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課題

本発明は、関心のあるトランスジーンを含むが、マーカー遺伝子欠くトランスジェニック種子を同定するための方法および組成物を提供する。

解決手段

検出可能な表現型を生じる同定配列の使用は、関心のある遺伝子に連鎖していないトランスジーン配列が関心のある遺伝子をコードする配列から分離している種子および植物をスクリーニングする効率を増大する。

概要

背景

(2.関連技術の説明)
形質転換植物中の不必要なまたは望ましくないDNAの同定は、多くの研究の主題であり、かかる植物からこれらのトランスジェニック配列を除去するために多くの異なる方法が努力して調べられている(例えば、Hansonら, 1999 ;Daleら, 1991 ; Ebinumaら, 1997 ; Yoderら, 1994 ; Kononovら, 1997 ; HareおよびChua, 2002; Scuttら, 2002; Puchta, 2003; de Vettenら, 2003; Halpin, 2005; 米国特許公開公報20030110532; 米国特許公開公報20040237142;米国特許第6,458,594号)。一般的には、トランスジェニック植物農業的に有用な特性に寄与しないトランスジェニックDNAを含まない植物を同定することは有利である。

アグロバクテリウム(Agrobacterium)を媒介とする形質転換によって植物にトランスジーンを導入する多くの方法は、トランスジーンおよび関連する遺伝子エレメントを取り込み、ついでこれらを植物のゲノム移入するT−DNA(トランスファードDNA)を利用する。一般的に、トランスジーン(または複数のトランスジーン)は右側ボーダーDNA分子(RB)および左側ボーダーDNA分子(LB)によって境界が形成され、植物ゲノムに移入され、1またはそれを超える遺伝子座に組み込まれる。DNA構築物が1を超えるT−DNAを含む場合、それらのT−DNAおよびその中に含まれるトランスジーンは別の遺伝子座で植物ゲノムに組み込まれ得ることが観察されている(Framondら, 1986)。これは、同時形質転換(co-transformation)といわれる。

概要

本発明は、関心のあるトランスジーンを含むが、マーカー遺伝子欠くトランスジェニック種子を同定するための方法および組成物を提供する。検出可能な表現型を生じる同定配列の使用は、関心のある遺伝子に連鎖していないトランスジーン配列が関心のある遺伝子をコードする配列から分離している種子および植物をスクリーニングする効率を増大する。なし

目的

本発明は、a)関心のある核酸を含む第1のDNAセグメントおよび植物中で機能的なプロモーター作動可能に連結したDNAカセット物理学的および/または遺伝学的に連結した植物マーカー遺伝子を含む第2のDNAセグメントで形質転換したトランスジェニック植物の種子を得、ここに該DNAカセットは当該DNAカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与し;b)検出可能な表現型の不存在について種子をスクリーニングし;ついで、c)検出可能な表現型を欠く少なくとも第1の種子を選択して、マーカー遺伝子を含まない種子を得る、工程を含むトランスジェニック植物からマーカーフリー種子を調製する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

トランスジェニック植物からマーカーフリーの種子を調製する方法であって、a)関心のある核酸を含む第1のDNAセグメントおよび種子中で機能的なプロモーター作動可能に連結したDNAカセット物理的に連結したマーカー遺伝子を含む第2のDNAセグメントを含むトランスジェニック植物の種子を得、ここに該DNAカセットは当該DNAカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与し、該検出可能な表現型が種子の色の変化であり;b)検出可能な表現型を欠いている種子をスクリーニングし;ついでc)検出可能な表現型を欠く少なくとも第1の種子を選択して、マーカー遺伝子を含まない種子を得る工程を含む該方法。

請求項2

工程c)が、さらに、関心のある核酸の存在について種子をアッセイし、ついで関心のある核酸を含む種子を選択することを含む請求項1記載の方法。

請求項3

マーカー遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子である請求項1記載の方法。

請求項4

マーカー遺伝子がスクリーニング可能なマーカー遺伝子である請求項1記載の方法。

請求項5

DNAカセットが、選択可能なマーカー遺伝子に翻訳的または転写的に融合したRNAをコードする請求項3記載の方法。

請求項6

第1のDNAセグメントおよび第2のDNAセグメントが重複している請求項1記載の方法。

請求項7

工程c)で選択した種子が、マーカー遺伝子およびDNAカセットを欠いている請求項1記載の方法。

請求項8

トランスジェニック植物またはいずれか以前の世代のその先祖を、別のDNA構築物上の第1および第2のDNAセグメントと同時形質転換する請求項1記載の方法。

請求項9

第1および第2のDNAセグメントが異なるT−DNAボーダー配列によって境界が形成されている請求項1記載の方法。

請求項10

工程a)がトランスジェニック植物またはいずれか以前の世代のその先祖を第1および第2のDNAセグメントを含む単一のDNA構築物で形質転換することを含む請求項9記載の方法。

請求項11

トランスジェニック植物を、植物またはいずれか以前の世代のその先祖を、(i)関心のある核酸を含む左側および右側T−DNAボーダーによって挟まれた第1のDNAセグメント、および(ii)第2のセットの左側および右側T−DNAボーダーによって挟まれた第2のDNAセグメントを含み、ここに第2のDNAセグメントはさらにトランスジェニック植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を含む、DNA構築物で形質転換することによって作成する請求項1記載の方法。

請求項12

第1および第2のDNAセグメントが該トランスジェニック植物中で遺伝子的に連結していない請求項1記載の方法。

請求項13

第1および第2のDNAセグメントが、該トランスジェニック植物中で遺伝子的に連結している請求項1記載の方法。

請求項14

トランスジェニック植物を、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、リゾビウム(Rhizobium)、メソリゾビウム(Mesorhizobium)またはシノリゾビウム(Sinorhizobium)属から選択される細菌菌株によって媒介される形質転換によって、第1および第2のDNAセグメントを該植物またはいずれか以前の世代のその先祖に導入することによって作成する請求項1記載の方法。

請求項15

トランスジェニック植物を、マイクロプロジェクタイルボンバードメントによって該植物またはいずれか以前の世代のその先祖に第1および第2のDNAセグメントを導入することによって作成する請求項1記載の方法。

請求項16

選択可能なマーカー遺伝子が、CP4EPSPS、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼDMO、NptII、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼメトトレキサート抵抗性DHFR、ダラポンデハロゲナーゼPMI、Protox、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび5−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードする請求項3記載の方法。

請求項17

DNAカセット配列がcrtB遺伝子を含む請求項1記載の方法。

請求項18

DNAカセットが、、種子内胚乳子葉アリューロンおよび種皮から選択される組織で機能的なプロモーターに作動可能に連結している請求項1記載の方法。

請求項19

DNAカセットが、ナピンプロモーター、ベータファゼオリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Osgt−1プロモーター、オレオシンプロモーターデンプン合成酵素プロモーター、グロブリン1プロモーター、オオムギLTP2プロモーター、アルファアミラーゼプロモーターキチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、HVA1プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼIIプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、VP1プロモーター、USP、USP88、USP99、レクチンおよびブロンズ(bronze)2プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結された核酸配列を含む請求項1記載の方法。

請求項20

検出可能な表現型を触媒活性の検出によってアッセイする、請求項1記載の方法。

請求項21

工程c)を自動種子ソーティング機によって行う請求項1記載の方法。

請求項22

(a)植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側T−DNAボーダーを含む第1のDNAセグメント、および(b)DNAカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を挟む第2のセットの左側および右側T−DNAボーダーを含む第2のDNAセグメントを含み、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、DNAカセットがcrtB遺伝子を含むDNA構築物。

請求項23

マーカー遺伝子が選択可能なマーカー遺伝子である請求項22記載のDNA構築物。

請求項24

関心のある遺伝子が、除草剤耐性昆虫もしくは有害生物抵抗性、病気抵抗性、増大したバイオマス、修飾した脂肪酸代謝、修飾した炭水化物代謝、および修飾した栄養品質よりなる群から選択される特性を付与する請求項22記載の構築物

請求項25

DNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子が同一のプロモーターに作動可能に連結された請求項22記載の構築物。

請求項26

DNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子が異なるプロモーターに作動可能に連結された請求項22記載の構築物。

請求項27

選択可能なマーカー遺伝子が、CP4EPSPS、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、DMO、NptII、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼ、メトトレキサート抵抗性DHFR、ダラポンデハロゲナーゼ、PMI、Protox、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび5−メチルトリプロファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードする請求項22記載の構築物。

請求項28

DNAカセットが、胚、種子内胚乳、子葉、アリューロンおよび種皮よりなる群から選択される組織で機能的なプロモーターに作動可能に連結された請求項22記載の構築物。

請求項29

DNAカセットが、ナピンプロモーター、ベータ−ファゼロリンプモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Osgt−1プロモーター、オレオシンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、グロブリン1プロモーター、オオムギLTP2プロモーター、アルファ−アミラーゼプロモーター、キチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、HVA1プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼIIプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、VP1プロモーター、USP、USP88またはUSP99プロモーター、およびブロンズ(bronze)2プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結された請求項22記載の構築物。

請求項30

請求項22記載の構築物で形質転換したトランスジェニック細胞

請求項31

請求項22記載の構築物で形質転換したトランスジェニック植物。

請求項32

植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側T−DNAボーダーを含む第1のDNAセグメント、およびDNAカセットを含む種子中で検出可能な表現型を付与するDNAカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を挟む第2のセットの左側および右側T−DNAボーダーを含む第2のDNAセグメントを含む第2のDNA構築物で同時形質転換したトランスジェニック植物。

請求項33

請求項32記載の植物の細胞

請求項34

右側および左側T−DNAボーダーを含むDNA構築物であって、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第1のDNAセグメントが右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したDNAカセットおよびマーカー遺伝子を含む植物種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットを含む第2のDNAセグメントが左側ボーダーの後に位置し、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するDNAカセットがcrtB遺伝子を含む該DNA構築物。

請求項35

右側および左側T−DNAボーダーを含むDNA構築物であって、ここにDNAカセットを含む植物種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を含む第1のDNAセグメントが右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第2のDNAセグメントが左側ボーダーの後に位置し、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するDNAカセットがcrtB遺伝子を含む該DNA構築物。

請求項36

第1および第2の右側T−DNAボーダーを含むDNA構築物であって、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第1のDNAセグメントが第1の右側ボーダーの後に位置し、DNAカセットを含む植物種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したマーカー遺伝子を含む第2のDNAセグメントが第2の右側ボーダーの後に位置し、ここに検出可能な表現型が種子の色の変化であり、検出可能な表現型を付与するDNAカセットがcrtB遺伝子を含む該DNA構築物。

請求項37

列番号:2、配列番号:3または配列番号:2もしくは配列番号:3に対して少なくとも71%の同一性を有する配列を含み、かつフィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列。

請求項38

植物中で機能的な異種プロモーターに作動可能に連結した請求項37記載の核酸配列を含む組換えDNA構築物

請求項39

請求項37記載の核酸配列を含む宿主細胞

請求項40

宿主細胞が細菌細胞または植物細胞である請求項39記載の宿主細胞。

請求項41

請求項37記載の核酸配列を含むトランスジェニック植物または種子。

技術分野

0001

本願は、参照することによってその全体の開示が本明細書に取り込まれる2006年5月12日に出願した米国仮特許出願60/799,875に基づく優先権を主張する。

0002

(1.発明の分野)
本発明は一般的にトランスジェニック植物に関する。より詳細には、本発明は、形質転換植物中の望ましくないまたは不必要なDNAの同定および除去に関する。

背景技術

0003

(2.関連技術の説明)
形質転換植物中の不必要なまたは望ましくないDNAの同定は、多くの研究の主題であり、かかる植物からこれらのトランスジェニック配列を除去するために多くの異なる方法が努力して調べられている(例えば、Hansonら, 1999 ;Daleら, 1991 ; Ebinumaら, 1997 ; Yoderら, 1994 ; Kononovら, 1997 ; HareおよびChua, 2002; Scuttら, 2002; Puchta, 2003; de Vettenら, 2003; Halpin, 2005; 米国特許公開公報20030110532; 米国特許公開公報20040237142;米国特許第6,458,594号)。一般的には、トランスジェニック植物の農業的に有用な特性に寄与しないトランスジェニックDNAを含まない植物を同定することは有利である。

0004

アグロバクテリウム(Agrobacterium)を媒介とする形質転換によって植物にトランスジーンを導入する多くの方法は、トランスジーンおよび関連する遺伝子エレメントを取り込み、ついでこれらを植物のゲノム移入するT−DNA(トランスファードDNA)を利用する。一般的に、トランスジーン(または複数のトランスジーン)は右側ボーダーDNA分子(RB)および左側ボーダーDNA分子(LB)によって境界が形成され、植物ゲノムに移入され、1またはそれを超える遺伝子座に組み込まれる。DNA構築物が1を超えるT−DNAを含む場合、それらのT−DNAおよびその中に含まれるトランスジーンは別の遺伝子座で植物ゲノムに組み込まれ得ることが観察されている(Framondら, 1986)。これは、同時形質転換(co-transformation)といわれる。

