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技術 種子生産性が向上したイネの品種とその製造方法

出願人 ユニバーシティ-インダストリーコーオペレイショングループオブキョンヒユニバーシティ
発明者 アンジンフンヤンジョンイル
出願日 2015年8月13日 (5年3ヶ月経過) 出願番号 2015-159911
公開日 2016年3月31日 (4年7ヶ月経過) 公開番号 2016-041061
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理 植物の育種及び培養による繁殖
主要キーワード 横断切断 食糧問題 破砕処理物 気候変動 比較観察 人口増加 バーニア 先取り
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2016年3月31日)のものです。
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図面 (11)

課題

イネの種子の生産量を増大させる方法を提供する。

解決手段

本発明は、イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含むイネの種子の生産量を増大させる方法、LOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制されたイネの種子の生産方法および該方法で製造され、種子の生産量が増大したイネの種子に関する。本発明で提供するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制させて種子の生産量を増大させる方法を用いると、外来遺伝子を導入せずして、イネの種子の生産量を増大させることができるため、外来遺伝子の導入による危険性を排除することができ、より安全なイネの種子の大量生産に広く活用されるであろう。

概要

背景

イネ(Oryza sativa)は、大麦トウモロコシと共に、世界で最も重要な食用作物の一つである。イネは、人口増加工業化による農地不足気候変動などにより、その需要が増加しており、これにより、種々の品種の開発が進められている。最近は、伝統的な育種法ではなく、有用遺伝子の導入方法を用いた品種の開発が行われているが、これらの有用遺伝子の発掘と、これを用いた新品種の開発は、食糧問題を解決するだけでなく、食料産業の全般に影響を及ぼしていると考えられている。

イネは、種子の生産が目的である世界で最も重要な作物の一つであり、ここ数年、遺伝子全体の配列が明らかになることにより、有用遺伝子を大量に確保し、前記有用遺伝子を活用する技術を先取りするための研究が活発に進められている。特に、イネの粒数の増加、イネの身長増大、イネの開花始期の調節などの特徴を調節するのに関与する遺伝子を活用すれば、最終的にはイネの生産量の増大という目的を達成することができると予想されており、これと関連した研究が盛んに行われている。例えば、特許文献1には、酢酸菌体破砕処理物を含む作物成長促進剤並びに該促進剤を施用して作物の生育を促進し、収量を増進させる方法が開示されており、特許文献2には、特定の遺伝子をイネに導入し着粒数が増加した形質転換イネを製造する方法および前記方法で製造され、着粒数が増加した形質転換イネが開示されており、特許文献3には、LOC_Os02g05840遺伝子をイネに導入して種子の収量が向上した形質転換イネを製造する方法および前記方法で製造され、種子の収量が向上した形質転換イネが開示されている。しかし、これまで明らかになったイネの遺伝子のうち、その機能が明確になっているのは、非常に少数であり、通常の生物機能の観点からすると、イネの生産量の増大に関与する遺伝子が多数あると予想されているため、継続的な研究によってイネの生産量の増大に関与する遺伝子が究明されることが期待されているが、まだイネの生産量の増大に関与することが究明された遺伝子は、少数に過ぎないのが現状である。

このような背景の下、本発明者らはイネの生産量の増大に関与する遺伝子を究明するために鋭意努力し研究を重ねた結果、LOC_Os08g12430遺伝子がイネの粒数、身長の長さ、開花始期の調節に関与する遺伝子であることを究明し、前記遺伝子の発現を抑制させると、イネの生産量を増大させ得ることを確認することによって、本発明を完成した。

概要

イネの種子の生産量を増大させる方法を提供する。本発明は、イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含むイネの種子の生産量を増大させる方法、LOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制されたイネの種子の生産方法および該方法で製造され、種子の生産量が増大したイネの種子に関する。本発明で提供するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制させて種子の生産量を増大させる方法を用いると、外来遺伝子を導入せずして、イネの種子の生産量を増大させることができるため、外来遺伝子の導入による危険性を排除することができ、より安全なイネの種子の大量生産に広く活用されるであろう。a

目的

本発明の一目的は、LOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制し、イネの種子の生産量を増大させる方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含む、イネの種子の生産量を増大させる方法。

