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技術 インターロイキン−2融合タンパク質及びそれらの使用

出願人 ロシュグリクアートアーゲー
発明者 ホッセ,ラルフクライン,クリスティアンメスナー,エッケハルトピーターソン,ローレンスバーナードウマーニャ,パブロウィッカー,リンダ
出願日 2013年8月7日 (6年0ヶ月経過) 出願番号 2015-525869
公開日 2015年10月29日 (3年9ヶ月経過) 公開番号 2015-530984
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 隣接グループ 中間親 共通サイト 単一チューブ フォーミュラ リサイクリング 組成物単独 疎水性固体
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重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、一般に、免疫グロブリンインターロイキン−2(IL−2)の融合タンパク質に関する。更に、本発明は、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質を生成するため方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。

概要

背景

調節性T細胞(Tregs)は、自己寛容の維持に重要であるTリンパ球の特定のサブセットを表す。抑制機能を有するこれらのCD4+CD25hi細胞は、転写因子FOXP3並びにCD127lo、CTLA−4+、LAP、CD39+、PD−1+、GARPなどの他の細胞マーカーの細胞内発現により、エフェクターT細胞から区別することができる。FOXP3は、Tregの分化及び機能のために重要であり、FOXP3遺伝子の欠損及び変異は、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群(IPEX)に罹患したscurfyマウス患者の双方において、Tregの欠乏又は機能の欠如に起因して、自己免疫寛容破壊および自己免疫疾患発症をもたらす。

1型糖尿病における自己免疫反応全身性エリテマトーデスSLE)、多発性硬化症、及び他の多くが、Tregの欠乏と相関している。動物モデルからのデータは、自己免疫応答は、Tregの、自己に対する破壊的な免疫応答の制御の不全によって促進されるという仮説を支持している。1型糖尿病は、膵臓インスリン産生β細胞の大部分の破壊後に起こる自己免疫疾患である。1型糖尿病の頻度は、米国の人口の〜0.3%であり、その発生率は、米国、欧州、特に欧(ほぼ1%)で増加し続け、次の20年以内に倍増すると予想される。

サイトカインIL−2は、Treg並びにエフェクターT細胞(Teff)の両方の活性化と機能において主要な役割を果たしている。IL−2の産生の欠乏又は応答性の欠如は、優先的にTreg機能の喪失及び自己免疫の可能性の増大をもたらす。TregはTeffより高レベル高親和性IL−2受容体を発現するので、Teff細胞と比較して、低用量のIL−2は、優先的にTregの維持を支援する。

インビトロ及びインビボでTregを活性化するIL−2の選択的な効果により、低用量で長寿命のIL−2療法の可能性は、自己免疫疾患における成功について大きな見込みを持っているように思われる。IL−2(プロロイキン登録商標))による、200人の患者の、二重盲検プラセボ対照、1型糖尿病の臨床試験は、2013年後半に開始するように設定されている。毎日、低用量のプロロイキン(登録商標)を用いる、最近の臨床試験では、慢性移植片対宿主病(GVHD)及びC型肝炎ウイルスによって誘発される血管炎徴候と症状の一部を改善した(Koreth et al., New Engl J Med 365, 2055-2066 (2011), Saadoun et al., New Engl J Med 365, 2067-2077 (2011))。両試験において、低用量のプロロイキン(登録商標)は、Tregを誘導し、Treg:Teffの比を増加させた。しかし、プロロイキン(登録商標)の悪いPK特性は、男性において、IL−2の低く、一貫したレベルを維持するためにそれを準最適にする。臨床試験で試験されている他の方法は、生体外でのTregの個別化増殖と続く再注入であるが、しかし、このアプローチ理想的とは言えず、品質管理上の問題の困難な組を表している。

このため、天然の調節性T細胞(Treg)媒介型優性免疫寛容を再確立する新たな治療アプローチは、1型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、並びに他の自己免疫疾患及び免疫系の炎症誘発性疾患、例えば、慢性の移植片対宿主病、喘息肺線維症慢性閉塞性肺疾患など、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患、及び実質臓器骨髄共に移植拒絶反応などの自己免疫疾患に罹患した患者を治療する能力を大きく増強するであろう。

本発明のIL−2融合タンパク質は、Tregを優先的に活性化し、Treg:Teffの高比率へとバランスを傾けて、自己免疫応答を減らす。それらは、長寿命であり、好都合投与スケジュールを可能とし、かつエフェクター機能を欠き、潜在的な副作用及び有効性の低下を減少させる。

概要

本発明は、一般に、免疫グロブリンインターロイキン−2(IL−2)の融合タンパク質に関する。更に、本発明は、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質を生成するため方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。

目的

本発明は、(i)Fc受容体に対する免疫グロブリン分子結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び(ii)2つのインターロイキン−2(IL−2)分子を含む融合タンパク質を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

(i)Fc受容体に対する免疫グロブリン分子結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び(ii)2つのインターロイキン−2(IL−2)分子を含む融合タンパク質

請求項2

前記免疫グロブリン分子は、IgGクラスの免疫グロブリン分子、特に、IgGサブクラスの免疫グロブリン分子である、請求項1に記載の融合タンパク質。

請求項3

前記免疫グロブリン分子はヒト免疫グロブリン分子である、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。

請求項4

前記免疫グロブリン分子は抗原への特異的結合能力を持たない、請求項1から3の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項5

前記免疫グロブリン分子は、ヒトVh3−23生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列を含む、請求項1から4の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項6

前記免疫グロブリン分子は、配列番号9の重鎖可変領域配列を含む、請求項1から5の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項7

前記免疫グロブリン分子は、ヒトVk3−20生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む、請求項1から6の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項8

前記免疫グロブリン分子は、配列番号11の軽鎖可変領域配列を含む、請求項1から7の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項9

前記Fc受容体はFcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である、請求項1から8の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項10

前記Fc受容体は活性化Fc受容体である、請求項1から9の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項11

前記Fc受容体は、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)の群から選択される、請求項1から10の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項12

前記Fc受容体はFcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである、請求項1から11の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項13

前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置329(EU番号付け)に、アミノ酸置換を含む、請求項1から12の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項14

前記アミノ酸置換はP329Gである、請求項13に記載の融合タンパク質。

請求項15

前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置234及び235(EU番号付け)に、アミノ酸置換を含む、請求項1から14の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項16

前記アミノ酸置換はL234A及びL235A(LALA)である、請求項15に記載の融合タンパク質。

請求項17

前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖に、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含む、請求項1から16の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項18

前記IL−2分子は、野生型IL−2分子である、請求項1から17の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項19

前記IL−2分子は、ヒトIL−2分子である、請求項1から18の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項20

前記IL−2分子は、配列番号1又は配列番号3の配列、特に配列番号3の配列を含む、請求項1から19の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項21

前記IL−2分子は各々、それらのN末端アミノ酸で、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖の一方のC末端アミノ酸へ、任意でリンカーペプチドを介して融合している、請求項1から20の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項22

融合タンパク質は、配列番号17及び配列番号19のポリペプチド配列を含む、請求項1から21の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項23

請求項1から22の何れか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド

請求項24

請求項23に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター

請求項25

請求項23に記載のポリヌクレオチド又は請求項24に記載のベクターを含む宿主細胞

請求項26

(i)請求項25に記載の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適した条件下で培養する工程と、(ii)融合タンパク質を回収する工程とを含む、請求項1から22の何れか一項に記載の融合タンパク質を生成するための方法。

請求項27

(i)Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び(ii)2つのインターロイキン−2(IL−2)分子を含む、請求項38に記載の方法により生成される、融合タンパク質。

請求項28

請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物

請求項29

医薬としての使用のための、請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項28に記載の薬学的組成物。

請求項30

自己免疫疾患治療又は予防における使用のための、請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項28に記載の薬学的組成物。

請求項31

前記自己免疫疾患は、1型糖尿病全身性エリテマトーデスクローン病多発性硬化症の群から選択される、請求項30に記載の融合タンパク質又は薬学的組成物。

請求項32

移植拒絶反応又は移植片対宿主病の治療又は予防において使用のための、請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質又は請求項28に記載の薬学的組成物。

請求項33

それを必要している個体における疾患の治療のための医薬の製造のための、請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質の使用。

請求項34

前記疾患が自己免疫疾患である、請求項33に記載の使用。

請求項35

前記自己免疫疾患は、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、多発性硬化症の群から選択される、請求項34に記載の使用。

請求項36

前記疾患が移植拒絶反応又は移植片対宿主病である、請求項33に記載の使用。

請求項37

前記個体は哺乳動物、特にヒトである、請求項33から36の何れか一項に記載の使用。

請求項38

請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質を薬学的に許容される形態で含む組成物の治療的に有効な量を前記個体に投与することを含む、個体における疾患を治療する方法。

請求項39

前記疾患が自己免疫疾患である、請求項38に記載の方法。

請求項40

前記自己免疫疾患は、1型糖尿病、全身性エリテマトーデス、クローン病、多発性硬化症の群から選択される、請求項39に記載の方法。

請求項41

前記疾患が移植拒絶反応又は移植片対宿主病である、請求項38に記載の方法。

請求項42

前記個体は哺乳動物、特にヒトである、請求項38から41の何れか一項に記載の方法。

請求項43

インビトロ又はインビボ調節性T細胞選択的活性化において使用のための請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質。

請求項44

前記活性化は、調節性T細胞の増殖の誘導及び/又は調節性T細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達の誘導を含む、請求項43に記載の融合タンパク質。

請求項45

前記使用はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約1ng/mL以下、具体的には約0.1ng/mL以下の濃度で使用される、請求項43又は44に記載の融合タンパク質。

請求項46

前記使用はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約20μg/kg体重以下の用量で、具体的には約12μg/kg体重以下の用量で、より具体的には約6μg/kg体重以下の用量で使用される、請求項43又は44に記載の融合タンパク質。

請求項47

請求項1から22及び27の何れか一項に記載の融合タンパク質と前記調節性T細胞を接触させることを含む、インビトロ又はインビボでの調節性T細胞の選択的活性化のための方法。

請求項48

前記活性化は、調節性T細胞の増殖の誘導及び/又は調節性T細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達の誘導を含む、請求項47に記載の方法。

請求項49

前記方法はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約1ng/mL以下、具体的には約0.1ng/mL以下の濃度で使用される、請求項47又は48に記載の方法。

請求項50

前記方法はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約20μg/kg体重以下の用量で、具体的には約12μg/kg体重以下の用量で、より具体的には約6μg/kg体重以下の用量で使用される、請求項47又は48に記載の方法。

請求項51

以上に記載される発明。

技術分野

0001

本発明は、一般に、免疫グロブリンインターロイキン−2(IL−2)の融合タンパク質に関する。更に、本発明は、そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明はさらに、本発明の融合タンパク質を生成するため方法、及び疾患の治療においてそれらを使用する方法に関する。

背景技術

0002

調節性T細胞(Tregs)は、自己寛容の維持に重要であるTリンパ球の特定のサブセットを表す。抑制機能を有するこれらのCD4+CD25hi細胞は、転写因子FOXP3並びにCD127lo、CTLA−4+、LAP、CD39+、PD−1+、GARPなどの他の細胞マーカーの細胞内発現により、エフェクターT細胞から区別することができる。FOXP3は、Tregの分化及び機能のために重要であり、FOXP3遺伝子の欠損及び変異は、X連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群(IPEX)に罹患したscurfyマウス患者の双方において、Tregの欠乏又は機能の欠如に起因して、自己免疫寛容破壊および自己免疫疾患発症をもたらす。

0003

1型糖尿病における自己免疫反応全身性エリテマトーデスSLE)、多発性硬化症、及び他の多くが、Tregの欠乏と相関している。動物モデルからのデータは、自己免疫応答は、Tregの、自己に対する破壊的な免疫応答の制御の不全によって促進されるという仮説を支持している。1型糖尿病は、膵臓インスリン産生β細胞の大部分の破壊後に起こる自己免疫疾患である。1型糖尿病の頻度は、米国の人口の〜0.3%であり、その発生率は、米国、欧州、特に欧(ほぼ1%)で増加し続け、次の20年以内に倍増すると予想される。

0004

サイトカインIL−2は、Treg並びにエフェクターT細胞(Teff)の両方の活性化と機能において主要な役割を果たしている。IL−2の産生の欠乏又は応答性の欠如は、優先的にTreg機能の喪失及び自己免疫の可能性の増大をもたらす。TregはTeffより高レベル高親和性IL−2受容体を発現するので、Teff細胞と比較して、低用量のIL−2は、優先的にTregの維持を支援する。

0005

インビトロ及びインビボでTregを活性化するIL−2の選択的な効果により、低用量で長寿命のIL−2療法の可能性は、自己免疫疾患における成功について大きな見込みを持っているように思われる。IL−2(プロロイキン登録商標))による、200人の患者の、二重盲検プラセボ対照、1型糖尿病の臨床試験は、2013年後半に開始するように設定されている。毎日、低用量のプロロイキン(登録商標)を用いる、最近の臨床試験では、慢性移植片対宿主病(GVHD)及びC型肝炎ウイルスによって誘発される血管炎徴候と症状の一部を改善した(Koreth et al., New Engl J Med 365, 2055-2066 (2011), Saadoun et al., New Engl J Med 365, 2067-2077 (2011))。両試験において、低用量のプロロイキン(登録商標)は、Tregを誘導し、Treg:Teffの比を増加させた。しかし、プロロイキン(登録商標)の悪いPK特性は、男性において、IL−2の低く、一貫したレベルを維持するためにそれを準最適にする。臨床試験で試験されている他の方法は、生体外でのTregの個別化増殖と続く再注入であるが、しかし、このアプローチ理想的とは言えず、品質管理上の問題の困難な組を表している。

0006

このため、天然の調節性T細胞(Treg)媒介型優性免疫寛容を再確立する新たな治療アプローチは、1型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、クローン病、並びに他の自己免疫疾患及び免疫系の炎症誘発性疾患、例えば、慢性の移植片対宿主病、喘息肺線維症慢性閉塞性肺疾患など、アテローム性動脈硬化症などの心血管疾患、及び実質臓器骨髄共に移植拒絶反応などの自己免疫疾患に罹患した患者を治療する能力を大きく増強するであろう。

