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課題・解決手段

本発明は、i)レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態NADP(H)の可用性に依存する、核酸配列;ii)RNAポリメラーゼが結合することができる、核酸配列i)の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列;iii)プロモーター配列ii)の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含むNADP(H)ナノセンサーに関する。本発明はさらに、細胞、NADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法、ならびにNADP(H)ナノセンサーの使用に関する。

概要

背景

化学工業界における触媒としてのNADP(H)依存性酵素の使用は、多数の例の中で開示されている。したがって、アルコールデヒドロゲナーゼオキシドレダクターゼまたはケトレダクターゼとも呼ばれる)は、カルボニル基還元するために利用されている。特に、エナンチオ特異性および位置特異性が、プロキラルケトンを還元するために使用される。有用な化合物の合成に役立つそのようなケトレダクターゼの例は、4−クロロアセトアセテートエステル不斉還元(US 5,559,030、US 5,700,670、およびUS 5,891,685)、ジカルボン酸の還元(US 6,399,339)、tert−ブチル−(S)−クロロ−5−ヒドロキシ−3−オキソヘキサノエートの還元(US 6,645,746、およびWO−A−01/40450)、ピロロトリアジン系化合物の還元(US−A−2006/0286646)、置換アセトフェノンの還元(US 6,800,477、US−A−2012/0178142)、またはヒドロキシチオランの還元(WO−A−2005/054491)である。同様に、α−ハロケトンはα—ハロアルコールに酵素還元される。これは、単離された酵素により行われ得、また細胞全体を用いても行われ得る(WO−A−2008/038050)。Lactobacillus brevisまたはThermoanaerobium brokii由来の特異的なアルコールデヒドロゲナーゼにより、8−クロロ−6−オキソオクタン酸アルキルエステルの、(R)−または(S)−8−クロロ−6−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステル(これらは、(R)−α−リポ酸および(S)−α−リポ酸の前駆体としてそれぞれ使用される)への還元が行われている(US 7,157,253)。活性であってもよいアルカノールの調製のためのプロセス(ここでは、例えば、(1S)−3−メチルアミノ−1−(2−チエニル)−プロパン−1−オールおよび(1S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)−プロパン−1−オールの調製が、対応するケトンの酵素還元により行われる)もまた記載されている(WO−A−2006/094945)。ケトレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼによりエナンチオ特異的に3−ヒドロキシブチル3−ヒドロキシブチラートを調製するためのプロセスが同様に知られている(US−A−2012/0064611)。US 6,645,746には、NADP(H)を用いてtert−ブチル−(5S)−6−クロロ−5−ヒドロキシ−3−オキソヘキサノエートをtert−ブチル−(3R,5S)−6−クロロ−3,5−ジヒドロキシヘキサノエートに還元するために使用することができる、Candida magnoliae由来のアミノ酸配列が開示されている。この文献の記述においては、酵素(好ましくは、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼ同時発現された酵素)が利用され、補因子NADP(H)の再生は、グルコースデヒドロゲナーゼを用い、そして補助基質としてグルコースを用いて行われている。WO−A−2004/111083には、ケトン(特に、2−および3−オキソ酸エステル)のエナンチオ選択的酵素還元のためのプロセスが記載されており、ここでは、反応は、Pichia capsulata由来のオキシドレダクターゼにより触媒される。WO−A−2005/108593には、1−ブタノールの調製のためのプロセスが記載されており、ここでは、2−ブタノンが、二相系において(例えば、Candida parapsilosis由来の)カルボニルレダクターゼおよび補酵素で還元される。EP−A−2 061 880には、α,β−不飽和アルキノン誘導体からのアルケノン誘導体の、NADP(H)依存性酵素による調製のためのプロセスが開示されており、ここでは、対応するレダクターゼが、精製された形態で、また、微生物自体の形態でも使用される。EP−A−2 087 127には、NADP(H)の存在下でオキシドレダクターゼ/デヒドロゲナーゼを使用する、セコジオン誘導体のエナンチオ選択的酵素還元によるセコル誘導体の調製のためのプロセスが記載されている。

ケトンおよびアルデヒドのNADP(H)依存性還元に加えて、NADP(H)依存性酵素、いわゆるエノアトレダクターゼもまた、エノアートのエナンチオ特異的還元に使用される。これにより、Kataokaと共同研究者らは、大腸菌由来のNADP(H)を生成するグルコースデヒドロゲナーゼとともにCandida macedoniensis由来のエノアートレダクターゼを使用することにより、ケトイソホロンが(6R)−レボジオン分取還元されることを報告した(Kataoka,Kotaka,Thiwthong,Wada,Nakamori,and Shimizu,J.Biotechnol.,2004,114,1−9)。

例えば、還元に続いて、エポキシドへの環化が行われる結合系におけるNADP(H)依存性酵素の使用がさらに記載されている。したがって、対応するエナンチオマーを形成させるため、および続いて特定のエポキシドへの塩基誘導性の環化を行うための(R)−または(S)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼの使用が記載されている(CA 2 612 407)。

極めて徹底的に研究されたBacillus megaterium由来のモノオキシゲナーゼP450 BM3(CYP102A1)の場合にそうであるように(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2012)95:357−367)、モノオキシゲナーゼが利用される場合には、NADP(H)の酵素的供給もまた必要である。この脂肪酸ヒドロキシラーゼは、アルカンアルケン、および芳香族炭化水素のような幅広基質酸化する。モノオキシゲナーゼはヒドロキシル化を触媒するが、NADP(H)の化学両論的供給が必要である。

NADP(H)依存性酵素はまた、例えば、2−ケト酸の対応するD−アミノ酸への還元的アミノ化(WO−A−2006/113085)、または2−ケトピメラートからの6−アミノカプロン酸の還元的アミノ化(WO−A−2012/031911)のような、還元的アミノ化にも利用される。

NADP(H)依存性酵素の最も多様な用途の概要は、例えば、Hollmann,Arendsa and Holtmann(Green Chemistry,2011,13,2285−2313)、または教本「Industrial Biotransformations」by Liese,Seelbach,and Wandrey(Wiley−VCH Verlag,2006,ISBN:3−527−31001−0)の中にも見ることができる。

NADP(H)依存性酵素を利用しようとする具体的な反応にかかわらず、第一に、高い変換率および高い立体特異性を確実にする適切な酵素を提供することが必要条件である。この必要条件には次に、そのような酵素のスクリーニング続き、これは様々な方法で行うことができる。

遊離体生成物への所望される変換についての直接の試験は、これまで、好ましくは、96、384、またはさらには1,536のウェルを持つマイクロタイタープレートの中で行われてきた。これらのプレートは、96、384、または1,536の酵素の同時の試験を可能にする。所望される酵素反応の生成物が、クロマトグラフィー技術により直接決定され得る。この方法には、反応産物(これは例えば、アルコール、またはカルボニル化合物であり得る)の検出のための96、384、または1,536のウェルからの試料の取り出しと、クロマトグラフィーによる分離が必要である。言うまでもなく、そのような手順は複雑であり、時間がかかる。したがって、間接的な試験がしばしば使用される。したがって、NADP(H)は340nmを吸収するが、NADPは吸収しないという事実が利用される。消費されたNADP(H)の量は、原則としてこれにより決定することができる。あるいは、アルコールのカルボニルレダクターゼに触媒される酸化においては、NADPのNADP(H)への変換もまたこの方法で測定され得る。この反応や同等の反応においては、補因子NADPの還元が340nmでの吸光度の増大により決定される。還元された補因子の固有蛍光はまた、定量化にも使用することができる。これは、マイクロタイターリーダー装置において行われる。

酵素による還元的アミノ基転移、およびまたケトンの還元の検出のためにNADP(H)消費を決定するための別の方法においては、HADP(H)消費に伴うpHの変化が変色指示薬により決定される(US 7,642,073)。変色指示薬の適切な選択により、色の変化の波長を決定することができ、これは次に、マイクロタイターリーダー装置において決定される。

1536までのウェルを持つマイクロタイタープレート形式でのスクリーニングが、特異的な分析物結合特性を持つメンブレン液体の流れを介して行われる特別なマイクロタイタープレートシステムもまた記載されている(EP−A−1 628 768)。

検出可能な基(例えば、蛍光団の)とのカップリングにより分析物さらに容易に検出できるようにする試みも行われている。このためには、反応が行われる前に分析物が蛍光基共有結合させられる。反応が行われ、分析物がこれに応じて反応させられると、蛍光基の蛍光が、例えば、基の分割により、または分析物の構造の変化により、変化するはずである。よって、蛍光の変化が分析物の変換の指標である。しかし、この欠点は、蛍光基が多くの場合に、分析物の反応性に影響を与える点である。WO−A−2007/131696には、調べようとする試料中に蛍光色素および大環状構造を提供し、そして少なくとも2つの時点で蛍光色素の蛍光特性を測定することにより、分析物の濃度を決定できることが記載されている。これにより、大環状構造は色素に結合し、そして分析物について調べようとする濃度範囲内で、これが大環状構造から蛍光色素に取って代わる

概要

本発明は、i)レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態がNADP(H)の可用性に依存する、核酸配列;ii)RNAポリメラーゼが結合することができる、核酸配列i)の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列;iii)プロモーター配列ii)の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含むNADP(H)ナノセンサーに関する。本発明はさらに、細胞、NADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法、ならびにNADP(H)ナノセンサーの使用に関する。

目的

NADP(H)依存性酵素を利用しようとする具体的な反応にかかわらず、第一に、高い変換率および高い立体特異性を確実にする適切な酵素を提供する

効果

実績

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請求項1

以下を含むNADP(H)ナノセンサー:i)レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態がNADP(H)の可用性に依存する、核酸配列;ii)RNAポリメラーゼが結合することができる、核酸配列i)の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列;iii)プロモーター配列ii)の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列。

請求項2

前記レギュレーターがSoxレギュレーター(SoxR)であり、前記プロモーター配列がsoxSプロモーター配列である、請求項1に記載のNADP(H)ナノセンサー。

請求項3

請求項1または2に記載のNADP(H)ナノセンサーであって、ここでは、構成要素i)およびii)は、SoxRとSoxSとの間に配置されており、SoxR結合配列、SoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してmRNAのレベルで対応する、soxSプロモーター配列の後ろに続く配列を含む大腸菌由来遺伝子間領域によって、あるいは、これに相同である核酸配列によって形成されている、NADP(H)ナノセンサー。

