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技術 DNAデンドリマーを使用するラテラルフローアッセイ

出願人 ジェニスフィア・エルエルシー
発明者 カスタ,ルイスジェイ.カズシン,ジェームスエム.ゲッツ,ロリエーゲッツ,ロバートシー.
出願日 2013年7月12日 (7年3ヶ月経過) 出願番号 2015-521872
公開日 2015年8月24日 (5年1ヶ月経過) 公開番号 2015-524557
状態 未査定
技術分野 微生物・酵素関連装置 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 構造的材料 吸収エレメント ウィック材料 公称サイズ 単量体層 試験ライン 手順ステップ ウィック内
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課題・解決手段

本発明は、DNAデンドリマーを使用するラテラルフローデバイスおよびラテラルフローキット、ならびにラテラルフローデバイスおよびラテラルフローキットを使用して分析物を検出するための方法に関する。より具体的には、DNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、試験試薬または結合性試薬は、分析物に特異的に結合する。

概要

背景

発明の背景
3DNA(登録商標DNAデンドリマーとは、もっぱらDNAを含む、特許権のある樹枝状分子である。クラスとしてのデンドリマーは、相互接続された天然または合成の単量体サブユニットから構築される、複雑で高度に分枝状の分子である。DNAデンドリマーは、それらの各々が、各鎖の中央部分に位置する配列相補性の領域を共有する2本のDNA鎖から作られる、DNA単量体から構築される(図1)。単量体は、作製工程において、サイズおよび形状の異なるDNAデンドリマーを調製するように組み合わされる(図2)。時間が経過するにつれてDNAデンドリマーが「ばらばらになる」ことを防止するために、場合によって、UV光を使用してソラーレン架橋剤のインターカレーションおよび活性化を介する工程において、化学的スポット溶接」を、成長しつつあるアセンブリーへと加える。デンドリマーは歴史的に、勾配超遠心分離後変性性のショ糖勾配において、それらのサイズおよび分子量に従い精製されてきた。

DNAデンドリマーはとりわけ、ニトロセルロースおよびナイロンを含む多様な膜基質へと非共有結合的固定化された核酸およびタンパク質を検出するための、膜ベースアッセイにおいて既に使用されている。これらのアッセイは典型的に、標的分析物に特異的なターゲティング部分または結合性部分を含有するように特異的に誘導体化されたデンドリマーの使用を必要とし、最適な結合のためには数時間〜一晩を要することが典型的であった。シグナル増幅由来する感度の改善は、アッセイの非デンドリマー変化形の5〜500倍の範囲であった。

DNAデンドリマーはまた、核酸(DNA/RNA)マイクロアレイELISA、ELOSA、ビーズベースイムノアッセイタンパク質アレイ、および他の類似のアッセイを含む他のいくつかの適用において、シグナル増幅剤として有用であることも示されている。これらのアッセイは全て、分析物または標的材料の基質への固定化であって、非共有結合的結合工程もしくは共有結合的結合工程を介する直接的な固定化、またはアッセイ工程の前もしくはアッセイ工程中のいくつかのステップを一般に必要とする、既に固定化されたリガンドへの結合を介する間接的な固定化を特徴とする。次いで、最大で数百の標識部分を含有するDNAデンドリマーは、分析物(または分析物に結合したリガンドに間接的に)およびデンドリマーの両方に同時に直接的に結合するターゲティングデバイスを介して分析物に直接的または間接的に結合し、これにより、多重標識されたデンドリマーと分析物との間の架橋を創出するであろう。これらのアッセイでは、デンドリマー上の標識部分(例えば、蛍光色素)から直接的に、またはシグナル発生部分の、デンドリマー上の結合部位への結合(例えば、ストレプトアビジン−HRPの、デンドリマーに結合させたビオチンへの結合)を介して間接的に、シグナルを発生させた。

概要

本発明は、DNAデンドリマーを使用するラテラルフローデバイスおよびラテラルフローキット、ならびにラテラルフローデバイスおよびラテラルフローキットを使用して分析物を検出するための方法に関する。より具体的には、DNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、試験試薬または結合性試薬は、分析物に特異的に結合する。

目的

発明の詳細な説明
開示の明確さのためであり、限定を目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

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請求項1

液体試料中分析物を検出するための試験デバイスであって、前記デバイスは、多孔性マトリックスを含み、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックス上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、試験試薬を含み、前記試験試薬は、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合するか、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体であり、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含み、a)前記分析物が、ポリヌクレオチドではないか、またはb)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含むか、またはc)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させるデバイス。

請求項2

前記第1の成分および前記第2の成分のうちの一方が、ポリヌクレオチドであり、他方が、非ポリヌクレオチド部分である、請求項1に記載の試験デバイス。

請求項3

前記分析物が、ポリペプチドまたは低分子であり、前記分析物に結合する前記試験試薬および/または結合性試薬が、前記ポリペプチドまたは低分子に結合する抗体である、請求項1に記載の試験デバイス。

請求項4

前記分析物が、ポリヌクレオチドであり、前記分析物に結合する前記試験試薬および/または結合性試薬が、前記分析物であるポリヌクレオチドと実質的に相補的な別のポリヌクレオチドである、請求項1に記載の試験デバイス。

請求項5

物質を、前記試験ゾーンより上流にある前記マトリックスの一部において乾燥させ、前記乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、前記試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、前記乾燥させた物質が、1)前記DNAデンドリマー、2)前記分析物に結合する前記第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体、および3)前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識のうちの少なくとも1つである、請求項1に記載の試験デバイス。

請求項6

1)前記DNAデンドリマー、2)前記分析物に結合する第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体、および3)前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識のうちの少なくとも2つが、互いに共有結合的に架橋されたものである、請求項1に記載の試験デバイス。

請求項7

前記DNAデンドリマーが、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む、請求項1に記載の試験デバイス。

請求項8

液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、請求項1に記載の試験デバイスと接触させるステップであり、前記液体試料を、前記試験デバイスの試験ゾーンの上流にある部位へと適用するステップと、b)前記液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、前記試験ゾーンへと移送するステップと、c)前記試験ゾーンにおける前記検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法。

請求項9

前記液体試料と、1)前記DNAデンドリマー、2)前記分析物に結合する第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体、および3)前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識のうちの少なくとも1つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、前記混合物を、前記試験デバイスへと適用する、請求項8に記載の方法。

請求項10

約0.001%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)、または約0.01%(v/v)以下のTween−20を含む液体中で実行される、請求項8に記載の方法。

請求項11

硫酸デキストランを含む液体中で実行される、請求項8に記載の方法。

請求項12

物質を、前記試験ゾーンより上流にある前記試験デバイスの一部において乾燥させ、前記乾燥させた物質を可溶化または再懸濁させ、前記試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送して、検出可能なシグナルを発生させ、前記乾燥させた物質が、1)前記DNAデンドリマー、2)前記分析物に結合する第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、前記分析物、または分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体、および3)前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識のうちの少なくとも1つである、請求項8に記載の方法。

請求項13

液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、前記デバイスは、多孔性マトリックスを含み、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックス上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、試験試薬を含み、前記試験試薬は、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合するか、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体であり、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する成分を含み、a)前記分析物が、ポリヌクレオチドではないか、またはb)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含むか、またはc)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させるデバイス。

請求項14

前記成分が、ポリヌクレオチドである、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項15

前記分析物が、ポリペプチドまたは低分子であり、前記分析物に結合する前記試験試薬および/または結合性試薬が、前記ポリペプチドまたは低分子に結合する抗体である、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項16

前記分析物が、ポリヌクレオチドであり、前記分析物に結合する前記試験試薬および/または結合性試薬が、前記分析物であるポリヌクレオチドと実質的に相補的な別のポリヌクレオチドである、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項17

物質を、前記試験ゾーンより上流にある前記マトリックスの一部において乾燥させ、前記乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、前記試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、前記乾燥させた物質が、1)前記DNAデンドリマー、および2)前記分析物に結合する前記第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体のうちの少なくとも1つである、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項18

前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含む、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項19

前記DNAデンドリマーが、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、または約900〜約1,100の前記検出可能な標識を含む、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項20

前記DNAデンドリマーが、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、または約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項21

前記DNAデンドリマーが、一層構造二層構造三層構造、または四層構造を構成する、請求項13に記載の試験デバイス。

請求項22

液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、請求項13に記載の試験デバイスと接触させるステップであり、前記液体試料を、前記試験デバイスの試験ゾーンの上流にある部位へと適用するステップと、b)前記液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、前記試験ゾーンへと移送するステップと、c)前記試験ゾーンにおける前記検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法。

請求項23

約0.001%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)、または約0.01%(v/v)以下のTween−20を含む液体中で実行される、請求項22に記載の方法。

請求項24

硫酸デキストランを含む液体中で実行される、請求項22に記載の方法。

請求項25

物質を、前記試験ゾーンより上流にある前記試験デバイスの一部において乾燥させ、前記乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、前記試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、前記乾燥させた物質が、1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結された前記DNAデンドリマー、および2)前記分析物に結合する第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、前記分析物、または分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体のうちの少なくとも1つである、請求項22に記載の方法。

請求項26

前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験ゾーンより上流にある前記試験デバイス上の位置において乾燥させ、前記乾燥させたDNAデンドリマーのうちの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が、液体により、前記試験ゾーンへと移動させるがこと可能な、請求項1から7および13から21のいずれかに記載の試験デバイス。

請求項27

前記DNAデンドリマーを、a)前記乾燥させたDNAデンドリマーを安定化させ、b)前記乾燥させたDNAデンドリマーの、液体に可溶化または再懸濁することを促進し、そして/またはc)前記乾燥させたDNAデンドリマーの可動性を促進させる材料の存在下で前記試験デバイス上の位置において乾燥させる、請求項26に記載の試験デバイス。

請求項28

前記材料が、タンパク質ペプチド多糖、糖、ポリマーゼラチン、および洗浄剤からなる群から選択される、請求項27に記載の試験デバイス。

請求項29

前記糖が、トレハロースおよび/またはスクロースである、請求項28に記載の試験デバイス。

請求項30

前記液体が、a)前記乾燥させたDNAデンドリマーを安定化させ、b)前記乾燥させたDNAデンドリマーの、前記液体に可溶化または再懸濁することを促進し、そして/またはc)前記乾燥させたDNAデンドリマーの可動性を促進させる材料を含む、請求項26から29のいずれかに記載の試験デバイス。

請求項31

前記材料が、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤からなる群から選択される、請求項30に記載の試験デバイス。

請求項32

前記タンパク質が、BSAであり、前記洗浄剤が、Tween−20である、請求項31に記載の試験デバイス。

請求項33

前記液体の容量が、少なくとも約20ul、25ul、30ul、35ul、40ul、45ul、50ul、55ul、60ul、65ul、70ul、75ul、80ul、85ul、90ul、95ul、100ul、110ul、120ul、150ul、200ul、300ul、400ul、500ulであるか、または500ulを超える容量である、請求項26から32のいずれかに記載の試験デバイス。

請求項34

前記DNAデンドリマーが、a)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約1〜2、2〜4、もしくは4〜8を含む1層DNAデンドリマー、b)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約1〜4、4〜8、もしくは8〜18を含む2層DNAデンドリマー、c)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約2〜6、6〜10、10〜18、18〜28、28〜38、38〜50、もしくは50超を含む3層DNAデンドリマー、および/またはd)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約15〜25、25〜45、45〜60、60〜80、85〜105、105〜130、もしくは130超を含む4層DNAデンドリマーを含む、請求項1から7、13から21、および26から33のいずれかに記載の試験デバイス。

請求項35

前記第1の成分および前記第2の成分のうちの少なくとも一方がポリヌクレオチドであり、他方が、非ポリヌクレオチド部分である、請求項34に記載の試験デバイス。

請求項36

前記DNAデンドリマーが、a)前記第1の成分のうちの約1〜2、2〜4、もしくは4〜8を含む1層DNAデンドリマー、b)前記第1の成分のうちの約1〜4、4〜8、もしくは8〜18を含む2層DNAデンドリマー、c)前記第1の成分のうちの約2〜6、6〜10、10〜18、18〜28、28〜38、38〜50、もしくは50超を含む3層DNAデンドリマー、および/またはd)前記第1の成分のうちの約15〜25、25〜45、45〜60、60〜80、85〜105、105〜130、もしくは130超を含む4層DNAデンドリマーを含む、請求項34に記載の試験デバイス。

請求項37

前記第1の成分が、ポリヌクレオチドを含む、請求項36に記載の試験デバイス。

請求項38

前記ポリヌクレオチドが、DNA鎖である、請求項37に記載の試験デバイス。

請求項39

液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、請求項26から38のいずれかに記載の試験デバイスと接触させるステップであり、前記液体試料を、前記試験デバイスの試験ゾーンの上流にある部位へと適用するステップと、b)前記液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、前記試験ゾーンへと移送するステップと、c)前記試験ゾーンにおける前記検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法。

請求項40

前記検出可能な標識が前記試験ゾーンにおいて発生させる前記シグナルを、a)より少数の第1および/もしくは第2の成分を含むDNAデンドリマーを使用して、前記検出可能な標識が前記試験ゾーンにおいて発生させるシグナルと比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、もしくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍以上増強するか、またはb)DNAデンドリマーを使用せずに、前記検出可能な標識が前記試験ゾーンにおいて発生させるシグナルと比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200倍以上増強する、請求項39に記載の方法。

請求項41

液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、前記デバイスは、多孔性マトリックスを含み、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックス上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、試験試薬を含み、前記試験試薬は、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体であり、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示すことが可能であり、a)前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むか、またはb)前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、もしくは前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第3の成分を含み、c)前記分析物が、ポリヌクレオチドではなく、そして/またはd)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含み、そして/またはe)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させるデバイス。

請求項42

液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、請求項41に記載の試験デバイスと接触させるステップであり、前記液体試料を、前記試験デバイスの試験ゾーンの上流にある部位へと適用するステップと、b)前記液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、前記試験ゾーンへと移送するステップと、c)前記試験ゾーンにおける前記検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法。

請求項43

液体試料中の分析物を検出するためのキットであって、a)多孔性マトリックスであって、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックス上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスと、b)DNAデンドリマーとを含み、1)前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むか、または2)前記DNAデンドリマーが、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結され、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、もしくは前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第3の成分を含むキット。

請求項44

前記DNAデンドリマーが、前記第1または第3の成分のうちの約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200を含む、請求項43に記載のキット。

請求項45

前記第1の成分および前記第2の成分のうちの一方が、ポリヌクレオチドであり、他方が、非ポリヌクレオチド部分である、請求項43または44に記載のキット。

請求項46

前記第3の成分が、ポリヌクレオチドである、請求項43または44に記載のキット。

請求項47

1)前記DNAデンドリマー、2)前記分析物に結合する前記第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体、および3)前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識のうちの少なくとも2つが、互いに共有結合的に結合または架橋されている、請求項43から45のいずれかに記載のキット。

請求項48

前記DNAデンドリマーが、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、または約900〜約1,100の前記検出可能な標識を含む、請求項43から47のいずれかに記載のキット。

請求項49

前記DNAデンドリマーが、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、または約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む、請求項43から48のいずれかに記載のキット。

請求項50

前記DNAデンドリマーが、一層構造、二層構造、三層構造、もしくは四層構造、または米国特許第6,274,723B1号に記載されている、少なくとも1つの単量体ユニットを含むDNAデンドリマー構造を構成する、請求項43から49のいずれかに記載のキット。

請求項51

抗体−オリゴコンジュゲート、分析物捕捉抗体ストレプトアビジン−標識、例えば、金粒子、コンジュゲート、または他の標識、緩衝液、試薬、指示書などのうちの1または複数をさらに含む、請求項43から50のいずれかに記載のキット。

技術分野

0001

関連出願への相互参照
本願は、「LATERALFLOW ASSAYS USING DNA DENDRIMERS」と題された、2012年7月13日に出願された米国仮特許出願第61/671,662号、および「LATERAL FLOW ASSAYS USING DNA DENDRIMERS」と題された、2013年3月15日に出願された米国特許出願第13/844,601号の優先権の利益を主張する。上述の出願の全体の内容は、本明細書中に参考として援用される。

0002

技術分野
本発明は、DNAデンドリマーを使用する新規ラテラルフローデバイスおよびラテラルフローキット、ならびにラテラルフローデバイスおよびラテラルフローキットを使用して分析物を検出するための方法に関する。

