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技術 核酸増幅の特異的抑制方法

出願人 国立大学法人大阪大学
発明者 藤井穂高藤田敏次谷川直紀
出願日 2015年8月25日 (6年2ヶ月経過) 出願番号 2015-165643
公開日 2016年4月11日 (5年7ヶ月経過) 公開番号 2016-049107
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 具体的条件 対照領域 目的領域 インターセプト 優占種 対照鋳型 トランスクリプション TRC
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年4月11日)のものです。
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図面 (20)

課題

簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供すること。

解決手段

複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はRNAまたはRNAと他の核酸とのキメラであり、かつ、10〜200塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法。

概要

背景

PCR(Polymerase Chain Reaction)法は、特異的な一対のプライマーとDNA依存性DNAポリメラーゼを用いて特定のDNA配列増幅する技術であり、分子生物学分野の研究に不可欠な技術である。一般的なプライマー配列を含む複数の鋳型の増幅は、遺伝子ファミリーメンバークローニング臨床診断における微生物の検出に広く使われているが、このような鋳型の増幅にPCR法を利用する場合、目的領域以外の部位にプライマーがアニーリングすることに起因して、増幅させたい領域以外の領域が増幅される場合がある。このような望ましくない増幅産物が生成することにより、目的の増幅産物の検出が困難になり、また目的の増幅産物の生成が阻害される。それゆえ、望ましくない増幅産物の生成を抑制する技術の開発が求められてきた。

望ましくない増幅産物の生成を抑制する従来技術として、例えば以下の技術が知られている。
(1)PCRによる増幅反応を特異的に阻害するために、長鎖(750塩基程度)のRNAを用いる方法が報告されている(非特許文献1)。この方法では、長鎖RNAをインビトロトランスクリプションで合成するため、コストと手間がかかる。また、長鎖RNA中の配列と一部相補的な鋳型DNAの増幅も阻害される可能性があることから、阻害の特異性が低下する可能性がある。

(2)3’側の修飾によりプライマーとして機能しないオリゴデオキシヌクレオチド(以下「ODN」と記す)やLNA(locked nucleic acid)をPCRで増幅される領域内にアニーリングするようにデザインし、これらを反応系に加えて増幅を抑制する方法が報告されている(非特許文献2,3,4)。この方法を用いる場合は、ODNの3’側の修飾が除去されるとODNがプライマーとして働く可能性があるため、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を持つDNA依存性DNAポリメラーゼを使用することができないという問題がある。また、標的の増幅を抑制するために、反応系に高濃度のODNやLNAを添加する必要がある。

(3)Alu配列等の繰り返し配列に一方のプライマー(第1プライマー)を設計し、特異的な配列領域に他方のプライマー(第2プライマー)を設計する必要がある場合には、第1プライマーがゲノムの他の領域にアニーリングすることによって第1プライマーのみによる非特異的な増幅産物が生成する結果、目的の増幅産物検出が困難になったり、目的の増幅産物の生成が阻害されたりする問題が生じる。このような場合に、第1プライマーと重複する配列を持つが、3’側が修飾されているためプライマーとして働かないODNを反応系に加え、繰り返し配列にプライマーがアニーリングすることを競合的に阻害する方法が開発されている(非特許文献5,6)。この方法を用いる場合は、第1プライマー同士からの増幅が効果的に阻害されるため、相対的に目的の領域の増幅が増加することになる。しかし、この方法では、(a)プライマーと阻害ODNの最適な量比を決めることが煩雑である、(b)目的領域の増幅も阻害されるため鋳型によっては目的領域の増幅ができなくなる場合があり得る、という問題がある。また、少なくとも第2プライマーは特異的なゲノム領域に設計する必要があり、もし設計した第2プライマーがアニーリング可能な領域がゲノム中に複数ある場合には、目的領域のみを増幅することは困難である。

(4)目的の配列を増幅するが、目的でない配列も増幅し得る第1プライマーおよび第2プライマー以外に、目的でない配列にハイブリダイズするインターセプトプライマーを含有する反応系を用いて核酸増幅反応を行う方法が開発されている(特許文献1)。この方法では、第1プライマーとインターセプトプライマーによって、目的でない配列の一部を増幅することにより第2プライマー認識部位欠失した配列部分を生成させ、第1プライマーと第2プライマーとの組み合わせによる目的でない配列の増幅を低減させるものである。しかしこの方法は、第1プライマーとインターセプトプライマーによる増幅は阻害されないので、第1プライマーとインターセプトプライマーによる増幅産物がノイズとなり得る。

概要

簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供すること。複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はRNAまたはRNAと他の核酸とのキメラであり、かつ、10〜200塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法。なし

目的

本発明は、望ましくない増幅産物の生成を抑制する上記従来技術の問題点を改善し、簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

複数領域の核酸増幅同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はRNAまたはRNAと他の核酸とのキメラであり、かつ、10〜200塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法

請求項2

一本鎖核酸が10〜50塩基からなることを特徴とする請求項1に記載の核酸増幅抑制方法。

請求項3

一本鎖核酸が20〜30塩基からなることを特徴とする請求項2に記載の核酸増幅抑制方法。

請求項4

一本鎖核酸が一本鎖RNAである請求項1〜3のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。

請求項5

鋳型依存的核酸増幅反応が、鋳型核酸プライマーアニーリングさせプライマーの3’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖増幅する反応であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。

請求項6

鋳型依存的核酸増幅反応が、PCR法RT−PCR法、LAMP法ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法およびTMA法からなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする請求項5に記載の核酸増幅抑制方法。

請求項7

鋳型依存的核酸増幅反応がPCR法またはRT−PCR法であることを特徴とする請求項6に記載の核酸増幅抑制方法。

請求項8

鋳型依存的核酸増幅反応に用いるDNAポリメラーゼがα型DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項5〜7のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。

技術分野

0001

本発明は、核酸増幅の特異的抑制方法に関するものであり、詳細には、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法に関するものである。

背景技術

0002

PCR(Polymerase Chain Reaction)法は、特異的な一対のプライマーとDNA依存性DNAポリメラーゼを用いて特定のDNA配列増幅する技術であり、分子生物学分野の研究に不可欠な技術である。一般的なプライマー配列を含む複数の鋳型の増幅は、遺伝子ファミリーメンバークローニング臨床診断における微生物の検出に広く使われているが、このような鋳型の増幅にPCR法を利用する場合、目的領域以外の部位にプライマーがアニーリングすることに起因して、増幅させたい領域以外の領域が増幅される場合がある。このような望ましくない増幅産物が生成することにより、目的の増幅産物の検出が困難になり、また目的の増幅産物の生成が阻害される。それゆえ、望ましくない増幅産物の生成を抑制する技術の開発が求められてきた。

