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図面 (14)

課題・解決手段

増幅反応モニターするための迅速で低費用アプローチのための方法が、提供される。この方法は、有色または蛍光であるpH感受性色素を使用して、終了まで、等温増幅反応またはPCR増幅反応の進行をモニターするステップを含む。DNAポリメラーゼデオキシリボヌクレオチド三リン酸および1mM未満のTrisもしくは等価物の弱いバッファーまたはバッファーなしの混合物を含む組成物が記載される。

概要

背景

電気泳動法は、労働集約型の手動プロセシングおよび機器を利用する増幅後ステップにおいてDNA産物を検出する従来の方法である。等温増幅における最近の発展は、代わりとなる検出方法、例えば、挿入フルオロフォアまたはマグネシウム感受性フルオロフォアによる二本鎖DNAdsDNA)の蛍光検出(Notomi,et al.,Nucleic Acids Res.,28:E63(2000);Tomita,et al.,Nat.Protoc,3:877−82(2008);Goto,et al.,BioTechniques,46:167−72,(2009));ピロりん酸変換を通しての生物発光(Gandelman,et al.,PLoS One,5:el4155(2010);または沈殿したピロりん酸マグネシウムの混濁度検出(Mori et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,289:150−4(2001))をもたらした。しかしながら、これらの視覚的な方法は、典型的に、長いインキュベーション時間(>60分間)を必要とする、検出のための特異的な機器を必要とするまたは研究所外での安定な(robust)検出について変化に敏感すぎる。リアルタイムPCR機器および化学における進歩は、PCR反応の間に多くのサンプルを同時にモニターすることを可能にした。検出原理は、典型的に、挿入色素によるdsDNAの蛍光検出の使用または配列特異的蛍光プローブの使用に基づき、費用のかかる機器を必要とする。この代わりに、ポリメラーゼ依存性の増幅の間に放出される水素イオンを検出するための機器が、開発された。これらの水素イオンの検出は、ハイスループット次世代シークエンシング(Ion Torrent(商標)Sequencing、Life Technologies、Grand Island、NY)において使用するために、例えば米国特許第7,888,015号明細書において実証されるように、最先端電子検出およびマイクロ流体デバイスを使用して実現された。

ポイントオブケア(point−of−care)診断法および現場での診断法は、迅速で簡単な試験を必要とし、理想的には、30分未満で標的核酸を検出し、最先端で費用のかかる機器を伴わない。

概要

増幅反応をモニターするための迅速で低費用のアプローチのための方法が、提供される。この方法は、有色または蛍光であるpH感受性色素を使用して、終了まで、等温増幅反応またはPCR増幅反応の進行をモニターするステップを含む。DNAポリメラーゼデオキシリボヌクレオチド三リン酸および1mM未満のTrisもしくは等価物の弱いバッファーまたはバッファーなしの混合物を含む組成物が記載される。

目的

配列特異的等温ポリメラーゼ連鎖反応PCR核酸増幅技術は、分子診断学の急速に成長している分野に相当し、DNAサンプルの急速で高感度な検出を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

1mM未満のTrisもしくは等価物の量で弱い緩衝剤を含有するまたは緩衝剤なしの調合物中に、pH感受性色素DNAポリメラーゼ、dNTPを含む調製物

請求項2

プライマーをさらに含む、請求項1に記載の調製物。

請求項3

鋳型DNAをさらに含む、請求項1または2に記載の調製物。

請求項4

pH感受性色素が、視覚的に検出可能な有色色素または蛍光色素のいずれかである、請求項1から3のいずれかに記載の調製物。

請求項5

核酸増幅を検出するための方法であって、弱緩衝または非緩衝液中に鋳型DNA、DNAポリメラーゼおよびpH感受性色素を含有する増幅反応混合物を提供するステップならびに標的DNAの増幅から結果として生じる色素のスペクトルまたは蛍光特性における変化を検出するステップを含む、方法。

請求項6

増幅が、等温核酸増幅またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項5に記載の方法。

請求項7

等温核酸増幅が、ループ媒介性等温増幅ヘリカーゼ置換増幅、鎖置換増幅、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅またはニッキング酵素増幅反応である、請求項5または6に記載の方法。

請求項8

色素が、可溶性である、請求項7に記載の方法。

請求項9

可溶性色素が、可視光線において検出可能な有色色素である、請求項7または8に記載の方法。

請求項10

色素が、クレゾールレッドフェノールレッドm−クレゾールパープルブロモクレゾールパープルニュートラルレッドナフトールフタレインチモールブルー、ナフトールフタレインから選択される、請求項7から9のいずれかに記載の方法。

請求項11

色素が、蛍光色素である、請求項8に記載の方法。

請求項12

蛍光色素が、2’,7’−ビス−(2−カルボキシエチル)−5−(および−6)−カルボキシフルオレセインまたはカルボキシルセミナトロフルオルである、請求項11に記載の方法。

請求項13

弱緩衝液が、1mM未満のTrisバッファーまたは等価なバッファーを含む、請求項5から12のいずれかに記載の方法。

請求項14

増幅反応の前から後まで、pH感受性色素のスペクトルまたは蛍光特性における変化を比較するステップをさらに含む、請求項5から13のいずれかに記載の方法。

請求項15

標的配列サンプル中に存在する場合に、標的配列の核酸増幅をモニターするための方法であって、増幅がサイクル閾値数を超えて進むにつれて、標的配列の存在化においてpHの変化をモニターするステップを含み、モニターするステップが、pH感受性の有色色素または蛍光色素を反応混合物に追加することと、増幅前と比較した、増幅が起こった場合の色の変化を決定することによって達成される、方法。

