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技術 組換えアデノ随伴ウイルス9の髄腔内送達

出願人 ネイションワイドチルドレンズホスピタルオハイオ・ステイト・イノベーション・ファウンデーション
発明者 カスパー,ブライアンケー.バージェス,アーサーポレンスキー,ポール
出願日 2013年7月31日 (6年6ヶ月経過) 出願番号 2015-525565
公開日 2015年9月7日 (4年5ヶ月経過) 公開番号 2015-525783
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 流動分布 トレンデレンブルグ体位 ASCIIテキスト 遊離浮遊 バイブレ 導入麻酔 低浸透性 低温保
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課題・解決手段

本発明は、ポリヌクレオチド髄腔送達のために有用なアデノ随伴ウイルス9型の方法および物質に関する。上記方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患(例えば、SMAおよびALS)、ならびにポンペ病およびリソソーム蓄積症処置について示される。生存運動ニューロンタンパク質発現のためにrAAV9ベクターといっしょに非イオン性低浸透性造影剤投与すると、発現ベクター単独の投与と比較してSMN変異体マウスの生存を改善することを開示する。

概要

背景

背景
型分子薬物は、血液脳関門(BBB)を横切らず、小型分子のうちの98%は、この関門を通過できず、それによって、多くのCNS障害の薬物開発の努力が制限されている[Pardridge, W.M. Nat Rev Drug Discov 1: 131−139 (2002)]。遺伝子送達は、BBBを迂回するための方法として近年提唱された[Kasparら、Science 301: 839−842 (2003)];しかし、脳および脊髄への広く行き渡る送達は、困難であった。運動ニューロン疾患に関する成功裡の遺伝子治療の開発は、脊髄および運動皮質内の広く行き渡る形質導入おそらく必要とする。最も一般的な運動ニューロン疾患のうちの2つは、脊髄性筋萎縮症SMA)および筋萎縮性側索硬化症ALS)であり、これらはともに、それぞれ、小児および成人衰弱させる障害であり、今までのところ有効な治療はない。SMAおよびALSの齧歯類モデルでの近年の研究は、筋肉内注射の後に逆行して輸送されるウイルスを使用する遺伝子送達を含む[Kasparら、Science 301: 839−842 (2003); Azzouzら、J Clin Invest 114: 1726−1731 (2004); Azzouzら、Nature 429: 413−417 (2004); Ralphら、Nat Med 11: 429−433 (2005)]。しかし、脊髄、脳幹および運動皮質全体にわたって神経変性が広く行き渡った領域を標的としてこれら疾患を有効に処置するために多くの注射が必要とされることを考慮すれば、臨床開発は困難であり得る。AAVベクターはまた、神経学的障害についての近年の多くの臨床試験で使用されてきており、持続する導入遺伝子発現、比較的安全なプロフィール、および有望な機能的応答を示すが、外科的な実質組織内注射(intraparenchymal injection)を要した[Kaplittら、Lancet 369: 2097−2105 (2007); Marksら、Lancet Neurol 7: 400−408 (2008); Worgallら、Hum Gene Ther (2008)]。

SMAは、生後6ヶ月以内に弛緩性麻痺によって特徴付けられる小児期早期の神経変性障害である。この疾患の最も重篤な症例では、麻痺によって呼吸不全がもたらされ、通常2までに死亡する。SMAは、新生児6000人に1人の発生率嚢胞性線維症に隠れた2番目に一般的な小児の常染色体劣性疾患である。SMAは、脊髄全体の長さに沿って下位運動ニューロン(LMN)喪失が存在することによって特徴付けられる遺伝性障害である。SMAは、骨格筋脱神経(denervation of skeletal muscle)および顕著な筋萎縮を生じる、生存運動ニューロン(SMN)タンパク質発現の低下によって引き起こされる。SMNは、U snRNP生物発生において機能する、遍在的に発現されるタンパク質である。

ヒトでは、SMN遺伝子の2つの非常によく似たコピーが存在し、SMN1およびSMN2といわれる。上記2つの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、同一である。しかし、エキソン7において生じるエキソン7のSMN2におけるサイレントな単一ヌクレオチド変化は、SMN2からの転写物のうちの80〜90%で排除される。得られた短縮型のタンパク質(SMNΔ7といわれる)は、安定性が低く、急速に分解される。SMN2の転写物のうちの残りの10〜20%が、全長SMNタンパク質をコードする。SMN1の全てのコピーが失われ、SMN2のみが残されて全長SMNタンパク質を生成するときに疾患が生じる。よって、SMN2は、より高いSMN2コピー数を有する患者は一般にはより遅い発症および重篤度がより低い疾患を示すという点において、SMAにおける表現型調節因子(phenotypic modifier)として作用する。

SMAの治療的アプローチは、SMNレベルを増大させるかまたは残りのSMN機能を増強するための薬物開発に主に焦点が当てられてきた。数年間のスクリーニングにも拘わらず、どの薬物も、回復治療としてSMNレベルを増大させるために十分に有効ではなかった。多くのマウスモデルがSMAに関して開発されてきた。Hsieh−Liら、Nature Genetics, 24 (1): 66−70 (2000); Leら、Hum. Mol. Genet., 14 (6): 845−857 (2005); Monaniら、J. Cell. Biol., 160 (1): 41−52 (2003)およびMonaniら、Hum. Mol. Genet., 9 (3): 333−339 (2000)を参照のこと。近年の研究は、マウスモデルにおいて全長SMNcDNAを発現させ、著者らは、ニューロンにおけるSMNの発現がSMAの症状に対して顕著に影響を有し得ると結論づけた。Gavrilinaら、Hum. Mol. Genet., 17(8):1063−1075 (2008)を参照のこと。

ALSは、筋肉および/もしくは筋機能の喪失を生じるもう1つの疾患である。これは、1869年にCharcotによって最初に特徴付けられ、100,000個体のうちの約5個体に影響を及ぼす広く行き渡った成人発症の神経変性疾患である。ALSは、随意運動を司る脳および脊髄の中の特定の神経細胞が徐々に変性するときに生じる。臨床上の発症から2〜5年以内に、これらの運動ニューロンの喪失によって、骨格筋の進行性萎縮が生じ、それは、麻痺、発語欠陥、および呼吸不全に起因する死亡を生じる筋機能の喪失を生じる。

ALS発症を引き起こすかもしくはその素因がある遺伝子異常は未知であるが、SOD−1遺伝子におけるミスセンス変異家族性ALS症例のうちの約10%で起こっており、そのうちの最大で20%までが、第21染色体に位置するCu/Znスーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)をコードする遺伝子に変異を有する。SOD−1は、フリーラジカルスーパーオキシドアニオン過酸化水素および分子酸素へと変換することによって、酸化的ストレスの調節において通常は機能している。現在まで、SOD−1遺伝子の全てのエキソンにわたって90を超える変異が同定されてきた。これら変異のうちのいくつかは、変異型ヒトSOD−1を発現するトランスジェニックマウス系統を作って、ALSの進行性の運動ニューロン疾患および病因モデル化するために使用されてきた。

SMAおよびALSは、最も一般的な運動ニューロン疾患のうちの2つである。SMAおよびALSの齧歯類モデルにおける近年の研究は、筋肉内注射の後に逆行して輸送されるウイルスを使用する遺伝子送達による処置を試験した。Azzouzら、J. Clin. Invest., 114: 1726−1731 (2004); Kasparら、Science, 301: 839−842 (2003); Azzouzら、Nature, 429: 413−417 (2004)およびRalphら、Nature Medicine, 11: 429−433 (2005)を参照のこと。脊髄、脳幹および運動皮質全体にわたる神経変性を標的とするために多くの注射が必要とされることを考慮すれば、このような処置の臨床使用は困難であり得る。

アデノ随伴ウイルス(AAV)は、複製欠損パルボウイルスであり、その中の1本鎖DNAゲノムは、長さ約4.7kbであり、145ヌクレオチド逆方向末端反復(ITR)を含む。AAV血清型2(AAV2)ゲノムのヌクレオチド配列は、Ruffingら、J Gen Virol, 75: 3385−3392 (1994)によって訂正されたが、Srivastavaら、J Virol, 45: 555−564 (1983)で示された。ウイルスDNA複製(rep)、キャプシド化パッケージングおよび宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、上記ITR内に含まれる。3つのAAVプロモーター(それらそれぞれのマップ位置にちなんでp5、p19、およびp40と称される)は、rep遺伝子およびcap遺伝子をコードする2つのAAV内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。2つのrepプロモーター(p5およびp19)は、1つのAAVイントロンの(ヌクレオチド2107および2227での)差次的スプライシングと合わせて、rep遺伝子から4つのrepタンパク質(rep 78、rep 68、rep 52、およびrep 40)の生成を生じる。Repタンパク質は、ウイルスゲノム複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。cap遺伝子は、p40プロモーターから発現され、それは、3つのキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、上記3つの関連キャプシドタンパク質の生成を担う。1つのコンセンサスポリアデニル化部位は、AAVゲノムのマップ位置95に位置する。AAVの生活環および遺伝的特質は、Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97−129 (1992)において総説されている。

