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技術 癌に対する胎盤ワクチン接種療法

出願人 ボリス,マルコシアン
発明者 ボリス,マルコシアン
出願日 2013年8月19日 (6年6ヶ月経過) 出願番号 2015-528558
公開日 2015年9月10日 (4年5ヶ月経過) 公開番号 2015-526469
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 平均ピーク値 本開示発明 DC源 最短直径 誘発要因 一般常識 実行範囲 アルファベータ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年9月10日)のものです。
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図面 (9)

課題・解決手段

本発明は、癌組織、および宿主打ち負かすために腫瘍により用いられる生物学的エフェクターに対する免疫応答を、胎盤組織細胞分子、およびそれらの組合せを使用して哺乳動物免疫処置することによって刺激する方法を開示する。一実施形態では、本発明は、免疫源として、同系、同種異系、異種、およびそれらの組合せを利用することを提供する。

概要

背景

外科手術放射線療法、および化学療法は、白血病固形腫瘍、および転移を含む癌の治療に対する承認済み標準アプローチである。

不運にも、これらのアプローチには極めて高い毒性および有害作用付随する。従来の癌治療に対する補助として、体内の免疫系を直接的または間接的に使用して、癌を縮小または根絶させる免疫療法が長年研究されてきた。ヒト免疫系が癌治療のための未開発の資源であり得ること、また、一旦免疫系の成分が適切に利用できれば、有効な治療法が開発され得ることが想定されている。重要な免疫制御分子および免疫シグナルが同定され、治療試薬として調製されているので、そのような試薬の臨床有効性を、確立された癌モデルを使用して試験することができる。免疫療法の戦略としては、ワクチン投与活性化細胞、抗体、サイトカインケモカイン、ならびに小分子阻害剤アンチセンスオリゴヌクレオチド、および遺伝子治療が挙げられる。本明細書に提供される本発明は、癌治療の現行のアプローチに付随した毒性を伴わない、癌治療のための新規方法を提供する。

概要

本発明は、癌組織、および宿主打ち負かすために腫瘍により用いられる生物学的エフェクターに対する免疫応答を、胎盤組織細胞、分子、およびそれらの組合せを使用して哺乳動物免疫処置することによって刺激する方法を開示する。一実施形態では、本発明は、免疫源として、同系、同種異系、異種、およびそれらの組合せを利用することを提供する。

目的

本発明は、免疫源として、同系、同種異系、異種、およびそれらの組合せを利用することを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

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請求項1

免疫応答の抑制と関連した免疫不全治療するための、異種宿主免疫処置に適した胎盤または胎盤抽出物を含む組成物

請求項2

前記胎盤が実質的にホモジナイズされ、単離された細胞が免疫処置のために使用される、請求項1に記載の組成物。

請求項3

前記単離された細胞が、栄養膜、栄養膜の合胞細胞、および内皮細胞である、請求項2に記載の組成物。

請求項4

抗原提示細胞をさらに含む、請求項1に記載の組成物。

請求項5

前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項4に記載の組成物。

請求項6

前記免疫不全が、癌、ヒト免疫不全ウイルス慢性疲労症候群、またはウイルス誘導免疫抑制である、請求項1に記載の組成物。

請求項7

必要とするレシピエントへの異種胎盤の投与を含む、癌を治療するための方法。

請求項8

前記胎盤が、実質的にホモジナイズされ、単離された細胞またはその生成物ワクチン接種のために使用される、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記単離された細胞が、栄養膜、栄養膜の合胞細胞、または内皮細胞である、請求項8に記載の方法。

請求項10

抗原提示細胞の投与をさらに含む、請求項7に記載の方法。

請求項11

前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記胎盤調製物起源ブタであり、前記レシピエントがヒトである、請求項7に記載の方法。

請求項13

前記胎盤ワクチン接種が、免疫原性を高めるためにアジュバント一緒に投与される、請求項7に記載の方法。

請求項14

(a)胎盤タンパク質を単離し精製すること、(b)前記精製された異種胎盤タンパク質の1つまたは複数を用いて、腫瘍担持実験レシピエントを免疫処置すること、および(c)目的の個々の腫瘍に対する免疫の最も強力な誘導物質である、異種胎盤からのタンパク質を同定することを含む、腫瘍交差反応性抗原の抽出のための抗原供給源

請求項15

異種胎盤タンパク質抽出物、異種胎盤由来細胞、異種栄養膜、または同種異系もしくは異種腫瘍細胞と融合された異種栄養膜を含む組成物による、必要とする患者の免疫処置を含む、癌を治療する方法。

請求項16

アジュバントが加えられる、請求項15に記載の方法。

請求項17

前記アジュバントが、化学物質、化学物質の組成物、細菌由来化合物、または免疫刺激受容体アゴニストである、請求項16に記載の方法。

請求項18

前記アジュバントが、DETOX、IL−12、CpG−オリゴデオキシヌクレオチド、CTLA−4遮断薬、IFNアルファ2b、CCR5遮断薬、水酸化アルミニウム、montanideISA51、GMCSFからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。

請求項19

前記アジュバントが樹状細胞である、請求項17に記載の方法。

請求項20

前記アジュバントが、4−IBBL、IL−2、IL−12、GM−CSF、OX−40リガンド、IFN−ガンマ熱ショックタンパク質70、およびシャペロンリッチ細胞溶解物からなる群から選択された遺伝子でトランスフェクトされた樹状細胞である、請求項19に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、癌組織、および宿主打ち負かすために腫瘍により用いられる生物学的エフェクターに対する免疫応答を、胎盤組織細胞分子、およびそれらの組合せを使用して哺乳動物免疫処置することによって刺激する方法を開示する。一実施形態では、本発明は、免疫源として、同系、同種異系、異種、およびそれらの組合せを利用することを提供する。

0002

優先権請求
本出願は2012年8月20日に出願された米国仮特許出願第61/691,187号明細書に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の内容全体は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。

0003

開示の本発明は、免疫調節の分野に関する。より具体的には、本発明は、治療上有用な抗原を含有すると同時に、免疫機能を増強する両機能的調製物に関する。

背景技術

0004

外科手術放射線療法、および化学療法は、白血病固形腫瘍、および転移を含む癌の治療に対する承認済み標準アプローチである。

0005

不運にも、これらのアプローチには極めて高い毒性および有害作用付随する。従来の癌治療に対する補助として、体内の免疫系を直接的または間接的に使用して、癌を縮小または根絶させる免疫療法が長年研究されてきた。ヒト免疫系が癌治療のための未開発の資源であり得ること、また、一旦免疫系の成分が適切に利用できれば、有効な治療法が開発され得ることが想定されている。重要な免疫制御分子および免疫シグナルが同定され、治療試薬として調製されているので、そのような試薬の臨床有効性を、確立された癌モデルを使用して試験することができる。免疫療法の戦略としては、ワクチン投与活性化細胞、抗体、サイトカインケモカイン、ならびに小分子阻害剤アンチセンスオリゴヌクレオチド、および遺伝子治療が挙げられる。本明細書に提供される本発明は、癌治療の現行のアプローチに付随した毒性を伴わない、癌治療のための新規方法を提供する。

課題を解決するための手段

0006

開示の本発明は、異種胎盤、胎盤抽出物、細胞、細胞株、または精製タンパク質の組合せによる免疫処置を介して、宿主に抗腫瘍および免疫刺激効果誘導する新規方法を教示する。同種異系胎盤ワクチン接種に比較して、異種胎盤ワクチン接種のアプローチが有するいくつかの利点は、以下のものに対する免疫応答を刺激する異種抗原成分の予期せぬ効果的性質にある:(1)腫瘍関連抗原;(2)機能性腫瘍関連抗原;および(3)腫瘍分泌免疫抑制成分。開示の本発明の有用性および実用性については、宿主が免疫刺激を必要とする他の免疫抑制関連状態の治療に向いている。

0007

本発明の一態様では、同種異系胎盤を利用するが、前記胎盤組織またはその細胞を、免疫原性を刺激することができる薬剤で前処理することにより免疫原性を増強する。免疫原性を刺激できる薬剤としては、以下に限定されるものではないが、サイトカイン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、およびDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤などMHC発現活性化剤が挙げられる。免疫調節のさらなる手段としては、異種または同種異系の成分による細胞のトランスフェクション、ならびに免疫刺激サイトカインによるトランスフェクションが挙げられる。