技術分野

0001

配列特異的等温ポリメラーゼ連鎖反応PCR核酸増幅技術は、分子診断学の急速に成長している分野に相当し、DNAサンプルの急速で高感度な検出を提供する。

背景技術

0002

電気泳動法は、労働集約型の手動プロセシングおよび機器を利用する増幅後ステップにおいてDNA産物を検出する従来の方法である。等温増幅における最近の発展は、代わりとなる検出方法、例えば、挿入フルオロフォアまたはマグネシウム感受性フルオロフォアによる二本鎖DNAdsDNA)の蛍光検出(Notomi,et al.,Nucleic Acids Res.,28:E63(2000);Tomita,et al.,Nat.Protoc,3:877−82(2008);Goto,et al.,BioTechniques,46:167−72,(2009));ピロりん酸変換を通しての生物発光(Gandelman,et al.,PLoS One,5:el4155(2010);または沈殿したピロりん酸マグネシウムの混濁度検出(Mori et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,289:150−4(2001))をもたらした。しかしながら、これらの視覚的な方法は、典型的に、長いインキュベーション時間(>60分間)を必要とする、検出のための特異的な機器を必要とするまたは研究所外での安定な(robust)検出について変化に敏感すぎる。リアルタイムPCR機器および化学における進歩は、PCR反応の間に多くのサンプルを同時にモニターすることを可能にした。検出原理は、典型的に、挿入色素によるdsDNAの蛍光検出の使用または配列特異的蛍光プローブの使用に基づき、費用のかかる機器を必要とする。この代わりに、ポリメラーゼ依存性の増幅の間に放出される水素イオンを検出するための機器が、開発された。これらの水素イオンの検出は、ハイスループット次世代シークエンシング(Ion Torrent(商標)Sequencing、Life Technologies、Grand Island、NY)において使用するために、例えば米国特許第7,888,015号明細書において実証されるように、最先端電子検出およびマイクロ流体デバイスを使用して実現された。

0003

ポイントオブケア(point−of−care)診断法および現場での診断法は、迅速で簡単な試験を必要とし、理想的には、30分未満で標的核酸を検出し、最先端で費用のかかる機器を伴わない。

0004

米国特許第7,888,015号明細書

先行技術

0005

Notomi,et al.,Nucleic AcidsRes.,28:E63(2000)
Tomita,et al.,Nat.Protoc,3:877−82(2008)
Goto,et al.,BioTechniques,46:167−72,(2009)
Gandelman,et al.,PLoS One,5:el4155(2010)
Mori et al.,Biochem.Biophys.Res.Commun.,289:150−4(2001)

課題を解決するための手段

0006

本発明の一実施形態において、1mM未満のTrisもしくは等価物の量で弱い緩衝剤を含有するまたは緩衝剤なしの調合物中に、pH感受性色素DNAポリメラーゼ、dNTPを含む調製物が、提供される。

0007

一態様において、調製物が、1つ以上のプライマーおよび鋳型DNAを含む。他の態様において、pH感受性色素が、視覚的に検出可能な有色色素または蛍光色素のいずれかである。

0008

本発明の一実施形態において、核酸の増幅を検出するための方法であって、弱緩衝または非緩衝液中に鋳型DNA、DNAポリメラーゼおよびpH感受性色素を含有する増幅反応混合物を提供するステップならびに標的DNAの増幅から結果として生じる色素のスペクトル特性における変化を検出するステップを含む方法が、提供される。

0009

一態様において、核酸増幅が、等温増幅または等温PCRである。

0010

他の態様において、等温核酸増幅が、ループ媒介性等温増幅(loop−mediated isothermal amplification)(LAMP)、ヘリカーゼ置換増幅(helicase displacement amplification)(HDA)、鎖置換増幅(strand displacement amplification)(SDA)、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅(recombinase polymerase amplification)(RPA)およびニッキング酵素増幅反応(nicking enzyme amplification reaction)(NEAR)からなる群から選択される。

0011

一態様において、pH感受性色素が、可溶性であり、他の態様において、可溶性色素が、可視光線において検出可能な有色色素である。適した色素の例は、クレゾールレッドフェノールレッドm−クレゾールパープルブロモクレゾールパープルニュートラルレッドナフトールフタレインチモールブルー、ナフトールフタレインである。

0012

他の態様において、pH感受性色素が、蛍光色素、例えば2’,7’−ビス−(2−カルボキシエチル)−5−(および−6)−カルボキシフルオレセインまたはカルボキシルセミナトロフルオル(seminaphthorhodafluor)である。

0013

他の態様において、弱緩衝液が、1mM未満のTrisバッファーまたは等価なバッファーを含有する。

0014

方法の他の態様において、増幅の検出が、増幅が起こった前および後の色素のスペクトルまたは蛍光特性における変化を比較することに依存する。

0015

本発明の一実施形態において、標的配列がサンプル中に存在する場合に、標的配列の核酸増幅をモニターするための方法が提供され、増幅がサイクル閾値数を超えて進むにつれて、pHの変化が標的配列の存在化において決定され、モニターは、pH感受性の有色色素または蛍光色素を反応混合物に追加し、増幅前と比較した、増幅が起こった場合の色の変化を決定することによって実現される。

