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図面 (20)

課題

細胞培養による組換え型高分子量vWF産生方法の提供。

解決手段

本発明は、いくつかの態様の中で特に、高比活性を有する高分子量vWF、特に、高次多量体WFおよび高比活性を有するADAMTS13の産生のための細胞培養条件に関する。本発明の細胞培養条件には、例えば、増加した銅濃度および/または低アンモニウム(NH4+)濃度の細胞培養上清を有する細胞培地を含むことができる。本発明は、また、高分子量vWFおよび高い比活性のrA13を発現する細胞培養条件下で細胞を培養する方法を提供する。

概要

背景

発明の背景
真核細胞培養、さらに具体的には、哺乳動物細胞培養を含む、細胞培養(特に、大規模細胞培養)を使った治療用タンパク質組み換え体発現では、効率的細胞増殖のための栄養物質を与える特殊な培地の使用が必要である。細胞培地配合に対し、ウシ胎仔血清FCS)、動物由来タンパク質および/またはウシ由来タンパク質加水分解物、ならびに植物または酵母由来タンパク質加水分解物を含む一連添加物の補充がよく行われる。このような培養の1つの課題は、細胞培地の配合が変化しない場合でも、産生されたタンパク質の量ならびにタンパク質の全活性および比活性が、異なる細胞培養間で変化することが多いということである。この変動は、特に、10L〜20,000Lを越える容量の細胞培養を利用した大規模製造プロセスの場合は特に顕著である。加水分解物を含む細胞培地は、特に、細胞培養毎に変動する傾向があり、総タンパク質産生量の低下、ならびに全活性および比活性の低下の原因となる。

異なる細胞培養間で見られる変動に対する1つの可能な理由は、加水分解物等の添加物中の混入物バッチ毎に変化しているということである。一般的に、血清または血清由来物質、例えば、アルブミントランスフェリンまたはインスリンは、細胞培養およびそれから得られる生物学的産物汚染する可能性のある望ましくない薬剤を含むことがある。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清を介して感染しうる肝炎ウイルスおよびHIV等の全ての既知ウイルスに関して、試験しなければならない。さらに、ウシ血清およびそれ由来産物は、BSE汚染のリスクがある。さらに、全ての血清由来産物は、未知物質に汚染されている可能性がある。ヒトまたは動物ソース由来の血清またはタンパク質添加物を細胞培養に使用する場合、特に、細胞がヒト投与用薬剤またはワクチン剤の製造に使われる場合、多くの問題(例えば、異なるバッチ組成物間の品質変動およびマイコプラズマ、ウイルスまたはBSEの感染のリスク)がある。このため、血清や他の動物タンパク質化合物を必要としない効率的な宿主系および培養条件を提供することを目的として、多くの試みがなされてきた。

このような無血清培地は、植物または酵母由来タンパク質抽出物ベースに開発されてきた。例えば、大豆加水分解物発酵プロセスに有用であることが知られており、多くの選好性生物酵母および真菌の増殖を高めることができる。特許文献1には、大豆ミールパパイン消化は、炭水化物窒素の源であり、多くの成分が組織培養に使用できることが記載されている。非特許文献1は、特定の大豆およびコムギ加水分解物ペプチド画分の増殖および生産性促進効果について記載している。

特許文献2には、脊椎動物細胞増殖およびウイルス産生プロセス用の合成基本培地および酵母抽出物から構成される無血清培地が開示されている。特許文献3には、コメペプチドならびに酵母抽出物およびその酵素消化物、および/または動物細胞増殖用植物脂質を含む基本細胞培地から構成される培地配合物が開示されている。組換え型細胞培養用の精製大豆加水分解物を含む培地が、特許文献4で開示されている。特許文献5には、大豆加水分解物および酵母抽出物を含む培地が開示されているが、組換え型の動物タンパク質、例えば、増殖因子の存在も必要である。

特許文献6には、操作CHO細胞培養用の生物合成培地が記載されており、これは、動物ソースから単離されたタンパク質、脂質および炭水化物を含まず、組換え型インスリンまたはインスリン類似体、1%〜0.025%w/vのパパイン消化大豆ペプトンおよびプトレシンを含む。特許文献7には、加水分解大豆ペプチド(1〜1000mg/L)、0.01〜1mg/Lプトレシンおよびアルブミン、フェチュイン、種々のホルモンおよび他のタンパク質等の種々の動物由来成分を含む無血清真核細胞培養液が記載されている。これに関連して、プトレシンも0.08mg/Lの濃度でDMEMハムF12のような標準的培地中に含まれていることが知られていることに留意されたい。

しかし、植物および/または酵母加水分解物は、オリゴペプチドおよび他の未知成分ならびに汚染物からなる不確定の混合物である。しかも、市販の加水分解物のロット品質は、極端にばらついている。結果として、使用される加水分解物のロットに応じて(「ロット間変動」)、組換え型タンパク質の産生またはウイルス性産物に大きな変動(3つの因子までの変動)が生ずる。この欠点が、細胞の増殖、ならびに各細胞のタンパク質発現に影響を与える。特許文献8には、組換え型タンパク質バイオ医薬品の大規模産生に有用な種々の動物タンパク質不含およびオリゴペプチド不含の、合成培地が記載されている。

止血は、最終的に血栓形成の原因となる種々の止血反応経路相互作用を伴う。血栓は、血管壁の表面上の血液成分の沈着物であり、これは、主に凝集血小板および不溶性架橋フィブリンから構成されている。フィブリン形成は、凝固酵素であるトロンビンによるフィブリノゲンの限定されたタンパク質分解の結果である。トロンビンは、活性化した血小板および白血球ならびに種々の血管細胞表面上で起こる連続した酵素前駆体活性化である凝固カスケード最終生成物である(概説は、非特許文献2、を参照)。

凝固カスケードの重要な機能は、活性化された第IX因子(第IXa因子)と活性化された第VIII因子(第VIIIa因子)の複合体による第X因子の活性化にある。この複合体の成分の欠損または機能不全は、血友病として既知の血液疾患に関連している(G.Stamatoyannopoulos et al.、(Eds.):血液疾患の分子基盤(The molecular basis of blood diseases)、W.B.Saunders Co.、Philadelphia、1987、pp.576−602、中のJ.E.Sadler & E.W.Davie:血友病A血友病B、およびフォン・ヴィレブランド病(Hemophilia A、Hemophilia B、and von Willebrand’s Disease))。血友病Aは、第III因子活性の欠損に関係し、一方、血友病Bは、第IX因子欠損に関係している。現在の治療は、正常な凝集因子からなる製剤を使った補充療法で構成される。これらの血小板障害の内で、血友病Aは、発生が他より多く、10,000人に約1人が罹患する。血友病A患者の補充療法は、正常な第VIII因子を含む製剤の静脈内注入による反復投与を伴う。注入間隔は、血液循環中の第VIII因子活性の低下の関数である。注入後の第VIII因子活性の半減期は、各個人毎に異なり、10〜30時間の範囲である。従って、予防的治療では、2〜3日毎に注入が必要となる。これは、静脈内注入のための高頻度穿刺後の局所抗凝血化(citratization)により静脈注入が困難になった場合は特に、血友病患者の生活にとって重荷になる。

延長された半減期を有する第VIII因子を使って、注入頻度が少なくなることがあれば、特に好都合となるであろう。非活性化した第VIII因子ヘテロダイマーの半減期は、フォン・ヴィレブランド因子の存在に強く依存することは当技術分野でよく知られている。フォン・ヴィレブランド因子は、第VIII因子(第VIIIa因子ではなく)に対し高い親和性を示し、キャリアタンパク質としての役目をする(G.Stamatoyannopoulos et al.、(Eds.):血液疾患の分子的基盤(The molecular basis of blood diseases)、W.B.Saunders Co.、Philadelphia、1987、pp.576−602、中のJ.E.Sadler & E.W.Davie:血友病A、血友病B、およびフォン・ヴィレブランド病(Hemophilia A、Hemophilia B、and von Willebrand’s Disease))。3型フォン・ヴィレブランド病の患者は血液循環中に検出可能なフォン・ヴィレブランド因子を持たず、さらに、第VIII因子も持たず、2つ目の欠損となっていることが知られている。さらに、これらの患者における静脈内投与第VIII因子の半減期は、2〜4時間であり、血友病A患者の10〜30時間に比べてかなり短い。これらの知見から、第VIII因子が血液循環から急速クリアランスの傾向があり、このプロセスは、天然キャリア:フォン・ヴィレブランド因子との複合体形成によりある程度抑制されるということが結論づけられる。

フォン・ヴィレブランド因子(vWF)は、血漿中にあって一連の多量体として循環する糖タンパク質であり、通常、約500〜20,000kDの大きさ(またはvWFの2〜40二量体)の範囲である。vWFの二量体と多量体型は、ジスルフィド結合により一緒に連結された250kDポリペプチドサブユニットからなる。vWFは、傷害性血管壁の内皮下層への初期血小板接着を媒介する;より大きな多量体のみが止血活性を示す。多量体化VWFは、VWFのA1ドメイン中の相互作用により、血小板表面糖タンパク質Gp1bαに結合し、血小板接着を促進する。内皮細胞が、大きな多多量体型vWFを分泌し、低分子量を有するvWF型(低分子量vWF)は、タンパク分解による切断から生ずると考えられている。大きな分子質量の多量体は、内皮細胞のワイベルパラード小体中に貯蔵され、刺激により放出される。

vWFタンパク質レベルまたは低下したFVIII結合親和性によるFVIII結合活性の減少は、3つの型のフォン・ヴィレブランド病の内の1つをもたらす。さらに、または代わりに、特定の型のフォン・ヴィレブランド病は、Gp1bα媒介血小板結合レベルの増加または減少、すなわち、2A、2B、および2M型を特徴とする(総説:Castaman et al.、Disorders of Hemostasis 88(1):94−108(2003))。従って、vWFとFVIIIおよびGp1bαとの相互作用の調節は、血友病とフォン・ヴィレブランド病の両方の治療に対し実現可能な戦略である。

vWFの生物学的重要性を考えれば、当技術分野において、治療への応用のためのvWF産生方法の改善に対する引き続くニーズが存在する。vWFが、内在ソース、例えば、ヒト血漿から単離できることはよく知られている。単離vWFは、その生物学的機能の実行のための高比活性を有し、従って、フォン・ヴィレブランド病等の関連疾患の治療のための治療用タンパク質として効果的に使用できるという点で有利である。通常、血漿vWFは、約100mU/μgの特異的リストセチン活性を有するが、ヒト血漿からの単離には、不都合がある。理由は、例えば、血漿は種々のウイルス、例えば、HIVおよび/または肝炎ウイルスを含む可能性があり、これが患者に感染する可能性があるからである。さらに、血漿は、限定的リソースであり、従って、血漿の不足が、治療用vWFの充分な供給の点で問題となり得る。従って、vWF産生のための組換え法は、vWFのソースとしての血漿依存に関連する問題の一部に対処できる点で、有利である。組換え型産生のために、vWFの完全長cDNAクローン化した。プロポリペプチドは、完全長プレプロvWFのアミノ酸残基23〜764に対応する(Eikenboom et al(1995)Haemophilia 1、7790)。

残念ながら、vWFは、複雑な翻訳後修飾を伴った分子である。また、ゴルジ体中でのvWF二量体の大きな、さらに超大型多量体への多量体化は、哺乳動物細胞中での発現にとって問題である。例えば、ヒト初代内皮細胞等の細胞培養中に発現した高分子量vWFは、ワイベル・パラード小体中での超大型vWF分子の特異的貯蔵に依存する。このような細胞培養は、治療用タンパク質の産生に適さない。他の細胞培養法が報告されており、種々の方法において、細胞培養条件がvWF産生に影響する可能性があることが知られている、例えば、高濃度アンモニウム(NH4+)は、翻訳後修飾を妨害することが示されている。Mayadas et al.(J.Biol.Chem.、264(23):13497−13503、1989)は、25mMアンモニウムのレベルで、内皮細胞中でのvWF多量体化が減少し、これがさらに、組換え型vWF特異的リストセチン活性に悪影響することを示した。多量体化の減少は、通常、組換え型vWFの活性の減少、特に、特異的リストセチン活性に関連する。

いまでも、どのパラメータが、特定のタンパク質の産生、特に、第VIII因子とvWF等の複合体糖タンパク質の産生に対し正や負に影響するのかを予測するのは困難なままである。例えば、特定の成分の細胞培地が第VIII因子の産生に影響することが示されている。米国特許第5,804,420号で開示されているように、ポリオール、銅、および他の痕跡の金属の添加は、第VIII因子の産生収率に対し、正に影響を与える可能性がある。さらに国際公開第2009/086309号で記載されているように、銅を使った細胞培養プロセスが、第VIII因子の産生を改善することが示されている。また、組換え型CHO細胞中のvWFの発現が、Mignot et al.(1989)により報告されている。しかし、これらの例のいずれも、vWFの比活性またはその多量体分布に関する情報を提供していない。

ADAMTSトロンボスポンジンI型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motifs))タンパク質は、メタロプロテイナーゼファミリーであり、亜鉛依存触媒ドメインシスティンリッチドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、および少なくとも1つの、大抵の場合複数のトロンボスポンジンI型反復、等のいくつかの保存ドメインを含む(概説に関しては、Nicholson et al.、BMCEvol Biol.2005
Feb 4;5(1):11、を参照)。メタロプロテイナーゼのADAMおよびMMPファミリーに進化的に関連しているこれらのタンパク質(JonesGC、Curr
Pharm Biotechnol.2006 Feb;7(1):25−31)は、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)(Moake JL、Semin Hematol.2004Jan;41(1):4−14)、結合組織障害、癌、炎症(Nicholson et al.)、および重篤熱帯熱マラリア原虫マラリア(Larkin et
al.、PLoS Pathog.2009 Mar;5(3):e1000349)等の、いくつかの疾患と状態に連関している分泌酵素である。これらの関連性から、ADAMTS酵素は、いくつかの病理に対する有望な治療の標的と認識されてきた(Jones GC、Curr Pharm Biotechnol.2006 Feb;7(1):25−31)。従って、高比活性を有する、ウイルス、BSE、および病原体用マイコプラズマ細菌、等の汚染物質を含まないADAMTSタンパク質の高収率産生法が必要とされている。