0003

望ましくない増幅産物の生成を抑制する従来技術として、例えば以下の技術が知られている。
(1)PCRによる増幅反応を特異的に阻害するために、長鎖(750塩基程度)のRNAを用いる方法が報告されている(非特許文献1)。この方法では、長鎖RNAをインビトロトランスクリプションで合成するため、コストと手間がかかる。また、長鎖RNA中の配列と一部相補的な鋳型DNAの増幅も阻害される可能性があることから、阻害の特異性が低下する可能性がある。

0004

(2)3’側の修飾によりプライマーとして機能しないオリゴデオキシヌクレオチド(以下「ODN」と記す)やLNA(locked nucleic acid)をPCRで増幅される領域内にアニーリングするようにデザインし、これらを反応系に加えて増幅を抑制する方法が報告されている(非特許文献2,3,4)。この方法を用いる場合は、ODNの3’側の修飾が除去されるとODNがプライマーとして働く可能性があるため、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を持つDNA依存性DNAポリメラーゼを使用することができないという問題がある。また、標的の増幅を抑制するために、反応系に高濃度のODNやLNAを添加する必要がある。

0005

(3)Alu配列等の繰り返し配列に一方のプライマー(第1プライマー)を設計し、特異的な配列領域に他方のプライマー(第2プライマー)を設計する必要がある場合には、第1プライマーがゲノムの他の領域にアニーリングすることによって第1プライマーのみによる非特異的な増幅産物が生成する結果、目的の増幅産物検出が困難になったり、目的の増幅産物の生成が阻害されたりする問題が生じる。このような場合に、第1プライマーと重複する配列を持つが、3’側が修飾されているためプライマーとして働かないODNを反応系に加え、繰り返し配列にプライマーがアニーリングすることを競合的に阻害する方法が開発されている(非特許文献5,6)。この方法を用いる場合は、第1プライマー同士からの増幅が効果的に阻害されるため、相対的に目的の領域の増幅が増加することになる。しかし、この方法では、(a)プライマーと阻害ODNの最適な量比を決めることが煩雑である、(b)目的領域の増幅も阻害されるため鋳型によっては目的領域の増幅ができなくなる場合があり得る、という問題がある。また、少なくとも第2プライマーは特異的なゲノム領域に設計する必要があり、もし設計した第2プライマーがアニーリング可能な領域がゲノム中に複数ある場合には、目的領域のみを増幅することは困難である。

0006

(4)目的の配列を増幅するが、目的でない配列も増幅し得る第1プライマーおよび第2プライマー以外に、目的でない配列にハイブリダイズするインターセプトプライマーを含有する反応系を用いて核酸増幅反応を行う方法が開発されている(特許文献1)。この方法では、第1プライマーとインターセプトプライマーによって、目的でない配列の一部を増幅することにより第2プライマー認識部位欠失した配列部分を生成させ、第1プライマーと第2プライマーとの組み合わせによる目的でない配列の増幅を低減させるものである。しかしこの方法は、第1プライマーとインターセプトプライマーによる増幅は阻害されないので、第1プライマーとインターセプトプライマーによる増幅産物がノイズとなり得る。

0007

国際公開第2007/074894号

先行技術

0008

Yuen PS, Brooks KM, Li Y. RNA: a method to specifically inhibitPCRamplification of known members of a multigene family by degenerate primers. Nucleic AcidsRes. (2001) 29: E31.
Seyama T, Ito T, Hayashi T, Mizuno T, Nakamura N, et al. A novel blocker-PCR method for detection of rare mutant alleles in the presence of an excess amount of normal DNA. Nucleic Acids Res. (1992) 20: 2493-2496.
Yu D, Mukai M, Liu QL, Steinman CR. Specific inhibition of PCR by non-extendable oligonucleotides using a 5' to 3' exonuclease-deficient DNA polymerase. Biotechniques (1997) 23: 714-720.
DominguezPL, Kolodney MS. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene (2005) 24: 6830-6834.
Puskas LG, Fartmann B, Bottka S Restricted PCR: amplification of an individual sequence flanked by a highly repetitive element from total human DNA. Nucleic Acids Res. (1994) 22: 3251-3252.
Puskas LG, Bottka S. Reduction of mispriming in amplification reactions with restricted PCR. Genome Res. (1995) 5: 309-311.

発明が解決しようとする課題

0009

本発明は、望ましくない増幅産物の生成を抑制する上記従来技術の問題点を改善し、簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供することを課題とする。

課題を解決するための手段

0010

本発明は、上記課題を解決するために、以下の各発明を包含する。
[1]複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法であって、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含み、該一本鎖核酸はRNAまたはRNAと他の核酸とのキメラであり、かつ、10〜200塩基からなることを特徴とする核酸増幅抑制方法。
[2]一本鎖核酸が10〜50塩基からなることを特徴とする前記[1]に記載の核酸増幅抑制方法。
[3]一本鎖核酸が20〜30塩基からなることを特徴とする前記[2]に記載の核酸増幅抑制方法。
[4]一本鎖核酸が一本鎖RNAである前記[1]〜[3]のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
[5]鋳型依存的核酸増幅反応が、鋳型核酸にプライマーをアニーリングさせプライマーの3’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖を増幅する反応であることを特徴とする前記[1]〜[4]のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。
[6]鋳型依存的核酸増幅反応が、PCR法、RT−PCR法、LAMP法ICAN法、NASBA法、LCR法、SDA法、TRC法およびTMA法からなる群より選択されるいずれかであることを特徴とする前記[5]に記載の核酸増幅抑制方法。
[7]鋳型依存的核酸増幅反応がPCR法またはRT−PCR法であることを特徴とする前記[6]に記載の核酸増幅抑制方法。
[8]鋳型依存的核酸増幅反応に用いるDNAポリメラーゼがα型DNAポリメラーゼであることを特徴とする前記[5]〜[7]のいずれかに記載の核酸増幅抑制方法。