0016

特許または出願書類は、カラー制作された少なくとも1つの図を含有する。色のついた図を有するこの特許または特許出願刊行物コピーは、依頼および必要な料金の支払いと同時に特許によって提供されるであろう。

図面の簡単な説明

0017

図1Aおよび1Bは、様々な指標色素を使用する、終了した増幅反応の可視色変化検出を示す図である。ここで、LAMPは、pH9の低バッファー溶液においてラムダファージDNA標的配列を増幅するために使用され、増幅の終了時に、pHが低下し、色変化が起こる。図1Aは、50μΜまたは100μΜのフェノールレッド、クレゾールレッド、ニュートラルレッドおよびm−クレゾールパープルの存在下における反応の開始時のサンプルの色を示す。図1Bは、Bst 2.0(New England Biolabs、Ipswich、MA)DNAポリメラーゼを省いた場合ではなく、反応混合物中に含んだ場合の増幅から結果として生じるpHの減少に応じた、65℃での30分間のLAMP反応後のサンプルの色を示す。サンプルは、フェノールレッドおよびクレゾールレッドの存在下において赤色から黄色に;ニュートラルレッドを使用すると無色から赤色に;m−クレゾールパープルにより青紫色から黄色に変わった。
図2Aおよび2Bは、増幅反応前後の色素の色の比較を示す図である。ラムダファージDNA標的は、色変化が増幅反応の終了時に起こるように、示されるように、初期pH10またはpH7.5の低バッファー溶液においてLAMPを使用して増幅した。図2Aは、反応の開始時のサンプルの色を示す。ここで使用される色素は、pH10でよりアルカリ性指示薬(チモールブルー、ナフトールフタレイン、フェノールフタレイン)またはpH7.5でより中性の指示薬(ブロモクレゾールパープル)であり、すべて、示されるように50μΜまたは100μΜで含まれた。図2Bは、Bst 2.0 DNAポリメラーゼを省いた場合ではなく、反応混合物中に含んだ場合の増幅から結果として生じるpHの減少に応じた、65℃での60分間のLAMP反応後のサンプルの色を示す。Bst 2.0を含有するサンプルは、チモールブルーの存在下において青色から黄色に;ナフトールフタレインの存在下において青色から無色(50uM)または淡青色(100uM)に;フェノールフタレインの存在下において淡紅色から無色(50uM)または紅梅色(100uM)に;ブロモクレゾールパープルの存在下において青紫色から黄色に変わった。
図3Aから3Cは、増幅反応における色変化検出が、標的DNAの増幅に対して特異的であることを示す図である。ここで、2つの異なるDNAが、増幅された場合に同様に応答することが示された。LAMP反応は、示されるように、線虫lec−10またはヒトBRCA1配列標的のいずれかについてのプライマーにより低バッファー反応溶液中で実行した。Bst 2.0 DNAポリメラーゼおよび標的ゲノムDNA(+Temp)または非鋳型コントロール(NTC)および100μΜの指標色素(フェノールレッド、クレゾールレッド、ニュートラルレッドまたはm−クレゾールパープル)を含有した反応液を65℃で、0分間インキュベートした。図3Aは、特定の指示薬についてのすべてのチューブが、時間=0分間に同じ色で開始されたことを示す。図3Bは、鋳型DNAを含有するサンプルのみが、増幅の開始の15分後に色を変化させたことを示し、標的DNAのポジティブな増幅を表す。図3Cは、鋳型DNAを含有する、増幅されたサンプルの色変化が、増幅の開始の60分後に強まったことを示す。幾つかのNTCは、ポジティブな(標的)増幅と時間的に明らかに区別されたが、非特異的増幅により中程度のレベルの色変化を示した。
図4Aから4Cは、4つのpH感受性色素による、増幅の間の、鋳型量に応じた、反応時間にわたる色変化の感受性を示す図である。LAMP反応は、示されるように、鋳型DNA(HeLa)(100ngから0.1ngまたは0.01ng)の連続的な10倍の用量設定を使用して、ヒトCFTR配列についてのプライマーにより低バッファー反応溶液中で実行した。図4Aは、時間=0分間での指標色素(それぞれ100μΜ)の色を示す。図4Bは、フェノールレッドおよびニュートラルレッドの色素を使用する100ngから0.1ng標的DNAならびにクレゾールレッドおよびm−クレゾールパープルの色素については100ngから0.01ng DNAの増幅後、時間=15分間での色変化を示す。図4Cは、時間=30分間での、図4Aおよび4Bと同じ反応を示し、完全な色変化が、すべての色素について、すべての鋳型量について観察されたが、すべての非鋳型コントロールは、初期の色を保持した。
図5は、低バッファー反応において100μΜフェノールレッドを使用するPCR増幅反応の検出を示す図である。DNA鋳型を含有した三通りの反応のみ(1、2および3と標識)が淡紅色から黄色に色を変化させたが、DNA鋳型なしの反応液(4、5および6)は、淡紅色のままであった。
図6は、100μΜフェノールレッドを含有するPCR反応液の使用による細菌コロニー中の特異的なプラスミドDNAの同定を示す図である。PCRの後に、標的プラスミドを含有した3つのコロニー由来の細菌を有するポジティブサンプル(1から3)は、淡紅色から黄色に色を変化させた。無関係なプラスミドを含有するコロニー由来の細菌を有した3つのネガティブコントロール(aからc)は、変化させなかった。これは、プラスミドDNAを有するポジティブ(+)反応液および水のみを有するネガティブコントロール(−)の結果と一致し、特定のプラスミドの存在について細菌コロニーをスクリーニングするための色変化検出の適用可能性を実証した。