1つのADAMTSファミリーメンバーのADAMTS13は、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)を残基Tyr1605とMet1606の間で切断し、大きなvWF多量体のインビボ分解に関与する機能を有する。ADAMTS13活性の減少は、いくつかの状態、例えば、TTP(Moake JL、Semin Hematol.2004 Jan;41(1):4−14)、急性および慢性炎症(Chauhan et al.、J Exp Med.2008 Sep 1;205(9):2065−74)、ならびに、ごく最近では、重篤な熱帯熱マラリア原虫マラリア(Larkin et al.、PLoS Pathog.2009 Mar;5(3):e1000349)に結びつけられている。

ADAMTS13プロテアーゼは、主に肝臓で産生される190kDaのグリコシル化タンパク質である(Levy et al.、Nature.2001;413:488−494;Fujikawa et al.、Blood.2001;98:1662−1666;Zheng et al.、J Biol Chem.2001;276:41059−41063;Soejima et al.、J Biochem(Tokyo).2001;130:475−480;およびGerritsen et al.、Blood.2001;98:1654−1661)。高次rVWF多量体に酷似して、哺乳動物細胞培養での大きなADAMTS13の組み換え体発現は、多くの問題を呈する。

従って、一貫した総タンパク質収率および/または異なる細胞培養間で産生されたタンパク質の一貫した全活性および比活性が得られる細胞培養条件、特に、大規模製造培養条件を提供する必要がある。大規模製造プロセスにおける培養間の一貫性は、治療用タンパク質の製造に重要である。また、正常なヒト血漿中に存在するVWFと同程度またはそれより優れた多量体分布および特異的リストセチン活性を有するrVWFの大規模産生用細胞培養条件の必要性もある。同様に、ADAMTSタンパク質は、いくつかの疾患と状態に関与しているので、医薬製剤および投与に適した高比活性を有する組換え型ADAMTSタンパク質の大規模生産方法に対し、当技術分野でのニーズがある。本発明は、当技術分野での組換え型フォン・ヴィレブランド因子および組換え型ADAMTS13の産生のための、これらおよび他のニーズに適合する。

概要

細胞培養による組換え型高分子量vWF産生方法の提供。本発明は、いくつかの態様の中で特に、高比活性を有する高分子量vWF、特に、高次多量体WFおよび高比活性を有するADAMTS13の産生のための細胞培養条件に関する。本発明の細胞培養条件には、例えば、増加した銅濃度および/または低アンモニウム(NH4+)濃度の細胞培養上清を有する細胞培地を含むことができる。本発明は、また、高分子量vWFおよび高い比活性のrA13を発現する細胞培養条件下で細胞を培養する方法を提供する。A

目的

このため、血清や他の動物タンパク質化合物を必要としない効率的な宿主系および培養条件を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

明細書に記載された発明。

技術分野

0001

出願の相互参照
本出願は、2010年7月8日出願の米国特許仮出願第61/362,635号の優先権を主張する。本開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

発明の背景
真核細胞培養、さらに具体的には、哺乳動物細胞培養を含む、細胞培養(特に、大規模細胞培養)を使った治療用タンパク質組み換え体発現では、効率的細胞増殖のための栄養物質を与える特殊な培地の使用が必要である。細胞培地配合に対し、ウシ胎仔血清FCS)、動物由来タンパク質および/またはウシ由来タンパク質加水分解物、ならびに植物または酵母由来タンパク質加水分解物を含む一連添加物の補充がよく行われる。このような培養の1つの課題は、細胞培地の配合が変化しない場合でも、産生されたタンパク質の量ならびにタンパク質の全活性および比活性が、異なる細胞培養間で変化することが多いということである。この変動は、特に、10L〜20,000Lを越える容量の細胞培養を利用した大規模製造プロセスの場合は特に顕著である。加水分解物を含む細胞培地は、特に、細胞培養毎に変動する傾向があり、総タンパク質産生量の低下、ならびに全活性および比活性の低下の原因となる。

0003

異なる細胞培養間で見られる変動に対する1つの可能な理由は、加水分解物等の添加物中の混入物バッチ毎に変化しているということである。一般的に、血清または血清由来物質、例えば、アルブミントランスフェリンまたはインスリンは、細胞培養およびそれから得られる生物学的産物汚染する可能性のある望ましくない薬剤を含むことがある。さらに、ヒト血清由来添加物は、血清を介して感染しうる肝炎ウイルスおよびHIV等の全ての既知ウイルスに関して、試験しなければならない。さらに、ウシ血清およびそれ由来産物は、BSE汚染のリスクがある。さらに、全ての血清由来産物は、未知物質に汚染されている可能性がある。ヒトまたは動物ソース由来の血清またはタンパク質添加物を細胞培養に使用する場合、特に、細胞がヒト投与用薬剤またはワクチン剤の製造に使われる場合、多くの問題(例えば、異なるバッチ組成物間の品質変動およびマイコプラズマ、ウイルスまたはBSEの感染のリスク)がある。このため、血清や他の動物タンパク質化合物を必要としない効率的な宿主系および培養条件を提供することを目的として、多くの試みがなされてきた。

0004

このような無血清培地は、植物または酵母由来タンパク質抽出物ベースに開発されてきた。例えば、大豆加水分解物発酵プロセスに有用であることが知られており、多くの選好性生物酵母および真菌の増殖を高めることができる。特許文献1には、大豆ミールパパイン消化は、炭水化物窒素の源であり、多くの成分が組織培養に使用できることが記載されている。非特許文献1は、特定の大豆およびコムギ加水分解物ペプチド画分の増殖および生産性促進効果について記載している。

0005

特許文献2には、脊椎動物細胞増殖およびウイルス産生プロセス用の合成基本培地および酵母抽出物から構成される無血清培地が開示されている。特許文献3には、コメペプチドならびに酵母抽出物およびその酵素消化物、および/または動物細胞増殖用植物脂質を含む基本細胞培地から構成される培地配合物が開示されている。組換え型細胞培養用の精製大豆加水分解物を含む培地が、特許文献4で開示されている。特許文献5には、大豆加水分解物および酵母抽出物を含む培地が開示されているが、組換え型の動物タンパク質、例えば、増殖因子の存在も必要である。

0006

特許文献6には、操作CHO細胞培養用の生物合成培地が記載されており、これは、動物ソースから単離されたタンパク質、脂質および炭水化物を含まず、組換え型インスリンまたはインスリン類似体、1%〜0.025%w/vのパパイン消化大豆ペプトンおよびプトレシンを含む。特許文献7には、加水分解大豆ペプチド(1〜1000mg/L)、0.01〜1mg/Lプトレシンおよびアルブミン、フェチュイン、種々のホルモンおよび他のタンパク質等の種々の動物由来成分を含む無血清真核細胞培養液が記載されている。これに関連して、プトレシンも0.08mg/Lの濃度でDMEMハムF12のような標準的培地中に含まれていることが知られていることに留意されたい。

0007

しかし、植物および/または酵母加水分解物は、オリゴペプチドおよび他の未知成分ならびに汚染物からなる不確定の混合物である。しかも、市販の加水分解物のロット品質は、極端にばらついている。結果として、使用される加水分解物のロットに応じて(「ロット間変動」)、組換え型タンパク質の産生またはウイルス性産物に大きな変動(3つの因子までの変動)が生ずる。この欠点が、細胞の増殖、ならびに各細胞のタンパク質発現に影響を与える。特許文献8には、組換え型タンパク質バイオ医薬品の大規模産生に有用な種々の動物タンパク質不含およびオリゴペプチド不含の、合成培地が記載されている。

0008

止血は、最終的に血栓形成の原因となる種々の止血反応経路相互作用を伴う。血栓は、血管壁の表面上の血液成分の沈着物であり、これは、主に凝集血小板および不溶性架橋フィブリンから構成されている。フィブリン形成は、凝固酵素であるトロンビンによるフィブリノゲンの限定されたタンパク質分解の結果である。トロンビンは、活性化した血小板および白血球ならびに種々の血管細胞表面上で起こる連続した酵素前駆体活性化である凝固カスケード最終生成物である(概説は、非特許文献2、を参照)。

0009

凝固カスケードの重要な機能は、活性化された第IX因子(第IXa因子)と活性化された第VIII因子(第VIIIa因子)の複合体による第X因子の活性化にある。この複合体の成分の欠損または機能不全は、血友病として既知の血液疾患に関連している(G.Stamatoyannopoulos et al.、(Eds.):血液疾患の分子基盤(The molecular basis of blood diseases)、W.B.Saunders Co.、Philadelphia、1987、pp.576−602、中のJ.E.Sadler & E.W.Davie:血友病A血友病B、およびフォン・ヴィレブランド病(Hemophilia A、Hemophilia B、and von Willebrand’s Disease))。血友病Aは、第III因子活性の欠損に関係し、一方、血友病Bは、第IX因子欠損に関係している。現在の治療は、正常な凝集因子からなる製剤を使った補充療法で構成される。これらの血小板障害の内で、血友病Aは、発生が他より多く、10,000人に約1人が罹患する。血友病A患者の補充療法は、正常な第VIII因子を含む製剤の静脈内注入による反復投与を伴う。注入間隔は、血液循環中の第VIII因子活性の低下の関数である。注入後の第VIII因子活性の半減期は、各個人毎に異なり、10〜30時間の範囲である。従って、予防的治療では、2〜3日毎に注入が必要となる。これは、静脈内注入のための高頻度穿刺後の局所抗凝血化(citratization)により静脈注入が困難になった場合は特に、血友病患者の生活にとって重荷になる。

0010

延長された半減期を有する第VIII因子を使って、注入頻度が少なくなることがあれば、特に好都合となるであろう。非活性化した第VIII因子ヘテロダイマーの半減期は、フォン・ヴィレブランド因子の存在に強く依存することは当技術分野でよく知られている。フォン・ヴィレブランド因子は、第VIII因子(第VIIIa因子ではなく)に対し高い親和性を示し、キャリアタンパク質としての役目をする(G.Stamatoyannopoulos et al.、(Eds.):血液疾患の分子的基盤(The molecular basis of blood diseases)、W.B.Saunders Co.、Philadelphia、1987、pp.576−602、中のJ.E.Sadler & E.W.Davie:血友病A、血友病B、およびフォン・ヴィレブランド病(Hemophilia A、Hemophilia B、and von Willebrand’s Disease))。3型フォン・ヴィレブランド病の患者は血液循環中に検出可能なフォン・ヴィレブランド因子を持たず、さらに、第VIII因子も持たず、2つ目の欠損となっていることが知られている。さらに、これらの患者における静脈内投与第VIII因子の半減期は、2〜4時間であり、血友病A患者の10〜30時間に比べてかなり短い。これらの知見から、第VIII因子が血液循環から急速クリアランスの傾向があり、このプロセスは、天然キャリア:フォン・ヴィレブランド因子との複合体形成によりある程度抑制されるということが結論づけられる。

0011

フォン・ヴィレブランド因子(vWF)は、血漿中にあって一連の多量体として循環する糖タンパク質であり、通常、約500〜20,000kDの大きさ(またはvWFの2〜40二量体)の範囲である。vWFの二量体と多量体型は、ジスルフィド結合により一緒に連結された250kDポリペプチドサブユニットからなる。vWFは、傷害性血管壁の内皮下層への初期血小板接着を媒介する;より大きな多量体のみが止血活性を示す。多量体化VWFは、VWFのA1ドメイン中の相互作用により、血小板表面糖タンパク質Gp1bαに結合し、血小板接着を促進する。内皮細胞が、大きな多多量体型vWFを分泌し、低分子量を有するvWF型(低分子量vWF)は、タンパク分解による切断から生ずると考えられている。大きな分子質量の多量体は、内皮細胞のワイベルパラード小体中に貯蔵され、刺激により放出される。

0012

vWFタンパク質レベルまたは低下したFVIII結合親和性によるFVIII結合活性の減少は、3つの型のフォン・ヴィレブランド病の内の1つをもたらす。さらに、または代わりに、特定の型のフォン・ヴィレブランド病は、Gp1bα媒介血小板結合レベルの増加または減少、すなわち、2A、2B、および2M型を特徴とする(総説:Castaman et al.、Disorders of Hemostasis 88(1):94−108(2003))。従って、vWFとFVIIIおよびGp1bαとの相互作用の調節は、血友病とフォン・ヴィレブランド病の両方の治療に対し実現可能な戦略である。

0013

vWFの生物学的重要性を考えれば、当技術分野において、治療への応用のためのvWF産生方法の改善に対する引き続くニーズが存在する。vWFが、内在ソース、例えば、ヒト血漿から単離できることはよく知られている。単離vWFは、その生物学的機能の実行のための高比活性を有し、従って、フォン・ヴィレブランド病等の関連疾患の治療のための治療用タンパク質として効果的に使用できるという点で有利である。通常、血漿vWFは、約100mU/μgの特異的リストセチン活性を有するが、ヒト血漿からの単離には、不都合がある。理由は、例えば、血漿は種々のウイルス、例えば、HIVおよび/または肝炎ウイルスを含む可能性があり、これが患者に感染する可能性があるからである。さらに、血漿は、限定的リソースであり、従って、血漿の不足が、治療用vWFの充分な供給の点で問題となり得る。従って、vWF産生のための組換え法は、vWFのソースとしての血漿依存に関連する問題の一部に対処できる点で、有利である。組換え型産生のために、vWFの完全長cDNAクローン化した。プロポリペプチドは、完全長プレプロvWFのアミノ酸残基23〜764に対応する(Eikenboom et al(1995)Haemophilia 1、7790)。