背景技術

0003

発明の背景
3DNA(登録商標)DNAデンドリマーとは、もっぱらDNAを含む、特許権のある樹枝状分子である。クラスとしてのデンドリマーは、相互接続された天然または合成の単量体サブユニットから構築される、複雑で高度に分枝状の分子である。DNAデンドリマーは、それらの各々が、各鎖の中央部分に位置する配列相補性の領域を共有する2本のDNA鎖から作られる、DNA単量体から構築される(図1)。単量体は、作製工程において、サイズおよび形状の異なるDNAデンドリマーを調製するように組み合わされる(図2)。時間が経過するにつれてDNAデンドリマーが「ばらばらになる」ことを防止するために、場合によって、UV光を使用してソラーレン架橋剤のインターカレーションおよび活性化を介する工程において、化学的スポット溶接」を、成長しつつあるアセンブリーへと加える。デンドリマーは歴史的に、勾配超遠心分離後変性性のショ糖勾配において、それらのサイズおよび分子量に従い精製されてきた。

0004

DNAデンドリマーはとりわけ、ニトロセルロースおよびナイロンを含む多様な膜基質へと非共有結合的固定化された核酸およびタンパク質を検出するための、膜ベースアッセイにおいて既に使用されている。これらのアッセイは典型的に、標的分析物に特異的なターゲティング部分または結合性部分を含有するように特異的に誘導体化されたデンドリマーの使用を必要とし、最適な結合のためには数時間〜一晩を要することが典型的であった。シグナル増幅由来する感度の改善は、アッセイの非デンドリマー変化形の5〜500倍の範囲であった。

0005

DNAデンドリマーはまた、核酸(DNA/RNA)マイクロアレイELISA、ELOSA、ビーズベースイムノアッセイタンパク質アレイ、および他の類似のアッセイを含む他のいくつかの適用において、シグナル増幅剤として有用であることも示されている。これらのアッセイは全て、分析物または標的材料の基質への固定化であって、非共有結合的結合工程もしくは共有結合的結合工程を介する直接的な固定化、またはアッセイ工程の前もしくはアッセイ工程中のいくつかのステップを一般に必要とする、既に固定化されたリガンドへの結合を介する間接的な固定化を特徴とする。次いで、最大で数百の標識部分を含有するDNAデンドリマーは、分析物(または分析物に結合したリガンドに間接的に)およびデンドリマーの両方に同時に直接的に結合するターゲティングデバイスを介して分析物に直接的または間接的に結合し、これにより、多重標識されたデンドリマーと分析物との間の架橋を創出するであろう。これらのアッセイでは、デンドリマー上の標識部分(例えば、蛍光色素)から直接的に、またはシグナル発生部分の、デンドリマー上の結合部位への結合(例えば、ストレプトアビジン−HRPの、デンドリマーに結合させたビオチンへの結合)を介して間接的に、シグナルを発生させた。

発明が解決しようとする課題

0006

したがって、とりわけ、より高感度ラテラルフローアッセイのために、現在の技術および方法の限界を克服するデバイスおよび方法が必要とされている。本発明は、これらの必要および他の関連の必要に取り組む。

課題を解決するための手段

0007

発明の簡単な要旨
一態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、その上に試験ゾーンを含む多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスを含み、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し(または液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過することが可能であり)、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むデバイスを提示する。

0008

いくつかの実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドではないか、またはDNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の第1の成分を含むか、またはDNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。いくつかの実施形態では、試験試薬または結合性試薬は、分析物に特異的に結合する。

0009

別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、上記の試験デバイスと接触させるステップであり、液体試料を、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位に適用するステップと、b)液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、試験ゾーンへと移送するステップと、c)試験ゾーンにおける検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、液体試料中の分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法を提示する。

0010

さらに別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、その上に試験ゾーンを備える多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスを含み、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し(または液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過することが可能であり)、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する成分を含むデバイスを提示する。

0011

いくつかの実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドではないか、またはDNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の第1の成分を含むか、またはDNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。いくつかの実施形態では、試験試薬または結合性試薬は、分析物に特異的に結合する。

0012

なおも別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、上記の試験デバイスと接触させるステップであり、液体試料を、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位に適用するステップと、b)液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、試験ゾーンへと移送するステップと、c)試験ゾーンにおける検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、液体試料中の分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法を提示する。

0013

なおも別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、その上に試験ゾーンを備える多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスを含み、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示すことが可能であり、a)前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むか、またはb)前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、もしくは前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第3の成分を含み、c)前記分析物が、ポリヌクレオチドではなく、および/またはd)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含み、および/またはe)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させるデバイスを提示する。また、上記のデバイスを使用して液体試料中の分析物を検出するための方法も提供される。

0014

なおも別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するためのキットであって、a)その上に試験ゾーンを備える多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスと、b)DNAデンドリマーとを含み、1)前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むか、または2)前記DNAデンドリマーが、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結され、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、もしくは前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第3の成分を含むキットを提示する。

0015

本試験デバイス、本試験キット、および本試験方法原理は、当技術分野で公知のラテラルフロー試験デバイスおよびラテラルフロー試験アッセイへと適用するか、またはこれらへと適用するように適合させることができる。例えば、本試験デバイスおよび方法の原理は、米国特許第3,641,235号、同第3,959,078号、同第3,966,897号、同第4,094,647号、同第4,168,146号、同第4,299,916号、同第4,347,312号、同第4,366,241号、同第4,391,904号、同第4,425,438号、同第4,517,288号、同第4,960,691号、同第5,141,875号、同第4,857,453号、同第5,073,484号、同第4,695,554号、同第4,703,017号、同第4,743,560号、同第5,075,078号、同第5,591,645号、同第5,656,448号、同第RE38,430E号、同第5,602,040号、同第6,017,767号、同第6,319,676号、同第6,352,862号、同第6,485,982号、同第5,120,643号、同第4,956,302号、同第RE39,664E号、同第5,252,496号、同第5,514,602号、同第7,238,538B2号、同第7,175,992B2号、同第6,770,487B2号、同第5,712,170号、同第5,275,785号、同第5,504,013号、同第6,156,271号、同第6,187,269号、同第6,399,398号、同第7,317,532号、EP0,149,168A1、EP0,323,605A1、EP0,250,137A2、GB1,526,708、およびWO99/40438において開示および/または特許請求されているラテラルフロー試験デバイスおよびラテラルフロー試験アッセイへと適用するか、またはこれらへと適用するように適合させることができる。

0016

本特許または本出願ファイルは、色刷りで作成された少なくとも1つの図面を含有する。色刷りの図面を伴う本特許または特許出願公開コピーは、申請および必要な手数料納付を行えば、特許により頒布されよう。

図面の簡単な説明

0017

図1は、例示的な標準的なラテラルフロー「ポイントオブケア」アッセイフォーマットを例示する。

0018

図2は、例示的なデンドリマー増強型ラテラルフロー「ポイントオブケア」アッセイフォーマットを例示する。デンドリマー−抗体試薬は、コンジュゲートパッド上でドライダウンさせて用意する。ラテラルフローアッセイの間、デンドリマーは、試験ラインにおいて、高濃度金粒子回収および濃縮し、これにより、捕捉されるタンパク質分子についてのシグナル強度を、標準的な非デンドリマーアッセイを超えて増大させる。

0019

図3は、DNAデンドリマーの例示的な作製:デンドリマー構造のステップ式「アセンブリー」を例示する。デンドリマーは、制御されたステップバイステップの工程において添加される、5つの部分的に二本鎖の「単量体」からアセンブルされる。いくつかの実施形態では、最終的なデンドリマーマトリックス構造は、アセンブリー工程におけるソラーレン(psorlen)架橋形成インターカレーション試薬の添加を介して、完全に共有結合的である。

0020

図4は、イムノアッセイのためのターゲティング抗体および標識を含有する例示的なデンドリマー分子を例示する。

0021

図5(a)は、hCGラテラルフローPOCアッセイモデル(直接的サンドイッチ法)における、3DNAデンドリマーによるタンパク質検出を例示する。

0022

図5(b)は、DNAデンドリマーを例示し、抗hCG抗体−オリゴコンジュゲートおよび金試薬を、例示的なデンドリマーラテラルフローアッセイを実施するときの液体成分として添加した。いくつかの実施形態では、3DNAデンドリマーアッセイの感度は、標準的な抗hCG金アッセイの16倍であり、標準的なビオチニル化抗hCG SA−金アッセイの約32倍である。

0023

図5(c)は、3DNAデンドリマー「ウェット」アッセイの、2つの標準的なアッセイとの比較を例示する。

0024

図6(a)は、hCGラテラルフローPOCアッセイモデル(間接的サンドイッチ法)における、3DNAデンドリマーによるタンパク質検出を例示する。

0025

図6(b)は、DNAデンドリマーを例示し、抗hCG抗体−オリゴコンジュゲート、天然抗体、および金試薬を、例示的なデンドリマーラテラルフローアッセイを実施するときの液体成分として添加した。いくつかの実施形態では、3DNAデンドリマーアッセイの感度は、標準的な抗hCG金アッセイの16倍であり、標準的なビオチニル化抗hCG SA−金アッセイの約32倍である。

0026

図7は、マルチステップデンドリマーLFアッセイの、例示的な1ステップ型完全ドライダウンアッセイへの転換を例示する。

0027

図8(a)は、例示的な蛍光3DNAデンドリマーによるラテラルフロータンパク質検出:直接的に標識された蛍光抗体との比較を例示する。

0028

図8(b)は、例示的な蛍光3DNAデンドリマーによるラテラルフロー(LF:lateral flow)タンパク質検出:直接的に標識された蛍光抗体との比較を例示する。

0029

図9は、実施例10において使用されるラテラルフローデバイスを例示する。

0030

図10は、抗体−オリゴコンジュゲートを伴わずに乾燥させ、hCGラテラルフローアッセイを含有するHF90ニトロセルロース上で走らせたデンドリマーの結果を例示する。

0031

図11は、抗体−オリゴコンジュゲートを伴わずに乾燥させ、hCGラテラルフローアッセイを含有するHF180ニトロセルロース上で走らせたデンドリマーの結果を例示する。

0032

図12は、抗体−オリゴコンジュゲートと共に乾燥させ、hCGラテラルフローアッセイを含有するHF90ニトロセルロース上で動かしたデンドリマーの結果を例示する。

0033

図13は、DCN評定ステムを例示する。

0034

図14は、実施例11における試験結果を例示する。

0035

発明の詳細な説明
開示の明確さのためであり、限定を目的とするものではないが、本発明についての詳細な記載を、後続小節に分ける。

0036

A.定義
別段に規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及される全ての特許、出願、出願公開、および他の刊行物は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。本節において示される定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、出願公開、および他の刊行物において示される定義に反するかまたはこれと他の形で齟齬を来す場合は、本節において示される定義が、参照により本明細書に組み込まれる定義に優先される。

0037

本明細書で使用される「a」または「an」とは、「少なくとも1つの」または「1または複数の」を意味する。

0038

本明細書で使用される「結合性試薬」とは、標的または分析物に所望のアフィニティーおよび/または特異性で結合する任意の物質を指す。結合性試薬の非限定的な例は、細胞細胞小器官ウイルス粒子微粒子、分子、または凝集物もしくはその複合体、または分子の凝集物もしくは複合体を含む。例示的な結合性試薬は、アミノ酸ペプチド、タンパク質、例えば、抗体または受容体ヌクレオシドヌクレオチドオリゴヌクレオチド、核酸、例えば、DNAまたはRNA、ビタミン単糖オリゴ糖炭水化物、脂質、アプタマー、およびこれらの複合体でありうる。

0039

「抗体」とは、免疫グロブリン分子可変領域に位置する少なくとも1つの抗原認識部位を介する、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的への特異的結合が可能な免疫グロブリン分子であり、任意のクラスの免疫グロブリン、例えば、IgGIgMIgAIgD、およびIgEでありうる。また、ニワトリなどの鳥類において主要な抗体種類であるIgYも定義内に含まれる。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、無傷ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、また、これらの断片(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fvなど)、単鎖(ScFv)、これらの突然変異体自然発生変異体、必要とされる特異性を有する抗原認識部位を伴う抗体部分を含む融合タンパク質ヒト化抗体キメラ抗体、および必要とされる特異性を有する抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変された立体配置包摂する。

0040

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量存在する自然に発生しうる突然変異を除いて同一な集団を含む抗体、を指す。本明細書で用いられる、「モノクローナル抗体」は、モノクローナル抗体の機能的断片もさらに指す。

0041

本明細書で使用される「抗原」という用語は、抗体がその抗原認識部位を介して特異的に結合する標的分子を指す。抗原は、一価の場合もあり、多価の場合もある、すなわち、抗原は、1または複数の抗体により認識される1または複数のエピトープを有しうる。抗体により認識されうる抗原の種類の例は、ポリペプチド、オリゴ糖、糖タンパク質、ポリヌクレオチド、脂質などを含む。

0042

本明細書で使用される「〜に特異的に結合する」という用語は、規定の分析物または標的に優先的に結合するような結合性試薬、例えば、抗体の特異性を指す。他の潜在的な干渉性物質の存在下における、結合性試薬または抗体による特定の分析物または標的の認識は、このような結合の1つの特徴である。いくつかの実施形態では、分析物に特異的に結合する結合性試薬は、被験試料中の1または複数の他の干渉性部分への結合を回避する。

0043

本明細書で使用される「結合を回避する」という用語は、特定の結合性試薬、例えば、抗体または抗体断片の特異性を指す。特定の部分への結合を回避する結合性試薬、抗体、または抗体断片は一般に、特定の部分に高い割合で、このような結合性試薬、抗体、または抗体断片が結合しないような特異性を有する。この比率は一般に、特異的な標的の検出を指向する結合性試薬または抗体を活用するアッセイの干渉性部分との許容可能な交差反応性比率のうちにある。本開示の結合性試薬、抗体、または抗体断片は、干渉性部分のうちの約90%超に対する結合を回避することがしばしばであるが、より大きな比率が想定され、好ましいことが明らかである。例えば、本開示の結合性試薬、抗体、または抗体断片は、干渉性部分のうちの約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%、および約99%以上に対する結合を回避する。それほどしばしばではないが、本開示の結合性試薬、抗体、または抗体断片は、干渉性部分のうちの約70%超、または約75%超、または約80%超、または約85%超に対する結合を回避する。

0044

本明細書で使用される「哺乳動物」とは、哺乳動物クラスの種のうちのいずれかを指す。本明細書で使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ヒト対象、またはヒト患者を指すことがしばしばである。

0045

本明細書で使用される「対象」という用語は、特殊な種または試料種類に限定されない。例えば、「対象」という用語は、患者を指す場合があり、しばしば、ヒト患者を指す。しかし、この用語は、ヒトに限定されず、したがって、様々な哺乳動物種を包摂する。

0046

本明細書で使用される「試料」という用語は、それについての分析物アッセイが所望される分析物を含有しうる任意のものを指す。試料は、生物学的流体または生物学的組織などの生物学的試料でありうる。生物学的流体の例は、尿、血液、血漿血清唾液精液糞便脳脊髄液涙液粘液羊水などを含む。生物学的組織とは、通常、それらの細胞間物質と併せた、特定の種類の細胞の凝集物であり、結合組織上皮組織筋肉組織、および神経組織を含む、ヒト構造、動物構造、植物構造、細菌構造、真菌構造、またはウイルス構造の構造的材料のうちの1つを形成する。生物学的組織の例はまた、臓器腫瘍リンパ節動脈、および個々の細胞も含む。

0047

本明細書で使用される「単離」という用語は、その元の環境から取り出され、その天然の状態から改変された材料を指す。例えば、単離ポリペプチドは、担体へとカップリングすることができるが、そのポリペプチドは、その元の環境にないため、やはり「単離」されている。

0048

本明細書で使用されるハイスループットスクリーニングHTS:high−throughput screening)とは、多様な化学的構造の試料など、多数の試料を、疾患標的に照らして調べて、「ヒット」を同定する工程を指す(例えば、Broachら、High throughput screening for drugdiscovery、Nature、384巻:14〜16頁(1996年);Janzenら、High throughput screening as adiscovery tool in the pharmaceutical industry、LabRobotics Automation:8261〜265頁(1996年);Fernandes、P.B.、Letter from the society president、J. Biomol. Screening、2巻:1頁(1997年);Burbaumら、New technologies for high-throughput screening、Curr. Opin. Chem. Biol.、1巻:72〜78頁(1997年)を参照されたい)。HTS操作は、試料調製、アッセイ手順、およびその後の大容量のデータの処理に対処するように、高度に自動化およびコンピュータ化されている。