発明の効果

0011

本発明により、簡便かつ低コストで実施できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げることなく標的領域の核酸増幅を特異的に抑制することが可能な核酸増幅の特異的抑制方法を提供することができる。

図面の簡単な説明

0012

ヒトゲノムDNAを鋳型としてIRF−1遺伝子座の標的領域(Target)および対照領域(Reference)を増幅するためのプライマーを設計し、オリゴリボヌクレオチド(ORN)を用いて標的領域のPCR増幅を特異的に抑制する実験スキームを示す図である。
図1の標的領域(Target)および対照領域(Reference)を、それぞれ図1に示したプライマーセットを用いて増幅し、得られたPCR産物アガロースゲル電気泳動で検出した結果を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−302FによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−298FによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−306FによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−310FによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
IRF−1遺伝子座の標的領域におけるオリゴリボヌクレオチド(ORN−666R、ORN−363R、ORN−181R)がハイブリダイズする位置を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−666RによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−363RによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
オリゴリボヌクレオチドORN−181RによるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
IRF−1遺伝子座の標的領域におけるオリゴリボヌクレオチド(ORN−302F、ORN−363R)がハイブリダイズする位置を示す図である。
方向が異なる2種類のORN(ORN−302FおよびORN−363R)の同時使用によるPCR増幅の特異的抑制を、リアルタイムPCRを用いて検討した結果を示す図である。
競合的状況におけるORNによるPCR増幅の特異的抑制実験のスキームを示す図である。
KODポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるORNによるPCR増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
Pfuポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるORNによるPCR増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
参考例1の競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制実験のスキームを示す図である。
参考例1の競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
参考例2の競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制実験のスキームを示す図である。
参考例2のTaqポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
参考例2のKODポリメラーゼを用いた場合の競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制実験の結果を示す図である。
本発明の核酸増幅抑制方法をマウス腸内細菌叢解析に応用した結果を示す図であり、左が優占種特異的なORNを添加していない場合の結果、右が優占種特異的なORNを添加した場合の結果である。

0013

本発明は、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応において、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制する方法を提供する。本発明の核酸増幅抑制方法は、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含む。

0014

鋳型依存的核酸増幅反応は、鋳型核酸に基づいて核酸合成酵素により相補鎖の合成を繰り返すことにより、目的領域の核酸鎖を増幅させるものであればよく、特に限定されない。鋳型核酸は、一本鎖でもよく二本鎖でもよい。また、鋳型核酸は、DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドのいずれでもよい。さらに、構成ヌクレオチド人工的な誘導体置換されているものや、天然のDNAまたはRNAが修飾されているものであっても、相補鎖合成の鋳型として機能する限り鋳型核酸に含まれる。鋳型核酸として、具体的には、例えばゲノムDNA、cDNA、合成DNA、全RNA、mRNArRNA、合成RNAなどが挙げられる。

0015

鋳型核酸はどのような由来の核酸でもよい。生体由来の核酸が好適であるが、生体に由来しない試料から得られる核酸を用いることも可能である。生体由来の核酸は、動物および植物の生体構成成分から好適に取得することができる。生体に由来しない試料から得られる核酸としては、例えば、細胞を含む食品材料、土、水、繊維、埃等から得られる核酸が挙げられる。

0016

本発明の核酸増幅抑制方法は、生きた生物内または生きた細胞内で行われる鋳型依存的核酸増幅反応(in vivo核酸増幅反応)を適用対象としない。すなわち、本発明の核酸増幅抑制方法は、生細胞内に存在する核酸を鋳型とする核酸増幅反応には適用されない。本発明の核酸増幅抑制方法を適用する鋳型依存的核酸増幅反応は、定法により細胞から抽出された核酸、または定法により作製された組織標本等の細胞中に存在する核酸を鋳型とする核酸増幅反応であることが好ましい。すなわち、本発明の核酸増幅抑制方法は、in vitro核酸増幅反応またはin situ核酸増幅反応に適用することが好ましい。

0017

鋳型依存的核酸増幅反応は、鋳型核酸にプライマーをアニーリングさせプライマーの3’末端から核酸を伸長させることにより核酸鎖を増幅する反応であることが好ましい。このような鋳型依存的核酸増幅反応としては、PCR法(Polymerase Chain Reaction:White,T.J. et al., TrendsGenet., 5, 185(1989))、RT−PCR法(Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction:James W. Larrick, Trends Biotechnol., 10, 146-152, 1992)、LAMP法(Loop-mediated isothermal Amplification:国際公開第WO00/28082号)、ICAN法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids:国際公開第02/16639号)、NASBA法(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification:特許第2650159号公報)、LCR法(Ligase Chain Reaction:Barany, F., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol.88, p.189-193, 1991)、SDA法(Strand Displacement Amplification:特公平7−114718号公報)、TRC法(Transcription-Reverse Transcription-Concerted method:Nakaguchi Y. et al., J. Clin. Microbiol., vol.42: p.4248-4292 (2004))、TMA法(Transcription-Mediated-Amplification:Sarrazin C. et al., J. Clin. Microbiol., vol.39: p.2850-2855(2001))などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の核酸増幅抑制方法は、いずれの鋳型依存的核酸増幅方法においても好適に適用することができるが、PCR法またはRT−PCR法に適用することが好ましい。

0018

鋳型依存的核酸増幅反応において用いるプライマーは、それぞれの核酸増幅方法に応じて好適なプライマーを用いることができる。それぞれの核酸増幅方法に好適なプライマーは、公知技術に基づいて設計することができ、公知の方法で製造することができる。また、鋳型依存的核酸増幅反応の反応条件は、それぞれの核酸増幅方法の原理に則った特異的な増幅産物が生成される限り特に限定されず、公知技術に基づいて適宜設定することができる。

0019

本発明の核酸増幅抑制方法は、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する鋳型依存的核酸増幅反応に適用される。鋳型依存的核酸増幅反応において、複数領域の核酸増幅が同一反応系で進行する場合としては、(A)目的領域を増幅するために設計したプライマーが鋳型核酸の別の部分にアニールすることにより、目的以外の領域が増幅される場合、(B)同一のプライマー(プライマーセット)により特異的に増幅される2種以上の鋳型核酸(競合的鋳型核酸)が存在する反応系で核酸増幅反応を行う場合等が挙げられる。したがって、本発明の核酸増幅抑制方法における標的領域は、上記(A)の目的以外の増幅領域、または上記(B)の目的の鋳型核酸以外の競合的鋳型核酸に基づく増幅領域であることが好ましい。いずれの場合においても、標的領域は一領域に限定されず、二領域以上であってもよい。