図7Aおよび7Bは、Bst 2.0ポリメラーゼの存在下および非存在下において100μΜ可視pH指示薬を使用する、ヒトDNAおよびBRCA1遺伝子についてのプライマーについてのSDA反応液の検出を示す図である。色変化は、Bst 2.0を含有するサンプルにおいて観察され、色変化は、Bst 2.0が存在しないサンプルにおいて観察されなかった。図7Aは、反応の開始時のBst 2.0の存在下および非存在下における反応液の色を示す。図7Bは、65℃での1時間のインキュベーション後のBst 2.0の存在下および非存在下における反応液の色を示す。色変化は、ポリメラーゼの存在下でのみ起こり、増幅の検出を示した。
図8Aから8Cは、蛍光pH指示薬のリアルタイム測定を使用する、LAMP反応の検出を示す図である。データは、差し引いたRFUとしてプロットし、ベースライン(0RFU)を生成するために、バックグラウンド値を最終RFUから差し引いた。DNAポリメラーゼなしでは、蛍光変化は、ほとんど観察されず(点線)、検出が増幅に対して特異的であり、pHの動きは、等温条件下で最小限であったことを示す。図8Aは、Bst 2.0 DNAポリメラーゼの存在下において、BCECF−AMについて蛍光の著しい低下を示し(CFX96(商標)蛍光計(Bio−Rad、Hercules CA)のFAチャネルで測定)、DNA増幅反応に対応する。図8Bは、DNA増幅に応じたSNARF−1(R)(Life Technologies、Grand Island、NY)の高pH形態についての蛍光における低下を示す(ROXチャネル)。図8Cは、DNA増幅に応じたSNARF−1の低pH形態についての蛍光における増加を示す(HEXチャネル)。
図9Aから9Cは、LAMP反応におけるpH変化の蛍光検出の感受性を示す図である。反応は、示されるように、ヒトCFTRについてのプライマーおよび様々な量の鋳型HeLa DNAを含有した。pH変化は、鋳型濃度依存性の形をしていることが観察され、蛍光変化に必要とされる時間は、反応液中に存在する鋳型DNAの量と相関した。鋳型量が多いほど、より急速なpH変化、従って蛍光変化がもたらされ、鋳型量が少ないほど、より遅いpH変化がもたらされたが、NTCは、初期のpHおよび蛍光値で安定したままであった。図9Aは、DNA増幅の間のBCECF−AMについてのpHにおける低下に対応する蛍光の低下を示す。
図9Aから9Cは、LAMP反応におけるpH変化の蛍光検出の感受性を示す図である。反応は、示されるように、ヒトCFTRについてのプライマーおよび様々な量の鋳型HeLa DNAを含有した。pH変化は、鋳型濃度依存性の形をしていることが観察され、蛍光変化に必要とされる時間は、反応液中に存在する鋳型DNAの量と相関した。鋳型量が多いほど、より急速なpH変化、従って蛍光変化がもたらされ、鋳型量が少ないほど、より遅いpH変化がもたらされたが、NTCは、初期のpHおよび蛍光値で安定したままであった。図9Bは、DNA増幅の間のSNARF−1(高pH)についてのpHにおける低下に対応する蛍光の低下を示す。
図9Aから9Cは、LAMP反応におけるpH変化の蛍光検出の感受性を示す図である。反応は、示されるように、ヒトCFTRについてのプライマーおよび様々な量の鋳型HeLa DNAを含有した。pH変化は、鋳型濃度依存性の形をしていることが観察され、蛍光変化に必要とされる時間は、反応液中に存在する鋳型DNAの量と相関した。鋳型量が多いほど、より急速なpH変化、従って蛍光変化がもたらされ、鋳型量が少ないほど、より遅いpH変化がもたらされたが、NTCは、初期のpHおよび蛍光値で安定したままであった。図9Cは、DNA増幅の間のSNARF−1の低pH形態の蛍光の増加を示す。
図10Aおよび10Bは、SNARF−1を使用する、異なるサイズの標的DNAを増幅するPCR反応の検出を示す図である。異なるサイズ(114bp、308bp、1278bp)を有する3つの断片を増幅した。反応における鋳型DNAの存在は、PCRの間の蛍光測定値の有意な変化に至った(バックグラウンド変化よりも>5000RFU)。シグナル低下のレベルは、アンプリコンサイズに比例し、114bpについて5000RFUまで、300bpについて6000RFUおよび1278bpアンプリコンについて8000RFU減少した。すべてのアンプリコンは、20サイクルまでのバックグラウンド補正した蛍光低下についての閾値時間をもたらした。図10Aは、PCRサイクリングにわたって記録した生の非補正RFUを示す。
図10Aおよび10Bは、SNARF−1を使用する、異なるサイズの標的DNAを増幅するPCR反応の検出を示す図である。異なるサイズ(114bp、308bp、1278bp)を有する3つの断片を増幅した。反応における鋳型DNAの存在は、PCRの間の蛍光測定値の有意な変化に至った(バックグラウンド変化よりも>5000RFU)。シグナル低下のレベルは、アンプリコンサイズに比例し、114bpについて5000RFUまで、300bpについて6000RFUおよび1278bpアンプリコンについて8000RFU減少した。すべてのアンプリコンは、20サイクルまでのバックグラウンド補正した蛍光低下についての閾値時間をもたらした。図10Bは、PCR反応の熱サイクルによるバックグラウンドのpHおよび蛍光の低下について補正するためにTaq DNAポリメラーゼなしのチューブからシグナルを差し引いた後のPCRサイクリングの間の正味RFU変化を示す。

