伝子座およびその近傍、gpd3遺伝子座およびその近傍、gpm1遺伝子座およびその近傍、pgk1遺伝子座およびその近傍、ならびにtpi1遺伝子座およびその近傍は、leu1遺伝子座およびその近傍、ura4遺伝子座およびその近傍、gpd1遺伝子座およびその近傍と同様に遺伝子組込み座として適しており、外来遺伝子を含む発現カセットを組込むことにより、外来遺伝子を発現させられることがわかった。また、いずれの形質転換体の発現量も、gpd1遺伝子座近傍に外来遺伝子を組込んだSG−EGFP株の発現量よりも多いことから、ef1a−a遺伝子座およびその近傍等は、従来公知の遺伝子組込み座と同様に外来遺伝子を充分な発現量で発現させられることがわかった。

0091

[実施例3]
<EGFP分泌発現ベクターの製造>
実施例1で製造した単座組込み用ベクターのうち、pSN2、pSF、pSG、pSP、およびpSTにそれぞれ、N末端にP3分泌シグナルペプチドを付加したEGFP遺伝子を組込み、EGFP分泌発現ベクターを製造した。合わせて、公知の単座組込みベクターpSL6P3中のマルチクローニングサイトにEGFP遺伝子を組込み、EGFP分泌発現ベクターを製造した。pSL6P3ベクターは、hCMVプロモーターの下流にP3分泌シグナルペプチドをコードする遺伝子を配し、該遺伝子とLPIターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込む単座組込み用ベクターである。

0092

(pSL−P3EGFP)
まず、EGFPをコードする人工合成遺伝子(配列番号47)を鋳型とし、5’末端にAflIIの制限酵素認識部位およびKKRペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー(配列番号50)および5’末端にKpnIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号51)とを用いたPCRによって、EGFP遺伝子のORF全長の5’末端にAflIIの制限酵素認識部位とKKRペプチド配列をコードするコドンを、3’末端にKpnIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(分泌用EGFPフラグメント)を得た。
該分泌用EGFPフラグメントおよびpSL6P3それぞれを制限酵素AflIIおよびKpnIで二重消化し、両者をライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをEGFP分泌発現ベクターpSL−P3EGFPとした。

0093

(pSN2−P3EGFP、pSF−P3EGFP、pSG−P3EGFP、pSP−P3EGFP、およびpST−P3EGFP)
単座組込みベクターpSN2、pSF、pSG、pSPおよびpSTの各マルチクローニングサイトに、P3分泌シグナルをN末端に付加させたEGFPの構造遺伝子および該遺伝子上流にhCMVプロモーターを、下流にLPIターミネーターを配したP3EGFP発現カセットを挿入したEGFP分泌発現ベクターpSN2−P3EGFP、pSF−P3EGFP、pSG−P3EGFP、pSP−P3EGFPおよびpST−P3EGFPをそれぞれ製造した。
具体的には、pSL−P3EGFPを制限酵素SpeIで消化した後に平滑化処理を行い、更に制限酵素BlnIで消化してEGFP発現カセットフラグメントを回収した。pSN2、pSF、pSG、pSPおよびpSTを制限酵素BlnIおよびSmaIで二重消化し、それぞれP3EGFP発現カセットフラグメントとライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれEGFP分泌発現ベクターpSN2−P3EGFP、pSF−P3EGFP、pSG−P3EGFP、pSP−P3EGFPおよびpST−P3EGFPとした。

0094

<宿主>
宿主として、S.ポンベARC001株の8つのプロテアーゼ遺伝子を欠失させたA8株(遺伝子型:h−、leu1−32、ura4−D18、△psp3、△isp6、△oma1、△ppp16、△fma2、△sxa2、△atg4、△ppp20)を用いた。A8株は、遺伝子カセットを用いた標的ORFの遺伝子置換により予め構築された株である(国際公開第2007/015470号パンフレット参照。)。

0095

<形質転換体の製造>
宿主としてA8株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として制限酵素NotIで消化した前記で得られた各EGFP分泌発現ベクター約1μgを用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。
pSL−P3EGFP、pSN2−P3EGFP、pSF−P3EGFP、pSG−P3EGFP、pSP−P3EGFPおよびpST−P3EGFPを用いて得た形質転換体をそれぞれ、SL−P3EGFP株、SN2−P3EGFP株、SF−P3EGFP株、SG−P3EGFP株、SP−P3EGFP株およびST−P3EGFP株とした。

0096

<EGFPの分泌生産量の測定>
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の5mLのYPD+MES(1%酵母エキス、1%ペプトン、2%グルコース、0.3M 2−モルホリノエタンスルホン酸一水和物)培地(pH6.0)に植菌し、32℃で3日間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収された培養上清4mLにTCA(トリクロロ酢酸溶液終濃度10%(w/w)になるよう添加して冷却し、得られた沈殿物を回収した。該沈殿物に40μLのSDS−PAGE用サンプルバッファーを添加し、95℃で5分間インキュベートし、PAGE用サンプルを調製した。該PAGE用サンプルのうち10μL(培養上清1mL相当)をアクリルアミドゲルアプライし、SDS−PAGE後にCBB染色して、染色像をGel Doc(登録商標) XR+システム(Bio−Rad Laboratories社製、米国)で検出した。検出されたEGFPの分泌バンド定量化し、SL−P3EGFP株のEGFP分泌量を1とした場合の各形質転換体のEGFPの相対分泌量を算出した。