発明が解決しようとする課題

0005

同時形質転換法は、別のT−DNAを運搬しているプラスミドで形質転換したアグロバクテリウム菌株の混合物でT−DNAを送達することによって行い得る。同時形質転換は、各々が1のT−DNAを含有する2またはそれを超えるDNA構築物で1のアグロバクテリウム菌株を形質転換することによっても行い得る。さらなる方法は、単一のDNAベクター上の2のT−DNA、および異なる遺伝子座にT−DNAを組み込んだトランスジェニック細胞および植物を用いる。マイクロプロジェクタイルを用いるボンバードメントを含むDNAを導入する物理的方法のような非−アグロバクテリウム媒介形質転換系においては、2のDNA分子を独立して標的ゲノムに組み込み、ついでその後の世代において独立して分離することができる。配列の独立した挿入およびその遺伝的分離を許容する2のT−DNA構築物の使用は記載されている(例えば、米国特許第5,731,179号; Zhouら, 2003; Breitlerら, 2004; Satoら, 2004)。前記したことは当該技術分野における理解をさらに深めるが、製品開発をより効率的に行うマーカーフリー植物を得るための改善された方法および組成物に対する要望が存在し続けている。以前に記載されているスクリーニング法は非常に労働集約的であり、例えばR0および/またはR1植物材料成長させた後にサザンブロットまたはPCR登録商標分析を必要とする。

0006

米国特許公開公報20060041956は、アグロバクテリウム媒介形質転換と結合した視覚的マーカー遺伝子の使用を記載している。しかしながら、当該公開公報は、どこでかかるマーカーが選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に結合し、関心のある遺伝子に結合しないという方法については記載していない。したがって、農業的に有用でないマーカー配列および/または他のトランスジェニックDNAを欠く植物を同定および除去し得る簡便性および効率性を改善する方法および組成物に対して当該技術分野における大きな要望が存在し続けている。

課題を解決するための手段

0007

1の態様において、本発明は、a)関心のある核酸を含む第1のDNAセグメントおよび植物中で機能的なプロモーター作動可能に連結したDNAカセット物理学的および/または遺伝学的に連結した植物マーカー遺伝子を含む第2のDNAセグメントで形質転換したトランスジェニック植物の種子を得、ここに該DNAカセットは当該DNAカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与し;b)検出可能な表現型の不存在について種子をスクリーニングし;ついで、c)検出可能な表現型を欠く少なくとも第1の種子を選択して、マーカー遺伝子を含まない種子を得る、工程を含むトランスジェニック植物からマーカーフリー種子を調製する方法を提供する。1の形態において、工程c)は、さらに、関心のある核酸の存在について種子をアッセイし、ついで、関心のある核酸を含みかつ選択可能なマーカー遺伝子を欠く種子を選択することを含む。

0008

ある種の形態において、DNAカセットは選択可能なマーカー遺伝子に翻訳的または転写的に融合することができ;すなわち、それは選択可能なマーカー遺伝子に翻訳的または転写的に融合したRNAをコードし得る。さらなる形態において、DNAカセットは、内因性遺伝子に少なくとも19または21bpのホモロジーを有するアンチセンスまたはセンスDNAフラグメントを含み、例えば、該アンチセンスまたはセンスDNAフラグメントは種子中で機能的なプロモーターに作動可能に連結している。いまだ他の形態において、DNAカセットはDNAフラグメントの一対の逆方向反復配列を含み、ここに各フラグメントは少なくとも19または21bpのサイズであり、該DNAフラグメントは種子中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した内因性遺伝子に相同である。内因性遺伝子に相同である逆方向DNAフラグメント反復配列は、選択可能なマーカー遺伝子内のイントロンに置くこともできる。ある種の形態においては、DNAカセットは少なくとも19または21のヌクレオチドを含むセンスまたはアンチセンスRNAをコードし、ここにDNAフラグメントは内因性遺伝子に相同である。

0009

本発明に係るマーカーフリー種子を調製する方法においては、選択した種子はスクリーニング可能な遺伝子またはスクリーニング可能なDNAカセットを欠くことができる。トランスジェニック植物の種子を得ることは、第1および第2のDNAセグメントでいずれか以前の世代のトランスジェニック植物またはその先祖を、別のDNA構築物上の第1および第2のDNAセグメントで形質転換または同時形質転換することも含み得る。トランスジェニック植物の種子を得ることは、トランスジェニック植物またはいずれか以前の世代のその先祖を、第1および第2のDNAセグメントを含む単一のDNA構築物で形質転換することも含み得る。第1および第2のDNAセグメントは、異なるT−DNAボーダー配列によって境界を形成し得る。本発明の方法においては、トランスジェニック植物は、(i)左側および右側T−DNAボーダーによって挟まれた第1のDNAセグメント、および(ii)第2のセットの左側および右側T−DNAボーダーによって挟まれた第2のDNAセグメントを含むDNA構築物で、植物またはいずれか以前の世代のその先祖を形質転換することによって作製することができ、ここに該第2のDNAセグメントはトランスジェニック植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した選択可能なマーカー遺伝子をさらに含む。第1および第2のDNAセグメントは、トランスジェニック植物に遺伝子的に連結してもしなくてもよい。

0010

本発明により使用するトランスジェニック植物は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)、リゾビウム(Rhizobium)、メソリゾビウム(Mesorhizobium)またはシノリゾビウム(Sinorhizobium)属から選択される細菌株によって媒介される形質転換によって、第1および第2のDNAセグメントを植物またはいずれか以前の世代のその先祖に導入することによって作製することができる。トランスジェニック植物は、例えばマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントによっても作製することができる。

0011

本発明と一緒に使用する選択可能なマーカーは、CP4EPSPS、bar、DMO、NptII、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ変異型アセト乳酸シンターゼメトトレキサート抵抗性DHFR、ダラポンデハロゲナーゼPMI、Protox、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび5−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードし得る。本発明と一緒に使用するDNAカセット配列は、例えば、crtB、gus、gfp、sacB、lux、アントシアニン合成遺伝子、DefH9−iaaM、rolB、OsCDPK2、AP2、ARF2、ANT転写因子LEC2、Snf−1、cobA、KAS4、splA、ゼイン逆方向繰り返し配列、B−peruおよび酵母ATPPFKよりなる群から選択し得る。カセットは、、種子内胚乳子葉アリューロンおよび種皮から選択される組織中で機能的なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターは、例えば、ナピンプロモーター、ベータファゼオリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Osgt−1プロモーター、オレオシンプロモーターデンプン合成酵素プロモーター、グロブリン1プロモーター、オオムギLTP2プロモーター、アルファアミラーゼプロモーターキチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、HVA1プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼIIプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、VP1プロモーター、USPプロモーター、USP88プロモーター、USP99プロモーター、レクチン、およびブロンズ(bronze)2プロモーターよりなる群から選択し得る。検出可能な表現型は、触媒活性の検出によってアッセイし得る。検出可能な表現型は、種子の色、種子の不透明性、種子の発可能性、種子の大きさ、種子の生存能力、種子の形、種子のテクスチャー、および欠陥のあるもしくは発育不全種子よりなる群から選択し得る。種子のスクリーニングは、自動種子ソーティング機によって行い得る。

0012

もう1の態様において、本発明は、(a)植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側T−DNAボーダーを含む第1のDNAセグメント、および(b)DNAカセットを含む種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターを挟む第2のセットの左側および右側T−DNAボーダーおよび植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した選択可能なマーカー遺伝子を含む第2のDNAセグメントを含むDNA構築物を提供する。関心のある遺伝子は、除草剤耐性昆虫もしくは有害生物抵抗性、病気抵抗性、増加したバイオマス、修飾された脂肪酸代謝、修飾された炭水化物代謝、および修飾された栄養品質よりなる群から選択される特性を付与し得る。構築物においては、DNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子は同一のプロモーターに作動可能に連結し得る。1の形態において、DNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子は、異なるプロモーターに作動可能に連結する。特定の形態において、選択可能なマーカー遺伝子は、CP4EPSPS、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ、DMO、NptII、グリホセートアセチルトランスフェラーゼ、変異型アセト乳酸シンターゼ、メトトレキサート耐性DHFR、ダラポンデハロゲナーゼ、PMI、Protox、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼおよび5−メチルトリプトファン抵抗性アントラニル酸シンターゼよりなる群から選択される生成物をコードする。もう1の形態において、DNAカセットは、crtB、gus、gfp、sacB、lux、アントシアニン合成遺伝子、DefH9−iaaM、rolB、OsCDPK2、AP2、ARF2、ANT転写因子、LEC2、Snf−1、cobA、KAS4、splA、ゼイン逆方向繰り返し配列、B−peruおよび酵母ATP−PFKよりなる群から選択される。DNAカセットは、胚、種子内胚乳、子葉、アリューロンおよび種皮よりなる群から選択される組織中で機能的なプロモーターに作動可能に連結することができる。1の形態において、DNAカセットは、ナピンプロモーター、ベータ−ファゼオリンプロモーター、ベータ−コングリシニンサブユニットプロモーター、ゼインプロモーター、Osgt−1プロモーター、オレオシンプロモーター、デンプン合成酵素プロモーター、グロブリン1プロモーター、オオムギLTP2プロモーター、アルファ−アミラーゼプロモーター、キチナーゼプロモーター、ベータ−グルカナーゼプロモーター、システインプロテイナーゼプロモーター、グルタレドキシンプロモーター、HVA1プロモーター、セリンカルボキシペプチダーゼIIプロモーター、カタラーゼプロモーター、アルファ−グルコシダーゼプロモーター、ベータ−アミラーゼプロモーター、VP1プロモーター、USP88またはUSP99プロモーターおよびブロンズ2プロモーターよりなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結する。

0013

いまだもう1の態様において、本発明は、本明細書に記載する構築物で形質転換したトランスジェニック細胞および植物を提供する。1の形態において、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を挟む左側および右側T−DNAボーダーを含む第1のDNAセグメント、および植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したDNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットに作動可能に連結した種子中で機能的なプロモーターを挟む第2のセットの左側および右側T−DNAボーダーを含む第2のDNAセグメントを含むDNA構築物で同時形質転換したトランスジェニック植物を提供する。かかる植物の細胞も提供する。

0014

なおいまだもう1の態様において、本発明は、右側および左側T−DNAボーダーを含むDNA構築物を提供し、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第1のDNAセグメントは右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したDNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子のようなマーカー遺伝子を含む植物種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットを含む第2のDNAセグメントは左側ボーダーの後に位置する。

0015

なおいまだもう1の態様において、本発明は、右側および左側T−DNAボーダーを含むDNA構築物を提供し、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したDNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む植物種子に検出可能な表現型を付与するDNAカセットを含む第1のDNAセグメントは右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第2のDNAセグメントは左側ボーダーの後に位置する。

0016

なおいまだもう1の態様において、本発明は、2の右側T−DNAボーダーを含むDNA構築物を提供し、ここに植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結した関心のある遺伝子を含む第1のDNAセグメントは1の右側ボーダーの後に位置し、植物中で機能的なプロモーターに作動可能に連結したDNAカセットおよび選択可能なマーカー遺伝子を含む植物に検出可能な表現型を付与するDNAカセットを含む第2のDNAセグメントは他の右側ボーダーの後に位置する。

0017

いまだもう1の態様において、本発明は、配列番号:2、配列番号:3、または配列番号:2もしくは配列番号:3に対して少なくとも70%、75%、85%または95%の同一性を有する配列を含み、かつ、フィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする単離された核酸配列を提供する。1の形態において、本発明は、配列番号:2または配列番号:3の核酸配列を含む組換えDNA構築物;または、植物中で機能的な外因性プロモーターに作動可能に連結した、配列番号:2または配列番号:3に少なくとも71%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有する配列を含み、かつ、フィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする組換えDNA構築物も提供する。かかる配列を含む宿主細胞、ここに該細胞が細菌細胞または植物細胞であることは、本発明のもう1の形態である。もう1の形態において、本発明は、配列番号:2または配列番号:3、配列番号:2、配列番号:3、または配列番号:2もしくは配列番号:3に対して少なくとも71%、80%、90%、95%、98%または99%の同一性を有し、かつ、フィトエンシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含むトランスジェニック植物または種子を提供する。

0018

以下の図面は本願明細書の一部をなし、それを含めて本発明のある種の態様をさらに説明する。本発明は、本明細書に示す具体的な形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってより良好に理解し得る。