0008

免疫刺激サイトカインの非限定例としては、Bリンパ球走化性因子(「BLC」)、C−Cモチーフケモカイン11(「エオタキシン−1」)、好酸球走化性タンパク質−2(「エオタキシン−2」)、果粒球コロニー刺激因子(「G−CSF」)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(「GM−CSF」)、I−309、細胞間接着分子−1(「ICAM−1」)、インターフェロンガンマ(「IFNガンマ」)、インターロイキン−1アルファ(「IL−1アルファ」)、インターロイキン−1ベータ(「IL−1ベータ」)、インターロイキン1受容体アンタゴニスト(「IL−1 ra」)、インターロイキン−2(「IL−2」)、インターロイキン−4(「IL−4」)、インターロイキン−5(「IL−5」)、インターロイキン−6(「IL−6」)、インターロイキン−6可溶性受容体(「IL−6 sR」)、インターロイキン−7(「IL−7」)、インターロイキン−8(「IL−8」)、インターロイキン−10(「IL−10」)、インターロイキン−11(「IL−11」)、インターロイキン−12のサブユニットベータ(「IL−12 p40」または「IL−12 p70」)、インターロイキン−13(「IL−13」)、インターロイキン−15(「IL−15」)、インターロイキン−16(「IL−16」)、インターロイキン−17(「IL−17」)、ケモカイン(C−Cモチーフリガンド2(「MCP−1」)、マクロファージコロニー刺激因子(「M−CSF」)、ガンマインターフェロンにより誘導されるモノカイン(「MIG」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド2(「MIP−1アルファ」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド4(「MIP−1ベータ」)、マクロファージ炎症性タンパク質−1−デルタ(「MIP−1デルタ」)、血小板由来増殖因子サブユニットB(「PDGF−BB」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド5、ランテス(「RANTES」)、TIMメタロペプチダーゼ阻害剤1(「TIMP−1」)、TIMPメタロペプチダーゼ阻害剤2(「TIMP−2」)、腫瘍壊死因子リンフォトキシン−アルファ(「TNFアルファ」)、腫瘍壊死因子、リンフォトキシン−ベータ(「TNFベータ」)、可溶性TNF受容体タイプ1(「sTNFRI」)、sTNFRIIAR、脳由来神経栄養因子(「BDNF」)、塩基性線維芽細胞増殖因子(「bFGF」)、骨形態形成タンパク質4(「BMP−4」)、骨形態形成タンパク質5(「BMP−5」)、骨形態形成タンパク質7(「BMP−7」)、神経成長因子(「b−NGF」)、上皮増殖因子(「EGF」)、上皮増殖因子受容体(「EGFR」)、内分泌腺由来血管内皮細胞増殖因子(「EG−VEGF」)、線維芽細胞増殖因子4(「FGF−4」)、角化細胞増殖因子(「FGF−7」)、増殖分化因子15(「GDF−15」)、グリア細胞由来神経栄養因子(「GDNF」)、成長ホルモンヘパリン結合性EGF様増殖因子(「HB−EGF」)、肝細胞増殖因子(「HGF」)、インスリン様増殖因子結合タンパク質1(「IGFBP−1」)、インスリン様増殖因子結合タンパク質2(「IGFBP−2」)、インスリン様増殖因子結合タンパク質3(「IGFBP−3」)、インスリン様増殖因子結合タンパク質4(「IGFBP−4」)、インスリン様増殖因子結合タンパク質6(「IGFBP−6」)、インスリン様増殖因子1(「IGF−1」)、インスリン、マクロファージコロニー刺激因子(「M−CSF R」)、神経成長因子レセプター(「NGF R」)、ニューロトロフィン−3(「NT−3」)、ニューロトロフィン−4(「NT−4」)、破骨細胞形成抑制因子(「オステオプロテゲリン」)、血小板由来増殖因子受容体(「PDGF−AA」)、ホスファチジルイノシトールグリカン生合成(「PIGF」)、Skp、カリン、F−ボックス含有複合体(「SCF」)、幹細胞因子受容体(「SCF R」)、形質転換増殖因子アルファ(「TGFアルファ」)、形質転換増殖因子ベータ−1(「TGFベータ1」)、形質転換増殖因子ベータ−3(「TGFベータ3」)、血管内皮細胞増殖因子(「VEGF」)、血管内皮細胞増殖因子受容体2(「VEGFR2」)、血管内皮細胞増殖因子受容体3(「VEGFR3」)、VEGF−D 6Ckine、チロシンプロテインキナーゼ受容体UFO(「Axl」)、ベータセルリン(「BTC」)、粘膜関連上皮性ケモカイン(「CCL28」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド27(「CTACK」)、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド16(「CXCL16」)、C−X−Cモチーフケモカイン5(「ENA−78」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド26(「エオタキシン−3」)、顆粒球走化性タンパク質2(「GCP−2」)、GRO、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド14(「HCC−1」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド16(「HCC−4」)、インターロイキン−9(「IL−9」)、インターロイキン−17F(「IL−17F」)、インターロイキン−18−結合タンパク質(「IL−18 BPa」)、インターロイキン−28A(「IL−28A」)、インターロイキン29(「IL−29」)、インターロイキン31(「IL−31」)、C−X−Cモチーフケモカイン10(「IP−10」)、ケモカイン受容体CXCR3(「I−TAC」)、白血病抑制因子(「LIF」)、Light、ケモカイン(Cモチーフ)リガンド(「リンホタクチン」)、単球走化性タンパク質2(「MCP−2」)、単球走化性タンパク質3(「MCP−3」)、単球走化性タンパク質4(「MCP−4」)、マクロファージ由来ケモカイン(「MDC」)、マクロファージ遊走阻止因子(「MIF」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド20(「MIP−3アルファ」)、C−Cモチーフケモカイン19(「MIP−3ベータ」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド23(「MPIF−1」)、マクロファージ刺激タンパク質アルファ鎖(「MSPアルファ」)、ヌクレオソームアセンブリータンパク質1様4(「NAP−2」)、分泌型リン酸化タンパク質1(「オステオポンチン」)、肺性および活性化調節性サイトカイン(Pulmonary and activation−regulated cytokine)(「PARC」)、血小板第4因子(「PF4」)、間質細胞由来因子−1アルファ(「SDF−1アルファ」)、ケモカイン(C−Cモチーフ)リガンド17(「TARC」)、胸腺発現ケモカイン(「TECK」)、胸腺間質性リンホポエチン(「TSLP4−1BB」)、CD166抗原(「ALCAM」)、表面抗原分類80(「B7−1」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー17(「BCMA」)、表面抗原分類14(「CD14」)、表面抗原分類30(「CD30」)、表面抗原分類40(「CD40リガンド」)、癌胎児性抗原関連細胞接着分子1(胆汁糖タンパク質)(「CEACAM−1」)、細胞死受容体6(「DR6」)、デオキシチミジンキナーゼ(「Dtk」)、1型膜糖タンパク質(「エンドグリン」)、受容体型チロシンプロテインキナーゼerbB−3(「ErbB3」)、内皮細胞白血球間接着分子−1(「E−セレクチン」)、アポトーシス抗原1(「Fas」)、Fms様チロシンキナーゼ3(「Flt−3L」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー1(「GITR」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー14(「HVEM」)、細胞間接着分子3(「ICAM−3」)、IL−1 R4、IL−1 RI、IL−10Rベータ、IL−17R、IL−2Rガンマ、IL−21R、リソソーム膜タンパク質2(「LIMPII」)、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン(「リポカリン−2」)、CD62L(「L−セレクチン」)、リンパ内皮(「LYVE−1」)、MHCクラスポリペプチド関連配列A(「MICA」)、MHCクラスIポリペプチド関連配列B(「MICB」)、NRGl−ベータ1、ベータ型血小板由来増殖因子受容体(「PDGF Rベータ」)、血小板内皮細胞接着分子(「PECAM−1」)、RAGE、A型肝炎ウイルス細胞受容体1(「TIM−1」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10C(「TRAIL R3」)、Trappinタンパク質トランスグルタミナーゼ結合ドメイン(「Trappin−2」)、ウロキナーゼ受容体(「uPAR」)、血管細胞接着タンパク質1(「VCAM−1」)、XEDARActivin A、アグーチ関連タンパク質(「AgRP」)、リボヌクレアーゼ5(「アンジオゲニン」)、アンジオポエチン1、アンジオスタチンカテプリンS(Catheprin S)、CD40、潜在性ファミリータンパク質1B(「Cripto−1」)、DAN、Dickkopf関連タンパク質1(「DKK−1」)、E−カドヘリン上皮細胞接着分子(「EpCAM」)、Fasリガンド(FasLまたはCD95L)、Fcg RIIB/C、フォリスタチンガレクチン−7、細胞間接着分子2(「ICAM−2」)、IL−13 R1、IL−13 R2、IL−17B、IL−2 Ra、IL−2 Rb、IL−23、LAP神経細胞接着分子(「NrCAM」)、プラスミノーゲン活性化因子インヒビター−1(「PAI−1」)、血小板由来増殖因子受容体(「PDGF−AB」)、レジスチンストロマ細胞由来因子1(「SDF−1ベータ」)、sgpl30、分泌型frizzled関連タンパク質2(「ShhN」)、シアル酸結合免疫グロブリンレクチン(「Siglec−5」)、ST2、形質転換増殖因子−ベータ2(「TGFベータ2」)、Tie−2、トロンボポイエチン(「TPO」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10D(「TRAIL R4」)、骨髄系細胞上に発現されるトリガー受容体1(Triggering receptor expressed on myeloid cells 1)(「TREM−1」)、血管内皮細胞増殖因子C(「VEGF−C」)、VEGFRlAdiponectin、アディプシン(Adipsin)(「AND」)、アルファ−フェトプロテイン(「AFP」)、アンジオポエチン様4(「ANGPTL4」)、ベータ−2−ミクログロブリン(「B2M」)、基底細胞接着分子(「BCAM」)、糖鎖抗原125(「CA125」)、癌抗原15−3(「CA15−3」)、癌胎児性抗原(「CEA」)、cAMP受容体タンパク質(「CRP」)、ヒト上皮増殖因子受容体2(「ErbB2」)、フォリスタチン、卵胞刺激ホルモン(「FSH」)、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド1(「GROアルファ」)、ヒト絨毛性ゴナドトロピン(「ベータHCG」)、インスリン様増殖因子1受容体(「IGF−1 sR」)、IL−1 sRII、IL−3、IL−18 Rb、IL−21、レプチンマトリックスメタロプロテイナーゼ−1(「MMP−1」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−2(「MMP−2」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−3(「MMP−3」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−8(「MMP−8」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−9(「MMP−9」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−10(「MMP−10」)、マトリックスメタロプロテイナーゼ−13(「MMP−13」)、神経細胞接着分子(「NCAM−1」)、エンタクチン(「ナイドジェン−1」)、ニューロン特異的エノラーゼ(「NSE」)、オンコスタチンM(「OSM」)、プロカルシトニンプロラクチン前立腺特異的抗原(「PSA」)、シアル酸結合Ig様レクチン9(「Siglec−9」)、ADAM17エンドペプチダーゼ(「TACE」)、チログロブリンメタロプロテイナーゼ阻害剤4(「TIMP−4」)、TSH2B4、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質9(「ADAM−9」)、アンジオポエチン2、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリー
ンバー13/酸性ロイシンリッチ核リン酸化タンパク質32ファミリーメンバーB(「APRIL」)、骨形態形成タンパク質2(「BMP−2」)、骨形態形成タンパク質9(「BMP−9」)、補体成分5a(「C5a」)、カテプシンL、CD200、CD97、ケメリン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー6B(「DcR3」)、脂肪酸結合タンパク質2(「FABP2」)、線維芽細胞活性化タンパク質、アルファ(「FAP」)、線維芽細胞増殖因子19(「FGF−19」)、ガレクチン−3、肝細胞増殖因子受容体(「HGF R」)、IFN−ガンマアルファ/ベータR2、インスリン様増殖因子2(「IGF−2」)、インスリン様増殖因子2受容体(「IGF−2R」)、インターロイキン−1受容体6(「IL−1R6」)、インターロイキン24(「IL−24」)、インターロイキン33(IL−33」)、カリクレイン14、アスパラギニルエンドペプチダーゼ(「Legumain」)、酸化低密度リポタンパク質受容体1(「LOX−1」)、マンノース結合レクチン(「MBL」)、ネプリライシン(「NEP」)、ノッチホモログ1、転座関連(ショウジョウバエ)(「ノッチ−1」)、腎芽細胞腫過剰発現(「NOV」)、オステオアクチビンプログラム細胞死タンパク質1(「PD−1」)、N−アセチルムラモイル−L−アラニンアミダーゼ(「PGRP−5」)、セルピンA4、分泌型frizzled関連タンパク質3(「sFRP−3」)、トロンボモジュリンToll様受容体2(「TLR2」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー10A(「TRAIL Rl」)、トランスフェリン(「TRF」)、WIF−lACE−2、アルブミン、AMICA、アンジオポエチン4、B細胞活性化因子(「BAFF」)、糖鎖抗原19−9(「CA19−9」)、CD163、クラスタリン、CRTAM、ケモカイン(C−X−Cモチーフ)リガンド14(「CXCL14」)、シスタチンC、デコリン(「DCN」)、Dickkopf関連タンパク質3(「Dkk−3」)、デルタ様タンパク質(「DLL1」)、フェチュインA、ヘパリン結合性増殖因子1(「aFGF」)、葉酸受容体アルファ(「FOLR1」)、フューリン、GPCR関連ソーティングタンパク質1(「GASP−1」)、GPCR関連ソーティングタンパク質2(「GASP−2」)、果粒球コロニー刺激因子受容体(「GCSFR」)、セリンプロテアーゼヘプシン(「HAI−2」)、インターロイキン−17B受容体(「IL−17B R」)、インターロイキン27(「IL−27」)、リンパ球活性化遺伝子3(「LAG−3」)、アポリポタンパク質A−V(「LDL R」)、ペプシノゲンI、レチノール結合タンパク質4(「RBP4」)、SOST、ヘパラン硫酸プロテオグリカン(「シンデカン−1」)、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー13B(「TACI」)、組織因子経路阻害物質(「TFPI」)、TSP−1、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー10b(「TRAIL R2」)、TRANCE、トロポニンI、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子(「uPA」)、カドヘリン5、CD144としても知られる2型またはVE−カドヘリン(血管内皮)(「VE−カドヘリン」)、WNTl誘導性シグナル伝達経路タンパク質1(「WISP−1」)、および核因子κ活性化受容体(「RANK」)が挙げられる。

0009

本発明の別の態様では、栄養膜系列分化する多能性幹細胞を含む癌ワクチンを使用し、前記多能性幹細胞は、中胚葉外胚葉、および内胚葉の組織に分化することができる細胞として定義され、さらに、前記多能性幹細胞は、以下の細胞群から選択される:(a)胚性幹細胞;(b)単為生殖由来幹細胞;(c)誘導性多能性幹細胞;(d)体細胞核移植由来幹細胞。

0010

本発明の別の態様では、癌ワクチンは、HLA−G、CD146、プロゲステロン胎盤増殖因子、および胎盤性ラクトゲンの発現のために最適化された栄養膜系列細胞を含む。本発明はさらに、多能性幹細胞から生成した栄養膜系列委任細胞の使用を提供し、この細胞は、FGF−2の非存在下でBMP−4により多能性幹細胞を処理することにより分化したものである。あるいは、分化は、BMP−4を供与しながら、アクチビンおよびFGF2シグナル伝達阻害剤多能性細胞曝露することにより行うことができる。

0011

本発明の別の態様では、栄養膜系列への分化は、細胞の支持細胞層の存在下でBMP−4を供与しながらアクチビンおよびFGF2シグナル伝達の阻害剤に前記多能性細胞を曝露することにより行なわれる。本発明のこの実施形態では、支持細胞層は、(a)哺乳動物胚線維芽細胞;(b)哺乳動物ケロイド組織由来細胞;(c)哺乳動物内皮細胞;および(d)哺乳動物間葉系幹細胞を含む群から選択される細胞で実質的に構成される。本発明の別の態様では、栄養膜分化細胞を、免疫原性を高めることができる薬剤に暴露するが、この薬剤は、栄養膜分化細胞上のMHCおよび/または1つもしくは複数の同時刺激分子の発現をアップレギュレートすることができる。

0012

本発明のさらに別の態様では、癌ワクチンを提供するが、この癌ワクチンでは、(a)CD80;(b)CD86;(c)CD40;(d)ICAM−1;(e)LFA−3;および(f)IL−12を含む分子の群から選択される分子の発現を誘導または実質的にアップレギュレートする、免疫原性を高めることができる薬剤で栄養膜を処理している。

0013

本発明の別の態様では、栄養膜または栄養膜様細胞に、免疫原性を高める分子をコードする遺伝子をトランスフェクトするが、前記分子は、(a)ABCF1、(b)TNF−アルファ;(c)TNF−ベータ;(d)BCL6、(e)補体C3;(f)補体C4A;(g)補体C5;(h)CEBPB;(i)CRP、(j)ICEBERG、(k)IL1R1、(l)IL1RN;(m)IL8RB;(n)LTB4R;(o)TOLLIP;(p)IFNA2;(q)IL12;(r)IL13RA1;(s)CD40L;(t)IFNA2;(u)IL17C;(v)IL18;(w)IL−21;(x)IL−22;(y)G−CSF;(z)GM−CSF;(aa)インターフェロンガンマ;(ab)HLAタンパク質の全体または構成部分;(ac)同種異系HLAタンパク質の全体または構成部分;および(ad)異種HLAタンパク質の全体または構成部分から選択される。

0014

本発明の一態様では、胎盤由来栄養膜、多能性由来栄養膜、または栄養膜が細胞の初期化により生成されたものであるかにかかわらず、免疫処置のために利用される細胞は、レシピエントに対して同種異系、異種、または同系である。レシピエントは、ヒト、イヌネコウマ、または他の哺乳動物を含む哺乳動物である。本発明の一態様では、癌ワクチンを提供するが、このワクチンは、十分量の末端炭水化物エピトープGalアルファ(1、3)Galの発現を誘導するようにアルファ−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼでトランスフェクトされている栄養膜または内皮細胞を含む。本発明の特定の一態様では、提供される癌ワクチンは、トランスフェクトされた細胞が、ヒト血液の存在下で補体カスケードの活性化を誘導することができるほど十分なレベルでトランスフェクトされているアルファ−1,3−ガラクトシルトランスフェラーゼ遺伝子を含有する。本発明の一態様では、栄養膜様細胞は多能性幹細胞から作製されるが、この栄養膜様細胞は、腫瘍生物活性を示す抗原の発現のために最適化されている。本発明の一態様では、腫瘍ワクチン接種に使用される栄養膜細胞は、前記多能性幹細胞から、(a)侵襲性;(b)免疫回避;および/または(c)血管新生を含む生物活性の群から選択される生物活性を発現するように分化している。

