図面 (/)

技術 肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法

出願人 エスケーケミカルズカンパニー,リミテッド
発明者 シン、ジン‐ファンパク、マン‐フンキム、フンノ、ミョン‐ジュパク、ス‐ジン
出願日 2013年9月6日 (7年2ヶ月経過) 出願番号 2015-531010
公開日 2015年9月17日 (5年2ヶ月経過) 公開番号 2015-527079
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造
主要キーワード 変化推移 球菌科 連鎖状 多糖類含量 プレブ pH調節 リン酸ナトリウム緩衝溶液 深層濾過
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年9月17日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (7)

課題・解決手段

肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の改善された製造方法に係り、該製造方法は、pH調節なしに、肺炎球菌血清型を生成する菌株を追加して培養する段階を含むことにより、pH調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を除去することができる。

概要

背景

肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)は、ラクトバシラス連鎖状球菌科に属するグラム陽性菌であり、ヒトに肺炎菌血症中耳炎脳膜炎などの疾病を起こす。肺炎球菌の血清型細胞は、各細胞の周辺を覆い包む多糖類コーティングである莢膜を有する。該莢膜は、抗体がバクテリア細胞に結合することを阻むことにより、食菌作用を邪魔する。免疫学的特性により、約90種以上の血清型に区分されているが、このうち一部の血清型が浸襲性疾患を誘発すると報告されている。1996〜2008年の間に収集された浸襲性肺炎球菌において、総37種の血清型が確認され、19F>23F>19A>6A>3>9V>6Bの血清型順序で表されたこれら主要血清型が、53.4%と過半数以上を占めた。このような血清型肺炎球菌の莢膜多糖類を利用して、多糖類ワクチン、多糖類・タンパク質接合ワクチンなどのワクチンが製造されている。

多糖類ワクチン及び多糖類・タンパク質接合ワクチンの生産のために利用される莢膜多糖類は、各血清型を生成する菌株培養液から得られる。各菌株は、最適化された温度、pH条件及び撹拌条件の下で、最大増殖量に逹するまで培養される。細胞質外に分泌されない肺炎球菌の莢膜多糖類を得るため、デオキシコール酸ナトリウムDOC)などを利用した細胞溶解過程遂行される。このとき、莢膜多糖類以外に、菌株が有する多様なタンパク質と核酸とが共に放出され、これは、培養後、精製工程で除去されなければならない。ワクチン接種後抗原以外の物質による副作用を最小化するためには、厳格なタンパク質及び核酸含量の基準を満足することが要求される。例えば、プレブナール7(登録商標)(Prevnar 7TM)の場合、血清型により、乾燥重量基準のタンパク質は、2〜5%以下、核酸は、1〜2%以下の基準を満足しなければならない。

国際特許公開第WO2006/110352号は、肺炎球菌の培養、細胞溶解、pH5.5未満による酸性化によるタンパク質沈澱振盪なしの放置遠心分離及び/または濾過などの段階を遂行し、莢膜多糖類を得る方法を開示している。また、国際特許公開第WO2008/118752号は、細胞溶解物限外濾過及び定容濾過した後、酸性化によるタンパク質沈澱工程を遂行し、莢膜多糖類を得る方法を開示している。しかし、従来の製造方法は、いずれもpH調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を必須に遂行しなければならないが、それは、全体工程を複雑にするだけではなく、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を引き起こすことにもなる。

概要

肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の改善された製造方法に係り、該製造方法は、pH調節なしに、肺炎球菌血清型を生成する菌株を追加して培養する段階を含むことにより、pH調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を除去することができる。

目的

本発明は、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の改善された製造方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

下記段階を含む、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法:(a)培養液のpHを7.0ないし9.4の範囲に維持しながら、肺炎球菌血清型を生成する菌株を培養する段階と、(b)培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階(a)の培養を終了する段階と、(c)pH調節なしに、段階(b)から得られた培養液を、培養液のpHが5.5以下になるまで追加して培養する段階と、(d)段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、タンパク質沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階と、(e)段階(d)から得られた溶液から、莢膜多糖類を単離及び精製する段階とである。

請求項2

前記肺炎球菌血清型が、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fまたは33Fであることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。

請求項3

段階(a)の前記培養が、34〜38℃で、50〜150rpmで撹拌しながら行われることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。