0007

本発明のIL−2融合タンパク質は、Tregを優先的に活性化し、Treg:Teffの高比率へとバランスを傾けて、自己免疫応答を減らす。それらは、長寿命であり、好都合投与スケジュールを可能とし、かつエフェクター機能を欠き、潜在的な副作用及び有効性の低下を減少させる。

0008

一態様において、本発明は、(i)Fc受容体に対する免疫グロブリン分子結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び(ii)2つのインターロイキン−2(IL−2)分子を含む融合タンパク質を提供する。

0009

一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、IgGクラスの免疫グロブリン分子、特に、IgGサブクラスの免疫グロブリン分子である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持つ。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持たない。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトVh3−23生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号9の重鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトVk3−20生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号11の軽鎖可変領域配列を含む。更により具体的な実施形態において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号9の重鎖可変領域配列、及び配列番号11の軽鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持たず、ヒトVh3−23生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列、及び、ヒトVk3−20生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。

0010

一実施態様において、前記Fc受容体はFcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である。一実施態様において、前記Fc受容体は活性化Fc受容体である。一実施態様において、前記Fc受容体は、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)の群から選択される。特定の実施態様において、前記Fc受容体はFcγRIIIa、特にヒトFcγRIIIaである。一実施態様において、前記修飾は、免疫グロブリン分子のエフェクター機能を低下させる。特定の実施態様において、前記エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害ADCC)である。一実施態様において、前記修飾は、前記免疫グロブリン分子のFc領域にあり、特に、CH2領域にある。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置329に(EU番号付け)、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、前記アミノ酸置換はP329Gである。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置234と235に(EU番号付け)、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、前記アミノ酸置換はL234A及びL235A(LALA)である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置234、235と329に(EU番号付け)、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖においてアミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含む。

0011

一実施態様において、前記IL−2分子は、野生型IL−2分子である。一実施態様において、前記IL−2分子は、天然に生じる天然型IL−2に比較して、前記IL−2分子のIL−2受容体への結合親和性を変えないアミノ酸置換を含む。一実施態様において、前記IL−2分子は、ヒトIL−2の残基125に対応する位置にアミノ酸変異を含む。より特定の実施態様において、前記アミノ酸変異はアミノ酸置換C125Aである。一実施態様において、前記IL−2分子は、ヒトIL−2分子である。特定の実施態様において、前記IL−2分子は、配列番号1又は配列番号3の配列、特に配列番号3の配列を含む。一実施態様において、前記IL−2分子は、配列番号1又は配列番号3の配列、特に配列番号3の配列を有する。一実施態様において、前記IL−2分子は各々、それらのN末端アミノ酸で、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖の一方のC末端アミノ酸へ、任意でリンカーペプチドを介して融合している。

0012

特定の実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号17及び配列番号19のポリペプチド配列を含む。特定の実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号19の免疫グロブリン軽鎖と、配列番号17の免疫グロブリン重鎖IL−2融合ポリペプチドを含む。一実施態様において、前記融合タンパク質は、Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子と、2個のインターロイキン−2(IL−2)分子と、及び任意で一以上のペプチドリンカーとから本質的になる。一実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号19の2つの免疫グロブリン軽鎖と、配列番号17の2つの免疫グロブリン重鎖IL−2融合ポリペプチドとから本質的になる。

0013

本発明は更に、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。更に、本発明のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクターが提供される。別の態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞を提供する。本発明はまた、(i)本発明の宿主細胞を、融合タンパク質の発現に適した条件下で培養し、(i)融合タンパク質を回収する工程を含む、本発明の融合タンパク質を生成する方法を提供する。また、(i)Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び(ii)前記方法により生成された、2つのインターロイキン−2(IL−2)分子を含む融合タンパク質が提供される。

0014

一態様において、本発明は、本発明のコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。また、本発明の融合タンパク質又は薬学的組成物は、医薬としての使用のため、及び自己免疫疾患、具体的には1型糖尿病、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)又はクローン病、最も具体的には、1型糖尿病、又は移植片対宿主病又は移植拒絶反応の治療若しくは予防における使用のために提供される。更に、それを必要とする個体において疾患を治療するための医薬の製造のための本発明の融合タンパク質の使用、及び薬学的に許容される形態で本発明の融合タンパク質を含む組成物の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体において疾患を治療する方法が提供される。一実施態様において、前記疾患は自己免疫疾患である。より特定の実施態様において、前記疾患は自己免疫疾患は、1型糖尿病、多発性硬化症(MS)、全身性エリテマトーデス(SLE)又はクローン病である。更により特定の実施態様において、前記自己免疫疾患は、1型糖尿病である。別の実施態様において、前記疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。一実施態様において、前記個体は哺乳動物、特にヒトである。

0015

更に提供されるのは、インビトロ又はインビボで調節性T細胞の選択的活性化に使用するための本発明の融合タンパク質である。一実施態様において、前記活性化は、調節性T細胞の増殖の誘導、及び/又は、調節性T細胞における、IL−2受容体シグナル伝達、特にSTAT5のリン酸化の誘導を含む。一実施態様において、前記使用はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約1ng/mL以下、具体的には約0.1ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記使用はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約20μg/kg体重以下の用量で、具体的には約12μg/kg体重以下の用量で、より具体的には約6μg/kg体重以下の用量で使用される。

0016

本発明はまた、本発明の融合タンパク質と前記調節性T細胞を接触させることを含む、インビトロ又はインビボでの調節性T細胞の選択的活性化のための方法を提供する。一実施態様において、前記活性化は、調節性T細胞の増殖の誘導、及び/又は、調節性T細胞における、IL−2受容体シグナル伝達、特にSTAT5のリン酸化の誘導を含む。一実施態様において、前記方法はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約1ng/mL以下、具体的には約0.1ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記方法はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約20μg/kg体重以下の用量で、具体的には約12μg/kg体重以下の用量で、より具体的には約6μg/kg体重以下の用量で使用される。

図面の簡単な説明

0017

DP47GSIgG−IL−2融合タンパク質(配列番号13、15、19を参照)の精製。(A)プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。(B)サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収率4mg/L。(C)最終生成物分析キャピラリー電気泳動SDS(キャリパー)。以下のバンドが観察された:非還元− 111kDaで7.5%の面積、174kDaで92.5%の面積;還元− 29kDaで23.6%の面積、67kDaで23.5%の面積、82kDaで52.9%の面積。生成物は、約7.5%の「半分のIgG」を含んでいる。(D)TSKgel G3000 SW XLカラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー(91%単量体含有量)。
DP47GS IgG−(IL−2)2融合タンパク質(配列番号17、19を参照)の精製。(A)プロテインAアフィニティークロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。(B)サイズ排除クロマトグラフィー工程の溶出プロファイル。収率13mg/L。(C)最終生成物の分析的キャピラリー電気泳動SDS(キャリパー)。以下のバンドが観察された:非還元 − 172.5kDaで2.3%の面積、185kDaで97.7%の面積;還元 − 27.3kDaで18.3%の面積、29.2kDaで0.6%の面積、78.3kDaで81.1%の面積。(D)Superdex200カラム上での最終生成物の分析的サイズ排除クロマトグラフィー(100%単量体含有量)。
CD4+ Tregサブセット、NK細胞サブセット及びNKT細胞上でのCD25(IL−2RA)及びCD122(IL−2RB)の発現。細胞表面マーカーが、CD4+ Tregサブセット、NKT細胞及びNK細胞を定義するために用いられた。CD25及びCD122の染色を最適化するために、細胞内FOXP3染色は実施されなかった。(A、B)3つの調節性CD4+ T細胞(Treg)集団:ナイーブ(CD45RA+、CD25+;点線)、記憶(CD45RA−、CD25+;実線)及び活性化(CD45RA−、CD25hi;点線)。(C、D)NKT(点線)、CD56明るいNK細胞(破線)、CD56中間 NK細胞(実線)。灰色:アイソタイプコントロール
CD4+及びCD8+の通常型T細胞サブセットにおけるCD25(IL−2RA)及びCD122(IL−2RB)の発現。細胞表面マーカーが、ナイーブ(CD45RA+;点線)及び記憶(CD45RA−;実線)通常型CD4+ T細胞(A、B)、通常型記憶CD8+ T細胞(CD45RA−;実線)及びCD45RA+ CD8 T細胞(ナイーブ及びTEMRAサブセットの組合せ;TEMRAは、CD45RAの発現に戻ったエフェクター記憶細胞を意味する;点線)(C、D)を定義するために使用された。灰色:アイソタイプコントロール。
DP47GS IgG−IL−2に応答した、ヒト末梢血細胞サブセットにおけるpSTAT5aの誘導。3つの異なるヒトドナー(C4からC6)が、STAT5aリン酸化の誘導に対するDP47GS IgG−IL−2の様々な用量の効果について、別々の時間に評価された。結果は、CD4+ Tregサブセット:記憶及びナイーブTreg;通常型CD4+記憶Tエフェクター細胞;CD56明るい NK細胞;CD8+記憶Tエフェクター細胞;CD4+ナイーブTエフェクター細胞;NK細胞;NKT細胞;及びCD8+ナイーブTエフェクター+CD45RA+記憶細胞について示されている。
DP47GS IgG−(IL−2)2に応答した、ヒト末梢血細胞サブセットにおけるpSTAT5aの誘導。5つの異なるヒトドナー(N1、N2、C4−C6)が、STAT5aリン酸化の誘導に対するDP47GS IgG−(IL−2)2の様々な用量の効果について、別々の時間に評価された。結果は、CD4+ Tregサブセット:記憶及びナイーブTreg;通常型CD4+記憶Tエフェクター細胞;CD56明るい NK細胞;CD8+記憶Tエフェクター細胞;CD4+ナイーブTエフェクター細胞;NK細胞;NKT細胞;及びCD8+ナイーブTエフェクター+CD45RA+記憶細胞について示されている。
ヒト末梢血細胞サブセットにおけるpSTAT5aの誘導:DP47GS IgG−IL−2及びDP47GS IgG−(IL−2)2の比較各細胞サブセットについての結果を、各サブセットからの観察された最大効果に対して正規化し、TregについてのおよそのEC50は表2に示す。(A)DP47GS IgG−IL−2についての正規化した結果、(B)DP47GS IgG−(IL−2)2についての正規化した結果。
DP47GS IgG−IL−2とDP47GS IgG−(IL−2)2を比較する、3つのドナーにおけるTregサブセット感受性の詳細な検討。グラフは、3つのドナーについて、pSTAT5aMFIの平均値±SDを表す。(A)CD3+、CD4+、FoxP3+ Tregの全て。(B)活性化Treg。(C)記憶Tregs。(D)ナイーブTreg。
DP47GS IgG−IL2は、カニクイザルにおいて、調節性T細胞を増大させる用量依存性効果を有する。治療後7日目における全血CD4+ CD25+ FOXP3+調節性T細胞(Treg)の変化が、(A)全血のmm3あたりのTregの絶対細胞数として、及び(B)Tregの倍率変化として示される。全データは、平均値±SDとして表される。空の棒:DP47GS IgG−IL−2(n=6);影付きの棒:ビヒクル(n=3)。
カニクイザルにおいてTregに対するDP47GS IgG−IL−2の時間と低用量の効果。(A)2又は6μg/kgのDP47GS IgG−IL−2による投与後のTregの倍率増加の時間依存性変化(それぞれn=4及び6)。(B)2又は6μg/kgのDP47GS IgG−IL−2による投与後のTregの絶対数における時間依存性変化(それぞれn=4及び6)。全データは、平均値±SDとして示される。
単一投与のプロロイキン(登録商標)は、カニクイザルにおける一過性の用量依存性Treg応答を刺激する。(A)3x104から3x105IU/kgのプロロイキン(登録商標)の単一投与後の末梢血のTreg数の変化。(B)3x104から3x105IU/kgのプロロイキン(登録商標)の単一投与後のTregのpSTAT5aの変化。データは、平均値±SDとして示される。
カニクイザルにおけるTregの誘導において、低用量のDP47GS IgG−IL−2は、高用量のプロロイキン(登録商標)よりも有効である。正常な健常カニクイザル(n=5の群)は、低用量のDP47GS IgG−IL−2又は高用量のプロロイキン(登録商標)で処置され、調節性T細胞の変化が10日目に試験された。0日目と7日目に、DP47GS IgG−IL−2は16800IU/kg(12μg/kg)の用量でSC投与された。プロロイキン(登録商標)の処置(200000IU/kg)は、合計5回用量に対して週当たり3回、皮下投与された。結果は、(A)血液mm3あたりの全Tregの変化、(B)Tregの倍率増加、及び(C)通常型CD4+ FOXP3−細胞に対するTregの比率の変化について平均値±SDとして示される。空の棒:は、IL−2処置を示し、影付きの棒はビヒクル対照を示す。
インビボでのDP47GS IgG−IL−2 Treg活性化に対する感受性バイオマーカーとしての、エキソビボでの全血リン酸化STAT5。健常なカニクイザル(n=5)へのDP47GS IgG−IL−2の単一低用量(12μg/kg)のインビボ投与後1日目及び3日目に、全血が採取され、リン酸化STAT5(pSTAT5a)について刺激をせずに直ちに試験された。各々のサルは、処置前0日目に出血させ、pSTAT5aの量を測定し(影付きの棒)、処置後に倍率変化を評価するために個々に使用した(空の棒)。(A)1日目及び3日目のTreg pSTAT5aの倍率変化、(B)通常型CD4+ CD45−サルのT細胞におけるpSTAT5aの倍率変化、及び(C)ナイーブT細胞pSTAT5aの倍率変化が示される。データは、平均値±SDとして示される。
インビボでの低用量DP47GS IgG−IL−2活性化に対する感受性バイオマーカーとしての、エキソビボでの全血pSTAT5a。健常なカニクイザルへのDP47GS IgG−IL−2の単一低用量のインビボ投与後1日目から7日目に、全血が採取され、pSTAT5aについて刺激をせずに直ちに試験された。各々のサルは、pSTAT5aの非刺激レベルのために、処置前0日目に出血させ、処置後のpSTAT5aの変化と比較した。(A)2μg/kgのDP47GS IgG−IL−2による処置の前後のTregのpSTAT5a(n=4)。(B)6μg/kgのDP47GS IgG−IL−2による処置の前後のTregのpSTAT5a(n=6)。データは、平均値±SDとして示される。
エキソビボのカニクイザルの全血Ki−67は、インビボでのDP47GS IgG−IL−2誘導T細胞増殖に対するマーカーとして機能を果たす。図14に記載される、2及び6μg/kgのDP47GS IgG−IL−2で処置されたカニクイザルは、インビボでの増殖の程度を評価するために、細胞内マーカーKi−67の変化についてエキソビボでモニターされた。細胞周期における細胞(Ki−67+)の正常な定常状態の割合は、治療前の0日目に定量化し、その後、次の7日目から11日目まで毎日モニターされた。(A)TregのKi−67+の%、(B)通常型CD4+CD45−サル/エフェクターT細胞のKi−67+の%、及び(C)ナイーブCD4+CD45RA+ T細胞のKi−67+の%が示される。データは、平均値±SDとして示される。
ナイーブ健常カニクイザルにおいてTregに対するDP47GS IgG−(IL−2)2の時間と低用量の効果。(A)6mg/kgのDP47 IgG−(IL−2)2後のTregの絶対数における時間依存性変化。(B)処置後のTregのpSTAT5aの時間依存性変化、(C)Tregの倍率変化の時間依存性変化、及び(D)DP47Gs IgG−IL−2で処置されたサルからのTregからのTregの倍率変化(空の棒、2から36μg/kg)に対するDP47GS IgG−(IL−2)2で処置されたもの(影付き棒)の比較。全データは、平均値±SDとして示される(n=4から6)。
ナイーブ健常カニクイザルにおいてTregに対する極低用量のDP47GS IgG−(IL−2)2の時間と低用量の効果。(A)0.7及び2μg/kgのDP47GS IgG−(IL−2)2の投与後のTregの倍率増加の時間依存性変化(それぞれn=2及び6)。(B)処置前の0日目及び処置後1日から4日目に測定されたTregのpSTAT5aの時間依存性変化、(C)Teff/men細胞のpSTAT5aの時間依存性変化。全データは、平均値±SDとして示される(0.7mg/kgでn=3及び2mg/kgでn=8)。
DP47GS IgG−IL−2対DP47GS IgG−(IL−2)2の、カニクイザルの全血Tregを増加させるそれらの能力についての用量依存性比較。全データは、平均値±SDとして示される(n=3から6)。
高用量のIL−2は、カニクイザルおいて好酸球増加症を誘導する。血中好酸球数の変化は、プロロイキン(登録商標)又はIL−2のイムノコンジュゲートによる全ての試験でモニターした。好酸球増加は、高用量プロロイキン(登録商標)による処置(2x105IU/kgを2週間、週に3回)後、又はDP47GS IgG−IL−2のより高用量での処置後、7日目〜14日目で検出された。ベースラインの好酸球数は、左側の影付きの棒であり、と6μg/kgのDP47GS IgG−(IL−2)2の後のものは右側の影付き棒である。(A)各用量群内の各動物からの好酸球数及び(B)処置後に好酸球が増加したものからのみの好酸球数。データは、平均値±SDとして示される。
DP47GS IgG−IL−2は、プロロイキン(登録商標)と比較してPK特性を強化している。NODマウスは、DP47GS IgG−IL−2又はプロロイキン(登録商標)の示された用量を、腹腔内(IP)(左パネル)又は皮下に(SC)(右パネル)注射された。ヒトIL−2は、mAbベース捕捉アッセイにより、示された時間での血清サンプルにおいて評価され、各アッセイの検出限界は、各グラフを横切る水平線として示される。
CD25とFOXP3共に、プロロイキン(登録商標)、DP47GS IgG−IL−2、及びDP47GS IgG−(IL−2)2で処理した後に、マウスのTregを増加させる。BALB/cマウスを、プロロイキン(登録商標)(20,000及び100000IU/マウス、n=3)、又はDP47GS IgG−(IL−2)2(60、300、または1500IU/マウス、n=3)で処置し、ビヒクル処置マウスを非刺激対照として含めた(n=4)。処置の24時間後に、脾臓のTregは、CD25及びFOXP3のレベルについて評価された。(A)細胞表面のCD25の用量依存性の変化、及び(B)は、細胞内FOXP3の用量依存性の変化を3つ全てのIL2の分子に対して観察した。ビヒクルマウスのMFIの平均は、CD25において4900、FOXP3において1566であった。データは、平均値±SDとして示される(n=3)。
DP47GS IgG−IL−2によるインビボでの処置は、マウス、ヒツジ赤血球遅延型過敏症(DTH)を抑制する。全データは、ビヒクル(100%応答)、IgG−IL−2(4000IU/マウス)又は陽性対照としてマウスCTLA−4−Ig(200μg/マウス)で処置した個々のマウスについて示されている。(A)NODマウスからの結果と(B)C57BL/6マウス。一日の4つのDTH応答の大きさが、非免疫マウスと比較して足の重量の変化(Δ足の重量)として示されている。データは、平均値±SDとして示される。
DP47GS IgG−IL−2(4000IU/マウス)によるインビボ処置は、(A)免疫化後21日目のC57BL/6マウス、及び(B)免疫化後7日目のNODマウスにおいて、KLHに対するマウスIgG抗体応答を抑制する。データは、平均値±SDとして示される。