図面の簡単な説明

0019

pMON10338の概略図。
pMON10339の概略図。
pMON67465の概略図。
pMON67465で形質転換したダイズ組織におけるCrtB発現
事象A33908からの種子中のCrtB発現。
未熟R1種子におけるcrtB、gusおよびCP4/EPSPSの発現。
成熟R1種子におけるcrtBの発現。
pMON67465種子のGUS発現。
GUS陽性種子上のCP4およびCrtBPCR。
トランスジェニック事象をスクリーニングするための連鎖−サザンおよびスクリーニング可能なマーカーの比較。
マーカーフリー種子のためのCP4選択可能なマーカー遺伝子に連結したスクリーニング可能な遺伝子を含む構築物の使用によって移入したDNA配列概要。A)RBおよびLBによって挟まれた1のT−DNA中に位置し、アグロバクテリウム媒介形質転換に使用する1の構築物中のCP4選択可能なマーカー遺伝子に連結したスクリーニング可能な遺伝子を含む第2のT−DNAに物理学的に連結したGOI;B)2のボーダーを含む1のベクター、ここにGOIはRBの後に位置する一方、スクリーニング可能および選択可能なマーカー遺伝子は第2のRBの後またはLBの後にバックボーンと一緒に位置する;C)GOIおよびスクリーニング可能な遺伝子−DNAは2のベクターに分離しており、1のアグロバクテリウム細胞または別のアグロバクテリウム細胞のいずれかで形質転換する;D)GOIおよびスクリーニング可能および選択可能なマーカー遺伝子からの2のDNAセグメントの可能な連結。GOI単独のみが正常な種子概観を示す一方、スクリーニング可能な遺伝子を含む細胞は視認できる表現型を示す;E)2の別のDNAセグメントは、非−細菌媒介形質転換に使用するGOIまたはスクリーニング可能および選択可能なマーカー遺伝子のいずれかを含む。
pMON67420は、同時形質転換用のGOI構築物を表す。
種子−特異的ゼインプロモーターによって駆動する、シゾサッカロマイセスポンベ(Schizosaccharomyces pombe)ATP依存性ホスホフルクトキナーゼを含むプラスミドpMON99575。
種子特異的酵母ATP依存ホスホフルクトキナーゼが破壊された正常な穀粒発達を発現するトウモロコシ
マーカー遺伝子のイントロン内に位置する反復繰り返しが視認できる表現型を生じることを説明するために用いるdsRNAをコードする構築物の概略図。
視認できる表現型を生じるイントロン内に埋め込まれた反復繰り返し。
視認できる表現型に通じるトウモロコシ穂中のα−ゼインのサイレンシング
KAS4を含むpMON83530の概略図。
pMON83530で形質転換したダイズ種子子孫。左側の種子はKAS4の発現に起因して収縮していて選択可能なマーカーの存在を示す一方、右の種子は正常であってマーカーフリーである。
2TDNA構築物中の同定配列として有用なKAS4を含むpMON107314の概略図。
同定遺伝子として有用なsplAを含むpMON68581の概略図。
pMON68581で形質転換した子孫ダイズ種子。右側の種子はsplAの発現に起因して収縮していてスクリーニング可能または選択可能なマーカーの存在を示す一方、左の種子は正常であってマーカーフリーである。
2のT−DNAベクター形式−概略図。

0020

(発明の詳細な説明)

0021

以下は、本発明を実施することにおいて当業者を助けるために提供した本発明の詳細な説明である。当業者は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載した形態における修飾および変化をなすことができる。

0022

本発明は、種子発現した同定遺伝子、配列またはカセットによって付与される表現型に基づいて、同定遺伝子およびマーカー遺伝子配列を含む種子から、同定配列およびマーカー遺伝子配列を欠くが目的の遺伝子または複数の遺伝子(GOI)を含む種子を効率的に区別することを許容する構築物および方法を提供することによって、先行技術における欠点を克服する。詳細には、本発明は、1の形態において、(i)関心のある遺伝子;および(ii)種々の植物組織中で発現し得る選択可能またはスクリーニング可能な遺伝子に物理学的に連結した種子中で発現する同定遺伝子を含む形質転換構造物および植物細胞を形質転換する方法を提供し、ここに該構築物および/または形質転換法は(i)および(ii)の遺伝因子が独立して植物ゲノムに取り込まれ、したがって遺伝学的に互いに分離するように設計することができる。

0023

子組織における同定配列の発現またはその欠失は、種子発現型同定配列および物理学的に連結した選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子を欠く種子および植物の直接的同定を許容する一方、関心のあるトランスジーンをいまだ含む種子および植物の選択を許容する。関心のある遺伝子を含み、種子レベルでマーカー遺伝子を欠く種子を選択することは、それが比較的費用集約的および労働集約的である以前に利用されていたスクリーニング方法の必要性を回避する点において著しい進歩を表す。また、スクリーニングとして省力し得る時間は、例えば連鎖−サザン分析に必要なように、次世代の植物が組織収穫を許容する生長を必要とすることなく、発芽の前またはその間に行うことができる。

0024

1の形態において、植物組織の形質転換は、アグロバクテリウムまたは他のリゾビア(Rhizobia)媒介法(例えば、参照することによって本願明細書に特異的に取り込まれる、「Use of Non-Agrobacterium Bacterial Species for Plant Transformation」なる発明の名称で2006年5月16日に出願された米国仮特許出願60/800,872および指定代理人ファイル番号MONS:100USP1を参照されたい)、および種子で発現する同定配列を含むDNA配列および物理学的に連鎖した選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子をT−DNA上または他の配列上に一緒に存在させ、それを植物細胞に移入する方法(例えば、T−DNA RBおよび/またはLB配列によって挟まれた、またはボーダー配列を含まない)によって行う。同定配列およびマーカー遺伝子は、関心のある遺伝子をそれ自体のRBおよびLB配列によって挟まれた別のT−DNA上に存在させつつ物理学的に連鎖した植物に移し得、または他の配列を植物細胞に移してそれを独立した遺伝子座に組み込むことができる(例えば、図21)。選択可能および/またはスクリーニング可能なマーカーは、形質転換した植物組織の同定を許容する。受精能力のある植物を得ることができ、次世代において表現型の分離を継がせるために、育種スキームにおいて自家受粉または交雑することができる。かかる育種を行う戦略は当該技術分野でよく知られており、異なる植物間で詳細に変化し得る。同定配列の種子発現または発現の欠損は、マーカーおよび同定配列の存在に関して種子の容易な同定を許容する。例えば、関心のある遺伝子は、除草剤耐性、抗生物質抵抗性昆虫抵抗性、病気抵抗性、ストレス耐性(例えば、渇水および低温)、高められた栄養効率性、高められた栄養含量(例えば、アミノ酸タンパク質、糖、炭水化物脂肪酸および/または油)、不稔系、産業用酵素(例えば、医薬およびバイオ燃料用の加工酵素)および高められた収量よりなる群から選択される特性をコードする少なくとも1の植物発現カセットを含み得る。

0025

植物細胞に移行し得る配列(例えば、T−DNA)は、形質転換に利用する細菌株中の1の形質転換ベクターに存在し得る。もう1の形態において、同定配列および植物選択可能なマーカーを含む配列、および、関心のある遺伝子(または複数の遺伝子)は細菌株中の別の形質転換ベクター上に存在し得る。いまだもう1の形態において、同定配列および植物選択可能なマーカーを含むT−DNAおよび関心のある遺伝子を含むT−DNAは、形質転換に一緒に用いる別の細菌細胞または細菌株に見出し得る。

0026

いまだもう1の形態において、(i)関心のある遺伝子;および(ii)種子中で発現し、かつ、選択可能またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子に物理学的に連鎖した同定配列を含むDNA配列は、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントのような物理学的方法によって植物細胞に導入することができる。かかる形態において、(i)および(ii)のDNA配列は、DNAでのマイクロプロジェクタイルのコーティングの前またはその間に一緒に混合し得る別のDNAフラグメント上に位置させることができる。DNA配列は単一のマイクロプロジェクタイル上に存在させることができ、あるいは、それはボンバードメントに先立って一緒に混合する別のマイクロプロジェクタイル上に存在させることができる。

0027

同定配列によって伝達される表現型は、構成的種子特異的プロモーターに連結した外因性または内因性の遺伝子の異所過剰発現、またはアンチセンスRNA、RNA干渉または同時抑制技術を用いた内因性遺伝子のダウンレギュレーションによって達成し得る。内因性遺伝子の例には、限定されるものではないが、糖/デンプン代謝、タンパク質代謝および脂肪代謝関与する遺伝子が含まれ得る。

0028

1の形態において、同定配列の種子発現は、同定配列を含むトランスジェニック植物の種子に検出可能な表現型を生じる。幾つかの形態において、表現型は、視覚検査によって検出することができ、種子の色、不透明性(または透明性)、蛍光、テクスチャー、大きさ、形、発芽能、生存能力あるいは一般的に物理学的または生化学的にアッセイ可能であって非トランスジェニック受容遺伝子型において見出されるものとは異なるいずれかの成分または特性における変化が含まれ得る。ある種の形態において、同定配列には、gusA、gfp(Pangら, 1996)、フィトエンシンターゼ、またはフィトエンデサチュラーゼをコードする遺伝子、またはアントシアニン遺伝子(P1、Lc、B−Peru、C1、R、Rc、mybAまたはmyb1(例えば、Selingerら, 1998; ludwigら, 1989; Himiら, 2005; Kobayashiら, 2002))が含まれる。特定の形態において、同定遺伝子は、トウモロコシ植物のような単子葉植物における発現に最適化されたcrtB配列を含む遺伝子を含む、フィトエンシンターゼをコードするcrtB遺伝子を含む(米国特許第5,429,939号;米国特許第6,429,356号;米国特許第5,545,816号)。このことに関して使用し得る遺伝子のもう1の例は、種子顔料の生成に関与する遺伝子である。

0029

他の形態において、表現型は、触媒活性の検出によってアッセイ可能である。いまだ他の形態において、表現型は組織切除表現型、例えば花粉または種子組織の形成における遮断である。生殖体の生成または生存能力に必要な遺伝子をサイレンシング(silence)する、マーカー遺伝子を含む受精を減少または妨害する組成物および方法も、想像される。例えば、花粉の発達および生存能力に必要な遺伝子のサイレンシングを生じる配列を使用し得る。マーカー遺伝子を運搬する減数分裂分離から誘導された花粉は発達せず、あるいは見えないであろう。したがって、花粉を介したマーカー遺伝子の子孫への伝達が防がれる。異系交配授粉においては、すべての子孫がマーカーフリーであろう。他の内因性遺伝子のサイレンシングを生じる配列の使用から、種子表現型を生じる他の内因性遺伝子のサイレンシングを生じる配列(miRNAを含むRNAi技術)までの使用も予想される。かかる遺伝子には、限定されるものではないが:ゼインのような種子貯蔵タンパク質、Opaque2、waxyをコードするかまたはその発現を修飾する遺伝子、ならびに種子における炭水化物、タンパク質、および/または脂質蓄積に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子が含まれる。

0030

非−生存花粉の表現型を付与する同定配列の発現も望ましい。同定配列を有していない花粉穀物のみが卵を受精することができ、したがって、花粉−特異的プロモーターの制御下の同定配列を運搬するトランスジェニック系統雄性授粉者として用いる場合に同定配列およびマーカー配列を含まない種子の収量を増加するからである。同定配列は、花粉に対して致死的であるかまたは花粉発芽に対して阻害的であるタンパク質を生成し得る。あるいは、必須の内因性花粉遺伝子に相同である一対の逆方向反復塩基配列の発現を用いて、遺伝子をサイレンシングし、花粉を非−生存性とすることができる。花粉特異的な遺伝子およびプロモーターの例は当業者に知られており、例えば、LAT52およびLAT59遺伝子、ならびに記載されているトマトのプロモーター(Eyalら, 1995)が含まれる。

0031

もう1の形態において、同定配列は、関心のある遺伝子を有する種子の選択をさらに高め、同定配列およびマーカー遺伝子を有する種子を排除するために、種子および花粉の両方において発現させることができる。これは、2のトランスジーンからなる同定配列を用いることによって行い得、そのうちの1は種子中で発現し、もう1は花粉中で発現する。あるいは、花粉および種子中の同じ同定配列を発現し得るプロモーターも、花粉および種子の両方において検出可能な表現型を生じることができる。花粉および種子の両方で発現するプロモーターの例には、トウモロコシWaxy遺伝子(zmGBS;Shureら, 1983)、およびイネ小サブユニットADPグルコースピロホスフォリアーゼ(osAGP;Andersonら, 1991)である。花粉および種子の発現パターンもRussellおよびFromm, 1997に記載されている。

0032

あるいは、同定配列は、検出可能な表現型が得られるように、細胞または種子代謝の炭水化物、タンパク質、脂質または他の生成物を変化し得る。1の形態において、同定配列は、同定配列およびマーカー遺伝子を含有する種子におけるデンプン蓄積を破壊するレバンスクラーゼまたは酵母ATP依存性ホスホフルクトキナーゼ(ATP−PFK)をコードするsacB遺伝子の内胚乳−特異的発現を許容する(Caimiら, 1996;図12)。同定配列は遺伝子とすることができる。同定配列はさらに転写または翻訳融合物をコードし得る(例えば、米国特許第6,307,123号;米国特許公開20060064772)。

0033

米国特許第6,307,123号は、選択可能なマーカー遺伝子(nptII)とスクリーニング可能なマーカー遺伝子(gfp)との間の翻訳融合物の構築に関する。該方法を適用して、本明細書に記載する同定配列と本明細書に記載する選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとの間の融合物を生成することができる。