AAVは、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとして(例えば、遺伝子治療において)それを魅力的にする特有の特徴を有する。培養における細胞のAAV感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の自然な感染は、無症状かつ無症候性である。さらに、AAVは、多くの哺乳動物細胞に感染し、多くの異なる組織インビボで標的とする可能性がある。さらに、AAVは、分裂細胞および非分裂細胞をゆっくりと形質導入し、転写的活性な核エピソーム(nuclear episome)(染色体外エレメント)として本質的にそれら細胞の寿命にわたって残っている。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実行可能にするプラスミド中のクローニングされたDNAとして感染性である。さらに、AAV複製、ゲノムキャプシド化および組み込みを指示するシグナルはAAVゲノムのITR内に含まれるので、上記ゲノムの内部の約4.3kbのうちのいくらかもしくは全て(複製および構造的キャプシドタンパク質、rep−capをコードする)は、外来DNA(例えば、プロモーター、目的のDNAおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット)で置き換えられ得る。上記repタンパク質およびcapタンパク質は、トランスで提供され得る。AAVの別の重要な特徴は、これが極めて安定なかつ強いウイルスであることである。上記ウイルスは、アデノウイルス不活化するために使用される条件(数時間にわたって56℃〜65℃)に容易に耐え、AAVの低温保存をそれほど不可欠にしない。AAVは、さらに凍結乾燥され得る。最後に、AAV感染細胞は、重感染に対して耐性ではない。

AAVには複数の血清型があり、種々の組織向性を表す。既知の血清型としては、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10およびAAV11が挙げられる。AAV9は、米国特許第7,198,951号およびGaoら、J. Virol., 78: 6381−6388 (2004)に記載されている。AAV6およびAAV8の送達の進歩は、簡単な全身静脈内注射もしくは腹腔内注射の後に骨格筋および心筋のこれら血清型による形質導入を可能にした。Pacakら、Circ. Res., 99(4): 3−9 (1006)およびWangら、Nature Biotech., 23(3): 321−8 (2005)を参照のこと。しかし中枢神経系内の細胞タイプを標的とするためにAAVを使用することは、外科的な実質組織内注射を要した。Kaplittら、前出; Marksら、前出およびWorgallら、前出を参照のこと。

概要

本発明は、ポリヌクレオチド髄腔内送達のために有用なアデノ随伴ウイルス9型の方法および物質に関する。上記方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患(例えば、SMAおよびALS)、ならびにポンペ病およびリソソーム蓄積症の処置について示される。生存運動ニューロンタンパク質の発現のためにrAAV9ベクターといっしょに非イオン性低浸透性造影剤投与すると、発現ベクター単独の投与と比較してSMN変異体マウスの生存を改善することを開示する。

目的

本発明は、組換えAAV9(rAAV9)をベクターとして使用する、中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達に有用な方法および物質を提供する

効果

実績

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請求項1

ポリヌクレオチド送達を必要とする患者中枢神経系にポリヌクレオチドを送達する方法であって、該方法は、該患者へのrAAV9および非イオン性低浸透性造影剤髄腔内送達を包含し、ここで該rAAV9は、該ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む、方法。

請求項2

前記ポリヌクレオチドが、脳に送達される、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記ポリヌクレオチドが、脊髄に送達される、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記ポリヌクレオチドが、グリア細胞に送達される、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記グリア細胞が、星状細胞である、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記ポリヌクレオチドが、下位運動ニューロンに送達される、請求項1に記載の方法。

請求項7

前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオビトリドールイオヘキソール、イオメプロールイオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランである、請求項1に記載の方法。

請求項8

前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオヘキソールである、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記ポリヌクレオチドが、生存運動ニューロンSMN)ポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。

請求項10

神経学的疾患処置を必要とする患者において神経学的疾患を処置する方法であって、該方法は、該患者へのrAAV9および非イオン性の低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで該rAAV9は、治療用ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む、方法。

請求項11

前記神経学的疾患が、レット症候群である、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記神経学的疾患が、神経変性疾患である、請求項10に記載の方法。

請求項13

前記治療用ポリヌクレオチドが、生存運動ニューロン(SMN)ポリヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。

請求項14

前記神経変性疾患が、脊髄性筋萎縮症である、請求項12に記載の方法。

請求項15

前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項12に記載の方法。

請求項16

前記ポリヌクレオチドが、脳に送達される、請求項10に記載の方法。

請求項17

前記ポリヌクレオチドが、脊髄に送達される、請求項10に記載の方法。

請求項18

前記ポリヌクレオチドが、グリア細胞に送達される、請求項10に記載の方法。

請求項19

前記グリア細胞が、星状細胞である、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記ポリヌクレオチドが、下位運動ニューロンに送達される、請求項10に記載の方法。

請求項21

前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランである、請求項10に記載の方法。

請求項22

前記非イオン性の低浸透性造影剤が、イオヘキソールである、請求項21に記載の方法。

請求項23

前記患者が、前記rAAV9の髄腔内送達後に、トレンデレンブルグ体位に置かれる、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。

技術分野

0001

(関連出願の引用
この出願は、2012年8月1日に出願された米国仮出願第61/678,458号(これは、その全体が参考として本明細書に援用される)からの優先権を主張する。

0002

政府権利に関する陳述)
本発明は、National Institutes of Health(NIH)によって付与されたRC2 NS69476−01の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

0003

電子提出された物件の参照による援用)
本明細書と同時に提出されかつ以下:「47099PCT_SeqListing.txt」と称されるASCIIテキストファイル(8,954バイト、2013年7月31日作製)のとおりに識別されるコンピューター読み取り可能な形態での配列表は、その全体において本明細書に参考として援用される。

0004

(発明の分野)
本発明は、ポリヌクレオチド髄腔送達(すなわち、脳もしくは脊髄くも膜の下にある空間への送達)に有用なアデノ随伴ウイルス9型の方法および物質に関する。上記方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患(例えば、SMAおよびALS)、ならびにポンペ病およびリソソーム蓄積症処置に関して示される。

背景技術

0005

背景
型分子薬物は、血液脳関門(BBB)を横切らず、小型分子のうちの98%は、この関門を通過できず、それによって、多くのCNS障害の薬物開発の努力が制限されている[Pardridge, W.M. Nat Rev Drug Discov 1: 131−139 (2002)]。遺伝子送達は、BBBを迂回するための方法として近年提唱された[Kasparら、Science 301: 839−842 (2003)];しかし、脳および脊髄への広く行き渡る送達は、困難であった。運動ニューロン疾患に関する成功裡の遺伝子治療の開発は、脊髄および運動皮質内の広く行き渡る形質導入おそらく必要とする。最も一般的な運動ニューロン疾患のうちの2つは、脊髄性筋萎縮症(SMA)および筋萎縮性側索硬化症(ALS)であり、これらはともに、それぞれ、小児および成人衰弱させる障害であり、今までのところ有効な治療はない。SMAおよびALSの齧歯類モデルでの近年の研究は、筋肉内注射の後に逆行して輸送されるウイルスを使用する遺伝子送達を含む[Kasparら、Science 301: 839−842 (2003); Azzouzら、J Clin Invest 114: 1726−1731 (2004); Azzouzら、Nature 429: 413−417 (2004); Ralphら、Nat Med 11: 429−433 (2005)]。しかし、脊髄、脳幹および運動皮質全体にわたって神経変性が広く行き渡った領域を標的としてこれら疾患を有効に処置するために多くの注射が必要とされることを考慮すれば、臨床開発は困難であり得る。AAVベクターはまた、神経学的障害についての近年の多くの臨床試験で使用されてきており、持続する導入遺伝子発現、比較的安全なプロフィール、および有望な機能的応答を示すが、外科的な実質組織内注射(intraparenchymal injection)を要した[Kaplittら、Lancet 369: 2097−2105 (2007); Marksら、Lancet Neurol 7: 400−408 (2008); Worgallら、Hum Gene Ther (2008)]。

0006

SMAは、生後6ヶ月以内に弛緩性麻痺によって特徴付けられる小児期早期の神経変性障害である。この疾患の最も重篤な症例では、麻痺によって呼吸不全がもたらされ、通常2までに死亡する。SMAは、新生児6000人に1人の発生率嚢胞性線維症に隠れた2番目に一般的な小児の常染色体劣性疾患である。SMAは、脊髄全体の長さに沿って下位運動ニューロン(LMN)喪失が存在することによって特徴付けられる遺伝性障害である。SMAは、骨格筋脱神経(denervation of skeletal muscle)および顕著な筋萎縮を生じる、生存運動ニューロン(SMN)タンパク質発現の低下によって引き起こされる。SMNは、U snRNP生物発生において機能する、遍在的に発現されるタンパク質である。