0018

定義
本明細書において、用語は、以下に定義されていない限り、当技術分野で一般的に使用されるように使用される。

0019

本明細書で使用される用語「融合タンパク質」は、免疫グロブリン分子及びIL−2分子を含む融合ポリペプチド分子を指し、融合タンパク質の成分は、ペプチド結合により、直接又はペプチドリンカーを介して互いに連結されている。明確にするため、融合タンパク質の免疫グロブリン成分の個々のペプチド鎖は、非共有結合で、例えば、ジスルフィド結合によって連結されていても良い。

0020

「融合された」とは、直接又は一以上のペプチドリンカーを介してペプチド結合によって連結されることを意味する。

0021

特異的結合」とは、結合が抗原について選択的であり、不必要な又は非特異的相互作用と区別されうることを意味する。特定の抗原に結合する免疫グロブリンの能力は、酵素結合免疫吸着測定法ELISA)又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴(SPR)技術(BIAcore機器解析される)(Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000))および伝統的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))のいずれかによって測定することができる。一実施態様では、無関係のタンパク質への免疫グロブリンの結合の程度は、例えばSPRにより測定される場合、抗原に対する免疫グロブリンの結合の約10%未満である。ある実施態様において、抗原へ結合する免疫グロブリンは、解離定数(KD)≦1μM、≦100nM、≦10nM、≦1nM、≦0.1nM、≦0.01nM、又は≦0.001nM(例えば、10−8M未満、例えば、10−8Mから10−13M、例えば、10−9Mから10−13M)を有する。

0022

「親和性」又は「結合親和性」とは、分子(例えば、抗体)の単一結合部位とその結合パートナー(例えば、抗原)との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対(例えば、抗体と抗原)のメンバー間の1:1の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般的に、解離の比率である解離定数(KD)および会合速度定数(ぞれぞれkoffとkon)で表すことができる。従って、同等の親和性は、速度定数の比が同じままである限り、別の速度定数を含み得る。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。親和性を測定するための特別な方法は、表面プラズモン共鳴(SPR)である。

0023

「結合の減少」とは、例えばFc受容体に対する結合の減少であり、例えばSPRにより測定される場合、それぞれの相互作用の親和性の減少を指す。明確にするために、この用語はまた、親和性がゼロへの低下(又は分析法の検出限界以下)、即ち、相互作用の完全な撤廃をも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。

0024

本明細書で使用されるように、用語「抗原決定基」は「抗原」と同義語であり、抗体が結合し、抗体−抗原複合体を形成する、ポリペプチド高分子の部位(例えば、非隣接アミノ酸の種々の領域を形成する、アミノ酸又は立体構造的配置の隣接伸長)を意味する。有用な抗原決定基は、例えば、細胞の表面上に、血清中遊離して、及び/又は細胞外マトリックス(ECM)中に見いだすことができる。

0025

本明細書で使用される場合、「単鎖」なる用語は、ペプチド結合により直線的に結合したアミノ酸モノマーを含有する分子を意味する。

0026

用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、様々な抗体構造包含し、限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。

0027

「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を意味する。抗体断片の例としては、限定されないが、Fv、Fab、Fab’、Fab’−SHは、F(ab’)2、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体分子(例えばscFv)、及び単一ドメイン抗体を含む。

0028

用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、IgGクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合している2つの同一の軽鎖と2つの同一の重鎖から成る約150,000ダルトンヘテロ四量体糖タンパク質である。N末端からC末端に、各免疫グロブリン重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VH)を有し、続いて重鎖定常領域とも呼ばれる3つの定常ドメイン(CH1、CH2及びCH3)がある。同様に、N末端からC末端に、各免疫グロブリン軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域(VL)を有し、続いて軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖(CL)ドメインがある。免疫グロブリンの重鎖は、α(IgA)、δ(IgD)、ε(IgE)、γ(IgG)又はμ(IgM)と呼ばれる5つのクラスの1つに割り当てることができ、そのうち幾つかは更にγ1(IgG1)、γ2(IgG2)、γ3(IgG3)、γ4(IgG4)、α1(IgA1)及びα2(IgA2)などのサブクラスに分割され得る。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパκ)とラムダ(λ)と呼ばれる、2つのタイプのいずれかに割り当てることができる。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して連結された2つのFab分子およびFcドメインから本質的になる。

0029

本明細書で使用される場合、「Fab断片」は、軽鎖のVLドメイン及び定常ドメイン(CL)、及び重鎖のVHドメイン及び第一定常ドメイン(CH1)を含む免疫グロブリン断片を指す。

0030

抗体又はイムノコンジュゲートの「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。免疫グロブリンには、5つの主要なクラス:IgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMが存在し、これらのいくつかはサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、及びIgA2に更に分割することができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと称される。

0031

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、免疫グロブリン又は抗体の抗原への結合に一般的に関与する、免疫グロブリン又は抗体の重鎖又は軽鎖のドメインを指す。しかしながら、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、抗原結合特異性を付与しない可変領域を含み得る。免疫グロブリン又は抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン(それぞれVH及びVL)は、一般に類似した構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域(FR)と3つの高頻度可変領域HVR)を含む。(例えば、Kindt et al.Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)参照)。単一のVH又はVLドメインは、抗原−結合特異性を付与するのに十分であり得る。

0032

本明細書で使用される用語「高頻度可変領域」又は「HVR」なる用語は、配列において高頻度可変であり、及び/又は構造的に定まったループ(「高頻度可変ループ」)を形成する免疫グロブリン又は抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、天然の四鎖抗体は6つのHVRを含む;つまり、VHに3つ(H1、H2、H3)、VLに3つ(L1、L2、L3)である。HVRは、一般に高頻度可変ループ及び/又は相補性決定領域(CDR)からのアミノ酸残基を有し、後者は、抗原認識に関与し、及び/又は最も高い配列可変性をしている。典型的な超可変ループはアミノ酸残基26−32(L1)、50−52(L2)、91−96(L3)、26−32(H1)、53−55(H2)、及び96−101(H3)で生じる(Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。典型的なCDR(CDR−L1、CDR−L2、CDR−L3、CDR−H1、CDR−H2、及びCDR−H3)は、L1のアミノ酸残基24−34、L2のアミノ酸残基50−56、L3のアミノ酸残基89−97、H1のアミノ酸残基31−35B、H2のアミノ酸残基50−65、及びH3のアミノ酸残基95−102に生じる(Kabat et al, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991))。VHのCDR1を除き、CDRは、一般に高頻度可変ループからのアミノ酸残基を含む。CDRは、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「SDR」をも含む。SDRは、省略された(abbreviated-)CDR、又はa−CDRと呼ばれる、CDRの領域内に含まれている。典型的なa−CDR(a−CDR−L1、a−CDR−L2、a−CDR−L3、a−CDR−H1、a−CDR−H2、及びa−CDR−H3)は、アミノ酸残基L1の31−34、L2の50−55、L3の89−96、H1の31−35B、H2の50−58、及びH3の95−102に生じる(Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)参照)。特に断らない限り、可変ドメイン内のHVR残基及び他の残基(例えば、FR残基)は、上掲のKabatら(「Kabatの番号付け」と称す)に従い、本明細書において番号が付けられる。

0033

「フレームワーク」又は「FR」は、高頻度可変領域(HVR)残基以外の可変ドメイン残基を意味する。可変ドメインのFRは、一般的に4つのFRのドメイン:FR1、FR2、FR3、及びFR4からなる。従って、HVRとFR配列は、一般にVH(又はVL):FR1−H1(L1)−FR2−H2(L2)−FR3−H3(L3)−FR4の配列のようになるであろう。

0034

「ヒト免疫グロブリン」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト免疫グロブリンのレパートリー又は他のヒト免疫グロブリンをコードする配列を利用した非ヒト起源由来する免疫グロブリンのそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト免疫グロブリンのこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化免疫グロブリンを特異的に除外する。

0035

本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、例えば、天然に生じる変異を含み、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生し、一般的に少量で存在している変異体などの、可能性のある変異体抗体を除き、集団を構成する個々の抗体は同一であり、及び/又は同じエピトープに結合する。異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体の調製物とは異なり、モノクローナル抗体の調製物の各モノクローナル抗体は、抗原の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」なる修飾語句は、抗体の、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないと解釈されるべきものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えDNA法、ファージディスプレイ法ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。

0036

用語「Fcドメイン」又は「Fc領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のC末端領域を定義するために使用される。その用語は、天然配列Fc領域と変異体Fc領域を含む。IgGのFc領域は、IgGのCH2及びIgGのCH3ドメインを含むヒトIgG Fc領域の「CH2ドメイン」は、通常は約231位のアミノ酸残基から約340位のアミノ酸残基まで延びている。一実施態様において、糖鎖は、CH2ドメインに結合している。本明細書におけるCH2ドメインは、天然型配列のCH2ドメイン又は変異体CH2ドメインである。「CH3ドメイン」は、Fc領域中のCH2ドメインのC末端残基の伸長(即ち、IgGの約341位のアミノ酸残基から約447位のアミノ酸残基)を含む。本明細書におけるCH3領域は、天然型配列のCH3ドメイン又は変異体CH3ドメイン(例えば、その一方の鎖に導入された「突起」(ノブ)を、及びその他方の鎖に導入された「空洞」(ホール)を有するCH3ドメイン;参照により本明細書に明確に援用される、米国特許第5,821,333号を参照)であってよい。