0049

本明細書では、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸、例えば、少なくとも5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1,000以上のアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状の場合もあり、分枝状の場合もあり、修飾アミノ酸を含むことが可能であり、非アミノ酸遮断することができる。「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語はまた、天然で修飾されたアミノ酸ポリマーまたは介入により、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化リン酸化、もしくは標識成分とのコンジュゲーションなど、他の任意の操作もしくは修飾により修飾されたアミノ酸ポリマーも包摂する。定義内にはまた、例えば、アミノ酸の1または複数の類似体(例えば、非天然アミノ酸などを含む)のほか、当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドも含まれる。

0050

本明細書では、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、互換的に使用され、任意の長さ、例えば、少なくとも8、9、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、1,000ヌクレオチド以上のヌクレオチドのポリマー形態を指し、リボヌクレオチドデオキシリボヌクレオチド、これらの類似体、またはこれらの混合物を含みうる。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、三本鎖デオキシリボ核酸、二本鎖デオキシリボ核酸、および一本鎖デオキシリボ核酸(「DNA」)のほか、三本鎖リボ核酸二本鎖リボ核酸、および一本鎖リボ核酸(「RNA」)を含む。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語はまた、例えば、アルキル化により、および/またはキャッピングにより修飾された形態、および非修飾形態のポリヌクレオチドも含む。より特定すると、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、スプライシングされている場合であれ、スプライシングされていない場合であれ、tRNArRNA、hRNA、およびmRNAを含む、ポリデオキシリボヌクレオチド(2−デオキシ−D−リボースを含有する)、ポリリボヌクレオチド(D−リボースを含有する)、プリン塩基またはピリミジン塩基のN−グリコシドまたはC−グリコシドである、他の任意の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド(例えば、ペプチド核酸(「PNA」))ポリマーおよびポリモルホリノ(Anti−Virals,Inc.、Corvallis、OR.からNeugeneとして市販されている)ポリマー、ならびにポリマーがDNA内およびRNA内で見出される塩基対合および塩基スタッキングなどを可能とする立体配置内にヌクレオ塩基を含有することを条件として、他の合成の配列特異的核酸ポリマーを含む。したがって、これらの用語は、例えば、3’−デオキシ−2’,5’−DNA、オリゴデオキシリボヌクレオチドのN3’〜P5’におけるホスホルアミデート、2’−O−アルキル置換RNA、DNAとRNAとの間のハイブリッド体、またはPNAとDNAもしくはRNAとの間のハイブリッド体を含み、また、公知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、ヌクレオチドのうちの1または複数の類似体による置換、例えば、非帯電連結(例えば、ホスホン酸メチルホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど)によるヌクレオチド間修飾、負に帯電させた連結(例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど)によるヌクレオチド間修飾、および正に帯電させた連結(例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル)によるヌクレオチド間修飾、例えば、タンパク質(酵素(例えば、ヌクレアーゼ)、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−L−リシンなどを含む)などのペンダント部分を含有するヌクレオチド間修飾、インタカレート剤(例えば、アクリジン、ソラーレンなど)を伴うヌクレオチド間修飾、キレート剤(例えば、金属、放射性金属ホウ素、酸化金属などによるキレート剤)を含有するヌクレオチド間修飾、アルキル化剤を含有するヌクレオチド間修飾、修飾された連結(例えば、アルファアノマー核酸など)によるヌクレオチド間修飾などのヌクレオチド間修飾のほか、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態も含む。

0051

本明細書で使用される「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリン塩基およびピリミジン塩基だけでなく、また、修飾された他の複素環塩基も含有する部分を含むことが察知されるであろう。このような修飾は、メチル化プリンもしくはメチル化ピリミジンアシル化プリンもしくはアシル化ピリミジン、または他の複素環を含む。修飾ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオチドはまた、糖部分上の修飾であって、例えば、ヒドロキシル基のうちの1または複数が、ハロゲン脂肪族基で置きかえられているか、またはエーテルアミンなどとして官能化された修飾も含みうる。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包摂することを意図する。

0052

核酸プローブ」と「プローブ」とは、互換的に使用され、対応する標的に結合しうる核酸配列を含有する、上記で定義されたポリヌクレオチドを含む構造を指す。プローブのポリヌクレオチド領域は、DNA、および/またはRNA、および/または合成のヌクレオチド類似体からなりうる。

0053

本明細書で使用される「相補的またはマッチ」とは、2つの核酸配列が、少なくとも50%の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、2つの核酸配列は、少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。「相補的またはマッチ」はまた、2つの核酸配列が、低度な厳密性の条件下、中程度の厳密性の条件下、および/または高度な厳密性の条件下でハイブリダイズしうることも意味する。

0054

本明細書で使用される「実質的に相補的または実質的にマッチ」とは、2つの核酸配列が、少なくとも90%の配列同一性を有することを意味する。好ましくは、2つの核酸配列は、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%、または100%の配列同一性を有する。代替的に、「実質的に相補的または実質的にマッチ」とは、2つの核酸配列が、高度な厳密性の条件下でハイブリダイズしうることを意味する。

0055

一般に、ハイブリッド体の安定性とは、イオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低度な厳密性の条件下で実施するのに続き、変化させるがより高度な厳密性で洗浄を行う。中程度に厳密なハイブリダイゼーションとは、プローブなどの核酸分子が、相補的核酸分子に結合することを許容する条件を指す。ハイブリダイズさせた核酸分子は一般に、例えば、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、または95%の同一性のうちのいずれかを含む、少なくとも60%の同一性を有する。中程度に厳密な条件とは、42℃で、50%のホルムアミド、5倍濃度のデンハルト液、5倍濃度のSSPE、0.2%のSDS中のハイブリダイゼーションに続く、42℃で、0.2倍濃度のSSPE、0.2%のSDS中の洗浄と同等な条件である。高度な厳密性の条件は、例えば、42℃で、50%のホルムアミド、5倍濃度のデンハルト液、5倍濃度のSSPE、0.2%のSDS中のハイブリダイゼーションに続く、65℃で、0.1倍濃度のSSPEおよび0.1%のSDS中の洗浄によりもたらすことができる。低度な厳密性のハイブリダイゼーションとは、22℃で、10%のホルムアミド、5倍濃度のデンハルト液、6倍濃度のSSPE、0.2%のSDS中のハイブリダイゼーションに続く、37℃で、1倍濃度のSSPE、0.2%のSDS中の洗浄と同等な条件を指す。デンハルト液は、1%のFicoll、1%のポリビニルピロリドン、および1%のウシ血清アルブミンBSA)を含有する。20倍濃度のSSPE(塩化ナトリウムリン酸ナトリウムエチレンジアミド四酢酸EDTA))は、3Mの塩化ナトリウム、0.2Mのリン酸ナトリウム、および0.025MのEDTAを含有する。当業者には、他の適する中程度の厳密性および高度な厳密性のハイブリダイゼーション緩衝液および条件が周知であり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A LaboratoryManual、2版、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.(1989年);およびAusubelら、Short Protocols in MolecularBiology、4版、John Wiley & Sons(1999年)において記載されている。

0056

代替的に、実質的な相補性は、RNA鎖またはDNA鎖が、その相補体と、選択的なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする場合にも存在する。典型的に、選択的なハイブリダイゼーションは、少なくとも14〜25ヌクレオチドの連なりにわたり少なくとも約65%の相補性、好ましくは少なくとも約75%、より好ましくは少なくとも約90%の相補性が存在する場合に生じるであろう。Kanehisa(1984年)、Nucleic AcidsRes.、12巻:203〜215頁を参照されたい。

0057

本明細書で使用される「生物学的試料」とは、高分子および生体分子生物供給源もしくはウイルス供給源、または他の供給源から得られる任意の試料を指し、核酸もしくはタンパク質または他の高分子を得うる、対象の任意の細胞型または組織を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接的に得られる試料の場合もあり、加工された試料の場合もある。例えば、増幅された単離核酸は、生物学的試料を構成する。生物学的試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、およびなどの体液、動物および植物に由来する組織試料および臓器試料、ならびにこれらに由来する加工された試料を含むがこれらに限定されない。また、土壌試料および水試料ならびに他の環境試料、ウイルス、細菌、真菌、藻類原虫、およびこれらの成分も含まれる。

0058

本明細書で記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「からなること」ならびに/または態様および実施形態「から本質的になること」を含むことが理解される。

0059

本開示を通して、本発明の多様な態様は、範囲形式で提示される。範囲形式の記載は、簡便さおよび簡潔さだけのためであり、本発明の範囲に対する厳格な限定としてはみなさないものとすることを理解されたい。したがって、範囲についての記載は、具体的に開示される全ての可能な部分範囲のほか、その範囲内の個々の数値も有すると考えるものとする。例えば、1〜6などの範囲についての記載は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6など、具体的に開示される部分範囲のほか、その範囲内の個々の数値、例えば、1、2、3、4、5、および6も有すると考えるものとする。これは、範囲の幅にかかわらず適用される。

0060

本発明の他の目的、利点、および特色は、付属の図面と共に理解される、以下の明細書から明らかとなろう。
B.DNAデンドリマーを使用するラテラルアッセイデバイス

0061

一態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、その上に試験ゾーンを備える多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスを含み、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し(または液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過することが可能であり)、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むデバイスを提示する。

0062

いくつかの実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドではないか、またはDNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の第1の成分を含むか、またはDNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。いくつかの実施形態では、試験試薬または結合性試薬は、分析物に特異的に結合する。

0063

第1の成分および第2の成分は、任意の適切な物質でありうる。例えば、第1の成分および/または第2の成分は、無機分子または無機部分の場合もあり、有機分子または有機部分の場合もあり、これらの複合体の場合もある。例示的な有機分子または有機部分は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびこれらの複合体を含む。

0064

いくつかの実施形態では、第1の成分と第2の成分とは同じである。他の実施形態では、第1の成分と第2の成分とは異なる。さらに他の実施形態では、第1の成分および第2の成分のうちの一方は、ポリヌクレオチドであり、他方は、非ポリヌクレオチド部分である。なおも他の実施形態では、第1の成分は、ポリヌクレオチドであり、第2の成分は、非ポリヌクレオチド部分、例えば、ポリペプチドである。

0065

DNAデンドリマーは、第1の成分を介して、任意の適切な結合性試薬へと連結されうる。例えば、第1の成分は、DNAデンドリマーを、分析物に結合する結合性試薬、好ましくは分析物に特異的に結合する結合性試薬へと連結しうる。別の例では、第1の成分は、DNAデンドリマーを、分析物に結合する別の結合性試薬、好ましくは分析物に特異的に結合する結合性試薬に結合する結合性試薬へと連結しうる。

0066

DNAデンドリマーは、第2の成分を介して、任意の適切な試薬へと連結されうる。例えば、第2の成分は、DNAデンドリマーを、検出可能な標識へと連結しうる。別の例では、第2の成分は、DNAデンドリマーを、検出可能な標識へと連結される別の結合性試薬へと連結しうる。

0067

本デバイスは、任意の適切なアッセイフォーマット、例えば、サンドイッチアッセイフォーマットまたは競合アッセイフォーマットにおいて使用することができる。いくつかの実施形態では、試験デバイスは、分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合し、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬は、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、試験デバイスは、分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合し、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む。

0068

さらに他の実施形態では、試験デバイスは、分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物または分析物類似体であり、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬は、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体は、第2の結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する。なおも他の実施形態では、試験デバイスは、分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物または分析物類似体であり、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬は、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体は、第2の結合性試薬に結合する結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する。

0069

本デバイスと共に使用される分析物および多様な試薬、例えば、分析物、分析物類似体、試験試薬、および/または結合性試薬は、任意の適切な物質でありうる。いくつかの実施形態では、分析物、分析物類似体、試験試薬、および/または結合性試薬は、無機分子、有機分子、またはこれらの複合体である。例示的な有機分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびこれらの複合体を含む。

0070

他の実施形態では、分析物は、ポリペプチド、低分子、または抗原であり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬は、ポリペプチド、低分子、または抗原に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する抗体である。さらに他の実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドであり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬は、分析物であるポリヌクレオチドと実質的に相補的な別のポリヌクレオチドである。なおも他の実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドであり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬は、非ポリヌクレオチド部分、例えば、分析物であるポリヌクレオチドに結合するポリペプチド、抗体、または受容体である。

0071

マトリックスは、任意の適切な材料を含むか、またはこれからなることが可能である。いくつかの実施形態では、マトリックスは、ニトロセルロース、グラスファイバーポリプロピレンポリエチレン(好ましくは極めて分子量の大きな)、フッ化ポリビニリデンエチレン酢酸ビニルアクリロニトリル、および/またはポリテトラフルオロエチレンを含む。例えば、米国特許第6,187,598号を参照されたい。膜内の任意の固有疎水性を低減し、したがって、湿性試料を、迅速かつ効率的に取り込み、送達するその能力を増強しうるので、作製時に膜を表面活性剤で前処理することが有利でありうる。マトリックスはまた、紙または他のセルロース性材料から作製することもできる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、ニトロセルロースまたはグラスファイバーを含むかまたはこれからなる。

0072

マトリックスはまた、任意の適切な形態または形状でもありうる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、ストリップまたはサークルの形態である。マトリックスはまた、任意の適切な数のエレメントを含むかまたは任意の適切な数のエレメントからなることも可能である。いくつかの実施形態では、マトリックスは、単一のエレメントであるか、または複数のエレメントを含む。

0073

本試験デバイスは、任意の適切なさらなるエレメントを含みうる。いくつかの実施形態では、試験デバイスは、マトリックスより上流にあり、マトリックスと流体連絡させた試料適用エレメントをさらに含みうる。他の実施形態では、試験デバイスは、マトリックスから下流にあり、マトリックスと流体連絡させた液体吸収エレメントをさらに含みうる。さらに他の実施形態では、試験デバイスは、液体試料の適正な流動および/または妥当な試験結果を示すための手段を含む対照ゾーンをさらに含みうる。なおも他の実施形態では、マトリックスの少なくとも一部は、固体バッキングで支持されている。なおも他の実施形態では、マトリックスの全体は、固体バッキングで支持されている。

0074

本デバイスと共に使用される多様な試薬、例えば、DNAデンドリマー、多様な結合性試薬、および/または検出可能な標識(detectable)は、使用前に試験デバイス上で乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識のうちの少なくとも1つである。

0075

他の実施形態では、2つの物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な標識のうちの少なくとも2つであり、乾燥させた物質を、単独でまたは複合体で、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能である。

0076

さらに他の実施形態では、3つの物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な標識の全てである。

0077

上記の物質は、試験デバイスの任意の適切な位置において乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、物質は、試験ゾーンより上流にあるコンジュゲートエレメント上で乾燥させる。他の実施形態では、物質を、試験デバイス上の試料適用箇所から下流に配置する。さらに他の実施形態では、物質を、試験デバイス上の試料適用箇所より上流に配置する。

0078

任意の適切な検出可能な標識を、本試験デバイスと共に使用することができる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、可溶性標識、例えば、可溶性酵素または蛍光標識である。他の実施形態では、検出可能な標識は、粒子標識である。粒子標識は、目視可能な粒子標識の場合もあり、目視不可能な粒子標識の場合もある。いくつかの実施形態では、目視可能な粒子標識は、金粒子、ラテックス粒子、Q−Dot、カーボンナノチューブ銀粒子、および銀でコーティングした粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目視不可能な粒子標識は、蛍光粒子である。検出可能な標識はまた、質量および/または電荷の変化をもたらす部分でもありうる。DNAデンドリマーは、質量および/または電荷の変化をもたらしうる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、あるDNAデンドリマー、例えば、そのDNAデンドリマー自体の場合もあり、さらなるDNAデンドリマーの場合もある。

0079

いくつかの実施形態では、物質を、a)乾燥させた物質を安定化させ、b)乾燥させた物質の、液体に可溶化もしくは再懸濁することを促進し、および/またはc)乾燥させた物質の可動性を促進させる材料の存在下で乾燥させる。任意の適切な材料を使用することができる。例えば、材料は、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤でありうる。例えば、米国特許第5,120,643号および同第6,187,598号を参照されたい。

0080

いくつかの実施形態では、試料液単独を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する。他の実施形態では、顕色液を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する。