請求項4

構成要素i)およびii)が、以下からなる群より選択される核酸配列により形成されている、請求項3に記載のNADP(H)ナノセンサー:a)配列番号1に記載の核酸配列、b)a)の核酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有している核酸配列であって、soxSプロモーターに対するRNAポリメラーゼの親和性がSoxRの酸化状態に依存するようにSoxRに結合することができる核酸配列、およびc)a)またはb)の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、soxSプロモーターに対するRNAポリメラーゼの親和性がSoxRの酸化状態に依存するようにSoxRに結合することができる核酸配列。

請求項5

以下を含む、先行する請求項のいずれか1項に記載のNADP(H)ナノセンサー:(α1)SoxRの大腸菌遺伝子(soxR)またはこれに相同である核酸配列;(α2)構成要素i)およびii)としての、(α1)の後ろに続く、soxRとsoxSとの間に配置されており、SoxR結合配列、SoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してmRNAのレベルで対応する、soxSプロモーター配列の後ろに続く配列を含む大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列;(α3)適切である場合には、(α2)の後ろに続く、大腸菌由来のsoxS遺伝子の部分配列またはこれに相同である核酸配列;(α4)構成要素iii)としての、(α2)または(α3)の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、soxSプロモーター配列の制御下にある核酸配列。

請求項6

以下を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載のNADP(H)ナノセンサー:(β1)SoxRの大腸菌遺伝子(soxR)またはこれに相同である核酸配列;(β2)構成要素i)およびii)としての、上記で定義したような、(β1)の後ろに続く、soxRとsoxSとの間に配置されており、SoxR結合配列、SoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してmRNAのレベルで対応する、soxSプロモーター配列の後ろに続く配列を含む、大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列;(β3)(β2)の後ろに続く、soxSプロモーター配列の制御下にある、大腸菌由来のsoxS遺伝子の配列、この遺伝子の部分配列、またはこれに相同である核酸配列;(β3’)mRNAレベルでリボソーム結合部位に対応する、(β3)の後ろに続くさらなる配列;(β4)構成要素iii)としての、(β3’)の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、soxSプロモーター配列の制御下にある核酸配列。

請求項7

構成要素(α1)または(β1)が以下からなる群より選択される、請求項5または6に記載のNADP(H)ナノセンサー:a)配列番号2に記載の核酸配列、b)配列番号3に記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする核酸配列、c)a)またはb)の核酸配列に対して少なくとも70%の同一性を有している核酸配列であって、soxRとsoxSとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のSoxR結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、d)配列番号3に対して少なくとも70%の相同性を有しているポリペプチドをコードする核酸配列であって、soxRとsoxSとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のSoxR結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、およびe)群a)〜d)のうちの1つに記載の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、soxRとsoxSとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のSoxR結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列。

請求項8

先行する請求項のいずれか1項に記載のNADP(H)ナノセンサーであって、ここでは、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列(iii)が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、高感度黄色蛍光タンパク質(EYFP)、高感度青色蛍光タンパク質(EBFP)、高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP)、DsRed、HcRed、AsRed、AmCyan、ZsGreen、AcGFP、およびZsYellowをコードする遺伝子からなる群より選択される、NADP(H)ナノセンサー。いわゆる、LOVドメインを含む光受容体タンパク質が同様に使用され得る。

請求項9

前記自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列(iii)が、高感度黄色蛍光タンパク質(EYFP)をコードする遺伝子である、請求項8に記載のNADP(H)ナノセンサー。

請求項10

請求項1〜9のいずれか1項に記載のNADP(H)ナノセンサーを含有している細胞

請求項11

前記NADP(H)ナノセンサーが、エピソームまたは染色体の形態で細胞中に存在する、請求項10に記載の細胞。

請求項12

前記細胞が、大腸菌、Pseudomonasfluorescens、Corynebacteriumglutamicum、Bacillussubtilis、またはSaccharomycescerevisiaeからなる群より選択される、請求項10または11に記載の細胞。

請求項13

NADP(H)依存性酵素をコードする変異させられていてもよい遺伝子を持つプラスミドをさらに含有している、請求項10〜12のいずれか1項に記載の細胞。

請求項14

前記NADP(H)依存性酵素が、アルコールデヒドロゲナーゼアルデヒドデヒドロゲナーゼラクテートデヒドロゲナーゼ、エノアトレダクターゼ、エポキシドレダクターゼジアミノピメラートデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼアルデヒドオキシドレダクターゼアルカンレダクターゼ、アミンレダクターゼ、エポキシドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸ケトレダクターゼ、およびヒドロキシ酸デハロゲナーゼからなる群より選択される、請求項14に記載の細胞。

請求項15

自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有している組換え細胞であって、ここでは、細胞内での自己蛍光タンパク質の発現の程度が、細胞内NADP(H)の可用性に依存する、組換え細胞。

請求項16

以下の方法工程を含む、NADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法:(I)請求項1〜9のいずれか1項に記載のNADP(H)ナノセンサーを提供する工程;(II)細胞内にNADP(H)ナノセンサーを導入する工程;(III)方法工程(II)で得られた細胞の細胞懸濁物の個々の細胞内にNADP(H)依存性酵素をコードし得る遺伝子を導入する工程;(IV)細胞をNADP(H)依存性酵素の基質とともにインキュベートする工程;(V)細胞内蛍光活性の検出により、NADP(H)依存性酵素の増大した活性を持つ細胞懸濁物中の個々の細胞を同定する工程;(VI)細胞懸濁物から同定した細胞を分離する工程;(VII)同定した細胞中のNADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離する工程。

請求項17

前記同定した細胞が、フローサイトメトリーにより方法工程(VI)において細胞懸濁物から分離される、請求項16に記載の方法。

請求項18

NADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子をinvivoで同定するための、請求項1〜9のいずれか1項に記載のNADP(H)ナノセンサーの使用。

技術分野

0001

本発明は、NADP(H)ナノセンサー細胞、NADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法、およびNADP(H)ナノセンサーの使用に関する。

背景技術

0002

化学工業界における触媒としてのNADP(H)依存性酵素の使用は、多数の例の中で開示されている。したがって、アルコールデヒドロゲナーゼオキシドレダクターゼまたはケトレダクターゼとも呼ばれる)は、カルボニル基還元するために利用されている。特に、エナンチオ特異性および位置特異性が、プロキラルケトンを還元するために使用される。有用な化合物の合成に役立つそのようなケトレダクターゼの例は、4−クロロアセトアセテートエステル不斉還元(US 5,559,030、US 5,700,670、およびUS 5,891,685)、ジカルボン酸の還元(US 6,399,339)、tert−ブチル−(S)−クロロ−5−ヒドロキシ−3−オキソヘキサノエートの還元(US 6,645,746、およびWO−A−01/40450)、ピロロトリアジン系化合物の還元(US−A−2006/0286646)、置換アセトフェノンの還元(US 6,800,477、US−A−2012/0178142)、またはヒドロキシチオランの還元(WO−A−2005/054491)である。同様に、α−ハロケトンはα—ハロアルコールに酵素還元される。これは、単離された酵素により行われ得、また細胞全体を用いても行われ得る(WO−A−2008/038050)。Lactobacillus brevisまたはThermoanaerobium brokii由来の特異的なアルコールデヒドロゲナーゼにより、8−クロロ−6−オキソオクタン酸アルキルエステルの、(R)−または(S)−8−クロロ−6−ヒドロキシオクタン酸アルキルエステル(これらは、(R)−α−リポ酸および(S)−α−リポ酸の前駆体としてそれぞれ使用される)への還元が行われている(US 7,157,253)。活性であってもよいアルカノールの調製のためのプロセス(ここでは、例えば、(1S)−3−メチルアミノ−1−(2−チエニル)−プロパン−1−オールおよび(1S)−3−クロロ−1−(2−チエニル)−プロパン−1−オールの調製が、対応するケトンの酵素還元により行われる)もまた記載されている(WO−A−2006/094945)。ケトレダクターゼまたはアルコールデヒドロゲナーゼによりエナンチオ特異的に3−ヒドロキシブチル3−ヒドロキシブチラートを調製するためのプロセスが同様に知られている(US−A−2012/0064611)。US 6,645,746には、NADP(H)を用いてtert−ブチル−(5S)−6−クロロ−5−ヒドロキシ−3−オキソヘキサノエートをtert−ブチル−(3R,5S)−6−クロロ−3,5−ジヒドロキシヘキサノエートに還元するために使用することができる、Candida magnoliae由来のアミノ酸配列が開示されている。この文献の記述においては、酵素(好ましくは、Bacillus megaterium由来のグルコースデヒドロゲナーゼ同時発現された酵素)が利用され、補因子NADP(H)の再生は、グルコースデヒドロゲナーゼを用い、そして補助基質としてグルコースを用いて行われている。WO−A−2004/111083には、ケトン(特に、2−および3−オキソ酸エステル)のエナンチオ選択的酵素還元のためのプロセスが記載されており、ここでは、反応は、Pichia capsulata由来のオキシドレダクターゼにより触媒される。WO−A−2005/108593には、1−ブタノールの調製のためのプロセスが記載されており、ここでは、2−ブタノンが、二相系において(例えば、Candida parapsilosis由来の)カルボニルレダクターゼおよび補酵素で還元される。EP−A−2 061 880には、α,β−不飽和アルキノン誘導体からのアルケノン誘導体の、NADP(H)依存性酵素による調製のためのプロセスが開示されており、ここでは、対応するレダクターゼが、精製された形態で、また、微生物自体の形態でも使用される。EP−A−2 087 127には、NADP(H)の存在下でオキシドレダクターゼ/デヒドロゲナーゼを使用する、セコジオン誘導体のエナンチオ選択的酵素還元によるセコル誘導体の調製のためのプロセスが記載されている。

0003

ケトンおよびアルデヒドのNADP(H)依存性還元に加えて、NADP(H)依存性酵素、いわゆるエノアトレダクターゼもまた、エノアートのエナンチオ特異的還元に使用される。これにより、Kataokaと共同研究者らは、大腸菌由来のNADP(H)を生成するグルコースデヒドロゲナーゼとともにCandida macedoniensis由来のエノアートレダクターゼを使用することにより、ケトイソホロンが(6R)−レボジオン分取還元されることを報告した(Kataoka,Kotaka,Thiwthong,Wada,Nakamori,and Shimizu,J.Biotechnol.,2004,114,1−9)。

0004

例えば、還元に続いて、エポキシドへの環化が行われる結合系におけるNADP(H)依存性酵素の使用がさらに記載されている。したがって、対応するエナンチオマーを形成させるため、および続いて特定のエポキシドへの塩基誘導性の環化を行うための(R)−または(S)−選択的アルコールデヒドロゲナーゼの使用が記載されている(CA 2 612 407)。