0014

残念ながら、vWFは、複雑な翻訳後修飾を伴った分子である。また、ゴルジ体中でのvWF二量体の大きな、さらに超大型多量体への多量体化は、哺乳動物細胞中での発現にとって問題である。例えば、ヒト初代内皮細胞等の細胞培養中に発現した高分子量vWFは、ワイベル・パラード小体中での超大型vWF分子の特異的貯蔵に依存する。このような細胞培養は、治療用タンパク質の産生に適さない。他の細胞培養法が報告されており、種々の方法において、細胞培養条件がvWF産生に影響する可能性があることが知られている、例えば、高濃度アンモニウム(NH4+)は、翻訳後修飾を妨害することが示されている。Mayadas et al.(J.Biol.Chem.、264(23):13497−13503、1989)は、25mMアンモニウムのレベルで、内皮細胞中でのvWF多量体化が減少し、これがさらに、組換え型vWF特異的リストセチン活性に悪影響することを示した。多量体化の減少は、通常、組換え型vWFの活性の減少、特に、特異的リストセチン活性に関連する。

0015

いまでも、どのパラメータが、特定のタンパク質の産生、特に、第VIII因子とvWF等の複合体糖タンパク質の産生に対し正や負に影響するのかを予測するのは困難なままである。例えば、特定の成分の細胞培地が第VIII因子の産生に影響することが示されている。米国特許第5,804,420号で開示されているように、ポリオール、銅、および他の痕跡の金属の添加は、第VIII因子の産生収率に対し、正に影響を与える可能性がある。さらに国際公開第2009/086309号で記載されているように、銅を使った細胞培養プロセスが、第VIII因子の産生を改善することが示されている。また、組換え型CHO細胞中のvWFの発現が、Mignot et al.(1989)により報告されている。しかし、これらの例のいずれも、vWFの比活性またはその多量体分布に関する情報を提供していない。

0016

ADAMTSトロンボスポンジンI型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin type I motifs))タンパク質は、メタロプロテイナーゼファミリーであり、亜鉛依存触媒ドメインシスティンリッチドメイン、ディスインテグリン様ドメイン、および少なくとも1つの、大抵の場合複数のトロンボスポンジンI型反復、等のいくつかの保存ドメインを含む(概説に関しては、Nicholson et al.、BMCEvol Biol.2005
Feb 4;5(1):11、を参照)。メタロプロテイナーゼのADAMおよびMMPファミリーに進化的に関連しているこれらのタンパク質(JonesGC、Curr
Pharm Biotechnol.2006 Feb;7(1):25−31)は、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)(Moake JL、Semin Hematol.2004Jan;41(1):4−14)、結合組織障害、癌、炎症(Nicholson et al.)、および重篤熱帯熱マラリア原虫マラリア(Larkin et
al.、PLoS Pathog.2009 Mar;5(3):e1000349)等の、いくつかの疾患と状態に連関している分泌酵素である。これらの関連性から、ADAMTS酵素は、いくつかの病理に対する有望な治療の標的と認識されてきた(Jones GC、Curr Pharm Biotechnol.2006 Feb;7(1):25−31)。従って、高比活性を有する、ウイルス、BSE、および病原体用マイコプラズマ細菌、等の汚染物質を含まないADAMTSタンパク質の高収率産生法が必要とされている。

0017

1つのADAMTSファミリーメンバーのADAMTS13は、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)を残基Tyr1605とMet1606の間で切断し、大きなvWF多量体のインビボ分解に関与する機能を有する。ADAMTS13活性の減少は、いくつかの状態、例えば、TTP(Moake JL、Semin Hematol.2004 Jan;41(1):4−14)、急性および慢性炎症(Chauhan et al.、J Exp Med.2008 Sep 1;205(9):2065−74)、ならびに、ごく最近では、重篤な熱帯熱マラリア原虫マラリア(Larkin et al.、PLoS Pathog.2009 Mar;5(3):e1000349)に結びつけられている。

0018

ADAMTS13プロテアーゼは、主に肝臓で産生される190kDaのグリコシル化タンパク質である(Levy et al.、Nature.2001;413:488−494;Fujikawa et al.、Blood.2001;98:1662−1666;Zheng et al.、J Biol Chem.2001;276:41059−41063;Soejima et al.、J Biochem(Tokyo).2001;130:475−480;およびGerritsen et al.、Blood.2001;98:1654−1661)。高次rVWF多量体に酷似して、哺乳動物細胞培養での大きなADAMTS13の組み換え体発現は、多くの問題を呈する。

0019

従って、一貫した総タンパク質収率および/または異なる細胞培養間で産生されたタンパク質の一貫した全活性および比活性が得られる細胞培養条件、特に、大規模製造培養条件を提供する必要がある。大規模製造プロセスにおける培養間の一貫性は、治療用タンパク質の製造に重要である。また、正常なヒト血漿中に存在するVWFと同程度またはそれより優れた多量体分布および特異的リストセチン活性を有するrVWFの大規模産生用細胞培養条件の必要性もある。同様に、ADAMTSタンパク質は、いくつかの疾患と状態に関与しているので、医薬製剤および投与に適した高比活性を有する組換え型ADAMTSタンパク質の大規模生産方法に対し、当技術分野でのニーズがある。本発明は、当技術分野での組換え型フォン・ヴィレブランド因子および組換え型ADAMTS13の産生のための、これらおよび他のニーズに適合する。

0020

国際公開第96/26266号
国際公開第96/15231号
国際公開第98/15614号
国際公開第01/23527号
国際公開第00/03000号
欧州特許出願公開第0481791号明細書
国際公開第98/08934号
米国特許出願公開第2007/0212770号明細書

先行技術

0021

Franek、等(Biotechnology Progress(2000)16、688−692)
K.G.Mann et al.、Blood、1990、Vol.76、pp.1−16

課題を解決するための手段

0022

特定の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)および組換え型ADAMTS13(rA13)の発現に使われる細胞培地の補充により、タンパク質発現および酵素活性の顕著な改善がもたらされるという意外な知見に基づいている。

0023

第1の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物を提供する方法を提供し、この方法は、(a)基本細胞培地を用意するステップ;(b)基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも2.4μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;(c)rVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;(d)銅を補充した細胞培地中で、1つまたは複数の細胞を培養し、rVWFを発現させ、細胞から培養液上清排泄させるステップ;および(e)少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収上清が少なくとも30mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0024

上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、1つまたは複数の細胞の培養の前に、基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む。

0025

上記で提供される方法の一実施形態では、加水分解物は、植物加水分解物である。具体的な実施形態では、加水分解物は、大豆加水分解物である。

0026

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、動物タンパク質を含まない培地である。

0027

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、タンパク質を含まない培地である。

0028

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、合成培地である。

0029

上記で提供される方法の一実施形態では、銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも4μg/L 銅である。

0030

上記で提供される方法の一実施形態では、銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、2.4μg/L〜20μg/L 銅である。

0031

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地に補充する銅は、銅塩銅キレート、またはそれらの組み合わせとして提供される。

0032

上記で提供される方法の一実施形態では、銅塩は、硫酸銅酢酸銅炭酸銅塩化銅水酸化銅硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。

0033

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞は、CHO細胞である。

0034

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は、前記細胞のバッチ培養を含む。

0035

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は、細胞の連続培養を含む。具体的な実施形態では、細胞の連続培養はケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、細胞の連続培養は灌流方式で行われる。

0036

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞が、少なくとも100Lの補充した基本細胞培地中で培養される。

0037

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞培養ステップの間、2.5x106細胞/mL未満に維持される。

0038

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞培養ステップの間、2.0x106細胞/mL未満に維持される。

0039

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞培養ステップの間、1.5x106細胞/mL未満に維持される。

0040

上記で提供される方法の一実施形態では、少なくとも一部の培養液上清の回収ステップは、濾過または遠心分離して一部の培養液上清から細胞を取り出すことを含む。

0041

上記で提供される方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも40mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらなる具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも60mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらなる具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。またさらに具体的な実施形態では、回収上清は、少なくとも80mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0042

上記で提供される方法の一実施形態では、上清中の少なくとも10%のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。具体的な実施形態では、少なくとも15%のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも20%のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも25%のrVWFが、10超の二量体超の高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、少なくとも30%のrVWFが、10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。

0043

上記で提供される方法の一実施形態では、上清は、14〜22二量体の高分子量VWF多量体を含む。

0044

上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4+含量は、10mM未満の濃度に維持される。

0045

上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4+含量は、4mM未満の濃度に維持される。

0046

上記で提供される方法の一実施形態では、rVWFは、組換え型第VIII因子(rFVIII)と同時発現する。具体的な実施形態では、方法は、回収上清中に存在する少なくとも50%のrFVIIIから分離してrVWFを精製するステップをさらに含む。一実施形態では、精製ステップ後のrVWFのrFVIIIに対する比率は、少なくとも10:1である。

0047

上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、rVWF濃縮ステップをさらに含む。

0048

第2の態様では、本発明は、本明細書で提供される方法により調製された組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物を提供する。

0049

上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、組換え型第VIII因子(rFVIII)をさらに含む。具体的な実施形態では、rVWFのrFVIIIに対する比率は、少なくとも10:1である。

0050

上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与の目的で処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内投与の目的で処方される。

0051

第3の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清を提供し、この上清は、本明細書で提供される方法で調製される。

0052

第4の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清を提供し、上清中の少なくとも15%のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。具体的な実施形態では、上清中の少なくとも10%のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも20%のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも25%のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。別の具体的な実施形態では、上清中の少なくとも30%のrVWFが10超の二量体高分子量VWFマルチマーの形で存在する。さらに別の上記で提供される上清の具体的な実施形態では、上清は本明細書で提供される方法に従って調製される。

0053

第5の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清を提供し、上清は少なくとも0.4IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。具体的な実施形態では、上清は少なくとも0.5IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも0.6IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも0.7IUリストセチンコファクター活性/mLを含む。さらに別の上記で提供される上清の具体的な実施形態では、上清は本明細書で提供される方法に従って調製される。

0054

第6の態様では、本発明は、組換え型ADAMTS13(rA13)組成物を産生する方法を提供し、この方法は、(a)基本細胞培地を用意するステップ;(b)基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも1.0μg/L最終銅濃度とするステップ;(c)rA13タンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;(d)1つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養してrA13を発現させ、細胞から培養液上清中に排出させるステップ;および(e)少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収培養液上清中に、少なくとも1500ユニット/L補充基本細胞培地/日のFRETS−VWF73活性が存在する。

0055

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、動物タンパク質を含まない培地である。

0056

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、タンパク質を含まない培地である。

0057

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地は、合成培地である。

0058

上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも1μg/L 銅である。

0059

上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも2μg/L 銅である。

0060

上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、少なくとも4μg/L 銅である。

0061

上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、1μg/L〜6μg/L 銅である。

0062

上記で提供される方法の一実施形態では、補充した基本細胞培地の最終銅濃度は、2μg/L〜4μg/L 銅である。

0063

上記で提供される方法の一実施形態では、基本細胞培地を補充する銅は、銅塩、銅キレート、またはそれらの組み合わせとして提供される。具体的な実施形態では、銅塩は、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される。

0064

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞は、哺乳動物細胞である。具体的な実施形態では、哺乳動物細胞はCHO細胞である。

0065

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は細胞のバッチ培養を含む。

0066

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞の培養は、細胞の連続培養を含む。具体的な実施形態では、細胞の連続培養はケモスタット方式で行われる。別の具体的な実施形態では、細胞の連続培養は灌流方式で行われる。

0067

上記で提供される方法の一実施形態では、1つまたは複数の細胞が、少なくとも100Lの補充基本細胞培地中で培養される。

0068

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、4.0x106細胞/mL未満に維持される。

0069

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、3.5x106細胞/mL未満に維持される。

0070

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、3.0x106細胞/mL未満に維持される。

0071

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、2.5x106細胞/mL未満に維持される。

0072

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、2.0x106細胞/mL未満に維持される。

0073

上記で提供される方法の一実施形態では、細胞密度は、1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、1.5x106細胞/mL未満に維持される。

0074

上記で提供される方法の一実施形態では、少なくとも一部の培養液上清の回収ステップは、濾過または遠心分離して一部の培養液上清から細胞を取り出すことを含む。

0075

上記で提供される方法の一実施形態では、回収培養液上清中に、少なくとも2000ユニット/L補充した基本細胞培地/日のFRETS−VWF73活性が存在する。

0076

上記で提供される方法の一実施形態では、回収培養液上清中に、少なくとも2500ユニット/L補充した基本細胞培地/日のFRETS−VWF73活性が存在する。

0077

上記で提供される方法の一実施形態では、回収上清は、少なくとも800mU/μgのrA13特異的FRETS−VWF73活性を有する。

0078

上記で提供される方法の好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも1200mU/μgのrA13特異的FRETS−VWF73活性を有する。

0079

上記で提供される方法のまた他の実施形態では、回収上清は、少なくとも1600mU/μgのrA13特異的FRETS−VWF73活性を有する。

0080

上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4+含量は、10mM未満の濃度に維持される。

0081

上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4+含量は、5mM未満の濃度に維持される。

0082

上記で提供される方法の一実施形態では、培養液上清のNH4+含量は、4mM未満の濃度に維持される。

0083

上記で提供される方法の一実施形態では、方法は、rA13濃縮ステップをさらに含む。

0084

第7の態様では、本発明は、組換え型ADAMTS13(rA13)を含む細胞培養上清を提供し、上清は、本明細書で提供される方法で調製される。

0085

第8の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清を提供し、上清は、少なくとも5U FRETS−VWF73活性/mLを含む。具体的な実施形態では、上清は少なくとも6U FRETS−VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも7U FRETS−VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも8U FRETS−VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも9U FRETS−VWF73活性/mLを含む。別の具体的な実施形態では、上清は少なくとも10U FRETS−VWF73活性/mLを含む。上記に提供される上清のさらに別の具体的な実施形態では、上清は、本明細書で提供される方法に従って調製される。

0086

第9の態様では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清を提供し、上清は少なくとも2μg rA13/mLを含む。具体的実施形態では、上清は少なくとも3μg rA13/mLを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも4μg rA13/mLを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも5μgrA13/mLを含む。別の具体的実施形態では、上清は少なくとも6μg rA13/mLを含む。上記に提供される上清のさらに別の具体的な実施形態では、上清は、本明細書で提供される方法に従って調製される。