0020

標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を設計するために、標的領域の塩基配列情報が必要である。標的領域の塩基配列情報は、鋳型核酸の塩基配列および鋳型核酸中の標的領域の位置が明らかである場合は、これらの情報に基づいて取得することができる。標的領域の塩基配列情報が不明である場合は、核酸増幅反応により増幅された目的以外の増幅産物をアガロースゲル電気泳動等の公知の方法で単離し、これを公知のシークエンス解析法に供することにより標的領域の塩基配列情報を取得することができる。取得した標的領域の塩基配列情報に基づいて、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を設計することができる。鋳型核酸が二本鎖(例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖からなる二本鎖DNA)である場合、一本鎖核酸はどちらの鎖にハイブリダイズするものでもよい。

0021

一本鎖核酸は、標的領域の塩基配列と完全に相補的であることが望ましいが、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制できる限り、完全に相補的な配列でなくてもよい。標的領域とハイブリダイズできる限り、1〜数個(例えば、2、3、4個)のミスマッチがあってもよい。標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸には、標的配列の90%以上と相補的な配列、好ましくは95%以上と相補的な配列、より好ましくは98%以上と相補的な配列を有し、かつ標的領域の核酸増幅を特異的に抑制できる一本鎖核酸が含まれる。

0022

標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、RNAまたはRNAと他の核酸とのキメラであればよいが、一本鎖RNAであることが好ましい。他の核酸としてはDNA、修飾されたDNA、修飾されたRNAなどが挙げられる。一本鎖核酸がRNAと他の核酸とのキメラである場合、他の核酸は全塩基長の50%以下であることが好ましく、40%以下であることがより好ましく、30%以下であることがさらに好ましく、20%以下であることがさらに好ましく、10%以下であることがさらに好ましく、5%以下であることがさらに好ましい。

0023

標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸の長さ(塩基長)は特に限定されないが、10〜200塩基が好ましく、10〜150塩基がより好ましく、10〜120塩基がより好ましく、10〜100塩基がより好ましく、10〜90塩基がより好ましく、10〜80塩基がさらに好ましく、10〜70塩基がさらに好ましく、10〜60塩基がさらに好ましく、10〜50塩基がさらに好ましく、12〜45塩基がさらに好ましく、14〜40塩基がさらに好ましく、16〜35塩基がさらに好ましく、18〜32塩基がさらに好ましく、20〜30塩基がさらに好ましく、21〜28塩基がさらに好ましく、22〜26塩基がさらに好ましい。特に好ましくは25塩基である。

0024

標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、その5’末端および/または3’末端が修飾されていてもよい。例えば、5’末端および/または3’末端がリン酸化アミノ化ビオチン化チオール化コレステロール化、DIG(ジゴキシゲニン)化、クエンチャー修飾(BHQ−1、BHQ−3など)、蛍光修飾(DNP、Cy3、Cy5、TAMRA、6−FAMなど)などで修飾された一本鎖核酸を用いることができる。

0025

標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、標的領域とハイブリダイズできる限り、そのヌクレオチド(リボヌクレオチドデオキシリボヌクレオチド)が、糖、塩基および/またはリン酸塩化学修飾されたヌクレオチドであってもよい。塩基が修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、5位修飾ウリジンまたはシチジン(例えば、5−プロピニルウリジン、5−プロピニルシチジン、5−メチルシチジン、5−メチルウリジン、5−(2−アミノプロピルウリジン、5−ハロシチジン、5−ハロウリジン、5−メチルオキシウリジン等);8位修飾アデノシンまたはグアノシン(例えば、8−ブロモグノシン等);デアザヌクレオチド(例えば7−デアザ−アデノシン等);O−およびN−アルキル化ヌクレオチド(例えば、N6−メチルアデノシン等)等が挙げられる。また、糖が修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、リボヌクレオチドの2’−OHが、H、OR、R、ハロゲン原子、SH、SR、NH2、NHR、NR2、もしくはCN(ここで、Rは炭素数1−6のアルキル基アルケニル基またはアルキニル基を示す)等によって置換された2’位糖修飾、5’末端がモノリン酸化された5’末端リン酸化修飾が挙げられる。リン酸塩が修飾されたヌクレオチドとしては、隣接するリボヌクレオチドを結合するホスホエステル基を、ホスホチオエート基で置換したものが挙げられる。

0026

標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸は、公知の方法で人工的に化学合成することにより作製することができる。また、鋳型DNAからインビトロ転写法により作製することができる。

0027

鋳型依存的核酸増幅反応に用いる核酸合成酵素は特に限定されず、上記に例示したそれぞれの核酸増幅方法に好適なDNAポリメラーゼおよび/またはRNAポリメラーゼを適宜選択して用いることができる。鋳型依存的核酸増幅反応にDNAポリメラーゼを用いる場合、用いるDNAポリメラーゼは特に限定されず、上記に例示したそれぞれの核酸増幅方法に好適なDNAポリメラーゼを用いることができる。例えば、polI型、α型、非polI非α型DNAポリメラーゼまたは混合型DNAポリメラーゼ(すなわち複数のDNAポリメラーゼの混合物)などを挙げることができる。なかでもα型DNAポリメラーゼを用いることが好ましい。α型DNAポリメラーゼは3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼである。α型DNAポリメラーゼとしては、例えば、KODDNAポリメラーゼ(東洋紡)、PyrobestDNAポリメラーゼ(タカラバイオ)、PfuDNAポリメラーゼ(プロメガ)などが市販されており、これらを好適に用いることができる。α型DNAポリメラーゼを用いる鋳型依存的核酸増幅反応としては、PCRが好ましい。

0028

本発明の核酸増幅抑制方法は、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を反応系に添加する工程を含むものであればよい。通常、上記例示したそれぞれの核酸増幅方法に用いる反応液中に、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を添加すればよい。反応系に添加する一本鎖核酸の濃度は、標的領域の核酸増幅を抑制できる濃度であれば特に限定されない。適用する核酸増幅反応における具体的条件ごとに予備検討を行い、適宜設定することが好ましい。具体的には、例えば1μM以下が好ましく、500nM以下がより好ましく、200nM以下がさらに好ましく、100nM以下がさらに好ましく、90nM以下がさらに好ましく、80nM以下がさらに好ましく、70nM以下がさらに好ましく、60nM以下がさらに好ましく、50nM以下がさらに好ましい。下限は特に限定されないが、10nM以上が好ましく、20nM以上がより好ましく、30nM以上がさらに好ましく、40nM以上がさらに好ましい。