0005

極めて徹底的に研究されたBacillus megaterium由来のモノオキシゲナーゼP450 BM3(CYP102A1)の場合にそうであるように(Appl.Microbiol.Biotechnol.(2012)95:357−367)、モノオキシゲナーゼが利用される場合には、NADP(H)の酵素的供給もまた必要である。この脂肪酸ヒドロキシラーゼは、アルカンアルケン、および芳香族炭化水素のような幅広基質酸化する。モノオキシゲナーゼはヒドロキシル化を触媒するが、NADP(H)の化学両論的供給が必要である。

0006

NADP(H)依存性酵素はまた、例えば、2−ケト酸の対応するD−アミノ酸への還元的アミノ化(WO−A−2006/113085)、または2−ケトピメラートからの6−アミノカプロン酸の還元的アミノ化(WO−A−2012/031911)のような、還元的アミノ化にも利用される。

0007

NADP(H)依存性酵素の最も多様な用途の概要は、例えば、Hollmann,Arendsa and Holtmann(Green Chemistry,2011,13,2285−2313)、または教本「Industrial Biotransformations」by Liese,Seelbach,and Wandrey(Wiley−VCH Verlag,2006,ISBN:3−527−31001−0)の中にも見ることができる。

0008

NADP(H)依存性酵素を利用しようとする具体的な反応にかかわらず、第一に、高い変換率および高い立体特異性を確実にする適切な酵素を提供することが必要条件である。この必要条件には次に、そのような酵素のスクリーニング続き、これは様々な方法で行うことができる。

0009

0010

遊離体生成物への所望される変換についての直接の試験は、これまで、好ましくは、96、384、またはさらには1,536のウェルを持つマイクロタイタープレートの中で行われてきた。これらのプレートは、96、384、または1,536の酵素の同時の試験を可能にする。所望される酵素反応の生成物が、クロマトグラフィー技術により直接決定され得る。この方法には、反応産物(これは例えば、アルコール、またはカルボニル化合物であり得る)の検出のための96、384、または1,536のウェルからの試料の取り出しと、クロマトグラフィーによる分離が必要である。言うまでもなく、そのような手順は複雑であり、時間がかかる。したがって、間接的な試験がしばしば使用される。したがって、NADP(H)は340nmを吸収するが、NADPは吸収しないという事実が利用される。消費されたNADP(H)の量は、原則としてこれにより決定することができる。あるいは、アルコールのカルボニルレダクターゼに触媒される酸化においては、NADPのNADP(H)への変換もまたこの方法で測定され得る。この反応や同等の反応においては、補因子NADPの還元が340nmでの吸光度の増大により決定される。還元された補因子の固有蛍光はまた、定量化にも使用することができる。これは、マイクロタイターリーダー装置において行われる。

0011

酵素による還元的アミノ基転移、およびまたケトンの還元の検出のためにNADP(H)消費を決定するための別の方法においては、HADP(H)消費に伴うpHの変化が変色指示薬により決定される(US 7,642,073)。変色指示薬の適切な選択により、色の変化の波長を決定することができ、これは次に、マイクロタイターリーダー装置において決定される。

0012

1536までのウェルを持つマイクロタイタープレート形式でのスクリーニングが、特異的な分析物結合特性を持つメンブレン液体の流れを介して行われる特別なマイクロタイタープレートシステムもまた記載されている(EP−A−1 628 768)。

0013

検出可能な基(例えば、蛍光団の)とのカップリングにより分析物さらに容易に検出できるようにする試みも行われている。このためには、反応が行われる前に分析物が蛍光基共有結合させられる。反応が行われ、分析物がこれに応じて反応させられると、蛍光基の蛍光が、例えば、基の分割により、または分析物の構造の変化により、変化するはずである。よって、蛍光の変化が分析物の変換の指標である。しかし、この欠点は、蛍光基が多くの場合に、分析物の反応性に影響を与える点である。WO−A−2007/131696には、調べようとする試料中に蛍光色素および大環状構造を提供し、そして少なくとも2つの時点で蛍光色素の蛍光特性を測定することにより、分析物の濃度を決定できることが記載されている。これにより、大環状構造は色素に結合し、そして分析物について調べようとする濃度範囲内で、これが大環状構造から蛍光色素に取って代わる

発明が解決しようとする課題

0014

改変された基質特異性を有している遺伝子ライブラリーから新規のNADP(H)消費酵素(NADP(H)−consuming enzymes)またはNADP(H)消費酵素を単離するための先行技術から既知であるin vitroスクリーニングの設定において、一般的な欠点は、可能な限り高スループットのスクリーニング、例えば、蛍光活性セルソーティングFACS)によるスクリーニングが可能ではない、マイクロタイタープレートシステムが使用されることである。

0015

さらに、新規のNADP(H)依存性酵素を単離するためのin vitroスクリーニングの設定においては、多くの場合に、細胞溶解物が新規の酵素の潜在的供給源として利用される。なぜなら、純粋な形態での単離が操作上困難であるからである。しかし、新規のNADP(H)依存性酵素について日常的に行われるスクリーニングにおけるそのような溶解物または調製物の問題は、反応バッチに典型的に不溶性材料またはNADP(H)と相互作用する他の酵素が含まれる点である。これは、高いブランク値に、または、340nmでの改変された非特異的吸光(これは、吸光度測定の精度および価値を低下させる)にもつながる。同じことが、不溶性材料により同様に困難になる補因子の蛍光測定にもあてはまる

課題を解決するための手段

0016

本発明は、新規のNADP(H)依存性酵素の単離と関連して先行技術から生じる欠点を克服するという目的に基づいていた。

0017

特に、本発明は、新規のNADP(H)依存性酵素を発現する可能性があるそのような細胞を、可能な限り最も簡単な様式で細胞懸濁物から高スループットスクリーニングにおいて(例えば、FACSにより)単離することを可能にするために使用することができるツールを提供するという目的に基づいていた。特に、これらの細胞の単離には、細胞の崩壊が含まれないはずであり、特に、特定の遊離体、生成物、または補因子の濃度の分析による決定も含まれない。

0018

本発明は、(例えば、プラスミドの形態の)可能性があるNADP(H)依存性酵素の遺伝子が細胞に導入された後に、この細胞により発現される遺伝子が、実際にNADP(H)依存性酵素をコードするかどうかを、特に容易に、そして特に、細胞を崩壊させる必要なく分析できる細胞を提供するという目的(objet)にさらに基づいていた。この様式で同定された細胞はさらに、多数の細胞から(例えば、細胞懸濁物から)高スループットスクリーニングにおいて(例えば、FACSにより)標的化された様式で可能である限りは、分離できるはずである。

0019

上記目的を達成するための貢献は、以下を含むNADP(H)ナノセンサーによってなされる:
i)レギュレーターが結合することができる核酸配列であって、ここでは、レギュレーターの酸化状態がNADP(H)の可用性に依存する、核酸配列;
ii)RNAポリメラーゼが結合することができる、核酸配列i)の後ろに続くプロモーター配列であって、ここでは、プロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性が、レギュレーターの酸化状態により影響を受ける、プロモーター配列;
iii)プロモーター配列ii)の制御下にあり、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列。

0020

驚くべきことに、本発明のNADP(H)ナノセンサーを使用して、細胞内NADPまたはNADP(H)濃度、したがって、間接的には、細胞内のNADP(H)依存性酵素の活性が、in vivoで特に容易に決定できることが明らかになった。本発明のNADP(H)ナノセンサーを含有している細胞が高いNADP(H)依存性酵素活性を特徴とする場合は、NADP濃度はこれに対応して高い(そしてこれに対応してNADP(H)濃度は低い)。細胞のこの還元状態に応じて、レギュレーターは、自己蛍光タンパク質の発現を制御するプロモーターに対するRNAポリメラーゼの親和性、または自己蛍光タンパク質をコードするmRNAの安定性に影響を及ぼすことができる。したがって、自己蛍光タンパク質の発現は、細胞の還元状態により制御され、また、光の放射のために自己蛍光タンパク質を励起させる電磁放射線照射により、簡単な様式でモニターすることができる。したがって、細胞による光の放射は、細胞の還元状態についての、そして結果として、NADP(H)依存性酵素の発現の程度についての指標である。

0021

本発明のNADP(H)ナノセンサーの好ましい実施形態によると、レギュレーターはSoxレギュレーター(SoxR)であり、プロモーター配列はsoxSプロモーター配列である。大腸菌K12由来のSoxRの遺伝子は、National Library of Medicine(Bethesda,MD,USA)のNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のデータベースに、寄託番号b4063,ECK4055で寄託されている。SoxRは2つの[2Fe−2S]クラスターを含み、これらは転写活性に不可欠である。各SoxRポリペプチドは1つの[2Fe−2S]クラスターを含み、これは、細胞の還元状態を検出する。Fe−SoxRとapo−SoxRはいずれもプロモーター領域に結合するが、Fe−SoxRだけが酸化された形態での正方向(towards)プロモーターの活性化に寄与する。鉄−硫黄クラスターの還元状態がSoxR活性を調節する。SoxRの標的遺伝子は隣接するsoxSであり、その配列は、National Library of Medicine(Bethesda,MD,USA)のNational Center for Biotechnology Information(NCBI)のデータベースに番号b4062,ECK4054で寄託されている。細胞の還元状態は、適切であれば、RsxまたはRseCのようなNADP(H)依存性レダクターゼにより促進され得る。

0022

これに関連して、構成要素i)およびii)については、大腸菌由来の遺伝子間領域により形成されることがさらに好ましく、これは、soxRとsoxSとの間に配置され、SoxR結合配列、SoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列、およびsoxSプロモーター配列の後ろに続く、mRNAのレベルリボソーム結合部位に対応する配列またはこれに相同である核酸配列を含む。この状況では、構成要素i)およびii)は、好ましくは、以下からなる群より選択される核酸配列により形成される:
a)配列番号1に記載の核酸配列、
b)a)の核酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも91%、さらにより好ましくは少なくとも92%、さらにより好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも94%、さらにより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、もっとも好ましくは少なくとも99%の同一性を有している核酸配列であって、soxSプロモーターに対するRNAポリメラーゼの親和性がSoxRの酸化状態に依存するようにSoxRに結合することができる核酸配列、および
c)a)またはb)の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、soxSプロモーターに対するRNAポリメラーゼの親和性がSoxRの酸化状態に依存するようにSoxRに結合することができる核酸配列。