請求項4

段階(b)が、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から1ないし3時間以内に、段階(a)の培養を終了することよって遂行されることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。

請求項5

段階(c)の追加培養が、pH調節なしに34〜38℃で、50〜150rpmで撹拌しながら行われることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。

請求項6

段階(d)で使用される溶解剤が、デオキシコール酸ナトリウムであることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。

請求項7

段階(d)が、段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、得られた溶液を、10〜20℃で3〜24時間、撹拌なしに維持してタンパク質を沈澱させ、遠心分離によって沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去することよって遂行されることを特徴とする請求項1に記載の製造方法。

請求項8

段階(e)の単離及び精製が、下記段階を含むことを特徴とする請求項1に記載の製造方法:(i)段階(d)から得られた溶液を深層濾過器で濾過する段階と、(ii)段階(i)から得られた濾液濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行う段階と、(iii)段階(ii)から得られた上澄み液に、陽イオン性界面活性剤を加えて反応させた後、遠心分離して莢膜多糖類を含むペレットまたは上澄み液を得る段階と、(iv)段階(iii)から得られた莢膜多糖類をヨード化ナトリウムと反応させ、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、(v)段階(iv)から得られた溶液に活性炭を加えて濾過する段階と、(vi)段階(v)から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行って莢膜多糖類を得る段階とである。

請求項9

段階(ii)の濃縮が、100kDaメンブレンを使用して遂行されることを特徴とする請求項8に記載の製造方法。

請求項10

段階(vi)の濃縮が、30kDaメンブレンを使用して遂行されることを特徴とする請求項8に記載の製造方法。

請求項11

段階(iii)で使用される陽イオン性界面活性剤が、臭化セチルトリメチルアンモニウムであることを特徴とする請求項8に記載の製造方法。

請求項12

前記臭化セチルトリメチルアンモニウムが、0.5〜3.0%の濃度で使用されることを特徴とする請求項11に記載の製造方法。

請求項13

段階(v)で使用される活性炭が、1〜5%(w/v)の含量で使用されることを特徴とする請求項8に記載の製造方法。

技術分野

0001

本発明は、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法に係り、さらに詳細には、肺炎球菌血清型を生成する菌株培養液から、タンパク質核酸などの不純物を除去し、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類を製造する方法に関する。

背景技術

0002

肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)は、ラクトバシラス連鎖状球菌科に属するグラム陽性菌であり、ヒトに肺炎菌血症中耳炎脳膜炎などの疾病を起こす。肺炎球菌の血清型細胞は、各細胞の周辺を覆い包む多糖類コーティングである莢膜を有する。該莢膜は、抗体がバクテリア細胞に結合することを阻むことにより、食菌作用を邪魔する。免疫学的特性により、約90種以上の血清型に区分されているが、このうち一部の血清型が浸襲性疾患を誘発すると報告されている。1996〜2008年の間に収集された浸襲性肺炎球菌において、総37種の血清型が確認され、19F>23F>19A>6A>3>9V>6Bの血清型順序で表されたこれら主要血清型が、53.4%と過半数以上を占めた。このような血清型肺炎球菌の莢膜多糖類を利用して、多糖類ワクチン、多糖類・タンパク質接合ワクチンなどのワクチンが製造されている。

0003

多糖類ワクチン及び多糖類・タンパク質接合ワクチンの生産のために利用される莢膜多糖類は、各血清型を生成する菌株の培養液から得られる。各菌株は、最適化された温度、pH条件及び撹拌条件の下で、最大増殖量に逹するまで培養される。細胞質外に分泌されない肺炎球菌の莢膜多糖類を得るため、デオキシコール酸ナトリウムDOC)などを利用した細胞溶解過程遂行される。このとき、莢膜多糖類以外に、菌株が有する多様なタンパク質と核酸とが共に放出され、これは、培養後、精製工程で除去されなければならない。ワクチン接種後抗原以外の物質による副作用を最小化するためには、厳格なタンパク質及び核酸含量の基準を満足することが要求される。例えば、プレブナール7(登録商標)(Prevnar 7TM)の場合、血清型により、乾燥重量基準のタンパク質は、2〜5%以下、核酸は、1〜2%以下の基準を満足しなければならない。