0007

ヒトでは、SMN遺伝子の2つの非常によく似たコピーが存在し、SMN1およびSMN2といわれる。上記2つの遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、同一である。しかし、エキソン7において生じるエキソン7のSMN2におけるサイレントな単一ヌクレオチド変化は、SMN2からの転写物のうちの80〜90%で排除される。得られた短縮型のタンパク質(SMNΔ7といわれる)は、安定性が低く、急速に分解される。SMN2の転写物のうちの残りの10〜20%が、全長SMNタンパク質をコードする。SMN1の全てのコピーが失われ、SMN2のみが残されて全長SMNタンパク質を生成するときに疾患が生じる。よって、SMN2は、より高いSMN2コピー数を有する患者は一般にはより遅い発症および重篤度がより低い疾患を示すという点において、SMAにおける表現型調節因子(phenotypic modifier)として作用する。

0008

SMAの治療的アプローチは、SMNレベルを増大させるかまたは残りのSMN機能を増強するための薬物開発に主に焦点が当てられてきた。数年間のスクリーニングにも拘わらず、どの薬物も、回復治療としてSMNレベルを増大させるために十分に有効ではなかった。多くのマウスモデルがSMAに関して開発されてきた。Hsieh−Liら、Nature Genetics, 24 (1): 66−70 (2000); Leら、Hum. Mol. Genet., 14 (6): 845−857 (2005); Monaniら、J. Cell. Biol., 160 (1): 41−52 (2003)およびMonaniら、Hum. Mol. Genet., 9 (3): 333−339 (2000)を参照のこと。近年の研究は、マウスモデルにおいて全長SMNcDNAを発現させ、著者らは、ニューロンにおけるSMNの発現がSMAの症状に対して顕著に影響を有し得ると結論づけた。Gavrilinaら、Hum. Mol. Genet., 17(8):1063−1075 (2008)を参照のこと。

0009

ALSは、筋肉および/もしくは筋機能の喪失を生じるもう1つの疾患である。これは、1869年にCharcotによって最初に特徴付けられ、100,000個体のうちの約5個体に影響を及ぼす広く行き渡った成人発症の神経変性疾患である。ALSは、随意運動を司る脳および脊髄の中の特定の神経細胞が徐々に変性するときに生じる。臨床上の発症から2〜5年以内に、これらの運動ニューロンの喪失によって、骨格筋の進行性萎縮が生じ、それは、麻痺、発語欠陥、および呼吸不全に起因する死亡を生じる筋機能の喪失を生じる。

0010

ALS発症を引き起こすかもしくはその素因がある遺伝子異常は未知であるが、SOD−1遺伝子におけるミスセンス変異家族性ALS症例のうちの約10%で起こっており、そのうちの最大で20%までが、第21染色体に位置するCu/Znスーパーオキシドジスムターゼ(SOD1)をコードする遺伝子に変異を有する。SOD−1は、フリーラジカルスーパーオキシドアニオン過酸化水素および分子酸素へと変換することによって、酸化的ストレスの調節において通常は機能している。現在まで、SOD−1遺伝子の全てのエキソンにわたって90を超える変異が同定されてきた。これら変異のうちのいくつかは、変異型ヒトSOD−1を発現するトランスジェニックマウス系統を作って、ALSの進行性の運動ニューロン疾患および病因モデル化するために使用されてきた。

0011

SMAおよびALSは、最も一般的な運動ニューロン疾患のうちの2つである。SMAおよびALSの齧歯類モデルにおける近年の研究は、筋肉内注射の後に逆行して輸送されるウイルスを使用する遺伝子送達による処置を試験した。Azzouzら、J. Clin. Invest., 114: 1726−1731 (2004); Kasparら、Science, 301: 839−842 (2003); Azzouzら、Nature, 429: 413−417 (2004)およびRalphら、Nature Medicine, 11: 429−433 (2005)を参照のこと。脊髄、脳幹および運動皮質全体にわたる神経変性を標的とするために多くの注射が必要とされることを考慮すれば、このような処置の臨床使用は困難であり得る。

0012

アデノ随伴ウイルス(AAV)は、複製欠損パルボウイルスであり、その中の1本鎖DNAゲノムは、長さ約4.7kbであり、145ヌクレオチド逆方向末端反復(ITR)を含む。AAV血清型2(AAV2)ゲノムのヌクレオチド配列は、Ruffingら、J Gen Virol, 75: 3385−3392 (1994)によって訂正されたが、Srivastavaら、J Virol, 45: 555−564 (1983)で示された。ウイルスDNA複製(rep)、キャプシド化パッケージングおよび宿主細胞染色体組み込みを指示するシス作用性配列は、上記ITR内に含まれる。3つのAAVプロモーター(それらそれぞれのマップ位置にちなんでp5、p19、およびp40と称される)は、rep遺伝子およびcap遺伝子をコードする2つのAAV内部オープンリーディングフレームの発現を駆動する。2つのrepプロモーター(p5およびp19)は、1つのAAVイントロンの(ヌクレオチド2107および2227での)差次的スプライシングと合わせて、rep遺伝子から4つのrepタンパク質(rep 78、rep 68、rep 52、およびrep 40)の生成を生じる。Repタンパク質は、ウイルスゲノム複製を最終的に担う複数の酵素特性を有する。cap遺伝子は、p40プロモーターから発現され、それは、3つのキャプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3をコードする。選択的スプライシングおよび非コンセンサス翻訳開始部位は、上記3つの関連キャプシドタンパク質の生成を担う。1つのコンセンサスポリアデニル化部位は、AAVゲノムのマップ位置95に位置する。AAVの生活環および遺伝的特質は、Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97−129 (1992)において総説されている。

0013

AAVは、外来DNAを細胞に送達するためのベクターとして(例えば、遺伝子治療において)それを魅力的にする特有の特徴を有する。培養における細胞のAAV感染は、非細胞障害性であり、ヒトおよび他の動物の自然な感染は、無症状かつ無症候性である。さらに、AAVは、多くの哺乳動物細胞に感染し、多くの異なる組織インビボで標的とする可能性がある。さらに、AAVは、分裂細胞および非分裂細胞をゆっくりと形質導入し、転写的活性な核エピソーム(nuclear episome)(染色体外エレメント)として本質的にそれら細胞の寿命にわたって残っている。AAVプロウイルスゲノムは、組換えゲノムの構築を実行可能にするプラスミド中のクローニングされたDNAとして感染性である。さらに、AAV複製、ゲノムキャプシド化および組み込みを指示するシグナルはAAVゲノムのITR内に含まれるので、上記ゲノムの内部の約4.3kbのうちのいくらかもしくは全て(複製および構造的キャプシドタンパク質、rep−capをコードする)は、外来DNA(例えば、プロモーター、目的のDNAおよびポリアデニル化シグナルを含む遺伝子カセット)で置き換えられ得る。上記repタンパク質およびcapタンパク質は、トランスで提供され得る。AAVの別の重要な特徴は、これが極めて安定なかつ強いウイルスであることである。上記ウイルスは、アデノウイルス不活化するために使用される条件(数時間にわたって56℃〜65℃)に容易に耐え、AAVの低温保存をそれほど不可欠にしない。AAVは、さらに凍結乾燥され得る。最後に、AAV感染細胞は、重感染に対して耐性ではない。

0014

AAVには複数の血清型があり、種々の組織向性を表す。既知の血清型としては、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10およびAAV11が挙げられる。AAV9は、米国特許第7,198,951号およびGaoら、J. Virol., 78: 6381−6388 (2004)に記載されている。AAV6およびAAV8の送達の進歩は、簡単な全身静脈内注射もしくは腹腔内注射の後に骨格筋および心筋のこれら血清型による形質導入を可能にした。Pacakら、Circ. Res., 99(4): 3−9 (1006)およびWangら、Nature Biotech., 23(3): 321−8 (2005)を参照のこと。しかし中枢神経系内の細胞タイプを標的とするためにAAVを使用することは、外科的な実質組織内注射を要した。Kaplittら、前出; Marksら、前出およびWorgallら、前出を参照のこと。

0015

米国特許第7,198,951号明細書

先行技術

0016

Pardridge,W.M. Nat Rev Drug Discov(2002)1:131〜139
Kasparら、Science(2003)301:839〜842