0023

本発明のNADP(H)ナノセンサーのこの特に好ましい実施形態の第1のバリエーションに従うと、これは、以下を含む:
(α1)SoxRの大腸菌遺伝子(soxR)またはこれに相同である核酸配列;
(α2)構成要素i)およびii)としての、上記で定義したような、(α1)の後ろに続く、soxRとsoxSとの間に配置されており、SoxR結合配列、SoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してmRNAのレベルで対応する、soxSプロモーター配列の後ろに続く配列を含む、大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列;
(α3)適切である場合には、(α2)の後ろに続く、大腸菌由来のsoxS遺伝子の部分配列またはこれに相同である核酸配列;
(α4)構成要素iii)としての、(α2)または(α3)、好ましくは(α3)の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、soxSプロモーター配列の制御下にある核酸配列。

0024

上記およびまた以下でも使用される文言「配列a)の後ろに続く配列b)」は、本発明によれば、配列b)が必ずしも配列a)に直接結合されている必要はなく、配列a)と配列b)との間に中間配列が配置され得ることを意味していると理解されるものとする。

0025

この特定の実施形態によると、NADP(H)ナノセンサーは、構成要素(α1)として、soxRの大腸菌遺伝子(soxR)またはこれに相同である核酸配列を含み、構成要素(α1)は、好ましくは、以下からなる群より選択される:
a)配列番号2に記載の核酸配列、
b)配列番号3に記載のアミノ酸配列を持つポリペプチドをコードする核酸配列、
c)a)またはb)の核酸配列に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも91%、さらにより好ましくは少なくとも92%、さらにより好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも94%、さらにより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、もっとも好ましくは少なくとも99%の同一性を有している核酸配列であって、soxRとsoxSとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のSoxR結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、
d)配列番号3に対して少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、さらにより好ましくは少なくとも85%、さらにより好ましくは少なくとも90%、さらにより好ましくは少なくとも91%、さらにより好ましくは少なくとも92%、さらにより好ましくは少なくとも93%、さらにより好ましくは少なくとも94%、さらにより好ましくは少なくとも95%、さらにより好ましくは少なくとも96%、さらにより好ましくは少なくとも97%、さらにより好ましくは少なくとも98%、もっとも好ましくは少なくとも99%の相同性を有しているポリペプチドをコードする核酸配列であって、soxRとsoxSとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のSoxR結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列、および
e)群a)〜d)のうちの1つに記載の相補性核酸配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列であって、soxRとsoxSとの間に配置されており、その酸化状態が大腸菌由来の遺伝子間領域の中に同様に配置されたプロモーター配列に対するRNAポリメラーゼの親和性に影響を及ぼし得る、大腸菌由来の遺伝子間領域中のSoxR結合配列に結合することができるポリペプチドをコードする核酸配列。

0026

表現「相同性」(または「同一性」)は、本明細書中で使用される場合は、方程式H(%)=[1−V/X]×100(式中、Hは相同性を示し、Xは比較配列ヌクレオ塩基/アミノ酸の総数であり、Vは、比較配列に関して、検討する配列の異なるヌクレオ塩基/アミノ酸の数である)により定義され得る。全ての場合において、ポリペプチドをコードする核酸配列という文言には、遺伝子コード縮重の条件にしたがい可能であるとみられる全ての配列が含まれる。

0027

核酸配列の同一性は、配列比較プログラムBLAST,Altschulら、J.Mol.Biol.1990,215,403−410)を使用して同定することができる。2つのアミノ酸配列間でのパーセント相同性が、同様に、先行技術から既知である方法を使用して当業者により容易に決定され得る。本発明にしたがって利用され得る適切なプログラムは、BLASTp(Altschulら、1997;「Gapped BLAST and PSI−BLAST:a new generation of protein database search programs」;Nucleic AcidsRes.25(17):3389−3402)である。

0028

当業者は、ハイブリダイゼーションのための説明を、特に、Boehringer Mannheim GmbH(Mannheim,Germany,1993)のハンドブック「The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization」の中、およびLieblら(International Journal of Systematic Bacteriology 41:255−260(1991))の中に見出だすことができる。ハイブリダイゼーションはストリンジェントな条件下で起こり、つまり、プローブ(例えば、soxRもしくはsoxSまたは大腸菌由来のsoxRSの遺伝子間領域に相補的であるヌクレオチド配列)と標的配列(すなわち、プローブで処理されたポリヌクレオチド)とが少なくとも70%同一であるハイブリッドにおいてのみ起こる。洗浄工程を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシー緩衝液組成、温度、および塩濃度を変えることにより影響を受ける、または決定されることが知られている。ハイブリダイゼーション反応は、一般に洗浄工程と比べて比較的低いストリンジェンシーで行われる(Hybaid Hybridisation Guide,Hybaid Limited,Teddington,UK,1996)。ハイブリダイゼーション反応のためには、例えば、5×SSC緩衝液に対応している緩衝液が、およそ50℃〜68℃の温度で利用され得る。この状況では、プローブは、プローブの配列に対して70%未満の同一性しか有していないポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができる。このようなハイブリッドは安定性が低く、ストリンジェントな条件下での洗浄により除去される。これは例えば、塩濃度を2×SSCに下げること、および適切であれば、続いて0.5×SSCに下げることにより達成され得(The DIG System User’s Guide for Filter Hybridization,Boehringer Mannheim,Mannheim,Germany,1995)、およそ50℃〜68℃、およそ52℃〜68℃、およそ54℃〜68℃、およそ56℃〜68℃、およそ58℃〜68℃、およそ60℃〜68℃、およそ62℃〜68℃、およそ64℃〜68℃、およそ66℃〜68℃の温度が確立される。好ましくは、洗浄工程は、およそ62℃〜68℃の温度、好ましくは64℃〜68℃またはおよそ66℃〜68℃の温度、特に好ましくはおよそ66℃〜68℃の温度で行われる。適切であれば、塩濃度を0.2×SSCまたは0.1×SSCに相当する濃度に下げることが可能である。50℃から68℃までおよそ1〜2℃ずつ段階的にハイブリダイゼーション温度を上昇させることにより、例えば、利用されるプローブの配列に対して少なくとも70%、または少なくとも80%、または少なくとも90%〜95%、または少なくとも96%〜98%、または少なくとも99%の同一性を有している、soxRもしくはsoxSまたはsoxRSの遺伝子間領域をコードするポリヌクレオチド断片が単離され得る。ハイブリダイゼーションについてのさらなる説明は、いわゆるキットの形態で市場において入手可能である(例えば、Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany,カタログ番号1603558のDIG Easy Hyb)。

0029

この特定の実施形態にしたがうNADP(H)ナノセンサーには、構成要素(α4)として、構成要素iii)としての、自己蛍光タンパク質をコードし、(α2)または(α3)(好ましくは標的遺伝子soxS(α3)、特に、標的遺伝子soxSの最初の5〜200ヌクレオチド)の後ろに続く、soxSプロモーター配列の制御下にある核酸配列が含まれる。

0030

本発明によれば、自己蛍光タンパク質をコードする構成要素iii)による遺伝子配列は、プロモーター配列ii)の制御下にある(本発明のNADP(H)ナノセンサーの特定の実施形態についての上記第1のバリエーションによると、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列(α4)はsoxSプロモーター配列の制御下にある)。文言「プロモーター配列の制御下にある」は、この状況では、好ましくは、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーターに対して機能的であるように連結されていることを意味すると理解される。プロモーターと自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とは、これらの2つの配列と、任意のさらなる調節エレメント(例えば、ターミネーターまたはリボソーム結合部位等)が、調節エレメントのそれぞれが核酸配列のトランスジェニック発現においてその機能を果たし得るように連続して配置されている場合は、機能的に連結されている。これについて、化学的な意味における直接の連結は不可欠であるとは限らない。例えば、エンハンサー配列のような遺伝子制御配列はまた、さらに取り除かれた位置により、さらには他のDNA分子から、標的配列に対するそれらの機能を発揮することができる。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列がプロモーター配列の後ろ(すなわち、3’末端)に位置しており、その結果、これらの2つの配列が互いに共有結合されている配置が好ましい。好ましくは、この状況では、自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーター配列との間の距離は、200塩基対未満、特に好ましくは100塩基対未満、極めて特に好ましくは50塩基対未満である。自己蛍光タンパク質をコードする遺伝子配列とプロモーターとについては、これらの2つの遺伝子配列の間に相同遺伝子(すなわち、野生型細胞中でのその発現がプロモーターにより調節される遺伝子)の部分配列がなおも存在するように、互いに機能的に連結されることも可能である(したがって上記NADP(H)ナノセンサーの特定の実施形態によれば、構成要素(α3)によるsoxS遺伝子の一部が、soxSプロモーター配列と自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列(α4)との間に存在し得る)。そのようなDNA構築物の発現においては、融合タンパク質は、自己蛍光タンパク質と、相同遺伝子の対応する部分配列によりコードされるアミノ酸配列とから得られる(=翻訳融合)。相同遺伝子のそのような部分配列の長さは、自己蛍光タンパク質の機能的能力、すなわち、特定の波長の光で励起させられた場合にその蛍光性の特性が著しく損なわれない限りは、重要ではない。上記本発明のNADP(H)ナノセンサーの特定の実施形態の場合は、soxS部分配列(α3)は、好ましくは、soxS遺伝子の少なくとも最初の5ヌクレオチド、なおさらに好ましくは、少なくとも最初の10ヌクレオチド、そしてなおより好ましくは、少なくとも最初の20ヌクレオチド、しかし好ましくは最大で最初の200ヌクレオチド、なおより好ましくは、最大で最初の150ヌクレオチド、なおより好ましくは、最大で最初の100ヌクレオチドを含む。

0031

自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列(iii)(または(α4)および(β4))は、好ましくは、Aequora属の蛍光タンパク質をコードする蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)および様々な波長の範囲で蛍光を発するその変異体(例えば、黄色蛍光タンパク質(YFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP))、あるいは、その蛍光が強化されたもの(例えば、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)、高感度黄色蛍光タンパク質(EYFP)、高感度青色蛍光タンパク質(EBFP)、または高感度シアン蛍光タンパク質(ECFP))をコードする、蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。他の自己蛍光タンパク質(例えば、BD Biosciences,Franklin Lakes,USAから既知であるような、DsRed、HcRed、AsRed、AmCyan、ZsGreen、AcGFP、ZsYellow)をコードする遺伝子配列もまたさらに、本発明に従って使用され得る。いわゆるLOVドメインを含む光受容体タンパク質が同様に使用され得る。この状況において特に好ましい自己蛍光タンパク質はEYFPである。