図面の簡単な説明

0015

本発明の一実施形態による、ブタ肝臓抽出物でも対照でもなく、ブタ胎盤ワクチン(異種)で免疫処置されたC57/BL6マウスにおけるB−16腫瘍増殖の予防を示す表である。
本発明の一実施形態による、ブタ肝臓抽出物でも対照でもなく、ブタ胎盤ワクチン(異種)で免疫処置されたC57/BL6マウスにおけるB−16腫瘍増殖の予防を示す表である。
本発明の一実施形態による、ブタ肝臓抽出物でも対照でもなく、ブタ胎盤ワクチン(異種)で免疫処置されたC57/BL6マウスにおけるB−16腫瘍増殖の予防を示す表である。
本発明の一実施形態による、アジュバントとして同系のDCを使用して、異種胎盤抽出物による免疫処置を示す表である。
本発明の一実施形態による、アジュバントとして同系のDCを使用して、異種胎盤抽出物による免疫処置を示す表である。
本発明の一実施形態による、アジュバントとして同系のDCを使用して、異種胎盤抽出物による免疫処置を示す表である。
本発明の一実施形態による、B16細胞溶解物ワクチン接種と異種胎盤ワクチン接種との間の相乗作用を示す表である。
本発明の一実施形態による、結腸癌マウスモデルの処置における異種胎盤抽出物の治療効果を示す表である。

0016

別段の記載がない限り、本文書中で使用される定義および科学用語は、当業者一般常識として解釈する意味を有する。本文書中で考察または参照される方法論は、当業者により一般に十分理解され、通常使用されるものである。さらに、別に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、開示の本発明が属する分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。具体的には、以下の用語および語句は以下の意味を有する。

0017

「癌の治療」、「癌の阻害」、「癌増殖の低減」は、癌細胞腫瘍形成活性を阻害または予防することを指す。腫瘍形成活性には、癌細胞の遊走浸潤薬剤抵抗性、細胞生存足場非依存性増殖細胞死シグナルに対する非応答性、血管新生、またはそれらの組合せを阻害することが含まれ得る。

0018

「癌」、「癌細胞」、「腫瘍」、および「腫瘍細胞」という用語は、本明細書中互換的に使用され、一般に、細胞の制御されない異常増殖(例えば、新生物)を特徴とする一群の疾患を指す。癌の一部の形態では、癌細胞は、局所的にまたは血流およびリンパ系を通して、他の身体各部に拡散することがある(「転移癌」)。「ex vivo活性化リンパ球」、「抗腫瘍活性が増強されたリンパ球」、および「樹状細胞サイトカインに誘導されたキラー」は、互換的に使用される用語であり、本発明の文脈内では、ex vivoで活性化され、その後再導入される細胞組成物を指す。

0019

「リンパ球」という単語が使用されるが、これには、樹状細胞、NKT細胞ガンマデルタT細胞、および他の種々の自然免疫および適応免疫細胞を含む、ex vivo培養工程中に広がった不均一細胞も含まれる。本明細書で使用される場合、「癌」は、白血病、癌腫、および肉腫を含む、動物に見出されるあらゆるタイプの癌または新生物または悪性腫瘍を指す。癌の非限定例としては、脳、黒色腫膀胱乳房子宮頸部結腸、頭頸部腎臓非小細胞肺、中皮腫卵巣前立腺、肉腫、子宮、および髄芽腫の癌がある。

0020

「白血病」という用語は、広義には、造血器官/系の進行性悪性疾患を意味し、一般に、血液および骨髄中の白血球およびその前駆体の異常な増殖および発生を特徴とする。白血病の非限定例としては、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病急性顆粒球性白血病慢性顆粒球性白血病急性前骨髄球性白血病成人T細胞白血病無白血病性白血病、白血球血症性白血病(leukocythemic leukemia)、好塩基球性白血病芽細胞性白血病、ウシ白血病、慢性骨髄球性白血病皮膚白血病胎生細胞性白血病、好酸球性白血病グロス白血病、リーダー細胞性白血病シリング白血病幹細胞性白血病亜白血性白血病未分化細胞性白血病有毛状細胞性白血病、血球芽細胞性白血病(hemoblastic leukemia)、血球芽細胞性白血病(hemocytoblastic leukemia)、組織球白血病、幹細胞性白血病、急性単球性白血病白血球減少性白血病リンパ性白血病リンパ芽球性白血病リンパ球性白血病リンパ向性白血病、リンパ様白血病、リンパ肉腫細胞性白血病、肥満細胞白血病、巨核球性白血病、小骨髄芽球性白血病単球性白血病骨髄芽球性白血病、骨髄球性白血病、骨髄顆粒球性白血病骨髄単球性白血病、ネーゲリ白血病、形質細胞白血病、形質細胞性白血病、および前骨髄球性白血病が挙げられる。

0021

「癌腫」という用語は、周辺組織に浸潤し、かつ/または生理学的および非生理学的細胞死シグナルに抵抗性で転移を起こしやすい上皮細胞で構成される悪性新生物を指す。癌腫の非限定的な例示的タイプとしては、腺房癌、小葉癌癌腫、腺様嚢胞癌腺癌副腎皮質癌、肺胞腺癌、肺胞上皮癌基底細胞癌(basal cell carcinoma)、基底細胞癌(carcinoma basocellulare)、類基底細胞癌基底扁平細胞癌(basosquamous cell carcinoma)、細気管支肺胞上皮癌、細気管支癌気管支原性癌大脳様癌、胆管細胞癌絨毛癌膠様癌面皰癌子宮体部癌篩状癌、鎧状癌皮膚癌円柱状癌、円柱細胞癌、腺管癌硬性癌胎生期癌脳様癌類表皮癌(epiennoid carcinoma)、腺上皮癌、外向発育癌、潰瘍癌、線維癌、膠様癌(gelatiniform carcinoma)、膠様癌(gelatinous carcinoma)、巨細胞癌印環細胞癌単純癌小細胞癌バレイショ状癌、回転楕円面細胞癌紡錘体細胞癌海綿様癌、扁平上皮癌有棘細胞癌様癌(string carcinoma)、血管拡張癌、毛細血管拡張症様癌、移行上皮癌結節癌(carcinoma tuberosum)、結節癌(tuberous carcinoma)、状癌、絨毛癌、巨大細胞癌、腺癌、顆粒膜細胞癌、毛母癌、血様癌、肝細胞癌ヒュルトレ細胞癌硝子状癌、副腎様癌(hypemephroid carcinoma)、乳児胎生期癌、上皮内癌(carcinoma in situ)、表皮内癌、上皮内癌(intraepithelial carcinoma)、クロムペッヘル癌(Krompecher´s carcinoma)、クルチツキー細胞癌(Kulchitzky−cell carcinoma)、大細胞癌レンズ状癌(lenticular carcinoma)、レンズ状癌(carcinoma lenticulare)、脂肪腫様癌、リンパ上皮癌、髄様癌(carcinoma medullare)、髄様癌(medullary carcinoma)、悪性黒色腫、軟性癌、粘液性癌、粘液分泌癌、粘液細胞癌、粘液性類表皮癌粘液癌、粘液性癌、粘液腫様癌、上咽頭癌燕麦細胞癌骨化性癌、類骨癌(osteoid carcinoma)、乳頭状癌門脈周囲癌、前浸潤癌、有棘細胞癌腫、軟性癌、腎臓の腎細胞癌予備細胞癌、肉腫様癌、シュナイダー癌、硬性癌、および陰嚢癌が挙げられる。

0022

「肉腫」という用語は、一般に、胎児結合組織のような物質で構成され、一般に、原線維性の不均一または均一な物質中に埋まった密に詰まった細胞で構成される腫瘍を指す。肉腫としては、以下に限定されるものではないが、軟骨肉腫線維肉腫、リンパ肉腫、黒色肉腫粘液肉腫骨肉腫子宮内膜肉腫、間質性肉腫、ユーイング肉腫筋膜肉腫、線維芽細胞肉腫、巨細胞肉腫、アバーネシー肉腫(Abemethy´s sarcoma)、脂肪肉腫(adipose sarcoma)、脂肪肉腫(liposarcoma)、胞巣状軟部肉腫エナメル上皮肉腫ブドウ状肉腫緑色腫肉腫(chloroma sarcoma)、絨毛癌、胎児性肉腫、ウィルムス腫瘍肉腫、顆粒球肉腫、ホジキン肉腫、特発性多発性色素性出血性肉腫、B細胞免疫芽球肉腫、リンパ腫、T細胞の免疫芽球肉腫、イエンセン肉腫カポジ肉腫クッパー細胞肉腫、血管肉腫白血肉腫悪性間葉腫肉腫、傍骨性骨肉腫、細網肉腫ラウス肉腫漿液嚢胞性肉腫、滑膜肉腫、および毛細血管拡張性肉腫が挙げられる。

0023

さらなる例示的な新生物としては、ホジキン病非ホジキンリンパ腫多発性骨髄腫神経芽細胞腫乳癌卵巣癌肺癌横紋筋肉腫原発性血小板血症原発性マクログロブリン血症小細胞肺腫瘍原発性脳腫瘍胃癌、結腸癌、悪性膵臓インスリノーマ(malignant pancreatic insulanoma)、悪性カルチノイド前癌皮膚病変精巣癌、リンパ腫、甲状腺癌、神経芽細胞腫、食道癌、泌尿生殖路癌、悪性高カルシウム血症子宮頸癌子宮内膜癌、および副腎皮質癌が挙げられる。

0024

本発明の一部の特定の実施形態では、治療される癌は黒色腫である。「黒色腫」という用語は、皮膚および他の器官メラニン細胞系から発生する腫瘍を意味すると解釈される。黒色腫の非限定例としては、ハーディング−パッセー黒色腫、若年性黒色腫、悪性黒子型黒色腫、悪性メラノーマ、末端黒子型黒色腫、無色性黒色腫、良性若年性黒色腫クラウドマン黒色腫(Cloudman´s melanoma)、S91黒色腫、結節性黒色腫、爪下黒色腫(subungal melanoma)、および表在拡大型黒色腫がある。

0025

用語「ポリペプチド」という用語は、「ペプチド」、「改変されたペプチドリガンド」、および「フルオロ炭酸ペプチド(flourocarbonated peptide)」と互換的に使用される。

0026

薬学的に許容される担体」という用語は、すべての溶媒分散媒コーティング剤抗菌剤および抗真菌剤等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。従来のいかなる媒体または薬剤でも、投与される活性化合物適合しない場合を除いて、医薬組成物中でそれを使用することが考えられる。二次的な活性化合物も本明細書に記載の組成物に組み込むことができる。

0027

「T細胞」という用語は、Tリンパ球とも呼ばれ、免疫応答に関与するリンパ球の中で胸腺に由来する細胞を意味する。T細胞には、CD8ポジティブT細胞(細胞傷害性T細胞:CTL)、CD4ポジティブT細胞(ヘルパーT細胞)、サプレッサーT細胞制御性T細胞などの調節性T細胞エフェクター細胞、ナイーブT細胞、記憶T細胞、TCRアルファ鎖およびベータ鎖を発現するアルファベータT細胞、およびTCRガンマ鎖およびデルタ鎖を発現するガンマデルタT細胞のいずれも含まれる。T細胞には、T細胞への分化が方向づけられているT細胞の前駆細胞が含まれる。

0028

「T細胞を含有する細胞集団」の例としては、血液(末梢血臍帯血等)および骨髄液などの体液に加えて、体液から採取、単離、精製、または誘導された末梢血単核細胞(PBMC)、造血細胞造血幹細胞臍帯血単核細胞等を含有する細胞集団が挙げられる。

0029

さらに、T細胞を含有しかつ造血細胞に由来する種々の細胞集団を、本発明では使用することができる。種々の実施形態では、これらの細胞は、in vivoまたはex vivoで、IL−2などのサイトカインにより活性化されたものでもよい。これらの細胞として、生体から採取された細胞またはex vivo培養により得られた細胞、例えば、本発明の方法により得られたそのままのT細胞集団または凍結保存により得られたT細胞集団のいずれも使用することができる。「抗体」という用語は、インタクトな分子および抗原結合部位を含むそのフラグメントの両方を含むことを意図する。全抗体構造は、H2L2として示される場合が多く、抗体が2つのアミノ酸軽鎖(L)と2つのアミノ酸重鎖(H)とを一般に含む事実を指す。両鎖とも、構造的相補的な抗原標的と相互作用することができる領域を有する。

0030

標的と相互作用する領域は、「可変」または「V」領域と呼ばれ、異なる抗原特異性の抗体とはアミノ酸配列が異なるという特徴がある。H鎖またはL鎖のいずれかの可変領域が、抗原標的に特異的に結合することができるアミノ酸配列を含有する。これらの配列内に、特異性が異なる抗体間で極端可変性があるため「超可変」と呼ばれるさらに小さな配列がある。このような超可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」領域とも呼ばれる。これらのCDR領域により、特定の抗原決定基構造に対する抗体の基本的な特異性が説明される。