0037

このような変異体CH3ドメインは、本明細書に記載される同一でない2つの免疫グロブリン重鎖のヘテロ二量体化を促進するために使用され得る。一実施態様において、ヒトIgG重鎖Fc領域はCys226又はPro230から重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Fc領域のC末端リジン(Lys447)は存在しているか、又は存在していない場合がある。本明細書に明記されていない限り、Fc領域又は定常領域内のアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991に記載されるように、EUインデックスとも呼ばれるEU番号付けシステムに従う。

0038

「エフェクター機能」なる用語は、免疫グロブリンのFc領域に起因し、抗体アイソタイプによって異なる、生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例には:C1q結合性及び補体依存性細胞傷害(CDC)、Fcレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)、抗体−依存性細胞食作用ADCP)、サイトカイン分泌抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原の取込み細胞表面レセプター(例えば、B細胞レセプター)のダウンレギュレーション、及びB細胞活性化が含まれる。

0039

「活性化Fc受容体」は、免疫グロブリンのFc領域による結合後に、エフェクター機能を遂行させるために受容体を持つ細胞を刺激するシグナル伝達イベントを誘発させるFc受容体である。活性化Fc受容体はFcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)、及びFcαRI(CD89)を含む。特定の活性化Fc受容体は、ヒトFcγRIIIaである(UniProtの受託番号P08637(バージョン141)を参照)。

0040

特に断らない限り、本明細書で使用する用語「インターロイキン−2」又は「IL−2」は、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えば、マウス、ラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型IL−2を指す。その用語は、未処理のIL−2、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のIL−2を含む。その用語はまた、天然に存在するIL−2の変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。典型的なヒトIL−2のアミノ酸配列は、配列番号1に示される。未処理のヒトIL−2は、成熟したIL−2分子に欠損している、N末端の20アミノ酸シグナルペプチドを付加的に含む。

0041

「天然型IL−2」は「野生型IL−2」とも称され、天然に生じるIL−2を意味する。天然型ヒトIL−2の配列は、配列番号1に示される。本発明の目的のため、野生型なる用語はまた、天然に生じる、天然型IL−2と比較して、IL−2受容体への結合を変えない一以上のアミノ酸変異、例えば、ヒトIL−2の125位に相当する位置においてシステインアラニンへの置換などを含むIL−2の形態を包含する。幾つかの実施態様において、本発明の目的のための野生型IL−2は、アミノ酸置換C125Aを含む(配列番号3を参照)。

0042

特に断らない限り、本明細書で使用する用語「CD25」又は「IL−2受容体」は、霊長類(例えばヒト)及びげっ歯類(例えば、マウス、ラット)などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物由来の任意の天然型CD25を指す。その用語は、「完全長」で未処理のCD25、並びに細胞内でのプロセシングから生じた任意の形態のCD25を含む。その用語はまた、CD25の天然に生じる変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。特定の実施態様において、CD25はヒトCD25である。典型的なヒトCD25のアミノ酸配列(シグナル配列のAvi−タグ及びHisタグを有するもの)は配列番号25に示される。

0043

「高親和性IL−2受容体」なる用語は、本明細書で使用される場合、受容体γ−サブユニット共通サイトイン受容体γ−サブユニット、γc、又はCD132としても知られる)、受容体β−サブユニット(CD122又はp70としても知られる)及び受容体α−サブユニット(CD25又はp55としても知られる)から成るIL−2受容体のヘテロ三量体形態を指す。一方、「中間親和性IL−2受容体」なる用語は、γ−サブユニット及びβ−サブユニットのみを含みα−サブユニットを持たないIL−2受容体を指す(総説については、例えばOlejniczak and Kasprzak, Med Sci Monit 14, RA179-189 (2008)を参照)。典型的なヒトCD122及びCD132のアミノ酸配列(Hisタグを有するFc領域に融合される)は、配列番号21及び23にそれぞれ示される。

0044

「調節性T細胞」又は「Treg細胞」は、他のT細胞を抑制することができるCD4+ T細胞の特定のタイプを意味する。Treg細胞はCD4、IL−2受容体のαサブユニット(CD25)、及び転写因子フォークヘッドボックスP3(FOXP3)の発現により特徴づけられ(Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)、腫瘍によって発現されるものを含む、抗原に対する末梢自己免疫寛容の誘導及び維持において重要な役割を果たしている。

0045

「Treg細胞の選択的活性化」は、他のT細胞サブセット(例えば、CD4+ Tヘルパー細胞、CD8+細胞傷害性T細胞、NK T細胞)又はナチュラルキラー(NK)細胞の同時活性化を本質的に含まないTreg細胞の活性化を意味する。

0046

これらの細胞型を同定し、区別するための方法は、実施例に記載される。活性化は、(例えば、リン酸化STAT5aの検出により測定されるように)IL−2受容体シグナル伝達の誘導、(例えば、Ki−67を検出することによって測定されるように)増殖の誘導、及び/又は活性化マーカー(例えば、例えば、CD25など)の発現の上方制御が含まれる場合がある。

0047

用語「ペプチドリンカー」は、一以上のアミノ酸、典型的には約2〜20個のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当技術分野で知られ、又は本明細書に記載されている。適切な、非免疫原性ペプチドペプチドは、例えば、(G4S)nは、(SG4)n又はG4(SG4)nペプチドリンカーが挙げられる。「n」は一般には1と10の間、典型的には2から4の間の数である。

0048

用語「修飾」は、ペプチド主鎖(例えばアミノ酸配列)の任意の操作又はポリペプチドの翻訳後修飾(例えば、グリコシル化)を意味する。

0049

一実施態様において、「ノブ・イントゥ・ホール(knob into hole)修飾」は、CH3ドメインの2つの免疫グロブリン重鎖の間の界面の修飾を指し、ここで、i)一重鎖のCH3ドメインにおいて、アミノ酸残基はより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、他の重鎖のCH3ドメイン内の界面の中のキャビティ(「ホール」)に配置可能である、一重鎖のCH3ドメイン内の界面の中に突起(「ノブ」)を生成し、及び、ii)他の重鎖のCH3ドメイン内で、アミノ酸残基はより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それによって、その中に、第一のCH3ドメイン内の界面の中の突起(「ノブ」)を配置可能である、第二のCH3ドメイン内の界面の中にキャビティ(「ホール」)を生成する。一実施態様において、「ノブ・イントゥ・ホール修飾」は、抗体重鎖の一方に、アミノ酸置換T366Wと、任意でアミノ酸置換S354Cを含み、かつ、抗体重鎖の他方に、アミノ酸置換T366S、L368A、Y407Vと、任意でアミノ酸置換Y349Cを含む。ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば米国特許第5,731,168号;米国特許第7,695,936号;Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996)及びCarter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載される。一般に、本方法は、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨げるように、突起が空洞内に配置することができるように、第一のポリペプチドの界面での突起(「ノブ」)及び第二ポリペプチドの界面における対応する空洞(「穴」)を導入することを含む。突起は、第一のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置換することによって構築される。突起と同一又はより小さい大きさの相補的な空洞が、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置換することによって第二ポリペプチドの界面に作成される。位置S354とY349のぞれぞれにおける2つのシステイン残基の導入は、Fc領域の2つの抗体重鎖間のジスルフィド架橋の形成をもたらし、更に二量体を安定化させる(Carter, J Immunol Methods248, 7-15 (2001))。

0050

アミノ酸「置換」は、ポリペプチドにおける、一アミノ酸の別のアミノ酸による置換を意味する。一実施態様において、アミノ酸は、同様の構造的及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸により置換される、例えば、保存的アミノ酸置換である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性電荷溶解性疎水性親水性、及び/又は、両親媒性性質類似性に基づいて行うことができる。例えば、非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシンイソロイシンバリンプロリンフェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンを含み;極性中性アミノ酸は、グリシンセリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンを含み;正に帯電した(塩基性)アミノ酸は、アルギニン、リジン、及びヒスチジンを含み;負に帯電した(酸性)アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。例えば、アミノ酸置換はまた、異なる構造及び/又は化学的特性を有する別のアミノ酸で一つのアミノ酸を置換すること、例えば、一群(例えば、極性)由来のアミノ酸を異なる群(例えば、塩基性)由来の別のアミノ酸で置換することをもたらすことができる。アミノ酸置換は、当分野でよく知られた遺伝学的又は化学的方法を使用して生成されうる。遺伝学的方法は、部位特異的変異誘発PCR遺伝子合成等を含みうる。化学的修飾など、遺伝子工学以外の方法によるアミノ酸の側鎖基改変方法がまた有用でありうることが意図される。本明細書において同一のアミノ酸置換を示すために様々な命名が使用されてもよい。例えば、免疫グロブリン重鎖の位置329におけるプロリンからグリシンへの置換は、329G、G329、G329、P329G、又はPro329Glyとして示すことができる。

0051

ポリペプチド配列に対する「パーセント(%)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ポリペプチド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST−2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、%アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN−2を用いて得られる。ALIGN−2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作成され、ソースコードは米国著作権、Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録されている。ALIGN−2プログラムはジェネンテク社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能であり、ソースコードからコンパイルしてもよい。ALIGN−2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、特にデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN−2プログラムによって設定され変動しない。アミノ酸配列比較にALIGN−2が用いられる状況では、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは、A及びBのプログラムアラインメントにおいて、配列アラインメントプログラムALIGN−2によって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基の全数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと一致しない場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは一致しないと評価されるであろう。特に断らない限りは、ここで使用されるの全ての%アミノ酸配列同一性値は、直前パラグラフに記載したように、ALIGN−2コンピュータプログラムを用いて得られる。

0052

「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書では同義的に用いられ、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、DNA及びRNAを含む。ヌクレオチドとは、デオキシリボヌクレオチドリボヌクレオチド修飾ヌクレオチド又は塩基、及び/又はそれらの類似体、又はDNA若しくはRNAポリメラーゼにより、又は合成反応により、ポリマー中に組み込むことができる任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、合成後に、標識へのコンジュゲーションなどの修飾(複数)を含んでもよい。

0053

本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも例えば95%「同一」であるヌクレオチド配列を有する核酸又はポリヌクレオチドにより、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列のそれぞれ100ヌクレオチドにつき最大で5つの点変異を含みうることを除けば、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの5%までが欠失されたり、又は別のヌクレオチド置換され得、または参照配列中の全ヌクレオチドの最大5%までの多数のヌクレオチドが参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変化は参照ヌクレオチド配列の5’又は3’末端位置又はそれらの位置の間のどこでも起こり得、参照配列中の残基中に個別に散在するか又は参照配列内における一以上の隣接グループ中に散在している。実際問題として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一であるかどうかは、従来法により、上記のものような既知のコンピュータプログラムを用いて決定することができる。

0054

本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なようにリンクされている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。

0055

用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する初代形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は、親細胞と、核酸含有物において完全に同一ではなく、変異を含む場合もある。元来の形質転換細胞において、スクリーニング又は選択された場合に、同様の機能又は生物活性を有する変異子孫がここに含まれる。宿主細胞は、本発明の融合タンパク質を生成するために使用することができる任意のタイプの細胞システムである。宿主細胞は、培養細胞、例えば、CHO細胞BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞又はハイブリドーマ細胞などの哺乳類培養細胞酵母細胞昆虫細胞植物細胞、わずかな例を挙げると、しかしまた、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織の中に含まれる細胞も含む。

0056

「有効な量」の薬剤とは、投与される細胞又は組織において生理学的変化をもたらすために必要な量を指す。

0057

薬剤、例えば、薬学的組成物の「治療的有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。治療的に有効な量の薬剤は例えば、疾患の有害作用を除去、低下、遅延、最小化又は防止させる。

0058

「個体」又は「被検体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物(例えば、ウシ、ヒツジ、ネコイヌウマ)、霊長類(例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類)、ウサギ、げっ歯類(例えば、マウス及びラット)を含む。特に、個体又は被検体はヒトである。

0059

用語「薬学的組成物」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。

0060

「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的組成物中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。

0061

本明細書で用いられるように、「治療」(及び「治療する(treat)」または「治療している(treating)」など文法上の変形)は、治療されている個体における疾患の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理過程においてのいずれかで実行できる。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学帰結縮小転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。幾つかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。

0062

「自己免疫疾患」は、個々の自身の組織から生じ及びそれに向けられた非悪性疾患又は障害を意味する。自己免疫疾患又は障害の例は、限定されないが、乾癬及び皮膚炎を含む炎症性皮膚疾患などの炎症性応答(例えば、アトピー性皮膚炎);炎症性腸疾患に関連する応答(例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎など);皮膚炎;湿疹や喘息などのアレルギー症状関節リウマチ;全身性エリテマトーデス(SLE)(ループス腎炎皮膚エリテマトーデスを含むがこれらに限定されない);糖尿病(例えば、1型糖尿病又はインスリン依存性糖尿病);多発性硬化症及び若年発症糖尿病を含む。

0063

本発明の融合タンパク質
本発明は、本明細書に記載される治療方法における使用のために特に有利な特性を有する新規の免疫グロブリン−IL−2融合タンパク質を提供する。
第一の態様において、本発明は、(i)Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子、及び(ii)2つのインターロイキン−2(IL−2)分子を含む融合タンパク質を提供する。

0064

一実施態様において、前記融合タンパク質は、Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、前記修飾を含む免疫グロブリン分子と、2個のインターロイキン−2(IL−2)分子と、及び任意で一以上のペプチドリンカーとから本質的になる。

0065

実施例に示されるように、2つのIL−2分子を含む融合タンパク質は、驚くべきことに、単一のIL−2分子を含む対応する融合タンパク質と比較した場合、調節性T細胞において大きく改善された有効性と選択性を提供する。

0066

一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、IgGクラスの免疫グロブリン分子、特に、IgG1サブクラスの免疫グロブリン分子である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒト免疫グロブリン分子であり、即ち、それは完全なヒト可変領域及び定常領域を含む。典型的なヒトIgG1定常領域の配列は、配列番号1に示される。IgGクラスの免疫グロブリン分子は、(i)各々がN末端からC末端に、軽鎖可変ドメイン(VL)及び軽鎖定常ドメイン(CL)を含む、2つの免疫グロブリン軽鎖、及び(ii)各々がN末端からC末端に、重鎖可変ドメイン(VH)、重鎖定常ドメイン(CH)1、免疫グロブリンヒンジ領域、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む2つの免疫グロブリン重鎖を含む。後者の2つのドメインは、免疫グロブリン分子のFc領域の部分を形成する。二つの重鎖は、Fc領域内で二量体化する。