0032

本発明のNADP(H)ナノセンサーの特に好ましい実施形態の第2のバリエーションによれば、これは以下を含む:
β1)SoxRの大腸菌遺伝子(soxR)またはこれに相同である核酸配列;
β2)構成要素i)およびii)としての、上記で定義したような、(β1)の後ろに続く、soxRとsoxSとの間に配置されており、SoxR結合配列、SoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列、およびリボソーム結合部位に対してmRNAのレベルで対応する、soxSプロモーター配列の後ろに続く配列を含む、大腸菌由来の遺伝子間領域、あるいは、これに相同である核酸配列;
(β3)(β2)の後ろに続く、soxSプロモーター配列の制御下にある、大腸菌由来のsoxS遺伝子の配列、この遺伝子の部分配列、またはこれに相同である核酸配列;
(β3’)mRNAレベルでリボソーム結合部位に対応する、(β3)の後ろに続くさらなる配列;
(β4)構成要素iii)としての、(β3’)の後ろに続く、自己蛍光タンパク質をコードし、soxSプロモーター配列の制御下にある核酸配列。

0033

好ましい構成要素(β1)、(β2)、(β3)、および(β4)は、本発明のNADP(H)ナノセンサーの特に好ましい実施形態の第1のバリエーションに関連して好ましい構成要素(α1)、(α2)、(α3)、および(α4)として上記ですでに述べたそのような構成要素である。そのようなDNA構築物の発現の間に、SoxSまたはこのタンパク質の断片と、これとは別に自己蛍光タンパク質が形成される(=転写融合)。

0034

上記目的を達成するための貢献はまた、本発明のNADP(H)ナノセンサーを含有している細胞によってもなされる。この状況では、本発明のNADP(H)ナノセンサーは、エピソームの形態または染色体の形態で細胞中に存在し得る。

0035

具体的に記述することができる適切な細胞の例は、大腸菌(Escherichia coli)、Pseudomonas fluorescens、Corynebacterium glutamicum、Bacillus subtilis、もしくは別のEubacteriumであり、また、Saccharomyces cerevisiaeもしくは別の酵母でもある。

0036

本発明の細胞は、特定の遺伝子配列がNADP(H)依存性酵素をコードするかどうかを立証するために適している。このためには、可能性があるNADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子が細胞に導入され、発現させられる。上記のように、細胞による光の放射が細胞の還元状態についての、そして結果としてNADP(H)依存性酵素の発現の程度についての指標である。

0037

この状況では、本発明によれば、「NADP(H)依存性酵素」は、基質のこの基質とは化学的に異なる反応産物への変換の少なくとも一部の工程に関与する任意の酵素を意味すると理解され、NADP(H)は、この変換の少なくとも1つの部分的な工程において補因子として関与する。

0038

したがって、本発明の細胞の好ましい実施形態によると、これには本発明のNADP(H)ナノセンサーに加えてさらに、NADP(H)依存性酵素をコードする変異させられていてもよい遺伝子を持つプラスミドが含まれる。この状況におけるNADP(H)依存性酵素は、好ましくは、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼラクテートデヒドロゲナーゼ、エノアートレダクターゼ、エポキシドレダクターゼ、ジアミノピメラートデヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、アルデヒドオキシドレダクターゼ、アルカンレダクターゼ、アミンレダクターゼ、エポキシドデヒドロゲナーゼ、カルボン酸デヒドロゲナーゼ、ヒドロキシ酸ケトレダクターゼ、およびヒドロキシ酸デハロゲナーゼからなる群より選択される。

0039

上記目的を達成するための貢献はまた、自己蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含有している組換え細胞によってもなされる。ここでは、細胞内での自己蛍光タンパク質の発現の程度は、細胞内NADP(H)の可用性に依存する。これに関連して、特に好ましい細胞は上記細胞であり、特に、本発明のNADP(H)センサーを含有している細胞である。

0040

上記目的を達成するための貢献はまた、以下の方法工程を含む、NADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離するための方法によってもなされる:
(I)本発明に従うNADP(H)ナノセンサーを提供する工程;
(II)細胞内にNADP(H)ナノセンサーを導入する工程;
(III)方法工程(II)で得られた細胞の細胞懸濁物の個々の細胞内にNADP(H)依存性酵素をコードし得る遺伝子を導入する工程;
(IV)細胞をNADP(H)依存性酵素の基質とともにインキュベートする工程;
(V)細胞内蛍光活性の検出により、NADP(H)依存性酵素の増大した活性を持つ細胞懸濁物中の個々の細胞を同定する工程;
(VI)細胞懸濁物から同定した細胞を分離する工程;
(VII)同定した細胞中のNADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を単離する工程。

0041

増大したかまたは改変された基質認識を持つ新規のNADP(H)依存性酵素および変異型のNADP(H)依存性酵素がこの方法を用いて単離され得る。

0042

NADP(H)センサーとしておよび細胞として好ましいセンサーおよび細胞は、本発明のセンサーまたは本発明の細胞に関連して好ましいセンサーまたは細胞として上記にすでに記載されたものである。

0043

方法工程(I)および(II)において、まず本発明の細胞が、本発明のNADP(H)ナノセンサーを細胞内に導入することにより調製され、この導入については、エピソームまたは染色体の形態で行われることが可能である。

0044

本発明の方法の方法工程(III)においては、次に、NADP(H)依存性酵素をコードし得る遺伝子が方法工程(II)で得られた細胞の細胞懸濁物の個々の細胞内に導入され、特に、遺伝子が、変異型のプラスミドにコードされるNADP(H)依存性酵素の遺伝子であることが可能である。多様性を増大させるためにプラスミドによりコードされるNADP(H)依存性酵素の遺伝子に部位非特異的突然変異を導入するためには、in vitro突然変異誘発が、好ましくは、変異性ポリメラーゼ連鎖反応PCR)および増幅技術を用いて行われる。この状況では、変異させようとする遺伝子について、反応の条件に応じて、合成された遺伝子に不正確に個々の塩基を取り込むポリメラーゼを使用してPCRが行われる(Tindall,K.R.and T.A.Kunkel:「Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase」;Biochemistry,1988,27(16),6008−13頁)。この方法のよく用いられるバリエーションには、マンガン(II)イオンまたはヌクレオチドアナログのPCRバッチの中での使用が含まれる(Cadwell R.Cら(1992);PCR MethodsAppl.(2),28−33頁/Leung D.W.ら(1989)Techniques(1),11−15頁)。突然変異を導入するためのこれらの技術は、「変異性PCR(epPCR)」と呼ばれる(Labrou NE:「Random mutagenesis methods for in vitro directed enzyme evolution」;Curr.Protein.Pept.Sci.2010(11),91−100頁)。突然変異は、例えば、点突然変異であり得、そして例えば、置換欠失、または挿入がポリメラーゼにより作製され得る。突然変異率は、1kbあたり1〜40の突然変異の間であり、好ましくは、1kbあたり1〜5の突然変異である。しかし、突然変異は、Stratagene QuikChange Kit(La Jolla,California,USA)を使用して、または飽和状態において任意の存在しているヌクレオチドを任意の可能なヌクレオチドに移動させるSeSamと呼ばれる方法(EP 1 670 914 B1)を使用して、飽和突然変異誘発を用いて生じさせることもできる。

0045

ナノセンサーを保有している宿主を用いて高スループットでその活性を分析することができる、可能性があるNADP(H)依存性酵素は、例えば、以下である:1,2−デヒドロレチクリンレダクターゼ(1.5.1.27)、2−エノイル−CoAレダクターゼ(1.3.1.10)、2−エノイルCoAレダクターゼ(1.3.1.39)、アルケナール/アルケノンオキシドレダクターゼ(1.3.1.74)、チトクロームP450レダクターゼ(1.6.2.4)、NADP(H)デヒドロゲナーゼ(1.6.99.1)、NADP(H)デヒドロゲナーゼ(フラビン)(1.6.8.2)、NADP(H)デヒドロゲナーゼ(キノン)(1.6.5.10)、NADP(H)依存性1,5−アンヒドロ−D−フルクトースレダクターゼ(1.1.1.263)、NADP(H)依存性チトクロームP450レダクターゼ(1.6.2.4)、ジアホラーゼ(1.6.99.1)、DT−ジアホラーゼ(1.6.5.5)、フェレドキシンレダクターゼ(1.18.1.2)、NADP(H)オキシダーゼ(1.6.3.1、1.6.5.10、1.6.3.1、1.6.3.1、1.6.3.1)、P450オキシドレダクターゼ(1.6.2.4)、P450レダクターゼ(1.6.2.4)、ペルオキシダーゼ(1.11.1.2)、キノンアクセプターオキシドレダクターゼ(1.6.5.5)、キノンオキシドレダクターゼ(1.6.5.10)、NADP(H)特異的FMNレダクターゼ(1.5.1.38)、チオレドキシンレダクターゼ(1.8.1.9)、トランスヒドロゲナーゼ(1.6.1.2)、NADP(H)−アルデヒドレダクターゼ(1.1.1.2)、アルドペントースレダクターゼ(1.1.1.21)、NADP(H)−アルドースレダクターゼ(1.1.1.21)、NADP(H)−カルボニルレダクターゼ(1.1.1.184)、NADP(H)−CYPレダクターゼ(1.6.2.4)、NADP(H)−チトクロームcオキシドレダクターゼ(1.6.2.4)、NADP(H)−チトクロームcレダクターゼ(1.1.1.2)、NADP(H)−チトクロームfレダクターゼ(1.6.2.5)、NADP(H)−チトクロームP450レダクターゼ(1.6.2.4)、およびNADP(H)−チトクロームP450レダクターゼ(1.14.13.68)。

0046

その後、NADP(H)依存性酵素の遺伝子の中に突然変異を含むプラスミドが、例えば、大腸菌またはC.glutamicumのような微生物に形質転換により導入される。この状況では、用語「形質転換」には、所望される細菌にポリヌクレオチド、具体的には、DNAを移動させるための全ての方法が含まれる。これらには、とりわけ、形質転換、電気的形質転換すなわちエレクトロポレーションにおける単離されたDNAの使用、接合においてそうであるような細胞の接触による移動、またはパーティクルボンバードメントによるDNAの移動が含まれる。

0047

処理工程(III)において、NADP(H)依存性酵素をコードしていてもよい遺伝子が、方法(II)で得られた細胞由来の細胞懸濁物の個々の細胞に導入され(そして発現させられ)た後、次に、細胞が、方法工程(IV)においてNADP(H)依存性酵素の基質とともにインキュベートされ、次に、方法工程(V)において、NADP(H)依存性酵素の増大した活性を持つ細胞懸濁物中の個々の細胞が、細胞内蛍光活性の検出により同定される。このためには、細胞懸濁物が、光の放射のためにNADP(H)ナノセンサーの自己蛍光タンパク質を励起させるその周波数の電磁放射線に暴露される。