0034

ポリペプチド融合物を作製するために用いることができるもう1の方法は、ユビキチン(Ub)プロセシング経路に基づく。この方法を用いて、2のタンパク質ドメインを含む長いポリペプチドを2の別々の活性タンパク質に切断する。この方法においては、単一の遺伝子カセットが2のORFをコードすることができ、その場合の2のORF、例えばcrtBおよびEPSPS−CP4はUbの14のC末端アミノ酸につづいて完全長のUb配列によって分離される。インビボ(in vivo)翻訳後、内因性の脱−ユビキチン化酵素(DUB)がポリタンパク質を3の別々のユニットに切断する:1)Ubの14のC末端アミノ酸中で終了する同定配列crtBを含むN−末端タンパク質;2)Ubプロモーター、および3)選択可能なマーカーEPSPS−CP4をコードするC−末端ポリペプチド。かかる方法は、当業者に知られている(例えば、Walkerら, 2007)。

0035

同定配列と選択可能またはスクリーニング可能なマーカーとの転写融合は、内部リボソーム入口部位(IRES)を用いることによって作製し得る。例えば、crtBのORFにつづいてESPSP−CP4のORFをコードする転写物は、それらの間に位置する機能的IRESを用いて作製し得る。幾つかのIRESは当業者に知られている(例えば、参照することによって本願明細書に取り込まれる、Dinkovaら, 2005およびその中の参考資料;および、米国特許第7,119,187号を参照されたい)。

0036

種子組織における同定配列の表現型は、かずある中で視覚、生化学、免疫学および核酸ベース(例えば、PCR−ベース)の方法を含む方法によって検出し得る。同定配列は、検出かのうな表現型をマーカー遺伝子の表現型から区別し得る種子組織における検出可能な表現型を付与し得る。同定配列によって付与された表現型は、種子発芽を変更することを含めることができる。同定配列は、表現型を識別し得るように、胚、内胚乳、子葉(または複数の子葉)、および種皮(種皮)を含む種子(穀粒)の1またはそれを超える部分で発現し得る。

0037

同定配列は、種なしの表現型も起し得る。1の形態において、組織破壊を行うために、同定配列は植物におけるdefH9−iaaMまたはrolBの胚珠特異的発現を指示し(例えば、Rotinoら, 1997、Carmiら, 2003、GenBankAM422760、X64255、AE009418)、それは発達を阻害し、マーカーおよび同定配列を含む子房において種なし表現型を生じる。いまだもう1の形態において、同定配列は、種子発達を中断する穀物作物におけるOsCDPK2の過剰発現を指示する(Morelloら, 2000; 例えば、GenBank Y13658)。

0038

遺伝子エレメントを設計して、内因性遺伝子の発現を抑制して、マーカー遺伝子を含まない種子からそれを含む種子の識別を許容する種子表現型を生じるようにすることもできる。この同定配列の遺伝子エレメントは、例えばマーカーDNAカセット内に存在させて、種子表現型がマーカーの存在に連鎖させてマーカーを含む種子の迅速な同定を許容するようにマーカー遺伝子に物理学的に連鎖させる。

0039

RNAiを用いて、容易に記録される、好ましくは目視し得る、種子表現型を生じる1またはそれを超える遺伝子をサイレンシングすることができる。RNAi媒介種子表現型に必要なDNA配列はマーカー遺伝子と同じT−DNA上に位置する。マーカー遺伝子を含むいずれの子孫種子も、種子表現型を示し、容易に同定されるであろう。かかる種子は、マーカー遺伝子の存在について生育およびスクリーニングする必要がないであろう。したがって、同定配列によって付与された表現型を有さない種子のみが生育し、および/または、GOIの存在についてスクリーニングされる。種子が自家授粉または異系交雑からのものであるかに依存して、この方法は自家授粉植物種について少なくとも3×または異系交雑植物種については1×によって植えるおよびスクリーニングする必要がある種子の数を減少する。

0040

RNAi関連経路を用いて標的遺伝子をサイレンシングするために用いることができる広範な種々の組成物が、当業者に知られている。1の形態は、配列の逆方向反復塩基配列を転写するDNAカセットを集め、典型的には少なくとも約19−21bp長であってサイレンシングに標的化する1またはそれを超える遺伝子の部分に対応する二本鎖RNA(dsRNA)を作製することである。dsRNAは約19−21bp長であってサイレンシングに標的化する1またはそれを超える遺伝子の部分に対応することができる。同定配列を含むこのDNAカセットは、選択可能なマーカー遺伝子と同一のT−DNA内に位置する。当業者に知られている遺伝子をサイレンシングする他の方法には、限定するものではないが:同時抑制、アンチセンス、miRNA(天然または設計した)の発現、トランス作用siRNAの発現、およびリボザイムの発現が含まれる。いずれのこれらの方法も、遺伝子サイレンシング効果が必要な配列がマーカー遺伝子と同一のT−DNAに位置する場合には、用いることができる。

0041

同定配列は種子のサイズを増大または減少することができる。1の形態において、同定配列は、同定配列および選択可能なマーカー遺伝子を含むより大きな種子を生じる、アンチセンスRNAまたはRNA干渉またはコサプレッション技術(Jofukuら, 2005)によってAP2遺伝子(例えば、GenBankU12546)のダウンレギュレーションを付与する。より大きな種子のサイズは、ARF2遺伝子(Schruffら, 2006; 例えば、GenBank受理番号NM 203251;NM 180913)、またはANT転写因子(MizukamiおよびFisher, 2000; 例えば、GenBank NM 202701、NM 119937、NM 180024、NM 101474、NM 202110)の異所の発現によっても行い得る。もう1の形態において、同定配列は、アンチセンスRNAもしくはRNAiまたはコサプレッション技術によるLEC2(例えば、GenBankAF400123)またはSnf−1(GenBank AB101657、AB101657、AB101655)遺伝子のダウンレギュレーションを運んでおり、これは減少した種子サイズに通じる(Mendozaら, 2005; Radchukら, 2006)。変化した種子サイズは、重量、形または手動および/もしくは機械的手段によるい分けによって容易にソートすることができる。

0042

特定の検出可能な表現型を有する種子の同定のために本発明を用いて自動スクリーニング技術を実行し得ることが特に予期される。このようにして、多数の種子を効率的にスクリーニングすることができ、同定配列を欠く種子を収集し得る。自動技術は、人的技術の信頼よりもより迅速で、より安価でより正確となり得る。この方法で使用することができるかかる種子ソーティング機器は記載されている。例えば、米国特許第4,946,046号は、色に従って種子をソートする装置を記載している。この機器においては、種子を回転式ドラムの均一な列のくぼみに置き、該種子をデジタル式イメージングカメラおよび光源の下側を通過させることによって、色に従って種子をソートする。イメージカメラによって読まれ、コンピュータに送られ、それはドラム速度センサーからの情報も受ける。コンピュータは空気の突風を引き起こすシグナルを生成して、色の付いた種子を含むくぼみの底部の開口を通して空気を吹き込んでかかる種子を収集する。収集した種子は収集ホッパーに送給され、色の付いていない種子は別のホッパーに送給される。

0043

色の付いた種子の検出に用いる光源の波長ならびに色の付いた種子と検出カメラとの間に位置するバリアフィルタを変化させることによって、潜在的にはいずれの同定マーカーもこの技術を用いて検出することができる。例えば、GFPを発現する種子を検出するためには、励起光青色光UVスペクトル、典型的には約395nmである。UV放射に好適な光源は当業者によく知られており、キセノンおよび水銀ランプが含まれる。好適なフィルタセットも当業者によく知られており、例えば、BP450−490励起フィルタ、FT510発色光スプリッタおよびBP515−565バリアフィルタ(Carl Zeiss, Inc., Thornwood, NY)が含まれる。かかるフィルタセットおよび放射波長は、その開示全体が参照することによって本明細書に取り込まれるHeimおよびTsienにより詳細に論じられている。

0044

1またはそれを超える同定配列(または複数の同定配列)を含む構成を使用することによって、選択力を複数の選択可能なおよび/またはスクリーニング可能な遺伝子および関心のある遺伝子に拡張することができる。したがって、種々の異なる形質転換事象を表す多数のトランスジェニック種子を効率的にスクリーニングすることができ、目的のセットの同定配列を有する(または欠く)種子のみを選択することができる。

0045

組換えDNAベクターは、例えば、線状DNAセグメントまたは閉環プラスミドとすることができる。ベクター系は単一のベクターもしくはプラスミド、または植物ゲノムに導入すべき全DNAを一緒になって含む2またはそれを超えるベクターまたはプラスミドとすることができる。本明細書に記載する核酸分子は、例えば、植物細胞中で機能して連結したコード配列または他のDNA配列の発現を駆動する好適なプロモーターの制御下のベクターに好適に挿入することができる。この目的に多くのベクターが利用可能であり、適当なベクターの選択は当該ベクターに挿入すべき核酸のサイズおよび当該ベクターで形質転換すべき特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能ならびに一緒に使用しまたは和合性である特定のベクターおよび植物細胞に依存する種々のコンポーネントを含む。

0046

植物細胞の安定な形質転換およびトランスジェニック植物の確立に好適な多数のベクターがよく知られている。例えば、Gelvinら(1990)。典型的には、章物発現ベクターには、限定されるものではないが、関心のある転写ユニットの1またはそれを超える遺伝子が含まれ、その各々には5'非翻訳領域が含まれ、それには作動可能に連結されたタンパク質コード配列(「オープンリーディングフレーム」、ORF)の転写(例えば、エンハンサー転写開始点ほかのようなシス作用プロモーター配列)および翻訳(例えば、リボソーム結合部位)を制御する配列が含まれ;3'非翻訳領域が含まれ、それには植物遺伝子の3'末端からのさらなる調節領域((Thornburgら, 1987);Anら, 1989)、例えばmRNA定性を上昇する3'ターミネーター領域が含まれる。あるいは、植物発現ベクターは、例えば、RNAi−媒介アプローチによって植物遺伝子発現を変化させ得るmRNA分子が発現されるように設計することもできる。さらに、かかる構築物は通常、選択可能および/またはスクリーニング可能なマーカー転写ユニットおよび所望により細菌宿主細胞中でベクターの複製のために必要な複製開始点または他の配列を含むことができる。

0047

構築物は、例えば、ori322のようなエスシェリキア・コリの複製開始点、oriVまたはoriRiのような広範な宿主範囲の複製開始点のような細菌細胞中の複製機能、ならびに、スペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する抵抗性を付与するTn7アミノグルコシドアデニルトランスフェラーゼ(aadA)をコードするSpec/Strpまたはゲンタマイシン(Gm、Gent)選択マーカー遺伝子のような選択マーカーのコード領域のような抗生物質選択を提供するプラスミド骨格DNAセグメントも含むことができる。植物形転換については、宿主細菌株は、発現ユニットの移入機能を有するプラスミドを運搬しているアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)ABI、C58、LBA4404、EHA101またはEHA105とする場合がある。植物形質転換の当業者に知られている他の菌株は、本発明において機能し得る。

0048

植物発現ベクターは、所望により、RNAプロセシングシグナル、例えばトランスジーン中のポリペプチドコード配列上流または下流に位置し得るイントロンを含むことができる。また、発現ベクターは、植物遺伝子の3'−非翻訳領域からのさらなる調節配列も含むことができる。これらの3'非翻訳領域は、mRNA転写終結シグナルを含む。植物発現ベクターに含まれる他の運動可能なエレメントには、5'リーダー配列トランジットシグナル配列、およびコード配列が含まれ得る。

0049

発現およびクローニングベクターには、植物選択マーカーともいわれる選択遺伝子が含まれ得る。この遺伝子は、選択培養様式で成長させる形質転換した植物細胞の生存または増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択遺伝子は、除草剤を含む抗生物質、または他の毒素、例えばネオマイシン、メトトレキサート、ジカンバグルホシネートまたはグリホセート、のような選択因子に対する抵抗性を付与するタンパク質をコードする。外因性タンパク質またはそのフラグメントで首尾よく形質転換した細胞は、例えば、薬剤抵抗性を付与するタンパク質を生成し、かくして選択様式で生存する。種々の選択可能/スクリーニング可能/評点付け可能なマーカーおよびそれらをコードする遺伝子の例は、MikiおよびMcHugh, 2004に開示されている。

0050

mRNAを生成する発現ベクターは、宿主植物細胞で認識され、関心のある核酸分子またはそのフラグメントをコードする核酸に作動可能に連結されている。誘導性または組織特異的なプロモーターも含むことができる。植物プロモーターは以下に論じる。

0051

1の形態において、使用する植物形質転換ベクターには、本発明の1またはそれを超えるヌクレオチド配列に作動可能に連結した外因性種子特異的プロモーターを含む単離されたおよび精製されたDNA分子が含まれる。もう1の形態において、プロモーターは種子発現されるが種子特異的でなく、かくして植物細胞におけるmRNA以外のものの生成を許容する。当業者であれば、DNAのセグメントをトランスジェニック植物における発現のために単一のコンポジットDNAセグメントに結合し得ることを容易に理解するであろう。