0087

第10の態様では、本発明は、上述の方法のいずれか1つの方法により調製される組換え型ADAMTS13(rA13)組成物を提供する。

0088

上記で提供される組成物の一実施形態では、組成物は、医薬品投与を目的として処方される。具体的な実施形態では、組成物は、静脈内投与を目的として処方される。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物を産生する方法であって、この方法は、
(a)基本細胞培地を用意するステップ;
(b)前記基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも2.4μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;
(c)rVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;
(d)1つまたは複数の細胞を銅補充した細胞培地中で培養し、rVWFを発現させ、これを前記細胞から培養液上清中へ排出させるステップ;および
(e)少なくとも一部の前記培養液上清を回収するステップ、
を含み、
前記回収上清が、少なくとも30mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する方法。
(項目2)
前記1つまたは複数の細胞の培養の前に、前記基本細胞培地に加水分解物を補充するステップをさらに含む項目1に記載の方法。
(項目3)
前記加水分解物が、植物加水分解物である項目2に記載の方法。
(項目4)
前記加水分解物が、大豆加水分解物である項目3に記載の方法。
(項目5)
前記基本細胞培地が、動物タンパク質不含培地である項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目6)
前記基本細胞培地が、タンパク質不含培地である項目1〜4のいずれか1項に記載の方法。
(項目7)
前記基本細胞培地が合成培地である項目1〜6のいずれか1項に記載の方法。
(項目8)
前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、少なくとも4μg/L銅である項目1〜7のいずれか1項に記載の方法。
(項目9)
前記銅補充した基本細胞培地の最終銅濃度が、2.4μg/L〜20μg/L銅である項目1〜8のいずれか1項に記載の方法。
(項目10)
前記基本細胞培地を補充する銅が、銅塩,銅キレート,またはこれらの組み合わせとして提供される項目1〜9のいずれか1項に記載の方法。
(項目11)
前記銅塩が、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅からなる群より選択される項目10に記載の方法。
(項目12)
前記1つまたは複数の細胞が、哺乳動物細胞である項目1〜11のいずれか1項に記載の方法。
(項目13)
前記哺乳動物細胞が、CHO細胞である項目12に記載の方法。
(項目14)
前記1つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞のバッチ培養を含む項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目15)
前記1つまたは複数の細胞の培養が、前記細胞の連続培養を含む項目1〜13のいずれか1項に記載の方法。
(項目16)
前記細胞の連続培養が、ケモスタット方式で行われる項目15に記載の方法。
(項目17)
前記細胞の連続培養が、灌流方式で行われる項目15に記載の方法。
(項目18)
前記1つまたは複数の細胞が、少なくとも100Lの前記補充基本細胞培地中で培養される項目1〜17のいずれか1項に記載の方法。
(項目19)
前記1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、細胞密度が2.5x106細胞/mL未満に維持される項目1〜18のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が2.0x106細胞/mL未満に維持される項目19に記載の方法。
(項目21)
前記1つまたは複数の細胞の培養ステップの間、前記細胞密度が1.5x106細胞/mL未満に維持される項目19に記載の方法。
(項目22)
少なくとも一部の前記培養液上清の回収ステップが、その一部の培養液上清から細胞を取り出すための濾過または遠心分離を含む項目1〜21のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記回収上清が、少なくとも40mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する項目1〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記回収上清が、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する項目23に記載の方法。
(項目25)
前記回収上清が、少なくとも60mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する項目23に記載の方法。
(項目26)
前記回収上清が、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する項目23に記載の方法。
(項目27)
前記回収上清が、少なくとも80mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する項目23に記載の方法。
(項目28)
前記上清中の少なくとも10%のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体に存在する項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目29)
前記上清中の少なくとも20%のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体に存在する項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目30)
前記上清中の少なくとも30%のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体に存在する項目1〜27のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記上清が、14〜22の二量体の高分子量VWF多量体を含む項目1〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記細胞培養液上清のNH4+含量が、10mM未満の濃度で維持されている項目1〜31のいずれか1項に記載の方法。
(項目33)
前記細胞培養上清のNH4+含量が、4mM未満の濃度で維持される項目32に記載の方法。
(項目34)
rVWFが、組換え型因子VIII(rFVIII)と同時発現する項目1〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記回収上清中に存在する少なくとも50%のrFVIIIからrVWFを精製するステップをさらに含む項目34に記載の方法。
(項目36)
前記精製ステップ後のrVWFのrFVIIIに対する比率が、少なくとも10:1である項目35に記載の方法。
(項目37)
rVWF富化ステップをさらに含む項目1〜36のいずれか1項に記載の方法。
(項目38)
項目1〜37のいずれか1項に記載の方法により調製される、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清。
(項目39)
組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清であって、少なくとも20%のrVWFが、10超の二量体の高分子量VWF多量体として存在する上清。
(項目40)
組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)を含む細胞培養上清であって、少なくとも0.5IUリストセチンコファクター活性/mLを含む上清。
(項目41)
項目1〜37のいずれか1項に記載の方法により調製される組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物。
(項目42)
組換え型因子VIII(rFVIII)をさらに含む項目41に記載の組成物。
(項目43)
rVWFのrFVIIIに対する比率が、少なくとも10:1である項目42に記載の組成物。
(項目44)
医薬品投与用に処方される項目42または43に記載の組成物。
(項目45)
静脈内投与用に処方される項目42〜44のいずれか1項に記載の組成物。

図面の簡単な説明

0089

(1A)実施例2に記載のように、低(1.0μg/L)および高(4.3μg/L)濃度の銅の存在下の哺乳動物細胞培養で発現したrVWFの低解像度(1%)アガロースゲル電気泳動の図である。培養3日目は、表7と表8のバッチ1日目に相当することに注意されたい。(1B)図1Aで明確化したバンドで示される1〜10二量体(バンド番号1)および10超の二量体(バンド番号2)を有するVWF多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
(1A)実施例2に記載のように、低(1.0μg/L)および高(4.3μg/L)濃度の銅の存在下の哺乳動物細胞培養で発現したrVWFの低解像度(1%)アガロースゲル電気泳動の図である。培養3日目は、表7と表8のバッチ1日目に相当することに注意されたい。(1B)図1Aで明確化したバンドで示される1〜10二量体(バンド番号1)および10超の二量体(バンド番号2)を有するVWF多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
(2A)高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたrVWF細胞培養上清の平均rVWF比活性のインターバルプロットである。(2B)高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたrVWF細胞培養上清中に認められた平均NH4+濃度のインターバルプロットである。
(2A)高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたrVWF細胞培養上清の平均rVWF比活性のインターバルプロットである。(2B)高または低レベルの銅の存在下、高および低細胞密度で増殖させたrVWF細胞培養上清中に認められた平均NH4+濃度のインターバルプロットである。
漸増レベルの銅の存在下、組換え型ADAMTS13を発現した細胞培養由来の上清のSDS−PAGE分析結果である。rA13は、銀染色(3A)および抗A13(3B)ウェスタンブロッティングによるSDS−PAGE後に可視化された。
漸増レベルの銅の存在下、組換え型ADAMTS13を発現した細胞培養由来の上清のSDS−PAGE分析結果である。rA13は、銀染色(3A)および抗A13(3B)ウェスタンブロッティングによるSDS−PAGE後に可視化された。
は、rA13生産性に対する最適銅濃度効果の外挿実線)を示す量的生産性(P Fret)データvs銅濃度のプロットである。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
基本レベルの銅(0.66μg/L)の効果を最終濃度の2μg/L銅に補充した培養液の効果と比較した、8週間の培養時間の間にrA13を発現した連続浮遊(ケモスタット)細胞培養の結果の棒グラフである。各バーは、1週間のケモスタット培養の平均データを示す。凡例は、データで示された特定の週を意味する。
(6A)実施例3に記載のように、低(1.0μg/L)および高(4.3μg/L)濃度の銅の存在下、高および低細胞密度の哺乳動物細胞培養で発現したrVWFの低解像度(1%)アガロースゲル電気泳動法測定結果である。8日目と17日目の培養(「CST8」と「CST17」)は、表10〜表13の8日目と17日目に同じであることに注意されたい。(6B)図6Aで明確化したバンドで示される1〜10二量体および10超の二量体を有するVWF多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。
(6A)実施例3に記載のように、低(1.0μg/L)および高(4.3μg/L)濃度の銅の存在下、高および低細胞密度の哺乳動物細胞培養で発現したrVWFの低解像度(1%)アガロースゲル電気泳動法測定結果である。8日目と17日目の培養(「CST8」と「CST17」)は、表10〜表13の8日目と17日目に同じであることに注意されたい。(6B)図6Aで明確化したバンドで示される1〜10二量体および10超の二量体を有するVWF多量体の相対量を、濃度分析により定量化したものである。

0090

発明の詳細な説明
I.緒言
組換え型vWF(rVWF)および組換え型ADAMTS13(rA13)は、大規模哺乳動物細胞培養における発現により産生出来る。しかし、標準的細胞培養条件を使って産生された場合、これらのタンパク質の活性は、全体の培地配合が変更されない場合でも、細胞培養間で変動することが多く、また、組換え型タンパク質の比活性は、血漿由来のvWFおよびrA13の比活性と同じでないことが多い。さらに、哺乳動物細胞培養で発現したrVWFは、低い(10%未満の)パーセンテージの高次多量体(高次多量体には、10超のVWF二量体を含む分子が含まれる)のタンパク質組成物を産生する傾向がある。rVWFおよびrA13の標準的産生方法のこれらの欠点は、大規模生産用の培養(すなわち、10〜20,000Lを越える培養)を開発する場合に、特に問題となる。

0091

異なる細胞培養バッチでよく見られる変動の1つの可能な原因は、細胞培地の成分中の混入物の存在である。これらの混入物は、異なるバッチ中に異なる量で存在する可能性があり、rVWFおよびrA13の産生において変動する原因となる。種々の細胞培地添加物中に認められる異なる混入物を調査後、本発明者等は、加水分解物の存在が細胞培地中の銅濃度の変動の原因であることを見出した。さらなる調査により、合計銅濃度を少なくとも約1μg/L〜約20μg/Lにするための細胞培地への銅濃度の補充により、常に、rVWFおよびrA13の全活性および比活性を増加させ、および/または、また、総タンパク質収率の増加に繋げることができるという意外な結果が得られた。従って、本発明は、高比活性を有するrVWFおよびrA13タンパク質の高収率生産のための方法と組成物を提供する。

0092

一態様では、本発明は、血漿由来vWF(pdVWF)または血漿由来ADAMTS13(pdA13)の活性と同等またはそれより高い活性を有するrVWFおよびrA13を大量生産する細胞培養方法および組成物を提供する。さらなる態様では、本発明に従い産生されたrVWFおよびrA13タンパク質は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を使った標準的細胞培養方法で産生されたタンパク質よりも、一貫して高い活性を示す。好都合にも、本明細書で提供される方法および組成物の特定の実施形態では、本発明に従って産生されたrVWFおよびrA13タンパク質は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を使った標準的細胞培養方法で産生されたタンパク質よりも、一貫して高い比活性(すなわち、U/mgタンパク質)を示す。同様に、本明細書でrVWFおよびrA13の産生用に提供される方法は、銅または本明細書でさらに詳細に記載される他の補充物で補充していない培地を利用した標準的細胞培養方法に比べて、より高い全活性/培養容量(すなわち、U/L/D)を与える。

0093

さらなる態様では、本発明は、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約1μg/Lの合計濃度になる細胞培養方法を提供する。他の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約2μg/Lの合計濃度になる。さらに他の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも約1μg/L〜約20μg/Lの合計濃度になる。一部の実施形態では、銅の合計濃度は、約1.5〜4.5μg/Lである。特定の実施形態では、細胞培地を補充して、約1、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/Lの銅、またはそれより高い濃度の銅になる。基本細胞培地は、通常、1μg/L未満の微量の濃度の銅を含む。

0094

一部の実施形態では、本発明は、rVWFの産生のために、基本細胞培地に約1.0〜約20μg/Lの銅を補充する細胞培養方法を提供する。さらなる実施形態では、rVWFの産生のために、基本細胞培地に1.5〜15、2.0〜10、2.5〜8、3.0〜6、4.0〜5.0μg/Lの銅を補充する。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、補充した銅に加えて、1つまたは複数の加水分解物を含んでもよい。

0095

他の実施形態では、本発明は、rA13の産生のために、基本細胞培地に約1.5〜約4μg/Lの銅を補充する細胞培養方法を提供する。さらなる実施形態では、rA13の産生のために、基本細胞培地に約1.6〜3.8、1.7〜3.6、1.8〜3.4、1.9〜3.2、2.0〜3.0、2.1〜2.8、2.2〜2.6、2.3〜2.4μg/Lの銅を補充する。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、補充した銅に加えて、1つまたは複数の加水分解物を含んでもよい。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、銅および/または1つまたは複数の加水分解物に加えて、約1.0〜約30μMの亜鉛を含む。またさらなる実施形態では、基本細胞培地は、銅および/または1つまたは複数の加水分解物および/または亜鉛に加えて、約0.5〜約5.0mMのカルシウムをさらに含む。

0096

上記のいずれかに基づいた、またさらなる態様では、本発明は、細胞培養溶液アンモニウムレベルが低い(10mM未満)細胞培養方法を提供する。特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法は、1、2、3、4、または5μg/Lより高い濃度の銅を、低レベルのアンモニウムと組み合わせて含む細胞培地を利用する。

0097

本発明の方法および組成物の利点の1つは、大規模細胞培養による生産を適用できる点である。これらの大規模細胞培養は、少なくとも10L、50L、100L、150L、200L、250L、500L、750L、1,000L、1,500L、2,000L、5,000L、10,000L、または20,000L培養である。