0097

各形質転換体のEGFPの相対分泌量の算出結果を図15に示す。図15に示すように、全ての形質転換体においてEGFPの分泌が確認された。実施例2と同様に、染色体中の組込み場所によってEGFPの分泌量が変動していたものの、相対量は実施例2とは異なっていた。即ち、ST−P3EGFP株はSL−P3EGFPと同等の分泌量を、SN2−P3EGFP株、SF−P3EGFP株、SG−P3EGFP株およびSP−P3EGFP株はSL−P3EGFP株の約50%のEGFP分泌量を示した。該結果から、同じ蛋白質であっても、発現様式により、発現量に対する発現カセットの組込み場所の影響が異なることが示唆された。

0098

[実施例4]
<LDH(乳酸脱水素酵素遺伝子)発現ベクターの製造>
実施例1で製造した単座組込み用ベクターのうちのpSU、pSE、pSHおよびpSUbベクターとpSL6のマルチクローニングサイトに、ラクトバシラス由来のD−乳酸脱水素酵素(LcDLDH)をコードする構造遺伝子(配列番号52)を挿入したLcDLDH発現ベクターpSL−DLDH、pSU−DLDH、pSE−DLDH、pSH−DLDHおよびpSUb−DLDHを作製した。

0099

(pSL−DLDHおよびpSU−DLDH)
pSL6およびpSUそれぞれを制限酵素AarIおよびPstIで二重消化した。DNA合成により作製したLcDLDHの構造遺伝子を含む塩基配列(配列番号53)からなるDNA断片を、二重消化したpSL6およびpSUそれぞれに、In−Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(Clontech社製)を用いて挿入し、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれLcDLDH発現ベクターpSL−DLDHおよびpSU−DLDHとした。

0100

(pSE−DLDH、pSH−DLDHおよびpSUb−DLDH)
pSE、pSHおよびpSUbそれぞれを制限酵素PciIで消化した。DNA合成により作製したLcDLDHの構造遺伝子を含む塩基配列(配列番号54)からなるDNA断片を、消化したpSE、pSHおよびpSUbそれぞれに、In−Fusion HD Cloning Kitを用いて挿入し、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれLcDLDH発現ベクターpSE−DLDH、pSH−DLDHおよびpSUb−DLDHとした。

0101

<宿主>
宿主として、S.ポンベのピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子2(pdc2)を欠損させた公知のIGF543株(遺伝子型:h−、leu1−32、ura4−D18、pdc2−D23)を用いた(国際公開第2011/021629号パンフレット参照。)。

0102

<形質転換体の製造>
宿主としてIGF543株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素NotIで消化したLcDLDH発現ベクターpSL−DLDHおよびpSU−DLDHと制限酵素PmeIで消化したLcDLDH発現ベクターpSE−DLDH、pSH−DLDHおよびpSUb−DLDHとをそれぞれ約1μg用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。
pSL−DLDH、pSU−DLDH、pSE−DLDH、pSH−DLDHおよびpSUb−DLDHを用いて得た形質転換体をそれぞれ、SL−DLDH株、SU−DLDH株、SE−DLDH株、SH−DLDH株およびSUb−DLDH株とした。

0103

<D−乳酸発酵生産試験
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の5mLのYPD6(1%酵母エキス、1%ペプトン、6%グルコース)培地に植菌し、32℃で24時間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収した菌体を、4.5mLの11.1%グルコース溶液初発菌体濃度が36g(乾燥菌体重量)/Lになるように接種した。32℃、振盪速度100rpmで3時間乳酸発酵を行い、発酵終了後の培養液中のD−乳酸濃度(g/L)を測定した。測定結果を元に、SL−DLDH株のD−乳酸生産速度(g/(L・h))を1とした場合の各形質転換体のD−乳酸の相対生産速度を算出した。

0104

培養液中のD−乳酸濃度を測定したところ、全ての形質転換体においてD−乳酸の生産が確認され、各株はLcDLDHを発現していた。各形質転換体のD−乳酸の相対生産速度の算出結果を図16に示す。染色体中の組込み場所によってD−乳酸の生産速度は異なっており、SU−DLDH株、SH−DLDH株およびSUb−DLDH株はSL−DLDH株の80〜90%の生産速度を、また、SE−DLDH株はSL−DLDH株の約30%の生産速度を示した。D−乳酸の生産速度は、各株のLcDLDHの菌体内発現量を反映すると考えられることから、実施例2の結果と比較して、発現させる蛋白質によって、発現量に対する発現カセットの組込み場所の影響が異なることが示唆された。