0004

国際特許公開第WO2006/110352号は、肺炎球菌の培養、細胞溶解、pH5.5未満による酸性化によるタンパク質沈澱振盪なしの放置遠心分離及び/または濾過などの段階を遂行し、莢膜多糖類を得る方法を開示している。また、国際特許公開第WO2008/118752号は、細胞溶解物限外濾過及び定容濾過した後、酸性化によるタンパク質沈澱工程を遂行し、莢膜多糖類を得る方法を開示している。しかし、従来の製造方法は、いずれもpH調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を必須に遂行しなければならないが、それは、全体工程を複雑にするだけではなく、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を引き起こすことにもなる。

発明が解決しようとする課題

0005

本発明者らは、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法を改善するために、多様な研究を行った。本発明者らは、驚くべきことに、pH調節なしに、同一条件で追加培養を行う場合、培養産物(特に、乳酸など)によって、pHをタンパク質沈澱に適する範囲、すなわち、pH5.5以下に低くすることができるということを発見した。すなわち、本発明者らは、pH調節なしに追加培養を行った後、細胞溶解工程及びタンパク質沈澱工程を遂行することにより、pH調節剤を使用した酸性化を介したタンパク質沈澱工程を除去することができるということを発見した。
従って、本発明は、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の改善された製造方法を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0006

本発明の一様態により、下記段階を含む、肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類の製造方法が提供される:
(a)培養液のpHを、7.0ないし9.4の範囲に維持しながら、肺炎球菌血清型を生成する菌株を培養する段階と、
(b)培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階(a)の培養を終了する段階と、
(c)pH調節なしに、段階(b)から得られた培養液を、培養液のpHが5.5以下になるまで追加して培養する段階と、
(d)段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階と、
(e)段階(d)から得られた溶液から、莢膜多糖類を単離及び精製する段階とである。
本発明の製造方法において、前記肺炎球菌血清型は、1、2、3、4、5、6A、6B、7F、9N、9V、14、18C、19A、19F、22F、23Fまたは33Fでもある。
段階(a)の前記培養は、34〜38℃で、50〜150rpmで撹拌しながら行われてもよい。

0007

本発明の一具現例において、段階(b)は、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から1ないし3時間以内に、段階(a)の培養を終了することよって遂行される。
段階(c)の追加培養は、pH調節なしに34〜38℃で、50〜150rpmで撹拌しながら行われてもよい。
段階(d)で使用される溶解剤は、デオキシコール酸ナトリウムでもある。
本発明の他の具現例において、段階(d)は、段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、得られた溶液を、10〜20℃で3〜24時間、撹拌なしに維持してタンパク質を沈澱させ、遠心分離によって沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去することよって遂行される。
本発明の他の具現例において、段階(e)の単離及び精製は、下記段階を含んでもよい:
(i)段階(d)から得られた溶液を、深層濾過器(depth filter)で濾過する段階と、
(ii)段階(i)から得られた濾液濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行う段階と、
(iii)段階(ii)から得られた上澄み液に、陽イオン性界面活性剤を加えて反応させた後、遠心分離して莢膜多糖類を含むペレットまたは上澄み液を得る段階と、
(iv)段階(iii)から得られた莢膜多糖類をヨード化ナトリウムと反応させ、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
(v)段階(iv)から得られた溶液に活性炭を加えて濾過する段階と、
(vi)段階(v)から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行って莢膜多糖類を得る段階とである。

0008

前記具現例において、段階(ii)の濃縮は、100kDaメンブレンを使用して行われ、段階(vi)の濃縮は、30kDaメンブレンを使用して行われる。また、段階(iii)で使用される陽イオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウムであり、前記臭化セチルトリメチルアンモニウムは、0.5〜3.0%の濃度で使用されもする。また、段階(v)で使用される活性炭は、1〜5%(w/v)の含量で使用されもする。

発明の効果

0009

本発明による製造方法は、タンパク質沈澱のためのpH調節剤を使用しない。すなわち、本発明によって、pH調節なしに、同一条件で、肺炎球菌血清型を生成する菌株を追加して培養する場合、培養産物(特に、乳酸など)によって、pHを、タンパク質沈澱に適する範囲、すなわち、pH5.5以下に低くすることができるということが明らかにされた。従って、本発明の製造方法は、タンパク質沈澱のためのpH調節剤の使用が要求されないので、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を最小化することができ、製造工程を単純化することができる。本発明の製造方法によって得られた肺炎球菌血清型を有する莢膜多糖類は、多糖類ワクチン及び多糖類・タンパク質接合ワクチンに有用に使用される。