発明が解決しようとする課題

0017

従って、中枢神経系にポリヌクレオチドを送達するための方法およびベクターが当該分野で未だに必要である。

課題を解決するための手段

0018

(要旨)
本発明は、組換えAAV9(rAAV9)をベクターとして使用する、中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達に有用な方法および物質を提供する。

0019

より具体的には、本発明は、必要な患者の中枢神経系にポリヌクレオチドを送達するための方法を提供し、上記方法は、上記患者へのrAAV9および非イオン性低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで上記rAAV9は、上記ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む。上記ポリヌクレオチドは、例えば、脳、脊髄、グリア細胞星状細胞および/もしくは下位運動ニューロンに送達される。上記非イオン性の低浸透性造影剤は、例えば、イオビトリドール(iobitridol)、イオヘキソール(iohexol)、イオメプロール(iomeprol)、イオパミドール(iopamidol)、イオペントール(iopentol)、イオプロミド(iopromide)、イオベルソール(ioversol)もしくはイオキシラン(ioxilan)である。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、生存運動ニューロン(SMN)ポリヌクレオチドである。

0020

本発明はまた、必要な患者における神経学的疾患を処置するための方法を提供し、上記方法は、上記患者へのrAAV9および非イオン性の低浸透性造影剤の髄腔内送達を包含し、ここで上記rAAV9は、治療用ポリヌクレオチドを含む自己相補性ゲノムを含む。上記神経学的疾患は、例えば、脊髄性筋萎縮症もしくは筋萎縮性側索硬化症のような神経変性疾患である。上記治療用ポリヌクレオチドは、例えば、SMNポリヌクレオチドである。上記SMNポリヌクレオチドは、例えば、脳、脊髄、グリア細胞、星状細胞および/もしくは下位運動ニューロンに送達される。上記非イオン性の低浸透性造影剤は、例えば、イオビトリドール、イオヘキソール、イオメプロール、イオパミドール、イオペントール、イオプロミド、イオベルソールもしくはイオキシランである。

0021

(詳細な説明)
従って、一局面において、本発明は、患者の中枢神経系へのポリヌクレオチドの髄腔内送達のための方法を提供し、上記方法は、上記ポリヌクレオチドを含むゲノムを有するrAAV9を投与する工程を包含する。いくつかの実施形態において、非イオン性の低浸透性造影剤はまた、上記患者に投与される。上記非イオン性の低浸透性造影剤は、上記患者の中枢神経系における標的細胞の形質導入を増大させる。いくつかの実施形態において、上記rAAV9ゲノムは、自己相補性ゲノムである。他の実施形態において、上記rAAV9ゲノムは、1本鎖ゲノムである。

0022

いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、脳に送達される。送達が企図される脳の領域としては、運動皮質および脳幹が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、脊髄に送達される。いくつかの実施形態において、上記ポリヌクレオチドは、下位運動ニューロンに送達される。本発明の実施形態は、ポリヌクレオチドを神経およびグリア細胞に送達するためにrAAV9を使用する。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞は、小グリア細胞、希突起膠細胞もしくは星状細胞である。いくつかの実施形態において、上記rAAV9は、ポリヌクレオチドをシュワン細胞に送達するために使用される。

0023

本発明の方法および物質の使用は、例えば、下位運動ニューロン疾患(例えば、SMAおよびALS)、ならびにポンペ病、リソソーム蓄積症、多形膠芽腫およびパーキンソン病の処置に関して示される。リソソーム蓄積症としては、アクチベーター欠損(Activator Deficiency)/GMガングリオシドーシス、α−マンノシドーシスアスパルチルグルコサミン尿症コレステロールエステル貯蔵病慢性ヘキソサミニダーゼA欠損症シスチン症、ダノン病、ファブリー病ファーバー病、フコース蓄積症ガラクトシアリドーシス、ゴーシェ病I型II型III型)、GM1ガングリオシドーシス(乳児型、乳児後期型/若年型、成人/慢性型)、I細胞病ムコリピドーシスII、乳児型遊離シアル酸蓄積症/ISSD、若年型ヘキソサミニダーゼA欠損症、クラッベ病(乳児発症型、後期発症型)、異染性白質ジストロフィームコ多糖症ハーラー多発性ジストロフィー/ムコリピドーシスIIIA、MPS Iハーラー症候群、MPS Iシャイエ症候群、MPS Iハーラー・シャイエ症候群、MPS IIハンター症候群サンフィリポ症候群A型/MPS III A、サンフィリポ症候群B型/MPS III B、サンフィリポ症候群C型/MPS III C、サンフィリポ症候群D型/MPS III D、モルキオA型/MPS IVA、モルキオB型/MPS IVB、MPS IXヒアルロニダーゼ欠損症、MPS VIマロトー・ラミー、MPS VIIスラ症候群ムコリピドーシスI/シアリドーシス、ムコリピドーシスIIIC、ムコリピドーシスIV型)、多発性スルファターゼ欠損症、ニーマンピック病(A型、B型、C型)、神経セロイドリポフスチノーシス(CLN6疾患(不定型乳児後期型、後期発症型変種、早期若年型)、バッテン・シュピールマイアー・フォークト(Batten−Spielmeyer−Vogt)/若年型NCL/CLN3疾患、フィンランド変種乳児後期型CLN5、ジャスキービールショウスキー病/乳児後期型CLN2/TPP1疾患、クフス/成人発症型NCL/CLN4病、癲癇(Northern Epilepsy)/変種乳児後期型CLN8、サンタビューリ・ハルティア(Santavuori−Haltia)/乳児型CLN1/PPT疾患、β−マンノシドーシス、ポンペ病/糖原病II型、濃化異骨症(Pycnodysostosis)、サンドホフ病/成人発症型/GM2ガングリオシドーシス、サンドホフ病/GM2ガングリオシドーシス-乳児型、サンドホフ病/GM2ガングリオシドーシス-若年型、シンドラー病、サラ病/シアル酸蓄積症、テイサックス/GM2ガングリオシドーシス、ウォルマン病が挙げられるが、これらに限定されない。

0024

さらなる実施形態において、上記方法および物質の使用は、神経系疾患(例えば、レット症候群、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病)の処置に関して、または神経系損傷(脊髄および脳の外傷/損傷、脳卒中、および脳の癌が挙げられる)の処置に関して示される。

0025

別の局面において、本発明は、rAAVゲノムを提供する。上記rAAVゲノムは、ポリペプチド(SMNポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない)をコードするか、またはそれらの遺伝子の変異したタンパク質もしくは制御配列指向されるsiRNA、shRNA、アンチセンス、および/もしくはmiRNAをコードするポリヌクレオチドに隣接する1個以上のAAV ITRを含む。上記ポリヌクレオチドは、遺伝子カセットを形成するために標的細胞において機能的である転写制御DNA、具体的には、プロモーターDNAおよびポリアデニル化シグナル配列DNAに作動可能に連結される。上記遺伝子カセットはまた、哺乳動物細胞で発現される場合に、RNA転写物プロセシングを促進するために、イントロン配列を含み得る。

0026

いくつかの実施形態において、上記rAAV9ゲノムは、神経系損傷(脊髄および脳の外傷/損傷、脳卒中、および脳の癌が挙げられる)とともに、神経変性障害(アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病が挙げられるが、これらに限定されない)の処置のための栄養因子もしくは保護因子をコードする。公知の神経系増殖因子非限定的例としては、神経増殖因子(NGF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロフィン−3(NT−3)、ニューロトロフィン−4/5(NT−4/5)、ニューロトロフィン−6(NT−6)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、グリア細胞株由来神経栄養因子GDNF)、線維芽細胞増殖因子ファミリー(例えば、FGFの1〜15)、白血病抑制因子(LIF)、インスリン様増殖因子ファミリーの特定のメンバー(例えば、IGF−1)、ニュルツリン、パーセフィン骨形成タンパク質(BMP)、イムノフィリン、増殖因子のトランスフォーミング増殖因子(TGF)ファミリー、ニューレグリン上皮増殖因子(EGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、血管内皮細胞増殖因子ファミリー(例えば、VEGF 165)、フォリスタチン、Hif1などが挙げられる。本明細書で企図される栄養因子もしくは保護因子の各々を調節するジンクフィンガー転写因子もまた、一般に企図される。さらなる実施形態において、神経−免疫機能を調節するための方法が企図される(siRNA、shRNA、アンチセンス、もしくはmiRNAによる例えば、NFkB阻害、または神経保護(種々の細胞型におけるNFkBおよび関連経路の二重活性化)のためのNFkBを介する小グリア細胞活性化および大グリア細胞活性化の阻害が挙げられるが、これらに限定されない)。なおさらなる実施形態において、上記rAAV9ゲノムは、アポトーシスインヒビター(例えば、bcl2、bclxL)をコードする。栄養因子もしくは脊髄損傷調節タンパク質(spinal cord cord injury modulating protein)または軸索成長のインヒビターのサプレッサー(例えば、Nogoのサプレッサー[Oertleら、The Journal of Neuroscience, 23(13):5393-5406 (2003)]をコードするrAAV9の使用はまた、脊髄損傷を処置するために企図される。