0018

DNA合成の間のヌクレオシド三リン酸組み込み事象は、DNAポリメラーゼによって触媒される反応の間にピロりん酸基および水素イオンを生成する。

0019

バッファー条件がないと、プロトンはDNA増幅反応液中蓄積し、溶液は、DNA増幅の増加と共にますます酸性になる。

0020

大きなかさ高い有機分子であるpH指標色素が増幅反応に干渉するかもしれないまたは増幅の間のプロトン濃度の増加がpH指示薬における色もしくは蛍光の検出可能な変化を可能にするのに十分ではないという初期の懸念にもかかわらず、これらの分子がDNA増幅をモニターするために使用できることが示された。dNTP、核酸、酵素および保存溶液から持ち越される緩衝剤由来のバッファー効果による溶液のバッファー能力にもかかわらず、pH変化は、LAMP反応において4pH単位くらいの高さになることが観察された。増幅反応をモニターするための化学色素および蛍光色素の実用性は、限定されることが意図されない一連の実施例によって支持される。好ましくは眼によって可視であるpH指標色素を含む蛍光色素およびまた化学色素は、様々な時点;様々な濃度の色素およびDNA標的;異なるタイプの標的DNAならびに例えば、定性的におよび定量的にの両方で分析されるSDA、LAMPおよびPCRなどのような、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを利用する任意のタイプの増幅プロトコールで、増幅産物の形成の検出において有効である。有意に、増幅エンドポイントの検出は、曖昧さを伴うことなく達成することができた。

0021

本発明の実施形態は、DNA増幅を検出するための手段として果たす、広範囲のpH感受性可視色素または蛍光色素を個々にまたは一緒に使用して、低費用および安定した能率で、増幅産物の形成および任意選択で数量を迅速におよび確実に検出する組成物および方法を提供する。ポリメラーゼは典型的に5から10のpHで働くので、色素の選択は、この範囲内の変化を反映する。可視色素については、色の変化は、異なるpHで同定されるのに対して、蛍光色素については、pHが蛍光色素のよく知られている特性に依存して低下するので、蛍光の増加または減少が、検出されてもよい(例えばBCECF−AM対SNARF−1を参照されたい。)。

0022

増幅反応のpHは、反応バッファーの非存在下においておよびまた酵素保存バッファーから持ち越された場合に生じるかもしれないなどのような、幾つかの残存しているバッファーの存在下においても(例えば、少なくとも約1mMのバッファーまで、例えば150μΜ Tris)、指標色素を使用して確実に測定されてもよい。一実施形態において、PCR反応が、反応バッファーの非存在下においてまたは残存しているバッファー(150μΜ Tris)の存在下において標準的な条件を使用して実行され、同様の結果を伴った。

0023

少なくともpH5から10のpH範囲に対して耐性鎖置換ポリメラーゼを使用して、LAMPは、≦1mM緩衝剤を有する溶液において実行された。中性のpH範囲移行指示薬の存在下においてアルカリ性条件(pH8から10)において反応を開始することによって、初期の高pH色が、観察された(例えば表1を参照されたい。)。増幅が進むにつれて、溶液pHは10分間ほどで第2の酸性pH(pH5から7)まで実質的に減少し、検出可能な色変化をもたらした。この色差は、容易に目に見えた。

0024

様々な色を有する広範囲のpH色指示薬があり、いずれも、本発明の実施形態における使用に適している(例えば、青紫色から黄色、赤色から黄色、黄色から赤色)。異なるpHで色を変化させる8つの異なるpH感受性色素についての実施例が、本明細書において提供される。これらの実施例は、限定するようには意図されない。

0025

指標色素のスペクトル特性における変化の検出は、例えば、オペレーターの眼、蛍光計または分光光度計を使用して、これらの光化学的特性によって実現することができる。用語「検出する」は、用語「モニターする」と区別なく使用されてもよい。

0026

適した可視色素は、pHが8よりも高い場合、真黄色の色、pHが6.8未満である場合、赤色の色を有するニュートラルレッド;pHが8よりも高い場合、赤色の色、pHが6.4未満である場合、黄色の色を有するフェノールレッド;pHが8.8よりも高い場合、赤みがかっている紫色の色、pHが7.2未満である場合、黄色の色を有するクレゾールレッド;pHが9.6よりも高い場合、青色の色、pHが8.0未満である場合、黄色の色を有するチモールブルー;pHが10よりも高い場合、フクシア色、pHが8.3未満である場合、無色を有するフェノールフタレイン;およびpHが8.7よりも高い場合、緑がかっている色、pHが7.3未満である場合、蒼白色の赤みがかっている色を有するナフトールフタレインを含む。本明細書において使用される色素についてのこれらの特性は、表1に掲げる。