0031

CDRは、可変領域内に不連続なアミノ酸ストレッチを示すが、種にかかわらず、可変重鎖および軽鎖領域内のこれらの重要なアミノ酸配列の所在位置は、可変鎖のアミノ酸配列内の同様な位置にあることが見出されている。すべての抗体の可変重鎖および軽鎖はそれぞれ、3つのCDR領域を有し、それぞれのCDRは、軽鎖(L)および重鎖(H)それぞれについて、他のCDR(LI、L2、L3、HI、H2、H3と称される)と連続していない。

0032

本発明による開示の抗体は、全面的に合成されたものであってもよく、抗体のポリペプチド鎖は合成され、おそらく、受容体として本明細書に開示のポリペプチドに対する結合について最適化されている。このような抗体は、キメラ抗体であってもヒト化抗体であってもよく、構造的に完全に四量体であっても二量体であってもよく、単一重鎖と単一軽鎖のみを含むものでもよい。

0033

「有効量」または「治療有効量」という用語は、治療される疾患状態の1つまたは複数の症状を治療、抑制、もしくは緩和するか、またはそうでなければ所望の薬理学的および/または生理的な効果を与える、特に選択した抗原に対するT細胞応答亢進させるのに十分な投与量を意味する。正確な投与量は、被験体に依存する変数(例えば、年齢、免疫系の健全性等)、疾患、および投与処置などの種々の要因に応じて変わることになる。

0034

「個体」、「宿主」、「被験体」、および「患者」という用語は、本明細書で互換的に使用され、以下に限定されるものではないが、霊長類、例えばヒト、ならびにマウスおよびラットなどのげっ歯類および他の実験動物を含む哺乳動物を指す。

0035

本明細書で使用される場合、「治療レジメン」という用語は、疾患の治療、あるいは所望の生理学的変化、例えば、抗原または免疫源に対する免疫系の応答の増大または低下、例えば、そのような応答に関与する1つまたは複数の細胞または細胞型の数または活性の増大または低下を達成するための方法を指し、前記治療または方法は、動物、例えば哺乳動物、特にヒトに、疾患を有効に治療するかまたは前記生理学的変化をもたらすのに十分な量の、前記レジメンの2つ以上の化学薬剤または成分を投与することを含み、前記化学薬剤または成分は、同じ組成物の一部としてなど一緒に投与されるか、または個別にかつ同時もしくは異なる時に独立して投与され(すなわち、各薬剤または成分の投与は、その薬剤または成分の1つまたは複数とは、有限時間分離される)、前記1つまたは複数の薬剤または成分の投与により、単独でまたは分離して投与される場合における前記薬剤または成分のいずれの投与よりも良好な結果が得られる。

0036

アネルギー」および「不応答性」という用語は、刺激、例えば活性化受容体またはサイトカインによる刺激に対する免疫細胞の不応答性を含む。アネルギーは、例えば、免疫サプレッサーへの曝露または高用量の抗原への曝露により起こり得る。そのようなアネルギーは、一般に抗原特異的であり、寛容化する抗原への曝露が終了した後でも継続する。例えば、T細胞および/またはNK細胞におけるアネルギーは、サイトカイン、例えばインターロイキン(IL)−2を産生しないことを特徴とする。T細胞アネルギーおよび/またはNK細胞アネルギーは、T細胞および/またはNK細胞の抗原への曝露に際して、第1のシグナル(TCRまたはCD−3を介するシグナル)が、第2のシグナル(共刺激シグナル)の非存在下で受け取られる場合に、部分的に生じる。

0037

用語「T細胞機能の増強」、「細胞傷害性の増強」、および「活性の増強」は、T細胞および/またはNK細胞のエフェクター機能が向上していることを意味する。T細胞および/またはNK細胞の機能の増強には、本発明を限定するものではないが、T細胞および/またはNK細胞の増殖速度の亢進、サイトカインの産生量の増加、または細胞傷害性の亢進が含まれる。さらに、T細胞および/またはNK細胞の機能の増強には、アネルギー(不応答)状態などの抑制状態または休止状態にあるT細胞および/またはNK細胞の寛容性解除および抑制、すなわち、T細胞および/またはNK細胞が抑制状態から、T細胞および/またはNK細胞が外部からの刺激に対して応答する状態に移ることが含まれる。

0038

「発現」という用語は、遺伝子、ポリヌクレオチド、およびオリゴヌクレオチドなどの核酸から、転写によりmRNAが生成すること、またはmRNAから転写によりタンパク質もしくはポリペプチドが生成することを意味する。発現は、RT−PCR、ノーザンブロット、またはin situハイブリダイゼーションを含む手段により検出することができる。

0039

「発現の抑制」は、抑制がない場合と比較して、転写産物量または翻訳産物量が顕著に減少することを指す。本明細書における発現の抑制は、例えば、30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは70%以上、最も好ましくは90%以上の転写産物量または翻訳産物量の減少を示す。

0040

栄養膜は、ヒト胎盤の形成に関与する細胞の前駆体となる細胞である。が分化を開始する場合、胚盤胞の段階では、内部細胞塊中の細胞は胚になる細胞を形成するようにコミットされているが、胚盤胞の外部細胞は胎盤の発生に関与するようにコミットされるようになる。ヒト栄養膜細胞株は、形質転換された胎盤細胞から作製されたものであるが、これは本発明の実施に有用となり得る。本発明の実施において、「栄養膜」には、比較的未分化絨毛性細胞栄養膜、中間の細胞栄養膜、最終分化した絨毛性合胞栄養膜、および母体脱落膜に浸潤する絨毛性細胞栄養膜が含まれる。これらの分化した栄養膜は、推定される栄養膜幹細胞集団から発生し、絨毛状の基底膜に細胞集団が含有されると提案されている。

0041

本発明の一実施形態では、第1のトリメスター期間(妊娠週目から9週目の間)に妊娠を終了することを自発的に選んだ患者から絨毛膜絨毛組織を得る。HEPES(25mmol)、DNアーゼ1、およびコラゲナーゼ(15U/ml)(Sigma,St.Louis,USA)を含有するハンクス平衡塩類溶液(HBSS)中、37℃で30分間、撹拌しながら組織を細かく刻み分離することにより、絨毛性栄養膜細胞層細胞を単離する。分散した細胞を、網ふるい(直径40μmの孔)による濾過により分離し、10%FCSの存在下で保存する。パーコール勾配遠心分離の後、細胞を、約1×106個の単分散細胞の状態で得る。細胞は種々の培地中で培養することができ、一実施形態では、栄養膜細胞層細胞を、10%ウシ胎仔血清と1%ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したRPMI培地中で培養する。培養物への他の添加物、例えば、2mMのL−グルタミン、100uMの2−メルカプトエタノール、およびマウス胚線維芽細胞の馴化培地を使用してもよい。

0042

本明細書で使用される場合、「1つ(「a」または「an」)」という単語は、特許請求の範囲および/または明細書中の「含む(comprising)」という用語と併せて使用される場合、「1つ」を意味し得るが、「1つまたは複数」、「少なくとも1つ」、および「1つまたは2つ以上」の意味とも一致する。

0043

「有する(having)」、「含む(including)」、「含有する(containing)」、および「含む(comprising)」という用語は、互換的であり、これらの用語がオープンエンド形式の用語であることを当業者は承知している。

0044

胚性生殖細胞」または「EG細胞」は、精子または卵子を生じるように運命づけられている胚または胎仔始原生殖細胞に由来する細胞である。EG細胞は、本発明により培養することができる胚性幹細胞の1つである。

0045

「胚性幹細胞」または「ES細胞」は、動物(例えば、ヒトなどの霊長類)の胚、好ましくは、約8週齢未満の胚から得られる細胞である。始原的な胚性幹細胞を単離するために好ましい胚形成期には、着床前段階の胚の桑実胚または胚盤胞段階が含まれる。細胞を幹細胞とみなすための周知の基準を本明細書では用いるとする。例えば、参照によりその内容全体が組み込まれる、Hoffman and Carpenter,Nature Biotech.23:699−708,2005を参照されたい。

0046

細胞外マトリックス」(ECM)または「マトリックス」とは、支持細胞により合成される細胞外マトリックスにより提供される状態と同じ細胞増殖を支持する状態を実質的に提供する1つまたは複数の物質を指す。マトリックスは基質上に用意することができる。あるいは、マトリックスを含む成分は、溶液で用意することができる。このように、ECMは、細胞の外部に固定化される分泌分子を基本的にすべて包含する。ECMは、in vivoでは、細胞外空間秩序を与え、分化した組織および器官を確立、分離、および維持することと関連する機能を果たす。ECMは、例えば結合組織および基底膜の中に見出される複雑な構造であり、基底層とも呼ばれる。結合組織は、典型的には、細胞から天然に分泌されるECMに取り囲まれた単離細胞を含有する。ECMの成分は、増殖因子および分化因子、サイトカイン、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)、組織メタロプロテアーゼ阻害因子(TIMP)、および細胞の増殖、遊走、および分化を調節する他の可溶性因子と相互作用および/または結合することが示されている。ECMおよびその成分の説明は、とりわけ、Guidebook to the Extracellular Matrix,Anchor,and Adhesion Proteins,2d ed.,Kreis and Vale,eds.,Oxford University Press,1999(「Kreis et al.」);Geiger et al.,Nature Reviews Molecular Cell Biology 2:793−803,2001;lozzo,Annual Review of Biochemistry,1998,Annual Reviews,Palo Alto,Calif.;Boudreau and Jones,Biochem.J.339:481−88,1999;Extracellular Matrix Protocols,Streuli and Grant,eds.,Humana Press 2000;Metzler,Biochemistry the Chemical Reactions of Living Cells,2d ed.,vol.1,2001,Academic Press,San Diegoに見つけることができる。これらのそれぞれは、その内容全体が参照により組み込まれる。

0047

「多能性」とは、必ずしもすべての細胞型である必要はないが、複数の異なる細胞型の1つに分化することができる細胞を指す。多能性細胞の非限定的な例示的クラスとして、胚性幹細胞があり、これは人体のいかなる細胞型にも分化することができる。したがって、多能性細胞は、複能性細胞(multipotent cell)および他の分化が進行した細胞型に分化することができるが、逆分化過程(すなわち、脱分化)は、もっと複雑であると考えられ、初期状態に近くなるように細胞の「初期化」を必要とすることが認識されよう。これは、初期化後、細胞は初期化前に可能であった細胞型よりも多くのまたは異なる細胞型に分化する能力を有するようになることを意味する。本発明により培養される、霊長類の始原幹細胞を含む幹細胞は、任意の適切な技術を使用して任意の適切な供給源から得ることができる。例えば、ヒト始原幹細胞を単離し増殖させるための手順は、米国特許第6,090,622号明細書に記載されている。アカゲザルおよび他の非ヒト霊長類の始原幹細胞を得るための手順は、国際公開第96/22362号パンフレットに記載されている。加えて、アカゲザルの始原幹細胞を単離するための方法は、Thomson,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844−7848,1995に記載されている。

0048

「幹細胞」には、ヒトまたは非ヒト供給源由来にかかわらず、いかなる幹細胞または前駆細胞も含まれ、また前駆細胞の特徴を保持する、幹細胞由来の細胞も含まれる。ヒト胚性幹細胞(hESC)は、例えば、ヒトのin vivo着床前胚、in vitro受精胚、または胚盤胞段階に拡大増殖した1細胞ヒト胚から得られる胚盤胞から単離することができる。例えば、Bongso,et al.(1989),Hum.Reprod.4:706を参照されたい。

0049

ヒト胚は、G1.2およびG2.2培地中で培養して胚盤胞段階にすることができる。例えば、Gardner,et al.,Fertil.Steril.69:84(1998)を参照されたい。プロナーゼ(Sigma)に短時間曝露することにより胚盤胞から透明帯を除去する。内部細胞塊は、免疫手術または機械的分離により単離することができ、マウス胚支持細胞層上にまたは本明細書に記載の合成培養系に播種する。9〜15日後、内部細胞塊に由来する増殖物は、1mMのEDTAを含む、カルシウムおよびマグネシウム不含リン酸緩衝生理食塩水PBS)に曝露するか、ディスパーゼ、コラゲナーゼ、もしくはトリプシンに曝露するか、またはマイクロピペットにより機械的に解離させることにより、凝集塊に解離させる。次いで、解離細胞を、前のように新たな培地中に再播種し、コロニー形成について観察する。未分化形態を示すコロニーを、マイクロピペットにより個々に選択し、機械的に解離して凝集塊にし、再播種する。

0050

胚性幹細胞様形態は、見かけ上高い核対細胞質比および目立つ核小体を有するコンパクトなコロニーとして特徴付けられる。次いで、得られた胚性幹細胞を、短時間トリプシン処理し、ダルベッコのPBS(カルシウムもマグネシウムも不含で、2mMのEDTAを含有)に曝露し、IV型コラゲナーゼ(約200U/mL)に曝露することによって、または例えばマイクロピペットを使用して機械的に解離させることにより個々のコロニーを選択することによって、1〜2週間ごとにルーチン的に分割する。