0081

試験デバイスは、試験デバイスの少なくとも一部を覆うハウジングをさらに含むことができ、ハウジングは、試験ゾーンより上流における試料の適用または試験ゾーンへの試料の適用を可能とする試料適用ポート、ならびに試験ゾーンおよび/または対照ゾーンにおけるシグナルの検出を可能とする、試験ゾーンの近傍の光学的開口部を含む。いくつかの実施形態では、ハウジングは、試験デバイスの全体を覆う。他の実施形態では、マトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの少なくとも一部は、ハウジングにより覆われておらず、試料を、ハウジングの外側にあるマトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの一部へと適用し、次いで、試験ゾーンへと移送する。

0082

DNAデンドリマー、多様な結合性試薬および検出可能な標識は、任意の適切な様式で連結することができる、例えば、非共有結合的に連結することもでき、共有結合的に連結することもできる。いくつかの実施形態では、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識のうちのいずれもが、互いと共有結合的に結合または架橋されていない。

0083

他の実施形態では、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識のうちの少なくとも2つが、互いに共有結合的に結合または架橋されている。

0084

さらに他の実施形態では、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識の全てが、互いに共有結合的に結合または架橋されている。

0085

任意の適切なDNAデンドリマーを使用することができる。例えば、米国特許第5,175,270号、同第5,487,973号、同第6,046,038号、同第6,072,043号、同第6,110,687号、同第6,117,631号、および同第6,274,723号において開示および/または特許請求されているDNAデンドリマーを使用することができる。DNAデンドリマーは、DNAデンドリマーを、検出可能な標識へと連結する、任意の適切な数の第2の成分を含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、DNAデンドリマーを、DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識へと連結する、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、約100〜約1,400、約500〜約1,200、または約900〜約1,100の第2の成分を含む。標識は、同じ場合もあり、異なる場合もある。

0086

DNAデンドリマーは、任意の適切な数のDNAヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、約10,000〜約80,000、約30,000〜約80,000、または約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む。

0087

DNAデンドリマーは、任意の適切な数の層を含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、一層構造二層構造三層構造、または四層構造を含む。

0088

いくつかの実施形態では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、液体試料が、試験デバイスに沿って側方方向に移動して、試験ゾーンにおいて検出可能なシグナルを発生させる試験デバイスを提示する。

0089

C.液体試料中の分析物を検出するための方法
別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、上記のB節で記載された試験デバイスと接触させるステップであり、液体試料を、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位に適用するステップと、b)液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、試験ゾーンへと移送するステップと、c)試験ゾーンにおける検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、液体試料中の分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法を提示する。

0090

本方法は、任意の適切なアッセイフォーマットで使用することができる。例えば、DNAデンドリマー、多様な結合性試薬、および/または検出可能な標識を、試料液および/または顕色液とあらかじめ混合することができ、次いで、混合物を試験デバイスへと適用して、アッセイを開始する。代替的に、DNAデンドリマー、多様な結合性試薬、および/または検出可能な標識のうちの1または複数を、試験デバイスの適切な位置において乾燥させることもでき、試料液および/または顕色液を試験デバイスへと適用して、アッセイを開始する。

0091

いくつかの実施形態では、液体試料と、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識のうちの少なくとも1つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する。

0092

他の実施形態では、液体試料と、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識のうちの少なくとも2つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する。

0093

さらに他の実施形態では、液体試料と、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識の全てとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する。

0094

本方法は、界面活性剤または洗浄剤、例えば、Tween−20を含む液体中で実行することができる。いくつかの実施形態では、方法は、約0.001%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)、または約0.01%(v/v)以下のTween−20を含む液体中で実行する。本方法はまた、ポリマー、例えば、硫酸デキストランを含む液体中で実行することもできる。いくつかの実施形態では、方法は、約0.1%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.5%(v/v)〜約1%(v/v)の硫酸デキストランを含む液体中で実行する。

0095

いくつかの実施形態では、物質を、試験ゾーンより上流にある試験デバイスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送して、検出可能なシグナルを発生させ、乾燥させた物質は、1)DNAデンドリマー、2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識のうちの少なくとも1つである。

0096

物質は、試験デバイスの任意の適切な位置において乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、乾燥させた物質を、試料の適用部位から下流に配置し、乾燥させた物質を、液体試料により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。他の実施形態では、乾燥させた物質を、試料の適用部位より上流に配置し、乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。さらに他の実施形態では、乾燥させた物質を液体試料単独により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。なおも他の実施形態では、分析物および/または乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。

0097

本方法は、任意の適切な試料中の分析物を評価するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、体液試料中、例えば、全血液試料中、血清試料中、血漿試料中、および尿試料中の分析物を評価するのに使用することができる。他の実施形態では、本方法は、生物学的供給源、法医学的供給源、食物供給源、生物戦争供給源、または環境供給源に由来する試料中の分析物を評価するのに使用することができる。

0098

本方法は、任意の適切な目的で使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、液体試料中の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用することができる。他の実施形態では、本方法は、液体試料中の複数の分析物を検出するのに使用することができる。さらに他の実施形態では、本方法は、液体試料中の複数の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用することができる。

0099

本方法は、任意の適切な分析物を評価するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞、ウイルス、および分子からなる群から選択される分析物を評価するのに使用することができる。

0100

いくつかの実施形態では、本方法は、自動化されており、および/またはハイスループットフォーマットにおいて使用される。
D.検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーを使用するラテラルアッセイデバイス

0101

さらに別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、その上に試験ゾーンを備える多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスを含み、液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し(または液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過することが可能であり)、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する成分を含むデバイスを提示する。

0102

いくつかの実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドではないか、またはDNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の第1の成分を含むか、またはDNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。いくつかの実施形態では、試験試薬または結合性試薬は、分析物に特異的に結合する。

0103

成分は、任意の適切な物質でありうる。例えば、成分は、無機分子または無機部分の場合もあり、有機分子または有機部分の場合もあり、これらの複合体の場合もある。例示的な有機分子または有機部分は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびこれらの複合体を含む。いくつかの実施形態では、成分は、ポリヌクレオチドである。

0104

本デバイスは、任意の適切なアッセイフォーマット、例えば、サンドイッチアッセイフォーマットまたは競合アッセイフォーマットにおいて使用することができる。いくつかの実施形態では、試験デバイスは、分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合し、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬は、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、試験デバイスは、分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合し、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む。

0105

さらに他の実施形態では、試験デバイスは、分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物または分析物類似体であり、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬は、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体は、第2の結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する。なおも他の実施形態では、試験デバイスは、分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬は、分析物または分析物類似体であり、分析物に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬は、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体は、第2の結合性試薬に結合する結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する。

0106

本デバイスと共に使用される分析物および多様な試薬、例えば、分析物、分析物類似体、試験試薬、および/または結合性試薬は、任意の適切な物質でありうる。いくつかの実施形態では、分析物、分析物類似体、試験試薬、および/または結合性試薬は、無機分子、有機分子、またはこれらの複合体である。例示的な有機分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびこれらの複合体でありうる。

0107

他の実施形態では、分析物は、ポリペプチド、低分子、または抗原であり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬は、ポリペプチド、低分子、または抗原に結合し、好ましくはこれに特異的に結合する抗体である。さらに他の実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドであり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬は、分析物であるポリヌクレオチドと実質的に相補的な別のポリヌクレオチドである。なおも他の実施形態では、分析物は、ポリヌクレオチドであり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬は、非ポリヌクレオチド部分、例えば、分析物であるポリヌクレオチドに結合するポリペプチド、抗体、または受容体である。

0108

マトリックスは、任意の適切な材料を含むか、またはこれからなることが可能である。いくつかの実施形態では、マトリックスは、ニトロセルロース、グラスファイバー、ポリプロピレン、ポリエチレン(好ましくは極めて分子量の大きな)、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリロニトリル、および/またはポリテトラフルオロエチレンを含む。例えば、米国特許第6,187,598号を参照されたい。膜内の任意の固有の疎水性を低減し、したがって、湿性試料を、迅速かつ効率的に取り込み、送達するその能力を増強しうるので、作製時に膜を表面活性剤で前処理することが有利でありうる。マトリックスはまた、紙または他のセルロース性材料から作製することもできる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、ニトロセルロースまたはグラスファイバーを含むかまたはこれからなる。

0109

マトリックスはまた、任意の適切な形態または形状でもありうる。いくつかの実施形態では、マトリックスは、ストリップまたはサークルの形態である。マトリックスはまた、任意の適切な数のエレメントを含むかまたは任意の適切な数のエレメントからなることも可能である。いくつかの実施形態では、マトリックスは、単一のエレメントであるか、または複数のエレメントを含む。

0110

本試験デバイスは、任意の適切なさらなるエレメントを含みうる。いくつかの実施形態では、試験デバイスは、マトリックスより上流にあり、かつ、マトリックスと流体連絡させた試料適用エレメントをさらに含みうる。他の実施形態では、試験デバイスは、マトリックスから下流にあり、かつ、マトリックスと流体連絡させた液体吸収エレメントをさらに含みうる。さらに他の実施形態では、試験デバイスは、液体試料の適正な流動および/または妥当な試験結果を示すための手段を含む対照ゾーンをさらに含みうる。なおも他の実施形態では、マトリックスの少なくとも一部は、固体バッキングで支持されている。なおも他の実施形態では、マトリックスの全体は、固体バッキングで支持されている。

0111

本デバイスと共に使用される多様な試薬、例えば、DNAデンドリマーおよび/または多様な結合性試薬は、使用前に試験デバイス上で乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、1)DNAデンドリマー、および2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体のうちの少なくとも1つである。他の実施形態では、DNAデンドリマー、および分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体の両方を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させる。

0112

物質は、試験デバイスの任意の適切な位置において乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、物質は、試験ゾーンより上流にあるコンジュゲートエレメント上で乾燥させる。他の実施形態では、物質を、試験デバイス上の試料適用箇所から下流に配置する。さらに他の実施形態では、物質を、試験デバイス上の試料適用箇所より上流に配置する。

0113

任意の適切な検出可能な標識を、本試験デバイスと共に使用することができる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、可溶性標識、例えば、可溶性酵素または蛍光標識である。他の実施形態では、検出可能な標識は、粒子標識である。粒子標識は、目視可能な粒子標識の場合もあり、目視不可能な粒子標識の場合もある。いくつかの実施形態では、目視可能な粒子標識は、金粒子、ラテックス粒子、Q−Dot、カーボンナノチューブ、銀粒子、および銀でコーティングした粒子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、目視不可能な粒子標識は、蛍光粒子である。検出可能な標識はまた、質量および/または電荷の変化をもたらす部分でもありうる。DNAデンドリマーは、質量および/または電荷の変化をもたらしうる。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、あるDNAデンドリマー、例えば、そのDNAデンドリマー自体の場合もあり、さらなるDNAデンドリマーの場合もある。

0114

いくつかの実施形態では、物質を、a)乾燥させた物質を安定化させ、b)乾燥させた物質の、液体に可溶化もしくは再懸濁することを促進し、および/またはc)乾燥させた物質の可動性を促進させる材料の存在下で乾燥させる。任意の適切な材料を使用することができる。例えば、材料は、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤でありうる。例えば、米国特許第5,120,643号および同第6,187,598号を参照されたい。

0115

いくつかの実施形態では、試料液単独を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する。他の実施形態では、顕色液を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する。

0116

試験デバイスはハウジングをさらに含みうる。いくつかの実施形態では、試験デバイスは、試験デバイスの少なくとも一部を覆うハウジングをさらに含み、ハウジングは、試験ゾーンより上流における試料の適用または試験ゾーンへの試料の適用を可能とする試料適用ポート、ならびに試験ゾーンおよび/または対照ゾーンにおけるシグナルの検出を可能とする、試験ゾーンの近傍の光学的開口部を含む。他の実施形態では、ハウジングは、試験デバイスの全体を覆う。さらに他の実施形態では、マトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの少なくとも一部は、ハウジングにより覆われておらず、試料を、ハウジングの外側にあるマトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの一部へと適用し、次いで、試験ゾーンへと移送する。

0117

任意の適切なDNAデンドリマーを使用することができる。例えば、米国特許第5,175,270号、同第5,487,973号、同第6,046,038号、同第6,072,043号、同第6,110,687号、同第6,117,631号、および同第6,274,723号において開示および/または特許請求されているDNAデンドリマーを使用することができる。DNAデンドリマーは、DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬へと連結する、任意の適切な数の成分を含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬へと連結する、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の成分を含む。

0118

DNAデンドリマーは、任意の適切な数の検出可能な標識を含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、または約100〜約1,200、または約900〜約1,100の検出可能な標識を含む。標識は、同じ場合もあり、異なる場合もある。

0119

DNAデンドリマーは、任意の適切な数のDNAヌクレオチドを含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、約10,000〜約80,000、約30,000〜約80,000、または約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む。

0120

DNAデンドリマーは、任意の適切な数の層を含みうる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーは、一層構造、二層構造、三層構造、または四層構造を含む。

0121

いくつかの実施形態では、本開示は、試験デバイスであって、液体試料が、試験デバイスに沿って側方方向に移動して、試験ゾーンにおいて検出可能なシグナルを発生させる試験デバイスを提示する。

0122

E.液体試料中の分析物を検出するための方法
なおも別の態様では、本開示は、液体試料中の分析物を検出するための方法であって、a)液体試料を、上記のD節で記載された試験デバイスと接触させるステップであり、液体試料を、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位に適用するステップと、b)液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、試験ゾーンへと移送するステップと、c)試験ゾーンにおける検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、液体試料中の分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップとを含む方法を提示する。

0123

本方法は、任意の適切なアッセイフォーマットで使用することができる。例えば、DNAデンドリマーおよび/または多様な結合性試薬を、試料液および/または顕色液とあらかじめ混合することができ、次いで、混合物を試験デバイスへと適用して、アッセイを開始する。代替的に、DNAデンドリマーおよび/または多様な結合性試薬を、試験デバイスの適切な位置において乾燥させることもでき、試料液および/または顕色液を試験デバイスへと適用して、アッセイを開始する。

0124

いくつかの実施形態では、液体試料と、1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマー、および2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体のうちの少なくとも1つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する。

0125

他の実施形態では、液体試料と、1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマー、および2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体の両方とをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する。

0126

本方法は、界面活性剤または洗浄剤、例えば、Tween−20を含む液体中で実行することができる。いくつかの実施形態では、方法は、約0.001%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)、または約0.01%(v/v)以下のTween−20を含む液体中で実行する。本方法はまた、ポリマー、例えば、硫酸デキストランを含む液体中で実行することもできる。いくつかの実施形態では、方法は、約0.1%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.5%(v/v)〜約1%(v/v)の硫酸デキストランを含む液体中で実行する。

0127

いくつかの実施形態では、物質を、試験ゾーンより上流にある試験デバイスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマー、および2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体のうちの少なくとも1つである。

0128

物質は、試験デバイスの任意の適切な位置において乾燥させることができる。いくつかの実施形態では、乾燥させた物質を、試料の適用部位から下流に配置し、乾燥させた物質を、液体試料により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。他の実施形態では、乾燥させた物質を、試料の適用部位より上流に配置し、乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。さらに他の実施形態では、乾燥させた物質を液体試料単独により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。なおも他の実施形態では、分析物および/または乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する。

0129

本方法は、任意の適切な試料中の分析物を評価するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、体液試料中、例えば、全血液試料中、血清試料中、血漿試料中、および尿試料中の分析物を評価するのに使用することができる。他の実施形態では、本方法は、生物学的供給源、法医学的供給源、食物供給源、生物戦争供給源、または環境供給源に由来する試料中の分析物を評価するのに使用することができる。

0130

本方法は、任意の適切な目的で使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、液体試料中の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用することができる。他の実施形態では、本方法は、液体試料中の複数の分析物を検出するのに使用することができる。さらに他の実施形態では、本方法は、液体試料中の複数の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用することができる。

0131

本方法は、任意の適切な分析物を評価するのに使用することができる。いくつかの実施形態では、本方法は、細胞、ウイルス、および分子からなる群から選択される分析物を評価するのに使用することができる。