0027

0028

pH指示薬の他の例は、メチルイエローメチルオレンジブロモフェノールブルーナフチルレッドブロモクレゾールグリーンメチルレッドアゾリトミンナイルブルーチモールフタレインアリザリンイエローサリチルエロー、ニトロアミンを含む。これらの指示薬は、従来のDNAポリメラーゼ耐性の範囲の外側に移行し得るが、増幅検出の原理は、所望のpH範囲に適切な指示薬による代替の検出方法に適用され得る。

0029

検出デバイスを必要とするあるクラスの色素は、蛍光色素である。上記に言及される視覚的な色素のように、pH感受性蛍光色素は、異なるpHで、異なるレベルの蛍光放出またはピーク放出波長シフトを有する。光度における変化およびピーク吸収におけるシフトの両方は、適切なフィルターセット装備したシステムを使用して容易に検出することができる。

0030

本発明の実施形態における使用のための蛍光色素は、pHに基づく蛍光のシフトを特色とする5−(および−6)カルボキシSNARF−1を含む。高pH(pH9)SNARF−1で、Amax 575nm/Emmax 650nmの最大の吸収/放出。これらの値は、pHが低下すると、Amax 525/Emmax 590まで有意にブルーシフトする。この蛍光シフトは、色素の2つの状態の同時のモニターを可能にし、一方の蛍光チャネルは、高pH形態(増幅と共に蛍光減少を示す、図5)に対応し、もう一つのチャネルは、低pH形態(蛍光増加)に対応する。発明者らは、pH10からpH6へのキャリブレーション溶液(calibration solution)のpH低下と同時に、高pH形態について蛍光の90%の損失(CFX96機器のROXチャネルにおいて測定したまたは蛍光の200%の増加(HEXチャネル)を測定した。SNARF−1と関係する他の適した蛍光色素は、pH変化をモニターするために開発されており、SNARF−4FおよびSNARF−5F、SNAFR、SNAFL、5−(および−6)−カルボキシナフトフルオレセイン、6−JOE、Oregon Green(R)(Life Technologies、Grand Island、NY)を含む。他の蛍光pH指示薬は、pH9でAmax 500nm/Emmax535nmの吸収/放出プロファイルを有する2’,7’−ビス−(2−カルボキシエチル)−5−(および−6)−カルボキシフルオレセイン,アセトキシメチルエステル(BCECF−AM)(Life Technologies、Grand Island、NY)を含む。このBCECF−AMもまた、pHが低下するにつれてスペクトルの青色シフトを特色とするが、低pH形態は、励起においてこれほど効率的ではなく、有効な読み取りは、高pH形態からの蛍光の減少に限られる。蛍光のおよそ80%の低下は、pH10からpH6で、BCECF−AM(CFX96のFAMチャネル)について測定された。BCECFはフルオレセインに由来し、フルオレセインと関係する多くの色素は、pH変化に対して同様の感受性を示す。

0031

上記に言及されるものを含む視覚的なおよび蛍光色素は、pHに応じた、改変された比色定量特性を有するように、化学的に修飾することができる。これらの修飾は、より明るいまたはより狭いpH範囲で色を変化させ、従って、より好適な検出を可能にする色素を作成することができる。

0032

LAMPおよびSDA、HDA、RPAならびにNEARなどのような等温ポリメラーゼ依存性増幅反応は、可視および蛍光色素を使用して、pH変化を測定することによって容易にモニターすることができる。例えば、共通してBst 2.0ポリメラーゼを利用するLAMP増幅、例えばGill,et al.,Nucleos.Nucleot Nucleic Acids,27:224−43(2008);Kim,et al,Bioanalysis,3:227−39(2011);Nagamine et al.,Mol.Cel.Probes,16:223−9(2002);Notomi et al.,Nucleic Acids Res.,28:E63(2000);およびNagamine et al.,Clin.Chem.,47:1742−3(2001)を参照されたい、は、化学物質または蛍光色素を使用して視覚的に検出可能な付随するpH変化を測定することによってモニターすることができる。

0033

PCRなどのような温度サイクリング増幅プロトコールは、どのポリメラーゼが増幅において使用されるかに関係なく、化学物質または蛍光色素を使用して、pH変化によってモニターすることができる。PCRは、Q5(R)DNAポリメラーゼ、Phusion(R)DNAポリメラーゼ、OneTaq(R)などのようなポリメラーゼを利用してもよい(New England Biolabs、Ipswich、MA(Phusionは、Thermo Fisher Scientific、Waltham、MAの登録商標である。))。例外を伴うことなくこれらのポリメラーゼは、DNAを増幅し、色素によって検出される付随するpH変化を伴う。実際に、任意の適したポリメラーゼが、DNAを増幅するために使用されてもよく、pH感受性指標色素を使用して次いで検出することができるプロトンの放出がもたらされる。