0105

[実施例5]
<LDH発現ベクターの製造>
実施例1で製造した単座組込み用ベクターのうちのpSM、pSNおよびpSDベクターとpSL6のマルチクローニングサイトに、ヒト由来のL−乳酸脱水素酵素(HsLLDH)をコードする構造遺伝子(配列番号55)を挿入したLDH発現ベクターpSL−LLDH、pSM−LLDH、pSN−LLDHおよびpSD−LLDHを作製した。

0106

(pSL−LLDH)
pSL6を制限酵素AarIおよびPstIで二重消化した。DNA合成により作製したHsLLDHの構造遺伝子を含む塩基配列(配列番号56)からなるDNA断片を、二重消化したpSL6にIn−Fusion HD Cloning Kitを用いて挿入し、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをHsLLDH発現ベクターpSL−LLDHとした。

0107

(pSM−LLDH)
pSMを制限酵素PciIで消化した。DNA合成により作製したHsLLDHの構造遺伝子を含む塩基配列(配列番号57)からなるDNA断片を、消化したpSMにIn−Fusion HD Cloning Kitを用いて挿入し、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをHsLLDH発現ベクターpSM−LLDHとした。

0108

(pSN−LLDHおよびpSD−LLDH)
pSM−LLDHを制限酵素EcoRVおよびEcoRIで二重消化してhCMV+HsLLDHフラグメントを回収した。pSNおよびpSDそれぞれを制限酵素EcoRVおよびEcoRIで二重消化し、二重消化したhCMV+HsLLDHフラグメントとそれぞれライゲーションし、続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれHsLLDH発現ベクターpSN−LLDHおよびpSD−LLDHとした。

0109

<形質転換体の製造>
宿主としてIGF543株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素NotIで消化したHsLLDH発現ベクターpSL−LLDHと制限酵素PmeIで消化したHsLLDH発現ベクターpSM−LLDH、pSN−LLDHおよびpSD−LLDHとをそれぞれ約1μg用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。
pSL−LLDH、pSM−LLDH、pSN−LLDHおよびpSD−LLDHを用いて得た形質転換体をそれぞれ、SL−LLDH株、SM−LLDH株、SN−LLDH株、およびSD−LLDH株とした。

0110

<L−乳酸の発酵生産試験>
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の5mLのYPD6培地に植菌し、32℃で24時間培養した。培養液を遠心分離処理し、回収した菌体を、4.5mLの11.1%グルコース溶液に初発菌体濃度が36g(乾燥菌体重量)/Lになるように接種した。32℃、振盪速度100rpmで3時間乳酸発酵を行い、発酵終了後の培養液中のL−乳酸濃度(g/L)を測定した。測定結果を元に、SL−LLDH株のL−乳酸生産速度(g/(L・h))を1とした場合の各形質転換体のL−乳酸の相対生産速度を算出した。

0111

培養液中のL−乳酸濃度を測定したところ、全ての形質転換体においてL−乳酸の生産が確認され、各株はHsLLDHを発現していた。各形質転換体のL−乳酸の相対生産速度の算出結果を図17に示す。染色体中の組込み場所によってL−乳酸の生産速度は異なっており、SD−LLDH株はSL−LLDH株の約80%の生産速度を、また、SM−LLDH株およびSN−LLDH株はSL−DLDH株の3.5倍以上の生産速度を示した。L−乳酸の生産速度は、各株のHsLLDHの菌体内発現量を反映すると考えられることから、実施例4の結果と同様に、発現させる蛋白質によって、発現量に対する発現カセットの組込み場所の影響が異なることが示唆された。

0112

[実施例6]
<hTF分泌発現ベクターの製造>
実施例1で製造した単座組込み用ベクターのうちのpSU、pSM、pSNおよびpSDベクターと公知の単座組込みベクターpPDI1(SP)−hPDI(abx)−AflIIのマルチクローニングサイトに、N結合型糖鎖付加部位に変異を導入したヒトトランスフェリン(変異型hTF)をコードする構造遺伝子を挿入したhTF分泌発現ベクターを作製した。pPDI1(SP)−hPDI(abx)−AflIIはpSL6ベクターと類似の基本構造を有し、hCMVプロモーター下流に、S.ポンベ由来PDI1のシグナルペプチド部分をコードする遺伝子とヒト由来PDI1のabxドメイン部分をコードする遺伝子との融合遺伝子(ヒトPDI(abx)分泌キャリア遺伝子)を配し、該融合遺伝子とLPIターミネーターの間にマルチクローニングサイトを備え、S.ポンベのleu1遺伝子座に外来遺伝子を組込むキャリア型分泌発現ベクターである(国際公開第2013/111754号パンフレット参照。)。