請求項2

前記LOC_Os08g12430遺伝子が、配列番号1の塩基配列を含むものである、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記LOC_Os08g12430遺伝子の発現抑制が、DNAレベルまたはmRNAレベルで行われる、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記DNAレベルにおいて、LOC_Os08g12430遺伝子の発現抑制が、イネのゲノムDNAに内在的に存在するLOC_Os08g12430遺伝子を構成する1つまたはそれ以上のヌクレオチドを別のヌクレオチドに置換するか、または欠失させる方法、前記LOC_Os08g12430遺伝子を構成するポリヌクレオチドに別のポリヌクレオチドを挿入させる方法、LOC_Os08g12430遺伝子を構成する1つまたはそれ以上のヌクレオチドを移動(frameshift)させる方法、およびそれらの組み合わせで構成された群から選択される方法によって行われるものである、請求項3に記載の方法。

請求項5

前記RNAレベルにおいて、LOC_Os08g12430遺伝子の発現抑制が、LOC_Os08g12430遺伝子の転写を抑制する方法、siRNAまたはshRNAを用いてLOC_Os08g12430遺伝子から転写されたmRNAを不活性化させる方法、およびそれらの組み合わせで構成された群から選択される方法によって行われるものである、請求項3に記載の方法。

請求項6

前記LOC_Os08g12430遺伝子の発現抑制が、イネのゲノムDNAに存在する野生型LOC_Os08g12430遺伝子を、配列番号5の塩基配列で構成される、変異したLOC_Os08g12430遺伝子に置換して行われるものである、請求項1に記載の方法。

請求項7

前記置換が、アグロバクテリウム属微生物を用いて、変異したLOC_Os08g12430遺伝子をイネのカルスに導入して行われるものである、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記アグロバクテリウム属微生物が、アグロバクテリウムツメファシエンスLB4404(AgrobacteriumtumefaciensLB4404)菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101(AgrobacteriumtumefaciensEHA101)菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105(AgrobacteriumtumefaciensEHA105)菌株、およびこれらの組み合わせで構成された群から選択される菌株である請求項7に記載の方法。

請求項9

イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含む、種子生産量が増大したイネの種子の生産方法

請求項10

請求項9に記載の方法により製造され、LOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制されて、種子生産量が増大したイネの種子。

技術分野

0001

本発明は、種子生産性が向上したイネ品種およびその製造方法に関し、より具体的には、イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含む、イネの種子の生産量を増大させる方法、LOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制されたイネの種子の生産方法および該方法で製造されて種子生産量が増大したイネの種子に関する。

背景技術

0002

イネ(Oryza sativa)は、大麦トウモロコシと共に、世界で最も重要な食用作物の一つである。イネは、人口増加工業化による農地不足気候変動などにより、その需要が増加しており、これにより、種々の品種の開発が進められている。最近は、伝統的な育種法ではなく、有用遺伝子の導入方法を用いた品種の開発が行われているが、これらの有用遺伝子の発掘と、これを用いた新品種の開発は、食糧問題を解決するだけでなく、食料産業の全般に影響を及ぼしていると考えられている。

0003

イネは、種子の生産が目的である世界で最も重要な作物の一つであり、ここ数年、遺伝子全体の配列が明らかになることにより、有用遺伝子を大量に確保し、前記有用遺伝子を活用する技術を先取りするための研究が活発に進められている。特に、イネの粒数の増加、イネの身長増大、イネの開花始期の調節などの特徴を調節するのに関与する遺伝子を活用すれば、最終的にはイネの生産量の増大という目的を達成することができると予想されており、これと関連した研究が盛んに行われている。例えば、特許文献1には、酢酸菌体破砕処理物を含む作物成長促進剤並びに該促進剤を施用して作物の生育を促進し、収量を増進させる方法が開示されており、特許文献2には、特定の遺伝子をイネに導入し着粒数が増加した形質転換イネを製造する方法および前記方法で製造され、着粒数が増加した形質転換イネが開示されており、特許文献3には、LOC_Os02g05840遺伝子をイネに導入して種子の収量が向上した形質転換イネを製造する方法および前記方法で製造され、種子の収量が向上した形質転換イネが開示されている。しかし、これまで明らかになったイネの遺伝子のうち、その機能が明確になっているのは、非常に少数であり、通常の生物機能の観点からすると、イネの生産量の増大に関与する遺伝子が多数あると予想されているため、継続的な研究によってイネの生産量の増大に関与する遺伝子が究明されることが期待されているが、まだイネの生産量の増大に関与することが究明された遺伝子は、少数に過ぎないのが現状である。