0052

本発明と一緒に用いる宿主細胞の形質転換に好適な方法は、プロトプラストの形質転換による(米国特許第5,508,184号; Omirullehら, 1993)、乾燥/阻害−媒介DNA取込みによる(Potrykusら, 1985)、エレクトロポレーションによる(米国特許第5,384,253号)、炭化珪素ファイバーとの振とうによる(Kaepplerら, 1990; 米国特許第5,302,523号;および米国特許第5,464,765号)、アグロバクテリウム−媒介形質転換による(米国特許第5,563,055号; 第5,591,616号; 第5,693,512号; 第5,824,877号; 第5,981,840号; 第6,384,301号)およびDNAコート粒子加速による(米国特許第5,015,580号; 第5,550,318号; 第5,538,880号; 第6,160,208号; 第6,399,861号; 第6,403,865号; Padgetteら, 1995)などのような、それによってDNAを細胞に導入することができる実質的にいずれの方法も含むと考えられる。これらのような技術の適用を通して、実質的にいずれの種の細胞も安定に形質転換することができる。多細胞生物種の場合、形質転換細胞トランスジェニック生物再生することができる。

0053

発現ベクターを植物に導入する最も広範に利用されている方法は、アグロバクテリウムの天然形質転換系に基づく(例えば、Horschら, 1985)。アグロバクテリウム・ツメファシエンスおよびリゾゲネスのTiおよびRiプラスミドは、各々、植物の遺伝子形質転換に寄与する遺伝子を運搬している。アグロバクテリウムベクター系およびアグロバクテリウム−媒介遺伝子トランスファーの説明は多くの参考文献によって提供されており、それにはGruberら, 1993; Mikiら, 1993, Moloneyら, 1989, および米国特許第4,940,838号および第5,464,763号が含まれる。シノリゾビウム(Sinorhizobium)、リゾビウム(Rhizobium)およびメソリゾビウム(Mesorhizobium)のような天然に植物と相互作用する他の細菌を修飾して多数の多様な植物への遺伝子トランスファーを媒介することができる(Broothaertsら, 2005)。これらの植物関連の共生細菌は、ディスアームTiプラスミドおよび好適なバイナリーベクターの両方を獲得することによって遺伝子トランスファーにコンピーテントとすることができる。アグロバクテリウム−媒介形質転換法を介してトランスファーすべきDNA配列には、植物細胞中で発現すべき1またはそれを超える遺伝子を含むトランスファーDNA(T−DNA)の範囲を通常決定する右側ボーダー(RB)および左側ボーダー(LB)配列のような1またはそれを超える「ボーダー」配列が含まれ、さらに、オーバードライブ配列(Toroら, 1989)または参照することによって本明細書に取り込まれる米国仮特許出願60/831,814に開示されているような複数のオーバードライブ配列のようなエンハンサー配列を含むことができる。

0054

ワタ形質転換の関係で特に有用となり得る技術は、米国特許第5,846.797、5,159,135号、第5,004,863号および第6,624,344号に開示されている。特にアブラナ属植物を形質転換する技術は、例えば米国特許第5,750,871号に開示されており;ダイズを形質転換する技術は、例えば、Zhangら, 1999、米国特許第6,384,301号および米国特許第7,002,058号に開示されている。本発明を用いた用途を見出し得る植物のいくつかの非限定的な例には、アルファルファ、オオムギ、豆類ビートブロッコリキャベツニンジンキャノーラカリフラワーセロリーハクサイ、トウモロコシ、ワタ、キュウリナスウイキョウインゲンマメヒョウタンニラネギレタスメロンエンバクオクラタマネギエンドウコショウカボチャラッカセイジャガイモ、カボチャ、ダイコン、イネ、サトウモロコシ、ダイズ、ホウレンソウ、カボチャ、スウィトコーン、テンサイヒマワリ、トマト、スイカおよびコムギが含まれる。

0055

ベクターまたは構築物は、種々の調節領域も含み得る。5'非−翻訳リーダー配列は、選択したプロモーターに由来して本発明のDNA分子の外因性遺伝子配列を発現することができ、望まれる場合には、mRNAの翻訳が上昇するように特異的に修飾することができる。5'非−翻訳領域は選択したプロモーターから誘導して本発明のDNA分子の外因性遺伝子配列を発現させることができ、望ましい場合は、mRNAの翻訳を増大するように特異的に修飾することができる。5'非−翻訳領域は、植物ウイルスRNA(例えば、タバコモザイクウイルスタバコエッチウイルス、トウモロコシ矮化モザイクウイルス、アルファルファモザイクウイルス)から、好適な真核生物遺伝子、植物遺伝子(コムギおよびトウモロコシ・クロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子リーダー)から、または合成遺伝子配列からも得ることができる。リーダー配列は、非関連のプロモーターまたはコード配列からも誘導し得る。本発明の関係で有用なリーダー配列には、トウモロコシHsp70リーダー(参照することによってその全体が本明細書に取り込まれる、米国特許第5,362,865号および米国特許第5,859,347号)およびTMVオメガエレメント(Gallieら, 1989)が含まれる。翻訳リーダーの例には、数ある中でも、トウモロコシおよびペチュニアヒートショックタンパク質リーダー(米国特許第5,362,865)、植物ウイルスコートタンパク質リーダー、植物rubiscoリーダー、GmHsp(米国特許第5,659,122号)、PhDnaK(米国特許第5,362,865号)、AtAnt1、TEV(CarringtonおよびFreed, 1990)、AGRtunos(GenBank受理番号V00087;Bevanら, 1983)、OsAct1(米国特許第5641876号)、OsTPI(米国特許第7,132,528号)およびOsAct15(米国特許公開番号20060162010)が含まれる。

0056

イントロン配列単子葉植物細胞中のトランスジーンの発現を援助することが当該技術分野で知られている。イントロンの例には、トウモロコシ・アクチンイントロン(米国特許第5,641,876号)、トウモロコシHSP70イントロン(ZmHSP70;米国特許第5,859,347号;米国特許第5,424,412号)およびイネTPIイントロン(OsTPI;米国特許第7,132,528)が含まれ、本発明を実施するのに有利である。

0057

ベクターはトランジット・ペプチド核酸配列も含むことができる。カロテノイド合成に関与するものを含む多くのクロプラスト局在タンパク質が前駆体として核遺伝子から発現し、インポート工程の後に削除されるクロロプラストトランジットペプチド(CTP)によってクロロプラストに標的化される。他のかかるクロロプラストタンパク質の例には、リブロース−1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼの小サブユニット(SSU)、ならびに集光性複合体タンパク質Iおよびタンパク質IIが含まれる。非−クロロプラストタンパク質をCTPとの融合タンパク質の使用によってクロロプラストに標的化し得ること、ならびに、CTP配列がタンパク質をクロロプラストに標的化するのに十分であることはイン・ビボ(in vivo)およびイン・ビトロ(in vitro)で実証されている。アラビドプシスタリアーナ(Arabidopsis thaliana)(At)EPSPS CTP(Kleeら, 1987)およびペチュニア・ハイブリダ(Ph)EPSPS CTP(della-Cioppaら, 1986)のような好適なクロロプラスト・トランジットペプチドの取込みが、外因性タンパク質配列をトランスジェニック植物のクロロプラストに標的化することが示されている。当業者であれば、必要であれば、特定のCTPの機能性を利用して所与遺伝子産物をクロロプラストに輸入する種々のキメラ構築物を作製し得ることを認識するであろう。本発明を実施するのに有用となり得る他のCTPには、PsRbcS由来CTP(ピサム・サティバム(Pisum sativum)Rubisco小サブユニットCTP;Coruzziら, 1984);ArRbcS CTP(アラビドプシス・タリアーナRubisco小サブユニット1A CTP;CTP1;米国特許第5,728,925号);AtShkG CTP(CTP2;Kleeら, 1987);AtShkGZm CTP(CTP2合成;単子葉植物発現に最適化したコドン;WO04009761の配列番号:14);PhShkG CTP(ペチュニア・ハイブリダEPSPS;CTP4;単子葉植物発現に最適化したコドン;Gasserら, 1988);TaWaxy CTP(トリカム・アエスチバム(Triticum aestivum)顆粒結合デンプン合成酵素CTP合成、トウモロコシ発現に最適化したコドン;Clarkら, 1991);OsWaxy CTP(オリザ・サティバ(Oryza sativa)デンプン合成酵素CTP;Okagaki, 1992);NtRbcS CTP(ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)リブロース1,5-二リン酸カルボキシラーゼ小サブユニットクロロプラスト・トランジット・ペプチド;Mazurら, 1985);ZmAS CTP(ゼア・メイズ(Zea mays)アントラニル酸シンターゼ・アルファ2サブユニット遺伝子CTP;Gardinerら, 2004);およびRgAS CTP(ルタ・グラベオレンズ(Ruta graveolens)アントラニル酸シンターゼCTP;Bohlmannら, 1995)が含まれる。有用となり得る他のトランジット・ペプチドには、トウモロコシcab−m7シグナル配列(PCT WO 97/41228)およびエンドウ(Pisum sativum)グルタチオン還元酵素シグナル配列(PCT WO 97/41228)が含まれる。

0058

転写の終結は、組換えトランスジーン(例えば、関心のある遺伝子、スクリーニング可能な遺伝子を含む同定配列、または植物選択マーカー遺伝子)に作動可能に連結した3'非−翻訳DNA配列によって行い得る。組換えDNA分子の3'非−翻訳領域は、植物中で機能してRNAの3'末端にアデニル酸ヌクレオチドの付加を引き起こすポリアデニル化シグナルを含む。3'非−翻訳領域は植物細胞中で発現する種々の遺伝子から得ることができる。ノパリンシンターゼ3'非翻訳領域((Fraleyら, 1983)はこのキャパシティーにおいて通常使用される。ピサム・サティバム(Pisum sativum)Rbc2遺伝子からのポリアデニル化分子(Ps.RbcS2−E9;Coruzziら, 1984)、AGRtu.nos(Genbank受理番号E01312)、E6(受理番号U30508)、イネ・グルテリン(Okitaら, 1989)およびTaHsp17(コムギ低分子量ヒートショックタンパク質遺伝子;受理番号X13431)は本発明を用いる使用に特に有利となり得る。

0059

構造プロモーターの使用が望ましい本発明の形態のためには、いずれのよく知られた構造植物プロモーターも使用することができる。構造植物プロモーターには、例えばカリフラワーモザイクウイルス(CaMV)35Sプロモーターが含まれ、それは単子葉(例えば、Dekeyserら, 1990);Teradaら, 1990)を含む大部分の植物組織において構造的高レベルの発現を付与し(例えば、Odellら, 1985)、ノパリンシンターゼプロモーター(Anら, 1988)、オクトピンシンターゼプロモーター(Frommら, 1989)、カリフラワーモザイクウイルス19Sプロモーター、ゴマハグサモザイクウイルス35Sプロモーター、イネアクチン1プロモーター、マンノピンシンターゼプロモーターおよびヒストンプロモーターが含まれる。

0060

本発明の他の形態のために、環境、ホルモン化学的および/または発生シグナルに応答して調節されるよく知られた植物遺伝子プロモーターを用いることができ、それには、(1)熱(Callisら, 1988)、(2)光(例えばエンドウrbcS−3Aプロモーター、Kuhlemeierら, 1989;トウモロコシrbcSプロモーター、SchaffnerおよびSheen, 1991;またはクロロフィルa/b−結合タンパク質プロモーター、Simpsonら, 1985)、(3)アブシジン酸のようなホルモン(Marcotteら, 1989)、(4)傷(例えば、wunl, Siebertzら, 1989);または(5)ジャスモン酸メチルサリチル酸ほかのような化学物質によって調節されるプロモーターが含まれる。また、(6)器官−特異的プロモーター(例えば、Roshalら, 1987; Schernthanerら, 1988; Bustosら, 1989)を用いることも有利になり得る。

0061

トランスジェニック植物中のポリヌクレオチドの組織−特異的発現を駆動するために使用し得る広範な種々の植物プロモーター配列が存在する。事実、本発明の特定の形態において、使用するプロモーターは種子特異的なプロモーターである。β−コングリシニンのプロモーター(Chenら, 1989)またはナピンプロモーターのような他の種子−特異的プロモーターは、植物種子成熟の間に調節され(Kridlら, 1991; Kohno-Muraseら, 1994)、オオムギHv.Per1(Staceyら, 1996)、ファゼオリン(Bustosら, 1989)、ダイズトリプシンインヒビター(Riggsら, 1989)、ACP(Baersonら, 1993)、ステアロイル−ACPデサチュラーゼ(Slocombeら, 1994)、ダイズ β−コングリシニンのα'サブユニット(P−Gm7S、例えばChenら, 1986を参照されたい)、Vicia faba USP(P−Vf.Usp、例えば配列番号:1、2および3、米国特許出願20030229918を参照されたい)、グロブリンプロモーター(例えば、BelangerおよびKriz, 1991を参照されたい)、ダイズβ−コングリシニンのアルファ・サブユニット(7Sアルファ;参照することによって取り込まれる米国特許第6,825,398号)およびゼア・メイズ(Zea mays)L3オレオシンプロモーター(P−Zm.L3、例えばHongらを参照されたい;また、参照することによってその開示が具体的に本明細書に取り込まれる米国特許第6,433,252号)が含まれる。