0113

(pSL−hPDI(abx)hTF)
変異型hTFをコードする人工合成遺伝子(配列番号58)を鋳型とし、5’末端にAflIIの制限酵素認識部位およびKKRペプチド配列をコードするコドンを備えるフォワードプライマー(配列番号59)および5’末端にXbaIの制限酵素認識部位を備えるリバースプライマー(配列番号60)を用いたPCRによって、変異型hTF遺伝子のORF全長の5’末端にAflIIの制限酵素認識部位とKKRペプチド配列をコードするコドンを、3’末端にXbaIの制限酵素認識部位を有するPCR産物(変異型hTFフラグメント)を得た。該変異型hTFフラグメントおよびpPDI1(SP)−hPDI(abx)−AflIIそれぞれを制限酵素AflIIおよびXbaIで二重消化し、両者をライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをhTF分泌発現ベクターpSL−hPDI(abx)hTFとした。

0114

(pSU−hPDI(abx)hTF)
pSL−hPDI(abx)hTFを制限酵素SnaBIおよびSalIで二重消化してヒトPDI(abx)分泌キャリア+変異型hTFフラグメントを回収した。pSUを制限酵素SnaBIおよびSalIで二重消化し、ヒトPDI(abx)分泌キャリア+変異型hTFフラグメントとライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをhTF分泌発現ベクターpSU−hPDI(abx)hTFとした。

0115

(pSE−hPDI(abx)hTF)
pSL−hPDI(abx)hTFを制限酵素BlnIおよびSpeIで二重消化してhTF分泌発現カセットフラグメントを回収した。pSEを制限酵素BlnIで消化し、hTF分泌発現カセットフラグメントとライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、プラスミドを得た。該プラスミドをhTF分泌発現ベクターpSE−hPDI(abx)hTFとした。

0116

(pSN−hPDI(abx)hTF、pSD−hPDI(abx)hTFおよびpSM−hPDI(abx)hTF)
pSE−hPDI(abx)hTFを制限酵素EcoRVおよびSalIで二重消化してhCMV+ヒトPDI(abx)分泌キャリア+変異型hTFフラグメントを回収した。一方、pSN、pSDおよびpSMそれぞれを制限酵素EcoRVおよびSalIで二重消化した。二重消化したpSN、pSDおよびpSMをそれぞれ、hCMV+ヒトPDI(abx)分泌キャリア+変異型hTFフラグメントとライゲーションして続く大腸菌DH5αへの形質転換後、各プラスミドを得た。該プラスミドをそれぞれhTF分泌発現ベクターpSN−hPDI(abx)hTF、pSD−hPDI(abx)hTFおよびpSM−hPDI(abx)hTFとした。

0117

<形質転換体の製造>
まず、宿主としてA8株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素NotIで消化したhTF分泌発現ベクターpSU-hPDI(abx)hTF約1μgを用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をSU−hPDI(abx)hTF株とした。

0118

次いで、SU-hPDI(abx)hTF株を5−フルオロオロチン酸(FOA)、ウラシルおよびロイシンを含有する最少寒天培地上で生育させる(FOA処理)ことによって、ウラシル要求性を示すSU−hPDI(abx)hTF株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すSU−hPDI(abx)hTF株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素PmeIで消化した前記で得られたhTF分泌発現ベクターpSM−hPDI(abx)hTF約1μgを用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をSU/SM−hPDI(abx)hTF株とした。

0119

次いで、SU/SM−hPDI(abx)hTF株にFOA処理を行うことによって、ウラシル要求性を示すSU/SM−hPDI(abx)hTF株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すSU/SM−hPDI(abx)hTF株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素PmeIで消化した前記で得られたhTF分泌発現ベクターpSN−hPDI(abx)hTF約1μgを用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をSU/SM/SN−hPDI(abx)hTF株とした。

0120

次いで、SU/SM/SN−hPDI(abx)hTF株にFOA処理を行うことによって、ウラシル要求性を示すSU/SM/SN−hPDI(abx)hTF株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すSU/SM/SN−hPDI(abx)hTF株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素PmeIで消化した前記で得られたhTF分泌発現ベクターpSD−hPDI(abx)hTF約1μgを用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をSU/SM/SN/SD−hPDI(abx)hTF株とした。

0121

次いで、SU/SM/SN/SD−hPDI(abx)hTF株にFOA処理を行うことによって、ウラシル要求性を示すSU/SM/SN/SD−hPDI(abx)hTF株を取得した。
宿主としてウラシル要求性を示すSU/SM/SN/SD−hPDI(abx)hTF株を用いたこと、および宿主に導入するDNA断片として、制限酵素NotIで消化した前記で得られたhTF分泌発現ベクターpSL−hPDI(abx)hTF約1μgを用いた以外は、実施例2と同様にして形質転換体を作製した。該形質転換体をSU/SM/SN/SD/SL−hPDI(abx)hTF株とした。

0122

SU-hPDI(abx)hTF株、SU/SM-hPDI(abx)hTF株、SU/SM/SN-hPDI(abx)hTF株、SU/SM/SN/SD-hPDI(abx)hTF株およびSU/SM/SN/SD/SL-hPDI(abx)hTF株は、染色体中に変異型hTF発現カセットをそれぞれ、1、2、3、4および5コピー有する。