0098

特定の態様では、本発明の方法は、全体的に見て、必ずしも、より多い量の組換え型タンパク質を生成しないが、産生された組換え型タンパク質(rVWFまたはrA13)は、標準的細胞培養を使って産生したタンパク質で見られるものより、特に、細胞培地が追加の銅で補充されていない細胞培養で産生されたタンパク質に比べて、高い全活性および比活性を示す。さらなる態様では、銅補充培地で細胞培養されたrVWFおよびrA13タンパク質は、銅を補充していない基本細胞培地で培養した細胞に比べて、一貫して1Lの細胞培養液当たりの活性増加を示す。またさらなる態様では、本発明の銅補充培地は、銅を補充していない培地に比べて、タンパク質収率の増加、培養液中の細胞数の増加、および/または1L培養液当たりの全活性の増加をもたらす。

0099

本発明の方法と組成物のまたさらなる利点は、高パーセンテージ(10%超)の高次多量体化rVWFを含むタンパク質集団が得られることである。

0100

多くの本明細書のADAMTSタンパク質に関する考察は、ADAMTS13(A13)の観点から行われているが、全てのADAMTSタンパク質は、共通のコアドメイン構造および共通の構造−機能関係性を共有するので、本明細書記載の方法と組成物は、rA13だけでなく、いずれのADAMTSタンパク質の産生にも適用可能であることは理解されよう。

0101

II.定義
本明細書で使用される「組換え型vWF」は、組換えDNA技術経由で得られたvWFを含む。特定の実施形態では、本発明のvWFタンパク質は、例えば、Ginsburg等の1986年10月23日付け公報の国際公開第1986/06096号および1990年7月23日出願の米国特許公開第07/559,509号に記載のように調製された構築物を含んでもよい。これらの特許は、組換え型vWFの産生方法に関する参照により本明細書に組み込まれる。本発明のvWFは、単量体および多量体型を含む全ての可能な形態、を含んでもよい。本発明は、組み合わせて使用されるべき異なる形のvWFを包含することは理解されよう。例えば、本発明のvWFは、異なる多量体、異なる誘導体ならびに両方の生物学的に活性な誘導体および生物学的に活性でない誘導体を含んでもよい。

0102

例えば、細胞もしくは核酸、タンパク質、またはベクターへの参照に伴って使用される場合の用語「組換え型」は、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが異種の核酸もしくはタンパク質またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変化の導入により改変されていること、または細胞がそのように改変された細胞由来であることを指す。従って、例えば、組換え型細胞は、ネイティブ(非組換え)型の細胞内に認められない遺伝子を発現する、または、他の方法では、異常発現するか、低発現するか、または全く発現しないネイティブ遺伝子を発現する。

0103

本発明においては、組換え型vWFは、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、サルウサギブタげっ歯類マウスラットハムスタースナネズミイヌネコ、および生物学的に活性なそれらの誘導体由来のvWFファミリーのいずれのメンバーも包含する。好ましい実施形態では、組換え型VWFは、ヒトVWFである。活性を有する突然変異および変種vWFタンパク質も、包含され、vWFタンパク質の機能性断片および融合タンパク質も包含される。さらに、本発明のvWFは、精製、検出、またはそれら両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書記載のvWFは、治療用成分またはインビトロまたはインビボでの画像処理に適した成分でさらに改変されてもよい。

0104

用語「高次多量体vWF」、「高分子量vWF」、および「HMW VWF」は、同義に使用でき、10超のVWF二量体を含む共有結合vWF多量体を指す。特定の実施形態では、HMW VWFは、少なくとも11VWF二量体、または少なくとも12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくはさらに多い数のVWF二量体を含む。

0105

本明細書で使用される「ADAMTSタンパク質」は、メタロプロテイナーゼファミリーのトロンボスポンジンI型モチーフを有するディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼのポリペプチドを指す。このファミリーのメンバーには、ヒトタンパク質ADAMTS1(NM_006988)、ADAMTS2(NM_014244;NM_021599)、ADAMTS3(NM_014243)、ADAMTS4(NM_005099)、ADAMTS5(NM_007038)、ADAMTS6(NM_014273)、ADAMTS7(NM_0142727)、ADAMTS8(NM_007037)、ADAMTS9(NM_182920;NM_182921;NM_020249)、ADAMTS10(NM_030957)、ADAMTS12(NM_030955)、ADAMTS13(NM_139025;NM_139026;NM_139027;NM_139028)、ADAMTS14(NM_139155;NM_080722)、ADAMTS15(NM_139055)、ADAMTS16(NM_139056)、ADAMTS17(NM_139057)、ADAMTS18(NM_199355;NM_139054)、ADAMTS19(NM_133638)、およびADAMTS20(NM_025003、NM_175851)が含まれる。ADAMTSタンパク質は、完全長タンパク質、および少なくとも部分生物活性、例えば、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%の、またはそれより多い量の、完全長タンパク質により示される活性、特に完全長タンパク質により示されるプロテアーゼ活性を示す部分ポリペプチドの両方を含む。特定の例では、ADAMTSタンパク質は、例えば、酵素的または化学的手段により、インビボまたはインビトロで、翻訳後修飾される。あるいは、本発明のADAMTSタンパク質は、スプライスされたアイソフォーム、保存的に改変されたタンパク質、実質的に同じタンパク質、相同体、等を含むことが理解されよう。

0106

本発明においては、ADAMTSタンパク質は、例えば、哺乳動物、例えば、霊長類、ヒト、サル、ウサギ、ブタ、げっ歯類、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、イヌ、ネコ、および生物学的に活性なそれらの誘導体由来のADAMTSファミリーのいずれかのメンバーを包含する。活性を有する突然変異および変種ADAMTSタンパク質もまた、包含され、ADAMTSタンパク質の機能性断片および融合タンパク質も包含される。さらに、本発明のADAMTSタンパク質は、精製、検出、または両方を促進するタグをさらに含んでもよい。本明細書記載のADAMTSタンパク質は、治療用成分またはインビトロまたはインビボでの画像処理に適した成分でさらに改変されてもよい。

0107

本明細書で使用される「ADAMTS13タンパク質」は、ADAMTS13活性、特にVWFの残基Tyr−842およびMet−843の間でペプチド結合を切断する能力、を有するいずれかのタンパク質またはポリペプチドを指す。代表的実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、NP_620594(ADAMTS13アイソフォーム1、プレプロタンパク質)またはNP_620594(ADAMTS13アイソフォーム1、成熟ポリペプチド)のアミノ酸75〜1427のアミノ配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。別の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、NP_620596(ADAMTS13アイソフォーム2、プレプロタンパク質)またはNP_620594(ADAMTS13アイソフォーム2、成熟ポリペプチド)のアミノ酸75〜1371のアミノ酸配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。また別の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、NP_620595(ADAMTS13アイソフォーム3、プレプロタンパク質)またはNP_620595(ADAMTS13アイソフォーム1、成熟ポリペプチド)のアミノ酸75〜1340のアミノ酸配列に非常に類似したアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。本明細書で使用されるADAMTS13タンパク質は、vWF切断活性を有する天然変異体およびvWF切断活性を有する人工構築物を含む。本発明で使われるADAMTS13は、一部の基本的活性を保持している任意の天然変異体、代替配列、アイソフォームまたは変異タンパク質を包含する。ヒト集団で見つかったADAMTS13変異の例には、限定されないが、R7W、V88M、H96D、R102C、R193W、T196I、H234Q、A250V、R268P、W390C、R398H、Q448E、Q456H、P457L、C508Y、R528G、P618A、R625H、I673F、R692C、A732V、S903L、C908Y、C951G、G982R、C1024G、A1033T、R1095W、R1123C、C1213Y、T1226I、G1239V、R1336Wが含まれ、これらの多くは、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)と関連することが解っている。ADAMTS13タンパク質は、また、翻訳後修飾を含むポリペプチドを含む。例えば、ADAMTS13は、残基614、667、および1354の位置で、N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)により修飾されることが示され、また、残基142、146、552、579、707、828、および1235もまた、同様の方式で修飾される可能性があると予測されている。

0108

タンパク分解性活性組換え型ADAMTS13は、Plaimauer et al.、(2002、Blood.15;100(10):3626−32)および米国特許公開第2005/0266528号(この特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)に記載のように、哺乳動物細胞培養での発現により調製できる。細胞培養での組換え型ADAMTS13の発現方法は、Plaimauer B、Scheiflinger F.(Semin Hematol.2004 Jan;41(1):24−33および米国特許公開第2011/0086413号(この特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる)で開示されている。

0109

また、本明細書で使用される用語「生物学的に活性な誘導体」は、ADAMTSタンパク質に関連して使われる場合、組換えDNA技術により得られたポリペプチドを包含する。これは、(i)遺伝子工学、例えば、RNAの逆転写および/またはDNAの増幅による組換えDNAの産生、(ii)トランスフェクション、すなわち、電気穿孔または微量注入による原核生物または真核細胞への組換えDNAの導入、(iii)前記形質転換された細胞の、例えば、連続またはバッチ方式で培養、(iv)例えば、恒常的な、または誘導時のADAMTSタンパク質の発現、および(v)例えば、培地からの、または形質転換細胞を回収することにより前記ADAMTSタンパク質を単離し、(vi)実質的に精製された組換え型ADAMTSタンパク質を、例えば、イオン交換クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー親和性クロマトグラフィー疎水性相互作用クロマトグラフィー、等により得ること、のために当技術分野で既知のいずれかの方法を含んでもよい。用語の「生物学的に活性な誘導体」は、また、キメラ分子、例えば、ADAMTSタンパク質、またはその機能性断片を、第2のポリペプチド、例えば、免疫グロブリンFcドメインまたはアルブミンドメインと組み合わせて含み、生物学的/薬理学的特性、例えば、ADAMTSタンパク質の哺乳動物、特にヒトの循環系中半減期を改善する。

0110

用語「単離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」は、実質的にまたは基本的に、ネイティブ状態で認められるような通常随伴する成分を含まない材料を指す。純度均一性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法または高速液体クロマトグラフィーを使って測定される。一実施形態では、配合物中の主な種であるrVWFは、充分に精製されている。別の実施形態では、配合物中の主な種であるrA13は、充分に精製されている。用語の「精製された」は、一部の実施形態では、核酸またはタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に一本のバンドを生ずることを意味する。他の実施形態では、これは、核酸またはタンパク質が、少なくとも50%純粋であること、より好ましくは少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%またはさらに純粋であることを意味する。他の実施形態では、「精製する」または「精製」は、精製されるべき組成物から少なくとも1つの混入物を除去することを意味する。この意味では、精製は、精製された化合物が同種、例えば、100%純粋であることを必要としない。

0111

vWFの生物活性は、既知のインビトロアッセイで測定できる。例えば、リストセチンコファクターアッセイは、vWFの存在下で抗生物質リストセチンにより誘導された、新鮮な、またはホルマリン固定した血小板の凝集に基づいている。血小板凝集度は、vWF濃度に依存し、例えば、血小板凝集計を使って比濁法により測定できる(Weiss et al.、J.Clin.Invest.52:2708−2716、1973;Macfarlaneetal.、Thromb.Diath.Haemorrh.34:306−308、1975)。本明細書に提供されるように、本発明のvWF特異的リストセチンコファクター活性は、インビトロアッセイを使って測定されるvWFをmU/μgに換算して記載される。

0112

本明細書で使用される「1ユニットのADAMTS活性」は、使用されるアッセイに関係なく、1mLのプールされた正常なヒト血漿中の活性の量として定義される。例えば、ADAMTSタンパク質がADAMTS13の場合、1ユニットのADAMTS13 FRETS−VWF73活性は、1mLのプールされた正常なヒト血漿により切断されるのと同量のFRETS−VWF73基質(Kokame et al.、Br J Haematol.2005 Apr;129(1):93−100)を切断するのに必要な活性の量である。便宜上、ADAMTS13活性は、機能アッセイ、例えば、修飾フォン・ヴィレブランド因子ペプチドをADAMTS13の基質として用いる機能アッセイ(Tripodietal.JThromb Haemost.2008 Sep;6(9):1534−41)により測定できる。組換え型ヒトADAMTS13活性の好ましい測定方法は、Gerritsenetal.(分解されたvWFのコラーゲン結合親和性減少に基づく、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)切断プロテアーゼのアッセイ:血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)の診断ツール(Assay of von Willebrand factor(vWF)−cleaving protease based on decreased collagen binding affinity of degraded vWF:a tool for the diagnosis of thrombotic thrombocytopenic purpura(TTP)) Thromb Haemost 1999;82:1386−1389)で開示されている。一実施形態では、上記で定義のADAMTS13タンパク質と見なされるべきポリペプチドまたはタンパク質は、ネイティブADAMTS13の少なくとも1%のvWF切断活性を有する必要がある。他の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、ネイティブADAMTS13の活性の少なくとも10%の活性を含む。さらに他の実施形態では、ADAMTS13タンパク質は、ネイティブADAMTS13の活性の少なくとも5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%の活性を含む。また、ADAMTS13タンパク質の量は、例えば、Rieger et al.、(2006、Thromb Haemost.2006 95(2):212−20)で開示のELISA法を使ってADAMTS13抗原の測定により決定できる。当技術分野で充分確立された約束事は、1mLのプールされた正常なヒト血漿が、1μgのADAMTS13を含むということである。従って、当技術分野の約束事は、1μgの血漿由来ADAMTS13は、1ユニットのADAMTS13活性を有するということである。

0113

用語「細胞培養溶液」、「細胞培地または培地」、および「細胞培養上清」は、通常当技術分野でよく知られた細胞培養プロセスの態様を指す。本発明においては、細胞培養溶液は、細胞培地および細胞培養上清を含んでもよい。細胞培地は、任意選択補充剤と一緒に、細胞培養溶液に外部から添加され、栄養素およびrVWFまたはrA13発現細胞培養用の他の成分を供給する。細胞培養上清は、栄養素および細胞培地ならびに培養中に細胞から放出され、代謝され、および/または排泄された産物由来の他の成分を含み、細胞それ自体を含まない細胞培養溶液を指す。したがって、ある文脈では、細胞培養上清は、細胞培養溶液の液相(すなわち、細胞を除く細胞培養溶液)を指してもよい。例えば、培養液上清のアンモニウム濃度は、通常、細胞培養溶液中に存在するアンモニウム濃度を指す。他の文脈では、細胞培養上清は、細胞が除かれている細胞培養溶液(すなわち、回収細胞培養上清)を指す。