0067

本発明による融合タンパク質の一実施態様において、前記2つのIL−2分子は各々、それらのN末端のアミノ酸で、前記免疫グロブリン分子の免疫グロブリン重鎖の一方のC末端アミノ酸へ、任意でリンカーペプチドを介して融合している。免疫グロブリン重鎖への2つの(同一な)IL−2分子の融合は、望ましくない副生成物の形成を回避し、非同一の重鎖のヘテロダイマー化、例えばノブ・イントゥ・ホール修飾などを促進する修飾の必要性を不要にする、融合タンパク質の簡単な生成を可能にする。

0068

免疫グロブリン分子のIL−2分子への融合は、遊離の(非融合)IL−2と比較して、(FcRnへの結合を介したリサイクリング、及び濾過のための閾値を十分超えている分子の大きさに起因する)長い血清半減期を含む望ましい薬物動態学的特性を提供する。更に、免疫グロブリン分子の存在は、例えば、プロテインAアフィニティークロマトグラフィーによる、融合タンパク質の簡単な精製を可能にする。しかしながら、同時に、免疫グロブリン分子、具体的には、免疫グロブリン分子のFc領域の存在は、好ましいIL−2受容体を有する細胞に対してよりむしろ、Fc受容体を発現する細胞への融合タンパク質の望ましくない標的化をもたらし得る。更に、Fc受容体の係合は、(炎症促進性)サイトカインの放出及び調節性T細胞以外の種々の免疫細胞の望ましくない活性化をもたらし得る。従って、本発明の融合タンパク質に含まれる前記免疫グロブリン分子は、Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含む。特定の実施態様において、前記Fc受容体はFcγ受容体、特にヒトFcγ受容体である。Fc受容体への結合親和性は、例えば、BIAcore装置(GE Healthcare)など標準的な計測機器を使用してELISAによって又は表面プラズモン共鳴(SPR)によって容易に決定することができ、そのようなFc受容体は、組換え発現によって得ることができる。結合親和性を測定するための特定の事例的及び具体的な実施態様を以下に記載する。一実施態様によれば、Fc受容体への結合親和性は、25℃でBIACORE(登録商標)T100装置(GE Healthcare)を使用して、CM5チップ固定化したリガンド(Fc受容体)を用いて表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5,GEヘルスケア)を、提供者指示書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化する。組換えリガンドを10mMの酢酸ナトリウム、pH5.5で、0.5−30μg/mlに希釈し、結合したタンパク質の応答単位(RU)がおよそ100−5000になるように10μl/分の流速注入する。リガンドの注入後、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、抗体の3から5倍の段階希釈(〜0.01nMから300nMの間の範囲)が、HBS−EP+(GE Healthcare、10mMのHEES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%界面活性剤P20、25℃、pH7.4)中で約30〜50μl/分の流量で注入される。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE(登録商標)T100エバリュエーションソフトウェアバージョン1.1.1)を用いて、会合速度(kon)と解離速度(koff)を算出した。平衡解離定数(KD)はkoff/kon比として算出する。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。代わりに、Fc受容体に対する抗体の結合親和性は、特定のFc受容体を発現することが知られている細胞株、例えばFcγIIIa受容体を発現するNK細胞などを使用して評価することができる。

0069

一実施態様において、修飾は、Fc受容体に対する免疫グロブリンの結合親和性を減少させる一以上のアミノ酸変異を含む。一実施態様では、アミノ酸変異はアミノ酸置換である。典型的には、同一の一以上のアミノ酸置換が2つの免疫グロブリン重鎖の各々に存在する。一実施態様において、前記アミノ酸変異は、Fcレセプターに対する免疫グロブリンの結合親和性を、少なくとも2倍、少なくとも5倍、又は少なくとも10倍減少させる。Fc受容体に対するイムノコンジュゲートの結合親和性を減少させる一以上のアミノ酸変異が存在する実施態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Fc受容体に対する免疫グロブリンの結合親和性を少なくとも10倍、少なくとも20倍、又は更に少なくとも50倍減少させ得る。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、Fc受容体に対する免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる修飾を含まない対応する免疫グロブリン分子と比較して、Fc受容体に対し、20%未満、具体的には10%未満、より具体的には5%未満の結合親和性を呈する。

0070

一実施態様において、前記Fc受容体は活性化Fc受容体である。特定の実施態様において、前記Fc受容体は、FcγRIIIa(CD16a)、FcγRI(CD64)、FcγRIIa(CD32)及びFcαRI(CD89)の群から選択される。特定の実施態様において、Fc受容体は、Fcγ受容体であり、より具体的にはFcγRIIIa、FcγRI又はFcγRIIa受容体である。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合親和性が減少する。更により特定の実施態様において、前記Fc受容体はFcγIIIa、特にヒトFcγIIIaである。幾つかの実施態様において、補体成分に対する結合親和性、具体的にはC1qに対する結合親和性もまた減少する。一実施態様において、新生児Fc受容体(FcRn)への結合親和性は低下しない。FcRnへの実質的に類似な結合、すなわち、前記受容体への免疫グロブリン分子の結合親和性の保存は、免疫グロブリン分子が、FcRnに対し、非修飾形態の免疫グロブリン分子の約70%より大の結合親和性を呈する場合に達成される。本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリン分子は、約80%より大、更には約90%より大のこのような親和性を呈しうる。

0071

一実施態様では、Fc受容体への免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる前記修飾は、免疫グロブリン分子のFc領域において、特にCH2ドメインにおいてである。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置329に(EU番号付け)、アミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、前記アミノ酸置換は、P329A又はP329G、特にP329Gである。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置234と235に(EU番号付け)、アミノ酸置換を含む。特定の実施態様において、前記アミノ酸置換はL234A及びL235A(LALA)である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗体重鎖の位置329(EU番号付け)にアミノ酸置換を含み、そして免疫グロブリン重鎖の位置228、233、234、235、297及び331から選択される位置に更なるアミノ酸置換を含む。より特定の実施態様では、更なるアミノ酸置換は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D又はP331Sである。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖の位置P329、L234及びL235にアミノ酸置換を含む。更に特定の実施態様では、前記免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン重鎖にアミノ酸変異L234A、L235A及びP329G(LALA P329G)を含む。その全体が参照により本明細書に援用される、PCT出願番号WO2012/130831に記載されるように、アミノ酸置換のこの組み合わせは、IgGクラスの免疫グロブリンのFcγ受容体結合を特に効率的に消失させる。PCT出願番号WO2012/130831はまた、このような修飾免疫グロブリンを調製する方法、及びFc受容体結合又はエフェクター機能などその特性を決定するための方法を記載する。

0072

免疫グロブリン重鎖に修飾を含む免疫グロブリンは、当該技術でよく知られている遺伝的又は化学的方法を使用し、アミノ酸を欠失、置換、挿入又は修飾することにより調製することができる。遺伝的方法は、コードするDNA配列、PCR、遺伝子合成等の部位特異的変異誘発を含むことができる。正確なヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって検証することができる。

0073

Fc受容体結合を減少させる修飾を含む免疫グロブリン又は抗体は、一般に、対応する非修飾免疫グロブリン又は抗体と比較して、低下したエフェクター機能、特に低下したADCCを有する。それゆえ、一実施態様では、Fc受容体への免疫グロブリン分子の結合親和性を減少させる前記修飾は、免疫グロブリン分子のエフェクター機能を低下させる。特定の実施態様において、前記エフェクター機能は抗体依存性細胞傷害(ADCC)である。一実施態様において、ADCCは、前記修飾を持たない対応する免疫グロブリン分子により誘導されるADCCの20%未満まで低下する。免疫グロブリン又は抗体のエフェクター機能は、当技術分野で周知の方法によって測定することができる。対象とする分子のADCC活性を評価するためのインビトロアッセイの他の例は、米国特許第5500362号:Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)及びHellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); U.S. Patent No. 5,821,337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)に記述されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる(例えば、フローサイトメトリーのためのACTITM非放射性細胞毒性アッセイ(CellTechnology, Inc. Mountain View, CA)及びCytoTox96(登録商標)非放射性細胞毒性アッセイ(Promega, Madison, WI)を参照)。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(PBMC)及びナチュラルキラー(NK)細胞を含む。あるいは、又は更に、目的の分子のADCC活性は、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)に開示される動物モデルにおいてインビボで評価することができる。幾つかの実施態様において、補体成分に対する、具体的にはC1qに対する免疫グロブリン分子の結合もまた低下する。従って、補体依存性細胞傷害(CDC)もまた低下され得る。免疫グロブリンがC1qに結合することができそれ故にCDC活性を有するかを決定するために、C1q結合アッセイを実施することができる。例えば、国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号のC1q及びC3c結合ELISAを参照。補体活性化を評価するために、CDCアッセイを行ってもよい(例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003);及び Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照)。

0074

本明細書に上述され及びPCT出願番号WO2012/130831に記載される免疫グロブリンに加えて、Fc受容体結合及び/又はエフェクター機能の減少を伴う免疫グロブリンはまた、一以上のFcドメイン残基238、265、269、270、297、327及び329の置換を持つものを含む(米国特許第6737056号)。そのようなFc変異体は、残基265及び297のアラニンへの置換を有する、いわゆる「DANA」Fc変異体を含む、アミノ酸位置265、269、270、297及び327の二以上での置換を有するFc変異体を含む(米国特許第7332581号)。

0075

IgG4サブクラスの免疫グロブリンは、IgG1免疫グロブリンと比較して、Fc受容体への結合親和性の低下及びエフェクター機能の低下を示す。従って、幾つかの実施態様では、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリン分子はIgG4サブクラスの免疫グロブリン、特にヒトIgG4サブクラスの免疫グロブリンである。一実施態様において、前記IgG4サブクラスの免疫グロブリンは、位置S228でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228Pを含む。Fc受容体に対する結合親和性及び/又はそのエフェクター機能を更に低下させるために、一実施態様において、IgG4サブクラスの免疫グロブリンは、位置L235でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換L235Eを含む。その他の実施態様において、前記IgG4サブクラスの免疫グロブリンは、位置P239でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換P329Gを含む。特定の実施態様において、前記IgG4サブクラスの免疫グロブリンは、位置S228、L235及びP329でアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換S228P、L235E及びP329Gを含む。このような修飾IgG4サブクラスの免疫グロブリンとそのFcγ受容体結合特性はPCT出願番号WO2012/130831に記載され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

0076

一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持つ。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、モノクローナル抗体である。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、抗原への特異的結合能力を持たず、具体的にはヒト抗原への特異的結合能力を持たない。このような免疫グロブリン分子の抗原への特異的結合の欠如は(即ち、非特異的相互作用から区別することができる任意の結合が存在しない場合)、例えば、本明細書に記載されるようにELISA又は表面プラズモン共鳴によって測定することができる。このような免疫グロブリン分子は、例えば、特定の組織への標的化が所望されない、融合タンパク質の血清半減期を向上させるために、特に有用である。

0077

一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトVh3−23生殖細胞系配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号9の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である重鎖可変領域配列を含む。一実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、ヒトVk3−20生殖細胞系配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施態様において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号9の配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%、99%又は100%同一である軽鎖可変領域配列を含む。更により具体的な実施形態において、前記免疫グロブリン分子は、配列番号9の重鎖可変領域配列、及び配列番号11の軽鎖可変領域配列を含む。これらの可変領域配列を含む免疫グロブリン分子は、抗原、特にヒト抗原への特異的結合能力を持たない。それらは、正常組織並びにPBMCへの結合を欠き、多反応性を有さず、イメージングによるインビボでの非特異的な蓄積を示さなかった(データ非表示)。可変領域配列は、GSG配列が非結合免疫グロブリンを生成するために導入されている、重鎖のCDR3を除いて、完全にヒト生殖細胞系配列に基づいている。

0078

一実施態様において、前記IL−2分子は、野生型IL−2分子である。一実施態様において、前記IL−2分子は、ヒトIL−2分子である。特定の実施態様において、前記IL−2分子は、配列番号1(天然型ヒトIL−2)の配列を含む。

0079

一実施態様において、前記IL−2分子は、ヒトIL−2の残基125に対応する位置にアミノ酸置換を含む。一実施態様において、前記アミノ酸置換はC125Aである。特定の実施態様において、前記IL−2分子は、配列番号3(アミノ酸置換C125Aを含むヒトIL−2)の配列を含む。あるいは、米国特許第4,518,584号に記載されるように、位置125でのシステインは、別の天然アミノ酸、例えばセリン、スレオニン又はバリンなどで置換されても良く、それぞれC125S IL−2、C125T IL−2又はC125V IL−2を生じる。そこに記載されるように、IL−2のN−末端アラニン残基が欠失されdes−A1 C125S又はdes−A1 C125A等の変異体を生じうる。あるいは又は併せて、IL−2変異体は、野生型ヒトIL−2の位置104に通常生じるメチオニンがアラニン等の中性アミノ酸で置換される変異を含みうる(米国特許第5,206,344号を参照)。ヒトIL−2におけるそのような修飾は、増加した発現又は安定性などの付加的な利点を与え得る。

0080

本発明の融合タンパク質に含まれるIL−2分子は、非グリコシル化IL−2分子であっても良い。例えば、融合タンパク質がCHO又はHEK細胞などの哺乳動物細胞で発現されるとき、IL−2分子のO−グリコシル化部位の除去によって、より均質な生成物を生じる。従って、ある実施態様において、IL−2分子は、ヒトIL−2の残基3に対応する位置でIL−2のO−グリコシル化部位を除去する修飾を含む。一実施態様では、ヒトIL−2の残基3に対応する位置でIL−2のO−グリコシル化部位を除去する前記修飾はアミノ酸置換である。例示的なアミノ酸置換は、T3A、T3G、T3Q、T3E、T3N、T3D、T3R、T3K、及びT3Pを含む。特定の実施態様において、前記修飾はアミノ酸置換T3Aである。