0029

核酸増幅反応の反応液は、目的の反応が進行する組成の反応液であれば特に限定されないが、通常、鋳型核酸、プライマー(プライマーセット)、核酸合成酵素(DNAポリメラーゼおよび/またはRNAポリメラーゼ)、核酸合成酵素の基質となるヌクレオチドが含まれる。これら以外に、反応液には緩衝剤塩類等が添加され、必要に応じて、酵素保護剤融解温度(Tm)の調整剤、界面活性剤等が添加される。緩衝剤としては、Tris−HCl等の中性から弱アルカリ性緩衝作用を持つものが用いられる。pHは使用するDNA合成酵素に応じて至適pH付近に調整される。塩類は、酵素の活性維持や核酸の融解温度(Tm)調整のために適宜添加され、具体的には、KCl、NaCl、MgCl2、MgSO4、(NH4)2SO4等が用いられる。酵素の保護剤としては、ウシ血清アルブミンや糖類が使用される。さらに、融解温度(Tm)の調整剤には、ジメチルスルホキシドDMSO)、ホルムアミドベタイン(N,N,N,-trimethylglycine)等が使用される。界面活性剤には、Tween20、TritonX等が使用される。

0030

標的領域の核酸増幅が特異的に抑制されていることは、例えば、核酸増幅反応後の反応液中の標的領域の増幅産物量によって確認することができる。核酸増幅反応後の反応液中の標的領域の増幅産物量は、例えば核酸増幅反応後の反応液をアガロースゲル電気泳動に供し、標的領域の増幅産物のバンドの濃さによって確認することができる。標的領域の増幅産物のバンドが検出されない、または反応系に一本鎖核酸を添加しない場合と比較して標的領域の増幅産物量が減少していれば、標的領域の核酸増幅が特異的に抑制されていると判定できる。したがって、本発明の核酸増幅抑制方法を実施する際には、標的領域にハイブリダイズする一本鎖核酸を添加した反応系以外に、対照として当該一本鎖核酸を添加しない反応系を同時に用いることが好ましい。

0031

本発明の核酸増幅抑制方法は、長鎖(750塩基程度)のRNAを用いる従来技術(非特許文献1参照)と比較して、顕著に短い一本鎖核酸を用いる点で非標的領域の核酸増幅を妨げる可能性を極めて低くできる点で非常有用である。また、一本鎖核酸の合成に要するコストと手間においても非常に軽減することが可能となる。また、本発明の核酸増幅抑制方法は、3’側を修飾したODNを用いる方法(非特許文献2,3,4参照)と比較して、非常に少量の一本鎖核酸で標的領域の核酸増幅を特異的に抑制できると共に、非標的領域の核酸増幅を妨げない点で、非常に有用である。

0032

本発明は、核酸増幅反応が使用される幅広い分野に応用することができる。特に、PCR法が利用される分野での応用は特に有望である。応用が期待できる分野と具体的な応用例としては、例えば、(1)臨床診断における病原体疾病マーカーの検出および定量、(2)畜産実験動物および変異動物の遺伝子型決定、(3)遺伝子ファミリーメンバーのクローニング、(4)腸内、皮膚、口腔粘膜等の細菌叢の解析などが挙げられる。

0033

本発明は、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制するためのキットを提供する。本発明のキットは、特定のプライマー(プライマーセット)を用いて鋳型核酸を増幅する際に増幅を抑制しようとする標的領域が明らかになっている場合に、上記本発明の核酸増幅抑制方法を簡便かつ短時間で実施することが可能となる。例えば、核酸増幅反応としてPCR法を用いる場合、特定のプライマーセット、標的領域の核酸増幅を特異的に抑制するための一本鎖核酸、耐熱性DNA合成酵素、デオキシヌクレオシド三リン酸混合液PCR反応緩衝液などを含むキットとして実施することができる。特定のプライマーセットおよび一本鎖核酸を目的に応じて適宜設計することにより、目的に応じたキットとして実施することができる。

0034

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

0035

〔ORNおよびプライマー〕
実施例で用いたORNおよびプライマーは、すべてグライナー(Greiner)社に委託して化学合成したものを使用した。用いたORNを表1に、用いたプライマーを表2に示した。

0036

0037

0038

〔実施例1:ORNによるPCR増幅の特異的抑制の検討〕
鋳型には、293T細胞(Mol. Cell Biol. 1987,7(1):379-87、ECACC株番号:12022001)から、定法に従い精製したゲノムDNAを用いた。ヒトIRF−1(interferon regulatory factor 1、NCBI ACCESSION: NG_011450)遺伝子座内の2つの隣接する領域(いずれも0.9kbp)が増幅されるようにプライマーを設計した。図1に示したように、プライマーセット1(hIRF1-913F/hIRF1-10R)はヒトIRF−1遺伝子のエクソン1の上流側の標的領域(図1中Target)を増幅するように設計され、プライマーセット2(hIRF1+269F/hIRF1+1167R)はヒトIRF−1遺伝子のエクソン1の下流側の対照領域(図1中Reference)を増幅するように設計されている。標的領域にハイブリダイズ可能な、長さが異なる4種類のORN(ORN-302F(21塩基)、ORN-298F(17塩基)、ORN-306F(25塩基)、ORN-310F(29塩基))を使用した(図1参照)。

0039

(1)PCR増幅の確認
最初にORNを用いずに、プライマーセット1またはプライマーセット2を用いて、標的領域および対照領域をそれぞれPCR増幅した。すなわち、10μL中に、40ngの293T細胞のゲノムDNA、1×Buffer、0.32mMのdNTPs、0.25μMの各プライマー(プライマーセット1またはプライマーセット2)、および0.2μLのKODFX(東洋紡)を含むPCR反応液を調製した。反応は最初に94℃2分間の変性を行った後、98℃10秒間の変性、68℃1分間のプライマーアニーリングおよび伸長を28サイクル行い、最後に68℃2分間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。