0034

このDNA増幅検出方法の多くの適用がある。このDNA増幅検出方法は、標準的な分子生物学プロトコールにおいて増幅反応の成功を示す手段として使用することができ、ゲル電気泳動法の実行の必要性を不要にする。この検出は、プラスミド中に適正な挿入物を持つことについてコロニーをスクリーニングする際のように、所望のDNA種の存在または非存在の表示を含むことができる。種の検出は、特異的なDNAまたはRNA標的種の存在または非存在を、サイクリングまたはインキュベーション時間の後の色変化によって示すことができるので、診断適用まで及ぶ。これは、特に、現場またはポイントオブケア試験において、LAMPなどのような等温増幅方法に適する。色変化の迅速さおよびロバスト性(robustness)は、最先端の機器を伴うことなく、素速く、診断標的の効率的な検出を可能にする。色または蛍光変化は、リアルタイムでモニターすることができ、このような情報が必要とされる標的核酸の量の定量化、例えばシークエンシングライブラリー調製、転写プロファイリングおよび装填物測定を可能にする。

0035

このpH依存性検出方法は、DNAシークエンシングなどのようなDNA合成を必要とする他の適用において使用することができる。それぞれのヌクレオチドの追加は、プロトンを生成し得、また、DNAのプールにおいて生成される全プロトンは、反応液を酸性にする要因となる。pHにおけるこの変化は、pH感受性色素を使用して検出することができる。4つのdNTPのうちの1つについて順番に調べることにより、どの塩基を追加することができるかを決定し、従って、複数回の反応の後に配列の構築を可能にすると思われる。

0036

緩衝剤は、典型的に、保存に向けて、反応混合物および構成成分に安定性をもたらす。本明細書において記載される検出方法は、増幅の間の適切な色変化のために、緩衝剤だけではなく、所望のpH(典型的にアルカリ性)の維持を最小限しか必要としない、もしくは全く必要としない。酵素保存バッファーまたは反応溶液に存在する少量の緩衝剤は、この目的のために十分となり得、あるいはこの代わりに、反応混合物は、長期間の保存の間、安定性を維持するために凍結乾燥されてもよい。

0037

本発明の実施形態は、核酸増幅の視覚的な検出のための、簡単で、安定な、迅速、高感度、費用効果的な手段を提供する。

0038

本明細書において引用される参考文献はすべて、参照によって組み込まれる。

0039

[実施例1]
pH感受性視覚的色素を使用するLAMP増幅の検出
LAMP反応は、バッファーなし反応溶液:10mM (NH4)2SO4、50mM KCl、8mM MgSO4、1.4mM dNTP、0.1% Tween−20、pH7.5から10、により実行した。最終バッファー濃度は、酵素保存バッファーキャリーオーバー由来の0.026mMから0.4mM Trisであった。

0040

反応は、ラムダファージDNAアンプリコンについてのプライマーおよび5ngのラムダDNAにより実行した(図1Aおよび図1B、図2Aおよび図2B;New England Biolabs、Ipswich、MA)。反応は、DNAポリメラーゼ(Bst 2.0)の存在下または非存在下において、示されるように50μΜまたは100μΜpH指示薬と共に65℃で30から60分間、インキュベートした。色変化は、DNAポリメラーゼの存在下においてのみ起こり、増幅が、視覚的な同定に十分なpH低下をもたらしたことを示した。

0041

図3Aから図3Cにおいて、LAMP反応は、線虫lec−10またはヒトBRCA1配列標的のいずれかについてのプライマーによりバッファーなし反応溶液中で実行した。反応液は、82.5ng線虫DNA、100ng HeLa DNA(+Temp)を含有したまたはDNAを含有しなかった(NTC)。反応液は、pH指示薬の存在下において30分間、65℃でインキュベートし、鋳型DNAを含有するサンプルのみが、眼によって観察される色変化を示した。

0042

図4Aから図4Cにおいて、反応液は、ヒトCFTRについてのプライマーおよび様々な量の鋳型HeLaゲノムDNA(100ngから0.01ng;29000から2.9コピー)を含有した。安定な色変化が、15分間で、すべての指示薬で100ngから0.1ngについてならびにクレゾールレッドおよびm−クレゾールパープル鋳型濃度についてすべての濃度で観察された。30分後、すべての指示薬が、すべての鋳型濃度について色を変化させたが、ネガティブコントロール(鋳型DNAなし)は、初期高pH色のままであった。使用したLAMPプライマー配列は、以下の通りであった。

0043

0044

[実施例2]
pH感受性視覚的色素を使用するPCR増幅の検出
PCR反応は、25μl中、500nMのそれぞれpAII17プラスミドDNA由来の1.287kb断片を増幅するフォワードおよびリバースプライマー、400μΜのそれぞれの4つのdNTP、100μΜフェノールレッド、0.025μlの1M KOH、1.875UのTaqDNAポリメラーゼを使用して、50mM KClおよび2.25mM MgCl2中で実行した。PCR反応は、2分間95℃、36サイクルの10秒間95℃、15秒間62℃、30秒間68℃で実行した。PCRサイクリング前に、DNA鋳型ありまたはなしのチューブはすべて、同じ淡紅色を有した。PCR反応の終了時に、DNA鋳型を有した三通りの反応(1、2および3と標識;図5)が淡紅色から黄色に色を変化させたが、DNA鋳型なしの反応液(4、5および6と標識;図5)は、淡紅色のままであった。鋳型を含有する反応におけるDNA合成は、リアルタイムPCRマシンおよびアガロースゲル電気泳動法を使用して確認した。従って、色変化は、PCR反応の成功についての信頼できる視覚的な指示薬をもたらした。プライマー配列は、以下の通りであった。