0123

<変異型hTFの分泌生産
前記で得られた各形質転換体をそれぞれ試験管内の5mLのYPD+MES培地(pH6.0)に植菌し、32℃で4日間培養した。培養液を遠心分離処理して培養上清と培養菌体とに分離し、培養上清中に含まれる変異型hTFをTransferrin, Human,ELISAQuantitation Kit(Bethyl Laboratories社製、米国)により検出し定量した。定量結果を元に、SU−hPDI(abx)hTF株の変異型hTF分泌量を1とした場合の各形質転換体の変異型hTFの相対分泌量を算出した。算出結果を図18に示す。

0124

<変異型hTF遺伝子のmRNA転写量>
前記で得られた各形質転換体の培養菌体よりRNAを抽出し、定量的RTPCR法によりact1遺伝子および変異型hTF遺伝子のmRNAをそれぞれ検出し、各形質転換体の変異型hTF遺伝子のmRNA転写量を比較した。
具体的には、High−CapacitycDNAReverse Transcription Kit(Life technologies社製、米国)を用いて、各形質転換体の培養菌体から抽出した各RNAサンプルよりcDNAを調製した。act1遺伝子の検出には配列番号61で表されるフォワードプライマーおよび配列番号62で表されるリバースプライマーを、変異型hTF遺伝子の検出には配列番号63で表されるフォワードプライマーおよび配列番号64で表されるリバースプライマーを用い、THUNDERIRDqPCRMix(東洋紡社製、日本)とMx3000P QPCR System(Agilent Technologies社製、米国)を用いて各cDNAサンプルを鋳型とした定量PCRを実施した。Mx3000P QPCR Systemに付属ソフトウェアに従ってact1遺伝子のmRNA転写量を内部標準とした変異型hTF遺伝子のmRNA相対転写量を算出し、SU−hPDI(abx)hTF株の変異型hTF遺伝子のmRNA転写量を1として各形質転換体の変異型hTF遺伝子のmRNA転写量を相対比較した。各形質転換体の変異型hTF遺伝子の相対転写量の算出結果を図19に示す。

0125

分泌生産試験の結果、図18に示すように、全ての形質転換体において変異型hTFの分泌が確認され、変異型hTF発現カセットの染色体への導入数が4までは、発現カセットコピー数の増加に伴い、変異型hTFの分泌量が向上した。しかし、SU/SM/SN/SD/SL−hPDI(abx)hTF株では、発現カセットのコピー数が最も多いにもかかわらず、SU−hPDI(abx)hTF株よりも変異型hTFの分泌量が減少してしまった。

0126

同様に、図19に示すように、変異型hTF遺伝子の転写量においては、変異型hTF発現カセットのゲノムへの導入数が4までは、発現カセットコピー数の増加に応じて、変異型hTF遺伝子の転写量が上昇していた。ただし、SU/SM/SN/SD/SL−hPDI(abx)hTF株では、SU/SM/SN/SD−hPDI(abx)hTF株よりも転写量がやや減少するものの、SU−hPDI(abx)hTF株の約4倍を示していた。

0127

全体的に転写量の結果が分泌量と相関しない結果となった理由としては、タンパク質の分泌生産は、遺伝子の転写以降様々な段階を経ることで至っており、変異型hTFの分泌に関しては、遺伝子の転写以降に分泌生産の律速段階が恐らく存在するため、転写量と分泌量に相関が見られなかったと考えられる。また、律速段階がそのまま宿主細胞に対するストレスとなり得るため、発現カセットのコピー数が5コピーになることで、宿主細胞の生命活動阻害し、転写量や分泌量の減少が観察されたものと推測される。一方で、4コピーまでの発現カセットの導入は、変異型hTFの分泌生産量向上をもたらすことに成功した。

0128

[実施例7]
<D−LDH遺伝子2コピー導入株の作製>
IGF543株の染色体中の2箇所に、異種の生物由来のDLDH遺伝子を導入した形質転換体を作製し、乳酸産生能を調べた。ウラシル要求性およびロイシン要求性回復させた株であって、ペディオコッカスアシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)のD−LDH遺伝子(PaDLDH)(GenBankaccession number:CAA50275.1)とラクトバチルスペントーサス(Lactobacillus pentosus)のD−LDH遺伝子(LpDLDH)(GenBank accession number:BAA14352.1)が1コピーずつ導入された株をASP4156株とした。

0129

具体的には、まず、IGF543株を、PaDLDH遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターpSE−PaDLDHの制限酵素BsiWI消化物で、Bahlerらの方法(Yeast誌、1998年、14巻、943−951頁)に従い形質転換し、PaDLDH遺伝子が1コピー導入されたS.ポンベLDH遺伝子1コピー導入株(ASP3472株)を作製した。

0130

pSE−PaDLDHは、pSLh−PaDLDHより発現カセット(hCMVプロモーター/PaDLDH−ORF/LPIターミネ—ター)を制限酵素SpeIおよびBst1107Iを用いた二重消化によって切り出し、pSEに組み込むことにより作製した。