0040

結果を図2に示した。図2から明らかなように、いずれのプライマーセットを用いた場合も0.9kbpのバンドが検出された。両バンドの濃さは同等であり、2つの領域の増幅効率は同等であることが示された。

0041

(2)ORNによるPCR増幅の特異的抑制
最初に、21塩基のORN−302Fを用いて、リアルタイムPCRにより特異的抑制の検討を行った。ORN−302Fの濃度は0、1、3、10、20、30、40、60および100nMとした。10μL中に、40ngの293T細胞のゲノムDNA、0.2μMの各プライマー(プライマーセット1およびプライマーセット2)、いずれかの濃度のORN、1×ROXリファレンス色素(ROX reference dye)、および5μLのKODSYBR qPCRMIX(東洋紡)を含むリアルタイムPCR反応液を調製した。反応は最初に98℃2分間の変性を行った後、98℃10秒間の変性、60℃10秒間のプライマーアニーリングおよび68℃1分間の伸長を40サイクル行った。PCR産物の特異性は、95℃15秒、60℃15秒および99℃15秒の融解曲線分析(dissociation curve analysis)を行うことによって確認した。PCR増幅産物は7900HTFast Real−Time PCR System(Applied Biosystems)を用いて定量した。全てのサンプルはトリプリケートでリアルタイムPCRを行った。Prism software(GraphPad)を用いて用量反応曲線を作成し、IC50値を算出した。

0042

結果を図3に示した。図3から明らかなように、標的領域の増幅はORN−302F濃度の増加と共に抑制されたが、対照領域の増幅は抑制されなかった。この結果から、標的領域にハイブリダイズするORNを用いて、標的領域のPCR増幅を特異的に抑制できることが明らかになった。なお、ORN−302FのIC50値は14.86nMであった。

0043

(3)長さの異なるORNによるPCR増幅の特異的抑制
21塩基のORN−302Fに代えて、17塩基のORN−298F、25塩基のORN−306Fまたは29塩基のORN−310Fを用い、上記と同じ方法でリアルタイムPCRを行い、用量反応曲線を作成してIC50値を算出した。

0044

ORN−298Fの結果を図4に、ORN−306Fの結果を図5に、ORN−310Fの結果を図6にそれぞれ示した。図4、5および6から明らかなように、いずれのORNを用いても、標的領域の増幅はORN濃度の増加と共に抑制された。ORN−310Fの最高濃度(100nM)を用いた場合のみ、対照領域の増幅が抑制されたが、これ以外では、対照領域の増幅は抑制されなかった。各ORNのIC50値は、ORN−298Fが77.64nM、ORN−306Fが6.415nM、ORN−310Fが9.236nMであった。この結果から、17塩基〜29塩基の範囲のORNを用いれば、標的領域の増幅を特異的に抑制できることが示された。

0045

(4)位置の異なるORNによるPCR増幅の特異的抑制
標的領域の異なる位置にハイブリダイズする3種類のORN(ORN−666R、ORN−363R、ORN−181R、表2参照)をそれぞれ用いて、上記と同じ方法でリアルタイムPCRを行い、用量反応曲線を作成してIC50値を算出した。標的領域(Target)における各ORNの位置を図7に示した。

0046

ORN−666Rの結果を図8に、ORN−363Rの結果を図9に、ORN−181Rの結果を図10にそれぞれ示した。図8、9および10から明らかなように、いずれのORNを用いても、標的領域(Target)の増幅はORN濃度の増加と共に抑制され、対照領域(Reference)の増幅は抑制されなかった。各ORNのIC50値は、ORN−666Rが12.01nM、ORN−363Rが10.63nM、ORN−181Rが34.52nMであった。この結果から、標的領域におけるORNの位置は特に制限されないことが示された。したがって、ORNは標的領域内の任意の位置に設計でき、実験的に容易に最適のORNを見出すことができると考えられる。

0047

(5)複数のORNの同時使用によるPCR増幅の特異的抑制
方向が異なる2種類のORN(ORN−302FおよびORN−363R)を同時に使用して、上記と同じ方法でリアルタイムPCRを行い、用量反応曲線を作成してIC50値を算出した。標的領域(Target)における各ORNの位置を図11に示した。

0048

結果を図12に示した。図12から明らかなように、両方を同時に使用しても標的領域(Target)の増幅はORN濃度の増加と共に抑制され、対照領域(Reference)の増幅は抑制されなかった。両方を同時に使用したときのIC50値は8.580nMであった。この値は、この値は、ORN−302Fを単独で使用した場合のIC50値(14.86nM、図3参照)およびORN−363Rを単独で使用した場合のIC50値(10.63nM、図9参照)よりわずかに低いけれども、相乗的または相加的な効果は認められなかった。この結果は、PCR増幅の特異的抑制に用いるORNは一種類で十分であることを示唆するものである。

0049

〔実施例2:競合的状況におけるORNによるPCR増幅の特異的抑制の検討〕
(1)hIRF−1−p/pBSプラスミド構築
hIRF−1−p/pBSを構築するために、293T細胞のゲノムDNAを鋳型としてhIRF−1プロモーターの配列を、プライマーセット(hIRF1-913F_KpnI/hIRF1-10R_SacI)を用いてPCR増幅した。増幅産物を制限酵素KpnIおよびSacIを用いて切断し、同じく制限酵素KpnIおよびSacIを用いて切断したpBluescript−SK+(Stratagene)にライゲートした。

0050

(2)実験スキーム
実験スキームを図13に示した。pBluescript−SK+(以下「pBS」と記す)を標的鋳型とし、hIRF−1−p/pBSを対照鋳型とした。プライマーには、M13プライマーM4およびM13プライマーRVを用いた。標的鋳型(pBS)を用いた場合、M13プライマーM4およびM13プライマーRVにより、マルチクローニングサイト(MCS)を含む0.25kbpの標的領域(Target)が増幅される。対照鋳型(hIRF−1−p/pBS)を用いた場合、M13プライマーM4およびM13プライマーRVにより、hIRF−1プロモーター配列を含む1.05kbpの対照領域(Reference)が増幅される。ORNとして、pBSのMCSにハイブリダイズするORN−MCS(21塩基)を用いた。