0132

いくつかの実施形態では、本方法は、自動化されており、および/またはハイスループットフォーマットにおいて使用される。

0133

F.例示的な実施形態
例示的な実施形態では、本開示は、エンドユーザーによる熟練をほとんど必要とせず、簡単なリードアウトおよび結果の解釈を提示し、比較的短時間で、最小限の手順ステップにより実施されるイムノアッセイを典型とする、「ポイントオブケア」(POC:point−of−care)検出アッセイにおける、DNAデンドリマーのシグナル増幅デバイスとしての使用について記載する。典型的に、POC試験は、いくつかの種類のイムノクロマトグラフィーアッセイ(目視可能なリードアウトによるラテラルフロー、デュアルパスプラットフォームなど)、膜およびラテラルフロー型デバイスを使用する蛍光検出アッセイ、電気化学的検出アッセイ、および酵素的検出アッセイ、ならびにマイクロフルイディクスおよびバイオセンサー(膜基質または紙基質を伴うかまたは伴わない)の使用を組み込むアッセイを含む、目視可能なシグナル発生デバイスおよび目視不可能なシグナル発生デバイスを組み込む、様々な異なるシグナル発生戦略を活用する様々なアッセイフォーマットを含む。これらのアッセイは、異なる単一の分析物または複数の分析物を同時に検出することが可能でありうる。一般に、POC試験を代表する主なものは、対象の分析物への結合が可能であり、試験ラインが陽性の場合に試験試料中の分析物の存在を示す、膜上の「試験」ライン内に固定化されたリガンド(抗体または抗原)を含有する膜ストリップを通常含む、ラテラルフローイムノアッセイである。ラテラルフローアッセイはまた、アッセイが適切に行われていることを示す「対照」ラインを含有することも多い。ラテラルフローアッセイの他の成分は、試料を含有する分析物がストリップアッセイへと添加される試料パッド、ドライダウンさせたアッセイ試薬を含有するコンジュゲートパッド、毛細管現象が可能な膜(典型的にはニトロセルロース)、ならびに固定化されたリガンドと、分析物ならびにシグナル発生リガンドおよび関連するデバイスとの間の免疫反応部位、ならびに膜内の毛細管現象を介して、試料パッドから、膜を通して、ウィッキングパッドへと液体を吸い出すのに用いられる、膜の遠位端上のウィッキングパッドを含む。液体試料を試料パッドへと添加すると、液体は、試料パッドから、コンジュゲートパッドへと流動し、ここで、コンジュゲートパッド(例えば、抗分析物抗体とコンジュゲートさせた金粒子)内で既に乾燥させた任意のシグナル発生試薬は、再水和し、試料液により、前方の膜へと運ばれる。次いで、分析物およびシグナル発生試薬は、試験ライン(T)および対照ライン(C)と反応し、分析物の検出についての陽性結果は、試験ラインにおけるシグナルにより示される。膜の遠位端におけるウィックまたは吸収性パッドは、毛細管現象を介して、膜を通して液体を「吸引」するのに用いられる(図1を参照されたい)。

0134

これらの適用は、既にDNAデンドリマーをシグナル増幅剤として組み込む他のイムノアッセイ(例えば、ELISA)と概念が類似するが、ラテラルフローアッセイおよび他のPOCアッセイにおけるDNAデンドリマーの使用が探索されるようになったのは、近年のことに過ぎない(例えば、米国特許出願第US2011/0160090A1号を参照されたい)。既に、本発明者らは、デンドリマーの性質およびサイズ、ならびにシグナル増幅が小さく、非特異的なバックグラウンドが極めて大きいことを含む、他の膜ベースのアッセイ(例えば、ウェスタンブロットイムノアッセイ)におけるデンドリマーの性能の低さについてのかつての経験を踏まえ、DNAデンドリマーは、ラテラルフローアッセイにおける使用に適さない可能性が高いことを仮定した。この仮定、および、数百の標識部分を単一の結合部位へと送達するDNAデンドリマーの能力(非デンドリマーラテラルフロー試薬を使用する単一の標識または最大で5〜10の標識と比較して)が示されているにもかかわらず、本発明者らは、DNAデンドリマーをシグナル増幅剤として活用するラテラルフローアッセイを実施することを決定した。具体的には、デンドリマー1つ当たり約1,000のビオチン部分を含有するDNAデンドリマーを合成し、hCG分析物と、シグナル発生剤として用いられるストレプトアビジン−金コンジュゲート(デンドリマー上のビオチンに結合するストレプトアビジン−金)との間の「架橋」試薬として用いられる、抗hCG抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートによる、モデルのラテラルフローhCGアッセイにおいて調べた。抗hCG抗体とコンジュゲートさせた金粒子を活用する標準的なhCGアッセイもまた、実施した(図2)。驚くべきことに、DNAデンドリマーによるラテラルフローアッセイは極めて良好な性能を示し、標準的なhCGアッセイを上回る、最大で128倍の感度の改善をもたらし、アッセイ膜にわたり、非特異的なバックグラウンドシグナルをほとんどまたはまったくもたらさなかった。デンドリマーのサイズおよび高度な分枝状構造に起因して、デンドリマーは、ラテラルフローアッセイを実施するときに、膜を効率的に潅流できないと予測されたので、DNAデンドリマーが、ラテラルフローアッセイにおいて良好な性能を示すとは予測されなかったことに注目されたい。さらに、DNAデンドリマーラテラルフローアッセイにおいても、シグナル発生部分の非特異的結合は生じるが、ブロッキングおよび緩衝液選択活性を介して制御可能である。

0135

ラテラルフローPOCアッセイにおけるDNAデンドリマーの具体的な適用
DNAデンドリマーは、サンドイッチアッセイフォーマットおよび/または競合アッセイフォーマットのPOCラテラルフロータンパク質検出アッセイにおいて使用することができる。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、直接的サンドイッチアッセイにおいて使用する。このアッセイフォーマットは、分析物に特異的な第1の抗体の、典型的には、毛細管現象を介して、液体を、膜の一方の端部から別の端部へと吸引することが可能な膜ストリップ上に位置する、抗体のストライプラインとしての固定化を必要とする。分析物を含有する水性試料を、膜ストリップの端部へと添加し、分析物を、固定化された第1の抗体により捕捉する。分析物に特異的であり、オリゴヌクレオチドへとコンジュゲートさせた(「抗体−オリゴコンジュゲート」)、第2の抗体(しかし、固定化された第1の抗体以外のエピトープを指向する)を、分析物に結合させる。抗体−オリゴコンジュゲートは、シグナルを発生させるかまたはシグナル発生デバイスに結合することが可能な標識部分を含有するDNAデンドリマーと別個であるかまたはこれに既に結合させている。DNAデンドリマーを、抗体−オリゴコンジュゲートに結合させ、膜ストリップ上に位置する試験ライン上でシグナルを発生させる。典型的には、金粒子をDNAデンドリマー上の標識部分へと結合させること(例えば、DNAデンドリマーに結合させたビオチン部分に結合するストレプトアビジン−金粒子)により、またはシグナルを直接的に発生させることが可能な、DNAデンドリマーに結合させた標識部分(例えば、蛍光色素)により、目視可能なシグナルを発生させる。この方法の例は、ヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG:human chorionic gonadotropin)などの分析物に直接的に結合し、これにより、抗体−オリゴコンジュゲートと、固定化された分析物との間の直接的連結を形成する抗体を含有する抗体−オリゴコンジュゲートを含むであろう。一般に、シグナルが大きいほど、陽性結果も大きくなる。

0136

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、間接的サンドイッチアッセイにおいて使用する。このフォーマットは、抗体−オリゴコンジュゲートが、分析物に直接的に結合せず、分析物に結合する別の成分に結合する抗体を含有することを除き、「直接的サンドイッチアッセイ」と極めて類似する。この方法の例は、ヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)などの分析物に直接的に結合する別の抗体に結合し、これにより、抗体−オリゴコンジュゲートと、固定化された分析物との間の間接的連結を形成する抗体を含有する抗体−オリゴコンジュゲートを含むであろう。一般に、シグナルが大きいほど、陽性結果も大きくなる。

0137

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、直接的競合アッセイにおいて使用する。このアッセイフォーマットは一般に、固定化された分析物(第1の抗体ではない)の使用を組み込み、次いで、固定化された分析物が、抗体−オリゴコンジュゲート、DNAデンドリマー、および標識発生部分に結合する。分析物を含有する試料を添加すると、可溶性抗体−オリゴコンジュゲートは、可溶性分析物に結合し、これが、抗体−オリゴコンジュゲートの、固定化された分析物への結合について競合し、これにより、シグナルの小さな(またはシグナルがみられない)結果が引き起こされる。この方法の例は、ヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)などの分析物に直接的に結合し、これにより、抗体−オリゴコンジュゲートと、可溶性分析物との間の直接的連結を形成し、抗体−オリゴコンジュゲート、DNAデンドリマー、およびシグナル発生部分の、固定化されたhCG分析物への結合について競合する抗体を含有する抗体−オリゴコンジュゲートを含むであろう。一般に、シグナルが小さいほど、陽性結果も大きくなる。

0138

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、間接的競合アッセイにおいて使用する。このフォーマットは、抗体−オリゴコンジュゲートが、分析物に直接的に結合せず、分析物に結合する別の成分に結合する抗体を含有することを除き、「直接的競合アッセイ」と極めて類似する。この方法の例は、ヒト絨毛ゴナドトロピン(hCG)などの分析物に直接的に結合する別の抗体に結合し、これにより、抗体−オリゴコンジュゲートと、可溶性hCG分析物との間の間接的連結を形成する抗体を含有する抗体−オリゴコンジュゲートを含むであろう。一般に、シグナルが小さいほど、陽性結果も大きくなる。

0139

さらに、DNAデンドリマーを、POC核酸検出アッセイにおいて使用する。いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、固定化された核酸標的の直接的検出において使用する。このアッセイは、核酸プローブの、POCデバイスへの固定化を含み、核酸プローブは、試料中の対象の核酸分子内に位置する第1の核酸配列とハイブリダイズし、これに、前述の試料中の対象の核酸分子内に位置する第2の核酸配列とハイブリダイズすることが可能な核酸プローブターゲティングデバイスを含有する、DNAデンドリマーが直接的に結合するであろう。このアッセイでは、シグナルは、タンパク質検出アッセイについて既に記載した通りに発生させることができる。この方法の例は、嚢胞性線維症(CF)突然変異に特異的な、固定化されたDNAプローブであって、CF遺伝子の部分的な遺伝子配列および対象の突然変異を含有する、特異的にPCR増幅されたDNA単位複製配列とハイブリダイズし、DNAデンドリマーに結合させたDNAオリゴヌクレオチドであり、CF遺伝子に特異的なDNAオリゴヌクレオチドとさらにハイブリダイズし(固定化されたプローブの結合に干渉しない配列の別の部分とはハイブリダイズしない)、これにより、DNAデンドリマーと、固定化された、ハイブリダイズさせたCF単位複製配列との間の直接的連結を形成する、固定化されたDNAプローブを含むであろう。一般に、シグナルが大きいほど、陽性結果も大きくなる。

0140

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、固定化された標的の間接的検出において使用する。このアッセイは、DNAデンドリマーが、固定化された対象の核酸分子に間接的に結合することを除き、「固定化された核酸標的の直接的検出」と類似する。間接的結合は、核酸分子を介する場合もあり、固定化された対象の核酸分子に結合させたデバイス内に含有されたハプテンへの結合など、他の手段を介する場合もある。この方法の例は、嚢胞性線維症(CF)突然変異に特異的な、固定化されたDNAプローブであって、CF遺伝子の部分的な遺伝子配列および対象の突然変異を含有する、特異的にPCR増幅されたDNA単位複製配列とハイブリダイズし、CF単位複製配列の別の部分に特異的であり、その5プライム(5’)端上にビオチンを含有する、第2の可溶性DNAプローブとさらにハイブリダイズする、固定化されたDNAプローブ、ならびに抗ビオチン抗体−オリゴコンジュゲートを含有するDNAデンドリマーを含み、これにより、DNAデンドリマーと、固定化された、ハイブリダイズさせたCF単位複製配列との間の間接的連結を形成するであろう。一般に、シグナルが大きいほど、陽性結果も大きくなる。

0141

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、競合核酸POCアッセイにおいて使用する。タンパク質アッセイについて上記で論じた通り、標識された部分(DNAデンドリマーまたはDNAデンドリマーに結合させた標識されたデバイス)が、可溶性分析物に結合し、固定化されたリガンドへの結合について競合するであろうという前提に基づくと、直接的競合POC核酸検出アッセイおよび間接的競合POC核酸検出アッセイのいずれもが可能である。一般に、シグナルが小さいほど、陽性結果も大きくなる。

0142

例示的な実施形態では、いくつかの新規の態様は、上記のPOCアッセイにおけるDNAデンドリマーの使用に関する。いくつかの実施形態では、POCアッセイにおいてDNAデンドリマーを使用する場合の感度の改善は、デンドリマーに結合させた標識部分の数に正比例せず、デンドリマー1つ当たりの標識部分の数を240の標識から480、960の標識へと増大させながら、ターゲティングデバイスの数を一定に保つ場合の感度の改善は、標識部分の数を増大させなかった場合に予測される改善より小さく、非直線的な様式であった。さらに、デンドリマー1つ当たり1,440の標識を伴うデンドリマーを使用する場合は、感度の改善がみられないか、または感度のわずかな低下がみられた。逆に、デンドリマー上のターゲティングデバイスの数を増大させることにより、感度は、著明に改善されたが、本発明者らは、これを、前記DNAデンドリマーと分析物との間の直接的結合または間接的結合を介する、DNAデンドリマーとターゲティングされる分析物との間の結合(または衝突)の可能性の改善であると考える。

0143

いくつかの実施形態では、POC試験成分の作製時に、DNAデンドリマー(関連のアッセイ試薬を伴い、および/または伴わない)を、POC試験へと「ドライダウン」させ、これにより、POCアッセイを実施するのに必要とされるステップの数を低減する。典型的には、抗体−金粒子コンジュゲートを含むアッセイ試薬を、POCラテラルフロー試験ストリップのためのコンジュゲートパッドへとドライダウンさせて、アッセイを実施するのに必要とされるステップの数を低減する。ドライダウン試薬は、水性試験試料の添加を介して、またはアッセイ手順において脱水試薬へと添加される水性緩衝液の添加を介して再水和させ、アッセイを実施するときにこれらの試薬を水性調製物として添加する必要性を排する。本発明者らが知る限りにおいて、いかなるアッセイフォーマットにおいても、DNAデンドリマーおよび抗体−オリゴコンジュゲートをドライダウンさせたことはなく、乾燥させたデンドリマーおよび抗体−オリゴコンジュゲートが、再水和後において適切な性能を示すのかどうかは知られていなかった。本発明者らは、他のラテラルフロー試薬のために使用される作製法と類似の作製法を使用して、DNAデンドリマーおよび抗体−オリゴコンジュゲートを、POCラテラルフロー試験ストリップへとドライダウンさせることができ、デンドリマーおよび抗体−オリゴコンジュゲートは、ドライダウンさせなかった液体状態において使用される試薬と同等以上の性能を示すことを明確に裏付けた。

0144

いくつかの実施形態では、ドライダウンさせたDNAデンドリマーを使用して、POCアッセイにおけるステップの数を変化させる能力を、アッセイ成分の一部または全部と組み合わせる。ワンステップアッセイおよびマルチステップアッセイを含む既往のPOCラテラルフロー法は、全てをラテラルフロー試験ストリップへとドライダウンさせた試薬、またはドライダウンさせた一部の試薬と、ドライダウンさせておらず、アッセイ時に液体試薬として使用される他の試薬とを含有する試薬を組み込む。これらの試薬は、DNAデンドリマー、抗体−オリゴコンジュゲート、DNAデンドリマーへの結合が可能な金粒子コンジュゲート、分析物に特異的な天然抗体(間接的ラテラルフローアッセイのための)、ならびにアッセイを実施するために必要とされる他の緩衝液およびブロッキング剤を含むがこれらに限定されない。本発明者らはまた、DNAデンドリマーを、試験に必要とされる他の全ての試薬成分と組み合わせて、ラテラルフロー試験ストリップへとドライダウンさせる結果として、ワンステップ工程をもたらしうることも見出した。さらに、本発明者らは、前述の試薬成分のうちの1または複数は、POCラテラルフローアッセイにおける成分として、単独または組合せで使用しうる結果として、実施するのに2つ、3つ以上のステップを必要としうる方法をもたらすことも見出した。