0045

0046

[実施例3]
細菌コロニーにおけるプラスミドDNAの視覚的な検出
PCR反応は、特異的なプラスミドDNAを持つように形質転換された大腸菌コロニーを同定するために、フェノールレッドの存在下において実行した。それぞれのコロニーのほんの一部を10μl水中に懸濁し、1μlをPCR反応に追加し、PCR反応を実施例2において記載されるように実行した。6つのコロニーについて、ポジティブコントロール(+)において使用されるものと同じプラスミドを持つプレート由来の3つのコロニー(1から3)および無関係なプラスミドを含有する細菌プレート由来の3つのコロニー(aからc)で試験した。ポジティブコントロールにおいてのように、標的プラスミドDNAを含有したチューブは、淡紅色から黄色に色を変化させた(図6)。無関係なプラスミドを含有するチューブは、ちょうど、いかなる鋳型も有していないチューブ(−)のように淡紅色のままであった。従って、これらのPCR反応における色変化は、特異的なプラスミドDNAを含有するコロニーの決定を可能にした。このアプローチは、厄介で、時間のかかる、PCR増幅を決定するためにアガロースゲル電気泳動法を使用する従来のステップを回避した。

0047

[実施例4]
pH感受性視覚的色素を使用するSPA増幅の検出
SDA反応は、バッファーなし反応溶液:8mM MgSO4、50mM KCl、10mM (NH4)2SO4、0.4mM dATP、0.4mM dGTP、0.4mM dTTP、0.8mM 2’−デオキシシチジン−5’−O−(1−チオトリホスフェート)(dCTP−αS;TriLink BioTechnologies、San Diego、CA)、0.5μΜ SDAプライマー、0.2U/μl BsoBI(New England Biolabs、Ipswich、MA)、0.32U/μl Bst 2.0、pH8.8中で実行した。最終バッファー濃度は、酵素保存バッファーキャリーオーバー由来の0.23mM Trisであった。プライマー配列は、ヒトBRCA1について設計し、BsoBI制限部位を含有した。反応は、図7Aおよび図Bにおいて示されるように、100μΜ pH感受性色素の存在下において65℃で60分間、インキュベートし、Bst 2.0DNAポリメラーゼを含有する反応のみが色を変化させた。これは、pH減少に基づく増幅の検出の成功を示した。プライマー配列は、以下の通りであった。

0048

0049

[実施例5]
pH感受性蛍光色素を使用するLAMP増幅の検出
LAMP反応は、ラムダ(図8Aから図8C)またはCFTR(図9Aから図9C)プライマーを使用して、実施例1におけるように、バッファーなし溶液中で実行した。pH感受性蛍光色素BCECF−AM(2μΜ)およびSNARF−1(10μΜ)を、pHの減少を介して増幅をレポートするために使用した。蛍光測定は、FAMチャネル、BCECF−AM;ROXチャネル、SNARF−1高pH形態;HEXチャネル、SNARF−1低pH形態に対応する色素スペクトルによりCFX−96リアルタイム蛍光計を使用して実行した。蛍光の損失(BCECF−AMおよびSNARF−1高pH形態)または蛍光の増加(SNARF−1低pH形態)によって測定されるpHの減少は、図8Aから図8Cにおいて示されるように、増幅反応に対して特異的であり、DNAポリメラーゼを欠く反応は、バックグラウンドにおける有意な変化を示さなかった。蛍光変化までの時間は、急速であり(<10分間)、LAMP反応の能率およびスピードを示した。検出はまた、図9Aから図9Cにおいて示されるように定量的でもあり、段階希釈HeLa標的DNA量の間で明らかな差異があった。

0050

[実施例6]
pH感受性蛍光色素を使用するPCR増幅の検出
3つのペアのプライマーを、異なるサイズのアンプリコンを増幅するために使用した。309bpおよび1287bp(pAII17プラスミドDNA由来)ならびに114bp(大腸菌ゲノムDNA由来)のアンプリコンは、10μΜ pH感受性蛍光色素SNARF−1を視覚的色素フェノールレッドの代わりに反応に含めた以外は、実施例2におけるように実行したPCR反応において使用した。蛍光測定値は、CFX96マシンのROXチャネルで記録した。記録されたシグナルの著しい低下は、PCRサイクリングの間にDNA鋳型を含有する反応において観察された(図10A)。TaqDNAポリメラーゼまたはDNA鋳型を含有しなかった反応(ネガティブコントロール)は、熱サイクル由来のpH変化と同じ速度でゆっくりと減少した。ネガティブコントロールからシグナルを差し引いた後に、鋳型を有する反応は、図10Bにおける劇的なシグナル減少を示した。シグナル低下のレベルは、アンプリコンサイズに比例した。この実施例は、pH感受性蛍光色素が、リアルタイムでPCR反応をモニターするために使用することができることを実証した。上記に列挙される1287bpプライマーに加えて、プライマー配列は以下の通りであった。

実施例

0051

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