0131

単座組込型組換えベクターpSLhは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、DNA全合成により作製された配列番号65に示す配列Y1を含むベクターを鋳型とし、配列番号66、67に示すプライマーセットによるPCR反応を行い、増幅したPCR産物を制限酵素KpnIとSnaBIで二重消化してDNA断片を得た。該DNA断片と、pSL1ベクターを制限酵素BsiWIで消化し得られた断片と、pSL6ベクターを鋳型とし配列番号68、69に示すプライマーセットによるPCR反応により得たPCR産物を制限酵素BsiWIで消化し再び制限酵素KpnIとSnaBIで二重消化して得られたDNA断片をライゲーションし、配列番号70にその配列(5’→3’、環状)を示すpSLh(5936bp、図20)を作製した。

0132

pSLh−PaDLDHは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ペディオコッカス・アシディラクティシNBRC3076株(NBRC(Biological Resource Center, NITE)より入手)の培養物からDNeasy(キアゲン社製)によって調製した全ゲノムDNAを鋳型とし、表1に記載の2種の合成オリゴDNA(PaDLDH−F、PaDLDH−R、オペロン社製)を使用し、KOD−Dash(東洋紡社製)を用いたPCR法によって、PaDLDH遺伝子のORF断片を得た。当該ORF断片は、PaDLDH(配列番号73)をコードしていた。

0133

0134

得られた増幅断片を、In−Fusion HD Cloning Kitを用いてpSLhに組み込んで、pSLh−PaDLDHを作製した。

0135

LpDLDH遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターpSLh−LpDLDHは、以下に示す工程で作製した。すなわち、まず、ラクトバチルス・ペントーサスNBRC106467株(NBRCより入手)の培養物からDNeasyによって調製した全ゲノムDNAを鋳型とし、表2に記載の2種の合成オリゴDNA(LpDLDH−F、LpDLDH−R、オペロン社製)を使用し、KOD−Dashを用いたPCR法によって、LpDLDH遺伝子のORF断片を得た。当該ORF断片は、LpDLDH(配列番号76)をコードしていた。

0136

0137

得られた増幅断片を、In−Fusion HD Cloning Kitを用いてpSLhに組み込んで、pSLh−LpDLDHを作製した。

0138

得られたS.ポンベLDH遺伝子1コピー導入株(ASP3472株)に対して、FOA(5−フルオロオロチン酸)処理を行ってura4遺伝子を除去した後、LpDLDH遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターpSLh−LpDLDHを用い、岡崎らの方法(Okazakiほか、Nucleic AcidsRes.誌、1990年、18巻、6485−6489頁)により形質転換し、leu1座近傍にhCMVプロモーターによって制御されたLpDLDH遺伝子をさらに1コピー導入したS.ポンベD−LDH遺伝子2コピー導入株を作製した。

0139

得られたS.ポンベLDH遺伝子2コピー導入株に対して、FOA処理を行ってura4遺伝子を除去した後、leu1遺伝子断片(配列番号77)およびura4遺伝子断片(配列番号78)を用いて形質転換を行い、ウラシル要求性およびロイシン要求性を回復させた株(ASP4156株)を作製した。

0140

培養試験
ASP4156株およびASP3472株をそれぞれYPD6液体培地に植菌して、温度32℃、振盪速度100rpmの条件下で24時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、4.5mLの11.1%グルコース水溶液に初発菌体濃度を36g(乾燥菌体換算)/Lになるように接種し、温度32℃、振盪速度100rpmの条件下で3または8時間培養を行い、終了後、培養液中のグルコース、エタノールおよび乳酸の濃度(g/L)を測定した。また、乳酸の光学純度を、配位子交換カラムを用いて光学異性体を分離し測定した。光学純度は、各光学異性体ピークエリア面積から、下記式([D体]:D−乳酸のピークエリア面積、[L体]:L−乳酸のピークエリア面積)により算出して求めた。発酵(培養)時間、測定結果ならびに該測定結果より計算した、D−乳酸の対糖収率選択率、%)およびD−乳酸の光学純度(%ee)を表3に示す。
式:[光学純度(%ee)]=([D体]−[L体])/([D体]+[L体])×100

0141

0142

[実施例8]
<S.ポンベpdc2遺伝子削除株の作製>
S.ポンベのウラシル要求性株ARC019株(遺伝子型:h− 、leu1−32、ura4−D18、Ade6−M216)(Strain name: JY741, NBRPID: FY7512)をLatour法に従って形質転換し、pdc2遺伝子(系統名:SPAC1F8.07c)を削除した削除株(IGF836株)を作製した。
削除断片の作製には、S.ポンベのARC032株からDNeasyによって調製した全ゲノムDNAを鋳型とし、表4に示す塩基配列を有する8種の合成オリゴDNA(オペロン社製)を使用した。