0114

本明細書で使用される用語「ビタミンB3」、「ニコチン酸アミド」、「ナイアシンアミド」、「ナイアシン」、および「ニコチン酸」は、同義に使用でき、ビタミンのB3ファミリーのメンバーを指す。従って、このファミリーのいずれのメンバーも、本発明の方法で使用される培地を補充するために使用できる。

0115

本明細書で使用される用語「合成培地」または「合成培地(複数)」は、合成増殖培地を指し、全成分の素性および濃度は既知である。合成培地は、細菌、酵母、動物、または植物抽出物を含まないが、個別の植物または動物由来成分(例えば、タンパク質、ポリペプチド、等)を含んでも、含まなくてもよい。市販の合成培地の非限定例には、種々のダルベッコ変法イーグル(DME)培地(Sigma−Aldrich Co;SAFCBiosciences、Inc)、ハム栄養混合物(Sigma−Aldrich Co;SAFC Biosciences、Inc)、こら等の組み合わせ、等が含まれる。合成培地の調製方法は、当技術分野で、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により既知である。これら特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0116

本明細書で使用される用語「オリゴペプチド不含培地」または「オリゴペプチド不含培地(複数)」は、オリゴペプチド、例えば、タンパク質加水分解物由来のオリゴペプチドを含まないタンパク質不含培地を指す。一実施形態では、培地は、20以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。本発明の一実施形態では、培地は、15以上のアミノ酸を含むオリゴペプチドを含まない。本発明の別の実施形態では、培地は、10以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。一実施形態では、培地は、7以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。別の実施形態では、培地は、5以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらに別の実施形態では、培地は、3以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。さらなる本発明の実施形態によれば、培地は、2以上のアミノ酸を有するオリゴペプチドを含まない。オリゴペプチド不含培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0117

本明細書で使用される用語「無血清培地」または「無血清培地(複数)」は、動物血清で補充していない培地を指す。無血清培地は、合成培地であることが多いが、無血清培地は、個別の動物または植物タンパク質またはタンパク質画分で補充してもよい。無血清培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0118

本明細書で使用される用語「動物タンパク質不含培地」または「動物タンパク質不含培地(複数)」は、動物血清、タンパク質、またはタンパク質画分を補充しない培地を指す。動物タンパク質不含培地は、合成培地であることが多いが、動物タンパク質不含培地は、植物または酵母加水分解物を含んでもよい。動物タンパク質不含培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

0119

本明細書で使用される用語「基本細胞培地」または「基本細胞培地(複数)」は、加水分解物、例えば、植物または酵母加水分解物を補充していない、合成培地、オリゴペプチド不含培地、無血清培地、または動物タンパク質不含培地を指す。基本培地は、例えば、DMEM、ハムF12、DMEM/ハムF12、Medium199、McCoy、またはRPMIが当技術分野でよく知られている。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに炭水化物ソース等のいくつかの成分を含んでもよい。各成分は、細胞の培養を補助する量で存在できるが、このような量は、通常、当業者には既知である。培地は、補助的物質、例えば、緩衝物質、例えば、炭酸水素ナトリウム抗酸化剤機械的な応力対抗するための安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。必要に応じ、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールポリプロピレングリコール共重合体および/または混合物を添加してもよい。

0120

III.細胞培地および細胞培養上清
本発明の一態様は、基本細胞培地を使って産生したrVWFおよびrA13に比べて、活性が増加したrVWFおよび/またはrA13を産生する細胞培地に関する。一態様では、本発明は、基本細胞培地に1つまたは複数の追加の物質を補充したrVWFおよび/またはrA13産生用細胞培地に関する。以下でさらに詳細に考察するように、具体的な実施形態では、本発明の細胞培養条件は、少なくとも1.0μg/Lの銅を有する基本細胞培地を含む。さらなる実施形態では、使用する細胞培地および本発明のプロセス由来の上清は、また、低レベル(10mM未満)のアンモニウムを含む。特定の実施形態では、rVWFおよび/またはrA13の発現に使われる細胞培養条件は、細胞培養上清が低レベルのアンモニウム、すなわち、10mM未満、好ましくは5mM未満のアンモニウムを維持するように制御される。

0121

本発明の培地は、当技術分野でよく知られた適切な基本培地、例えば、DMEM、ハムF12、DMEM/ハムF12、Medium199、McCoy、またはRPMIをベースにしてもよい。基本培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩類、ならびに炭水化物ソース等のいくつかの成分を含んでもよい。各成分は、細胞培養を補助する量で存在してもよく、このような量は、通常、当業者には既知である。培地は、補助物質、例えば、緩衝物質、例えば、炭酸水素ナトリウム、抗酸化剤、機械的な応力に対抗する安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含んでもよい。必要に応じ、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの共重合体および/または混合物を添加してもよい。

0122

一般的に、基本培地は、1μg/L未満の銅を含み、例えば、DMEM/ハムF12は、約0.3μg/Lの濃度の銅を含む。このような濃度の銅は、本発明の高比活性を示すrVWFおよびrA13タンパク質の産生を支援するのに充分な銅イオンを供給しない。

0123

銅は、種々の方式により、例えば、培地補充剤の添加により本発明細胞培地に供給できる。一部の実施形態では、培地補充剤は、加水分解物を含んでもよく、これを供給して培地中の銅濃度を増加させることができる。加水分解物は、当技術分野でよく知られたいずれかの加水分解物、例えば、植物加水分解物、大豆加水分解物、およびコムギグルテン加水分解物を含んでもよい。特定の実施形態では、加水分解物の添加により、約0.2〜約10μg/LのCu2+の銅濃度の増加に寄与できる。一部の実施形態では、加水分解物より供給される銅の量は、加水分解物中の銅の量ならびに添加される加水分解物の量に依存する。加水分解物の銅含量は、元素分析、例えば、原子吸光分光法(GFAA:黒鉛炉原子吸光)、または質量分析法(例えば、ICP−MS)により測定できる。

0124

特定の実施形態では、銅は、培地のみに、または適切な銅塩または銅キレートを含む培地補充剤を用意して、加水分解物に添加することにより供給できる。適切な銅塩には、限定されないが、硫酸銅、酢酸銅、炭酸銅、塩化銅、水酸化銅、硝酸銅、および酸化銅が含まれる。適切な銅キレート剤には、限定されないが、アルブミン、エチレンジアミン四酢酸EDTA)、ポリアミンキレート化剤エチレンジアミンジエチレントリアミントリエチレンテトラミントリエチレンジアミンテトラエチレンペンタミンアミノエチルエタノールアミンアミノエチルピペラジンペンタエチレンヘキサミン、トリエチレンテトラミンヒドロクロリド、テトラエチレンペンタミンヒドロクロリド、ペンタエチレンヘキサミンヒドロクロリド、テトラエチルペンタアミンカプトプリル、ペニシルアミン、N、N’−ビス(3−アミノプロピル)−1、3−プロパンジアミン、N、N、ビス(2アニモエチル)1、3−プロパンジアミン、1、7−ジオキサ−4、10−ジアザシクロドデカン、1、4、8、11−テトラアザシクロテトラデカン−5、7−ジオン、1、4、7−トリアザシクロノナントリヒドロクロリド、1−オキサ−4、7、10−トリアザシクロドデカン、1、4、8、12−テトラアザシクロペンタデカン、および1、4、7、10−テトラアザシクロドデカンを含んでもよい。

0125

特定の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して約1.0〜約20μg/Lの合計銅濃度になる。具体的な実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して約1.0〜約10μg/Lの最終濃度になる。さらなる実施形態では、基本細胞培地に補充して約1.0〜5.0、1.2〜4.0、1.3〜3.0、1.4〜2.9、1.5〜2.8、1.6〜2.7、1.7〜2.6、1.8〜2.5、1.9〜2.4、2.0〜2.3、2.1〜2.2μg/Lの最終銅濃度になる。さらなる実施形態では、本発明の方法で使われる基本細胞培地に補充して約1.2〜9.5、1.4〜9、1.6〜8.5、1.8〜8、2.0〜7.5、2.2〜7、2.4〜6.5、2.6〜6.0、2.8〜5.5、3.0〜5.0、3.2〜4.5、3.4〜4、および2〜4μg/Lの銅濃度になる。さらに他の実施形態では、本発明の方法で使われる基本細胞培地に補充して約1−6、2〜5、3〜4μg/Lの銅濃度になる。一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも1μg/Lの合計銅濃度になる。別の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも2μg/Lの合計銅濃度になる。さらに別の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも4μg/Lの合計銅濃度になる。特定の実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも1μg/L、もしくは少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20μg/L、またはさらに高い合計銅濃度になる。特定の実施形態では、本明細書でさらに詳細に考察されるように、rA13産生用培養液は、約2〜4μg/Lの銅を含んでもよく、一方、rVWF産生用培養液は、少なくとも2μg/Lの銅を含んでもよい。

0126

上記で示した濃度は、銅二価型(Cu2+)の純粋な銅のそれぞれの濃度である。銅誘導体、例えば、銅含有水和塩、または化合物、例えば、銅キレート剤が使用される場合は、誘導体またはキレート剤の量は、銅の最終濃度が本明細書記載の範囲に入るように添加される。例えば、2μg/LのCuSO4・5H2Oは、約0.51μg/Lの銅濃度(硫酸塩および5H2Oを除いた)と等価である。

0127

好都合なことに、細胞培養溶液中で(すなわち、培養液上清中で)低アンモニウム(NH4+)濃度を生ずる細胞培養プロセスにおける細胞培地の使用は、高比活性を有する組換え型VWFおよび/またはrA13の発現をもたらすことが明らかとなった。従って、特定の実施形態では、上清のNH4+濃度は、10mM以下である。好ましい実施形態では、上清のNH4+濃度は、5mM以下である。好ましい実施形態では、上清のNH4+濃度は、4mM以下である。また別の実施形態では、上清のNH4+濃度は、10mM、9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに少ない濃度である。

0128

従って、特定の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、上清中に10mM以下のNH4+濃度を生ずるプロセスで使用される、銅を補充した(例えば、少なくとも2μg/Lの最終濃度に)基本細胞培地の使用に基づいている。また別の実施形態では、表1の組み合わせのバリエーション1〜440の内のいずれかに対応した最終の銅とアンモニウム濃度を得るように基本細胞培地が補充される。

0129

一部の実施形態では、本発明の銅補充培地は、動物タンパク質不含および/または合成の基本培地を補充することにより産生される。動物タンパク質不含および合成培地の調製方法は、例えば、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号により当技術分野で既知である。これらの特許の開示は、あらゆる目的に対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一実施形態では、本明細書記載の方法で使用される基本培地は、動物タンパク質不含またはオリゴペプチド不含培地である。特定の実施形態では、培地は、合成できる。特定の実施形態では、培地は、約0.5mg/L〜約10mg/Lの濃度で少なくとも1つのポリアミンを含んでもよい。

0130

さらなる実施形態では、上記で提供のいずれかの記載に加えて、基本培地に銅および少なくとも1つのカルシウム、亜鉛、および/またはビタミンB3を補充した本発明の培地が提供される。特定の実施形態では、培地は、動物タンパク質不含、オリゴペプチド不含、または合成培地であってもよい。特定の実施形態では、動物タンパク質不含またはオリゴペプチド不含培地は、米国特許第6,171,825号および同6,936,441号、国際公開第2007/077217号、ならびに米国特許公開第2008/0009040号および同2007/0212770号で教示のように調製される。これらの特許の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。これらの内の両方が、あらゆる目的、およびに対し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、追加の銅および任意選択の1つまたは複数のカルシウム、亜鉛、およびビタミンB3で補充される。具体的な実施形態では、合成培地は、ダルベッコ変法イーグル培地/ハムF12の1:1混合物(DMEM/ハムF12)に類似であってもよく、これは追加の銅および任意選択のカルシウム、亜鉛、および/またはビタミンB3で補充されており、培地中で培養された細胞で発現したrVWFまたはrA13の比活性を増加させる。また別の実施形態では、培地は、動物成分不含である。別の実施形態では、培地は、タンパク質、例えば、ウシ胎仔血清等の血清由来の動物タンパク質を含む。別の実施形態では、培養液は、外部から添加された組換え型タンパク質を有する。別の実施形態では、タンパク質は、認定された病原体不含動物由来である。

0131

特定の実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L〜30mg/Lの濃度の少なくとも1つのポリアミンを含む。別の実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L〜10mg/Lの少なくとも1つのポリアミンを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L〜8mg/Lの少なくとも1つのポリアミンを含む。特定の実施形態では、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン等の群由来である。好ましい実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L〜8mg/Lのプトレシンを含む。

0132

一実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L〜30mg/Lの濃度の少なくとも1つのポリアミンならびに表1で設定されたバリエーション1〜440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。別の実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mg/L〜10mg/Lの少なくとも1つのポリアミンならびに表1で設定されたバリエーション1〜440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L〜8mg/Lの濃度の少なくとも1つのポリアミンならびに表1で設定されたバリエーション1〜440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。特定の実施形態では、ポリアミンは、オルニチン、プトレシン、スペルミンまたはスペルミジン等の群由来である。好ましい実施形態では、ポリアミンはプトレシンである。具体的な実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L〜8mg/Lのプトレシンならびに表1で設定されたバリエーション1〜440の内のいずれか1つに対応した銅とアンモニウムの組み合わせを含む。

0133

さらなる態様では、銅に加えて、本発明で使用の細胞培地は、1つまたは複数の追加のカルシウム、亜鉛、1つまたは複数のビタミン、およびこれらのいずれかの組み合わせをさらに含んでもよい。

0134

一般的に、任意のカルシウム塩が、本発明の培地を補充するために使用可能で、受容可能な塩の非制限的例には、CaCl2、CaCl2、CaFPO3・2H2O、CaI2、CaBr2、(C2H3O2)2Ca、(CHO2)2Ca、(C6H7O6)2Ca、(C6H5O7)2Ca3・2H2O、等が含まれる。特定の実施形態では、薬学的に許容可能なカルシウム塩が、本発明の培地の補充に使用可能である。