0062

ゼインはゼア・メイズ(Zea mays)内胚乳に見出される一群貯蔵タンパク質である。ゼイン遺伝子のゲノムクローンが単離されており(Pedersenら, 1982;米国特許第6,326,527号)、15kDa、16kDa、19kDa、22kD、27kDaおよびガンマ遺伝子を含むこれらのクローンからのプロモーターも用いることができる。例えば、ゼア・メイズで機能することが知られている他のプロモーターには、以下の遺伝子のプロモーターが含まれる:waxy(RussellおよびFromm, 1997;Shureら, 1983)、Brittle (Girouxら, 1994)、Shrunken 2、分枝酵素IおよびII、デンプン合成酵素、脱分枝酵素オレオシン、グルテリン、スクロースシンターゼ。ゼア・メイズ内胚乳発現用の他のプロモーターは、イネからのグルテリン遺伝子のプロモーター、より詳細にはOsgt−1プロモーター(Zhengら, 1993)である。イネにおけるかかるプロモーターの例は、ADPGPPサブユニットのプロモーター、顆粒結合および他のデンプン合成酵素、分枝酵素、脱分枝酵素、スクロースシンターゼ(Yangら, 1990)およびBetl1(基底内胚乳移動層)およびグルテリン1が含まれる。

0063

本発明で有用となり得る他のプロモーターの例は、米国特許第6,437,217号(トウモロコシRS81プロモーター)、米国特許第5,641,876号(イネアクチンプロモーター;OsAct1)、米国特許第6,426,446号(トウモロコシRS324プロモーター)、米国特許第6,429,362号(トウモロコシPR−1プロモーター)、米国特許第6,232,526号(トウモロコシA3プロモーター)、米国特許第6,177,611号(構造的トウモロコシプロモーター)、米国特許第5,322,938号、第5,352,605号、第5,359,142号および第5,530,196号(35Sプロモーター)、米国特許第6,433,252号(トウモロコシL3オレオシンプロモーター)、米国特許第6,429,357号(イネアクチン2プロモーターならびにイネアクチン2イントロン)、米国特許第5,837,848号(根特異的プロモーター)、米国特許第6,294,714号(光誘導プロモーター)、米国特許第6,140,078号(塩誘導プロモーター)、米国特許第6,252,138号(病原菌誘導プロモーター)、米国特許第6,175,060号(リン欠乏誘導プロモーター)、米国特許第6,635,806号(ガンマ−コイシンプロモーター)および米国特許第7,151,204号(トウモロコシクロロプラスト・アドラーゼプロモーター)が含まれる。用途を見出し得るさらなるプロモーターは、ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター(Ebertら, 1987)、オクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター(それはアグロバクテリウム・ツメファシエンスの癌腫誘導プラスミド上に運搬されている)、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)19Sプロモーター(Lawtonら, 1987)、CaMV 35Sプロモーター(Odellら, 1985)、ゴマノハグサモザイクウイルス35Sプロモーター(Walkerら, 1987)のようなカリモウイルスプロモーター、スクロースシンターゼプロモーター(Yangら, 1990)、R遺伝子複合体プロモーター(Chandlerら, 1989)およびクロロフィル結合a/b結合タンパク質遺伝子プロモーターほかが含まれる。本発明においては、エンハンサー配列を有するCaMV35S(e35S;米国特許第5,322,938号;第5,352,605号;第5,359,142号;および第5,530,196号)、FMV35S(米国特許第6,051,753号;第5,378,619号)、peanut chlorotic streak caulimovirus (PClSV;米国特許第5,850,019号)、At.Act 7(受理番号U27811)、At.ANT1(米国特許公開公報20060236420)、FMV.35S−EF1a(米国特許公開公報20050022261)、eIF4A10(受理番号X79008)およびAGRtu.nos(GenBank受理番号V00087;Depickerら, 1982;Bevanら, 1983)、イネサイトゾルトリオースリン酸イソメラーゼ(OsTPI;米国特許第7,132,528号)、およびイネアクチン15遺伝子(OsAct15;米国特許公開公報20060162010)プロモーターは特に有利である。幾つかの例、例えばOsTPIおよびOsAct 15において、プロモーターは5'UTRおよび/または第1のイントロンを含むことができる。当業者によって知られている本発明を実施するのに有用な他のプロモーターも本発明によって予想されている。

0064

植物発現ベクターは、本発明において使用して分離する細胞または発現用(発現の喪失)の子孫をモニターすることができるスクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子カセットも含むことができる。例示的なマーカーは知られており、種々の発色性基質の酵素をコードするβ−グルクロニダーゼ(GUS)(Jeffersonら, 1987a;Jeffersonら, 1987b);植物組織中でのアントシアニン色素(赤色)の生成を調節する産物をコードするR−遺伝子座(Dellaportaら, 1988);β−ラクタマーゼ遺伝子(Sutcliffeら, 1978);種々の発色性基質の酵素をコードする遺伝子(例えば、PADAC、発色性セファロスポリン);ルシフェラーゼ遺伝子(Owら, 1986);発色性カテコールを変換することができるカテコールジオキシゲナーゼをコードするxy1E遺伝子(Zukowskyら, 1983);α−アミラーゼ遺伝子(Ikatuら, 1990);チロシンDOPAおよびドーパミン酸化し、ついでメラニン縮合することができる酵素をコードするチロシナーゼ遺伝子(Katzら, 1983);緑色蛍光タンパク質(Elliotら, 1999)およびα−ガラクトシダーゼ)が含まれる。スクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子は、スクリーニング可能または評点付け可能な遺伝子を含む同定配列と同じ遺伝子産物をコードすることができ、あるいは異なる遺伝子産物をコードすることができる。しかしながら、同定配列は卵、花粉または種子組織で発現され、一方スクリーニング可能または評点付け可能なマーカー遺伝子は形質転換植物細胞を同定する工程の間に発現する。同定配列は構成的に発現させることもできるが、卵、花粉または種子組織における表現型を運ぶのみでもよい。

0065

トランスジェニック植物は、植物細胞培養の分野でよく知られている方法によって形質転換植物細胞から再生することができる。アグロバクテリウム形質転換法を用いて形成したトランスジェニック植物は、典型的に、1つの染色体に挿入された単一の単純な組換えDNA配列を含み、トランスジェニック事象といわれる。かかるトランスジェニック植物は、挿入した外因性配列に対して異型接合であるということができる。トランスジーンに関して同型接合であるトランスジェニック植物は、単一の外因性遺伝子配列を含む独立した分離するトランスジェニック植物をそれ自体に交雑(自家授粉)することによって得ることができ、例えばF0植物からF1種子を得ることができる。生成したF1種子の1/4はトランスジーンに関して同型接合であろう。F1種子を発芽させると植物を生じ、それは典型的には異型接合体および同型接合体の間の区別を許容するSNPアッセイまたは加熱増幅アッセイを用いて接合性について試験することができる(すなわち、接合性アッセイ)。

0066

多数の同定配列を使用することができ、例えば、その発現が視認し得る表現型を生じ得る遺伝子を用いることができ、それにはgus、gfpおよびlucの使用が含まれる(例えば、Owら, 1986;WO 97/41228および米国特許第6,583,338号;例えばM26194; M15077を参照されたい)。「shurunken」種子表現型に通じるレバンスクラーゼ遺伝子、SacB(Caimiら, 1996;例えば、X02730)、または発芽の素材に通じるピロホスファターゼ遺伝子(Hajirezaeiら, 1999)も用いることができる。フィトエンシンターゼをコードする遺伝子(crtB)も当該技術分野において知られており、それには、数ある中でもエルニア・ウレドボーラ(Erwinia uredovora)(例えば、Misawaら, 1990;SandmannおよびMisawa, 1992;米国特許第5,429,939号;第6,429,356号)およびパントエアエンテロバクターアグロメランス(Pantoea/Enterobacter agglomerans)(例えば、GenBankM38423; M87280)からのものが含まれる。

0067

多面発現性種子発現型を生成する大部分のトランスジーンは、スクリーニング可能なマーカーに連結した視認し得る標識遺伝子として用いて、関心のある陽性種子のマーカーフリー遺伝子を同定することができる。視認可能な表現型はトランスジーンの異所性過剰発現によって生成することができ、またはアンチセンスRNA、RNA干渉または同時抑制技術によって内因性代謝経路遺伝子のダウンレギュレーションからも生じ得る。

0068

以下の定義および方法を提供して本発明をより良好に規定し、当業者が本発明を実施することに案内する。別段指摘しない限り、用語は、関連する技術における当業者による慣用的な用法に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的な用語の定義は、Riegerら (1991);およびLewin (1994)にも見出すことができる。37 CFRセクション1.822に記載されているDNA塩基の命名法を用いる。

0069

「CP4」、「aroA:CP4」、「AGRTU.aroA:CP4」、「CP4EPSPS」および「EPSPS CP4」とは、EPSPシンターゼ遺伝子およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス(AGRTU)CP4株から精製したタンパク質をいい、それは植物で発現した場合、グリホセートおよびグリホセート含有除草剤処方に対する耐性を付与する(参照することによってその全体が本明細書に取り込まれる米国特許第5,633,435号)。遺伝子配列ネイティブであっても、植物において発現を高めるために修飾されていてもよい。

0070

DNA「セグメント」とは、DNA構築物のDNA配列の領域をいう。DNAセグメントは、アグロバクテリウム−媒介植物細胞形質転換に用いる構築物に見出されるT−DNA分子の中、間に存在するかまたはそれを挟んで存在することができる。例えば、DNAセグメントは、細菌中のプラスミドの複製のための遺伝子エレメントまたは他の種々のエレメント、ならびに、植物細胞形質転換に使用するよう設計されたDNA構築物の発現カセットを含むことができる。したがって、「DNAカセット」は、細胞中のDNA配列の発現のためのエレメント(または複数のエレメント)を含むDNAセグメントを含むことができる。

0071

「融合タンパク質」とは、単一の単位として発現される翻訳融合物をいい、非−融合出発遺伝子配列によってコードされるタンパク質の表現型を付与する遺伝子産物をいまだ産生する。

0072

「単離した」核酸とは、天然発生する核酸、すなわち他の染色体および染色体外のDNAおよびRNAを含む生物の細胞中の他の核酸配列から、慣用的な核酸精製方法によって実質的に分離または精製されたものである。該語は、組換え核酸および化学合成核酸も包含する。

0073

「グリホセート抵抗性遺伝子」とは、植物中でトランスジーンとして発現した場合に、さもなければ植物を損傷または殺すであろう除草剤グリホセートの耐性レベル能力を付与するいずれの遺伝子をもいう。当業者に知られているいずれのグリホセート耐性遺伝子も、本発明の実施における使用に好適である。グリホセート(N−ホスホノメチルグリシンおよびいずれのその塩のいずれか除草剤的に活性な形を含む)は、酵素5−エノールピルビルキメート−3−ホスフェートシンターゼ(EPSPS)を阻害する。グリホセート耐性を付与するために、種々の天然および変異型EPSPS酵素がトランスジェニック植物で発現されており、それらのいずれのものも本発明において使用することができる。これらのEPSPSの幾つかの例には、米国特許第4,940,835号、第4,971,908号、第5,145,783号、第5,188,642号、第5,310,667号および第6,803,501号と一致して記載および/または単離されたものが含まれる。それらは、アグロバクテリウム種 CP4株(AGRTU.aroA:CP4)から単離されたクラスIIEPSPS遺伝子のような、構造的に異なる非−相同EPSPS遺伝子から誘導することができる。

0074

「同定配列」なる語は、種子または生殖体の色、不透明性または透明性、蛍光、テクスチャー、サイズ、形、発芽能または生存能のような検出可能な表現型、または細胞もしくは種子の代謝の他の産物を付与する生成物をコードする核酸をいう。同定配列は、RNA−i媒介法を介するような、他の遺伝子の発現のダウンレギュレーションを介して表現型を付与し得るヌクレオチド配列(例えば、遺伝子フラグメント)を含み得る。ある種の形態において、同定配列は、gusA、gfpまたはcrtB遺伝子のようなスクリーニング可能な遺伝子を含む。特定の形態において、同定配列は、エルビニア・ハービコーラ(Erwinia herbicola)パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans;参照することによって本明細書に取り込むGenBankM38423;および米国特許第5,429,939号、第6,429,356号)からのフィトエンシンターゼをコードするcrtB遺伝子を含む。同定配列は、抗生物質抵抗性または除草剤耐性をコードするもののような植物の選択可能、スクリーニング可能および/または評点付け可能なマーカー遺伝子に物理学的に連結する。同定配列は、種子における検出可能な(例えば、スクリーニング可能または選択可能な)表現型を付与することができる。