0145

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、金粒子およびラテックス粒子を含む、標識された補助的粒子と共に使用し、シグナル発生粒子をデンドリマーへと結合させるための、多様な架橋戦略を活用する。DNAデンドリマーは、目視可能なシグナルまたは目視不可能なシグナルをPOCアッセイへと付与する多様な種類の粒子を伴う使用のために適合させてある。目視可能なPOCラテラルフローアッセイでは、DNAデンドリマーの構造へと組み込まれた部分への結合が可能な金粒子の使用が裏付けられている。例えば、表面に固定化されたストレプトアビジンまたは抗ビオチン抗体を含有する金粒子を使用して、組み込まれたビオチン部分を含有するDNAデンドリマーに結合させる。さらに、固定化された核酸プローブを含有する金粒子または他の種類の粒子も、DNAデンドリマー上の相補的核酸配列に結合させるのに使用されている。加えて、ラテックス粒子、Q−Dot、カーボンナノチューブ、銀粒子、または銀でコーティングした粒子などを含む他の種類の粒子も、DNAデンドリマーへの結合が可能な場合の目視可能なシグナル発生のために使用することができる。また、DNAデンドリマー結合性粒子、例えば、蛍光アッセイのための蛍光色素を含有するQ−Dotおよびラテックス粒子も、目視不可能なシグナルを発生させるために使用することができる。

0146

いくつかの実施形態では、DNAデンドリマーを、シグナル発生部分(および酵素などのシグナル発生部分)で直接的に標識し、これにより、このようなデンドリマー−標識複合体が、水溶液中および他の溶液中で完全に可溶性である場合における、シグナル発生粒子の使用を回避する。POCアッセイにおける可溶性DNAデンドリマーを使用する明確な利点であって、不溶性のシグナル発生粒子の使用を回避することにより達成されるステップの低減、液体形態または脱水形態にある可溶性DNAデンドリマーの、粒子コンジュゲートと比較した固有の安定性、POCアッセイ基質へと乾燥させた後における、DNAデンドリマーの再水和の容易さおよび効率などを含む利点が存在する。

0147

いくつかの実施形態では、POCアッセイにおいて使用されるDNAデンドリマーは、他の既に開示されているDNAデンドリマーアッセイ適用のために必要とされる、標識部分およびターゲティングデバイスの、DNAデンドリマーへの共有結合的架橋形成の必要性を消失させる様式で作製する。典型的に、DNAマイクロアレイおよびタンパク質マイクロアレイ上のDNAデンドリマーの使用を含む他のアッセイフォーマットでは、DNAデンドリマーが、共有結合的に架橋された標識部分およびターゲティングデバイスを有し、最終的には、既に開示されている、比較的非効率的なスクロース勾配遠心分離精製法を使用して精製されている(例えば、第5,175,270号および第5,487,973号を参照されたい)。本発明者らは、標識部分またはターゲティングデバイスを付加した後で架橋されなかったDNAデンドリマーも慣例的な作製工程で調製されたDNAデンドリマーと同様の性能を示すことを経験的に判定している。これは、様々なPOCラテラルフローアッセイフォーマットにおける使用のための前記DNAデンドリマーを作製する費用を著明に低減する驚くべき知見であった。