0004

このような背景の下、本発明者らはイネの生産量の増大に関与する遺伝子を究明するために鋭意努力し研究を重ねた結果、LOC_Os08g12430遺伝子がイネの粒数、身長の長さ、開花始期の調節に関与する遺伝子であることを究明し、前記遺伝子の発現を抑制させると、イネの生産量を増大させ得ることを確認することによって、本発明を完成した。

先行技術

0005

特開2006−248898号公報
特許第4462566号公報
韓国公開特許第2014−0050122号公報

発明が解決しようとする課題

0006

本発明の一目的は、LOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制し、イネの種子の生産量を増大させる方法を提供することである。
本発明の他の目的は、LOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制されたイネの種子の生産方法を提供することである。

0007

発明のさらに他の目的は、前記方法により製造され、種子の生産量が増大したイネの種子を提供することである。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、イネの生産量の増大に関与する遺伝子を究明するために、イネのゲノムDNAにT−DNAを挿入させてランダム突然変異を作製し、その中から開花始期が遅くなる品種を選抜した。前記選抜された品種のゲノムDNAを分析した結果、LOC_Os08g12430遺伝子にT−DNAが挿入され、前記LOC_Os08g12430遺伝子が不活性化した品種であることを確認し、この表現型を分析した結果、野生型品種と比較して開花始期が遅く、身長の長さが増加し、細胞のサイズが減少し、の太さが増加し、の数および長さが増加し、種子の収穫量が増大することを確認した。

0009

したがって、イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子を不活性化させてイネの生産量を増大させ得ることが分かった。
上述した目的を達成するための一実施態様として、本発明は、イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含む、イネの種子の生産量を増大させる方法を提供する。

0010

本発明の用語「LOC_Os08g12430遺伝子」とは、イネの8番染色体に存在する遺伝子を意味するが、その全体のサイズは9252bpであり、コード領域(LOC_Os08g12430.1)のサイズは1893bpであり、3つのエクソンと2つのイントロンで構成され、631個のアミノ酸を含むタンパク質を発現させることができる。前記発現したタンパク質は、植物ホメオドメイン(Plant Homeo domain、PHD finger domain)、フィブロネクチンIII型ドメイン(fibronectin Type III domain、FNIII)およびVIN3反応ドメイン(VIN3 interacting domain、VID)で構成される。前記LOC_Os08g12430遺伝子の塩基配列は知られており、機能はこれまで知られていなかったが、本発明者らは、前記LOC_Os08g12430遺伝子がイネの開花始期の調節、身長の調節および茎の太さの調節を通じて、生産量の増大と関連していることを最初に解明した。

0011

本発明において、前記LOC_Os08g12430遺伝子の塩基配列は、特にそれに限定されるものではないが、好ましくは、配列番号1の塩基配列を有することができる。
前記LOC_Os08g12430遺伝子の発現抑制は、イネのゲノムDNAに内在的に存在するLOC_Os08g12430遺伝子をDNAレベルmRNAレベルおよびタンパク質レベルで不活性化させて行うことができるが、イネの種子という特性上、前記LOC_Os08g12430遺伝子の発現抑制は、DNAレベルおよびmRNAレベルで不活性化させて行うことが望ましい。例えば、DNAレベルで不活性化させる方法としては、通常の突然変異誘発方法を用いることができるが、イネのゲノムDNAに内在的に存在するLOC_Os08g12430遺伝子を構成する1つまたはそれ以上のヌクレオチドを他のヌクレオチドに置換または欠失させるか、または、前記LOC_Os08g12430遺伝子を構成するポリヌクレオチドに他のポリヌクレオチドを挿入させるか、またはLOC_Os08g12430遺伝子を構成する1つまたはそれ以上のヌクレオチドを移動(フレームシフト)させて、正常なLOC_Os08g12430遺伝子が発現しないようにする方法を用いることができる。また、RNAレベルで不活性化させる方法としては、LOC_Os08g12430遺伝子の転写を抑制したり、siRNAまたはshRNAを用いてLOC_Os08g12430遺伝子から転写されたmRNAを不活性化させて、mRNAが正常なタンパク質に翻訳されることを抑制する方法を用いることができる。上述したLOC_Os08g12430遺伝子をDNAレベルおよびmRNAレベルで不活性化させる具体的な方法は、当業界で通常に用いられる突然変異の方法を制限なく使用することができる。例えば、組換えベクターを用いた相同組換え法、単一交叉組換え方法、T−DNAの挿入方法などを用いることができる。