0048

0049

その後、方法工程(VII)において、同定された細胞中のNADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子が単離され、適切であれば、例えば、分離された細胞から酵素を保有しているプラスミドを単離すること、配列決定により、改変された蛍光をもたらすそれらの突然変異を同定し、そして確認することにより、分析される。

0050

上記目的を達成するための貢献はまた、in vivoでNADP(H)依存性酵素をコードする遺伝子を同定するための本発明のNADP(H)ナノセンサーの使用によってもなされる。

0051

次に本発明を、図面と非限定的である実施例を用いて、さらに詳細に説明する。

図面の簡単な説明

0052

図1は、上記の特に好ましい実施形態の例により本発明のNADP(H)ナノセンサーの機能の様式を示す。
図2は、本発明のNADP(H)ナノセンサー(pSensox)を用いて実施例3において調製した大腸菌BL21(DE3)細胞の特異的蛍光、および発現されたアルコールデヒドロゲナーゼ(Lbadh)(黒色四角)を示す。不活性なアルコールデヒドロゲナーゼを持つナノセンサーpSennegKの蛍光を対照として示す(白色の四角)。
図3は、転写融合(上)および翻訳融合(下)としての自己蛍光タンパク質の形成の模式図を示す。

0053

図1によると、NADP(H)ナノセンサーは、SoxRの大腸菌遺伝子(soxR)、これの後ろに続く、大腸菌由来の遺伝子間領域(これは、soxRとsoxSとの間に配置されており、soxR結合配列およびsoxR結合配列の後ろに続くsoxSプロモーター配列を含む)、この後ろに続く、大腸菌由来のsoxS遺伝子の部分配列(soxS’)、およびこの後ろに続く、soxSプロモーター配列の制御下にある、自己蛍光タンパク質(AFP)をコードする核酸配列を含み得る。高い細胞質ゾルNADP(H)濃度(図1の左上)では、[2Fe−2S]クラスター(菱形)がプロモーターに結合したSoxRにより還元された形態で存在する。低いNADP(H)可用性(図1の右上)では、[2Fe−2S]クラスターが酸化され、これによる生じるsoxSプロモーター領域の変形が、RNAポリメラーゼについての可能性がある標的遺伝子の転写を開始させる。本発明によると、本来の標的遺伝子soxSは自己蛍光タンパク質(AFP)と融合させられる。NADP(H)依存性酵素は、NADP(H)の消費によるsoxS’−AFPの増大した発現と、したがって、増大したNADP(H)消費の結果としての細胞の増大した蛍光を生じる。

0054

図3は上に転写融合を、そして下に翻訳融合を示す。いずれの場合にも、転写物はプロモーターP1(例えば、SoxRにより制御されるsoxSプロモーター)により形成される。転写融合の間には、2つの別のペプチドが、第2のリボソーム結合部位(RBS)が原因で形成されるが、翻訳融合の間には、自己蛍光タンパク質がさらなるアミノ酸配列を含む、融合タンパク質である1つのペプチドが形成される。

0055

実施例1
NADPHナノセンサーの構築(転写融合)
SoxS_for_SphI(配列番号4)とSoxR_rev_SalI(配列番号5)のプライマー対、および鋳型としての大腸菌DH5α由来の染色体DNAを用いて、遺伝子soxRを、soxR−soxSの遺伝子間領域およびsoxSの最初の63ヌクレオチドとともに増幅させた。

SoxS_for_SphI:
ATCTGCATGCTTACGGCTGGTCAATATGCTCGTC
SoxR_rev_SalI:
GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG

0056

EYFP_for_SphI(配列番号6)およびEYFP_rev_ClaI(配列番号7)のプライマー対と、鋳型としてのベクターpSenLysを用いて、遺伝子eyfpをリボソーム結合部位とともに増幅させた。ベクターpSenLysは特許出願WO−A−2011/138006に記載されている。

EYFP_for_SphI:
AGAGGCATGCAAGGAGAATTACATGGTGAGCAAGGGCGAGG
EYFP_rev_ClaI:
GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG

0057

0058

pSennegKを、改変したアルコールデヒドロゲナーゼLbadhを用いて誘導体として作製した。このために、プライマーADH_negK_for(配列番号9)およびADH_negK_rev(配列番号10)と、そして鋳型として再びpBtacLbadhを用いて、不活性なLbadhを、221bpが欠失したアルコールデヒドロゲナーゼを用いて増幅させた。得られた断片を、リボソーム結合部位とともに遺伝子eyfpを含有している約5.7kbの大きさのベクター断片と連結させた。得られたベクターの配列を配列番号11として寄託する。

ADH_negK_for:
ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC
ADH_negK_rev:
GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG

0059

pSen−L194Sを、改変したアルコールデヒドロゲナーゼLbadhを用いてさらなる誘導体として作製した。このために、プライマーL194S_for(配列番号12)およびL194S_rev(配列番号13)を用いて、pSenSoxを、突然変異の標的化された挿入のための鋳型として増幅した。作製したプラスミドを配列決定により確認した。得られたベクターの配列を配列番号14として寄託する。

L194S_for:
CTGGCTACATCAAGACACCATCTGTTGATG
L194S_rev:
CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACAGATGGTG

0060

pSen−L194Aを、改変したアルコールデヒドロゲナーゼLbadhを用いてさらなる誘導体として作製した。このために、プライマーL194A_for(配列番号15)およびL194A_rev(配列番号16)を用いて、pSenSoxを突然変異の標的化された挿入のための鋳型として増幅した。作製したプラスミドを配列決定により確認した。得られたベクターの配列を配列番号17として寄託する。

L194A_for:
CTGGCTACATCAAGACACCAGCGGTTGATG
L194A_rev:
CGGCCCCTGGTAGGTCATCAACCGCTGGTG

0061

0062

その後、細胞懸濁物の0.9mlの部分を、BioLector培養システム(m2plabs GmbH,Aachen,Germany)のFlowerplateマイクロタイタープレート(48ウェル)の反応容器に入れた。メチルアセトアセテート(MAA)を、0.1mlの定容量において、この細胞懸濁物に対して漸増濃度で添加した。その後、Flowerplateマイクロタイタープレートを、30℃、1,200rpm、振盪半径3mmでインキュベートした。BioLector培養システムにおいて、増殖を620nmでの散乱光としてオンラインで記録し、培養物の蛍光を485nmの励起波長および520nmの発光波長で連続的に記録した。10時間後の特異的な蛍光を、添加したMAAの量に対してプロットし、図2に示す(0〜70mMのメチルアセトアセテートを個々のバッチに添加し、10時間後に特異的な蛍光を決定し、これを黒色の四角として示している;不活性なLbadhを持つ大腸菌BL21(DE3)pSennegKを陰性対照とした(白色の四角))。図2は、MAA濃度の増大に伴う蛍光の増大を示す。この増大はpSenSoxに起因する。なぜなら、不活性なアルコールデヒドロゲナーゼを持つ(が、それ以外はpSenSoxと同一である)プラスミドpSennegKを用いた対照反応が蛍光の増大を生じないからである。

0063

0064

次に、実施例2に記載したように、細胞の0.9mlの部分をそれぞれ、BioLector培養システム(m2plabs GmbH,Aachen,Germany)のFlowerplateマイクロタイタープレート(48ウェル)の反応容器に導入した。いずれの場合にも、0.1 ml中において、メチルアセトアセテート(MAA)を、40mMの最終濃度になるように細胞懸濁物に対して添加した。その後、Flowerplateマイクロタイタープレートを、30℃、1,200rpm、振盪半径3mmでインキュベートし、特異的な蛍光を決定した。19時間後に得られた特異的蛍光を表1に示す。

0065

加えて、組換え大腸菌細胞のアルコールデヒドロゲナーゼ活性を個々のバッチにおいて決定した。このために、細胞を、10,000×g、4℃、5分で回収し、100mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5、1mMのジチオトレイトール、1mMのMgCl2中に入れた。細胞を0.1mmの直径のガラスビーズを用いてSilamat S5(Ivoclar Vivadent GmbH,Germany)によって崩壊させた。16,000×g、4℃、20分の遠心分離後に得られた粗抽出物をアルコールデヒドロゲナーゼ活性の定量化のための酵素試験に利用した。この試験には、100mMのリン酸カリウム緩衝液、pH6.5中の5mMのメチルアセトアセテート、0.25mMのNADPH、および1mMのMgCl2、ならびに0.01〜0.1mlの粗抽出物を含めた。NADP(H)の還元を340nmおよび30℃でモニターした。酵素単位(U)は、1分あたり0.001mmolのNADP(H)を還元する粗抽出物の量として記載する。これを同様に表1に提供する。

0066

実施例4
改変された基質認識を持つ変異型アルコールデヒドロゲナーゼの単離
Lactococcus lactis由来のアルコールデヒドロゲナーゼLbadhは、メチルアセトアセテートを用いる場合には高い活性を有するが、基質として4−メチル2−ペンタノンを用いる場合には約10%の低い活性しか有しない。より高い活性を持つLbadhを進化させるために、無作為な突然変異を変異性PCR(epPCR)によりpSenSoxに挿入した。突然変異を挿入するために、反応あたり10ngのpSenSoxを鋳型として、ならびに0.1〜0.8mMのMn2+を利用し、<0.2mM未満のMn2+の低濃度では、少なくとも0.2mMの全濃度をMg2+を用いて確立した。反応あたり、Fermentas(カタログ番号EP0401)による0.5μlのTaqポリメラーゼを添加した。ポリヌクレオチド:

配列番号18:
ACAAGAATTCGCTAAGAGTGTCGGCACTCC
配列番号19:
GGCCAAGCTTCCGAAGAAGACACCATCAAG
をプライマーとして使用した。反応を30分間インキュベートした。その後、反応産物をBamHIおよびSalIで処理し、あらかじめ同様に処理したベクターpSenSoxと連結させた。

0067

大腸菌DH5αmcrを連結産物で形質転換した(Grant,1990,Proceedings of the National Academy of Sciences,USA,87,4645−4649頁)。30時間のインキュベーションの後、形質転換体を10mlの2×YTを用いてプレートから洗い落とし、新鮮な2×YT培地中に10倍希釈した。37℃で4時間のインキュベーション後、20mMの4−メチル−2−ペンタノンを基質として添加し、3時間のさらなるインキュベーション後、バッチをFACS分析と選別に送った。