0027

神経変性障害(例えば、パーキンソン病)の処置のために、上記rAAV9ゲノムは、種々の実施形態において芳香族酸ドパデカルボキシラーゼ(Aromatic acid dopa decarboxylase)(AADC)、チロシンヒドロキシラーゼGTPシクロヒドロラーゼ1(gtpch1)、アポトーシスインヒビター(例えば、bcl2、bclxL)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、抑制性神経伝達物質アミノ酪酸GABA)、またはドパミン生合成関与する酵素をコードする。さらなる実施形態において、上記rAAV9ゲノムは、例えば、Parkinおよび/もしくはシヌクレインの調節因子をコードし得る。

0028

神経変性障害(例えば、アルツハイマー病)の処置のために、いくつかの実施形態において、アセチルコリン生成を増大させるための方法が企図される。いくつかの実施形態において、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)のレベルを増大させるか、またはアセチルコリンエステラーゼ(AchE)の活性を阻害するための方法が、企図される。

0029

上記rAAV9ゲノムは、いくつかの実施形態において、神経変性障害(例えば、ハンチントン病)を処置するために、変異型ハンチントンタンパク質(htt)発現を減少させるための方法において使用するために、siRNA、shRNA、アンチセンス、および/もしくはmiRNAをコードする。

0030

上記rAAV9ゲノムは、種々の実施形態において、神経変性障害(例えば、ALS)の処置において使用するために、siRNA、shRNA、アンチセンス、および/もしくはmiRNAをコードする。処置は、疾患の分子マーカー(例えば、TNFα、一酸化窒素ペルオキシ亜硝酸、および/もしくは一酸化窒素合成酵素(NOS))の発現における減少を生じる。

0031

いくつかの実施形態において、上記ベクターは、変異タンパク質(例えば、ALSについてのスーパーオキシドジスムターゼ)、または神経栄養因子(例えば、ALSもしくはパーキンソン病についてのGDNFもしくはIGF1)に指向されるショートヘアピンRNAをコードする。

0032

いくつかの実施形態において、本発明の物質および方法の使用は、神経発生障害(例えば、レット症候群)を処置することに関して示される。レット症候群に関する実施形態について、上記rAAV9ゲノムは、例えば、メチルシトシン結合タンパク質2(MeCP2)をコードし得る。

0033

「処置」は、本発明のrAAVを含む組成物の有効用量、もしくは有効複数回用量を必要な動物(ヒトが挙げられる)に、髄腔内経路を介して投与する工程を包含する。上記用量が障害/疾患の発生前に投与される場合、上記投与は、予防的である。上記用量が障害/疾患の発生後に投与される場合、上記投与は、治療的である。本発明の実施形態において、有効用量は、処置されている上記障害/疾患の状態と関連する少なくとも1つの症状を緩和する(除去するかもしくは低減するかのいずれか)、障害/疾患の状態への進行を遅らせるかもしくは予防する、障害/疾患の状態の進行を遅らせるかもしくは予防する、疾患の程度を縮小させる、疾患の寛解(部分的もしくは全体)を生じる、ならびに/または生存を延ばす用量である。本発明の方法による処置が企図される疾患の状態の例は、上記に示される。

0034

組み合わせ治療はまた、本発明によって企図される。組み合わせは、本明細書で使用される場合、同時の処置もしくは逐次的な処置の両方を含む。本発明の方法と標準医療処置(例えば、ALSにおけるリルゾール)との組み合わせが、新規治療との組み合わせと同様に、具体的に企図される。

0035

生後必要な個体への送達が企図される一方で、胎児への子宮内送達もまた、企図される。

0036

rAAVでの形質導入はまた、インビトロで行われ得る。一実施形態において、所望の標的細胞は、被験体から取り出され、rAAVで形質導入され、被験体へと再導入される。あるいは、同系細胞もしくは異種細胞は、それら細胞が被験体において不適切免疫応答を生じない場合に使用され得る。

0037

被験体への形質導入および形質導入した細胞の再導入に適した方法は、当該分野で公知である。一実施形態において、細胞は、rAAVと上記細胞とを、例えば、適切な培地中で合わせ、目的のDNAを有する細胞を、従来の技術(例えば、サザンブロットおよび/もしくはPCR)を使用して、または選択マーカーを使用することによってスクリーニングすることによって、インビトロで形質導入され得る。形質導入された細胞は、次いで、薬学的組成物へと処方され得、上記組成物は、種々の技術によって(例えば、脊髄への注射によって)被験体へと導入され得る。

0038

本発明のrAAVゲノムは、AAV rep DNAおよびcap DNAを欠いている。上記rAAVゲノム中のAAV DNA(例えば、ITR)は、組換えウイルスが由来し得る任意のAAV血清型(AAV血清型 AAV−1、AAV−2、AAV−3、AAV−4、AAV−5、AAV−6、AAV−7、AAV−8、AAV−9、AAV−10およびAAV−11が挙げられるが、これらに限定されない)に由来し得る。上記AAV血清型のゲノムのヌクレオチド配列は、当該分野で公知である。例えば、AAV−1の完全ゲノムは、GenBankアクセッション番号NC_002077に提供され;AAV−2の完全ゲノムは、GenBankアクセッション番号NC_001401およびSrivastavaら、J. Virol., 45: 555−564 {1983)に提供され;AAV−3の完全ゲノムは、GenBankアクセッション番号NC_1829に提供され;AAV−4の完全ゲノムは、GenBankアクセッション番号NC_001829に提供され;AAV−5ゲノムは、GenBankアクセッション番号AF085716に提供され;AAV−6の完全ゲノムは、GenBankアクセッション番号NC_00 1862に提供され;AAV−7およびAAV−8ゲノムのうちの少なくとも一部は、それぞれGenBankアクセッション番号AX753246およびAX753249に提供され;AAV−9ゲノムは、Gaoら、J. Virol., 78: 6381−6388 (2004)に提供され;AAV−10ゲノムは、Mol. Ther., 13(1): 67−76 (2006)に提供され;そしてAAV−11ゲノムは、Virology, 330(2): 375−383 (2004)に提供される。

0039

別の局面において、本発明は、本発明のrAAVゲノムを含むDNAプラスミドを提供する。上記DNAプラスミドは、上記rAAVゲノムを、AAV9キャプシドタンパク質を有する感染性ウイルス粒子へとアセンブリするために、AAVのヘルパーウイルス(例えば、アデノウイルス、E1欠失アデノウイルスもしくはヘルペスウイルス)での感染を可能にする細胞に移される。rAAV粒子を生成する技術(ここでパッケージされる予定のAAVゲノム、rep遺伝子およびcap遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能が細胞に提供される)は、当該分野で標準的である。rAAVの生成は、以下の成分が単一の細胞(本明細書でパッケージング細胞と称される)内に存在することを必要とする:rAAVゲノム、上記rAAVゲノムとは別個(すなわち、その中にはない)AAV rep遺伝子およびcap遺伝子、ならびにヘルパーウイルス機能。偽型化(pseudotyped)rAAVの生成は、例えば、WO 01/83692(その全体において本明細書に参考として援用される)に開示される。種々の実施形態において、AAVキャプシドタンパク質は、組換えベクターの送達を増強するために改変され得る。キャプシドタンパク質の改変は、当該分野で一般に公知である。例えば、US 2005/0053922およびUS 2009/0202490(これらの開示は、それら全体において本明細書に参考として援用される)を参照のこと。

0040

パッケージング細胞を生成するための方法は、AAV粒子生成に必須の成分を全て安定して発現する細胞株を作製することである。例えば、AAV rep遺伝子およびcap遺伝子を欠いているrAAVゲノム、rAAVゲノムとは別個のAAV rep遺伝子およびcap遺伝子、ならびに選択マーカー(例えば、ネオマイシン耐性遺伝子)を含むプラスミド(もしくは複数のプラスミド)は、細胞のゲノムへと組みこまれる。AAVゲノムは、GCテール化(Samulskiら、1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077−2081)、制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む合成リンカーの付加(Laughlinら、1983, Gene, 23:65−73)のような手順によって、または直接の平滑末端ライゲーション(Senapathy & Carter, 1984, J. Biol. Chem., 259:4661−4666)によって、細菌プラスミドへと導入されてきた。上記パッケージング細胞株は、次いで、アデノウイルスのようなヘルパーウイルスに感染させられる。この方法の利点は、上記細胞が選択可能でありかつrAAVの大規模生成に適していることである。適切な方法の他の例は、パッケージング細胞へとrAAVゲノムならびに/もしくはrep遺伝子およびcap遺伝子を導入するために、プラスミドよりむしろ、アデノウイルスもしくはバキュロウイルスを使用する。