0012

本発明では、T−DNA挿入方法を用いて前記LOC_Os08g12430遺伝子のエクソンにT−DNAが挿入された遺伝子(配列番号5)を生成することにより、LOC_Os08g12430遺伝子をDNAレベルで不活性化させ、前記LOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制させた。

0013

上述した目的を達成するための他の実施態様として、本発明は、イネのゲノムDNAに存在するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制する工程を含む種子の生産量が増大したイネの種子の生産方法を提供する。

0014

本発明で提供するLOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制され、種子の生産量が増大したイネの種子の生産方法の具体的な例として、(a)野生型LOC_Os08g12430遺伝子にT−DNAが挿入され、配列番号5の塩基配列で構成される変異したLOC_Os08g12430遺伝子を合成し、前記変異LOC_Os08g12430遺伝子を含む組換えベクターを得る工程、(b)前記得られた組換えベクターをアグロバクテリウム属微生物に導入して形質転換体を得る工程、(c)前記得られた形質転換体をイネのカルス接種し、前記変異したLOC_Os08g12430遺伝子がイネのゲノムDNAに導入された形質転換カルスを得る工程、(d)前記得られた形質転換カルスを再分化させ、再分化した植物体を得る工程、および、(e)前記得られた再分した化植物体を栽培し、それより種子を収穫する工程を含む方法を用いることができる。

0015

前記(a)工程において、前記変異したLOC_Os08g12430遺伝子は、通常の突然変異によりLOC_Os08g12430遺伝子の機能が不活性化された遺伝子を意味する。通常、機能が不活性化された遺伝子とは、種々の原因により、機能が正常に示されない遺伝子を意味するが、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、前記遺伝子の発現が抑制され、前記の遺伝子から合成され得る該当のタンパク質が生産されないか、または生産レベルが顕著に減少する現象や異常なタンパク質が発現される現象を誘発する原因となる変異遺伝子であってもよい。

0016

本発明において、前記変異したLOC_Os08g12430遺伝子は、LOC_Os08g12430遺伝子を構成する塩基配列の一部または全体が他の塩基配列に置換されるか、LOC_Os08g12430遺伝子を構成する塩基配列の一部または全体が欠失するか、又はLOC_Os08g12430遺伝子を構成する塩基配列に他の塩基配列が導入された遺伝子などであってもよい。例えば、本発明では、前記変異したLOC_Os08g12430遺伝子として、LOC_Os08g12430遺伝子のエクソン部位にT−DNAが挿入された配列番号5の塩基配列を有するポリヌクレオチドを使用した。

0017

また、前記組換えベクターは、前記変異したLOC_Os08g12430遺伝子を含むベクターであってもよいが、これに使用されるベクターは、特にそれに限定されないが、好ましくは、アグロバクテリウム属微生物と植物細胞内で元来の機能を維持するシャトルベクターになり得、より好ましくはアグロバクテリウム属微生物を通じてイネの種子に導入された後、相同組換えなどの方法により、イネのゲノムDNAで、前記変異したLOC_OsO8g12430遺伝子を挿入させる機能を有するシャトルベクターになり得、最も好ましくはpGA3426ベクターであってもよい。

0018

前記組換えベクターは、変異したLOC_Os08g12430遺伝子を発現させるプロモーターを含むことができるが、前記プロモーターは、植物細胞においてその機能を発揮できる限り、特にそれに限定されないが、好ましくは、過発現のためのプロモーター、前記発現のためのプロモーター、ストレス条件下で発現される誘導性プロモーター目的遺伝子植物生育期間中の一定時期に発現されるようにするプロモーター、植物組織の特異な部分のみに発現させるプロモーターおよび目的遺伝子の発現を高めるために、「エンハンサー配列(enhancer sequences)」が結合されたハイブリッド(hybrid)プロモーターなどを用いることができる。

0019

併せて、前記組換えベクターに含まれているLOC_Os08g12430遺伝子は、前記ベクターの多クローン部位にそのまま挿入することもでき、リンカー塩基配列と共に多クローン部位に挿入することもできるが、前記リンカー塩基配列は、当業界で通常に使用される配列であってもよい。