0068

高い蛍光を持つ細胞のFACS分析および選別のために、2×YT培地中の細胞懸濁物を0.1未満の光学密度に調整し、FACS ARIAII高速セルソーター(Becton Dickinson GmbH,Tullastr.8−12,69126 Heidelberg)にすぐに送った。分析は、70psiの試料圧力下で、488および633nmの励起波長を用いる分析、ならびに530±15nmおよび660±10nmの発光波長での検出を行った。データを、装置に付属しているソフトウェアバージョンBD DIVA 6.1.3で分析した。BD FACSflowをシース液として使用した。非細菌粒子を排除するために、前方散乱および後方散乱を用いて電子ゲート(electronic gating)を設定した。EYFP陽性細胞を選別するために、非蛍光細胞を排除するための次のレベルの電子ゲートを選択した。この様式で、2×YT培地を含むペトリ皿上で123個の蛍光細胞を選別した。

0069

BioLector培養システム(m2plabs GmbH,Aachen,Germany)のFlowerplateマイクロタイタープレート(48ウェル)の反応容器に、実施例2に記載したように、37℃で30時間のインキュベーション後に得られたコロニー接種した。しかし、メチルアセトアセテートではなく、20mMの4−メチル−2−ペンタノンを基質として使用した。120分後、特異的蛍光を定量化し、クローンを選択した。そのアルコールデヒドロゲナーゼ活性を、実施例3に記載したように酵素試験において決定した。ここでは、20mMの4−メチル−2−ペンタノンを基質として使用した。

0070

この方法で得られたプラスミドpSen−A93Mを持つ突然変異体は、出発株と比較して26%増大した特異的活性を有しており(表2)、基質として4−メチル−2−ペンタノンを用いた場合の変換率は37%増大した。プラスミドpSen−A93Mの配列を配列番号20として寄託する。

0071

0072

0073

実施例5
NADPHナノセンサーの構築(翻訳融合)
プライマー対SoxS_for_SphI_tl(配列番号21)およびSoxR_rev_SalI_tl(配列番号22)と、鋳型としての大腸菌DH5α由来の染色体DNAを用いて、遺伝子soxRを、soxR−soxSの遺伝子間領域およびsoxSの最初の63ヌクレオチドとともに増幅させた。

SoxS_for_SphI_tl:
ATCTGCATGCCGGCTGGTCAATATGCTCGTC
SoxR_rev_SalI_tl:
GCTAGTCGACCAAACTAAAGCGCCCTTGTG

0074

プライマー対EYFP_for_SphI_tl(配列番号23)およびEYFP_rev_ClaI_tl(配列番号24)と、鋳型としてのベクターpSenLysを用いて、遺伝子eyfpを増幅させた。ベクターpSenLysは、特許出願WO−A−2011/138006に記載されている。

EYFP_for_SphI_tl:
AGAGGCATGCGTGAGCAAGGGCGAGG
EYFP_rev_ClaI_tl:
GCGCATCGATTTATTACTTGTACAGCTCGTCCATG

実施例

0075

配列表
Sequences

Seq. Id. No. 01
aaatctgcct cttttcagtg ttcagttcgt taattcatct gttggggagt ataattcctc 60
aagttaactt gaggtaaagc gattt 85

Seq. ID. No. 02
atggaaaaga aattaccccg cattaaagcg ctgctaaccc ccggcgaagt ggcgaaacgc 60
agcggtgtgg cggtatcggc gctgcatttc tatgaaagta aagggttgat taccagtatc 120
cgtaacagcg gcaatcagcg gcgatataaa cgtgatgtgt tgcgatatgt tgcaattatc 180
aaaattgctc agcgtattgg cattccgctg gcgaccattg gtgaagcgtt tggcgtgttg 240
cccgaagggc atacgttaag tgcgaaagag tggaaacagc tttcgtccca atggcgagaa 300
gagttggatc ggcgcattca taccttagtg gcgctgcgtg acgaactgga cggatgtatt 360
ggttgtggct gcctttcgcg cagtgattgc ccgttgcgta acccgggcga ccgcttagga 420
gaagaaggta ccggcgcacg cttgctggaa gatgaacaaa actaa 465

Seq. Id. No. 03
MEKKLPRIKALLTPGEVAKR SGVAVSALHF YESKGLITSI RNSGNQRRYK RDVLRYVAII 60
KIAQRIGIPLATIGEAFGVL PEGHTLSAKEWKQLSSQWRE ELDRRIHTLV ALRDELDGCI 120
GCGCLSRSDC PLRNPGDRLGEEGTGARLLEDEQN 154

Seq. Id. No. 04
atctgcatgc ttacggctgg tcaatatgct cgtc 34

Seq. Id. No. 05
gctagtcgac caaactaaag cgcccttgtg 30

Seq. Id. No. 06
agaggcatgc aaggagaatt acatggtgag caagggcgag g 41

Seq. Id. No. 07
gcgcatcgat ttattacttg tacagctcgt ccatg 35

Seq. Id. No. 08
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta 600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420
cacacaggaa acagaa 6436

Seq. Id. No. 09
acaagaattc gctaagagtg tcggcactcc 30

Seq. Id. No. 10
ggccaagctt ccgaagaaga caccatcaag 30

Seq. Id. No. 11
agcttctgtt ttggcggatg agagaagatt ttcagcctga tacagattaa atcagaacgc 60
agaagcggtc tgataaaaca gaatttgcct ggcggcagta gcgcggtggt cccacctgac 120
cccatgccga actcagaagt gaaacgccgt agcgccgatg gtagtgtggg gtctccccat 180
gcgagagtag ggaactgcca ggcatcaaat aaaacgaaag gctcagtcga aagactgggc 240
ctttcgtttt atctgttgtt tgtcggtgaa cgctctcctg agtaggacaa atccgccggg 300
agcggatttg aacgttgcga agcaacggcc cggagggtgg cgggcaggac gcccgccata 360
aactgccagg catcaaatta agcagaaggc catcctgacg gatggccttt ttgcgtttct 420
acaaactctt ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 480
aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 540
gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 600
cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 660
tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 720
tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag 780
agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 840
cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 900
tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 960
ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 1020
tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 1080
cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 1140
actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 1200
ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 1260
tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 1320
ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 1380
aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 1440
ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 1500
agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 1560
ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 1620
tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 1680
cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 1740
ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 1800
gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 1860
ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 1920
aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 1980
cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 2040
ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 2100
gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 2160
ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 2220
ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 2280
gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgcctg atgcggtatt 2340
ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct 2400
gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat 2460
ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 2520
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 2580
accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagct gcggtaaagc tcatcagcgt ggtcgtgaag 2640
cgattcacag atgtctgcct gttcatccgc gtccagctcg ttgagtttct ccagaagcgt 2700
taatgtctgg cttctgataa agcgggccat gttaagggcg gttttttcct gtttggtcac 2760
ttgatgcctc cgtgtaaggg ggaatttctg ttcatggggg taatgatacc gatgaaacga 2820
gagaggatgc tcacgatacg ggttactgat gatgaacatg cccggttact ggaacgttgt 2880
gagggtaaac aactggcggt atggatgcgg cgggaccaga gaaaaatcac tcagggtcaa 2940
tgccagcgct tcgttaatac agatgtaggt gttccacagg gtagccagca gcatcctgcg 3000
atgcagatcc ggaacataat ggtgcagggc gctgacttcc gcgtttccag actttacgaa 3060
acacggaaac cgaagaccat tcatgttgtt gctcaggtcg cagacgtttt gcagcagcag 3120
tcgcttcacg ttcgctcgcg tatcggtgat tcattctgct aaccagtaag gcaaccccgc 3180
cagcctagcc gggtcctcaa cgacaggagc acgatcatgc gcacccgtgg ccaggaccca 3240
acgctgcccg agatgcgccg cgtgcggctg ctggagatgg cggacgcgat ggatatgttc 3300
tgccaagggt tggtttgcgc attcacagtt ctccgcaaga attgattggc tccaattctt 3360
ggagtggtga atccgttagc gaggtgccgc cggcttccat tcaggtcgag gtggcccggc 3420
tccatgcacc gcgacgcaac gcggggaggc agacaaggta tagggcggcg cctacaatcc 3480
atgccaaccc gttccatgtg ctcgccgagg cggcataaat cgccgtgacg atcagcggtc 3540
cagtgatcga agttaggctg gtaagagccg cgagcgatcc ttgaagctgt ccctgatggt 3600
cgtcatctac ctgcctggac agcatggcct gcaacgcggg catcccgatg ccgccggaag 3660
cgagaagaat cataatgggg aaggccatcc agcctcgcgt cgcgaacgcc agcaagacgt 3720
agcccagcgc gtcggccgcc atgccggcga taatggcctg cttctcgccg aaacgtttgg 3780
tggcgggacc agtgacgaag gcttgagcga gggcgtgcaa gattccgaat accgcaagcg 3840
acaggccgat catcgtcgcg ctccagcgaa agcggtcctc gccgaaaatg acccagagcg 3900
ctgccggcac ctgtcctacg agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga 3960
tagtcatgcc ccgcgcccac cggaaggagc tgactgggtt gaaggctctc aagggcatcg 4020
gtcgaccaaa ctaaagcgcc cttgtggcgc tttagttttg ttcatcttcc agcaagcgtg 4080
cgccggtacc ttcttctcct aagcggtcgc ccgggttacg caacgggcaa tcactgcgcg 4140
aaaggcagcc acaaccaata catccgtcca gttcgtcacg cagcgccact aaggtatgaa 4200
tgcgccgatc caactcttct cgccattggg acgaaagctg tttccactct ttcgcactta 4260
acgtatgccc ttcgggcaac acgccaaacg cttcaccaat ggtcgccagc ggaatgccaa 4320
tacgctgagc aattttgata attgcaacat atcgcaacac atcacgttta tatcgccgct 4380
gattgccgct gttacggata ctggtaatca accctttact ttcatagaaa tgcagcgccg 4440
ataccgccac accgctgcgt ttcgccactt cgccgggggt tagcagcgct ttaatgcggg 4500
gtaatttctt ttccataaat cgctttacct caagttaact tgaggaatta tactccccaa 4560
cagatgaatt aacgaactga acactgaaaa gaggcagatt tatgtcccat cagaaaatta 4620
ttcaggatct tatcgcatgg attgacgagc atattgacca gccgtaagca tgcaaggaga 4680
attacatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 4740
tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 4800
cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 4860
ccaccctcgt gaccaccttc ggctacggcc tgcagtgctt cgcccgctac cccgaccaca 4920
tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 4980
tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 5040
ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcaacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 5100
ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 5160
agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgagggcggc agcgtgcagc 5220
tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 5280
accactacct gagctaccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 5340
tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 5400
agtaataaat cgatccggag cttatcgact gcacggtgca ccaatgcttc tggcgtcagg 5460
cagccatcgg aagctgtggt atggctgtgc aggtcgtaaa tcactgcata attcgtgtcg 5520
ctcaaggcgc actcccgttc tggataatgt tttttgcgcc gacatcataa cggttctggc 5580
aaatattctg aaatgagctg ttgacaatta atcatcggct cgtataatgt gtggaattgt 5640
gagcggataa caatttcaca caggaaacag aattcgctaa gagtgtcggc actcctgatc 5700
agattcaatt tttccaacat gattcttccg atgaagacgg ctggacgaaa ttattcgatg 5760
caacggaaaa agcctttggc ccagtttcta cattagttaa taacgctggg atcgcggtta 5820
acaagagtgt cgaagaaacc acgactgctg aatggcgtaa attattagcc gtcaaccttg 5880
atggtgtctt cttcgga 5897