0051

幹細胞は、単細胞レベルにおいて、自己再生する能力ならびに自己再生前駆体、非再生前駆体、および最終分化細胞を含む子孫細胞を産生するように分化する能力の両方を有することによって定義される未分化細胞である。幹細胞はまた、複数の胚葉(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)から種々の細胞系列機能細胞にin vitroで分化する能力、および移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、かつ胚盤胞への注入後にすべてではないにしてもほとんどの組織に実質的に寄与する能力によっても特徴づけられる。

0052

幹細胞は、以下のようにその発生上の能力により分類される:(1)全能性−すべての胚細胞型および胚外細胞型を生じさせることができる;(2)多能性−すべての胚細胞型を生じさせることができる;(3)複能性−細胞系列のサブセットであるが、特定の組織、器官、または生理系内のすべてを生じさせることができる(例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生)、血液細胞に限定される少能性(oligopotent)前駆体、および血液の正常成分であるすべての細胞型および要素(例えば、血小板)を含む子孫を産生することができる);(4)少能性−複能性幹細胞よりも限定された細胞系列のサブセットを生じさせることができる;および(5)単能性単一細胞系列を生じさせることができる(例えば、精子形成幹細胞)。

0053

癌は、種々の型の悪性新生物および腫瘍を指し、原発腫瘍および腫瘍転移を含む。本発明のセンサーアレイおよび系により検出することができる癌の非限定例としては、脳、卵巣、結腸、前立腺、腎臓、膀胱、乳房、肺、口腔、および皮膚の癌がある。癌の特定例としては、癌腫、肉腫、骨髄腫、白血病、リンパ腫、および混合型腫瘍がある。特定の腫瘍カテゴリとしては、リンパ球増殖性疾患、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、子宮頸癌、子宮体癌骨癌肝癌、胃癌、結腸癌、膵臓癌、甲状腺癌、頭頸部癌中枢神経系の癌、末梢神経系の癌、皮膚癌、腎臓癌、および上記のすべての癌の転移が挙げられる。特定の腫瘍型としては、肝細胞癌、肝細胞腫肝芽腫、横紋筋肉腫、食道癌、甲状腺癌、神経節芽細胞腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング腫瘍平滑筋肉腫横紋皮肉腫(rhabdotheliosarcoma)、浸潤性腺管癌、乳頭腺癌、黒色腫、肺有棘細胞癌、基底細胞癌、腺癌(高分化型、中分化型低分化型、および未分化型)、細気管支肺胞上皮癌、腎細胞癌、副腎腫、副腎様腺癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、精巣腫瘍小細胞肺癌非小細胞肺癌、および大細胞肺癌を含む肺癌、膀胱癌神経膠腫星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫上衣腫松果体腫網膜芽細胞腫、神経芽細胞腫、結腸癌、直腸癌、すべての型の白血病を含む造血悪性腫瘍、ならびに急性骨髄性白血病急性骨髄球性白血病急性リンパ球性白血病慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、肥満細胞白血病、多発性骨髄腫、骨髄性リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫が挙げられる。

0054

「実質的に未分化」とは、幹細胞(例えば、霊長類始原幹細胞)の集団が、少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約60%、70%、または80%、さらにより好ましくは少なくとも約90%の未分化幹細胞を含有することを意味する。所望の未分化状態(例えば、始原状態)を表す1つまたは複数のマーカーに対する標識抗体またはレポーター遺伝子/タンパク質(例えば、高感度緑色蛍光タンパク質またはEGFP)を使用する蛍光標識細胞分取を使用して、所与の幹細胞集団のうち未分化の細胞の数を測定することができる。この評価を行う目的で、未分化状態と関連する1つまたは複数の細胞表面マーカー(例えばOct−4、SSEA−4、Tra−1−60およびTra−1−81)を検出することができる。

0055

テロメラーゼ逆転写酵素(TERT)活性およびアルカリホスファターゼアッセイすることができる。霊長類始原幹細胞の文脈において、ポジティブおよび/またはネガティブセレクションを使用して、例えば、免疫染色またはレポーター遺伝子(例えば、EGFP)の使用によって、特定のマーカーの発現(またはその欠如)(例えば、Oct−4、SSEA4、Tra−1−60、Tra−1−81、SSEA−1、SSEA−3、ネスチンテロメラーゼ、Myc、p300、およびTip60ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、およびアルカリホスファターゼ活性)、または特定の翻訳後修飾(例えば、アセチル化ヒストン)の存在を検出することができ、それによって自己再生または細胞分化の状態の評価が容易になる。

0056

「全能性」とは、以下に限定されるものではないが、胚性幹細胞、神経幹細胞骨髄幹細胞、造血幹細胞、心筋細胞神経細胞星状細胞筋細胞、および結合組織細胞など、多能性細胞、複能性細胞、および完全に分化した細胞(すなわち、種々の細胞型にもはや分化できない細胞)を含む、いかなる細胞型にも分化することができる細胞を指す。分子遺伝学および遺伝子工学一般的方法は、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」(Sambrook,et al.,Cold Spring Harbor);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller & Calos eds.);および「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel,et al.eds.,Wiley & Sons)の最新版に記載されている。細胞生物学、タンパク質化学、および抗体技術は、「Current Protocols in Protein Science」(Colligan,et al.eds.,Wiley & Sons);「Current Protocols in Cell Biology」(Bonifacino,et al.,Wiley & Sons)、および「Current Protocols in Immunology」(Colligan et al.eds.,Wiley & Sons.)に見つけることができる。本開示で言及された遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech、およびSigma−Aldrich Coなどの商用ベンダーから入手可能である。

0057

量、一定期間等の計測可能な値に言及する場合に本明細書で使用される「約」とは、所定値の±20%、±10%、±5%、±1%、および±0.1%の変動を包含することを意図するものであり、このような変動は開示方法の実施にとって妥当なものである。

0058

本発明の特定の実施形態を以下に記載する。本発明の実施形態では、免疫抑制および腫瘍抗原の供給源として異種胎盤の利用を教示する。異種胎盤またはそれに由来する生成物を使用するレシピエントの免疫処置によって、免疫抑制因子および腫瘍関連腫瘍抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この免疫応答により、胎盤で見出される免疫抑制化合物相同性を有する内因性免疫抑制因子が中和され得る。この調製物の異種成分が、同種異系の胎盤組織による免疫処置に比較して、より強固な免疫応答を刺激することにとって重要であることが発見された。具体的には、癌に罹患した宿主を、当技術分野で公知の方法により精製された胎盤抽出物で免疫処置することができる。本発明の具体的な適用としては、以下に限定されるものではないが、ヒト癌患者への免疫処置のためにブタ由来の異種胎盤を利用することが可能である。分娩する雌ブタから得られる胎盤組織を入手して、5%のペニシリン−ストレプトマイシン混合物を含有する無菌リン酸緩衝生理食塩水中で洗浄する。次いで、50mlのチューブに入れた胎盤組織(約1gの組織/チューブ)を、電子ホモジナイザー(Ultra Turrax T25−S1;Janke & Kunkel KG,Staufen,Germany)を使用して、無菌生理食塩水中で直ちにホモジナイズする。ホモジナイゼーションに続いて、チューブを1000gで1時間回転させ、組織デブリペレットにする。次いで、全タンパク質内容物を当技術分野で公知の方法を使用して濃縮する。

0059

特定の一実施形態では、胎盤タンパク質の濃縮は、Waters Corp.製のSep−Pak C18カートリッジなどの固相抽出カラムによって遂行する。別の実施形態では、上清凍結乾燥し、脱塩用の1000Da超の透析チューブ中で濃縮する。次いで、精製されたタンパク質を、腫瘍免疫処置に関する以前の研究に基づいて、1,125ug〜2,000ugの間の濃度で患者に注射する。例えば、Hollinshead,A.C.,T.H.Stewart,and R.B.Herberman,Delayed−hypersensitivity reactions to soluble membrane antigens of human malignant lung cells.J Natl Cancer Inst,1974.52(2):p.327−38を参照されたい。注射スケジュールとしては、腕の三角筋部などへの皮下投与での月1回の注射が挙げられる。

0060

注射プロトコールは、患者の必要性に応じて調整することができる。加えて、免疫処置は、当技術分野で公知の他の方法によって実施してもよく、例えば、注射(例えば、皮下、皮内、筋肉内)、エアロゾル、経口、経皮髄腔内、経粘膜、胸膜腔内、または一般に使用される経路によるものがある。ワクチン調製物変更形態には、アジュバントとの同時投与、またはDCをパルスするための抗原供給源としてのタンパク質調製物の利用、およびワクチン接種調製物としてのパルスDCの使用を挙げることができる。

0061

本発明の別の実施形態には、ワクチン源としての精製されたブタ栄養膜の投与がある。前記栄養膜は、当技術分野で公知の方法により精製することができる。一方法は以下のとおりである:約30gの胎盤絨毛の塊を生理食塩水中ですすぎ、膜および結合組織から分離し、次いで、はさみで粗く切り刻み、0.185%のトリプシン、25mMのHEPES、および0.4mg/mlのI型DNアーゼを含有する、カルシウムおよびマグネシウム不含のハンクス液に移す。次いで、5分ごとに撹拌しながら、37℃で30分間、水浴中で組織をインキュベートする。次いで、上清のアリコート子ウシ血清の上に重層し、室温で5分間、1000gで遠心する。次いで、ペレットをパーコール勾配の上に重層し、Reis,F.M.,et al.,Corticotropin−releasing factor,urocortin and endothelin−1 stimulate activin A release from cultured human placental cells.Placenta,2002.23(6):p.522−5にある報告のように、約35%パーコールレベルを使用して精製する。前記栄養膜は、サイトケラチンビメンチン、およびCD45の染色により判定すると、約95%の純度である。栄養膜は、必要に応じて、約107〜108個の細胞を癌患者に注入することができる。あるいは、精製された栄養膜は、ワクチン接種のための異種タンパク質源として利用することができる。タンパク質抽出は、当技術分野で詳細に記載されており、凍結融解サイクルまたはホモジナイザーの使用により実施することができる。

0062

他の栄養膜細胞株が、マウス、ブタ、およびヒトを含む種々の種から作製されている。これらの代替細胞株の異種レシピエントへの利用は、本発明の他の実施形態を表わす。増殖および成長を阻害するために、細胞株を照射することができる。免疫原性を高めるために、インターフェロンガンマまたは細胞上のMHCIIなどの免疫原性分子の発現を増大させることが公知の他の薬剤による前処理によって免疫刺激分子を発現するように、栄養膜細胞株を誘導する。細胞株の免疫原性は、以下の方法など当技術分野で公知の方法により高めることができる:(1)免疫刺激サイトカインまたは膜タンパク質、例えば、それぞれIL−1、IL−2、IL−4、IL−12、TNF−アルファ、GM−CSF、またはMHC I、MHC II、CD40、CD80、CD86によるトランスフェクション;(2)高熱またはフリーラジカルストレスなどの「ストレッサー」の投与;および/または(3)IL−10など内因的に発現される免疫抑制分子の阻害。

0063

DCのトランスフェクションのために胎盤抽出物由来のmRNAを利用することにより、開示の本発明を実行する別の方法が生まれる。胎盤組織由来のRNAは、Trizol試薬の利用など当技術分野で公知の方法を使用して抽出することができる。DCにトランスフェクトされた精製RNAから、内因性経路を介してDCによりプロセシングされるようになる抗原タンパク質翻訳が始まる。この方法は、腫瘍由来RNAを使用して腫瘍ワクチンを作製するためにGilboaのグループが利用した。トランスフェクトされたDCは、LPSおよび/もしくはTNF−アルファ、ならび/またはポリ(IC)などのtoll様受容体(TLR)アゴニストの投与など当技術分野で公知の方法を使用して成熟するように誘導することができる。次いで、成熟または未成熟DCを、免疫刺激のために癌患者に注入することができる。

0064

抗異種応答は高度に強力かつ強固であるが、アジュバントの添加により、胎盤調製物の免疫原性をさらに高めることができる。免疫刺激に適したアジュバントは当業者に周知であり、BCG、De−Tox、または非メチル化cpgモチーフとの同時投与が含まれる。

0065

一実施形態では、本発明は、殺腫瘍能を有する細胞集団を生成させる手段を提供する。具体的には、50mlの末梢血を癌患者から採取し、フィコール法を使用して末梢血単核細胞(PBMC)を単離する。次いで、PBMCを10mlのSTEM−34培地に再懸濁し、プラスチック表面上に2〜4時間付着させる。次いで、ハンク緩衝生理食塩水(HBSS)中で緩やかに洗浄することにより非付着細胞を除去した後、付着細胞を、1,000U/mLの顆粒球−単球コロニー刺激因子および500U/mLのIL−4を添加したSTEM−34培地中で37℃にて培養する。GM−CSFおよびIL−4を添加した培地の容量の半分を一日おきに交換する。未成熟DCを7日目に回収する。

0066

特定の実施形態では、作製したDCを使用して、異種抗原と共インキュベートすることにより、T細胞およびNK細胞の殺腫瘍活性を刺激する。異種抗原の供給源としては、以下に限定されるものではないが、異種腫瘍またはその抽出物が挙げられる。種々の実施形態では、T細胞および/またはNK細胞を活性化するために、栄養膜抽出物を使用してin vitroでヒト樹状細胞をパルスする。栄養膜抽出物は、胎盤組織、または高濃度の栄養膜を含有するように精製された胎盤組織を溶解させることにより作製する。より具体的には、抗原として使用する前に、栄養膜をin vitroで培養して増殖させる。