0020

前記工程(b)において、前記アグロバクテリウム属微生物は、前記得られた組換えベクターを植物細胞内に導入し、最終的には、前記変異したLOC_Os08g12430遺伝子でイネのゲノムDNAに存在する野生型LOC_Os08g12430遺伝子を置換させる役割をする。この時、用いられるアグロバクテリウム属微生物は、組換えベクターを植物細胞内に導入することができる限り、特にそれに限定されないが、好ましくは、病原性が除去された(disarmed)TiまたはRiプラスミドを含むアグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)を使用することができ、より好ましくはオクトピン型(octopine−type)またはスクシナピン型(succinamopine−type)アグロバクテリウム・ツメファシエンスを使用することができ、最も好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスLBA4404菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA101菌株、アグロバクテリウム・ツメファシエンスEHA105菌株などを単独、または組み合わせて使用することができる。

0021

前記工程(c)において、前記カルスは、実験室的環境でイネの全部または一部を培養して生成される培養生成物であり、前記カルスを生成するのに用いられる部位は、イネの茎、根、葉などが制限なく使用することができる。また、前記カルスの培養は、当業界に公知となった方法を用いて行うことができる。

0022

また、カルスの形質転換も当業界に公知となった方法を用いて行うことができる。例えば、前記形質転換体をカルスに加え、常温および暗条件で培養し、形質転換体に導入された組換えベクターをカルス細胞内に導入し、前記組換えベクターが導入されたカルスを光条件で培養することにより、組換えベクターに導入された変異したLOC_Os08g12430遺伝子を相同組換えによりカルス細胞のゲノムDNAに存在する野生型LOC_Os08g12430遺伝子に置換して挿入し、変異したLOC_Os08g12430遺伝子が導入した形質転換カルスを得る方法を用いることができる。

0023

前記形質転換カルスを選別する方法は、当業界に公知となった植物形転換マーカーであるネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(neomycin phosphotransferase、NPT II)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hygromycin phosphotransferase、HPT)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(chloramphenicol acetyltransferase)、ゲンタマイシン(gentamicin、CAT)、ハイグロマイシンなどの抗生剤耐性遺伝子;bar遺伝子などの除草剤抵抗性遺伝子;GUS、緑色蛍光タンパク質(green fluorescent protein、GFP)、ルシフェラーゼ(luciferase、LUX)などの標識遺伝子などを用いてもよい。

0024

前記工程(d)において、前記カルスの再分化は、当業界において公知となった方法を用いて行うことができる。例えば、前記形質転換カルスをMSR固体培地に接種し、常温で光条件で培養してカルスの再分化を誘導する方法を使用することができる。

0025

上述した目的を達成するためのさらに他の実施態様として、本発明は、前記方法で製造され、種子の生産量が増大したイネの種子を提供する。
本発明において提供するイネの種子は、LOC_Os08g12430遺伝子の発現が抑制された種子であって、イネの種子の生産に直接影響を及ぼす穂の数と長さだけでなく、身長の長さや茎の太さを増大させ、全体的にイネの種子の生産量を約20%増大させることができる。

0026

本発明の一実施例によれば、T−DNAの突然変異集団から開花始期を基準にスクリーニングし、開花始期が最も遅れた3A−00136系統のイネを選抜し(実施例1)、その遺伝型を分析した結果、LOC_Os08g12430遺伝子にT−DNAが挿入され、LOC_Os08g12430遺伝子が正常に発現されない品種であることが分かった(図2a〜2c)。併せて、前記3A−00136系統のイネの表現型を対照群のものと比較した結果、対照群に比べて身長が約15%増加し(図3a)、対照群に比べて細胞のサイズが約32%減少し(図3b)、対照群に比べて茎の太さが約34%増加することを確認した(図3c)。また、種子の生産量を比較した結果、前記3A−00136系統のイネは、対照群に比べて種子収穫量が約20%増加することを確認した(図4b)。

発明の効果

0027

本発明において提供するLOC_Os08g12430遺伝子の発現を抑制して、種子の生産量を増大させる方法を用いると、外来遺伝子を導入しなくても、イネの種子の生産量を増大させるため、外来遺伝子の導入に伴う危険性を排除することができ、より安全なイネの種子の大量生産に広く活用されるであろう。