0081

一実施態様において、融合タンパク質は、25℃でSPRにより測定される場合、親和性定数(KD)が10nM未満、特に3nM未満で、IL−2βγ受容体へ結合することができる。特定の実施態様において、前記IL−2βγ受容体はヒトIL−2βγ受容体である。一実施態様において、融合タンパク質は、25℃でSPRにより測定される場合、親和性定数(KD)が100nM未満、特に20nM未満で、IL−2βγ受容体へ結合することができる。特定の実施態様において、前記IL−2α受容体はヒトIL−2α受容体である。SPRによる、IL−2βγ又はIL−2α受容体への結合親和性を測定するたjめの方法が本明細書に記載される。一実施態様によれば、結合親和性(KD)は、25℃でBIACORE(登録商標)T100装置(GE Healthcare)を使用して、CM5チップに固定化したIL−2受容体を用いて表面プラズモン共鳴によって測定される。簡潔には、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ(CM5,GEヘルスケア)を、提供者の指示書に従ってN−エチル−N’−(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩(EDC)及びN−ヒドロキシスクシニミド(NHS)で活性化する。組換えIL−2受容体を10mMの酢酸ナトリウム、pH5.5で、0.5−30μg/mlに希釈し、結合したタンパク質の応答単位(RU)がおよそ200−1000(IL−2Rαに対して)又は500−3000(IL−2Rβγに対して)になるように10μl/分の流速で注入する。IL−2受容体の注入後、反応しない群をブロックするために1Mのエタノールアミンを注入する。動力学測定のために、融合タンパク質の3倍の段階希釈(〜3nMから300nMの間の範囲)が、HBS−EP+(GE Healthcare、10mMのHEPES、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.05%界面活性剤P20、25℃、pH7.4)中で約30μl/分の流速で注入される。会合及び解離のセンサーグラムを同時にフィットさせることによる単純一対一ラングミュア結合モデル(simple one-to-one Langmuir binding model)(BIACORE(登録商標)T100エバリュエーションソフトウェアバージョン1.1.1)を用いて、会合速度(kon)と解離速度(koff)を算出した。平衡解離定数(KD)はkoff/kon比として算出する。例えば、Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999)を参照。

0082

特定の態様において、本発明は、(i)免疫グロブリン重鎖に、アミノ酸置換L234A、L235A及びP329G(EU番号付け)を含むIgG1サブクラスの免疫グロブリン分子と、(ii)各々がそのN末端アミノ酸で、ペプチドリンカーを介して免疫グロブリン重鎖の一方のC末端アミノ酸に融合した、2つのインターロイキン−2(IL−2)分子とを含む融合タンパク質を提供する。

0083

一実施態様において、前記免疫グロブリン分子と前記IL−2分子はヒトである。特定の実施態様において、免疫グロブリン分子は、配列番号9の重鎖可変領域配列、及び配列番号11の軽鎖可変領域配列を含む。更なる特定の実施態様において、前記IL−2分子の各々は、配列番号3のアミノ酸配列を含む。より特定の実施態様において、前記融合タンパク質は、配列番号17の配列に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるポリペプチド配列、及び配列番号19の配列に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一であるポリペプチド配列を含む。

0084

実施例に示されるように、本発明の融合タンパク質は、調節性T細胞を選択的に活性化するために用いることができる(即ち、他のT細胞サブセット及び/又はNK細胞の同時活性化を本質的に含まない)。従って、本発明は、インビトロ又はインビボで調節性T細胞の選択的活性化に使用するための融合タンパク質を提供する。一実施態様において、前記使用は、調節性T細胞をインビボ又はインビトロで前記融合タンパク質と接触させることを含む。一実施態様において、前記使用は、他の(非調節性)T細胞を前記融合タンパク質と接触させることを更に含む。一実施態様において、前記使用はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約1ng/mL以下、具体的には約0.1ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記使用はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約20μg/kg体重以下の用量で、具体的には約12μg/kg体重以下の用量で、より具体的には約6μg/kg体重以下の用量で使用される(「体重」は、融合タンパク質が投与される個体の体重を指す)。

0085

本発明はまた、本発明の融合タンパク質と前記調節性T細胞を接触させることを含む、インビトロ又はインビボでの調節性T細胞の選択的活性化のための方法を提供する。一実施態様において、前記方法は、他の(非調節性)T細胞を、前記融合タンパク質と接触させることを更に含む。一実施態様において、前記活性化は、増殖の誘導及び/又はIL−2受容体シグナル伝達の誘導を含む。一実施態様において、前記方法はインビトロにおいてであり、前記融合タンパク質は、約1ng/mL以下、具体的には約0.1ng/mL以下の濃度で使用される。別の実施態様において、前記方法はインビボにおいてであり、前記融合タンパク質は、約20μg/kg体重以下の用量で、具体的には約12μg/kg体重以下の用量で、より具体的には約6μg/kg体重以下の用量で使用される(「体重」は、融合タンパク質が投与される個体の体重を指す)。

0086

前のパラグラフに記載される使用又は方法の所定の実施態様によれば、前記活性化は、調節性T細胞の増殖の誘導及び/又は調節性T細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達の誘導を含む。増殖の誘導は、実施例に記載されるように、例えば細胞内増殖マーカーKi−67の検出によって測定することができる。一実施態様において、本発明の融合タンパク質により活性化される調節性T細胞の増殖は、非活性化調節性T細胞の増殖に比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、又は少なくとも約3倍増加する。一実施態様において、本発明の融合タンパク質と接触された他の(非調節性)T細胞及び/又はNK細胞は、前記融合タンパク質と接触されない対応する細胞の増殖と比較して、約1.5倍未満、約1.2倍未満、又は約1.1倍未満増加する。IL−2受容体シグナル伝達の誘導は、実施例に記載されるように、例えば、リン酸化STAT5の検出によって測定することができる。一実施態様において、本発明の融合タンパク質により活性化される調節性T細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達は、非活性化調節性T細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達と比較して、少なくとも約1.5倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、又は少なくとも約5倍増加する。一実施態様において、本発明の融合タンパク質と接触された他の(非調節性)T細胞及び/又はNK細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達は、前記融合タンパク質と接触されない対応する細胞におけるIL−2受容体シグナル伝達と比較して、約1.5倍未満、又は約1.2倍未満、又は約1.1倍未満増加する。

0087

ポリヌクレオチド
本発明はさらに、本明細書に記載される融合体又はその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。

0088

本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号2、4、5、6、7、10、12、18及び20に記載された配列に対して少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%,又は100%同一であるものを、その機能性断片又は変異体を含み、含む。本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質全体をコードする単一のポリヌクレオチドとして、又は共発現される複数(例えば、2つ以上の)ポリヌクレオチドとして発現され得る。共発現するポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して結合し、機能性融合タンパク質を形成する。例えば、免疫グロブリンの軽鎖部分は、免疫グロブリンの重鎖部分からの別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現されたとき、重鎖ポリペプチド軽鎖ポリペプチドと会合し、免疫グロブリンを形成する。

0089

一実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号9又は11に示される可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ここで、ポリヌクレオチドは、配列番号17又は19に示されるポリペプチド配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号2、4、5、6、7、10、12、18又は20に示される核酸配列に、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号2、4、5、6、7、10、12、18又は20に示される核酸配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号9又は11のアミノ酸配列に、少なくとも約80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一である可変領域配列をコードする配列を含む。別の実施態様において、本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片に対するものであり、ポリヌクレオチドは、配列番号17又は19のアミノ酸配列に、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明は、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片を包含し、ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を含む、配列番号9又は11の可変領域配列をコードする配列を含む。本発明はまた、免疫グロブリン分子と2つのIL−2分子の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はその断片を包含し、ポリヌクレオチドは、保存的アミノ酸置換を含む、配列番号17又は19のポリペプチド配列をコードする配列を含む。

0090

ある実施態様において、ポリヌクレオチドまたは核酸はDNAである。一実施態様において、本発明のポリヌクレオチドは、例えばメッセンジャーRNAmRNA)の形態のRNAである。本発明のRNAは、一本鎖または二本鎖であってもよい。

0091

組換え方法
本発明の融合タンパク質は、例えば、固相ペプチド合成(例えばメリフィールド固相合成)又は組換え生成によって得ることができる。組換え生成のために、例えば上述したように、融合タンパク質(断片)をコードする一又は複数のポリヌクレオチドが単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び/又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、一般的な手順を使用して容易に単離され配列決定されうる。一実施態様において、本発明の一以上のポリヌクレオチドを含むベクタ−、好ましくは発現ベクターが提供される。当業者によく知られている方法は、適切な転写翻訳制御シグナルとともに、融合タンパク質(断片)のコード配列を含む発現ベクターを構築するために使用することができる。これらの方法は、インビトロでの組換えDNA技術、合成技術及びインビボでの組換え/遺伝子組換えが含まれる。例えば、Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); 及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)に記載される技術を参照。発現ベクターはプラスミド、又はウイルスの一部でもよく、核酸断片でありうる。発現ベクターは、融合タンパク質(断片)をコードするポリヌクレオチド(すなわちコーディング領域)が、プロモーター及び/又は他の転写又は翻訳調節要素と作動可能に結合してクローン化される発現カセットを含む。本発明で使用される場合、「コーディング領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンから成る核酸の一部である。「終止コドン」(TAG、TGA、又はTAA)はアミノ酸に翻訳されないが、存在する場合には、コード領域の一部と考えられ、しかし、任意の隣接配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位転写ターミネーターイントロン、5’及び3’非翻訳領域などはコード領域の一部ではない。二以上のコード領域が、単一ポリヌクレオチドコンストラクト、例えば単一のベクター上に、又は別々のポリヌクレオチドコンストラクトの中に、例えば別の(異なる)ベクター上に存在することができる。更に、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよいし、2つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、タンパク質分解性切断を介して、翻訳後又は翻訳と同時に最終タンパク質に分離された一又は複数のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、本発明のベクター、ポリヌクレオチド、又は核酸は、本発明の融合タンパク質(断片)、又は変異体又はその誘導体をコードするポリヌクレオチドに融合され又は融合されない異種性コーディング領域をコードしうる。異種性コーディング領域は、限定するものではないが、特殊化要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種性機能ドメインを含む。作動可能に結合とは、例えばポリペプチドなど遺伝子産物のコード領域が、制御配列の影響下又は制御下に遺伝子産物の発現を配置するように、一以上の制御配列と結合するときである。(ポリペプチドコーディング領域及びそれに結合するプロモーターのような)二つのDNA断片は、プロモーター機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするmRNAの転写をもたらす場合、および二つのDNA断片間の連結の性質が、遺伝子産物の発現を導く発現制御配列の能力を妨げないか又は転写されるべきDNA鋳型の能力を妨げない場合、「作動可能に結合している」。従って、プロモーター領域は、プロモーターがその核酸の転写をもたらすことができる場合にポリペプチドをコードする核酸に作動可能に結合される。プロモーターは所定の細胞においてのみDNAの実質的な転写を導く細胞特異的プロモーターであってもよい。プロモーターの他に他の転写制御エレメント、例えばエンハンサーオペレーターリプレッサー、及び転写終結シグナルが、細胞特異的転写を導くポリヌクレオチドと結合することができる。好適なプロモーター及び他の転写制御領域は本明細書に開示されている。種々な転写制御領域が当業者に知られている。これらには、限定されないが、脊椎動物細胞において機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント(例えばイントロン−Aと併せて最初期プロモーター)、サルウイルス40(例えば初期プロモーター)、及び(例えばラウス肉腫ウイルスなど)レトロウイルスを含む。他の転写制御領域は、脊椎動物の遺伝子、例えばアクチン熱ショックタンパク質ウシ成長ホルモン及びウサギα−グロビン、並びに、真核細胞における遺伝子発現を調節することができる他の配列に由来するものを含む。更なる好適な転写コントロール領域は、組織特異的プロモーター及びエンハンサー並びに誘導性プロモーター(例えばプロモーター誘導性テトラサイクリン)を含む。同様に、様々な転写制御エレメントが当業者に知られている。これらは、限定するものではないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び終止コドン、及びウィルス系由来の要素(特に、内部リボソーム進入部位、又はIRES、CITE配列としても知られる)を含む。発現カセットはまた、他の特性、例えば複製起源、及び/又は染色体組込み要素、例えばレトロウイルス長末端反復LTR)、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)末端逆位配列(ITR)を含みうる。

0092

本発明のポリヌクレオチド及び核酸コーディング領域は、本発明のポリヌクレオチドにコードされるポリペプチドの分泌を指示する、分泌又はシグナルペプチドをコードする更なるコーディング領域を伴い得る。例えば、融合体の分泌が望まれる場合、シグナル配列をコードするDNAが本発明の融合タンパク質又はその断片をコードする核酸の上流に配置されうる。シグナル仮説によると、哺乳類細胞によって分泌されるタンパク質はシグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有し、これは一旦粗面小胞体を横切って成長するタンパク質鎖の排出が開始すると成熟タンパク質から切断される。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドは、一般に、ポリペプチドの分泌型または「成熟」型を生成するために翻訳されたポリペプチドから切断されるポリペプチドのN末端に融合されたシグナルペプチドを有することを認識している。ある実施態様において、天然のシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖または軽鎖シグナルペプチド又は作動可能に結合しているポリペプチドの分泌を指示する能力を保持するその配列の機能的誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能的誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子TPA)又はマウスβ−グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。分泌シグナルペプチドの例示的なアミノ酸及びヌクレオチド配列を、配列番号39〜47に示す。

0093

後の精製を容易にし(例えば、ヒスチジンタグ)又は融合タンパク質の標識化における補助のために使用されうる短いタンパク質配列をコードするDNAは、ポリヌクレオチドをコードする融合タンパク質(断片)の中又は末端に含まれうる。