0067

ヒト胎盤に加えて、ブタ、マウス、イヌ、ウシ、ウマの栄養膜を使用することができる。特定の一実施形態では、血絨毛型胎盤を有する哺乳動物の胎盤から栄養膜を単離する。具体的には、作製したDCは、フローサイトメトリーソーティングまたは磁気活性化セルソーティング(MACS)を使用して培養物からさらに精製してもよく、または半精製集団として患者に投与してもよい。DCは、in vivoでNKおよびT細胞活性を刺激するというコンセプトの下で、治療を必要とする前記患者に加えてもよく、あるいは、他の実施形態では、T細胞および/またはNK細胞を含有する細胞集団と共にin vitroでインキュベートしてもよい。

0068

種々の特定の実施形態では、in vitroで成熟を刺激することができる薬剤にDCを曝露する。in vitroで成熟を刺激する非限定的手段としては、DCまたはDC含有集団をtoll様受容体アゴニストと培養することが挙げられる。DC成熟を達成する別の手段には、約20ng/mL濃度のTNF−アルファにDCを曝露することがある。

0069

in vitroでT細胞および/またはNK細胞を活性化するために、約1000IU/mlのインターフェロンガンマを含有する培地中で細胞を培養する。インターフェロンガンマと一緒のインキュベーションは、2時間〜7日間実施することができる。好ましい実施形態では、インキュベーションを約24時間実施し、その後T細胞および/またはNK細胞を、胎盤抗原の存在下で、CD3およびCD28により刺激する。胎盤抗原は、同種異系、同系、または異種である。これを達成する一手段として、これらの受容体を活性化することができる抗体の添加によるものがある。

0070

例示的な一実施形態では、約1ug/mlの抗CD28と一緒に、約2ug/mlの抗CD3抗体を添加する。T細胞およびNK細胞の生存を促進しかつ増殖を刺激するために、T細胞/NK有系分裂促進物質を使用する。特定の一実施形態では、サイトカインIL−2を利用する。本発明の実施に有用なIL−2濃度の一例は、約500u/mLである。IL−2および抗体を含有する培地は、約8〜14日間、48時間ごとに交換する。特定の一実施形態では、腫瘍細胞に対する細胞傷害活性を付与するために、T細胞および/またはNK細胞にDCを含める。特定の実施形態では、T細胞および/またはNK細胞のアポトーシスの割合を低下させるように、カスパーゼ阻害剤を培養物に添加する。作製した細胞を、以下に限定されるものではないが、皮内、筋肉内、皮下、腹腔内、動脈内、静脈内(カテーテル留置を含む)、腫瘍内、または輸入リンパ管中を含む、適切な手段によって被験体に投与する。

0071

一実施形態では、異種免疫処置による腫瘍への免疫刺激は、IL−2などの公知の免疫刺激剤と組み合わせることができる。過剰免疫処置が有害事象をもたらし得る場合、免疫刺激と一緒に静脈内アスコルビン酸(AA)を利用することが、本明細書に提供される本発明により企図される。AAには全身性炎症プロセスに有益な効果がある。例えば、敗血症様状態を誘導するためにクレブシエラ肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)をチャレンジした後、アスコルビン酸欠乏動物では、対照に比較して、3倍高い死亡率が観察されることが、一マウス実験で示された。例えば、Gaut,J.P.,et al.,Vitamin C fails to protect amino acidsand lipids from oxidation during acute inflammation.Free Radic Biol Med,2006.40(9):p.1494−501;およびTyml,K.,F.Li,and J.X.Wilson,Septic impairment of capillary blood flow requires nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase but not nitric oxide synthase and is rapidly reversed by ascorbate through an endothelial nitric oxide synthase−dependent mechanism.Crit Care Med,2008.36(8):p.2355−62を参照されたい。

0072

他の実験では、AAを過剰補給すると、敗血症関連低血糖微小循環異常、および内皮応答性の鈍化に関し良好なアウトカムがもたらされることが示された。例えば、Shen,K.P.,et al.,Antioxidant eugenosedin−A protects against lipopolysaccharide−induced hypotension,hyperglycaemia and cytokine immunoreactivity in rats and mice.J Pharm Pharmacol,2005.57(1):p.117−25;Tyml,K.,F.Li,and J.X.Wilson,Delayed ascorbate bolus protects against maldistribution of microvascular blood flow in septic rat skeletal muscle.Crit Care Med,2005.33(8):p.1823−8;Wu,F.,K.Tyml,and J.X.Wilson,Ascorbate inhibits iNOS expression in endotoxin− and IFNgamma−stimulated rat skeletal muscle endothelial cells.FEBSLett,2002.520(1−3):p.122−6;Wu,F.,J.X.Wilson,and K.Tyml,Ascorbate inhibits iNOS expression and preserves vasoconstrictor responsiveness in skeletal muscle of septic mice.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol,2003.285(1):p.R50−6;およびWu,F.,J.X.Wilson,and K.Tyml,Ascorbate protects against impaired arteriolar constriction in sepsis by inhibiting inducible nitric oxide synthase expression.Free Radic Biol Med,2004.37(8):p.1282−9を参照されたい。

0073

本明細書に開示の免疫刺激調製物の治療効果を最適化するために、これらの発見を利用することは本発明の範囲内である。AAの使用のさらなる支持は、AAおよびビタミンEを使用して、敗血症性患者(免疫過剰活性化状態を示す敗血症)で実施された無作為化臨床試験から得られ、これは、酸化ストレスパラメーターの低下と同様に、優れたアウトカムを示している。

0074

最近の一試験では、全身性炎症の患者においてAAを単独で評価した。研究者らは、全身表面積の30%超が傷害された熱傷患者について検討した。患者に静脈内AAをi.v.投与するか(66mg/kg/時を24時間、n=19)、または標準医療のみを施した(対照、n=18)。AA処置により、24時間全輸液量および体液貯留(血管の漏出を示す)の統計的に有意な減少がもたらされた。おそらく最も顕著なことは、機械的人工呼吸の必要性の低下であった:処置群は、平均12.1±8.8日間必要としたが、一方対照群は21.3±15.6日間必要とした。例えば、Tanaka,H.,et al.,Reduction of resuscitation fluid volumes in severely burned patients using ascorbic acid administration:a randomized,prospective study.Arch Surg,2000.135(3):p.326−31を参照されたい。

0075

血管漏出症候群に伴う数多くの炎症性マーカーがSIRSおよび重篤な熱傷患者でも見出されることを考慮すると、AAが、IL−2療法に対して、毒性見込みの軽減および効力の促進の両方によるいくらかの有益な効果を及ぼし得る可能性が提示される。

0076

本発明の一部の実施形態では、精製されたリンパ球集団と一緒に異種応答性免疫細胞の培養を実施する。例えば、細胞集団とT細胞を含有する細胞亜集団とを分離するステップを、例えば密度勾配遠心分離による単核細胞画分分画または指標としてT細胞の表面マーカーを使用する分離手段により実施することができる。次いで、表面マーカーに基づいた単離を実施することができる。表面マーカーの非限定例としては、CD3、CD8、およびD4が挙げられ、これらの表面マーカーに依存する分離法は当技術分野で公知である。

0077

例えば、このステップは、抗CD8抗体が固定化されているビーズなどの担体または培養容器を、T細胞を含有する細胞集団と混合し、担体に結合したCD8ポジティブT細胞を回収することによって、実施することができる。抗CD8抗体が固定化されているビーズとして、例えば、CD8 MicroBeads、Dynabeads M450 CD8、およびEligix抗CD8 mAbコーティングニッケル粒子が好適に使用されている。

0078

これは、指標としてCD4を使用して実施することでも同じであり、例えば、CD4 MicroBeads、Dynabeads M−450 CD4も使用することができる。本発明の一部の実施形態では、培養の開始前に制御性T細胞を枯渇させる。制御性T細胞の枯渇は、ニューロピリン、CD25、CD4、CTLA4、および膜結合性TGF−ベータなどのマーカーを発現する細胞を除去することによるネガティブセレクションにより実施することができる。当業者による実験は、腫瘍死滅および腫瘍部位への遊走の両方に関して最大活性を有するエフェクターリンパ球または細胞傷害性細胞を生成させるために種々の培養条件で実施することができる。例えば、細胞集団およびT細胞を含有する細胞亜集団を培養するステップは、細胞集団に応じた適切な公知の培養条件を選択することにより実施することができる。

0079

加えて、癌細胞に由来する異種抽出物を使用して細胞集団を刺激するステップでは、栄養膜または栄養膜様細胞が培養を行う培地に加えられる。例えば、サイトカイン、ケモカイン、または他の成分を培地に添加することができる。本明細書では、サイトカインは、T細胞に作用することができる限り、特に限定されることはなく、その例としては、IL−2、IFN−ガンマ、形質転換増殖因子(TGF)−ベータ、IL−15、IL−7、IFN−アルファ、IL−12、CD40L、およびIL−27が挙げられる。

0080

細胞性免疫を増強する観点から、特定の実施形態では、IL−2、IFN−ガンマ、またはIL−12が使用され、またin vivoでの移入T細胞の生存を向上させる観点からは、IL−7、IL−15、またはIL−21が使用される。加えて、ケモカインは、T細胞に作用し、遊走活性を示す限り、限定されない。その非限定例としては、RANTES、CCL21、MlPlアルファ、MlPlベータ、CCL19、CXCL12、IP−10、およびMIGが挙げられる。細胞集団の刺激は、T細胞の表面上に存在する分子、例えばCD3、CD28、もしくはCD44に対するリガンド、および/またはその分子に対する抗体の存在によって実施することができる。

0081

さらに、細胞集団は、細胞表面上の癌抗原に由来するペプチドなどの標的ペプチドを提示する抗原提示細胞(樹状細胞)などの他のリンパ球と接触させることにより刺激することができる。特定の一実施形態では、栄養膜を使用して、in vivo投与前にin vitroで増殖または感作されるようにT細胞および/またはNK細胞を刺激する。エンドポイントとして細胞障害性および遊走を評価することに加えて、T細胞活性を評価する他の手段に基づいて細胞産物を最適化することも本発明の範囲内である。例えば、本発明の方法におけるT細胞の機能増強は、サイトカインアッセイ、抗原特異的細胞アッセイテトラマーアッセイ)、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、あるいは組換え腫瘍関連抗原または免疫原性フラグメントまたは抗原由来ペプチドを用いたin vivo遅延型過敏性試験を使用して、各ステップの前後の複数時点で評価することができる。

0082

免疫応答の増大を測定するためのさらなる方法の例としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを使用するフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法、酵素結合免疫スポット測定法(enzyme−linked immunospot assay)、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞傷害性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインmRNAの測定、または限界希釈法などT細胞応答を測定するために現在使用されているアッセイが挙げられる。

0083

本発明を使用する、作製した細胞の効力のin vivo評価は、本発明の機能が増強されたT細胞の最初の投与前または治療開始後の種々の時点で、抗原特異的細胞アッセイ、増殖アッセイ、細胞溶解性細胞アッセイ、あるいは組換え腫瘍関連抗原または免疫原性フラグメントまたは抗原由来ペプチドを用いたin vivo遅延型過敏性試験を使用して、生体で評価することができる。

0084

免疫応答の増大を測定するためのさらなる方法の例としては、遅延型過敏性試験、ペプチド主要組織適合遺伝子複合体テトラマーを使用するフローサイトメトリー、リンパ球増殖アッセイ、酵素結合免疫吸着測定法、酵素結合免疫スポット測定法(enzyme−linked immunospot assay)、サイトカインフローサイトメトリー、直接細胞傷害性アッセイ、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応によるサイトカインmRNAの測定、または限界希釈法などT細胞応答を測定するために現在使用されているアッセイが挙げられる。さらに、免疫応答は、体重、生体が保持する腫瘍の直径または悪性度、あるいは被験体または被験体群生存率または生存期間によって評価することができる。

0085

異種免疫処置の起こり得る用量制限毒性の1つは、血管漏出症候群(VLS)である可能性がある。これは、IL−2投与などの他の免疫療法の主要な用量制限有害作用であるとみなされている。転移性腎細胞癌患者で実施された試験のメタ分析では、目的の応答が患者の23%で観察され、それらの大多数は、10年を超えて持続した。不運にも、患者の65%は、VLSのために治療を中断または中止しなければならない。この症候群は、細胞外液溢出の増大、低血圧腹水肺水腫、および水胸症を特徴とし、全身性炎症反応症候群(SIRS)と臨床的に類似している。皮膚症状には、紅斑性発疹、ならびに皮膚の熱傷および掻痒に関連する軽度の乳頭状浮腫が含まれる。

0086

VLSの重篤な形態は、肺不全または心不全を伴い、約1%の治療患者が死に至るアウトカムになる。典型的には、VLSの症状は、昇圧療法、および浸透圧効果のためのコロイド溶液を含むものなど妥当な補液により治療される。患者はまた、テオフィリンおよびテルブタリンで治療することも可能であり、これに対する臨床経験によると、急性発作重症度および頻度の低減が可能になることが示唆される。