図面の簡単な説明

0028

変異した3A−00136系統のイネ(HO)の開花表現型(A)と光周期の条件に応じた開花始期(B)を対照群(ドンジン品種のイネ、WT)と比較した写真およびグラフである。
LOC_Os08g12430遺伝子にT−DNAが挿入された位置を示す概略図であり、1はLOC_Os08g12430遺伝子のエクソン(配列番号5の塩基配列において6360〜7030番に相当)を示し、2はLOC_Os08g12430遺伝子のエクソン(配列番号5の塩基配列において7365〜7694番に相当)を示し、3はLOC_Os08g12430遺伝子のエクソン(配列番号5の塩基配列において7863〜8461番に相当)を示し、T−DNA挿入位置(3A−00136)は、配列番号5の塩基配列の6468番である。
3A−00136系統のイネに存在する変異したLOC_Os08g12430遺伝子をPCR増幅した結果を示す写真であり、左側は変異したLOC_Os08g12430遺伝子を増幅して得られた産物を示し、右側は変異したLOC_Os08g12430遺伝子に挿入されたT−DNAのRB上のNGUS1を増幅して得られた産物を示す。
野生型イネの種子と3A−00136系統のイネの種子において正常なLOC_Os08g12430遺伝子の発現の有無を確認した結果を示す電気泳動写真であり、左側は野生型イネの種子(WT)を示し、右側は3A−00136系統のイネの種子(HO)を示す。
対照群と3A−00136系統のイネの平均身長を比較した結果を示すグラフであり、(■)は対照群を示し、(□)は3A−00136系統のイネを示す。
対照群と3A−00136系統のイネの節間組織に含まれている細胞を示す顕微鏡写真であり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。
対照群と3A−00136系統のイネの平均茎の太さを比較した結果を示すグラフであり、(■)は対照群を示し、(□)は3A−00136系統のイネを示す。
対照群と3A−00136系統のイネの節間組織に含まれている茎の断面を示す顕微鏡写真であり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。
3A−00136系統のイネから生成された穂を対照群のものと比較観察した結果を示す写真であり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。
3A−00136系統のイネから収穫された種子の数を対照群のものと比較した結果を示すグラフであり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。

実施例

0029

以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。

0030

実施例1:変異したイネの品種の選抜および特性の解析
イネの収量を増大させて、生産量を向上させるのに影響を与える形質である穂、茎、開花始期を調節する遺伝子を見出すために、アグロバクテリウム(Agrobacterium)を用いた形質転換法により作出された10万系統のイネ突然変異集団において粒数、身長の長さ、開花始期に変化がある突然変異体を観察した。それぞれの突然変異植物体は、アグロバクテリウムによりT−DNAがイネのゲノムDNAに挿入され、挿入された区域の遺伝子が機能し得ない植物体である。T−DNA挿入位置は、ゲノムDNAPCRと塩基配列分析によって確認することができ、データベースにおいて遺伝子のlocus idを検索することにより、T−DNAが挿入された遺伝子を検索することができる。前記方法を用いて、10万系統のT−DNAの突然変異集団の植物体の表現型を観察し、このうち開花始期が遅くなる3A−00136系統のイネを選抜した。前記選抜されたイネを12時間の光周期/12時間の暗周期短日条件、SD)、14時間の光周期/10時間の暗周期(長日条件、LD)と水田条件(paddy)で生育し、対照群と開花始期を比較した(図1)。この時、対照群としては、変異していないドンジン品種のイネを使用した。

0031

図1は、変異した3A−00136系統のイネ(HO)の開花表現型(a)および光周期の条件に応じた開花始期(b)を対照群(ドンジン品種のイネ、WT)と比較した写真およびグラフである。図1で見られるように、3A−00136系統のイネは、対照群と比較し、開花の表現型の茎の長さが比較的長く、すべての光周期の条件で開花始期が対照群より遅れることを確認した。