0148

本発明は、以下の例示的な実施形態によりさらに例示される。
1.液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、前記デバイスは、多孔性マトリックスを含み、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックスの上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含み、
液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し(または液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過することが可能であり)、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含み、
a)前記分析物が、ポリヌクレオチドではないか、または
b)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含むか、または
c)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる
デバイス。
いくつかの実施形態では、前記分析物は、ポリヌクレオチドではなく、前記DNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含む。他の実施形態では、前記分析物は、ポリヌクレオチドではなく、前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。さらに他の実施形態では、前記DNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含み、前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。なおも他の実施形態では、前記分析物は、ポリヌクレオチドではなく、前記DNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含み、前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。
2.第1の成分と第2の成分とが同じである、実施形態1による試験デバイス。
3.第1の成分と第2の成分とが異なる、実施形態1による試験デバイス。
4.第1の成分および第2の成分のうちの一方が、ポリヌクレオチドであり、他方が、非ポリヌクレオチド部分である、実施形態3による試験デバイス。
5.第1の成分が、ポリヌクレオチドであり、第2の成分が、非ポリヌクレオチド部分である、実施形態4による試験デバイス。
6.非ポリヌクレオチド部分が、ポリペプチドである、実施形態1〜5のうちのいずれかによる試験デバイス。
7.第1の成分が、DNAデンドリマーを、分析物に結合する結合性試薬へと連結する、実施形態1〜6のうちのいずれかによる試験デバイス。
8.第1の成分が、DNAデンドリマーを、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する結合性試薬へと連結する、実施形態1〜6のうちのいずれかによる試験デバイス。
9.第2の成分が、DNAデンドリマーを、検出可能な標識へと連結する、実施形態1〜8のうちのいずれかによる試験デバイス。
10.第2の成分が、DNAデンドリマーを、検出可能な標識へと連結される別の結合性試薬へと連結する、実施形態1〜8のうちのいずれかによる試験デバイス。
11.分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物に結合し、分析物に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜10のうちのいずれかによる試験デバイス。
12.分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物に結合し、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態1〜10のうちのいずれかによる試験デバイス。
13.分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物または分析物類似体であり、分析物に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体が、第2の結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する、実施形態1〜10のうちのいずれかによる試験デバイス。
14.分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物または分析物類似体であり、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの第1の成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体が、第2の結合性試薬に結合する結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する、実施形態1〜10のうちのいずれかによる試験デバイス。
15.分析物、分析物類似体、試験試薬、および/または結合性試薬が、無機分子、有機分子、またはこれらの複合体である、実施形態1〜14のうちのいずれかによる試験デバイス。
16.有機分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびこれらの複合体からなる群から選択される、実施形態15による試験デバイス。
17.分析物が、ポリペプチドまたは低分子であり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬が、ポリペプチドまたは低分子に結合する抗体である、実施形態1〜14のうちのいずれかによる試験デバイス。
18.分析物が、ポリヌクレオチドであり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬が、分析物であるポリヌクレオチドと実質的に相補的な別のポリヌクレオチドである、実施形態1〜14のうちのいずれかによる試験デバイス。
19.マトリックスが、ニトロセルロース、グラスファイバー、ポリプロピレン、ポリエチレン(好ましくは極めて分子量の大きな)、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリロニトリル、および/またはポリテトラフルオロエチレンを含む、実施形態1〜18のうちのいずれかによる試験デバイス。
20.マトリックスが、ストリップまたはサークルの形態である、実施形態1〜19のうちのいずれかによる試験デバイス。
21.マトリックスが、単一のエレメントであるか、または複数のエレメントを含む、実施形態1〜20のうちのいずれかによる試験デバイス。
22.マトリックスより上流にあり、かつ、マトリックスと流体連絡させた試料適用エレメントをさらに含む、実施形態1〜21のうちのいずれかによる試験デバイス。
23.マトリックスから下流にあり、かつ、マトリックスと流体連絡させた液体吸収エレメントをさらに含む、実施形態1〜22のうちのいずれかによる試験デバイス。
24.液体試料の適正な流動および/または妥当な試験結果を示すための手段を含む対照ゾーンをさらに含む、実施形態1〜23のうちのいずれかによる試験デバイス。
25.マトリックスの少なくとも一部が、固体バッキングで支持されている、実施形態1〜24のうちのいずれかによる試験デバイス。
26.物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
のうちの少なくとも1つである、実施形態1〜25のうちのいずれかによる試験デバイス。
27.2つの物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な標識
のうちの少なくとも2つであり、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、単独でまたは複合体で、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能である、実施形態26による試験デバイス。
28.3つの物質を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な標識
の全てである、実施形態26による試験デバイス。
29.物質を、試験ゾーンより上流にあるコンジュゲートエレメント上で乾燥させる、実施形態26〜28のうちのいずれかによる試験デバイス。
30.物質を、試験デバイス上の試料適用箇所から下流に配置する、実施形態26〜29のうちのいずれかによる試験デバイス。
31.物質を、試験デバイス上の試料適用箇所より上流に配置する、実施形態26〜30のうちのいずれかによる試験デバイス。
32.検出可能な標識が、可溶性標識である、実施形態1〜31のうちのいずれかによる試験デバイス。
33.可溶性標識が、可溶性酵素または蛍光標識である、実施形態32による試験デバイス。
34.検出可能な標識が、粒子標識である、実施形態1〜31のうちのいずれかによる試験デバイス。
35.粒子標識が、目視可能な粒子標識または目視不可能な粒子標識である、実施形態34による試験デバイス。
36.目視可能な粒子標識が、金粒子、ラテックス粒子、Q−Dot、カーボンナノチューブ、銀粒子、銀でコーティングした粒子、およびこれらの複合体からなる群から選択される、実施形態35による試験デバイス。
37.目視不可能な粒子標識が、蛍光粒子である、実施形態35による試験デバイス。
38.物質を、a)乾燥させた物質を安定化させ、b)乾燥させた物質の、液体に可溶化または再懸濁することを促進し、および/またはc)乾燥させた物質の可動性を促進させる材料の存在下で乾燥させる、実施形態26〜37のうちのいずれかによる試験デバイス。
39.材料が、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤からなる群から選択される、実施形態38による試験デバイス。
40.試料液単独を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する、実施形態1〜39のうちのいずれかによる試験デバイス。
41.顕色液を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する、実施形態1〜39のうちのいずれかによる試験デバイス。
42.試験デバイスの少なくとも一部を覆うハウジングをさらに含み、ハウジングが、試験ゾーンより上流における試料の適用または試験ゾーンへの試料の適用を可能とする試料適用ポート、および試験ゾーンにおけるシグナルの検出を可能とする、試験ゾーンの近傍の光学的開口部を含む、実施形態1〜41のうちのいずれかによる試験デバイス。
43.ハウジングが、試験デバイスの全体を覆う、実施形態42による試験デバイス。
44.マトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの少なくとも一部が、ハウジングにより覆われておらず、試料を、ハウジングの外側にあるマトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの一部へと適用し、次いで、試験ゾーンへと移送する、実施形態42による試験デバイス。
45.1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
のうちのいずれもが、互いに共有結合的に結合または架橋されていない、実施形態1〜44のうちのいずれかによる試験デバイス。
46.1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
のうちの少なくとも2つが、互いに共有結合的に結合または架橋されている、実施形態1〜44のうちのいずれかによる試験デバイス。
47.1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
の全てが、互いに共有結合的に結合または架橋されている、実施形態1〜44のうちのいずれかによる試験デバイス。
48.DNAデンドリマーが、DNAデンドリマーを、DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識へと連結する、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、約900〜約1,100の第2の成分を含む、実施形態1〜47のうちのいずれかによる試験デバイス。
49.DNAデンドリマーが、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む、実施形態1〜48のうちのいずれかによる試験デバイス。
50.DNAデンドリマーが、一層構造、二層構造、三層構造、もしくは四層構造、または米国特許第6,274,723B1号に記載されている、少なくとも1つの単量体ユニットを含むDNAデンドリマー構造を含む、実施形態1〜49のうちのいずれかによる試験デバイス。
51.液体試料が、試験デバイスに沿って側方方向に移動して、試験ゾーンにおいて検出可能なシグナルを発生させる、実施形態1〜50のうちのいずれかによる試験デバイス。
52.液体試料中の分析物を検出するための方法であって、
a)液体試料を、実施形態1〜50のうちのいずれかによる試験デバイスと接触させるステップであり、液体試料を、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位に適用するステップと、
b)液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、試験ゾーンへと移送するステップと、
c)試験ゾーンにおける検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、液体試料中の分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップと
を含む方法。
53.液体試料と、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
のうちの少なくとも1つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する、実施形態52による方法。
54.液体試料と、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
のうちの少なくとも2つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する、実施形態52による方法。
55.液体試料と、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
の全てとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する、実施形態52による方法。
56.約0.001%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)、または約0.01%(v/v)以下のTween−20を含む液体中で実行される、実施形態52〜55のうちのいずれかによる方法。
57.硫酸デキストランを含む液体中で実行される、実施形態52〜56のうちのいずれかによる方法。
58.物質を、試験ゾーンより上流にある試験デバイスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送して、検出可能なシグナルを発生させ、乾燥させた物質が、
1)DNAデンドリマー、
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体、および
3)DNAデンドリマーに連結可能な検出可能な標識
のうちの少なくとも1つである、実施形態52による方法。
59.乾燥させた物質を、試料の適用部位から下流に配置し、乾燥させた物質を、液体試料により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態58による方法。
60.乾燥させた物質を、試料の適用部位より上流に配置し、乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態58による方法。
61.乾燥させた物質を液体試料単独により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態58による方法。
62.分析物および/または乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態58による方法。
63.液体試料が、体液試料である、実施形態52〜62のうちのいずれかによる方法。
64.体液試料が、全血液試料、血清試料、血漿試料、および尿試料からなる群から選択される、実施形態63による方法。
65.液体試料が、生物学的供給源、法医学的供給源、食物供給源、生物戦争供給源、または環境供給源に由来する試料である、実施形態52〜64のうちのいずれかによる方法。
66.液体試料中の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用される、実施形態52〜65のうちのいずれかによる方法。
67.液体試料中の複数の分析物を検出するのに使用される、実施形態52〜66のうちのいずれかによる方法。
68.液体試料中の複数の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用される、実施形態67による方法。
69.分析物が、細胞、ウイルス、および分子からなる群から選択される、実施形態52〜68のうちのいずれかによる方法。
70.液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、その上に試験ゾーンを含む多孔性マトリックスであり、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスを含み、
液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し(または液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過することが可能であり)、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示し、前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する成分を含み、
a)前記分析物が、ポリヌクレオチドではないか、または
b)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含むか、または
c)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる
デバイス。
いくつかの実施形態では、前記分析物は、ポリヌクレオチドではなく、前記DNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含む。他の実施形態では、前記分析物は、ポリヌクレオチドではなく、前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。さらに他の実施形態では、前記DNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含み、前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。なおも他の実施形態では、前記分析物は、ポリヌクレオチドではなく、前記DNAデンドリマーは、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含み、前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる。
71.成分が、ポリヌクレオチドである、実施形態70による試験デバイス。
72.分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物に結合し、分析物に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態70または71による試験デバイス。
73.分析物についてのサンドイッチアッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物に結合し、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含む、実施形態70または71による試験デバイス。
74.分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物または分析物類似体であり、分析物に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体が、第2の結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する、実施形態70または71による試験デバイス。
75.分析物についての競合アッセイにおいて使用されるデバイスであり、試験ゾーンにおける試験試薬が分析物または分析物類似体であり、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬を使用し、第2の結合性試薬が、DNAデンドリマーの成分であるポリヌクレオチドと実質的に相補的なポリヌクレオチドを含み、試験ゾーンにおける分析物または分析物類似体が、第2の結合性試薬に結合する結合性試薬への結合について試料中の分析物と競合する、実施形態70または71による試験デバイス。
76.分析物、分析物類似体、試験試薬、および/または結合性試薬が、無機分子、有機分子、またはこれらの複合体である、実施形態70〜75のうちのいずれかによる試験デバイス。
77.有機分子が、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ビタミン、単糖、オリゴ糖、炭水化物、脂質、およびこれらの複合体からなる群から選択される、実施形態76による試験デバイス。
78.分析物が、ポリペプチドまたは低分子であり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬が、ポリペプチドまたは低分子に結合する抗体である、実施形態70〜77のうちのいずれかによる試験デバイス。
79.分析物が、ポリヌクレオチドであり、分析物に結合する試験試薬および/または結合性試薬が、分析物であるポリヌクレオチドと実質的に相補的な別のポリヌクレオチドである、実施形態70〜77のうちのいずれかによる試験デバイス。
80.マトリックスが、ニトロセルロース、グラスファイバー、ポリプロピレン、ポリエチレン(好ましくは極めて分子量の大きな)、フッ化ポリビニリデン、エチレン酢酸ビニル、アクリロニトリル、および/またはポリテトラフルオロエチレンを含む、実施形態70〜79のうちのいずれかによる試験デバイス。
81.マトリックスが、ストリップまたはサークルの形態である、実施形態70〜80のうちのいずれかによる試験デバイス。
82.マトリックスが、単一のエレメントであるか、または複数のエレメントを含む、実施形態70〜81のうちのいずれかによる試験デバイス。
83.マトリックスより上流にあり、かつ、マトリックスと流体連絡させた試料適用エレメントをさらに含む、実施形態70〜82のうちのいずれかによる試験デバイス。
84.マトリックスから下流にあり、かつ、マトリックスと流体連絡させた液体吸収エレメントをさらに含む、実施形態70〜83のうちのいずれかによる試験デバイス。
85.液体試料の適正な流動および/または妥当な試験結果を示すための手段を含む対照ゾーンをさらに含む、実施形態70〜84のうちのいずれかによる試験デバイス。
86.マトリックスの少なくとも一部が、固体バッキングで支持されている、実施形態70〜85のうちのいずれかによる試験デバイス。
87.試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において物質を乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、
1)DNAデンドリマー、および
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体
のうちの少なくとも1つである、実施形態70〜86のうちのいずれかによる試験デバイス。
88.DNAデンドリマー、および分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体の両方を、試験ゾーンより上流のマトリックスの一部において乾燥させる、実施形態87による試験デバイス。
89.物質を、試験ゾーンより上流にあるコンジュゲートエレメント上で乾燥させる、実施形態87または88による試験デバイス。
90.物質を、試験デバイス上の試料適用箇所から下流に配置する、実施形態87または88による試験デバイス。
91.物質を、試験デバイス上の試料適用箇所より上流に配置する、実施形態87または88による試験デバイス。
92.検出可能な標識が、可溶性標識である、実施形態70〜91のうちのいずれかによる試験デバイス。
93.可溶性標識が、可溶性酵素または蛍光標識である、実施形態92による試験デバイス。
94.検出可能な標識が、粒子標識である、実施形態70〜91のうちのいずれかによる試験デバイス。
95.粒子標識が、目視可能な粒子標識または目視不可能な粒子標識である、実施形態94による試験デバイス。
96.目視可能な粒子標識が、金粒子、ラテックス粒子、Q−Dot、カーボンナノチューブ、銀粒子、銀でコーティングした粒子、およびこれらの複合体からなる群から選択される、実施形態95による試験デバイス。
97.目視不可能な粒子標識が、蛍光粒子である、実施形態95による試験デバイス。
98.物質を、a)乾燥させた物質を安定化させ、b)乾燥させた物質の、液体に可溶化または再懸濁することを促進し、および/またはc)乾燥させた物質の可動性を促進させる材料の存在下で乾燥させる、実施形態87〜97のうちのいずれかによる試験デバイス。
99.材料が、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤からなる群から選択される、実施形態98による試験デバイス。
100.試料液単独を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する、実施形態70〜99のうちのいずれかによる試験デバイス。
101.顕色液を使用して、分析物および/または物質を試験ゾーンへと移送する、実施形態70〜99のうちのいずれかによる試験デバイス。
102.試験デバイスの少なくとも一部を覆うハウジングをさらに含み、ハウジングが、試験ゾーンより上流における試料の適用または試験ゾーンへの試料の適用を可能とする試料適用ポート、および試験ゾーンにおけるシグナルの検出を可能とする、試験ゾーンの近傍の光学的開口部を含む、実施形態70〜101のうちのいずれかによる試験デバイス。
103.ハウジングが、試験デバイスの全体を覆う、実施形態102による試験デバイス。
104.マトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの少なくとも一部が、ハウジングにより覆われておらず、試料を、ハウジングの外側にあるマトリックスの試料受容部分または試料適用エレメントの一部へと適用し、次いで、試験ゾーンへと移送する、実施形態102による試験デバイス。
105.DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200の前記第1の成分を含む、実施形態70〜104のうちのいずれかによる試験デバイス。
106.DNAデンドリマーが、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、または約900〜約1,100の検出可能な標識を含む、実施形態70〜105のうちのいずれかによる試験デバイス。
107.DNAデンドリマーが、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、または約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む、実施形態70〜106のうちのいずれかによる試験デバイス。
108.DNAデンドリマーが、一層構造、二層構造、三層構造、もしくは四層構造、または米国特許第6,274,723B1号に記載されている、少なくとも1つの単量体ユニットを含むDNAデンドリマー構造を含む、実施形態70〜107のうちのいずれかによる試験デバイス。
109.液体試料が、試験デバイスに沿って側方方向に移動して、試験ゾーンにおいて検出可能なシグナルを発生させる、実施形態70〜108のうちのいずれかによる試験デバイス。
110.液体試料中の分析物を検出するための方法であって、
a)液体試料を、実施形態70〜108のうちのいずれかによる試験デバイスと接触させるステップであり、液体試料を、試験デバイス上の試験ゾーンより上流の部位に適用するステップと、
b)液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、試験ゾーンへと移送するステップと、
c)試験ゾーンにおける検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、液体試料中の分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップと
を含む方法。
111.液体試料と、
1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマー、および
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体
のうちの少なくとも1つとをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する、実施形態110による方法。
112.液体試料と、
1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマー、および
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体
の両方とをあらかじめ混合して、混合物を形成し、混合物を、試験デバイスへと適用する、実施形態110による方法。
113.約0.001%(v/v)〜約5%(v/v)、好ましくは約0.01%(v/v)〜約0.5%(v/v)、または約0.01%(v/v)以下のTween−20を含む液体中で実行される、実施形態110〜112のうちのいずれかによる方法。
114.硫酸デキストランを含む液体中で実行される、実施形態110〜113のうちのいずれかによる方法。
115.物質を、試験ゾーンより上流にある試験デバイスの一部において乾燥させ、乾燥させた物質を、液体試料および/またはさらなる液体により、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移動させて、検出可能なシグナルを発生させることが可能であり、乾燥させた物質が、
1)検出可能な標識へと非共有結合的に連結されたDNAデンドリマー、および
2)分析物に結合する第1の結合性試薬、分析物に結合する別の結合性試薬に結合する第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体であって、それらの各々がDNAデンドリマーに連結可能な、第1の結合性試薬、第2の結合性試薬、分析物、または分析物類似体
のうちの少なくとも1つである、実施形態110による方法。
116.乾燥させた物質を、試料の適用部位から下流に配置し、乾燥させた物質を、液体試料により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態115による方法。
117.乾燥させた物質を、試料の適用部位より上流に配置し、乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態115による方法。
118.乾燥させた物質を液体試料単独により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態115による方法。
119.分析物および/または乾燥させた物質を、別の液体により可溶化または再懸濁させ、試験ゾーンおよび/または対照ゾーンへと移送する、実施形態115による方法。
120.液体試料が、体液試料である、実施形態110〜119のうちのいずれかによる方法。
121.体液試料が、全血液試料、血清試料、血漿試料、および尿試料からなる群から選択される、実施形態120による方法。
122.液体試料が、生物学的供給源、法医学的供給源、食物供給源、生物戦争供給源、または環境供給源に由来する試料である、実施形態110〜121のうちのいずれかによる方法。
123.液体試料中の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用される、実施形態110〜122のうちのいずれかによる方法。
124.液体試料中の複数の分析物を検出するのに使用される、実施形態110〜123のうちのいずれかによる方法。
125.液体試料中の複数の分析物の量を定量化または半定量化するのに使用される、実施形態124による方法。
126.分析物が、細胞、ウイルス、および分子からなる群から選択される、実施形態110〜125のうちのいずれかによる方法。
127.DNAデンドリマーを、試験デバイスを使用する前に、試験ゾーンより上流にある試験デバイス上の位置において乾燥させ、乾燥させたDNAデンドリマーのうちの少なくとも約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%が、液体により、試験ゾーンへと移動させるがこと可能な、実施形態1〜51および70〜109のうちのいずれかによる試験デバイス。
128.DNAデンドリマーを、a)乾燥させたDNAデンドリマーを安定化させ、b)乾燥させたDNAデンドリマーの、液体に可溶化または再懸濁することを促進し、および/またはc)乾燥させたDNAデンドリマーの可動性を促進させる材料の存在下で試験デバイス上の位置において乾燥させる、実施形態127による試験デバイス。
129.材料が、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤からなる群から選択される、実施形態128による試験デバイス。
130.糖が、トレハロースおよび/またはスクロースである、実施形態129による試験デバイス。
131.液体が、a)乾燥させたDNAデンドリマーを安定化させ、b)乾燥させたDNAデンドリマーの、液体に可溶化または再懸濁することを促進し、および/またはc)乾燥させたDNAデンドリマーの可動性を促進させる材料を含む、実施形態127〜130のうちのいずれかによる試験デバイス。
132.材料が、タンパク質、ペプチド、多糖、糖、ポリマー、ゼラチン、および洗浄剤からなる群から選択される、実施形態131による試験デバイス。
133.タンパク質が、BSAであり、洗浄剤が、Tween−20である、実施形態132による試験デバイス。
134.前記液体の容量が、少なくとも約20ul、25ul、30ul、35ul、40ul、45ul、50ul、55ul、60ul、65ul、70ul、75ul、80ul、85ul、90ul、95ul、100ul、110ul、120ul、150ul、200ul、300ul、400ul、500ulであるか、または500ulを超える容量である、実施形態127から133のいずれかに記載の試験デバイス。
135.前記DNAデンドリマーが、
a)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約1〜2、2〜4、もしくは4〜8を含む1層DNAデンドリマー、
b)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約1〜4、4〜8、もしくは8〜18を含む2層DNAデンドリマー、
c)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約2〜6、6〜10、10〜18、18〜28、28〜38、38〜50、もしくは50超を含む3層DNAデンドリマー、および/または
d)前記第1および/もしくは第2の成分のうちの約15〜25、25〜45、45〜60、60〜80、85〜105、105〜130、もしくは130超を含む4層DNAデンドリマー
を含む、実施形態1から51、70から109、および127から134のいずれかに記載の試験デバイス。
136.前記第1の成分および前記第2の成分のうちの少なくとも一方がポリヌクレオチドであり、他方が、非ポリヌクレオチド部分である、実施形態135に記載の試験デバイス。
137.前記DNAデンドリマーが、
a)前記第1の成分のうちの約1〜2、2〜4、もしくは4〜8を含む1層DNAデンドリマー、
b)前記第1の成分のうちの約1〜4、4〜8、もしくは8〜18を含む2層DNAデンドリマー、
c)前記第1の成分のうちの約2〜6、6〜10、10〜18、18〜28、28〜38、38〜50、もしくは50超を含む3層DNAデンドリマー、および/または
d)前記第1の成分のうちの約15〜25、25〜45、45〜60、60〜80、85〜105、105〜130、もしくは130超を含む4層DNAデンドリマー
を含む、実施形態135に記載の試験デバイス。
138.前記第1の成分が、ポリヌクレオチドを含む、実施形態137に記載の試験デバイス。
139.前記ポリヌクレオチドが、DNA鎖である、実施形態138に記載の試験デバイス。
140.液体試料中の分析物を検出するための方法であって、
a)液体試料を、実施形態127から139のいずれかに記載の試験デバイスと接触させるステップであり、前記液体試料を、前記試験デバイスの試験ゾーンの上流にある部位へと適用するステップと、
b)前記液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、前記試験ゾーンへと移送するステップと、
c)前記試験ゾーンにおける前記検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップと
を含む方法。
141.前記検出可能な標識が前記試験ゾーンにおいて発生させる前記シグナルを、
a)より少数の第1および/もしくは第2の成分を含むDNAデンドリマーを使用して、前記検出可能な標識が前記試験ゾーンにおいて発生させるシグナルと比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、もしくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20倍以上増強するか、または
b)DNAデンドリマーを使用せずに、前記検出可能な標識が前記試験ゾーンにおいて発生させるシグナルと比べて、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、150%、または2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200倍以上増強する、実施形態140に記載の試験デバイス。
142.液体試料中の分析物を検出するための試験デバイスであって、前記デバイスは、多孔性マトリックスを含み、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックス上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、試験試薬を含み、前記試験試薬は、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体であり、
液体試料が、前記試験デバイスに沿って側方方向に流れ、前記試験ゾーンを通過し、検出可能なシグナルを形成して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を示すことが可能であり、
a)前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識およびDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むか、または
b)前記検出可能なシグナルの形成が、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結されたDNAデンドリマーの使用を必要とし、前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、もしくは前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第3の成分を含み、
c)前記分析物が、ポリヌクレオチドではなく、そして/または
d)前記DNAデンドリマーが、約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、もしくは約100〜約200の前記第1の成分を含み、そして/または
e)前記DNAデンドリマーを、前記試験デバイスを使用する前に、前記試験デバイス上の前記試験ゾーンより上流の部位で乾燥させる
デバイス。
143.液体試料中の分析物を検出するための方法であって、
a)液体試料を、実施形態142に記載の試験デバイスと接触させるステップであり、前記液体試料を、前記試験デバイスの試験ゾーンの上流にある部位へと適用するステップと、
b)前記液体試料中に存在する場合、分析物、検出可能な標識、およびDNAデンドリマーを、前記試験ゾーンへと移送するステップと、
c)前記試験ゾーンにおける前記検出可能な標識が発生させるシグナルの存在、非存在、および/または量を評価して、前記液体試料中の前記分析物の存在、非存在、および/または量を決定するステップと
を含む方法。
144.液体試料中の分析物を検出するためのキットであって、
a)多孔性マトリックスであって、前記多孔性マトリックスは、前記多孔性マトリックス上に試験ゾーンを備え、前記試験ゾーンが、分析物もしくは前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する、または結合性試薬への前記分析物の結合について前記試料中の分析物と競合する分析物もしくは分析物類似体である試験試薬を含む多孔性マトリックスと、
b)DNAデンドリマーと
を含み、
1)前記DNAデンドリマーが、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、または前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第1の成分と、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識へと連結する第2の成分とを含むか、または
2)前記DNAデンドリマーが、検出可能な標識へと共有結合的もしくは非共有結合的に連結され、前記DNAデンドリマーを、前記DNAデンドリマーに連結可能な結合性試薬、前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物、もしくは前記DNAデンドリマーに連結可能な分析物類似体へと連結する第3の成分を含む
キット。
145.前記DNAデンドリマーが、前記第1または第3の成分のうちの約1〜約324、好ましくは約60〜約324、約80〜約300、または約100〜約200を含む、実施形態144に記載の試験デバイス。
146.前記第1の成分および前記第2の成分のうちの一方が、ポリヌクレオチドであり、他方が、非ポリヌクレオチド部分である、実施形態144または145に記載のキット。
147.前記第3の成分が、ポリヌクレオチドである、実施形態144または145に記載のキット。
148. 1)前記DNAデンドリマー、
2)前記分析物に結合する前記第1の結合性試薬、前記分析物に結合する別の結合性試薬に結合する前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体であって、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体の各々が前記DNAデンドリマーに連結可能である、前記第1の結合性試薬、前記第2の結合性試薬、前記分析物、または前記分析物類似体、および
3)前記DNAデンドリマーに連結可能な前記検出可能な標識
のうちの少なくとも2つが、互いに共有結合的に結合または架橋されている、実施形態144から147のいずれかに記載のキット。
149.前記DNAデンドリマーが、約10〜約1,500、好ましくは約40〜約1,500、または約900〜約1,100の前記検出可能な標識を含む、実施形態144から148のいずれかに記載のキット。
150.前記DNAデンドリマーが、約400〜約80,000、好ましくは約4,000〜約80,000、または約60,000〜約80,000のDNAヌクレオチドを含む、実施形態144から149のいずれかに記載のキット。
151.前記DNAデンドリマーが、一層構造、二層構造、三層構造、もしくは四層構造、または米国特許第6,274,723B1号に記載されている、少なくとも1つの単量体ユニットを含むDNAデンドリマー構造を構成する、実施形態144から150のいずれかに記載のキット。
152.抗体−オリゴコンジュゲート、分析物捕捉抗体、ストレプトアビジン−標識、例えば、金粒子、コンジュゲート、または他の標識、緩衝液、試薬、指示書などのうちの1または複数をさらに含む、実施形態144から151のいずれかに記載のキット。

0149

G.実施例
以下の実施例は、POCラテラルフローアッセイにおけるDNAデンドリマーの使用についての上記の記載の適用を表す。以下の実施例は、例示的な目的だけで組み入れられるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