0087

細胞レベルでは、VLSは内皮細胞活性化および血管透過性の亢進と関連することがよく知られている。IL−2を投与された患者の生検により、ICAMおよびLFA−1などの接着分子の発現が増大することが示された。これらのタンパク質は顆粒球の血管外遊走を促進することが知られているが、そのようなアップレギュレーションは、内皮細胞培養物に直接in vitroでIL−2を添加した場合には観察されず、この効果が他の宿主成分に媒介されることが示唆される。IL−2の主要な細胞標的の1つが、2つのIL−2受容体型を発現するT細胞であることを考慮すると、最初のT細胞活性化が、IL−2投与後の内皮に対する下流炎症性効果への主要な寄与要因であるように見える。

0088

初期の研究において、Rosenbergのグループは、IL−2を投与したマウスに、放射性ヨウ素化アルブミンを投与して組織の放射活性を評価することによりVLSを定量化するためのマウスモデルを確立した。このモデルでは、ガンマ線カウントの増加が、内皮透過性および組織へのアルブミン漏出相関する。彼らは、放射線シクロホスファミド、またはステロイドにより免疫抑制されたヌードマウスまたはマウスへのIL−2の投与が、血管漏出の顕著な低下または血管漏出がないことと関連することを見出した。例えば、Rosenstein,M.,S.E.Ettinghausen,and S.A.Rosenberg,Extravasation of intravascular fluid mediated by the systemic administration of recombinant interleukin 2.J Immunol,1986.137(5):p.1735−42を参照されたい。したがって、LAK生成のプロセスは、VLSの刺激に関係している可能性がある。

0089

興味深いことには、研究者らは、宿主リンパ球の枯渇により、IL−2およびLAK移入に対する応答ではなく、IL−2単独に対する応答でのみ血管漏出が低減することを見出した。他の研究では、NKマーカーのアシアロ−GM1を有する細胞が、IL−2関連毒性の一部と関連することが示された。一グループは、アシアロGM1に対する抗血清が、死亡率、血管漏出症候群、および肝損傷を抑制し、IL−2処置により誘導されたアシアロGM1+リンパ球による肺血管系および肝血管系の浸潤を低減することを示した。アシアロ−GM1担持細胞の枯渇は、リンパ過形成、Lyt 2+リンパ球による組織浸潤、組織および末梢好酸球増加または血小板減少を変化させなかった。興味深いことには、この抗血清は、colon38結腸癌を担持するBDFマウスにおけるIL−2療法の抗腫瘍効果に影響を及ぼさなかった。したがって、高用量IL−2によるT細胞およびNK細胞活性化は、これに限定されるものではないが、内皮細胞活性化を局所的に誘導することが知られ、全身性にはSIRSのメディエーターであるTNF−アルファを含む種々のサイトカインの産生を誘導し得る。癌において免疫系の過剰活性化により誘導される炎症性カスケードについての知識は、当業者が治療効果を維持しながら、有害作用を最小限に抑える方法で本発明を実行するのに有用である。

0090

IL−2などの効力のある免疫促進剤の投与に付随する別の事象に、補体活性化がある。補体系は、肝臓で主に生成する約30種の循環タンパク質の酵素カスケードであり、炎症および種々の免疫応答の増幅を引き起こす。補体系は、古典的(抗体媒介)経路、副経路(抗体非依存性)、またはマンノース結合レクチン経路を介して活性化することができ、これらすべてによって、膜に細孔を生成させることにより細胞溶解を引き起こす膜侵襲複合体の形成がもたらされる。

0091

3×10(6)U/m2の1日用量で連続5日間、24時間i.v.点滴によりIL−2を投与された転移性腎癌患者の臨床試験において、古典補体経路成分のC3およびC4が、IL−2点滴中およびその休止毎日測定された。IL−2投与は、C3およびC4の両方のレベルの顕著な低下を伴った。このレベルはIL−2点滴終了後の平均5日に関し標準化したものである。例えば、Lissoni,P.,et al.,Activation of the complement system during immunotherapy of cancer with interleukin−2:a possible explanation of the capillary leak syndrome.Int J Biol Markers,1990.5(4):p.195−7を参照されたい。

0092

別の試験では、IL−2を投与された患者におけるVLSの存在がC3aおよび古典的補体成分C4aのレベルにより評価された補体活性化と関連した。この試験では、C3aのレベルは、敗血症および熱傷の患者で見出されたレベルと同様に上昇した。例えば、Thijs,L.G.,et al.,Activation of the complement system during immunotherapy with recombinant IL−2.Relation to the development of side effects.J Immunol,1990.144(6):p.2419−24を参照されたい。

0093

インターロイキン2およびリンフォカイン活性化キラー細胞による治療を受けた23人の癌患者を調査する別の試験では、治療8日目までにC3adesArg濃度が3倍上昇すること、またC4a desArgの濃度も治療終了までに上昇することが示された。補体系の活性化と関連して、補体受容体1型および補体受容体3型の好中球表面における発現が増大した。例えば、Moore,F.D.,Jr.,et al.,The systemic complement activation caused by interleukin− 2/lymphokine−activated killer−cell therapy of cancer causes minimal systemic neutrophil activation.Int J Cancer,1991.49(4):p.504−8を参照されたい。

0094

補体活性化がT細胞に興味深いことに依存することは、IL−2投与に伴う内皮活性化およびVLSにT細胞が必要であることを実証する研究を橋渡しする可能性がある。一試験では、癌患者が同様の前処置を受けて、C3a、Ba、Bb、およびSC5b−9の血漿レベルが制御されることが示された。IL−2処置後、C3aレベルは対照と比較して平均15.6倍増大することが示された。補体活性化副経路に属するBaおよびBbタンパク質はそれぞれ、IL−2処置後8.0倍および5.0倍増大した。エフェクター補体複合体のSC5b−9の血漿レベルは、5.0倍増大し、血漿C4bおよびiC3b濃度はそれぞれ、処置後4.8倍および2.9倍増大した。

0095

補体活性化における患者のリンパ球の関与を示すために、研究者らは、T細胞マーカーのCD3を発現する細胞が、IL−2療法後、抗C3cおよび抗SC5b−9の表面発現をそれぞれ6.2倍および5.1倍増大させることを見出した。これらの結果は、T細胞がIL−2誘導補体活性化に関与していると研究者に結論を下させるものである。これはまた、炎症性タンパク質であるC反応性タンパク質(CRP)の濃度増大がIL−2療法後に見出されること、またT細胞がCRBに結合することにおいて示された。T細胞結合CRPは、補体副経路を活性化することができた。Deehan,D.J.,et al.,Correlation of serum cytokine and acute phase reactant levels with alterations in weight and serum albumin in patients receiving immunotherapy with recombinant IL−2.Clin Exp Immunol,1994.95(3):p.366−72;Vachino,G.,et al.,Complement activation in cancer patients undergoing immunotherapy with interleukin−2(IL−2):binding of complement and C−reactive protein by IL−2−activated lymphocytes.Blood,1991.78(10):p.2505−13を参照されたい。

0096

治療的には、補体阻害剤であるC1エステラーゼ阻害剤の投与は、患者におけるIL−2誘導低血圧および補体活性化を軽減することができる。補体カスケードの種々の成分は、直接内皮細胞を活性化し、内皮細胞活性化は、リンパ球および好中球の血管外遊走を引き起こすだけでなく、組織因子のアップレギュレーションにより血栓症も引き起こす。C5aは、内皮細胞の活性化および透過性を誘導することが実証されている補体活性化の副生成物である。このタンパク質はまた、全身性炎症性障害の主要なエフェクターであり、その抗体は、一部の効果シグナルおよび内皮活性化の抑制に関する、この条件について臨床的に評価されている。

0097

補体エフェクター複合体SC5b−9が、補体に対する応答遺伝子(Response Gene to Complement)(RGC)−32の発現を刺激することによって(これにより、次いでCDC2およびAKT経路が活性化する)、内皮細胞活性化を誘導することがin vitroで示された。Jeffrey Plattのグループは、補体活性化がIL−1の誘導と関連すると結論した。IL−1の誘導により、E−セレクチン、細胞内接着分子−1、血管細胞接着分子−1、Iカッパ−Bアルファ、インターロイキン(IL)−1アルファ、IL−lベータ、IL−8、および組織因子の内皮細胞発現が刺激される。Saadi,S.,et al.,Endothelial cell activation by pore−forming structures:pivotal role for interleukin−1 alpha.Circulation,2000.101(15):p.1867−73を参照されたい。したがって、IL−2誘導VLSのカスケードでは、T細胞活性化が補体活性化と関連している可能性があり、補体活性化により内皮細胞活性化が刺激される。

0098

内皮細胞活性化の基本的特徴の1つは、凝固カスケードの刺激である。したがって、本発明の種々の特定の実施形態では、免疫関連活性化から内皮細胞を保護することが想定される。内皮を保護する手段には、静脈内アスコルビン酸などの静脈内抗酸化剤の投与が含まれる。一般に、アスコルビン酸またはその塩は、5.0〜30.0gの量、好ましくは5.0〜10.0gの量で使用される。非経口製剤のpHは、6.0〜8.0の間である。腫瘍患者に対する静脈内アスコルビン酸の使用に関する手引きは、米国特許第6,284,786号明細書および米国特許第6,426,076号明細書で見つけることができる。

0099

VLSにはSIRSと多くの共通の要素があるという新たな見方によれば、共通の特徴の1つは、局所血小板の発生および凝固系活性化である。自然免疫応答は、凝固刺激およびその結果としての隔離によって病原体を局所的に排除する能力を有する。しかしながら、このプロセスは、SIRSまたはVLSなど、全身性レベルで起こる場合には病態になる。組織因子発現のアップレギュレーションが、IL−2で処置された動物に由来する内皮細胞で見られた。例えば、Trichonas,G.,et al.,A novel nonradioactive method to evaluate vascular barrier breakdown and leakage.Invest Ophthalmol Vis Sci.51(3):p.1677−82を参照されたい。

0100

このタンパク質の発現は、凝固カスケードの活性を引き起こすと共に、炎症過程を刺激することが知られている。Hackらは、IL−2療法の患者では第XII因子およびプレカリクレインの分解があることを示すことによって、凝固タンパク質の接触系の活性化を実証した。これらのタンパク質の減少は、アルブミン減少に対して補正した場合、それらのレベルが依然として顕著に低下、すなわち、それぞれ80および50%であったので、間隙へのタンパク質漏出によるものではないように見えた(内皮はアルブミンに対してよりもこれらの凝固因子に対して透過性が高い可能性がまだあり、これが「ように見えた」を選ぶ理由である)。Hack,C.E.,et al.,Studies on the contact system of coagulation during therapy with high doses of recombinant IL−2:implications for septic shock.Thromb Haemost,1991.65(5):p.497−503を参照されたい。

0101

したがって、凝固系の非特異的活性化およびその結果生じる血栓症の可能性が、IL−2処置の結果として起こる。多くの癌患者が本質的に血栓形成促進状態であることを考慮すると、IL−2療法が血栓合併症をもたらし得ることは理論的にあり得る。本発明の特定の実施形態では、凝固カスケードの操作が、免疫活性化の間に発生し得る凝固異常を低減するように免疫療法と併用して実施される。

0102

顆粒球活性化および組織浸潤は、全身性の免疫/炎症活性化の特徴である。IL−2に関する4人の患者の試験において、顆粒球はIL−2後に活性化されるようになり、IL−2後6時間に生じたエラスターゼ/アルファ1−アンチトリプシン(Eアルファ1A)およびラクトフェリン平均ピーク値は、それぞれ212(標準誤差=37)および534(標準誤差=92)ng/mlであった。補体カスケードの活性化は、IL−2の5日目におけるC3aピーク値用量依存的な上昇により証明された。C3aレベルとIL−2後最初の24時間における低血圧の程度との間の顕著な相関(r=0.91)、ならびにC3aレベルと体重の増加および血清アルブミンの減少などの毛細管漏出のパラメーターとの間の顕著な相関(r=0.71)が認められ、これにより、PMNが活性化されると、内皮細胞の損傷が惹起され、次いで補体カスケードの活性化がもたらされるという結論が得られた。

0103

IL−2療法の患者の好中球は、強力な好中球活性化表現型による証拠(CD11b/CD18接着受容体発現のアップレギュレーション)および機能的な証拠(過酸化水素および次亜塩素酸の産生)の両方を示した。したがって、腫瘍に対する過剰免疫の誘導中の好中球活性化についての知識を考慮に入れるべきであり、必要に応じて抗炎症剤を使用することによって、適切に処置されるべきである。心不全、粘膜炎などの慢性的炎症状態、および敗血症またはGVHDなどの急性状態と関連するものとして、細菌叢体循環への移行がある。

0104

興味深いことには、腸内細菌叢および炎症に対する干渉もまたIL−2毒性の中にあるように見える。最近の試験では、51匹の雄性ラットを無作為化して、10(5)(n=15)、10(4)(n=8)、10(3)(n=8)、または10(2)(n=8)の用量(IU)で、1日2回腹腔内注射によりrIL−2を投与するか、または生理食塩水をボーラス投与した(n=12)。5日後に、回腸組織形態を評価し、腸間膜リンパ節複合体を培養した。結果から、大腸菌(Escherichia coli)による腸間膜リンパ節のコロニー形成が、rIL−2の10(5)IUで処置されたすべてのラットで、また用量が低減されたrIL−2で処置されたラットの62%、37%、および12%で起こることがわかった。移行は対照動物では観察されなかった。粘膜下リンパ管の増加および時々粘膜破壊が10(5)IUを投与された群にのみ見られた。このデータから、rIL−2が細菌移行を促進することがわかり、ヒトにおける高用量rIL−2の毒性を悪化させる機序が示唆される。Reynolds,J.V.,et al.,High−dose interleukin 2 promotes bacterial translocation from the gut.Br J Cancer,1995,72(3):p.634−6を参照されたい。