0094

更なる実施態様では、本発明の一又は複数のポリヌクレオチドを含んでなる宿主細胞が提供される。更なる実施態様では、本発明の一又は複数のベクターを含んでなる宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、ポリヌクレオチド及びベクターそれぞれ関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを単独または組み合わせて組み込むことができる。一つのそのような実施態様において、宿主細胞は、本発明の融合タンパク質(の一部)をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む(例えば該ベクターで形質転換又はトランスフェクトされる)。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の融合タンパク質又はその断片を生成するよう操作できる何れかの種類の細胞システムを指す。融合タンパク質の複製及び発現の補助に好適な宿主細胞は当分野でよく知られている。このような細胞は、適切である場合、特定の発現ベクターを用いて形質移入又は形質導入されてよく、多量のベクター含有細胞は、例えば臨床用途に、十分な量の融合タンパク質を得るために、大規模発酵槽播種して増殖させることができる。好適な宿主細胞は、原核生物微生物、例えば大腸菌、又は様々な真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、昆虫細胞などを含む。例えば、特に、グリコシル化が必要ない場合には、ポリペプチドは細菌で産生することができる。発現の後、ポリペプチドは可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製することができる。原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、グリコシル化経路が、「ヒト化」されている菌類酵母菌株を含むポリペプチドをコードするベクターのための、適切なクローニング宿主又は発現宿主であり、部分的または完全なヒトのグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす。Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004),及びLi et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006)を参照。(グリコシル化)ポリペプチドの発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物無脊椎動物と脊椎動物)から派生している。無脊椎動物細胞の例としては、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株が同定され、これらは特にSpodoptera frugiperda細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と組み合わせて使用することができる。植物細胞培養を宿主として利用することができる。例えば、米国特許第5959177号、第6040498号、第6420548号、第7125978号及び第6417429号(トランスジェニック植物における抗体産生に関するPLNTBODIESTM技術を記載)を参照。脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適応された哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞の他の例は、SV40により形質転換したサル腎臓CV1系(COS−7);ヒト胎児腎臓(HEK)系(例えば、Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977))に記載されているような293又は293T細胞、ベビーハムスター腎臓細胞(BHK)、マウスセルトリ細胞(例えば、Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)に記載されているようなTM4細胞)、サル腎臓細胞(CV1)、アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76)、ヒト子宮頸癌細胞(HELA)、イヌ腎臓細胞(MDCK)、バッファローラット肝臓細胞BRL3A)、ヒト肺細胞(W138)、ヒト肝臓細胞(Hep G2)、マウス乳房腫瘍細胞(MMT060562)、TRI細胞(例えば、Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)に記載)、MRC5細胞、及びFS4細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、dhfr−CHO細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))を含むチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、及びYO、NS0、P3X63及びSp2/0などの骨髄腫細胞株を含む。タンパク質生成に適したある種の哺乳動物宿主細胞の概説について、例えばYazaki 及び Wu, Methodsin Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 255-268を参照。宿主細胞は、培養細胞、例えば、哺乳動物の培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞、また、トランスジェニック生物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞を含む。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞、又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。

0095

これらのシステムにおいて外来遺伝子を発現する標準的な技術が当技術分野で知られている。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖のどちらかを含むポリペプチドを発現する細胞は、発現された産物が重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体であるように、抗体鎖の他方を発現するように操作されうる。

0096

一実施態様において、本発明による融合タンパク質を生産する方法が提供され、その方法は、本明細書に与えられるように、融合タンパク質の発現に適した条件下で、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び宿主細胞(または宿主細胞培養培地)から融合タンパク質を回収することを含む。

0097

本発明の融合タンパク質において、その構成要素(免疫グロブリン分子及びIL−2分子)は相互に遺伝子融合している。融合タンパク質は、その成分が、お互いに直接的に又はリンカー配列を介して互いに間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成物と長さは、当該技術分野において周知の方法に従って決定することができ、有効性について試験され得る。また、付加的な配列が、所望であれば、融合タンパク質の個々の成分を分離するための切断部位、例えばエンドペプチダーゼ認識配列を組み込むために含まれていてもよい。

0098

ある実施態様において、本発明の融合タンパク質は、少なくとも、抗原に結合することができる免疫グロブリン可変領域を含む。可変領域が、天然に又は非天然に生じる抗体及びその断片の一部を形成し、及びそれに由来しうる。ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を産生する方法は当分野で周知である(例えば、Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988を参照)。非天然に生じる抗体は、固相−ペプチド合成を使用して構築されるか、組換え的に生産されるか(例えば米国特許第4,186,567号に記載のように)、又は例えば可変重鎖及び可変軽鎖を含んでなるコンビナトリアルライブラリーのスクリーニング(例えばMcCaffertyの米国特許第5,969,108号を参照)によって得られうる。

0099

任意の動物種の免疫グロブリンが、本発明で使用することができる。本発明において有用である、非限定的な免疫グロブリンは、マウス、霊長類、又はヒト起源のものであり得る。融合タンパク質がヒトでの使用を意図する場合、免疫グロブリンの定常領域はヒトに由来するキメラ形態の免疫グロブリンが使用され得る。また、ヒト化又は完全ヒト形態の免疫グロブリンが、当分野でよく知られている方法に従って調製されうる(例えばWinterの米国特許第5,565,332号を参照)。ヒト化は、様々な方法によって達成することができ、限定されなが、(a)非ヒト(例えば、ドナー抗体)のCDRを、重要なフレームワーク残基(例えば、良好な抗原結合親和性又は抗体の機能を維持するために重要であるもの)の保持を伴うか又は伴わない、ヒト(例えば、レシピエント抗体)のフレームワーク領域及び定常領域の上に移植すること、(b)非ヒト特異性決定領域(SDR又はa−CDR;抗体−抗原相互作用に重要な残基)のみを移植ヒトフレームワーク領域及び定常領域上に移植すること、又は(c)非ヒト可変ドメイン全体を移植するが、表面残基の置換によってヒト様部分(section)で「覆い隠す」ことを含む。ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)に総説され、更に、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989);米国特許第55821337号、第7527791号、第6982321号、及び第7087409号; Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol. 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun. 31(3):169-217 (1994); Kashmiri et al., Methods36:25-34 (2005) (SDR(a−CDR)グラフティングを記述); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (「リサーフシング」を記述); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (「FRシャッフリング」を記述);及びOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 及びKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FRシャッフリングへの「誘導選択」アプローチを記述)に記載されている。本発明による特定の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。ヒト抗体及びヒト可変領域は、当技術分野で周知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は一般的にvan Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)に記載されている。ヒト可変領域は、ハイブリドーマ法によって作製されたヒトモノクローナル抗体の一部を形成することができ、それに由来することができる(例えば、Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体、又はヒト可変領域を持つインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる(例えば、Lonberg, Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)を参照)。ヒト抗体及びヒト可変領域はまた、ヒト由来ファージディスプレイライブラリーから選択されたFvクローン可変領域配列を単離することによって生成され得る(例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001);及びMcCafferty et al., Nature 348, 552-554; Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991)を参照)。ファージは典型的には、抗体断片を短鎖Fv(scFv)断片として又はFab断片としてディスプレイする。

0100

ある実施態様において、本発明の融合タンパク質に含まれる免疫グロブリンは、例えばPCT公開番号WO2012/020006(親和性成熟に関する実施例を参照)又は米国特許出願公開番号2004/0132066(この全内容を出典明記によってここに援用する)に開示される方法に従い、増強された結合親和性を有するように操作される。特定の抗原決定基に結合する本発明において有用な抗体の能力は、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)又は当業者によく知られている他の技術、例えば表面プラズモン共鳴技術(BIAcoreT100システムで解析される)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)))及び伝統的な結合アッセイ(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))のいずれかによって測定することができる。競合アッセイは、特定の抗原への結合について参照抗体競合する抗体を同定するために使用され得る。ある実施態様では、このような競合する抗体は、参照抗体によって結合される同じエピトープ(例えば線状又はコンホメーションエピトープ)に結合する抗体が結合するエピトープをマッピングするための詳細な典型的な方法が、Morris (1996) “Epitope MappingProtocols," in Methodsin Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)に提供されている。典型的な競合アッセイにおいて、固定化抗原は、抗原に結合する第一の標識された抗体、及び抗原へ結合について第一の抗体と競合する能力について試験された未標識の第二の抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第二抗体はハイブリドーマ上清中に存在してもよい。コントロールとして、固定化抗原が、第二の未標識の抗体でなく、第一の標識された抗体を含む溶液中でインキュベートされる。第一の抗体の抗原への結合を許容する条件下でインキュベートした後、過剰の未結合の抗体が除去され、固定化された抗原に結合した標識の量が測定される。もし、固定化抗原に結合した標識の量が、コントロールサンプルと比較して試験サンプル中で実質的に減少している場合、それは、第二抗体が、抗原への結合において、第一の抗体と競合していることを示している。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照。

0101

本明細書で記載のように調製される免疫グロブリンは、当分野で知られている技術、例えば高速液体クロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィーゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー等によって精製されうる。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、一部には正味荷電、疎水性、親水性等の要因に依存し、当業者に明瞭であろう。アフィニティークロマトグラフィー精製では、融合タンパク質が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原が使用されうる。例えば、本発明の融合タンパク質のアフィニティークロマトグラフィー精製では、プロテインA又はプロテインGを伴うマトリックスが使用されうる。逐次的なプロテインA又はGアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーが、実施例に本質的に記載されるように融合タンパク質を単離するために使用されうる。融合タンパク質の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィー等を含む様々なよく知られた分析方法の何れかによって決定されうる。例えば、実施例に記載されるように発現される融合タンパク質は、還元及び非還元SDS−PAGEで実証されるように、インタクトであって、正しく会合していると示された(例えば図2を参照)。

0102

組成物、製剤、及び投与の経路
更なる態様においは、本発明は、例えば下記の治療方法の何れかにおける使用のための、本明細書に提供される融合タンパク質の何れかを含んでなる薬学的組成物を提供する。一実施態様において、薬学的製剤は、本明細書で提供される融合タンパク質の何れか、及び薬学的に許容される担体を含む。他の実施態様において、薬学的組成物は、例えば以下に記載するような、少なくとも一の付加的な治療剤と、ここで提供される融合タンパク質を含有する。

0103

更に提供されるのは、インビボでの投与に適した形態における本発明の融合タンパク質を生産する方法であって、(a)本発明による融合タンパク質のを得ること、及び(b)少なくとも一の薬学的に許容可能な担体を含む融合タンパク質の製剤化を含み、それによって融合タンパク質の調製物がインビボでの投与のために製剤化される方法である。
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体中に溶解又は分散された、治療的に有効な量の一又は複数の融合タンパク質を含む。「薬学的に又は薬理学的許容可能な」なる語句は、用いられる投与量及び濃度ではレシピエントに一般的に非毒性であり、すなわち、例えばヒトなどの動物に適宜投与された時に、有害な、アレルギー性の又は他の望まない応答をもたらさない分子実体及び組成物を指す。少なくとも一の融合タンパク質及び場合によっては更なる活性成分を含有する薬学的組成物の調製は、本開示に照らして当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990に例示され、出典明記によってここに援用する。更に、動物(例えばヒト)投与では、調製物が、FDA生物学的標準品部(Office of Biological Standards)又は他の国において対応する当局によって要求される無菌性発熱性、一般的な安全性及び純度標準を満たすべきであることが理解されるだろう。好ましい組成物は凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体」は、当業者に知られている、ありとあらゆる溶剤バッファー分散媒コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤(例えば、抗菌剤抗真菌剤)、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、抗酸化剤、タンパク質、薬物、薬物安定剤、ポリマー、ゲル結合剤、賦形剤、崩壊剤潤滑剤、甘味剤香味剤色素、同様な物質及びその組合せを含む(例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329を参照(出典明記によってここに援用する))。何れかの一般的な担体が活性成分と不適合である場合を除き、治療的又は薬学的組成物におけるその使用が意図される。

0104

組成物は、それが固体液体又はエアロゾル形態で投与されるか、またそれが注射などの投与経路のために無菌である必要があるかに依存して、異なるタイプの担体を含みうる。本発明の融合タンパク質(及び何れかの追加の治療剤)は、当業者に知られているように、静脈内に、皮内に、動脈内に、腹腔内に、病巣内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、脾臓内に、腎内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、腟内に、直腸内に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、内に、眼球内に、経口で、局所的に、局在的に、吸入によって(例えば、エアロゾル吸入)、注射によって、注入によって、持続注入によって、標的細胞浸す限局灌流によって直接、カテーテルによって、洗浄(lavage)によって、クリームにおいて、液体組成物(例えばリポソーム)において、又は他の方法によって、又は前述の何れかの組合せによって投与されうる(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990を参照(出典明記によってここに援用する))。非経口投与、特に静脈内注射が、発明の融合タンパク質などのポリペプチド分子の投与に最も一般的に使用される。

0105

非経口組成物は、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、くも膜下腔内又は腹腔内注射による投与のために設計されたものを含む。注射では、本発明の融合タンパク質は、水溶液中、好ましくは生理学的に適合したバッファー、例えばHanks液、Ringer液、又は生理学的緩衝生理食塩水中に製剤化されうる。溶液は、懸濁、安定及び/又は分散剤などのフォーミュラトリー剤を含みうる。あるいは、融合タンパク質は、使用前は、適切なビヒクル、例えば滅菌発熱性物質除去蒸留水の構成用に粉末形態でありうる。滅菌注射溶液は、本発明の融合タンパク質を、必要に応じて下に挙げる様々な他の成分を伴う適切な溶媒中に必要量組み入れることによって調製される。滅菌は、例えば滅菌濾過膜を介して濾過することにより、容易に達成される。一般的に分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基礎分散培地及び他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液又はエマルションの調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分+任意の追加の所望成分粉末を、先に滅菌−濾過されたその液体培地から得る真空乾燥又は凍結乾燥技術である。液体培地は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体希釈剤は注射の前に十分な生理食塩水又はグルコースでまず等張にされるべきである。組成物は、製造及び保管の条件下で安定でなければならなく、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。内毒素汚染は安全なレベル、例えば0.5ng/mg未満のタンパク質で最小限に保たれるべきであることが理解されるだろう。適な薬学的に許容可能な担体は、限定するものではないが;リン酸塩クエン酸塩および他の有機酸のような緩衝液アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤(例えば、オクタデシルジメチオベンジルアンモニウムクロライドヘキサメトニウムクロライド塩化ベンザルコニウム塩化ベンゼトニウムフェノールブチルまたはベンジルアルコールアルキルパラベン、例えば、メチルまたはプロピルパラベンカテコールレゾルシノールシクロヘキサノール;3−ペンタノール;およびm−クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば、血清アルブミンゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン;マンサッカライドジサッカライド、およびグルコース、マンノースまたはデキストリンを含む他の炭水化物キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロースマンニトールトレハロースまたはソルビトール塩形成対イオン、例えば、ナトリウム金属錯体(例えば、Zn−タンパク質錯体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。水性注射懸濁液は、カルボキシルメチルセルロース・ナトリウム、ソルビトール、デキストランなど、懸濁液の粘度を増加させる化合物を含有しうる。場合によっては、懸濁液は、高濃縮液の調製を可能にするために、適切な安定剤又は化合物の溶解度を増加させる薬剤をまた含有しうる。更に、活性化合物の懸濁液は、適切な油性注射懸濁液として調製されうる。適切な親油性溶媒又はビヒクルは、脂肪油、例えばゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えばエチルクリート(ethyl cleats)又はトリグリセリド、又はリポソームを含む。