図面の簡単な説明

0010

肺炎球菌血清型3を生成する菌株の培養pH変化推移及びその条件を示すグラフである。
肺炎球菌血清型6Bを生成する菌株の培養pH変化推移及びその条件を示すグラフである。
肺炎球菌血清型7Fを生成する菌株の培養pH変化推移及びその条件を示すグラフである。
肺炎球菌血清型14を生成する菌株の培養pH変化推移及びその条件を示すグラフである。
肺炎球菌血清型19Aを生成する菌株の培養pH変化推移及びその条件を示すグラフである。
肺炎球菌血清型23Fを生成する菌株の培養pH変化推移及びその条件を示すグラフである。

0011

本発明は、下記段階を含む、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)血清型を有する莢膜多糖類の製造方法を提供する:
(a)培養液のpHを7.0ないし9.4の範囲に維持しながら、肺炎球菌血清型を生成する菌株を培養する段階と、
(b)培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階(a)の培養を終了する段階と、
(c)pH調節なしに、段階(b)から得られた培養液を、培養液のpHが5.5以下になるまで追加して培養する段階と、
(d)段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階と、
(e)段階(d)から得られた溶液から、莢膜多糖類を単離及び精製する段階とである。
本発明による製造方法の段階(a)において、前記肺炎球菌血清型は、肺炎球菌ワクチン製造に使用される全ての形態の血清型であり、例えば、血清型1,2,3,4,5,6A,6B,7F,9N,9V,14,18C,19A,19F,22F,23F,33Fなどを含むが、それらに制限されるものではない。前記肺炎球菌血清型を生成する菌株は、本技術分野に公知されており、公知の菌株を制限なしに使用することができる(例えば、WO2006/110381号参照)。本発明による製造方法の段階(a)の培養は、例えば、水酸化ナトリウムなどを使用して、培養液のpHを7.0ないし9.4、望ましくは、7.2ないし8.2の範囲に維持しながら、大豆基剤培地などの通常の培地内で行われる。前記培養は、公知の培養条件、例えば、34〜38℃で、50〜150rpmで撹拌しながら行われてもよい。肺炎球菌の代表的な血清型による種培養、及び本培養に適して使用されるpH条件は、下記表1の通りである。

0012

0013

本発明による製造方法は、タンパク質沈澱のためのpH調節剤を使用しない。すなわち、本発明者らは、驚くべきことに、pH調節なしに、同一条件で追加培養を行う場合、培養産物(特に、乳酸など)によって、pHをタンパク質沈澱に適する範囲、すなわち、pH5.5以下に低くすることができるということを発見した。従って、本発明の製造方法は、肺炎球菌血清型を生成する菌株の培養後、望ましくは、最大増殖に到達された時点において、pH調節なしに追加培養を行った後、細胞溶解工程及びタンパク質沈澱工程を遂行することを含む。それにより、本発明の製造方法は、タンパク質沈澱のためのpH調節剤の使用が要求されないので、莢膜多糖類の変形及び有害物質の生成を最小化することができ、製造工程を単純化することができる。
従って、本発明の製造方法は、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から低下し始める時点の間で、段階(a)の培養を終了する段階[すなわち、段階(b)]、及びpH調節なしに、段階(b)から得られた培養液を、培養液のpHが5.5以下になるまで追加して培養する段階[すなわち、段階(c)]を含む。

0014

本発明の製造方法の段階(a)によって培養を行えば、菌株が増殖することよって、培養液の吸光度[例えば、590nmでの吸光度(OD590)]が徐々に上昇し、最大増殖に達した時点(培養開始後、約7〜24時間)での吸光度が、一定値に維持される。その後、前記吸光度は、1ないし3時間以内に低下する。従って、本発明の一具現例において、段階(b)は、培養液の吸光度が、一定値に維持される時点から1ないし3時間以内に、段階(a)の培養を終了することによって遂行される。段階(c)の追加培養は、pH調節なしに、段階(a)と同一条件、すなわち、34〜38℃で、50〜150rpmで撹拌しながら行われてもよい。このように追加培養を行う場合、培養液のpHは、5.5以下に自然に低下し、従って、タンパク質凝集に必要な適正pHを提供する。