0051

(3)KODポリメラーゼを用いた場合
10μL中に、1000pgの標的鋳型(pBS)および10pgの対照鋳型(hIRF−1−p/pBS)、1×Buffer、0.2mMのdNTPs、0.3μMのM13プライマーM4およびM13プライマーRV、いずれかの濃度のORN−MCS、1.5mMのMgSO4、0.2μLのKOD−Plus−Ver.2(東洋紡)を含むPCR反応液を用いた。反応は最初に94℃2分間の変性を行った後、98℃10秒間の変性、55℃30秒間のプライマーアニーリングおよび68℃1分間の伸長を30サイクル行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。

0052

結果を図14に示した。対照鋳型のみをM13プライマーM4およびM13プライマーRVで増幅すると、1.05kbpの増幅産物が得られた(レーン1)。標的鋳型と対照鋳型を100:1の比率で混合し、ORN−MCSの非存在下でPCRを行うと、標的鋳型が選択的に増幅され、対照鋳型由来の増幅産物はほとんど検出されなかった(レーン2)。ORN−MCSの濃度が1μMになると、標的鋳型由来の増幅産物が減少し、対照鋳型由来の増幅産物が増加した(レーン6)。この結果は、ORNによるPCR増幅の特異的抑制は、増幅が難しい少量の鋳型の選択的増幅に使用できることを示す。なお、ORN−MCSの濃度が3μM以上では、標的鋳型由来の増幅産物および対照鋳型由来の増幅産物のどちらもほとんど検出されなくなったが、この原因は不明である。

0053

(4)Pfuポリメラーゼを用いた場合
10μL中に、1000pgのpBSおよび10pgのhIRF−1−p/pBS、1×Buffer、0.2mMのdNTPs、5%DMSO、0.4μMのM13プライマーM4およびM13プライマーRV、いずれかのORN−MCS、0.1μLのPfu−X(Greiner)を含むPCR反応液を用いた。反応は最初に95℃2分間の変性を行った後、95℃20秒間の変性、55℃20秒間のプライマーアニーリングおよび68℃30秒間の伸長を25サイクル行い、最後に68℃30秒間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。

0054

結果を図15に示した。KODポリメラーゼと同様に、ORN−MCSの濃度が1μMになると、標的鋳型由来の増幅産物が減少し、対照鋳型由来の増幅産物が増加した(レーン6)。ORN−MCS濃度が3μMおよび10μMでは、標的鋳型由来の増幅はほとんど検出されず、対照鋳型由来の増幅産物が増加した。

0055

以上の結果から、KODポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼはORNによるPCR増幅の特異的抑制に用いるDNAポリメラーゼとして好適であることが示された。KODポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼは、α型DNAポリメラーゼに属し、3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を保持し、5’−3’エキソヌクレアーゼ活性は保持しないDNAポリメラーゼである。

0056

〔参考例1:競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制の検討1〕
図16に示したスキームで3’末端をリン酸化修飾したODN(方向が異なる2種類のODN、図16中ODN−FおよびODN−R)を用いて競合的状況におけるPCR増幅の特異的抑制を検討した。
(1)ODN−FおよびODN−R
ODN−FおよびODN−Rの塩基配列は以下のとおりであり、3’末端にリン酸基を付加して化学合成により作製した。
ODN-F: ATGGCTACCATAGCTCTTCCCTGG(配列番号17)
ODN-R: GGTGGACTGAATCTTGGGCCTGTA(配列番号18)
(2)mIL−2Rβ/pBSの構築
mIL−2Rβ/pBSを構築するために、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1806-1810, 1990に記載のあるmIL−2Rβ−10プラスミドからBamHIを用いてマウスIL−2RβcDNAを切り出し、同じくBamHIで切断したpBluescript−SK+(Stratagene)にライゲートした。
(3)hStat5/pBSの作り方
hStat5/pBSは、Immunity 2:321-329, 1995に記載されているものを利用した。
(4)PCR
PCRには、QIAGEN Long Range PCR Kitを用いた。50μL中に、10ngの標的鋳型(mIL−2Rβ/pBS)および1ngの対照鋳型(hStat5/pBS)、1×Buffer、0.5mMのdNTPs、0.4μMのM13プライマーM4およびM13プライマーRV、いずれかのODN、0.5μLのLong Range PCR enzyme Mix(QIAGEN)を含むPCR反応液を用いた。反応は最初に93℃3分間の変性を行った後、93℃15秒間の変性、62℃30秒間のプライマーアニーリングおよび68℃3分間の伸長を25サイクル行い、最後に68℃10分間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。

0057

結果を図17に示した。対照鋳型のみをM13プライマーM4およびM13プライマーRVで増幅すると、3.7kbpの増幅産物が得られた(レーン1)。標的鋳型と対照鋳型を10:1の比率で混合し、ODNの非存在下でPCRを行うと、対照鋳型由来の3.7kbpの増幅産物と標的鋳型由来の1.7kbpの増幅産物が、鋳型の比率と同様の比率で増幅された(レーン2)。ODN−FおよびODN−Rを8μM〜80μMの濃度で反応液に添加してPCRを行うと、標的鋳型由来の増幅産物量はODN濃度依存的に減少した(レーン3−8)。しかし、ODN−FおよびODN−Rでは抑制されないはずの対照鋳型の増幅が抑制され、対照鋳型由来の増幅産物が検出されなくなった(レーン3〜8)。この結果から、3’末端をリン酸化修飾したODNを用いる方法では、標的鋳型の増幅を抑制するために必要なODNの量がORNの1000倍以上必要であることが明らかになった。また、原因は不明であるが、本実験で用いたODNは、標的鋳型の特異的増幅抑制だけでなく、対照鋳型の非特異的増幅抑制をも生じさせた。

0058

〔参考例2:競合的状況におけるODNによるPCR増幅の特異的抑制の検討2〕
図18に示したスキームで3’末端をリン酸化修飾したODN(方向が異なる2種類のODN、図18中ODN−FおよびODN−R)を用いて競合的状況におけるPCR増幅の特異的抑制を検討した。

0059

(1)hIL−2Rα−0.3K+0.1K/pMD20の構築
hIL−2Rα−0.3K+0.1K/pMD20を構築するために、ヒトYT細胞のゲノムDNAを鋳型としてhIL−2Rαプロモーターの配列を、以下のプライマーセット(hIL2Ra-SalNot-F/hIL2Ra-SalNot-R)を用いてPCR増幅した。増幅産物をpMD20−Tにライゲートし、hIL−2Rα−0.3K+0.1K/pMD20とした。
hIL2Ra-SalNot-F:CTGTCGACGGGGAGGACTCAGCTTATGAAGTGCTG(配列番号19)
hIL2Ra-SalNot-R:CAGCGGCCGCCAGCCTCTTTTTGGCATCGCGCCGG(配列番号20)