0106

活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイドドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィアマイクロエマルションナノ粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。これらの技術は、上掲のRemington's Pharmaceutical Sciences 18th editionに開示されている。徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、ポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。特定の実施態様では、注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば例えばモノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン又はその組合せの組成物における使用によってもたらされうる。

0107

前述の組成物に加えて、融合タンパク質はまた、デポー調製物として製剤化されうる。そのように長く作用する製剤は、インプラント術(例えば皮下又は筋肉内)又は筋肉内注射によって投与されうる。従って、例えば、融合タンパク質は、適切なポリマー又は疎水性材料(例えば許容可能な油中のエマルションとして)又はイオン交換樹脂とともに、又は難溶性誘導体として、例えば難溶性塩として製剤化されうる。

0108

本発明の融合タンパク質を含んでなる薬学的組成物は、慣習的な混合、溶解、乳化カプセル化封入凍結乾燥プロセスによって製造されうる。薬学的組成物は、薬剤的使用可能な調製物へのタンパク質の加工を容易にする一又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して、一般的な方法において製剤化されうる。適切な製剤は、選択された投与経路に依存する。

0109

融合タンパク質は、遊離酸又は塩基、中性又は塩形態の組成物に製剤化されうる。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は塩基の生物学的活性を実質的に保った塩である。これらは酸付加塩、例えばタンパク質組成物遊離アミノ基で形成されるもの、又は塩酸又はリン酸などの無機酸、又は酢酸シュウ酸酒石酸又はマンデル酸などの有機酸で形成されるものを含む。遊離カルボキシル基で形成される塩はまた、水酸化ナトリウム水酸化カリウム水酸化アンモニウム水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩基;又はイソプロピルアミントリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインなどの有機塩基から得ることができる。薬学的塩は、対応する遊離塩基形態よりも水性及び他のプロトン性溶媒中において溶けやすい傾向がある。

0110

治療方法及び組成物
本明細書で提供される融合タンパク質のいずれかを、治療方法で使用することができる。

0111

治療的方法において使用のために、本発明の融合タンパク質は良好な医療行為に合致した方法で処方され、投与され、投薬される。この観点において考慮すべき要因は、治療すべき特定の障害、治療すべき特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤送達部位、投与方法投与日程及び医療従事者が知る他の要因を包含する。

0112

一態様では、医薬として使用するために本発明の融合タンパク質が提供される。更なる態様では、疾患の治療において使用のために本発明の融合タンパク質が提供される。ある実施態様において、治療の方法における使用のために本発明の融合タンパク質が提供される。一実施態様において、本発明は、それを必要としている個体において、疾患の治療に使用のために、本明細書に記載される融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、本発明は、個体に融合タンパク質の治療的有効量を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法に使用のための融合タンパク質を提供する。ある実施態様において、治療すべき疾患は、自己免疫疾患である。典型的な自己免疫疾患は、1型糖尿病、多発性硬化症(MS)、喘息、関節リウマチ、クローン病、全身性エリテマトーデス(SLE)、多発性硬化症を含む。一実施態様において、疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。特定の実施態様において、疾患は、1型糖尿病、クローン病、SLE、及び多発性硬化症の群から選択される。より特定の実施態様において、疾患は、1型糖尿病である。別の実施態様において、疾患は多発性硬化症である。更なる実施態様において、疾患は、喘息、肺線維症又は閉塞性肺疾患である。更に別の実施態様では、疾患は、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合には免疫抑制剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトである。

0113

更なる態様では、本発明は、必要している個体における疾患の治療のための医薬の製造又は調製における、本発明の融合タンパク質の使用を提供する一実施態様において、本医薬は、疾患を有する個体に、医薬の治療的有効量を投与することを含む、疾患を治療する方法で使用するためのものである。ある実施態様において、治療すべき疾患は、自己免疫疾患である。一実施態様において、疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。特定の実施態様において、疾患は、1型糖尿病、クローン病、SLE、及び多発性硬化症の群から選択される。より特定の実施態様において、疾患は、1型糖尿病である。別の実施態様において、疾患は多発性硬化症である。更なる実施態様において、疾患は、喘息、肺線維症又は閉塞性肺疾患である。更に別の実施態様では、疾患は、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症である。一実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合には免疫抑制剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。

0114

更なる態様において、本発明は、本発明の融合タンパク質の治療的有効量を前記個体に投与することを含む、個体において疾患を治療するための方法を提供する。一実施態様において、本発明の融合タンパク質を薬学的に許容される形態で含む組成物が前記個体に投与される。ある実施態様において、治療すべき疾患は、自己免疫疾患である。一実施態様において、疾患は、移植拒絶反応又は移植片対宿主病である。特定の実施態様において、疾患は、1型糖尿病、クローン病、SLE、及び多発性硬化症の群から選択される。より特定の実施態様において、疾患は、1型糖尿病である。別の実施態様において、疾患は多発性硬化症である。更なる実施態様において、疾患は、喘息、肺線維症又は閉塞性肺疾患である。更に別の実施態様では、疾患は、心血管疾患、特にアテローム性動脈硬化症である。ある実施態様において、本方法は、少なくとも一の更なる治療剤、例えば、治療すべき疾患が自己免疫疾患である場合には免疫抑制剤の治療的有効量を個体に投与することを更に含む。上記実施態様のいずれかに記載の「個体」は、哺乳動物であり、好ましくはヒトであり得る。

0115

幾つかの実施態様では、有効量の本発明の融合タンパク質が、細胞に投与される。他の実施態様では、治療的に有効な量の本発明の融合タンパク質が、疾患の治療のために個体に投与される。

0116

疾患の予防又は治療のためには、本発明の融合タンパク質の適切な用量(単独で使用されるか、又は、一以上の更なる治療的薬剤との組み合わされる場合)は、治療すべき疾患の種類、投与の経路、患者の体重、融合タンパク質の種類、疾患の重症度及び経過、融合タンパク質を予防又は治療目的のいずれにおいて投与するか、事前の或いは併用による治療介入、融合タンパク質に対する患者の臨床的履歴及び応答性、及び担当医の判断に依存する。何れの場合も、投与に責任のある実践者が、個々の被験体に対し、組成物中の活性成分の濃度及び適切な用量を決定するだろう。限定するものではないが、単一又は様々な時間点にわたる複数回投与ボーラス投与、及びパルス注入を含む様々な投与スケジュールが、ここで考えられる。

0117

融合タンパク質は、患者に対して、単一、又は一連の治療にわたって適切に投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、例えば一回以上の別個の投与によるか、連続注入によるかに関わらず、融合タンパク質の約1μg/kgから15mg/kg(例えば0.1mg/kgから10mg/kg)が患者への投与のための初期候補用量となり得る。1つの典型的な一日当たり用量は上記した要因に応じて約1μg/kgから100mg/kg又はそれ以上の範囲である。数日間以上に渡る反復投与の場合には、状態に応じて、治療は疾患症状の所望される抑制が起こるまで持続するであろう。融合タンパク質の1つの例示される用量は約0.05mg/kgから約10mg/kgの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量はまた、投与あたり約1μg/kg/体重から、約5μg/kg/体重、約10μg/kg/体重、約50μg/kg/体重、約100μg/kg/体重、約200μg/kg/体重、約350μg/kg/体重、約500μg/kg/体重、約1mg/kg/体重、約5mg/kg/体重、約10mg/kg/体重、約50mg/kg/体重、約100mg/kg/体重、約200mg/kg/体重、約350mg/kg/体重、約500mg/kg/体重、約1000mg/kg/体重まで又はそれ以上、及びその中で導きだされる任意の範囲を含む。ここで挙げた数値から導きだされる範囲の非限定的な例は、約5mg/kg/体重〜約100mg/kg/体重、約5μg/kg/体重〜約500mg/kg/体重などの範囲が、上記の数値に基づき投与されうる。このように、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、5.0mg/kg又は10mg/kgの一又は複数(又はその何れかの組合せ)の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、間欠的に、例えば毎週又は3週間毎に投与されうる(例えば、患者は約2〜約20、又は例えば約6用量の融合タンパク質を受ける)。初期の高負荷投与量の後に一以上の低投与量が投与され得る。しかしながら、他の投与レジメンも有益であり得る。この治療の進行は、従来技術及びアッセイにより容易にモニターされる。

0118

本発明の融合タンパク質は一般的に、意図した目的を達成するために有効な量において使用されるだろう。疾患状態を治療又は防止するための使用では、発明の融合タンパク質又はその薬学的組成物は、治療的に有効な量において投与又は適用される。治療的に有効な量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の考慮のもと、十分に当業者の能力の範囲内である。

0119

全身性投与では、治療的に有効な用量は最初に、細胞培養アッセイなどのインビトロアッセイから推定されうる。次いで用量は、細胞培養において決定されるIC50を含む循環濃度範囲を得るために、動物モデルにおいて処方され得る。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用されうる。

0120

最初の投与量はまた、当分野においてよく知られている技術を使用して、インビボデータ、例えば動物モデルから推定されうる。当業者は、動物データに基づいてヒトへの投与を容易に最適化できるだろう。

0121

投与量及び間隔は、治療効果を維持するのに十分な融合タンパク質の血漿レベルを提供するために、個々に調整されうる。注射による投与のための通常の患者の投与量は、約0.1〜50mg/kg/日、典型的には約0.5〜1mg/kg/日である。治療的に有効な血漿レベルは、毎日の複数回投与によって達成されうる。血漿中のレベルは、例えばHPLCによって測定されうる。

0122

局所投与又は選択的取込みの場合、融合タンパク質の有効な局所濃度は血漿濃度と関連しない場合がある。当業者は、過度実験をすることなく、治療的に有効な局所投与量を最適化できるだろう。

0123

治療的に有効な用量の融合タンパク質は一般的に、実質的な毒性をもたらすことなく治療効果を提供するだろう。融合タンパク質の毒性及び治療効果は、細胞培養又は実験動物において標準的な手順によって決定できる。細胞培養アッセイ及び動物研究は、LD50(集団の50%に致死性である用量)及びED50(集団の50%に治療的に有効である用量)を決定するために使用できる。毒性及び治療効果間の用量比は、LD50/ED50の比として表される治療指数である。大きい治療指数を示す融合タンパク質が好ましい。一実施態様では、本発明による融合タンパク質は、高い治療指数を示す。細胞培養アッセイ及び動物研究から得られるデータは、ヒトにおける使用に好適な投与量の範囲の策定に使用されうる。投与量は好ましくは、ほとんどあるいは全く毒性の無いED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、様々な要因、例えば採用される剤形、利用される投与経路、被験体の状態などに応じて、この範囲内において変わりうる。正確な処方、投与の経路及び投与量は、患者の状態を考慮してそれぞれの医師によって選択されうる。(例えばFingl et al., 1975, in: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1(出典明記によってその全体をここに援用する)を参照)。

0124

本発明の融合タンパク質で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに対し、どのように及びいつ投与を終了、中断、調整するかを知っているだろう。逆に、主治医はまた、臨床反応が十分でない場合、治療を高レベルに調整することを知っているだろう(毒性を除く)。目的の障害の管理における投与量の程度は、治療される状態の重症度、投与の経路などによって様々だろう。状態の重症度は、例えば標準的な予後評価方法によって一部には評価されうる。さらに、用量及びおそらくは投与頻度はまた、個々の患者の年齢、体重及び反応によって様々だろう。

0125

他の薬剤及び治療
本発明による融合タンパク質は、治療において一又は複数の他の薬剤との組合せで投与されうる。例えば、本発明の融合タンパク質が少なくとも一の付加的な治療剤と同時投与することができる。「治療剤」なる用語は、治療を必要としている個体における症状又は疾患を治療するために投与される何れかの薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療されている特定の徴候に好適な何れかの活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補活性を伴うものを含みうる。ある実施態様において、付加的治療剤は、免疫抑制剤である。

0126

このような他の薬剤は、意図した目的のために有効な量で組み合わされ適切に存在する。そのような他の薬剤の有効量は、使用される融合タンパク質の量、障害又は治療の種類及び上記した他の要因に依存する。融合タンパク質は一般的には本明細書に記載されるのと同じ用量及び投与経路において、又は、本明細書に記載された用量の1%から99%で、又は経験的に/臨床的に妥当であると決定された任意の用量で及び任意の経路により使用される。

0127

上記のこうした併用療法は、併用投与(2つ以上の治療剤が、同一または別々の組成物に含まれている)、及び、本発明の融合タンパク質の投与が、付加的治療剤及び/又はアジュバントの投与の前、同時、及び/又はその後に起きうる分離投与を包含する。

0128

製造品
本発明の他の態様では、上述の疾患の治療、予防及び/又は診断に有用な物質を含む製造品が提供される。製造品は、容器と容器上ないしは容器に付随するラベルないしはパッケージ挿入物具備する。好適な容器には、例えば、ビンバイアルシリンジ、IV液バッグ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。容器は、症状を治療、予防及び/又は診断するために有効な組成物単独又は他の組成物と組み合わせる組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一の活性剤は本発明の融合タンパク質である。ラベル又はパッケージ挿入物は、組成物が選択した症状の治療のために使用されることを示している。更に、製造品は、(a)本発明の融合タンパク質を含有する組成物を中に収容する第一の容器と、(b)更なる治療薬を含有する組成物を中に収容する第二の容器とを含みうる。本発明の本実施態様における製造品は、組成物が特定の疾患を治療することに用いることができることを示すパッケージ挿入物を更に含んでいてもよい。別法として、または加えて、製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えば注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝化塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二(又は第三)の容器をさらに含んでもよい。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

0129

以下は本発明の方法及び組成物の例である。上記提供される一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。

0130

組換えDNA技術
Sambrook et al., Molecular cloning: A laboratory manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989に記述されるように、標準的な方法がDNAを操作するために使用された。分子生物学試薬を、製造元の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖の塩基配列に関する一般情報については次に与えられる:Kabat, E.A. et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Ed., NIH Publication No 91-3242.

0131

DNA配列決定
DNA配列は、二本鎖配列決定により決定した。

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