0015

本発明の製造方法は、段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加え、細胞を溶解させた後、タンパク質を沈澱させ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去する段階[すなわち、段階(d)]を含む。
前記細胞の溶解は、公知の方法、例えば、WO2006/110381号、WO2008/118752号などに開示された方法によって行われる。例えば、前記細胞の溶解は、溶解剤として、デオキシコール酸ナトリウムを使用して行われる。デオキシコール酸ナトリウムは0.10〜0.15%の濃度(デオキシコール酸ナトリウムを加えたときの濃度)で使用されるが、それに制限されるものではない。前記細胞の溶解によって、肺炎球菌血清型の莢膜多糖類が細胞質外に放出される。また、タンパク質沈澱は、例えば、10〜20℃で静置することよって行われ、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸の除去は、通常の方法(例えば、遠心分離など)によって行われる。本発明の一具現例において、段階(d)は、段階(c)から得られた培養液に溶解剤を加えて細胞を溶解させた後、得られた溶液を、10〜20℃で3〜24時間、撹拌なしに維持してタンパク質を沈澱させ、遠心分離によって沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去することよって遂行される。

0016

本発明の製造方法は、段階(d)から得られた溶液から、不純物(例えば、細胞内部に含まれていたタンパク質、核酸など)を除去し、莢膜多糖類を単離及び精製する段階[すなわち、段階(e)]を含む。前記莢膜多糖類の単離及び精製は、公知の精製方法、例えば、WO2006/110381号、WO2008/118752号などに開示された方法によって行われる。一具現例において、段階(e)の単離及び精製は、下記段階を含んでもよい:
(i)段階(d)から得られた溶液を深層濾過器(depth filter)で濾過する段階と、
(ii)段階(i)から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行う段階と、
(iii)段階(ii)から得られた上澄み液に、陽イオン性界面活性剤を加えて反応させた後、遠心分離して莢膜多糖類を含むペレットまたは上澄み液を得る段階と、
(iv)段階(iii)から得られた莢膜多糖類をヨード化ナトリウムと反応させ、遠心分離して上澄み液を回収する段階と、
(v)段階(iv)から得られた溶液に活性炭を加えて濾過する段階と、
(vi)段階(v)から得られた濾液を濃縮した後、限外濾過及び遠心分離を行って莢膜多糖類を得る段階とである。

0017

前記具現例において、深層濾過器を使用した濾過によって、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸の除去のための遠心分離後にも残っている溶解物が除去される。
また、濃縮/限外濾過を二次にわたって行うことより、タンパク質及び核酸を除去することができる。一具現例において、段階(ii)の濃縮は、100kDaメンブレンを使用して行われ、段階(vi)の濃縮は、30kDaメンブレンを使用して行われる。前記限外濾過は、本工程で、「定容濾過(diafiltration)」と呼ばれもする。

0018

また、段階(iii)で使用される陽イオン性界面活性剤は、臭化セチルトリメチルアンモニウムでもある。前記臭化セチルトリメチルアンモニウム(cetrimonium bromide、HB:hexadecyl-trimethylammonium bromide)は、0.5〜3%の濃度(臭化セチルトリメチルアンモニウムを加えたときの濃度)で使用される。使用されたHBなどの陽イオン性界面活性剤は、ヨード化ナトリウムを使用して沈澱及び除去される。前記段階(iii)で遠心分離工程を遂行する場合、莢膜多糖類は、ペレット(例えば、血清型1,2,3,4,5,6A,6B,9N,9V,18C,19A,19F,22F,23Fなど)または上澄み液(例えば、血清型7F,14,33Fなど)に存在する。ペレット状で得られる莢膜多糖類は、適切な溶媒(例えば、塩化ナトリウム水溶液など)に溶解させ、次の段階(すなわち、ヨード化ナトリウムとの反応)を遂行することができる。上澄み液に存在する莢膜多糖類は、別途の分離なしに、そのまま上澄み液状で、次の段階(すなわち、ヨード化ナトリウムとの反応)を遂行することができる。
また、段階(v)において、活性炭(activated carbon)は、1〜5%(w/v)の含量で、望ましく使用される。