0075

第1の核酸配列が第2の核酸配列と機能的な関係で位置する場合には、第1の核酸配列は第2の核酸配列と「作動可能に」結合しているまたは「連結している」。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合は、プロモーターはタンパク質コード配列に作動可能に連結している。一般的に、作動可能に連結したDNA配列は隣接しており、2のタンパク質コード領域を結合する必要がある場合は、同じ読み枠で隣接している。

0076

「植物」なる語は、単子葉(例えば、ユリ、トウモロコシ、イネ、コムギ、オオムギほか)、双子葉(例えば、ダイズ、ワタ、トマト、キャノーラ、ジャガイモ、アラビドプシス(Arabidopsis)、タバコほか)、裸子植物マツモミヒマラヤスギほか)を含むいずれの高等植物またはその子孫を包含し、植物の再生単位(例えば、種子、球根塊茎、または植物を再生できる植物からの他の部分もしくは組織)、果実、花ほかを含む。

0077

「組換え核酸」は、例えば化学合成または遺伝子工学的技術によって核酸の単離したセグメントの操作によって2の別の方法で分離した配列のセグメントの人工的な組み合わせによって作製する。

0078

「DNA構築物」または「DNAベクター」なる語は、組換えDNA技術によって機能的に影響を及ぼす様式で連結されたプロモーター、タンパク質コード配列、3'非翻訳領域ほかのような1またはそれを超えるDNA配列を含む、いずれかの起源に由来する、いずれかのプラスミド、コスミド、ウイルス、自律複製配列ファージまたは他の環状一本鎖もしくは二本鎖のDNAまたはRNAをいう。植物形質転換用の組換えDNAベクターは、細菌細胞中で複製することができる一般的には二本鎖の環状プラスミドである。組換え核酸構築物を作製および使用する慣用的な組成物および方法はよく知られている。例えば、数ある中でもSambrookら, 1989;およびAusubelら, 1992 (定期的に改訂されている)およびClarkら(1997)。

0079

「プロモーター」または「プロモーター領域」なる語は、RNAポリメラーゼ認識部位および/または転写の開始に必要な他の因子を正確な部位に提供することによってメッセンジャーRNA(mRNA)の生成を制御することによってコード配列の発現を制御する、通常はコード配列の上流(5')側に見出される核酸配列をいう。本明細書で予期するように、プロモーターまたはプロモーター領域には、種々の調節配列への連結、ランダムもしくは制御した突然変異導入、およびエンハンサー配列の付加もしくは倍加によって誘導した種々のプロモーターが含まれる。プロモーター領域は、mRNAを生成するその能力によって実証されるように、好適な組換えベクターの一部分として宿主に導入した場合に、その制御下でコード配列の転写を駆動することに寄与する。

0080

「再生」とは、植物細胞(例えば、植物プロトプラストまたは外植片)から植物を成長させる工程をいう。

0081

「選択可能なマーカー」とは、その発現が核酸配列を含む細胞の同定を促進する表現型を付与する核酸配列をいう。選択可能なマーカーには、毒性化学物質に対する抵抗性(例えば、抗生物質抵抗性)を付与するもの、または、視覚的に区別される特徴(例えば、色の変化または蛍光)を付与するものが含まれる。

0082

有用な優勢植物選択可能なマーカー遺伝子には、数ある中でも、抗生物質抵抗性遺伝子(例えば、ハイグロマイシン、イミダゾリノン、カナマイシンブレオマイシン、G418、ストレプトマイシンまたはスペクチノマイシンに対する抵抗性);および除草剤抵抗性遺伝子(例えば、ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、修飾ALS、BAR、修飾クラスIEPSPS、クラスII EPSPS、DMO)をコードする遺伝子が含まれる。

0083

「評点付け可能なマーカー遺伝子」または「スクリーニング可能なマーカー遺伝子」という用語の中に含まれるものは、形質転換細胞を同定または選択する手段としてその分泌を検出し得る分泌可能なマーカーをコードする遺伝子である。例としては、抗体相互作用によって同定することができる分泌可能な抗原、または触媒的に検出することができる分泌可能な酵素さえもコードするマーカーが含まれる。検出可能である小さい拡散可能なタンパク質、細胞外溶液中に検出することができる小さい活性酵素(例えば、α−アミラーゼ、β−ラクタマーゼ、ホスフィノスリシン・アセチルトランスフェラーゼ)、または細胞壁に挿入または捕捉されたタンパク質(拡張またはタバコPR−Sの発現単位に見出されるもののようなリーダー配列を含むタンパク質のような)を含む多数のクラスに入る。他の可能な選択可能および/またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子は、当業者に明らかであろう。

0084

「T−DNA」とは、アグロバクテリウムまたは他のリゾビア媒介形質転換法を介して植物ゲノムに組み込まれるDNA分子をいう。T−DNA分子の少なくとも1の末端は、アグロバクテリウムTiまたはRiプラスミドからのT−DNAの少なくとも1のボーダー領域によって挟まれる。これらのボーダー領域は、一般的に右側ボーダー(RB)および左側ボーダー(LB)領域といい、その起源に依存してヌクレオチド配列および長さの変化として存在する(例えば、アグロバクテリウムのノパリンまたはオクトピン産生株)。トランスジーンを植物に移入するために設計されるDNA構築物に一般的に使用される右側領域は数百ポリヌクレオチド長となる場合があり、植物のゲノムへのT−鎖組込みを案内するT−鎖形成の後に、TiまたはRiヘルパープラスミド由来のvirD2エンドヌクレアーゼがDNAを消化し、5'末端に共有的に結合するニック部位を含む場合がある。T−DNA分子(または複数の分子)は、一般的に1またはそれを超える植物発現カセットを含む。

0085

「トランスジーン」なる語は、該細胞または生物に形質転換した細胞または生物に対して非天然であるいずれの核酸配列をもいう。「トランスジーン」とは、コード配列または調節配列を修飾することによって異所的に発現するいずれの内因性配列をもいう場合がある。「トランスジーン」は、指示した組換えによる非−天然または天然の核酸配列の挿入によって修飾された天然の植物遺伝子のコンポーネント部分をも含む。

0086

実施例1
同定配列およびマーカー遺伝子、および関心のある遺伝子を含む2T−DNAベクターの調製
標準的な分子クローニング法(Sambrookら, 1989)に従って、2のT−DNA植物発現ベクター、pMON67465、pMON101338およびpMON101339(図1)を構築した。1のT−DNAはカナマイシンに対する抵抗性をコードするnptII遺伝子に作動可能に連結されたCaMV35SプロモーターおよびGUSレポーター遺伝子に作動可能に連結したCaMV35Sプロモーターを含む。他のT−DNAは、グリホセート抵抗性を付与するナピン:ctp−crtB:ナピン3'カセットおよび35S:ctp:CP4EPSPSカセットを含む。oriV複製起点を有するpMON67465中のcrtBは、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)からの1.8kb種子特異的ナピンプロモーターおよび1kbナピンターミネーターによって駆動した。oriV複製起点を有するpMON101338中およびpRi複製起点を有するpMON101339中のcrtBは、短いバージョンのナピンプロモーター(1kb)およびターミネーター(0.3kb)によって駆動した。エルビニア(Erwinia)種からのフィトエンシンターゼをコードするcrtB遺伝子は、形質転換頻度に影響することなくダイズ種子にオレンジ色を付与する。

0087

実施例2
pMON67465を用いたダイズ組織片の形質転換および再生
ダイズ(栽培品種A3244)組織を、実質的に以前に記載されているように(米国特許第6,384,301号、参照することによって本願明細書に取り込まれる)、アグロバクテリウム媒介法を介してpMON67465(図1)で形質転換した。簡単には、手で切除したダイズ分裂組織片をアグロバクテリウムと23℃にて2−4日、アグロバクテリウムと同時培養し、PLANTCON中の75μMグリホセート選択を含むWPM固形培地に移し、16/8(明/暗)期下28℃にて培養した。2週間後、組織片を新鮮なWPM培地に移し、シュート収穫まで培養した。2週間後、真の三つ葉を有するシュートを切断し、BMR発根培地上で2−4週間培養した。発根した苗木を、種子成熟のために温室中で生育させた。分析した40の事象の中で、72.5%が両方のT−DNAによる同時形質転換を示した。40の事象の中の45%がnptIIおよびgus遺伝子の両方を含んでいた。pMON67465からのT−DNAを含む事象A33908をさらに分析した。

0088

プラスミドpMON67465を有するさらなる事象は同一栽培品種A3244へのプラスミドの再−形質転換によって得、13のトランスジェニック系統を0.22%の形質転換頻度で得た。13系統のうちの7は、gusまたはCP4マーカー遺伝子の存在または不存在についてのPCRを介した正常外観種子の分析後に、関心のある遺伝子陽性であり、マーカーフリーであった(図6)。R0植物からの橙色種子も、crtB遺伝子およびCP4マーカー遺伝子の存在についてPCRによって分析した。3を除くすべての橙色種子がcrtBおよびCP4の両方について陽性であることが判明した(図7)が、CP4またはcrtB遺伝子を含む正常外観種子は存在せず(図7、白色の欄)、これはcrtB表現型がCP4選択可能なマーカー遺伝子に強固に連鎖していることを示した。

0089

したがって、選択可能なマーカー遺伝子に連鎖したスクリーニング可能な遺伝子を含む同定配列を有する2のT−DNA構築物の使用は、関心のある遺伝子を含むが選択可能なマーカーをコードする配列を欠くトランスジェニック事象のより効率的なスクリーニングおよび選択を許容する。連鎖−サザンベースのアプローチ(「標準2T」)、および関心のある遺伝子および選択可能なマーカーが独立して分離している子孫種子を同定するための標識ベース(すなわち、同定配列ベース)のスクリーニングの間の例示的な比較は、図8に見出される。同定配列アプローチの脂肪は、より多くのトランスジェニック事象、およびさらなる分析に有用な子孫を同定するための各事象のより多くの子孫をスクリーニングすることを許容する。

0090

実施例3
ダイズ事象A33908およびR1子孫種子におけるCrtB/GUS/CP4発現
事象A33908からの組織の目視検査図2)は、および開いた若葉が橙色キャスト(cast)を示した。葉および根組織は、CrtB発現植物において別段表現的に正常であった。R0植物の種子(すなわち、R1世代)からの種皮はわずかなCrtB発現を示したが、A33908由来の種子の子葉は異なる橙色を示し、そのうちの幾つかはしわになった表現型を有していた(図3)。

0091

事象A33908からの12の未熟R1種子を種皮から切開し、CP4−EPSPSELISA、およびCrtBおよびGUS目視分析に付した(図4)。CrtB、GUSおよびCP4−EPSPS表現型の分離が明らかであった。9/12の種子が3のアッセイすべてにおいて陽性であった。1/12の種子がCrtBおよびCP4−EPSPS陽性であったが、GUS陰性であり、gus遺伝子の欠失を有する、pMON67465の2のT−DNAの分離を示した。2/12の種子はCP4−EPSPS ELISA陰性であった。これらの種子は両方ともCrtB陰性であってGUS陽性であり、したがって同定配列(crtB)および選択可能なマーカーCP4−EPSPS遺伝子の間の連鎖、およびgus遺伝子座からのこれらのトランスジェニック遺伝子座の分離を示している。分離した種子における表現型比は、2の優性遺伝子座のメンデル分離と一致した。

0092

実施例4
R1種子目視分析
A33908からの成熟種子を色、大きさおよび形について目視分析した(図5)。(i)マーカーフリー正常(例えば、黄色および平面);(ii)橙色および平面;および(iii)橙色および収縮した種子が見られた。

0093

実施例5
GUS陽性種子に対するPCR分析
INVADERPCR(例えばMeinら, 2000)を用いて、トランスジェニックダイズ植物の種子におけるpMON67465によって送達されるCP4−EPSPS、crtBおよびgus遺伝子の分離を追跡した。事象A33908は、CP4−EPSPSマーカー遺伝子の単一のコピーおよびNPTII遺伝子の単一のコピーを含むことが決定された。橙色:正常種子の分離は、事象A33908において予想される3:1の結果となった(表1)。

0094

0095

実施例6
同定配列としてのATPPFKの使用
トウモロコシを含むデンプンを豊富に含む穀物粒について、収縮または破壊された種子発育の表現型を生じる糖/デンプン代謝の操作を利用し得る。sacBの種子特異的発現(Caimiら, 1996)、またはトウモロコシ穂における酵母ATP依存性ホスホフルクトキナーゼの種子特異的発現(ATP PFK;例えばGenBank受理番号NC003423、bases2297466..2300294)は破壊された穀粒発育を生じた(図12)。CP4選択可能なマーカーおよびATP−PFKを含む構築物pMON99575は、関心のある遺伝子を含む1のT−DNA構築物との同時形質転換に、各々がこれらの構築物のうちの1を含む2のアグロバクテリウム株の細胞を混合し、ついで混合した細菌培養物で植物細胞を形質転換することにより直接的に用い得る。あるいは、種子特異的発現するATP−PFKカセットは、マーカーフリー種子の効率的同定のために、同定配列として2のT−DNA構築物にサブクローニングし得る。この遺伝子を含む穀粒は極めて収縮し、発芽しない。同定配列フリーであってマーカー遺伝子フリーの穀粒のみが正常な外観を示している。