0041

rAAV生成の一般原則は、例えば、Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533−539;およびMuzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97−129)に総説されている。種々のアプローチが、以下に記載されている:Ratschinら、Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984); Hermonatら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984); Tratschinら、Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985); McLaughlinら、J. Virol., 62:1963 (1988);およびLebkowskiら、1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988). Samulskiら、(1989, J. Virol., 63:3822−3828); 米国特許第5,173,414号; WO 95/13365および対応の米国特許第5,658.776号; WO 95/13392; WO 96/17947; PCT/US98/18600; WO 97/09441 (PCT/US96/14423); WO 97/08298 (PCT/US96/13872); WO 97/21825 (PCT/US96/20777); WO 97/06243 (PCT/FR96/01064); WO 99/11764; Perrinら、(1995) Vaccine 13:1244−1250; Paulら、(1993) Human Gene Therapy 4:609−615; Clarkら、(1996) Gene Therapy 3:1124−1132;米国特許第5,786,211号;米国特許第5,871,982号;および米国特許第6,258,595号。前述の文書は、rAAV生成に関する文書のそれら節を特に強調して、それらの全体において本明細書に参考として援用される。

0042

本発明は、従って、感染性rAAVを生成するパッケージング細胞を提供する。一実施形態において、パッケージング細胞は、安定に形質転換された癌細胞(例えば、HeLa細胞、293細胞およびPerC.6細胞(同起源の293株))であり得る。別の実施形態において、パッケージング細胞は、形質転換された癌細胞ではない細胞(例えば、継代数が少ない293細胞(アデノウイルスのE1で形質転換したヒト胎児腎臓細胞)、MRC−5細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、WI−38細胞(ヒト胎児線維芽細胞)、Vero細胞サル腎臓細胞)およびFRhL−2細胞(アカゲザル胎仔肺細胞))である。

0043

他の実施形態において、本発明は、本発明のrAAVゲノムを含むrAAV9(すなわち、感染性キャプシド化rAAV9粒子)を提供する。本発明の一局面において、上記rAAVゲノムは、自己相補性ゲノムである。

0044

別の局面において、rAAVが提供される(例えば、「rAAVSMN」と称したrAAV9)。上記rAAV SMNゲノム(配列番号1のヌクレオチド980−3336)は、順に、AAV2 ITR、ニワトリβ−アクチンプロモーターサイトメガロウイルスエンハンサーSV40イントロン、SMNコードDNA((GenBankAccession Number NM_000344.2)に示される)、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列およびもう1つのAAV2 ITRを有する。SMN DNAの保存的ヌクレオチド置換もまた、企図される(例えば、GenBank Accession Number NM_000344.2の625位でのグアニンからアデニンへの変化)。ゲノムは、AAV rep DNAおよびcap DNAを欠いており、すなわち、上記ゲノムのITRの間にAAV rep DNAもcap DNAも存在しない。企図されるSMNポリペプチドとしては、NCBIタンパク質データベース番号NP_000335.1に示されるヒトSMN1ポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。SMN1調節因子ポリペプチドプラスチン−3(PLS3)もまた企図される[Opreaら、Science 320(5875): 524−527 (2008)]。他のポリペプチドをコードする配列は、SMN DNAに関して置換され得る。

0045

上記rAAVは、当該分野で標準的な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィーもしくは塩化セシウム勾配によって精製され得る。rAAVベクターをヘルパーウイルスから精製するための方法は、当該分野で公知であり、例えば、Clarkら、Hum. Gene Ther., 10(6): 1031−1039 (1999); Schenpp and Clark, MethodsMol. Med., 69: 427−443 (2002); 米国特許第6,566,118号およびWO 98/09657に開示される方法を含む。

0046

別の局面において、本発明は、本発明のrAAVを含む組成物を企図する。一実施形態において、本発明の組成物は、SMNポリペプチドをコードするrAAVを含む。他の実施形態において、本発明の組成物は、目的の種々のポリペプチドをコードする2つ以上のrAAVを含み得る。

0047

本発明の組成物は、薬学的に受容可能なキャリアの中にrAAVを含む。上記組成物はまた、希釈剤およびアジュバントのような他の成分を含み得る。受容可能なキャリア、希釈剤およびアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、好ましくは、使用される投与量および濃度で不活性であり、緩衝剤(例えば、ホスフェートシトレート、もしくは他の有機酸);抗酸化剤(例えば、アスコルビン酸);低分子量ポリペプチド;タンパク質(例えば、血清アルブミンゼラチン、もしくは免疫グロブリン);親水性ポリマー(例えば、ポリビニルピロリドン);アミノ酸(例えば、グリシングルタミンアスパラギンアルギニンもしくはリジン);モノサッカリドジサッカリド、および他の炭水化物グルコースマンノース、もしくはデキストリンが挙げられる);キレート剤(例えば、EDTA);糖アルコール(例えば、マンニトールもしくはソルビトール);塩形成対イオン(例えば、ナトリウム);ならびに/または非イオン性界面活性剤(例えば、Tween、ブルロニックもしくはポリエチレングリコール(PEG))を含む。

0048

本発明の方法において投与される予定のrAAVの力価は、例えば、特定のrAAV、投与様式、処置目標、個体、および標的となる細胞型に依存して変動し、当該分野で標準的な方法によって決定され得る。rAAVの力価は、約1×106から、約1×107、約1×108、約1×109、約1×1010、約1×1011、約1×1012、約1×1013、約1×1014以上までのDNase耐性粒子(DRP)/mlの範囲に及び得る。投与量はまた、ウイルスゲノムのユニット(vg)単位で表され得る。投与量はまた、ヒトへの投与のタイミングに基づいて変動し得る。rAAVのこれら投与量は、約1×1011 vg/kgから、約1×1012、約1×1013、約1×1014、約1×1015、約1×1016以上のウイルスゲノム/kg成人体重までの範囲に及び得る。新生児については、rAAVの投与量は、約1×1011、約1×1012、約3×1012、約1×1013、約3×1013、約1×1014、約3×1014、約1×1015、約3×1015、約1×1016、約3×1016以上のウイルスゲノム/kg 体重の範囲に及び得る。

0049

別の局面において、標的細胞(神経細胞もしくはグリア細胞が挙げられるが、これらに限定されない)をrAAVで形質導入するための方法は、本発明によって企図される。

0050

用語「形質導入」とは、レシピエント細胞による機能的ポリペプチドの発現を生じる本発明の複製欠損rAAVを介して、ポリヌクレオチドを標的細胞にインビボもしくはインビトロのいずれかで、投与/送達することをいうために使用される。

0051

本発明のrAAVでの細胞の形質導入は、上記rAAVによってコードされるポリペプチドもしくはRNAの持続的な発現を生じる。本発明は、従って、動物もしくはヒト患者に本発明のrAAV(例えば、SMNタンパク質をコードする)を投与/送達するための方法を提供する。これら方法は、神経細胞および/もしくはグリア細胞を1以上の本発明のrAAVで形質導入する工程を包含する。形質導入は、組織特異的制御エレメントを含む遺伝子カセットで行われ得る。例えば、プロモーターは、ニューロン内で特異的にもしくは星状細胞内で特異的に発現を可能にする。例としては、ニューロン特異的エノラーゼおよびグリア線維性酸性タンパク質プロモーターが挙げられる。摂取された薬物の制御下での誘導性プロモーターもまた、開発され得る。

0052

いくつかの局面において、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本開示のベクターが本明細書で記載されるとおりに造影剤と組み合わせて使用される場合に細胞の形質導入が増大されることは、予期される。種々の実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合に、少なくとも約1%、もしくは少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約120%、少なくとも約150%、少なくとも約180%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約350%、少なくとも約400%、少なくとも約450%、少なくとも約500%以上増大される。さらなる実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合、約10%〜約50%、もしくは約10%〜約100%、もしくは約5%〜約10%、もしくは約5%〜約50%、もしくは約1%〜約500%、もしくは約10%〜約200%、もしくは約10%〜約300%、もしくは約10%〜約400%、もしくは約100%〜約500%、もしくは約150%〜約300%、もしくは約200%〜約500%増大される。