0060

(2)hIL−2Rα−2.4K−0.3K/pMD20の構築
hIL−2Rα−2.4K−0.3K/pMD20を構築するために、ヒトYT細胞のゲノムDNAを鋳型としてhIL−2Rαプロモーターの配列を、以下のプライマーセット(hIL2Ra-XhoCla-F/hIL2Ra-XhoCla-R)を用いてPCR増幅した。増幅産物をpMD20−Tにライゲートし、hIL−2Rα−2.4K−0.3K/pMD20とした。
hIL2Ra-XhoCla-F:GACTCGAGGGAACTTAGAAGACAGGTGAGTAGGTG(配列番号21)
hIL2Ra-XhoCla-R:ATATCGATTCAGGGCTGTAACGTCCTCAGGAGTC(配列番号22)

0061

(3)Taqポリメラーゼを用いるPCR
以下に示す方向が異なる2種類のODN(ODN-F hIL-2Rα blockSおよびODN-R hIL-2Rα blockA)を用いた。これらのODNは、3’末端にリン酸基を付加して化学合成により作製した。
ODN-F hIL-2Rα blockS: GGGGAGGACTCAGCTTATGAAGTGCTGTTA(配列番号23)
ODN-R hIL-2Rα blockA: CAGCCTCTTTTTGGCATCGCGCCGGTAA(配列番号24)
25μL中に、1ngの標的鋳型(hIL−2Rα−0.3K+0.1K/pMD20)および10ngの対照鋳型(hIL−2Rα−2.4K−0.3K/pMD20)、1×Buffer、1.5mMのMgCl2、0.2mMのdNTPs、0.4μMのM13プライマーM4およびM13プライマーRV、いずれかのODN、0.125μLのrTaq(タカラバイオ)を含むPCR反応液を用いた。反応は最初に94℃2分間の変性を行った後、94℃20秒間の変性、60℃30秒間のプライマーアニーリングおよび72℃30秒間の伸長を25サイクル行い、最後に72℃10分間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。

0062

(4)KODポリメラーゼを用いるPCR
以下に示す方向が異なる2種類のODN(ODN-F hIL-2Rα blockS2 FおよびODN-R hIL-2Rα blockA2 R)を用いた。これらのODNは、3’末端にリン酸基を付加して化学合成により作製した。
ODN-F hIL-2Rα blockS2 F: GGATCAGCGGCCGCCAGCCTCTTTTTGGCATATA(配列番号25)
ODN-R hIL-2Rα blockA2 R: GATTCTGTCGACGGGGAGGACTCAGCTTAACC(配列番号26)
25μL中に、1ngの標的鋳型(hIL−2Rα−0.3K+0.1K/pMD20)および10ngの対照鋳型(hIL−2Rα−2.4K−0.3K/pMD20)、1×Buffer、1.5mMのMgCl2、0.2mMのdNTPs、0.2μMのM13プライマーM4およびM13プライマーRV、いずれかのODN、0.25μLのKOD Dash(東洋紡)を含むPCR反応液を用いた。反応は、94℃30秒間の変性、60℃2秒間のプライマーアニーリングおよび74℃30秒間の伸長を25サイクル行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行った。

0063

(5)Taqポリメラーゼを用いた結果
結果を図19に示した。標的領域の増幅はODN濃度の増加と共に抑制され、IC50値は約10μMであった。しかし、対照領域の増幅も抑制されてしまい、この条件では標的領域のPCR増幅を特異的に抑制することは難しいことが判明した。

0064

(6)KODポリメラーゼを用いた結果
結果を図20に示した。標的領域の増幅はODN濃度の増加と共に抑制され、IC50値は数百nM程度であった。しかし、対照領域の増幅も抑制されてしまい、この条件では標的領域のPCR増幅を特異的に抑制することは難しいことが判明した。

0065

〔実施例3:マウス腸内細菌叢解析への応用〕
16SrDNA配列の解析によりマウスの腸内細菌叢を調べる際に、優占種特異的なORNを反応系に添加してPCRを行い、希少細菌の検出を試みた。
(1)鋳型の調製
マウス(C57BL/6J系統、雌、10.4週齢SPF条件下での自家繁殖)を安楽死させた後、小腸(その内容物を含む)を摘出し、Proteinase KおよびPronase Eで処理した。得られたゲノムDNAをフェノールクロロホルム抽出エタノール沈殿により精製し、PCRの鋳型として用いた。

0066

(2)プライマーおよびORN
プライマーには、細菌類の16SrDNA増幅用ユニバーサルプライマーである10Fプライマー(5'-GTTTGATCCTGGCTCA-3' 配列番号27)および800Rプライマー(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3' 配列番号28)を用いた。
ORNには、菌種Aの16SrDNAにハイブリダイズするORN(5'-GAACAAGAGGGCAGAUUAUCCACGC-3' 配列番号29)を用いた。

0067

(3)解析方法
10μL中に、20ngのマウス小腸由来ゲノムDNA、1×Buffer、0.2mMのdNTPs、5%DMSO、0.4μMの各プライマー(10Fプライマーおよび800Rプライマー)、および0.1μLのPfu−X(Greiner)を含むPCR反応液を調製した。この反応液に50μMのORNを添加してPCRを行い、ORNを添加せずにPCRを行った場合と比較した。反応は最初に95℃2分間の変性を行った後、95℃20秒間の変性、55℃20秒間のプライマーアニーリングおよび68℃30秒間の伸長を30サイクル行い、最後に68℃30秒間の伸長を行った。定法に従い、アガロースゲル電気泳動で増幅産物の確認を行い、ゲルからDNAを精製し、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing(Invitrogen)を用いてクローニングを行った。次いで、クローン化されたインサートの塩基配列をサンガー法により決定し、菌種を同定した。

0068

結果を図21に示した。左がORNを添加しない場合の結果、右がORNを添加した場合の結果である。図21から明らかなように、ORNの添加により菌種Aの割合が21%から11%に減少すると共に、ORN非添加時には検出されなかった13種類の菌が新たに検出された。この結果から、本発明の核酸増幅抑制方法は、腸内細菌叢のより詳細な解析に有用であることが示された。

実施例

0069

なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

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