0032

実施例2:変異したイネ品種の遺伝子型の分析
実施例2−1:ゲノムDNAの分析
前記実施例1で選抜した3A−00136系統のイネの種子をMSO培地に接種し、28℃で10日間培養した。培養された固体から葉100mgを採取し、前記採取した葉を液体窒素に浸漬して凍結させた後、これを物理的に粉砕して粉砕物を得た。得られた前記粉砕物に緩衝液(1M Tris5ml、0.5MEDTA1ml、KCl 3.73gおよび水50ml、pH9.5)を加え、懸濁させた後、それからイネのゲノムDNAを抽出した。前記抽出されたイネのゲノムDNAを鋳型とし、LOC_Os08g12430遺伝子の最初のエクソンにT−DNAが挿入された系統でT−DNA挿入位置の前後で作られたプライマー(配列番号2および配列番号3)とT−DNAの右境界配列(right border、RB)上のNGUS1を認識することができるNGUS1プライマー(配列番号4)を用いたPCRを行い、前記イネに存在するT−DNAが挿入されたDNA断片を得た(図2b)。この時、PCR反応は、95℃で5分;95℃で30秒、53℃で30秒および72℃で1分10秒を1サイクルとして38回反復;72℃で7分の条件で行った。
3A−00136 F:5’−tacgcatctccagagttcaa−3’(配列番号2)
3A−00136 R:5’−TTTTACTCTGTCGTGCAG−3’(配列番号3)
NGUS1:5’−AACGCTGATCAATTCCACAG−3’(配列番号4)
図2bは、3A−00136系統のイネに存在する変異したLOC_Os08g12430遺伝子をPCR増幅した結果を示す写真であり、左側は変異したLOC_Os08g12430遺伝子を増幅して得た産物を示し、右側は変異したLOC_Os08g12430遺伝子に挿入されたT−DNAのRB上のNGUS1を増幅して得た産物を示す。図2bに示されるように、3A−00136系統のイネのゲノムDNAから変異したLOC_Os08g12430遺伝子とT−DNAが検出されることを確認した。

0033

したがって、前記の3A−00136系統のイネに含まれているゲノムDNAには、変異したLOC_Os08g12430遺伝子とT−DNAが含まれていることが分かった。

0034

実施例2−2:mRNA分析
前記実施例2−1で得られた3A−00136系統のイネの種子の粉砕物にRNA抽出用緩衝液(RNA iso buffer、takara、http://www.takara−bio.com)を加え、これから総RNAを得た。前記得られた総RNA2μgとマウス白血病ウイルス逆転写酵素(Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase/Promega、Madison、WI、USA)を用いた逆転写PCRを行い、それぞれのcDNAを得た。前記得られたcDNAを鋳型とし、LOC_Os08g12430遺伝子を増幅し得るプライマー(配列番号6および7)を用いたPCRを行い、前記3A−00136系統のイネからLOC_Os08g12430遺伝子が正常に発現されるかどうかを確認した(図2c)。この時、対照群の試料としては、変異していないドンジン品種のイネの種子を使用し、内部の対照群としては、イネのユビキチン遺伝子を増幅させるプライマー(配列番号8および9)を用いてPCRを行った結果を使用した。
LOC_Os08g12430 F:5’−TGTTTGGTGTGGGAAGATGA−3’(配列番号6)
LOC_Os08g12430 R:5’−GCTGGATAGTTGGCCATGTT−3’(配列番号7)
ubi F:5’−AACCAGCTGAGGCCCAAGA−3’(配列番号8)
ubi F:5’−ACGATTGATTTAACCAGTCCATGA−3’(配列番号9)
図2cは、野生型イネの種子と3A−00136系統のイネの種子において正常なLOC_Os08g12430遺伝子の発現有無を確認した結果を示す電気泳動の写真であり、左側は野生型イネの種子(WT)を示し、右側は3A−00136系統のイネの種子(HO)を示す。図2cに示されるように、野生型イネの種子ではLOC_Os08g12430遺伝子とユビキチン遺伝子が正常に発現されたが、3A−00136系統のイネの種子ではLOC_Os08g12430遺伝子は発現されず、ユビキチン遺伝子のみが正常に発現されることを確認した。

0035

したがって、3A−00136系統のイネの種子は、LOC_Os08g12430遺伝子が変異した変異品種であることが分かった。
前記実施例2−1および2−2の結果をまとめると、前記実施例1で得られた3a00136系統のイネはLOC_Os08g12430遺伝子にT−DNAが挿入され、LOC_Os08g12430遺伝子が正常に発現されない品種であることが分かった(図2a)。

0036

図2aは、LOC_Os08g12430遺伝子にT−DNAが挿入された位置を示す概略図であり、1はLOC_Os08g12430遺伝子のエクソン(配列番号5の塩基配列において6360〜7030番に相当)を示し、2はLOC_Os08g12430遺伝子のエクソン(配列番号5の塩基配列において7365〜7694番に相当)を示し、3はLOC_Os08g12430遺伝子のエクソン(配列番号5の塩基配列において7863〜8461番に相当)を示し、T−DNA挿入位置(3A−00136)は、配列番号5の塩基配列の6468番である。