0019

以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、下記実施例は、本発明を例示するためのものであり、本発明は、それら実施例によって制限されるものではない。

0020

下記実施例で使用された大豆基剤培地の組成は、下記表2の通りである。

0021

0022

実施例1.肺炎球菌血清型3,6B及び19Aの莢膜多糖類製造
細胞銀行の製造>
肺炎球菌血清型3,6B及び19Aをそれぞれ生産する原種菌(seed stock)を、受託機関ATCC:American Type Culture Collection]から収得した。種培養、及び本培養に使用された菌株は、下記表3の通りである。

0023

0024

前記原種菌を、何世代か培養した(F1,F2及びF3世代)。原種菌を、追加して2世代さらに培養した。追加された第1世代は、F3バイアルから培養し、後続世代は、追加された第1世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した(<−70℃)。細胞銀行製造のために、全ての培養物を大豆基剤培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤(例:合成グリセロール)を含む新たな培地に、細胞ペレット再懸濁させた。

0025

<培養及び回収>
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基剤培地を含むシード瓶(seed bottles)に接種して培養した。目標吸光度に逹した後、シード瓶を使用して、大豆基剤培地を含む発酵器に接種した。3N NaOHを使用して、pHを約7.2以上に維持しながら、34〜38℃で、120rpmの条件下で培養を行った。2〜3時間ごとにサンプリングし、吸光度値を測定した。吸光度値が急激に上昇し始めれば、0.5〜1時間ごとにサンプリングして吸光度を測定した。吸光度値が一定値に維持され始めた後、約1時間後に培養を終了した。培養終了後、pH調節なしに、pHが5.5以下になるまで、同一温度及びrpm条件で、追加培養を行った。前記追加培養終了後、0.12%の濃度で、デオキシコール酸ナトリウムを加えて細胞を溶解(lysis)させた。得られた培養物を10〜15℃に冷却し、該温度で約3時間、撹拌なしに維持し、タンパク質沈澱を誘導した。その後、前記混合物を遠心分離し、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去した。

0026

<精製>
前記遠心分離を介して得られた溶液を深層濾過器で濾過し、遠心分離時に沈んでいないタンパク質及び細胞残骸を除去した。得られた濾液を、100kDaメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、25mMリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.2)を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液伝導度が、3〜4mS/cmほどになるまで行い、膜差圧(TMP)は、0.5〜1.5バー以下に設定した。得られた試料の不純物を除去した後、約1.0w/v%の濃度で臭化セトリモニウム(cetrimonium bromide、HB:hexadecyl-trimethylammonium bromide(HB))を加えて約1時間撹拌した後、遠心分離して多糖類を沈澱させた。得られたペレットを、約0.25M塩化ナトリウム水溶液に溶解させた後、約0.5w/v%の濃度で、ヨード化ナトリウム(NaI)を添加した。前記溶液を遠心分離して上澄み液を回収し、得られた溶液を撹拌しながら、約2.0w/v%の濃度で、活性炭を徐々に添加した後、約1時間撹拌した後で濾過した。得られた濾液を、30kDaメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、約10倍の三次蒸溜水を使用して限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が約10μs/cmほどになるまで行い、膜差圧(TMP)は、0.5〜1.5バー以下に設定した。得られた濃縮液を無菌濾過した後、−20℃以下で冷凍保管した。

0027

前記各段階の精製過程において、総タンパク質含量、総核酸含量、総多糖類含量及び精製収率を評価した結果は、下記表4ないし表6の通りである。

0028

0029

0030

0031

前記表4ないし表6の結果から、本発明による製造方法によって得られた莢膜多糖類は、別途の酸性化工程の採用なしにも、残留タンパク質含量基準値を満足し、莢膜多糖類の回収率も、それぞれ49%以上(血清型3莢膜多糖類)、65%以上(血清型6B莢膜多糖類)、及び60%以上(血清型19A莢膜多糖類)であった。従って、本発明による製造方法は、単純化された工程を介して、莢膜多糖類を効果的に生産することができる。