0053

いくつかの局面において、細胞の形質導入は、本開示のベクターが造影剤と組み合わせて使用される場合および患者がトレンデレンブルグ体位(頭を低くした姿勢(head down position))に置かれる場合に、さらに増大されることが企図される。いくつかの実施形態において、例えば、上記患者は、髄腔内ベクター注入の間もしくは後に、約1度〜約30度、約15〜約30度、約30〜約60度、約60〜約90度、もしくは約90度を超えて約180度までで頭を低くした姿勢に傾けられる。種々の実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合に、少なくとも約1%、もしくは少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約120%、少なくとも約150%、少なくとも約180%、少なくとも約200%、少なくとも約250%、少なくとも約300%、少なくとも約350%、少なくとも約400%、少なくとも約450%、少なくとも約500%以上増大される。さらなる実施形態において、細胞の形質導入は、造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて使用されない場合の本開示のベクターの形質導入と比較して、本明細書で記載されるとおりに造影剤およびトレンデレンブルグ体位と組み合わせて本開示のベクターが使用される場合に、約10%〜約50%、もしくは約10%〜約100%、もしくは約5%〜約10%、もしくは約5%〜約50%、もしくは約1%〜約500%、もしくは約10%〜約200%、もしくは約10%〜約300%、もしくは約10%〜約400%、もしくは約100%〜約500%、もしくは約150%〜約300%、もしくは約200%〜約500%増大される。

0054

本開示はまた、本開示のベクターおよび造影剤の、必要な患者の中枢神経系への髄腔内投与が、本開示のベクターが上記造影剤の非存在下で投与される場合の患者の生存と比較して、上記患者の生存の増大を生じる局面を提供する。種々の実施形態において、本開示のベクターおよび造影剤の、必要な患者の中枢神経系への投与は、本開示のベクターが上記造影剤の非存在下で投与される場合の上記患者の生存と比較して、少なくとも約1%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%以上の上記患者の生存の増大を生じる。

0055

本開示はまた、本開示のベクターおよび造影剤の、トレンデレンブルグ体位に置かれた必要な患者の中枢神経系への髄腔内投与が、本開示のベクターが上記造影剤の非存在下およびトレンデレンブルグ体位をとらずに投与される場合の患者の生存と比較して、上記患者の生存のさらなる増大を生じる局面を提供する。種々の実施形態において、本開示のベクターおよび造影剤の、トレンデレンブルグ体位に置かれた必要な患者の中枢神経系への投与は、上記造影剤の非存在下およびトレンデレンブルグ体位をとらずに本開示のベクターが投与される場合の患者の生存と比較して、少なくとも約1%、少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約100%、少なくとも約150%、少なくとも約200%以上の患者の生存の増大を生じる。

0056

本発明の材料および方法を使用して送達されるポリヌクレオチドが当該分野で公知のシステムを使用して調節制御下に置かれ得ることは、当業者によって理解される。非限定的例によれば、テトラサイクリン(TETオンオフ)システム[例えば、TETシステムに対する近年の改善についてはUrlingerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97(14):7963-7968 (2000)を参照のこと]およびエクジソンレセプター調節可能システム[Palliら、Eur J. Biochem 270: 1308−1315 (2003]のようなシステムが誘導性ポリヌクレオチド発現を提供するために利用され得ることは、理解される。本明細書で企図される方法および材料のうちのいずれかの組み合わせが神経変性疾患を処置するために使用され得ることはまた、当業者によって理解される。

0057

本発明は、以下の実施例によって例証され、ここで実施例1は、例示的rAAV9の生成を記載し、実施例2は、rAAV9の髄腔内投与を記載し、実施例3は、rAAV9SMNと造影剤との脳室内(ICV注入後のSMN変異体マウスの生存の増大を記載し、実施例4は、カニクイザルにおけるrAAV9での運動ニューロン形質導入を記載する。

0058

実施例1
rAAV9が中枢神経系を標的として、そこでタンパク質を発現する能力を、インビボモデル系で評価した。rAAVゲノムは、先にBevanら、Molecular Therapy, 19(11): 1971−1980 (2011)に記載されるように、順に、AAV2 ITR、ニワトリβ−アクチンプロモーターとサイトメガロウイルスエンハンサー、SV40イントロン、緑色蛍光タンパク質(GFP)DNA、ウシ成長ホルモン由来のポリアデニル化シグナル配列およびもう1つのAAV2 ITRを含んだ。

0059

自己相補性AAV9(AAV9 GFP)を、293細胞においてアデノウイルスヘルパープラスミドpHelper(Stratagene, Santa Clara, CA)とともに以前に記載されるようにRep2Cap9配列をコードするプラスミドと、2本鎖AAV2−ITRベースのCB−GFPベクターを使用する一過性トランスフェクション手順によって生成した[Gaoら、J. Virol., 78: 6381-6388 (2004)]。血清型9配列を、配列決定によって確認したところ、以前に記載されるものと同一であった。ウイルスを、実験のために3つの別々のバッチで生成し、2回の塩化セシウム密度勾配精製工程によって精製し、PBSに対して透析し、0.001%プルロニック−F68とともに処方して、ウイルス凝集を防止し、4℃で貯蔵した。全てのベクター調製物を、Taq−Man技術を使用する定量的PCRによって力価測定した。ベクターの純度を、4-12%ドデシル硫酸ナトリウムアクリルアミドゲル電気泳動および銀染色(Invitrogen, Carlsbad, CA)によって評価した。

0060

実施例2
いくつかの神経学的障害は、遍在的に発現されるタンパク質の欠損によって引き起こされるものの、他の障害においては、CNSのみにおける遺伝子発現が実質的な影響を有し得る。本発明は、CSFへの遺伝子送達が脳脊髄軸に沿った形質導入と、必要とされる用量を潜在的に低下させるという付加的な利益を生じ得ることを企図する。従って、より局所化したCNS送達をもたらすために、5.2×1012 vg/kgのAAV9 GFPおよび非イオン性の低浸透性造影剤の、5日齢ブタ(各々n=3)への髄腔内注入および/もしくは槽内注入を行い、それらの脳および脊髄を、GFP発現について試験した。

0061

髄腔内注射農場繁殖した雌ブタ(Sus scrofa domestica)を、地域の農場から得た。5日齢(P5)の子に、0.5cc/kgケタミン導入麻酔を受けさせ、次いで、酸素中5%イソフルランマスク吸入によって維持した。体温心電図、および呼吸数を手順の間中モニターした。腰椎穿刺のために、子ブタをうつぶせにし、椎骨間腔を拡げるために脊椎弯曲させた。上前腸骨棘触診し、2点を繋ぐ線を視覚化した。この線の吻側にある椎骨間腔は、ほぼL5-L6である。手術中にX線透視で吻側−尾側および中外軌跡を確認した。滅菌技術を使用して、1mlシリンジに取り付けた25ゲージ針を挿入した。CSFの透明な飛び出しが見えるまでニードルを進めながら、軽い陰圧を上記シリンジに加えた。大槽穿刺のために、気道完全性を維持しながら子ブタの頭部を弯曲させた。X線透視で適切な軌跡を再び確認した。25ゲージ針を後頭骨の直ぐ尾側に入れ、透明なCSFが飛び出てくることから、大槽に入ったのを確認した。

0062

ベクターもしくはコントロールの送達のために、上記針を適所に保持すると同時に上記シリンジを外した。ウイルス溶液(5.2×1012 vg/kg)もしくはPBSのいずれかを含む第2の1ccシリンジを固定し、上記溶液を、ゆっくりと一定の速度で髄腔内空間へと注入した。送達後、約0.25mlの滅菌PBSを、試薬の完全な送達を確実にするように、脊椎の針を通して一気流し込んだ。イオヘキソール放射線不透過性薬剤[OmnipaqueTM(イオヘキソール、N,N’−ビス(2,3−ジヒドロキシプロピル)−5−[N(2,3−ジヒドロキシプロピル)−アセトアミド]−2,4,6−トリヨード(trioldo)−イソフタルアミド), GE Healthcare, Waukesha, WI]およびリアルタイム連続X線透視での髄腔内での拡散の記録。

0063

灌流および組織処理。全ての被験体を注入後21日〜24日の間の屠殺した。被験体を、テラゾール、続いて、プロポフォールの筋肉内注射によって深麻酔した。胸骨正中開胸術(midventral sternal thoracotomy)を行い、カニューレ左心室を通して大動脈に挿入した。右心房を開き、0.5〜1リットルのPBSを、重力流によってカニューレを通して注入し、続いて、リン酸緩衝液(pH 7.4)中の4%パラホルムアルデヒド1リットルで灌流した。器官を取り出し、組織学切片形成のためにさらに処理する前に4% パラホルムアルデヒド中で48時間後固定するか、または0.1% NaN3PBS溶液中で長期間貯蔵した。