0037

実施例3:3A−00136系統のイネの表現型の分析
前記実施例1で得られた3A−00136系統のイネの外形を変化していないドンジンイネ(対照群)の外形と比較観察し、その表現型を分析した。

0038

第一に、各イネの茎の先端から穂の先端までの身長の長さを測定し、比較した(図3a)。
図3aは、対照群と3A−00136系統のイネの平均身長を比較した結果を示すグラフであり、(■)は対照群を示し、(□)は3A−00136系統のイネを示す。図3aに示されるように、対照群の平均身長は約90cmであるのに対し、3A−00136系統のイネの平均身長は約110cmであることを確認した。したがって、3A−00136系統のイネは、対照群に比べて身長が約15%増加することが分かった。

0039

第二に、各イネに含まれている細胞のサイズと数を観察するために、開花してから、30日が経過した各イネの第3節間組織(internode)を得、前記得られた節間組織をFAA fix溶液ホルマリン(formalin)(35%):酢酸(acetic acid):アルコール(alcohol)(70%)=1:1:18)に浸漬し、各節間組織に含まれた細胞を固定した。前記固定された節間組織をLEICARM2265section機器を使用し、約1μmの厚さで細切し、細切された節間組織を0.05%のトルイジンブルー(toluidine blue)溶液で染色した後、20〜40倍率光学顕微鏡で観察した(図3b)。

0040

図3bは、対照群と3A−00136系統のイネの節間組織に含まれている細胞を示す顕微鏡写真であり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。図3bに示されるように、対照群の節間組織で観察された細胞に比べて、3A−00136系統のイネの節間組織で観察された細胞はサイズが小さく、同じ範囲に含まれている細胞の数が増加することを確認し、これを数値化した結果、対照群の細胞に比べて約32%が減少したことを確認した。

0041

第三に、バーニアキャリパーを用い、各イネの節間組織の1〜6番目の節の上側4cmの位置で、それぞれの茎の太さを測定し、比較した(図3c)。
図3cは、対照群と3A−00136系統のイネの平均茎の太さを比較した結果を示すグラフであり、(■)は対照群を示し、(□)は3A−00136系統のイネを示す。図3cに示されるように、概ね対照群よりは3A−00136系統のイネの平均茎の太さが増加することを確認し、これを数値化した結果、対照群の茎の太さに比べて約34%増加していることを確認した。

0042

第四に、各イネの茎の断面を観察するために、開花してから30日が経過した各イネの第三節間組織を得、得られた前記節間組織をFAA fix溶液に浸漬し、各節間組織に含まれた細胞を固定した。固定された前記節間組織をLEICARM2265 section機器を使用して、約1μmの厚さで横断切断し、切断された節間組織を0.05%のトルイジンブルー溶液で染色した後、20〜40倍率の光学顕微鏡で観察した(図3d)。

0043

図3dは、対照群と3A−00136系統のイネの節間組織に含まれている茎の断面を示す顕微鏡写真であり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。図3dに示されるように、対照群の節間組織で観察された茎の断面の面積に比べて、3A−00136系統のイネの節間組織で観察された茎の断面の面積が広いことを確認した。

0044

前記図3a〜3dの結果をまとめると、LOC_Os08g12430遺伝子の機能が抑制されると、茎の長さだけでなく、厚さの発達加速するため、全体的な茎の発達が促進されることが分析された。

0045

実施例4:3A−00136系統のイネの種子生産性の分析
まず、前記実施例1で得られた3A−00136系統のイネに実る穂と粒を対照群のものと比較観察した(図4a)。

0046

図4aは、3A−00136系統のイネで生成された穂を対照群のものと比較観察した結果を示す写真であり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。図4aに示されるように、3A−00136系統のイネは、対照群に比べて穂の長さと数が増加することを確認した。

0047

また、前記3A−00136系統のイネから収穫された種子の数を対照群のものと比較した(図4b)。
図4bは、3A−00136系統のイネから収穫された種子の数を対照群のものと比較した結果を示すグラフであり、WOは対照群を表し、HOは3A−00136系統のイネを示す。図4bに示されるように、3A−00136系統のイネは、対照群に比べて収穫された種子の数が約20%増加することを確認した。

0048

前記図4aおよび4bの結果をまとめると、LOC_Os08g12430遺伝子の機能が抑制されると、穂の長さ、数だけでなく、種子の数が増加すると分析することができる。

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