0105

恒常的に誘導されるリンパ球活性化に関して臨床的に見られる顕著な効果、およびT細胞の恒常的増殖が腸内細菌叢移行と関連していると考えられる最近の発見を考慮すると、IL−2の腫瘍抑制活性は、腸内細菌叢に高度に依存している可能性があると考えられ、したがってこれにより患者間変動がおそらく説明される。したがって、本発明の一実施形態では、抗生物質またはプロバイオティクスによる腸ミクロビオームの操作は、本発明の文脈内にあると企図される。米国特許第8,197,805号明細書;同第5,728,380号明細書;同第5,589,168号明細書、および同第7,195,906号明細書に記載されるように、乳酸菌を含む数多くのプロバイオティクスが炎症を軽減することが示されている。これらの文献のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。

0106

いくつかの研究から、酸化ストレスが、優先的に補体カスケードを活性化する様式で、内皮細胞を修飾することが実証されている。酸化ストレス後の内皮細胞による補体活性化の促進にマンノース結合レクチンおよびレクチン補体活性化経路(LCP)が関与することが、低酸素(24時間;1%O(2))/再酸素負荷(3時間;21%O2)ヒト内皮細胞を使用する試験で示された。補体活性化のマーカーとしてiC3b沈着を使用すると、N−アセチル−D−グルコサミン、またはL−マンノースではなくD−マンノースが活性化を遮断することが示され、酸化ストレスがマンノース依存性経路をアップレギュレートすることが示唆された。これはまた、マンノース結合レクチン欠損血清およびマンノース結合レクチンに対する抗体を使用して実証された。さらに、C3沈着が、酸化ストレスの公知の誘発要因である心虚血再潅流傷害を受けたラットの虚血領域で見出された。

0107

本発明の一部の実施形態では、細胞傷害性または他の癌治療薬の投与は、腫瘍体積を縮小させるために、免疫処置の前に行われる。本明細書に記載される本発明の種々の実施形態に有用な癌治療薬としては、以下に限定されるものではないが、アセグラトンアクラルビシンアルトレタミンアミノグルテチミド;5−アミノレブリン酸(5−Aminogleavulinic Acid);アムサクリンアナストロゾール塩酸アンシタビン;17−1A抗体;抗リンパ球免疫グロブリン;アンチネオプラストンA10;アスパラギナーゼ;ペガスパルガーゼアザシチジンアザチオプリンバチマスタットベンゾポルフィリン誘導体ビカルタミド;塩酸ビサントレン硫酸ブレオマイシンブレキナナトリウムブロクスウリジンブスルファンキャンパス−IH;カラセミド;カルベチマー;カルボプラチンカルボコンカルモフールカルムスチンクロランブシルクロロゾトシン;クロモマイシンシスプラチンクラドリビンコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum);シクロホスファミド;シクロスポリンシタラビンダカルバジンダクチノマイシン塩酸ダウノルビシンデシタビン;ジアジコンジクロロジエチルスルフィドジデムニンB;ドセタキセルドキシフルリジン塩酸ドキソルビシン;ドロルオキシフェン(Droloxifene);エキノマイシンエダトレキサート;エリプチニウム;エルスチン;エンロプラチン;エノシタビン塩酸エピルビシンリン酸エストラムスチンナトリウムエタニダゾール;エトグルシド;エトポシド;塩酸ファドロゾールファザラビンフェンレチニドフロクスウリジンリン酸フルダラビンフルオロウラシルフルタミドホルメスタン;ホテムスチン;硝酸ガリウムゲンタビン(Gencitabine);グスペリムス;ホモハリントニンヒドロキシ尿素;塩酸イダルビシンイホスファミドイルホシン;トシル酸イソプロスルファン;イノリモマブ(Inolimomab);インターロイキン−2;イリノテカン;JM−216;レトロゾールリチウムガモレネート(Lithium Gamolenate);ロバプラチン;ロムスチンロニダミン;マホスファミド;メイファラン(Meiphalan);メノガリル;メルカプトプリンメトトレキセート;メトトレキセートナトリウム;ミボプラチン;ミルテホシンミソニダゾールミトブロニトールミトグアゾン二塩酸塩;ミトラクトールマイトマイシンミトタン;塩酸ミトザントロン(Mitozanetrone Hydrochloride);ミゾリビンモピダモール;ムイトライチルペプチド(Muitlaichilpeptide);ムロモナブ−CD3;塩酸ムスチン;ミコフェノール酸ミコフェノール酸モフェチルネダプラチン;ニルタミド塩酸ニムスチンオキサリプラチンパクリタキセル;PCNU;ペノスタチン硫酸ペプロマイシンピポブロマンピラルビシンイセチオン酸ピリトレキシム;塩酸ピロキサントロン;プリカマイシンポルフィマーナトリウムプレニムスチン塩酸プロカルバジン;ラルチトレキセド;ラニムスチン;ラゾキサン;ログレチミド;ロキニメックス;セブリプラチン;セムスチン;シロリムスシゾフィランソブゾキサン;ナトリウムブロメブレート(Sodium Bromebrate);スパルホス酸;スパルホサートナトリウムストレプトゾシン(Sreptozocin);スロフェヌルタクロリムスタモキシフェンテガフール;塩酸テロキサントロン;テモゾロミド;テニポシド;テストラクトン;四ナトリウムメソテトラフェニルポルフィンスルホン酸塩(Tetrasodium Mesotetraphenylporphine−sulphonate);チオグアニンチオイノシンチオテパトポテカントレミフェントレオスルファントリメトレキサートトロホスファミド;腫瘍壊死因子;ウベニメクスウラムスチン(Uramustine);硫酸ビンブラスチン硫酸ビンクリスチン硫酸ビンデシン酒石酸ビノレルビン;ボロゾール;ジノスタチン;ゾリモマブ・アリトックス(Zolimomab Aritox);および塩酸ゾルビシンが挙げられる。

0108

以下の実施例は、本発明の実施形態をさらに詳細に説明するために提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。これらは、使用され得るものの典型であるが、当業者に公知の他の手順、方法論、または技術を代替的に使用することができる。本発明の結果に顕著にまたは実質的に影響を及ぼさない、本開示発明の変更形態は、本開示の手段の範囲内に包含されることを理解されたい。以下に提供される実施例は、本発明の範囲を限定するものではなく、特定の実施形態を説明することを意図するものである。

0109

実施例1:異種胎盤ワクチンの予防的投与
ブタ組織およびB16溶解物の調製:
ブタ胎盤組織を分娩するブタから入手し、5%のペニシリン−ストレプトマイシン混合物を含有する無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、輸送のために上に置いた。胎盤組織を組織粉砕機でホモジナイズし、液体窒素と42℃の水浴に交互に浸す4回の凍結融解サイクルに付した。細胞デブリを1500gで45分間遠心分離してペレットにした。上清を回収して、0.2ミクロンミリポアフィルター滅菌した。全タンパク質濃度は、Bradfordアッセイ(BioRad)を使用して測定した。対照組織のために、同一プロトコールを使用してブタ肝臓およびB16黒色腫細胞株のタンパク質を単離した。

0110

ワクチンの調製および投与:
全タンパク質調製物を、2mg/mlの濃度で無菌注射用PBSに溶解し、腫瘍チャレンジ7日前にC57/BL6マウスに50uL(全重量10ug)を皮下注射した。

0111

腫瘍モデル
5×105個のB16細胞(米国培養細胞系統保存機関(Manassas,VA))を、6〜8週齢の雌性C57BL/6(The Jackson Laboratory:Bar Harbor,ME)の後肢側腹部に皮下注射した。腫瘍増殖は、カリパスによる2つの直交する直径の測定により3日ごとに評価し、腫瘍がいずれかの方向で1cmのサイズに達したときに動物を屠殺した。腫瘍容積は、次式により計算した:(最短直径×最長直径)/2

0112

実験群
1群当たり4匹のC57/BL6マウスに、腫瘍チャレンジの7日前に、以下の処置を施した:
A.50μlの生理食塩水の処置
B.50μLの生理食塩水中の10μgのブタ肝臓抽出物
C.50μLの生理食塩水中の10μgのブタ胎盤抽出物
D.50μLの生理食塩水中の10μgのB16黒色腫細胞抽出物

0113

結果:
図1〜3に示すように、B16黒色腫細胞増殖の統計的に有意な阻害がブタ胎盤抽出物を投与されたマウスで観察されたが、対照のブタ肝臓抽出物では観察されなかった。これは、異種胎盤の組織特異的な癌免疫能力を示す。

0114

実施例2:アジュバントとして自己由来の樹状細胞を使用する異種胎盤ワクチン接種
本発明をさらに詳細に説明するために、上記実施例に記載のように、胎盤タンパク質抽出物を精製した。腫瘍モデルとして、B16黒色腫担持C57/BL6マウスを使用し、同系DC源を必要とした。手短に言えば、C57/BL6マウス(Jackson Labs,Bar Harbor ME)の大腿骨および脛骨から骨髄細胞摘出し、洗浄し、組換えGM−CSF(10ng/ml;Peprotech,Rocky Hill,NJ)および組換えマウスIL−4(10ng/ml;Peprotech)を添加された、2mlの完全培地(2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μgのストレプトマイシン、50μΜの2−メルカプトエタノール、および10%のウシ胎仔血清(すべてGibco RBL製)を添加されたRPMI−1640)中、24ウェルプレート(1ウェル当たり2×106細胞)で培養した。すべての培養物は、5%加湿CO2中、37℃でインキュベートした。48時間の培養後、非付着顆粒球を除去し、新鮮培地を加えた。

0115

7日間の培養後、FACSにより測定すると、細胞の90%超が特徴的なDC特異的マーカーを発現していた。DCを洗浄し、400μlの無血清RPMI−1640中、ウェル当たり2×105個の細胞の濃度で、24ウェルプレートに播種した。7日目に、骨髄由来DCをパルスしないままにするか、または10μg/mlのブタ肝臓ホモジネート(抽出物)もしくは異種ブタ胎盤ホモジネート(抽出物)でパルスした。パルスのために、肝臓または胎盤の抽出物と共にDCを24時間インキュベートした。次いで、マウス当たり500,000個の細胞濃度でDCを皮下投与した。上記に記載のように、5×105個のB16黒色腫細胞を同時に注射投与した。対照として、ブタ肝臓ホモジネートおよびDC単独を投与した。図4、5、および6に示すように、異種胎盤をパルスされたDCを投与されたマウスはいずれも顕著な腫瘍を発生しなかった。

0116

実施例3:異種胎盤ワクチン接種は、腫瘍細胞溶解物ワクチンの免疫原性を高めることができる
異種胎盤ワクチン接種の利用に対する潜在的な懸念は、腫瘍組織特異性の欠如である。胎盤ワクチン接種の免疫刺激特性を考慮すると、異種ワクチン調製物の同時投与が既存の癌ワクチン源の免疫原性を増強するか否かについて疑問があった。

0117

C57/B6マウスに、実施例1に記載のように、B16黒色腫を投与した。次いで、同日にマウスを以下のもので処置した:(a)生理食塩水;(b)B16溶解物;(c)ブタ肝臓溶解物と一緒にB16溶解物;(d)ブタ胎盤溶解物と一緒にB16溶解物;(e)ブタ肝臓溶解物単独;および(f)ブタ胎盤溶解物単独。

0118

腫瘍細胞をワクチン調製物と同時にマウスに接種した場合、黒色腫B16細胞単独で免疫処置したときには、保護効果はなかった。これに対して、共混合物による免疫処置は、異種胎盤単独よりも強力な効果を示した。注目すべきことには、胎盤単独でも幾分腫瘍予防活性があった(図7)。

0119

実施例4:異種胎盤ワクチン接種による結腸癌の処置
6〜8週齢の雌性C57/B6マウスの側腹部位に、200,000個のMC38結腸癌細胞を皮下注射した。腫瘍チャレンジ後5日目、10日目、および15日目に、動物を以下のいずれかで処置した:(a)生理食塩水;(b)ブタ肝臓抽出物(PLE);および(c)ブタ胎盤抽出物(PPE)。(2×10(5))個のMC38マウス結腸腺癌細胞、腫瘍を1週間に2回測定した。図8に示すように、異種胎盤抽出物(ブタ)は、腫瘍増殖を阻止した。

0120

特定の実施形態を上記に記載したが、これら記載の実施形態は例としてのみ示したものであることを理解されよう。したがって、本明細書に記載の系および方法は、記載の実施形態に基づいて限定されるべきではない。正しくは、本明細書に記載の組成物および方法は、上記の説明および添付図面と併せて解釈される場合、後続する特許請求の範囲に照らしてのみ限定されるべきである。

0121

特許、特許出願、および刊行物を含む、本明細書に引用のすべての参考文献は、これまでに具体的に組み込まれているか否かにかかわらず、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

実施例

0122

本開示では、その特定の実施形態と関連させて説明しているが、さらなる変更形態も可能であることを理解されよう。本出願は、一般に、本開示の原理に従い、本開示が関係する技術範囲内で公知または通例の実行範囲内になるような、また本明細書の上記に示される基本的な特徴に適用され得るような本開示からの逸脱を含む、本開示のいかなる変更形態、使用、または適応も包含することを意図するものである。

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