0032

実施例2.肺炎球菌血清型7F及び14の莢膜多糖類製造
<細胞銀行の製造>
肺炎球菌血清型7F,14を生産する原種菌を、受託機関[ATCC:American Type Culture Collection]から収得した。種培養及び本培養に使用された菌株は、下記表7の通りである。

0033

0034

前記原種菌を何代か培養した(F1,F2及びF3世代)。原種菌を、追加して2世代さらに培養した。追加された第1世代は、F3バイアルから培養し、後続世代は、追加された第1世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した(<−70℃)。細胞銀行製造のために、全ての培養物を大豆基剤培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤(例:合成グリセロール)を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁させた。

0035

<培養及び回収>
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基剤培地を含むシード瓶に接種して培養した。目標吸光度に逹した後、シード瓶を使用して、大豆基剤培地を含む発酵器に接種した。3N NaOHを使用して、pHを約7.2以上に維持しながら、34〜38℃で120rpmの条件下で、培養を行った。2〜3時間ごとにサンプリングし、吸光度値を測定した。吸光度値が急激に上昇し始めれば、0.5〜1時間ごとにサンプリングして吸光度を測定した。吸光度値が一定値に維持され始めた後、約1時間後に培養を終了した。培養終了後、pH調節なしに、pHが5.5以下になるまで、同一温度及びrpm条件で追加培養を行った。前記追加培養終了後、0.12%の濃度でデオキシコール酸ナトリウムを加え、細胞を溶解させた。得られた培養物を10〜15℃に冷却し、この温度で、約3時間撹拌なしに維持し、タンパク質沈澱を誘導した。その後、前記混合物を遠心分離し、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去した。

0036

<精製>
前記遠心分離を介して得られた溶液を深層濾過器で濾過し、遠心分離時に沈んでいないタンパク質及び細胞残骸を除去した。得られた濾液を、100kDaメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、25mMリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.2)を使用して、限外濾過を遂行した。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、3〜4mS/cmほどになるまで行い、膜差圧(TMP)は、0.5〜1.5バー以下に設定した。得られた試料の不純物を除去した後、約1.0w/v%の濃度で、臭化セトリモニウム(cetrimonium bromide、HB:hexadecyl-trimethylammonium bromide)を加えて約1時間撹拌した後、遠心分離して上澄み液を回収した。得られた上澄み液に、約0.5w/v%の濃度で、ヨード化ナトリウム(NaI)を添加した。前記溶液を遠心分離して上澄み液を回収し、得られた溶液を撹拌しながら、約2.0w/v%の濃度で活性炭を徐々に添加した後、約1時間撹拌した後で濾過した。得られた濾液を、30kDaメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、約10倍の三次蒸溜水を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、10μs/cmほどになるまで行い、膜差圧(TMP)は、0.5〜1.5バー以下に設定した。得られた濃縮液を無菌濾過した後、−20℃以下で冷凍保管した。

0037

前記各段階の精製過程において、総タンパク質含量、総核酸含量、総多糖類含量、及び精製収率を評価した結果は、下記表8及び表9の通りである。

0038

0039

0040

前記表8及び表9の結果から、本発明による製造方法によって得られた莢膜多糖類は、別途の酸性化工程の採用なしにも、残留タンパク質含量基準値を満足し、莢膜多糖類の回収率も、それぞれ60%以上(血清型7F莢膜多糖類)及び55%以上(血清型14莢膜多糖類)であった。従って、本発明による製造方法は、単純化された工程を介して、莢膜多糖類を効果的に生産することができる。

0041

実施例3.肺炎球菌血清型23Fの莢膜多糖類製造
<細胞銀行の製造>
肺炎球菌血清型23Fを生産する原種菌を受託機関[ATCC:American Type Culture Collection,No.6323]から収得した。前記原種菌を何世代か培養した(F1,F2及びF3世代)。原種菌を、追加して2世代さらに培養した。追加された第1世代は、F3バイアルから培養し、後続世代は、追加された第1世代のバイアルから培養した。冷凍保存剤としての合成グリセロールと共に、種菌バイアルを冷凍保管した(<−70℃)。細胞銀行製造のために、全ての培養物を、大豆基剤培地で増殖させた。冷凍させる前に、遠心分離によって細胞を濃縮させ、使用された培地を除去した後、冷凍保存剤(例:合成グリセロール)を含む新たな培地に細胞ペレットを再懸濁させた。