0135

一般的に、任意の亜鉛塩が、本発明の培地を補充するために使用可能で、受容可能な塩の非制限的例には、ZnSO4・7H2O、ZnSO3・2H2O、(C6H5O7)2Zn3・2H2O、ZnBr2、ZnBr2・2H2O、ZnCl2、Zn(NO3)2・6H2O、Zn(H2PO4)2・H2O、(C2H3O2)2Zn・2H2O、等が含まれる。特定の実施形態では、薬学的に許容可能な亜鉛塩が、本発明の培地の補充に使用される。他の実施形態では、亜鉛含有ペプチドまたはタンパク質配合物、例えば、インスリンが、本明細書で提供される培養液を補充するのに使用可能である。

0136

またさらなる態様では、銅および上記で考察の1つまたは複数の追加の材料を補充した基本細胞培地は、さらに、上清中の低アンモニウムレベルの培養液中で使用可能である。特定の実施形態では、本発明で使用する補充細胞培地は、細胞培養溶液中の10mM未満のアンモニウムレベルを生ずる。さらなる実施形態では、本発明の補充細胞培地は、約0.5〜9.5、1.0〜9.0、1.5〜8.5、2.0〜8.0、2.5〜7.5、3.0〜7.0、3.5〜6.5、4.0〜6.0、4.5〜5.5mMの細胞培養アンモニウムレベルで使用される。

0137

一実施形態では、細胞培地および細胞培養上清の銅とアンモニウム濃度は、製造プロセスの間の長期間維持される。具体的な実施形態では、細胞培養の銅とアンモニウム濃度は、製造プロセスの間、すなわち、rVWFまたはrA13が発現し、大規模細胞培養から回収される時間の間、維持される。特定の実施形態では、銅とアンモニウム濃度は、培養溶液中で、表1に設定のバリエーション1〜440の内のいずれか1つで、維持される。好ましい実施形態では、銅とアンモニウム濃度は、このような産生プロセスの全体時間にわたり維持される。

0138

一部の実施形態では、本発明により提供される培地は、液体またはドライまたは粉末形態で提供できる。培地は、単一使用に適した量で事前分注してもよく、または2つ以上の細胞培養に使用可能な多量で提供されてもよい。一般的に、本発明の培地は、無菌の方法で提供されることになる。

0139

rVWFまたはrA13を産生するために使用する細胞培地の具体的詳細については、下記で考察される。下記では、rVWFまたはrA13のいずれかに関して考察されるが、下記のrVWFに関する考察のいずれもrA13に対し適用可能であり、逆もまた同じであることは理解されよう。

0140

A.組換え型VWF細胞培地
本発明の一態様は、組換え型vWF、さらに具体的には、高比活性を有する高分子量vWF、を産生するための細胞培養溶液に関し、これは本明細書でさらに記載される。一実施形態では、本発明高分子量、組換え型vWFを産生するための細胞培養溶液を提供し、この溶液は、少なくとも約2.4μg/Lの濃度の銅を含む細胞培地、および約14〜約22の二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチンコファクター活性を含む高次多量体vWFを発現する複数の細胞を含む。

0141

一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む.好ましい実施形態では、細胞培養液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した銅およびアンモニウム濃度を有する。特定の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、上記で与えられた濃度で長期間保持される。例えば、一実施形態では、アンモニウム濃度は、少なくとも3日間、または少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、63、70日、またはさらに多くの日数の間、低濃度で維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間維持される。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液を使ってrVWFを産生している合計時間の間)、低レベルで維持される。

0142

本発明の一実施形態では、細胞培地は、少なくとも約2.4μg/L、別の実施形態では、少なくとも約3μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約4μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約8μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約10μg/L、さらに別の実施形態では、少なくとも約15μg/L、およびさらなる実施形態では、少なくとも約20μg/Lの濃度の銅を含んでもよい。

0143

他の実施形態では、本発明の細胞培地中の銅濃度は、約2.4μg/L〜約20μg/L、別の実施形態では、約2.4μg/L〜約15μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L〜約10μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L〜約8μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L〜約6μg/L、さらに別の実施形態では、約2.4μg/L〜約4μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L〜約20μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L〜約15μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L〜約10μg/L、さらに別の実施形態では、約4μg/L〜約8μg/Lの範囲、また、さらなる実施形態では、約4μg/L〜約6μg/Lの範囲であってもよい。

0144

本発明は、また、高比活性を有するrVWFの発現に適した培地を含む、rVWFの発現または産生用のキットを提供する。

0145

B.ADAMTS13(A13)細胞培地
一態様では、本発明は、高比活性を有するADAMTSタンパク質の発現に有用な培地を提供する。好都合にも、培地に銅を補充することにより、補充した培地中で培養した細胞で発現した組換え型ADAMTS(例えば、rADAMTS13)酵素の活性が大きく高められ、一方、この酵素は、非補充培地中で培養した細胞より発現レベルが高くない場合は、その細胞と同レベルで発現することが明らかになった。

0146

一態様では、本発明は、高比活性を有する組換え型ADAMTS13タンパク質の発現のための銅を補充した細胞培地を提供する。一実施形態では、培地に補充して約2〜約4μg/Lの合計銅濃度になる。さらなる実施形態では、培地に補充して、約1〜3、2〜3、3〜4μg/Lの合計銅濃度になる。一実施形態では、培地は、少なくとも1μg/Lの銅濃度を含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、少なくとも4μg/Lの銅を含む。他の実施形態では、培地は、2μg/L〜20μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、1μg/L〜6μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、2μg/L〜5μg/Lの銅を含む。別の実施形態では、培地は、3μg/L〜4μg/Lの銅を含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも1μg/L、または少なくとも2μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、11μg/L、12μg/L、13μg/L、14μg/L、15μg/L、16μg/L、17μg/L、18μg/L、19μg/L、20μg/L、またはそれより高い濃度の銅を含む。

0147

一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下の、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、表1で設定のバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した銅とアンモニウム濃度を有する。特定の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、上述の濃度で長期間維持される。例えば、一実施形態では、アンモニウム濃度は、少なくとも3日間、または少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、28、35、42、49、56、63、70日間、またはそれを越える日数の間、低濃度で維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間、維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間、維持される。具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間、維持される。別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも14日間、維持される。さらに別の実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液を使ってrA13を産生する全体時間の間)低レベルで維持される。

0148

一実施形態では、少なくとも1μg/L銅および少なくとも2μM亜鉛を含む培地が、組換え型ADAMTSタンパク質(例えば、rADAMTS13)の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅または少なくとも4μg/Lの銅を含む。培地が銅で補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは約5μMの亜鉛も含む。一実施形態では、培地は、また、正確にまたは約2μM〜12μMのl亜鉛を含む。別の実施形態では、培地は、また、正確にまたは約5μM〜12μMの亜鉛を含む。また別の実施形態では、培地は、また、少なくとも正確にまたは2μM、または少なくとも正確にまたは約3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM、11μM、12μM、13μM、14μM、15μM、20μM、25μM、30μM、またはさらに多い亜鉛を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表2で設定されるバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。

0149

一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、10mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、6mM以下のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、6mM以下の濃度で少なくとも7日間保持される。
別の好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、5mM以下の濃度で少なくとも7日間保持される。別の好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、4mM以下の濃度で少なくとも7日間保持される。また別の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、(すなわち、培養液を使ってrA13が産生される全時間の間)低レベルで維持される。

0150

一実施形態では、少なくとも1μg/Lの銅および少なくとも正確にまたは約0.5mMカルシウムを含む培地が、組換え型ADAMTSタンパク質(例えば、rADAMTS13)の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅または少なくとも4μg/Lの銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも1.5mMカルシウムを含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約0.5mM〜1.5mMカルシウムを含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約0.5mM、または少なくとも正確にまたは約0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、またはさらに多いカルシウムを含んでもよい。一実施形態では、培地は、表3に設定されるバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウムを含む。

0151

一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、10mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培地は、6mM以下のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、6mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、細胞培地は、5mM以下のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、5mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、細胞培地は、4mM以下のアンモニウム濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、4mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。また別の実施形態では、細胞培地は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度およびならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、(すなわち、培養液を使ってrA13が産生される全時間の間)低レベルで維持される。

0152

一実施形態では、細胞培地に銅、亜鉛およびカルシウムが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも0.5mMのカルシウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも1.5mMのカルシウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、0.5mM〜1.5mMのカルシウム濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。また別の実施形態では、培地は、少なくとも0.6mM、0.7mM、0.8mM、0.9mM、1.0mM、1.1mM、1.2mM、1.3mM、1.4mM、1.5mM、1.6mM、1.7mM、1.8mM、1.9mM、2.0mM、2.25mM、2.5mM、2.75mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM、5.0mM、またはさらに高いカルシウム濃度、ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。

0153

一実施形態では、少なくとも1μg/Lの銅および少なくとも2mg/Lのニコチン酸アミド(ビタミンB3)を含む培地が、組換え型ADAMTSタンパク質(例えば、rADAMTS13)の発現のために提供される。他の実施形態では、培地は、少なくとも2μg/Lの銅または少なくとも4μg/Lの銅を含む。培地に銅が補充される別の実施形態では、培地は、また、少なくとも7mg/Lのニコチン酸アミド(ビタミンB3)を含む。一実施形態では、培地は、正確にまたは約2mg/L〜10mg/Lのニコチン酸アミド(ビタミンB3)を含む。また別の実施形態では、培地は、少なくとも正確にまたは約2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、またはそれより高い濃度のニコチン酸アミド(ビタミンB3)を含んでもよい。一実施形態では、培地は、表4に設定されたバリエーション1321〜1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。

0154

一実施形態では、細胞培養溶液は、低アンモニウム濃度をさらに含む。一実施形態では、培地は、10mM未満のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321〜1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、10mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、6mM以下のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321〜1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、6mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、5mM以下のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321〜1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、5mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。別の好ましい実施形態では、4mM以下のアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321〜1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。具体的な実施形態では、アンモニウムは、4mM以下の濃度で少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度ならびに表4に設定されたバリエーション1321〜1760のいずれか1つに対応した銅およびニコチン酸アミド濃度を含む。さらに別の具体的な実施形態では、細胞培養液のアンモニウム濃度は、プロセス持続期間の間、(すなわち、培養液を使ってrA13が産生される全時間の間)低レベルで維持される。

0155

一実施形態では、細胞培地に銅、亜鉛およびニコチン酸アミドが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも7mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、2mg/mL〜10mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度ならびに表2に設定されたバリエーション441〜880のいずれか1つに対応した銅および亜鉛濃度を有する。

0156

一実施形態では、細胞培地に銅、カルシウムおよびニコチン酸アミドが補充される。具体的な実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、少なくとも7mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。別の具体的な実施形態では、培地は、2mg/mL〜10mg/mLのニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。また他の実施形態では、培地は、少なくとも2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、またはさらに高いニコチン酸アミド濃度ならびに表3に設定されたバリエーション881〜1320のいずれか1つに対応した銅およびカルシウム濃度を有する。

0157

IV.高比活性を有する血液因子の産生方法
A.細胞培養法
本発明は、組換え型タンパク質(例えば、rVWFおよびrA13)の大規模産生方法を提供する。特定の実施形態では、このような大規模産生方法では、これらの治療用組換え型タンパク質の製造に、攪拌式(stirred/agitated)タンク型反応器を利用する。

0158

特定の実施形態では、本発明の方法は、バッチまたは連続方式で操作される細胞培養システムの使用を含めてもよい。例えば、バッチ式細胞培養が利用される場合は単一バッチ流加バッチ、または繰返しバッチ方式により操作できる。同様に、連続細胞培養は、例えば、灌流、タービドスタットまたはケモスタット方式により操作できる。バッチおよび連続細胞培養は、浮遊または接着状態で行うことができる。浮遊状態で操作する場合は、細胞は、自由に浮遊し、培地内で混合される。あるいは、接着状態では、細胞は、固相、例えば、マイクロキャリア多孔性マイクロキャリア、ディスクキャリアセラミックカートリッジ中空繊維フラットシートゲルマトリックス、等に固定される。

0159

バッチ培養は、通常、単一バッチとして、細胞接種材料が、タンクまたは培養槽中最大密度に培養され、採取され、さらに処理される大規模細胞培養である。流加バッチ培養は、通常、新鮮な栄養素(例えば、増殖制限基質)または添加物(例えば、産物の前駆物質)が供給されるバッチ培養である。供給液は、通常、バイオリアアクター希釈を避けるために高濃縮される。繰返しバッチ培養では、細胞は、培地中に置かれ、所望の細胞密度まで増殖される。次に、衰退期および細胞死発生を避けるために、細胞が最大濃度に達する前に、培養液が完全増殖培地で希釈される。希釈の量および頻度は、広く変化し、細胞株増殖特性および培養プロセス都合に依存する。このプロセスは、必要に応じ何回でも繰り返すことができ、継代培養時に細胞と培地が廃棄されない限り、培養液の容量は希釈毎に段階的に増えることになる。容量の増加は、充分な大きさの反応器にして容器内での希釈を可能にするか、または希釈した培養液をいくつかの容器に分けることにより対処できる。このタイプの培養の原理は、指数関数増殖状態中で細胞を維持することである。連続継代培養は、培養液の容量が段階的に増加し、複数回の細胞採取ができ、細胞が増殖を続け、さらにそのプロセスを望む限り続けることができるという点が特徴である。特定の実施形態では、組換え型ADAMTSタンパク質(例えば、rADAMTS13)は、バッチ培養の上清採取後、回収できる。他の実施形態では、組換え型VWFは、バッチ培養の上清採取後、回収できる。