Seq. Id. No. 12
ctggctacat caagacacca tctgttgatg 30

Seq. Id. No. 13
cggcccctgg taggtcatca acagatggtg 30

Seq. Id. No. 14
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccatctgt tgatgaccta 600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420
cacacaggaa acagaa 6436

Seq. Id. No. 15
ctggctacat caagacacca gcggttgatg 30

Seq. Id. No. 16
cggcccctgg taggtcatca accgctggtg 30

Seq. Id. No. 17
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccagcggt tgatgaccta 600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360
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gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420
cacacaggaa acagaa 6436

Seq. Id. No. 18
acaagaattc gctaagagtg tcggcactcc 30

Seq. Id. No. 19
ggccaagctt ccgaagaaga caccatcaag 30

Seq. Id. No. 20
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcatggttaa caagagtgtc 300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta 600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840
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tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080
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atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320
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agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440
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catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740
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agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340
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ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020
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gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200
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gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560
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ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920
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ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040
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gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400
atggattgac gagcatattg accagccgta agcatgcaag gagaattaca tggtgagcaa 5460
gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa 5520
cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac 5580
cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac 5640
cttcggctac ggcctgcagt gcttcgcccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt 5700
cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga 5760
cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat 5820
cgagctgaag ggcatcaact tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta 5880
caactacaac agccacaacg tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt 5940
gaacttcaag atccgccaca acatcgaggg cggcagcgtg cagctcgccg accactacca 6000
gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcta 6060
ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt 6120
cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaat aaatcgatcc 6180
ggagcttatc gactgcacgg tgcaccaatg cttctggcgt caggcagcca tcggaagctg 6240
tggtatggct gtgcaggtcg taaatcactg cataattcgt gtcgctcaag gcgcactccc 6300
gttctggata atgttttttg cgccgacatc ataacggttc tggcaaatat tctgaaatga 6360
gctgttgaca attaatcatc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 6420
cacacaggaa acagaa 6436

Seq. Id. No. 21
atctgcatgc cggctggtca atatgctcgt c 31

Seq. Id. No. 22
gctagtcgac caaactaaag cgcccttgtg 30

Seq. Id. No. 23
agaggcatgc gtgagcaagg gcgagg 26

Seq. Id. No. 24
gcgcatcgat ttattacttg tacagctcgt ccatg 35

Seq. Id. No. 25
ttcatgtcta accgtttgga tggtaaggta gcaatcatta caggtggtac gttgggtatc 60
ggtttagcta tcgccacgaa gttcgttgaa gaaggggcta aggtcatgat taccggccgg 120
cacagcgatg ttggtgaaaa agcagctaag agtgtcggca ctcctgatca gattcaattt 180
ttccaacatg attcttccga tgaagacggc tggacgaaat tattcgatgc aacggaaaaa 240
gcctttggcc cagtttctac attagttaat aacgctggga tcgcggttaa caagagtgtc 300
gaagaaacca cgactgctga atggcgtaaa ttattagccg tcaaccttga tggtgtcttc 360
ttcggtaccc gattagggat tcaacggatg aagaacaaag gcttaggggc ttccatcatc 420
aacatgtctt cgatcgaagg ctttgtgggt gatcctagct taggggctta caacgcatct 480
aaaggggccg tacggattat gtccaagtca gctgccttag attgtgccct aaaggactac 540
gatgttcggg taaacactgt tcaccctggc tacatcaaga caccattggt tgatgaccta 600
ccaggggccg aagaagcgat gtcacaacgg accaagacgc caatgggcca tatcggtgaa 660
cctaacgata ttgcctacat ctgtgtttac ttggcttcta acgaatctaa atttgcaacg 720
ggttctgaat ttgtagttga cggtggctac actgctcaat agtaagcttc tgttttggcg 780
gatgagagaa gattttcagc ctgatacaga ttaaatcaga acgcagaagc ggtctgataa 840
aacagaattt gcctggcggc agtagcgcgg tggtcccacc tgaccccatg ccgaactcag 900
aagtgaaacg ccgtagcgcc gatggtagtg tggggtctcc ccatgcgaga gtagggaact 960
gccaggcatc aaataaaacg aaaggctcag tcgaaagact gggcctttcg ttttatctgt 1020
tgtttgtcgg tgaacgctct cctgagtagg acaaatccgc cgggagcgga tttgaacgtt 1080
gcgaagcaac ggcccggagg gtggcgggca ggacgcccgc cataaactgc caggcatcaa 1140
attaagcaga aggccatcct gacggatggc ctttttgcgt ttctacaaac tcttttgttt 1200
atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct 1260
tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc 1320
cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa 1380
agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg 1440
taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt 1500
tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg 1560
catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac 1620
ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc 1680
ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa 1740
catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc 1800
aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt 1860
aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga 1920
taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa 1980
atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa 2040
gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa 2100
tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt 2160
ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt 2220
gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg 2280
agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt 2340
aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca 2400
agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac 2460
tgtccttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac 2520
atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct 2580
taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg 2640
gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca 2700
gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt 2760
aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta 2820
tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc 2880
gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc 2940
cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa 3000
ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag 3060
cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct 3120
gtgcggtatt tcacaccgca tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata 3180
gttaagccag tatacactcc gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac 3240
ccgccaacac ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga 3300
caagctgtga ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa 3360
cgcgcgaggc agctgcggta aagctcatca gcgtggtcgt gaagcgattc acagatgtct 3420
gcctgttcat ccgcgtccag ctcgttgagt ttctccagaa gcgttaatgt ctggcttctg 3480
ataaagcggg ccatgttaag ggcggttttt tcctgtttgg tcacttgatg cctccgtgta 3540
agggggaatt tctgttcatg ggggtaatga taccgatgaa acgagagagg atgctcacga 3600
tacgggttac tgatgatgaa catgcccggt tactggaacg ttgtgagggt aaacaactgg 3660
cggtatggat gcggcgggac cagagaaaaa tcactcaggg tcaatgccag cgcttcgtta 3720
atacagatgt aggtgttcca cagggtagcc agcagcatcc tgcgatgcag atccggaaca 3780
taatggtgca gggcgctgac ttccgcgttt ccagacttta cgaaacacgg aaaccgaaga 3840
ccattcatgt tgttgctcag gtcgcagacg ttttgcagca gcagtcgctt cacgttcgct 3900
cgcgtatcgg tgattcattc tgctaaccag taaggcaacc ccgccagcct agccgggtcc 3960
tcaacgacag gagcacgatc atgcgcaccc gtggccagga cccaacgctg cccgagatgc 4020
gccgcgtgcg gctgctggag atggcggacg cgatggatat gttctgccaa gggttggttt 4080
gcgcattcac agttctccgc aagaattgat tggctccaat tcttggagtg gtgaatccgt 4140
tagcgaggtg ccgccggctt ccattcaggt cgaggtggcc cggctccatg caccgcgacg 4200
caacgcgggg aggcagacaa ggtatagggc ggcgcctaca atccatgcca acccgttcca 4260
tgtgctcgcc gaggcggcat aaatcgccgt gacgatcagc ggtccagtga tcgaagttag 4320
gctggtaaga gccgcgagcg atccttgaag ctgtccctga tggtcgtcat ctacctgcct 4380
ggacagcatg gcctgcaacg cgggcatccc gatgccgccg gaagcgagaa gaatcataat 4440
ggggaaggcc atccagcctc gcgtcgcgaa cgccagcaag acgtagccca gcgcgtcggc 4500
cgccatgccg gcgataatgg cctgcttctc gccgaaacgt ttggtggcgg gaccagtgac 4560
gaaggcttga gcgagggcgt gcaagattcc gaataccgca agcgacaggc cgatcatcgt 4620
cgcgctccag cgaaagcggt cctcgccgaa aatgacccag agcgctgccg gcacctgtcc 4680
tacgagttgc atgataaaga agacagtcat aagtgcggcg acgatagtca tgccccgcgc 4740
ccaccggaag gagctgactg ggttgaaggc tctcaagggc atcggtcgac caaactaaag 4800
cgcccttgtg gcgctttagt tttgttcatc ttccagcaag cgtgcgccgg taccttcttc 4860
tcctaagcgg tcgcccgggt tacgcaacgg gcaatcactg cgcgaaaggc agccacaacc 4920
aatacatccg tccagttcgt cacgcagcgc cactaaggta tgaatgcgcc gatccaactc 4980
ttctcgccat tgggacgaaa gctgtttcca ctctttcgca cttaacgtat gcccttcggg 5040
caacacgcca aacgcttcac caatggtcgc cagcggaatg ccaatacgct gagcaatttt 5100
gataattgca acatatcgca acacatcacg tttatatcgc cgctgattgc cgctgttacg 5160
gatactggta atcaaccctt tactttcata gaaatgcagc gccgataccg ccacaccgct 5220
gcgtttcgcc acttcgccgg gggttagcag cgctttaatg cggggtaatt tcttttccat 5280
aaatcgcttt acctcaagtt aacttgagga attatactcc ccaacagatg aattaacgaa 5340
ctgaacactg aaaagaggca gatttatgtc ccatcagaaa attattcagg atcttatcgc 5400
atggattgac gagcatattg accagccggc atgcgtgagc aagggcgagg agctgttcac 5460
cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt 5520
gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac 5580
caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accttcggct acggcctgca 5640
gtgcttcgcc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc 5700
cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg 5760
cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcaa 5820
cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa 5880
cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca 5940
caacatcgag ggcggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg 6000
cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc taccagtccg ccctgagcaa 6060
agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat 6120
cactctcggc atggacgagc tgtacaagta ataaatcgat ccggagctta tcgactgcac 6180
ggtgcaccaa tgcttctggc gtcaggcagc catcggaagc tgtggtatgg ctgtgcaggt 6240
cgtaaatcac tgcataattc gtgtcgctca aggcgcactc ccgttctgga taatgttttt 6300
tgcgccgaca tcataacggt tctggcaaat attctgaaat gagctgttga caattaatca 6360
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