0096

実施例7
同定配列としてのポルフィリン合成に関与する遺伝子の使用
S−アデノシル−L−メチオニン依存性ウロポルフィリノーゲンIII(ウロゲンメチルトランスフェラーゼ(SUMT)は、イー・コリ(E.coli)、酵母およびCHO細胞中で過剰発現させた場合に明赤色蛍光のポルフィノイ化合物を生成する。この特性は形質転換イー・コリ(E.coli)コロニーの目視選択を可能にし(RossnerおよびScott, 1995)、形質転換した酵母細胞およびCHO細胞の自動ソーティングを可能にした(WildtおよびDeuschle, 1999)。この蛍光は、ジ−およびトリ−メチル化ウロゲン(ジヒドロシロヒドロクロリンおよびトリメチルピロロコルフィンの結果であり、その両方はポルフィリン合成経路に見出される化合物である(すなわち、クロロフィルおよびコバラミン)。

0097

プロピオニバクテリウムフリューデンレイチ(Propionibacterium freudenreichii)からのSUMTをコードするcobA(GenBank受入番号U13043;参照することによって本明細書に取り込まれる)で形質転換した細胞は、605nmの発光帯とともに384nmおよび500nmに吸収ピークを有する蛍光シグナルを与える。cobAウロゲンメチルトランスフェラーゼによって生成する蛍光ポルフィリノイドは、植物材料をマーキングするための良好なスペクトルシグナルを有する。384または500nmのいずれかでの励起は、強力なクロロフィル吸収を回避し、得られる赤色発光はそれが(500nm吸収起源からの)実体ストークシフトを有し、遠赤外におけるクロロフィル自己蛍光重複しないために容易に検出される(Haseloff, 1999)。

0098

トウモロコシSUMT(GenBankD83391)のカルボキシ末端、アラビドプシス(Arabidopsis)Upm1(GenBank L47479)およびイー・コリ(E.coli)CysG(GenBank X14202)タンパク質は、ピイ・フリューデンレイチの遺伝子(cobA)、シュードモナスデニトリフィカンス(cobA;GenBank M59236)およびシネコシスティス(Synechocystis)種(正式には、アナシスティス・ニデュランス(Anacystis nidulans);GenBank X70966)(いずれも参照することによって本明細書に取り込まれる)によってコードされるタンパク質に極めて類似し、同様にして使用することができる。

0099

実施例8
検出可能な種子表現型を生成するための遺伝子サイレンシングの使用
マーカー遺伝子カセットのイントロン内に位置する逆方向繰り返し配列は、植物細胞における有効な遺伝子サイレンシングに通じる。これは、米国特許公開公報2006/0200878号に開示されている(例えば、参照することによって本明細書に取り込まれる図7、8、9)。イントロン内に位置する逆方向反復塩基配列によってコードされるdsRNAが遺伝子サイレンシングを誘起することができるかを試験するために、ルシフェラーゼ遺伝子の〜400bpセグメントの逆方向反復塩基配列(配列番号:1)をEPSPS−CP4遺伝子カセット(pMON73874)中のイネアクチン1プロモーターのイントロンに設置し、トウモロコシ葉プロトプラストの一過性の形質転換においてルシフェラーゼ遺伝子を抑制する構築物の能力を試験した。対照として、対照プラスミドがルシフェラーゼ遺伝子の代わりにGUS遺伝子のセグメントの逆方向反復塩基配列を有する(pMON73875)以外は同様のプラスミドを試験した。最後に、逆方向反復塩基配列を有していない以外は同一であるさらなる対照、pMON25492、も用いた(図13)。

0100

ホタルルシフェラーゼの抑制およびRENILLAルシフェラーゼ(Promega Corp., Madison, WI)内部対照に対する標準化のためのトウモロコシ葉プロトプラストの経時的遺伝子サイレンシング系においてこれら3のプラスミドを試験すると、イントロン内に逆方向反復塩基配列をコードするdsRNAを有するプラスミド(pMON73874)が対照pMON73875およびpMON25492に対してルシフェラーゼを抑制することができることが判明した(図14)。実験は2回繰り返したが、同様の結果であった。

0101

遺伝子サイレンシング・アプローチを介してトウモロコシ穀粒表現型を創製し得るかを試験するために、Waxy遺伝子を抑制するように設計した構築物を作製した。pMON81990はWaxy遺伝子の一部分の逆方向反復塩基配列を含む。pMON81990を含むトランスジェニック・トウモロコシ植物は、デンプン生成に対するヨウ素を用いた花粉および穀粒の染色によって判定して、独立したR0植物の少なくとも65%においてWaxy遺伝子のサイレンシングを示した。比較すると、Waxyのセンスフラグメントを発現するpMON81993を含む植物は、Waxy遺伝子の有効なサイレンシングを示さなかった。

0102

視認し得る表現型に通じるゼイン(種子貯蔵タンパク質)をコードする遺伝子のサイレンシングも示された。pMON73567には、トウモロコシ穀粒のα−ゼインをコードする遺伝子の配列の逆方向反復塩基配列も含まれる。逆方向反復塩基配列の転写はこれらの遺伝子のサイレンシングを生じ、試験した29のR0植物のうち26において19kDおよび22kDのα−ゼインのレベルを低下した。図15は、このdsRNAをコードする配列で形質転換した細胞から生じた穀粒が明らかな視認し得る表現型を有し、ここで減少したゼインを有する穀粒は野生型穀粒よりも透明性が低い。

0103

したがって、マーカー遺伝子のイントロン内に存在するdsRNAをコードする配列は、本発明に係る同定配列として用いることができる。例えば、選択可能なマーカー遺伝子のイントロン中に選択可能なマーカーとしてCP4EPSPSのようなグリホセート耐性遺伝子およびかかるdsRNAコード配列を含む構築物は、各々これらの構築物のうちの1を含む2のアグロバクテリウム菌株の細胞を混合し、植物細胞を混合した細菌培養物で形質転換することによって、関心のある遺伝子を含む1のT−DNA構築物での同時形質転換に用いることができる。あるいは、dsRNAをコードするカセットは、マーカーフリー種子の有効な同定のために、同定配列として2T−DNA構築物にサブクローニングし得る。当業者であれば、マイクロプロジェクタイル・ボンバードメント媒介植物細胞形質転換に用いるための類似の構築物を設計することもできるであろう。

0104

実施例9
同定配列としてのKAS4の使用
バイナリーベクターpMON83530(図16)は、同一T−DNA上の選択可能なマーカーとしてのCP4植物発現可能なカセットと一緒にダイズUSP88プロモーター(米国特許第7,078,588号)によって駆動されるKAS4(ケトアセチル−ACTシンターゼ;GenBank受理番号AF060518)を含む。KAS4遺伝子の種子特異的発現は、遺伝子を含まない正常な種子から簡単に区別し得る(図17)。構築物は同定配列として直接的に使用することができ、かかる同定配列および選択可能なマーカーを含むT−DNAは、関心のある遺伝子を含むT−DNAを含む第2の構築物と一緒に、各々これらの構築物を含むアグロバクテリウム菌株を混同し、混合した細菌培養物で植物細胞を形質転換することによって、同時形質転換し得る。

0105

KAS4発現カセットはpMON107314に示す2T−DNAプラスミドにも存在し(図18)、ここに1のT−DNAが同定配列としてのsplA遺伝子(アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのスクロースホスホリアーゼ;Genbank受理番号AE009432)およびマーカー遺伝子を含み、もう1のT−DNAが当業者に知られているルーチンクローニング法によって構築される関心のある遺伝子を含み得る。ついで、2のT−DNAプラスミドは、例えば、ダイズ形質転換のために用いることができる。同定遺伝子は、同定遺伝子によって提供される表現型に基づいてマーカー遺伝子なしに種子の選択に用いる。

0106

実施例10
同定配列としてのspLA遺伝子の使用
バイナリーベクターpMON68581(図19)は、同一のT−DNA上に選択可能なマーカーとしてのCP4植物発現可能なカセットと一緒に、ダイズ7Sアルファプロモーターによって駆動されるsplA(アグロバクテリウム・ツメファシエンスからのスクロースホスホリアーゼ;GenBank受理番号AE009432)を含む。splA遺伝子の種子特異的発現は、遺伝子を含まない正常な種子から簡単に区別し得る収縮した種子を生じる(図20)。構築物は同定配列として直接的に使用することができ、かかる同定配列および選択可能なマーカーを含むT−DNAは、関心のある遺伝子を含むT−DNAを含む第2の構築物と、各々これらの構築物のうちの1を含む2のアグロバクテリウム菌株を混合し、植物細胞を混合した細菌培養物で形質転換することによって、同時形質転換し得る。splA発現カセットは当業者に知られているルーチンのクローニング法によって、2のT−DNAベクターに容易にサブクローニングすることもでき、ここに1のT−DNAは同定配列としてのsplAおよびマーカー遺伝子を含み、もう1のT−DNAは関心のある遺伝子を含む。ついで、2のT−DNAプラスミドは、例えばダイズ形質転換のために用いることができる。同定配列は、同定配列によって提供される表現型に基づいて選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子なしに、種子選択に用いる。

0107

実施例11
マーカーフリー・トウモロコシ種子の作製における幾つかの同定配列の使用
複数の2のT−DNA植物発現ベクターを構築した。各々の構築物において、第1のT−DNAセグメントは関心のある核酸の例として植物で発現可能なuidAトランスジーンを含み、第2のT−DNAセグメントは選択可能なマーカーとしての植物で発現可能なCP4EPSPSトランスジーンおよび下記の表に示す同定配列からなる。単子葉植物における発現用に設計されたcrtBの配列は、当該技術分野で知られている方法によって調製した(例えば、配列番号:2、配列番号:3に見出されるコドン最適化によって)。pMON68412は配列番号:3を含む。第1のT−DNAは右側および左側ボーダーによって挟まれる一方で第2のT−DNAはベクター骨格に位置し、2のT−DNA形式はタンデム形式として一般的に知られている(Huangら, 2005)。トウモロコシ組織は、当該技術分野で知られている方法によって各々の構築物で別々に形質転換した。各同定遺伝子を用いた予想される表現型を下記の表2に示す。内胚乳中での同定配列の発現のための別のプロモーターには、イネからのグルテリン1プロモーター、トウモロコシからのwaxyプロモーター、およびトウモロコシからのbrittle2プロモーターが含まれる。

0108

0109

本明細書に開示し、特許請求するすべての組成物および方法は、本願明細書の開示に鑑みて過度な実験なしに作製および実施することができる。本発明の組成物および方法を前記の形態および例示的な実施例の観点から記載したが、当業者であれば、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、変形、変化、修飾および改変を本明細書に記載した組成物、方法ならびに本明細書に記載した方法の工程または一連の工程に適用し得ることが明らかであろう。より具体的には、同一または同様の結果を達成しつつ、両方が化学的および物理学的に関連するある種の因子を、本明細書に記載した因子に代えて用い得ることは明らかであろう。当業者に対して明らかなすべてのかかる同様の置換および変形は、添付する特許請求の範囲によって規定される本発明の意図、範囲および概念の中にあるとみなされる。

実施例

0110

参照
以下の参照文献は、それらが本明細書に記載したものについての例示的方法または本命支所に記載するものの他の詳細な補足を提供する程度において、参照することによって本願明細書に特異的に取り込まれる。
米国特許第4,940,835号; 米国特許第4,940,838号; 米国特許第4,946,046号; 米国特許第4,971,908号; 米国特許第5,015,580号; 米国特許第5,145,783号; 米国特許第5,188,642号; 米国特許第5,302,523号; 米国特許第5,310,667号; 米国特許第5,362,865号; 米国特許第5,384,253号; 米国特許第5,429,939号; 米国特許第5,464,763号; 米国特許第5,464,765号; 米国特許第5,508,184号; 米国特許第5,538,880号; 米国特許第5,545,816号; 米国特許第5,550,318号; 米国特許第5,563,055号; 米国特許第5,591,616号; 米国特許第5,633,435号; 米国特許第5,693,512号; 米国特許第5,731,179号; 米国特許第5,824,877号; 米国特許第5,859,347号; 米国特許第5,981,840号; 米国特許第6,160,208号; 米国特許第6,307,123号; 米国特許第6,326,527号; 米国特許第6,384,301号; 米国特許第6,399,861号; 米国特許第6,403,865号; 米国特許第6,429,356号; 米国特許第6,433,252号; 米国特許第6,458,594号; 米国特許第6,583,338号; 米国特許第6,803,501号; 米国特許第6,825,398号; 米国特許第7,078,588号; 米国特許第7,119,187号; 米国特許第7,151,204号。
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