0160

連続培養は、新しい培地の流入により栄養素が連続的に供給される浮遊培養であってもよく、この場合、培養液容量は、通常、同時に生ずる消費された培地の除去により、一定に保持される。ケモスタットおよびタービドスタット法では、抽出した培地は、細胞を含む。従って、細胞培養容器に残っている細胞は、定常状態を維持するために増殖する必要がある。ケモスタット法では、成長速度は、通常、希釈速度、すなわち、新しい培地が添加される速度を調節することにより制御される。培養液中の細胞の成長速度は、希釈速度を変えることにより、例えば、準最大成長速度に制御できる。対称的に、タービドスタット法では、希釈速度は、pHや温度等の所与操作条件で細胞が到達できる最大成長速度を可能とするように設定される。特定の実施形態では、rVWFまたはrA13は、連続培養の上清採取の後で回収される。連続細胞培養の代表的方法は、国際公開第2011/012725号(Grillberger et al.)に記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。

0161

灌流培養では、抽出した培地は細胞が枯渇しており、細胞は、例えば、濾過または遠心法により培養液中への細胞を再導入して培養容器中で維持される。しかし、通常、濾過に使用される膜では、100%の細胞を保持できないので、培地が抽出される際に、一部は除去される。大部分の細胞は培養容器中に保持されるので、非常に大きい成長速度で灌流培養を行う目的に対しては、これは重要なことではないであろう。特定の実施形態では、rVWFまたはrA13は、灌流培養の上清を採取後、回収される。

0162

攪拌式タンク型反応器システムは、浮遊または接着方式で操作されるバッチおよび連続細胞培養に対し使用できる。一般的に、攪拌式タンク型反応器システムは、いずれかの型の攪拌器、例えば、 Rushton水中翼傾斜翼, または船舶翼と組み合わせて、どの従来の攪拌式タンク型反応器としても操作できる。

0163

特定の実施形態では、本発明の細胞培養方法にマイクロキャリアの使用を含めてもよい。一部の実施形態では、その実施形態の細胞培養を、大きなバイオリアクター中で、高細胞密度およびタンパク質発現を得るための高容量特異的培養表面積の提供に適した条件下で行うことができる。このような増殖条件を得る1つの手段は、攪拌式タンク型バイオリアクター中で細胞培養用マイクロキャリアを使うことである。マイクロキャリア上での細胞増殖の概念は、最初にvan Wezel(van Wezel、A.L.、Nature 216:64−5(1967))により記載され、増殖培地中に懸濁された小さい固体粒子の表面上の細胞接着を考慮している。これらの方法は、高表面−対−容量比率を与え、その結果として、効率的な栄養素利用を可能とする。さらに、真核細胞株中の分泌タンパク質の発現に関しては、増加した表面−対−容量比率が、より高レベルの分泌、およびその結果の培養液上清中のより高いタンパク質収率を可能とする。最終的に、これらの方法は、真核生物発現培養の規模拡大を容易にする。

0164

vWFおよび/またはrA13を発現している細胞は、細胞培養増殖中に球状または多孔性マイクロキャリアに結合できる。マイクロキャリアは、Butler(1988.Spier & Griffiths、Animal Cell Biotechnology 3:283−303)により記載されているような、デキストランコラーゲンプラスチックゼラチンおよびセルロース、等をベースとしたマイクロキャリア分から選択されるマイクロキャリアであってよい。また、細胞を球状マイクロキャリア上で生物量に増殖させて、最終培養槽生物量達した後に多孔性マイクロキャリア上の発現タンパク質を産生する前に、またはその逆の場合に、細胞を継代することが可能である。適切な球状マイクロキャリアには、スムーズ表面マイクロキャリア、例えば、Cytodex(登録商標)1、Cytodex(登録商標)2、およびCytodex(登録商標)3(GEHealthcare)、ならびにマクロ多孔性マイクロキャリア、例えば、Cytopore(登録商標)1、Cytopore(登録商標)2、Cytoline(登録商標)1、およびCytoline(登録商標)2(GE Healthcare)を含めてもよい。

0165

上述のように、本発明は、銅濃度を増加させた細胞培地を含む。上記「細胞培地」セクションで記載された全ての実施形態および濃度が、本明細書記載の発明の方法に適用できることを理解されたい。

0166

特定の実施形態では、培養は、少なくとも約7日、または少なくとも約14日、21日、28日、または少なくとも約5週、6週、7週、8週、9週、または少なくとも約2ヶ月、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18ヶ月の間またはさらに長い期間の間、維持してもよい。細胞培養が組換え型vWFまたは組換え型rA13タンパク質の産生のために維持される細胞密度は、タンパク質発現に使われる培養条件および培地に依存する。当業者なら、rVWFまたはrA13産生細胞培養用の最適細胞密度を容易に決定できるであろう。一実施形態では、培養は、約0.5x106〜4x107細胞/mLの細胞密度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約1.0x106〜約1.0x107細胞/mLの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約1.0x106〜約4.0x106細胞/mLの濃度で長期間維持される。他の実施形態では、細胞密度は、約1.0x106〜約4.0x106細胞/mLの濃度で長期間維持される。また他の実施形態では、細胞密度は、約2.0x106〜約4.0x106細胞/mL、または約1.0x106〜約2.5x106細胞/mL、または約1.5x106〜約3.5x106細胞/mL、またはいずれかの他の類似の範囲の濃度で長期間維持できる。

0167

一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、4.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。

0168

一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、3.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。

0169

一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、3.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。

0170

一実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、2.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。

0171

別の実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、2.0x106細胞/mL以下の濃度に維持される。

0172

別の実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも14日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。さらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも21日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも28日間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも5週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも6週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも7週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも8週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。またさらなる具体的な実施形態では、本明細書で提供される連続細胞培養の細胞密度は、少なくとも9週間、1.5x106細胞/mL以下の濃度に維持される。

0173

以下に、rVWFおよびrA13産生方法に関する具体的詳細内容を提供する。これから分かるように、rVWFまたrA13に対し条件が具体的に提示されているが、rVWFに対する条件は、rA13の産生に使用可能であり、逆もまた同様である。

0174

B.高分子量組換え型vWFの産生方法
別の態様では、本発明は、さらに、銅濃度を増加させた細胞培地を含む細胞培養条件下でのvWF産生方法に関する。特定の実施形態では、培養液は、また、低アンモニウム濃度をも含む。本明細書で使用される用語の「細胞培養」および「細胞培養溶液」は同義に使用される。

0175

一実施形態では、本発明は、高分子量、組換え型vWFの産生方法を提供し、この方法は:a)細胞培養液を用意すること;b)vWFをコードする核酸配列を導入すること;c)核酸配列を含む細胞を選択すること;および、d)少なくとも約2.4μg/Lの銅濃度を含む細胞培地および約10mM未満のアンモニウム濃度を含む細胞培養上清を含む細胞培養条件下、細胞中でvWFを発現させることを含み、ここでvWFは、約14〜約22二量体および少なくとも約30mU/μgの特異的リストセチン活性を含む高次多量体vWFである。さらなる実施形態では、本発明の方法を使って産生された多量体rVWFは、約10〜30、12〜28、14〜26、16〜24、18〜22、20〜21の二量体を含む。またさらなる実施形態では、本発明により産生されたrVWFは、少なくとも約20、22.5、25、27.5、30、32.5、35、37.5、40、42.5、45、47.5、50、52.5、55、57.5、60、62.5、65、67.5、70、72.5、75、77.5、80mU/μg、またはさらに高い比活性を有する.具体的な実施形態では、rVWF産生用連続細胞培養の細胞密度は、2.5x106細胞/mL以下の濃度で長期間維持される。他の具体的な実施形態では、細胞密度は、2.0x106細胞/mL、1.5x106細胞/mL、1.0x106細胞/mL、0.5x106細胞/mL以下、またはさらに少ない密度で維持される。一実施形態では、細胞密度は、1.5x106細胞/mL〜2.5x106細胞/mLで維持される。

0176

一実施形態では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物を産生する方法を提供し、この方法は、(a)基本細胞培地を用意するステップ;(b)基本細胞培地に銅を補充し、少なくとも2.0μg/Lの最終銅濃度とするステップ;(c)rVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;(d)銅補充細胞培地に入れた1つまたは複数の細胞を培養し、rVWFを発現させ、これを細胞から培養液上清中に排出させるステップ;および(e)少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、回収上清が少なくとも30mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM未満のアンモニウム濃度で、少なくとも7間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0177

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも2.4μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0178

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも3μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0179

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも4μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0180

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して少なくとも4.3μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0181

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して2μg/L〜20μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0182

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して3μg/L〜10μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0183

上述の方法の一実施形態では、基本細胞培地に銅を補充して4μg/L〜7.5μg/Lの最終銅濃度を得る。一実施形態では、細胞培養溶液は、10mM未満のアンモニウム濃度をさらに含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、10mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、5mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、5mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。好ましい実施形態では、細胞培養溶液は、4mM以下のアンモニウム濃度を含む。別の具体的な実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、4mM以下のアンモニウム濃度で、少なくとも7日間維持される。また他の実施形態では、細胞培養溶液は、10mM以下、または9mM、8mM、7mM、6mM、5mM、4mM、3mM、2mM、1mM以下、またはさらに低いアンモニウム濃度を含む。さらに別の実施形態では、細胞培養溶液のアンモニウム濃度は、プロセスの持続期間の間(すなわち、培養液が使われrVWFを産生している全時間の間)低レベルに維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0184

一実施形態では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物を産生する方法を提供し、この方法は、(a)基本細胞培地を用意するステップ;(b)基本細胞培地に銅を補充するステップ;(c)rVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;(d)銅補充細胞培地中で1つまたは複数の細胞を培養し、rVWFを発現させ、細胞から培養液上清中に排出させるステップ;および(e)少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで上清のNH4+濃度が低レベルで少なくとも7日間維持され、さらに、回収上清が少なくとも30mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。具体的な実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0185

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも14日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0186

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも21日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0187

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも28日間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0188

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも5週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0189

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも6週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0190

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも7週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0191

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも8週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0192

一実施形態では、細胞培養溶液の銅濃度およびNH4+濃度は、表1で設定されたバリエーション1〜440のいずれか1つに対応した濃度で少なくとも9週間維持される。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0193

一実施形態では、本発明は、組換え型フォン・ヴィレブランド因子(rVWF)組成物の産生方法を提供し、この方法は、(a)基本細胞培地を用意するステップ;(b)基本細胞培地に銅を補充し少なくとも2.0μg/Lの最終銅濃度を得るステップ;(c)rVWFタンパク質をコードする核酸を含む1つまたは複数の細胞を用意するステップ;(d)1つまたは複数の細胞を銅補充細胞培地中で培養し、rVWFを発現させ、細胞から培養液上清中へ排出させるステップ;(e)培養液上清のアンモニウム濃度をモニタリングするステップ;および(f)少なくとも一部の培養液上清を回収するステップを含み、ここで10mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清がrVWF組成物産生に使用されず、さらに、回収上清が少なくとも30mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2〜20μg/L、2〜10μg/L、3〜8μg/L、または4〜6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0194

上述の方法の一実施形態では、6mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、rVWF組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2〜20μg/L、2〜10μg/L、3〜8μg/L、または4〜6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0195

上述の方法の一実施形態では、5mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、rVWF組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2〜20μg/L、2〜10μg/L、3〜8μg/L、または4〜6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0196

上述の方法の一実施形態では、4mMより高いアンモニウム濃度を含む培養液上清は、rVWF組成物産生に使用されない。特定の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、少なくとも2.4μg/L、3μg/L、4μg/L、5μg/L、6μg/L、7μg/L、8μg/L、9μg/L、10μg/L、15μg/L、20μg/L、またはさらに高い濃度である。他の実施形態では、補充基本培地の最終銅濃度は、2〜20μg/L、2〜10μg/L、3〜8μg/L、または4〜6μg/Lである。好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも50mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。さらに好ましい実施形態では、回収上清は、少なくとも70mU/μg rVWFのrVWF特異的リストセチンコファクター活性を有する。

0197

組換え型vWFは、適切な真核生物宿主系での発現により産生出来る。真核細胞の例には、限定されないが、哺乳動物細胞、例えば、CHO、COS、HEK293、BHKSK−Hep、およびHepG2;昆虫細胞、例えば、SF9細胞、SF21細胞、S2細胞、およびHigh Five細胞;ならびに酵母細胞、例えば、サッカロミセスまたはシゾサッカロミセス細胞、が含まれる。一実施形態では、vWFは、酵母細胞、昆虫細胞、トリ細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞株ハムスター細胞株、またはマウス細胞株、等中で発現可能である。一特定実施形態では、細胞株は、CHO、BHK、またはHEK細胞株である。通常、哺乳動物細胞、例えば、連続継代性細胞株由来のCHO細胞は、本発明のvWFの発現に使用可能である。

0198

特定の実施形態では、vWFをコードする配列を含む核酸配列は、ベクターであってもよい。ベクターは、ウイルスにより送達されてもよく、プラスミドであってもよい。タンパク質をコードする核酸配列は、特定の遺伝子でも、またはそれの生物学的に機能的な部分であってもよい。一実施形態では、タンパク質は、少なくともvWFの生物学的に活性な部分である。

0199

各種ベクターをvWFの発現に使用でき、真核生物発現ベクターから選択できる。真核生物発現用ベクターの例には、:(i)pAO、pPIC、pYES、pMET等のベクターが、AOX1、ギャップ、GAL1、AUG1、等のプロモーターを使って酵母中での発現用として;(ii)、pMT、pAc5、pIB、pMIB、pBAC、等のベクターが、PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、polh、等のプロモーターを使って、昆虫細胞中での発現用として、ならびに(iii)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、pBPV、等のベクター、および、ワクチニアウイルスアデノ随伴ウイルスヘルペスウイルスレトロウイルス、等のウイルス系由来のベクターが、CMV、SV40、EF−1、UbC、RSV、ADV、BPV、およびβ−アクチン等のプロモーターを使って、哺乳動物細胞中での発現用として、含まれる。rVWF発現用代表的ベクターは、Kaufman et al.(Mol Cell Biol.1989 Mar;9(3):1233−42)により記載されている。この内容は、あらゆる目的に対し、参照によってその全体が組み込まれる。

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