0064

組織学および鏡検脊髄セグメントを3%アガロース中に包埋し、その後、LeicaVT1200バイブレティングミクロトーム(Leica Microsystems, Buffalo Grove,IL)を使用して40μm水平切片へと切断した。切片を、Tris緩衝化食塩水中に移し、処理するまで4℃で貯蔵した。10%、20%、および30%のスクロース溶液中で逐次的なインキュベーションをすることによって、脳を低温保護した。いったん十分に低温保護(30% スクロース溶液中に浸漬させる)した後、脳を凍結し、OCT(Tissue−Tek, Torrance, CA)中で改変LeicaSM2000Rスライディングミクロトーム(Leica Microsystems)上に全体をマウントし、40μm冠状面切片へと切断した。

0065

形質導入した細胞タイプの免疫蛍光決定のために、浮遊切片を、ブロッキング溶液(10%ロバ血清、Tris緩衝化食塩水中1% Triton−X100)の中に1時間沈め、続いて一次抗体溶液中、4℃で一晩インキュベートした。以下の一次抗体をこの研究で使用した:ウサギ抗GFP(1:500; Invitrogen)、ヤギ抗ChAT(1:100; Millipore, Billerica, MA)、モルモット抗GFAP(1:1,000; Advanced Immunochemical, Long Beach, CA)およびウサギ抗Iba1(1:500; Dako, Carpentaria, CA)。一次抗体を、Fitc結合体化、Cy3結合体化、もしくはCy5結合体化二次抗体(1:1,000; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)を使用して検出し、PVA−DABCO媒体にマウントした。

0066

免疫組織化学染色のために、切片を、0.5% H2O2/10% MeOH溶液中で室温においてインキュベートし、その後、ブロッキングし、ウサギ抗GFPで一晩上記のように染色した。抗GFP抗体を、ビオチン化ロバ抗ウサギ二次抗体(1:200; Jackson ImmunoResearch)を使用して検出し、提供されたプロトコルに従って、Vector NovaRedを使用して発色させた(Vector Labs, Burlingame, CA)。次いで、切片をCytoseal 60媒体(Thermo Fisher Scientific, Kalamazoo,MI)にマウントした。

0067

非神経組織を、約1cmの3ブロックに切断し、30%スクロース溶液中で一晩インキュベートすることによって低温保護した。次いで、それらをトラガカントガムの中に包埋し、液体窒素で冷却したイソペンタン中で急速凍結した。サンプルを、10〜12μm切片へとクリオスタットで切断し、スライドを−20℃で貯蔵した。GFP発現を、上記と類似の免疫蛍光プロトコルによって二次抗体溶液(1:1,000;Invitrogen)中にDAPIを添加して検出した。

0068

蛍光画像を、TRINCHに配置したZeiss 710 Meta共焦点顕微鏡(Carl Zeiss MicroImaging, Thornwood, NY)を使用して捕捉し、LSMソフトウェアで処理した。

0069

全脳切片を、Aperio自動化スライドスキャナー(Aperio, Vista, CA)を使用して、Nationwide Children’s Hospitalの研究所にあるResearch Informatics Coreの中のBiopathology Centerで×40解像度までスキャンし、得られた画像をImageScopeソフトウェアで処理した。

0070

全ての動物において、GFP発現は、後根神経節、ならびに脊髄の灰白質および白質において認められた。重要なことには、頭蓋基部の槽空間もしくはL5の髄腔内空間のいずれかへのAAV9 GFP注入は、インサイチュハイブリダイゼーションによって試験される場合、広範囲な運動ニューロン形質導入および脊髄の全てのレベルでグリアを生じた。大きな前角ニューロンはまた、脊髄の全てのレベルでの免疫組織化学によればGFP発現陽性であった。免疫蛍光によって、GFP+細胞が運動ニューロンマーカーChATを発現することが確認された。

0071

最後に、5歳のブタへのAAV9−GFPの槽内注入もしくは髄腔内注入後の発現のパターンをさらに特徴付けるために、脳を、GFP免疫蛍光を使用して、再び導入遺伝子発現について調べた。最高レベルのGFP発現を有する領域は、小脳プルキンエ細胞髄質内の神経線維、ならびにオリーブ核のような不連続核であった。脳の残りの中での発現は、髄膜表面近く散在した細胞に制限された。末梢器官におけるGFP発現の試験から、目に見えるGFP発現を生じなかった。このことは、ウイルスの大部分がCNSに局在したことを示す。

0072

従って、若いブタの脳脊髄液へのAAV9注入は、運動ニューロンを効率的に標的とした。

0073

実施例3
SMN変異体マウスの脳脊髄液(CSF)へのrAAV9 SMN[Foustら、Nature Biotechnology 28(3): 271−274 (2010)および本明細書中上記の説明を参照のこと。ここでベクターゲノム挿入物の配列は、配列番号1のヌクレオチド980〜3336として示される)]および造影剤のインビボ送達の効果を試験した。

0074

簡潔には、上記rAAV9SMNを造影剤と混合し、続いて、ICV注入して、上記組成物をSMN変異体マウスのCSFへと配置した。コントロール実験として、上記rAAV9 SMNベクターを、造影剤なしで別の群のSMN変異体マウスへと注入した。

0075

結果から、約108 vg/kgのrAAV9SMNと造影剤との注入が、20日というSMN変異体マウスのメジアン生存を生じる一方で、造影剤の非存在下での等量のrAAV9 SMNの注入は生存を生じないことを示した。

0076

約109 vg/kgのrAAV9SMNと造影剤との注入は、70日を超えるSMN変異体マウスのメジアン生存を生じた。対して、造影剤の非存在下で等量のrAAV9 SMNを注入したSMN変異体マウスの生存は認められなかった。

0077

最後に、約1010 vg/kgのrAAV9SMNと造影剤との注入は、100日を超えるSMN変異体マウスのメジアン生存を生じた。対して、造影剤の非存在下で等量のrAAV9 SMNを注入したSMN変異体マウスでは、70日のメジアン生存を生じた。

0078

従って、造影剤の非存在下でのrAAV9SMNの注射後のSMN変異体マウスの生存と比較して、SMN変異体マウスの生存は、rAAV9 SMNと造影剤との注射後に増大する。

0079

実施例4
3匹の1歳のカニクイザルに、1×1013 vg/KgのshRNAおよびGFPをコードするrAAV9の髄腔内注入を受けさせた。上記注入を、腰椎髄腔(lumbar thecal sac)のくも膜下腔への腰椎穿刺によって行った。上記rAAV9を、オムニパーク(イオヘキソール)(臨床状況慣用的に使用されるヨウ素化化合物)とともに再懸濁した。イオヘキソールを、くも膜下腔カニューレ挿入が成功したことを確認するために使用し、用量100mg/Kgを投与した。被験体を側臥位に配置し、ほぼL4/5レベルの後正中線注入部位脊髄円錐の下)を確認した。滅菌条件下で、スタイレット付きの脊髄穿刺針(spinal needle)を挿入し、くも膜下カニューレ挿入を針から透明なCSFが流れ出てくることで確認した。くも膜下腔での圧力を減らすために、0.8mlのCSFを排出し、直後に2.1mLのウイルスと混合した0.7mL イオヘキソール(300mg/ml処方物)を含む混合物(合計2.8ml)を注入した。上記ウイルスの吻側流動分布頸部領域の細胞形質導入を改善し得るか否かを調査するために、ある被験体を側臥位で回復させ、第2の被験体および第3の被験体を、トレンデレンブルグ体位(頭を低くした姿勢)にて傾けた。これは、ヒト被験体でCTミエログラムを行う場合の慣用的手順である。

0080

ウイルスを注入したカニクイザルを、注射後2週間で安楽死させた。動物に、80〜100mg/kgの用量において静脈内でペントバルビタールナトリウムで麻酔し、生理食塩水で灌流した。脳および脊髄の解剖を直ぐに行い、組織を、核酸単離のために処理するか(急速凍結)、または4%パラホルムアルデヒド中で後固定し、その後、30%スクロースで低温保護し、イソペンタン中で−65℃で凍結した。上記ウイルスによって形質導入された細胞を同定するために緑色蛍光タンパク質(GFP)を用いた、そして運動ニューロンを同定するためにコリンアセチルトランスフェラーゼ(Chat)を用いた遊離浮遊免疫染色のためにクリオスタットを使用して12μm冠状面切片を腰髄から集めた。二重陽性細胞を、頚髄胸髄(thoracic cord)および腰髄の10個の切片で計数し、それらの数を、同じセグメントの中のChat陽性細胞の総数に対して正規化した。

0081

細胞計数から、ウイルス注入後に被験体を傾けると、胸椎レベルおよび頚椎レベルでの運動ニューロン形質導入の2倍(100%)の改善を生じることが明らかにされた。

0082

本発明は、種々の実施形態および実施例に関して記載されてきたが、変形および改善他当業者に想起されることは理解される。従って、特許請求の範囲において現れるような限定のみが、本発明に対して定められるべきである。

実施例

0083

本明細書で言及される全ての文書は、それらの全体において参考として援用される。

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