0150

(実施例1)
全液体(「ウェット」)型直接的サンドイッチPOCラテラルフローアッセイにおける感度を改善するための、DNAデンドリマーおよび抗hCGマウスモノクローナルターゲティング抗体−オリゴコンジュゲートの使用
DNAデンドリマーの作製
DNAデンドリマーは、既に開示されている(特許第5,175,270号、同第5,484,904号、同第5,487,973号、同第6,110,687号、および同第6,274,723号を参照されたい)通りに作製する。略述すると、DNAデンドリマーは、それらの各々が、各鎖の中央部分に位置する配列相補性の領域を共有する2本のDNA鎖から作製されるDNA単量体から構築される。2本の鎖がアニールして、単量体を形成する場合、結果として得られる構造は、4本の一本鎖「アーム」に隣接する、中央の二本鎖「ウェスト」を有する構造として記載することができる。このウェストプラスアーム構造は、基本的なDNA単量体を含む。5つの単量体種類の各々の末端における一本鎖アームは、正確かつ特異的な様式で互いに相互作用するようにデザインする。相補的単量体のアームの間の塩基対合は、単量体層の逐次的付加を介する、デンドリマーの方向付けられたアセンブリーを可能とする(図3)。デンドリマーの各層のアセンブリーは、DNA鎖を互いに共有結合的に結合させ、これにより、そうしければデンドリマー構造の変形を引き起こす変性条件の影響を受けにくい、完全に共有結合的な分子を形成する架橋形成工程を含む(図2)。加えて、相補的捕捉オリゴとして用いられる38塩基のオリゴヌクレオチドも、以下の簡単なT4DNAリガーゼ依存型ライゲーション反応
124マーのDNA鎖 500ng
e(+)LIG−BR7 Bridgingオリゴ(14マー) 241.9ng
ligA Cap03オリゴ(38マー) 306.5ng
10倍濃度のリガーゼ緩衝液1uL(1/10容量)
ヌクレアーゼ非含有水 10uLの全容量まで
T4 DNAリガーゼ(1U/uL) 1uL(1ユニット、1/10容量)
を介して、別個の124マーの一本鎖DNAオリゴヌクレオチドの5’端へとあらかじめライゲーションする(「鎖ライゲート」)。

0151

最初の5つの反応物を併せて添加し、42℃で15分間にわたりインキュベートし、次いで、室温まで冷却させる。次いで、6番目の反応物を添加し、2時間にわたりインキュベートする。ライゲーション反応は、0.5MのEDTA溶液0.25uLを添加する(12.5mMの最終濃度まで)ことにより停止させる。この鎖ライゲートを、下記の捕捉配列特異的なビオチニル化DNAデンドリマーの作製において使用する。

0152

ハイブリダイゼーションを介して、鎖ライゲート(上記)およびビオチン標識部分を含有するDNAオリゴヌクレオチドを、デンドリマーの末端側の一本鎖DNA配列に共有結合的に結合させるのに続き、ハイブリダイズさせた2本のDNA鎖の間で、ソラーレンのインターカレーションを施す。インターカレーションされたソラーレンは、300nmのUV光に曝露されると、ハイブリダイズさせたDNA鎖の間で、共有結合的に結合する。

0153

典型的なハイブリダイゼーション−架橋形成作製工程は、以下のようになろう。

0154

マイクロ遠心管へと、以下の成分:
4層DNAデンドリマー1000ng(1ug)
鎖ライゲート(上記に由来する) 鎖として500ng(総合成量:10uL)
c(+) 2×ビオチンオリゴ(35マー)(デンドリマーの「cアーム」と相補的)
452.4ng
N3(−)#1 2×ビオチンオリゴ(18マー)(「鎖3のライゲート」と相補的)
291.9ng
N3(−)#2 2×ビオチンオリゴ(19マー)(「鎖3のライゲート」と相補的)
243.2ng
N3(−)#3 2×ビオチンオリゴ(26マー)(「鎖3のライゲート」と相補的)
316.2ng
5MのNaCl 1.1uL(0.2Mの最終濃度)
0.1MのDTT 0.7uL(2.5mMの最終濃度)
ヌクレアーゼ非含有水 28uLの全容量まで
エタノール中の2,4,8トリメチルソラーレン飽和溶液1.1uL
を添加する。

0155

上記の反応物を併せて添加し、十分に混合し、75℃の水の容器に入れ、42℃までゆっくりと冷却する。300nmのUV光へと10分間にわたり曝露することにより、ビオチニル化オリゴをDNAデンドリマーのアームへと共有結合的に結合させる架橋形成イベントを誘発する。1.1uLエタノール中のソラーレン飽和溶液をさらに添加し、反応物を、さらに2.5分間にわたり300nmのUV光へと曝露する。架橋形成しなかったオリゴヌクレオチドは、サイズ除外スピンカラムまたは同等の方法を使用することにより除去する。

0156

より多くの捕捉配列またはより少ない捕捉配列を含有するデンドリマーのためには、これに応じて、「鎖ライゲート」(上記の反応物2)の量を変化させることができる。

0157

マウス抗hCGターゲティング抗体(DCN、Carlsbad、CA)を、デンドリマーに結合させた「鎖ライゲート」へと既にライゲーションされたCap03 DNAオリゴヌクレオチドと相補的なcplCap03 DNAオリゴヌクレオチドへとコンジュゲートさせた。cplCap03 DNAオリゴヌクレオチドは、標準的な架橋形成縮合コンジュゲーション化学反応を使用して、抗マウスIgG抗体へと共有結合的にコンジュゲートさせる。この抗体−オリゴコンジュゲートは、ラテラルフローアッセイにおける別個の試薬として使用することもでき、抗体に結合させたcplCap03オリゴヌクレオチドの、デンドリマーの末端側の「アーム」上の相補的なCap03配列とのハイブリダイゼーションを介して、DNAデンドリマーとあらかじめ組み合わせることもできる。このハイブリダイゼーション部位は、31塩基対を含み、溶融温度が65℃を超え、これにより、生理学的温度および生理学的条件で安定的な、抗体と結合させたデンドリマーの複合体をもたらす(図4)。

0158

DNAデンドリマーをシグナル増幅剤として活用するPOCラテラルフローアッセイの性能:
以下の材料:
1.a)ニトロセルロース膜(HF180、EMD Millipore、Billerica、MA)およびb)ウィック材料からなるラテラルフローストリップ。ニトロセルロース膜に、試験ラインとして使用するための、ラテラルフローイムノアッセイ適用に適する濃度の抗hCGアルファ抗体ならびに対照ラインとして使用するための抗マウスIgG抗体のさらなるストライプで筋をつけた。標準的なラテラルフローイムノアッセイのために、全ての成分を適切にブロッキングし、調製した;
2.公知量のhCGを含有する液体(水性)試料;
3.溶液中のデンドリマー結合のためのターゲティング分子として使用するための、マウス抗hCG(ベータ)抗体−オリゴコンジュゲート;
4.ビオチニル化させ、水性緩衝液中にCap03捕捉配列(上記で記載した)を含有する、DNAデンドリマー;
5.溶液中のストレプトアビジンコンジュゲート金コロイドナノ粒子(40nmの公称サイズ)(Diagnostics Consulting Network(DCN)、Carlsbad、CA);
6.0.05%のTween−20(T)および0.5%のBSA(B)(PBS−TB)を伴うリン酸緩衝生理食塩液(PBS);
7.溶液中のマウス抗hCG金コロイドコンジュゲート(40nmの公称サイズ)(DCN);
8.平底ウェルを伴う、96ウェルポリスチレンマイクロ滴定プレート
が必要とされた。

0159

アッセイ手順(マルチステップ):
1.PBS−TBを使用して、全ての試薬を希釈した。
2.96ウェルマイクロ滴定プレートの第1行に、15μlの適量のhCG抗原(100mIUで始め、2倍の系列希釈で、0.024mIUまでの範囲にわたる)を分注した。
3.第2行に、15μlのマウス抗hCG抗体−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、適正な希釈率(経験的に決定される1:100)で分注した。
4.第3行に、13.3ng/μlまで希釈した(デンドリマーのウェル1つ当たり/ラテラルフローストリップ1つ当たりの総最終常用量を200ngとする)、15μlのデンドリマーを分注した。
5.第4行に、1.0ODまで希釈した、20μlのストレプトアビジン−金コロイドコンジュゲートを分注した。
6.ストリップの基部が、ウェルの前部において溶液との接触を維持するように、ストリップを、行1のウェル(hCG抗原を含有する)に入れ、ストリップをプレートの後部へと寄せかけた。
7.第1行のウェル内の全ての液体を、全てのストリップへとウィッキングさせたら、ストリップを、ウェルの次の行へと移した。各ストリップについて、後続のウェルへと、各ウェル内の全ての液体が、対応するストリップにより吸収されるまでこの工程を繰り返した。
8.全てのウェルを通して、全てのストリップを移動させるのに成功した後、各試験ラインの目視スコアを記録した(DCNによる標準的なラテラルフロー目視評定ガイドによる(図13))。試験ラインおよび対照ラインの両方における目視可能な赤色調または赤褐色の線では、妥当な陽性結果(試料中のhCGの検出の成功)が示された。目視可能な対照ラインだけでは、妥当な陰性結果(試料中のhCGの検出は見られない)が示された。任意の目視可能な対照ラインが欠如すれば、試験の非妥当性が示され、結果は棄却された。
9.標準的なアッセイを構成するため、上記の手順に従い、マウス抗hCG抗体−オリゴコンジュゲートおよび3DNAデンドリマーの両方を、15μlのPBS−Tで置きかえ、ストレプトアビジン金コロイドコンジュゲートをマウス抗hCG金コロイドコンジュゲート(1.0 ODの常用濃度まで希釈した)で置きかえる。

0160

直接的サンドイッチPOCラテラルフローhCGアッセイ(ウェットアッセイフォーマット)における3DNAデンドリマーの活用の結果:上記で記載したアッセイを、2倍の系列希釈における100mIU〜0.024mIUの範囲のhCG試料に対して実施した後で、デンドリマーアッセイについて、標準的な非デンドリマーhCGアッセイについての3.1〜6.2mIUのLODと比較して、0.20〜0.40mIU hCGの検出限界(LOD:limit of detection)が達成されることから、DNAデンドリマーをシグナル増幅剤として使用する場合に、8〜32倍の感度の改善が結果としてもたらされることが観察された(図5)。

0161

(実施例2)
全液体(「ウェット」)型間接的サンドイッチPOCラテラルフローアッセイにおける感度を改善するための、3DNAデンドリマーおよび抗マウスIgGターゲティング抗体−オリゴコンジュゲートの使用
以下の材料:
1.実施例1で記載した、ラテラルフローストリップ;
2.実施例1で記載した、hCG抗原を含有する液体(水性)試料;
3.一次抗体(経験的に決定される1:1000の希釈率)として使用されるマウス抗hCG(ベータ)抗体(DCN);
4.溶液中のデンドリマー結合のためのターゲティング分子として使用するための、抗マウス抗体−オリゴコンジュゲート;
5.溶液中の3DNAビオチニル化デンドリマー;
6.実施例1で記載した、ストレプトアビジンコンジュゲート金コロイドナノ粒子;
7.実施例1で記載した、PBS−TB;
8.実施例1で記載した、マウス抗hCG金コロイドコンジュゲート;
9.実施例1で記載した、96ウェルポリスチレンマイクロ滴定プレート
が必要とされた。

0162

アッセイ手順(マルチステップ):アッセイは、以下のステップを除き、実施例1の通りに実施した。
3.第2行に、15μlのマウス抗hCG抗体を、適正な希釈率(経験的に決定される1:1000)で分注する。
4.第3行に、15μlの抗マウス抗体−オリゴコンジュゲートを、適正な希釈率(経験的に決定される1:18)で分注する。
5.第4行に、13.3ng/μlまで希釈した(デンドリマーのウェル1つ当たり/ラテラルフローストリップ1つ当たりの総最終常用量を200ngとする)、15μlのデンドリマーを分注する。
6.第5行に、1.0ODまで希釈した、20μlのストレプトアビジン−金コロイドコンジュゲートを分注する。
7.残りのステップは、実施例1のステップ7〜9と同一の様式で実施した。

0163

間接的サンドイッチPOCラテラルフローhCGアッセイ(ウェットアッセイフォーマット)におけるDNAデンドリマーの活用の結果:上記で記載したアッセイを、2倍の系列希釈における100mIU〜0.024mIUの範囲のhCG試料に対して実施した後で、デンドリマーアッセイについて、標準的な非デンドリマーhCGアッセイについての3.1〜6.2mIUのLODと比較して、0.10〜0.20mIU hCGの検出限界(LOD)が達成されることから、DNAデンドリマーをシグナル増幅剤として使用する場合に、16〜64倍の感度の改善が結果としてもたらされることが観察された(図6)。

0164

(実施例3)
DNAデンドリマーの多様な物理的特徴の、実施例1で実施した直接的サンドイッチPOCラテラルフローアッセイの性能に対する影響
必要とされる材料:下記で記載される通り、異なるDNAデンドリマーを活用したことを除き、実施例1の通りであった。

0165

アッセイ手順(マルチステップ):アッセイは、下記で記載される通り、異なるDNAデンドリマーを使用したことを除き、実施例1の通りに実施した。

0166

捕捉配列の数の影響
POCアッセイにおいて、分析物に直接的または間接的に結合することが可能な抗体−オリゴコンジュゲートは、DNAデンドリマーシグナル増幅剤へとあらかじめ組み込まれたDNAオリゴヌクレオチド「捕捉」配列を「架橋する」か、またはこれに結合する。DNAデンドリマー内に作製された(前記アームのハイブリダイゼーションおよび架橋形成を介して)オリゴヌクレオチド「捕捉」配列の数は、変化させることができる。約60、約120、または約160の「捕捉」配列を含有するDNAデンドリマーを、既に記載した通りに合成した。次いで、これらのDNAデンドリマーを、実施例1で記載した直接的サンドイッチPOCラテラルフローアッセイ(「ウェット」フォーマット)において活用した。

0167

hCG検出アッセイでは、捕捉配列の数を増大させると、より低値のLODが達成されることが観察された。感度を最高レベルまで増大させたところ、多様な反応緩衝液、洗浄剤、および他の試薬を使用することにより部分的に制御される非特異的結合(NSB:non−specific binding)がアッセイ中で観察された。これらの結果は、DNAデンドリマー上の抗体−オリゴコンジュゲート結合部位の数を増大させることにより、分析物、抗体−オリゴコンジュゲート、およびDNAデンドリマーシグナル増幅剤の間の接触の可能性の増大を介する反応速度の改善を介して、アッセイの感度が改善される可能性が高いことを裏付けた。
標識の数の影響

0168

標識部分(例えば、ビオチン)の総数を、DNAデンドリマー上で変化させた。DNAデンドリマーを、約1,440、約960、約480、および約240のビオチンと共に合成した。約960のビオチンを含有するDNAデンドリマーの性能が最良であるのに続き、それぞれ、約1,440、約480、および約240のビオチンの性能が良好であることが観察された。約1,440のビオチンを伴うDNAデンドリマーの感度が低いことは予測外であり、この分子試薬のサイズが他のデンドリマーと比較して幾分大きく、イムノアッセイでは最適に標識されたデンドリマーに対して、反応速度的に好適でないことに起因した可能性がある。

0169

サイズの影響
DNAデンドリマーは、多様な物理的サイズとなるように合成することができ、これは、POCラテラルフローシステムにおけるこれらの分子の性能に対して影響を及ぼしうる。分子のサイズおよび構造が、イムノアッセイの反応速度に寄与することを踏まえると、最多の標識部分を有する最も大型のDNAデンドリマーが、ラテラルフローアッセイ中で反応速度的に好適でない可能性があるのに対し、少数の標識を含有する小型のデンドリマーは、小型分子の良好な反応速度に起因して、アッセイ中で同等以上の性能を示しうることが仮定される。上記で言及した通り、約1,440のビオチン標識部分を伴う最も大型のデンドリマーは、約960のビオチンを伴うデンドリマーより低い性能を示した。約1,440のビオチンデンドリマーは、約960のビオチンデンドリマーの場合の約69,900のDNAヌクレオチドと比較して、約81,500のDNAヌクレオチドを含有し、総質量の差違は16.6%である。この質量差は、大型のデンドリマー上の多数のビオチン部分にもかかわらず、これらの分子の間の性能の差違の一因となりうると本発明者らは考える。さらに、他のサイズのさらなるDNAデンドリマーについても調べたところ、より大きいシグナル増幅結果またはより小さなシグナル増幅結果であって、様々なデンドリマーの間のサイズの差違に正比例しないシグナル増幅結果をもたらすことが判明した。

0170

(実施例4)
直接的サンドイッチPOCラテラルフローアッセイにおける非特異的結合(NSB)の低減
必要とされる材料:下記で記載される通り、異なるPBS緩衝液を活用したことを除き、実施例1の通りであった。

0171

アッセイ手順(マルチステップ):アッセイは、下記で記載される通り、異なるPBS緩衝液を使用したことを除き、実施例1の通りに実施した。

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