0143

0144

具体的には、UFとURでUP領域を、OFとORでOL領域を、DFとDRでDN領域をそれぞれKOD−Dashを用いたPCR法によって作製したのち、さらにそれらを鋳型として、それぞれFFとFRを用いた同様のPCR法によって全長の削除断片を作製した。全長の削除断片作製時には、表5に示す塩基配列を有する2種の合成オリゴDNA(オペロン社製)を用い、ARC032株より同様に調製した全ゲノムDNAを鋳型とし、同様のPCR法によって調製したS.ポンベのウラシル要求性マーカーura4(GeneDB収載の系統名SPCC330.05c、オロチジン−5’−リン酸脱炭酸酵素遺伝子)領域断片も鋳型として合わせて使用した。

0145

0146

<外来遺伝子を導入したS.ポンベ形質転換株の作製>
得られたS.ポンベpdc2遺伝子削除株(IGF836株、h− leu1−32 ura4−D18 ade6−M216 pdc2−D23)に、サッカロミセス・セレビシエ由来のPYC(ScePYC)およびデルフチア・アシドボランス由来のMDH(DacMDH)を導入したS.ポンベ形質転換株(ASP4491株)を作製した。

0147

具体的には、作製したIGF836株(S.ポンベの遺伝子削除株)を、ScePYC遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターpSLh−ScePYCとDacMDH遺伝子発現カセットを保持した単座組込型組換えベクターpSMh−DacMDHの制限酵素BsiWI消化物で、Bahlerらの方法に従い形質転換した。

0148

単座組込型組換えベクターpSMhは、以下に示す工程で作製することができる。まず、DNA全合成により作製された配列番号89に示す塩基配列からなるDNA断片(Fr.1)を制限酵素BsiWIで消化し得られた断片と、pSEベクターを制限酵素BsiWIで消化し再び制限酵素KpnIとSnaBIで二重消化して得られたDNA断片をライゲーションし、配列番号90に示す塩基配列(5’→3’、環状)からなるpSMh(8849bp、図21)を作製した。

0149

pSLh−ScePYCは、以下に示す工程で作製した。まず、サッカロミセス・セレビジエの培養物からDNeasyによって調製した全ゲノムDNAを鋳型とし、表6に記載の2種の合成オリゴDNA(ScePYC−F、ScePYC−R、オペロン社製)を使用し、KOD−Dashを用いたPCR法によって、ScePYC遺伝子のORF断片を得た。当該ORF断片は、ScePYC(配列番号93)をコードしていた。

0150

0151

得られた増幅断片を、In−Fusion HD Cloning Kitを用いて、pSLhに組み込んで、pSLh−ScePYCを作製した。

0152

同様の手法で単座組込型組換えベクターpSMh−DacMDHを作製した。用いたプライマーセットを表7に示す。

0153

0154

<mae2削除株の作製>
ScePYC遺伝子とDacMDH遺伝子を導入したASP4491株のmae2遺伝子を削除した削除株(ASP4964株)を作製した。mae2の削除断片の作製方法は、pdc2削除の削除断片と同様の作製方法で行った。
S.ポンベのASP4491株(遺伝子型:h− 、leu1−32、ura4−D18、Ade6−M216、Δpdc2、+ScePYC、+DacMDH)をLatour法に従って形質転換し、mae2遺伝子(系統名:SPCC794.12c)を削除したASP4964株を作製した。
削除断片の作製には、S.ポンベのARC032株からDNeasyによって調製した全ゲノムDNAを鋳型とし、表8に示す塩基配列を有する8種の合成オリゴDNA(オペロン社製)を使用した。

0155

0156

<リンゴ酸生産能の確認>
S.ポンベの野生株(ARC010株)と、pdc2遺伝子とmae2遺伝子を削除し、ScePYC遺伝子とDacMDH遺伝子を導入したASP4964株(Δpdc2,Δmae2,+ScePYC,+DacMDH)のリンゴ酸生産速度を調べた。

0157

具体的には、菌体をYESプレート播種し、30℃で96時間培養しコロニーを得た。得られたコロニーを5mLのYES培地(試験管)に植継ぎ、30℃で24時間振とう培養した。得られた菌液を100mLのYPD6培地(坂口フラスコ)に植継ぎ、30℃で44時間振とう培養した。
得られた菌体を集菌し、試験管内の3mLの発酵培地(100g/Lグルコース、111g/L炭酸カルシウム)に36g乾燥菌体重量/Lとなるように加え、30℃、振とう条件で発酵させた。発酵液から適時サンプリングを行った。
得られたサンプルについて、酵素電極法バイオセンサBF−7(王子計測機器社製)を用いてグルコース濃度とエタノール濃度を測定し、HPLCによりリンゴ酸濃度を測定した。HPLC測定では、高速液体クロマトグラフProminence(島津製作所製)を用い、カラムはAminex HPX—87H 300×7.8mm(Bio−RAD社製)を用い、インジェクション容量を10μLとし、溶媒に10mM H2SO4を用い、流速は0.6mL/minとし、測定時間は35分間とし、測定温度は60℃とし、検出にはダイオードアレイ検出(210nm)と示差屈折率検出を用いた。各濃度は、培養液または発酵液当たりの濃度である。