0042

<培養及び回収>
製造用細胞銀行由来の培養物を使用して、大豆基剤培地を含むシード瓶に接種して培養した。目標吸光度に逹した後、シード瓶を使用して、大豆基剤培地を含む発酵器に接種した。3N NaOHを使用して、pHを約7.2以上に維持しながら、34〜38℃で120rpmの条件下で、培養を行った。2〜3時間ごとにサンプリングし、吸光度値を測定した。吸光度値が急激に上昇し始めれば、0.5〜1時間ごとにサンプリングし、吸光度を測定した。吸光度値が一定値に維持され始めた後、約1時間後に培養を終了した。培養終了後、pH調節なしに、pHが5.5以下になるまで、同一温度及びrpm条件で追加培養を行った。前記追加培養終了後、0.12%の濃度で、デオキシコール酸ナトリウムを加え、細胞を溶解させた。得られた培養物を10〜15℃に冷却し、この温度で、約3時間撹拌なしに維持し、タンパク質沈澱を誘導した。その後、前記混合物を遠心分離し、沈澱されたタンパク質及び細胞残骸を除去した。

0043

<精製>
前記遠心分離を介して得られた溶液を深層濾過器で濾過し、遠心分離時に沈んでいないタンパク質及び細胞残骸を除去した。得られた濾液を、100kDaメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、25mMリン酸ナトリウム緩衝溶液(pH7.2)を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、3〜4mS/cmほどになるまで行い、膜差圧(TMP)は、0.5〜1.5バー以下に設定した。得られた試料の不純物を除去した後、約2.5w/v%の濃度、で臭化セトリモニウム(cetrimonium bromide、HB:hexadecyl-trimethylammonium bromide)を加えて約1時間撹拌した後、遠心分離して多糖類を沈澱させた。得られたペレットを、約0.25M塩化ナトリウム水溶液に溶解させた後、約0.5w/v%の濃度で、ヨード化ナトリウム(NaI)を添加した。前記溶液を遠心分離して上澄み液を回収し、得られた溶液を撹拌しながら、約2.0w/v%の濃度で、活性炭を徐々に添加した後、約1時間撹拌した後で過した。得られた濾液を、30kDaメンブレンを使用して濃縮した後、得られた濃縮液に対して、約10倍の三次蒸溜水を使用して、限外濾過を行った。前記限外濾過は、透過液の伝導度が、10μs/cmほどになるまで行い、膜差圧(TMP)は、0.5〜1.5バー以下に設定した。得られた濃縮液を無菌濾過した後、−20℃以下で冷凍保管した。

0044

前記各段階の精製過程において、総タンパク質含量、総核酸含量、総多糖類含量、及び精製収率を評価した結果は、下記表10の通りである。

0045

実施例

0046

前記表10の結果から、本発明による製造方法によって得られた血清型23F莢膜多糖類は、別途の酸性化工程の採用なしにも、残留タンパク質含量基準値を満足し、莢膜多糖類の回収率も、60%以上であった。従って、本発明による製造方法は、単純化された工程を介して、莢膜多糖類を効果的に生産することができる。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • ナガセケムテックス株式会社の「 核酸吸着材」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題】タンパク質、核酸などを含む溶液中の核酸を選択的に吸着することができる核酸吸着材を提供する。【解決手段】窒素原子を含むカチオン性基を有するセルロースナノファイバーを備える、核酸吸着材。窒素原子を... 詳細

  • 阿万恵理の「 モリンガ発酵食品」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題】モリンガを発酵させるのに最適な食品を選択し、モリンガの有効成分を強化させたモリンガ発酵食品を提供すること。【解決手段】モリンガに大豆乾燥粉砕物を混合し、当該モリンガを発酵させる。また、使用する... 詳細

  • 国民大学校産学協力団の「 Fcガンマ受容体変異体」が 公開されました。( 2020/09/24)

    【課題・解決手段】本発明はFcガンマ受容体変異体を含むポリペプチドに関するものである。本発明のFcガンマ受容体変異体は、Fcガンマ受容体の一部アミノ酸配列を他のアミノ酸配列に置換して最適化することによ... 詳細

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