0158

グルコース濃度(g/L)、エタノール濃度(g/L)、およびリンゴ酸の濃度(g/L)の測定結果を、図22および23に示す。この結果、ASP4964株(Δpdc2,Δmae2,+ScePYC,+DacMDH)のみが、リンゴ酸の産生が確認された。

0159

[実施例9]
<S.ポンベHsLLDH遺伝子1コピー導入株の作製>
S.ポンベの染色体のgpm1遺伝子座近傍に、ヒト由来のL−乳酸脱水素酵素遺伝子(HsLLDH遺伝子)を組込むための発現ベクターpSM−HsLDHベクター(4562bp、図24)を作製した。pSM−HsLDHベクターは、DNA合成により、配列番号105に示す塩基配列からなるDNA断片として作製した。

0160

次いで、IGF543株を、pSM−HsLDHベクターで形質転換した。該操作により、HsLLDH発現カセットがゲノム上のgpm1遺伝子座近傍に組込まれた。該形質転換株(HsLLDH遺伝子1コピー導入株)をASP3494株とした。

0161

<S.ポンベHsLLDH遺伝子2コピー導入株の作製>
ASP3494株を、HsLLDH遺伝子発現カセットを保持し、ihc1プロモーターを有する発現ベクターpSL17−HsLDH(国際公開第2014/030655号参照。)の制限酵素BsiWI消化物で、Bahlerらの方法に従い形質転換した。該操作により、該発現カセットがゲノム上のleu1遺伝子座近傍に組込まれ、gpm1遺伝子座近傍にhCMVプロモーターによって制御されたHsLLDH遺伝子を1コピーと、leu1遺伝子座近傍にihc1プロモーターによって制御されたHsLLDH遺伝子を1コピーとの合計2コピーのHsLLDH遺伝子が組込まれた形質転換株を作製した。該形質転換株(HsLLDH遺伝子2コピー導入株)をASP4121株とした。

0162

<ウラシル要求性の復帰
pSM−HsLDHベクターによりS.ポンベのゲノムに組込まれたura4遺伝子は、2つのhCMVプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ASP4121株をFOA処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。

0163

<S.ポンベHsLLDH遺伝子3コピー導入株の作製>
まず、HsLLDH遺伝子発現カセットを保持し、S.ポンベの染色体のeno101遺伝子座近傍にHsLLDH遺伝子を組込むための発現ベクターpSN−HsLDHベクター(4535bp、図25)を作製した。pSN−HsLDHベクターは、DNA合成により、配列番号106に示す塩基配列からなるDNA断片として作製した。

0164

次いで、ASP4121株をFOA処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、pSN−HsLDHベクターで形質転換した。該操作により、HsLLDH発現カセットがゲノム上のeno101遺伝子座近傍に組込まれ、gpm1遺伝子座近傍にhCMVプロモーターによって制御されたHsLLDH遺伝子を1コピーと、leu1遺伝子座近傍にihc1プロモーターによって制御されたHsLLDH遺伝子を1コピーと、eno101遺伝子座近傍にhCMVプロモーターによって制御されたHsLLDH遺伝子を1コピーとの合計3コピーのHsLLDH遺伝子が組込まれた形質転換株を作製した。該形質転換株(HsLLDH遺伝子3コピー導入株)をASP4956株とした。

0165

<ウラシル要求性の復帰>
pSM−HsLDHベクターによる場合と同様に、pSN−HsLDHベクターによりS.ポンベのゲノムに組込まれたura4遺伝子は、2つのhCMVプロモーター配列に挟まれている為、ホモロガスリコンビネーションによりゲノム上から脱落しやすい。
そこで、ASP4956株をFOA処理し、ウラシルの要求性を復帰させた。

0166

<ウラシル要求性の補完
ASP4956株をFOA処理してウラシルの要求性を復帰させた形質転換株を、ura4遺伝子を含むDNA断片(3277bp、配列番号107)で形質転換し、ウラシル要求性が補完された形質転換株を作製した。該形質転換株(HsLLDH遺伝子3コピー導入栄養要求補完株)をASP5019株とした。

実施例

0167

<培養試験>
ASP5019株の増殖能と乳酸産生能を調べた。具体的には、形質転換株をYPD6液体培地に植菌して、温度32℃、振盪速度100rpmの条件下で24時間培養を行った。培養終了後、菌体を回収し、4.5mLの11.1%グルコース水溶液に初発菌体濃度を36g(乾燥菌体換算)/Lになるように接種し、温度32℃、振盪速度100rpmの条件下で3または20時間培養を行い、終了後、培養液のOD660および培養液中の乳酸の濃度(g/L)を測定した。この結果、ASP5019株の20時間培養後の培養液のOD660は22.5であり、3時間培養(発酵)後の乳酸濃度は91.0g/Lであった。

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