図面 (/)

技術 AAVSFLT−1を用いたAMDの処置

出願人 アバランチオーストラリアプロプライエタリーリミテッド
発明者 コンスタブル,イアンジェイ.ラコジー,エリザベスピー.ライ,チョーイ−メイチャルバーグ,トーマスダブリュー.ジュニア
出願日 2013年5月7日 (6年3ヶ月経過) 出願番号 2015-512688
公開日 2015年8月13日 (4年0ヶ月経過) 公開番号 2015-523060
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 初期流体 モジュール配列 水平軌道 微小内 内径サイズ 貯留部分 局所網 中心窩領域
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年8月13日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

本開示は、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt−1)タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象において、AMDなどの眼の血管新生を防止または処置するための組成物および方法を提示する。ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、VEGF阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。

概要

背景

加齢黄斑変性(AMD:age−related macular degeneration)は、50を超える人々における視覚不可逆的な損傷の主要な原因のうちの1つである。AMDは、臨床的に「萎縮型」および「滲出型」という2つの種類へと分けられる。AMDの滲出形態は、急速に発症する可能性があり、失明を結果としてもたらすことが多い。疾患の病理学的変化は、重度視覚機能障害を引き起こしうる。AMDの症状は、黄斑帯域内の網膜色素上皮(RPE:retinal pigment epithelial)細胞機能不全および脈絡膜血管新生(CNV:choroidal neovascularization)を含みうるがこれらに限定されない。重度の症例では、流体漏出、RPEまたは神経上皮剥離、および破裂した血管からの出血も生じうる。その中に血管内皮成長因子VEGF:vascular endothelial growth factor)、VEGF受容体(VEGFR:VEGF receptor)、血小板由来成長因子(PDGF)、低酸素誘導因子(HIF)、アンジオポエチン(Ang)および他のサイトカインマイトジェン活性タンパク質キナーゼMAPK)などを含みうるがこれらに限定されない、多くの細胞因子が、CNV発生の調節において重要な役割を果たすことが見出されている。

現在承認されている、滲出型AMDのための1つの処置は、Lucentis(登録商標)である。Lucentis(登録商標)とは、抗血管形成剤であり、血管内皮成長因子(VEGF)の全てのアイソフォームを標的とする。臨床研究は、処置を施された患者のうちの約60%と比較して、Lucentis(登録商標)投与された患者のうちの約95%における視覚の改善または安定を示している。Lucentis(登録商標)は、視覚を改善することが最初に承認された薬剤であるが、最適な視覚への有益性のためには、4週間ごとの硝子体内投与を要求する。Eylea(登録商標)とは、滲出型AMDを処置することが承認されている、別のVEGF阻害剤である。Eylea(登録商標)もまた、最適な視覚への有益性のためには、4〜8週間ごとに高頻度硝子体内注射を要求する。硝子体内投与経路は、投与の反復と共にそれらの累積的な危険性が増大する、感染性眼内炎および網膜剥離などの重篤合併症に対する危険性を増大させる可能性がある。眼内圧の増大、外傷性白内障、および網膜裂傷もまた報告されている。最後に、処置が眼科医により送達される場合、処置頻度は、患者、医師、および医療システム一般に対する負担を決定し、可能な程度までこれを低減すべきである。当技術分野では、AMDに続発するCNVのために現在利用可能な治療限界から、要求される高頻度の処置および処置手順侵襲性に取り組む代替的な手法に対する必要が創出された。VEGFの上昇を伴う血管新生はまた、糖尿病性網膜症糖尿病性黄斑浮腫DME:diabetic macular edema)、および網膜静脈閉塞症RVO:retinal vein occlusion)など、他の眼病態ももたらしうる。これらの疾患は、網膜血管新生および視覚喪失をもたらす。Lucentis(登録商標)などのVEGF阻害剤は、DMEおよびRVOにおける有効性裏付けているが、有益性を維持するためには、滲出型AMDの場合と同様に、高頻度の硝子体内投与を要求する。

概要

本開示は、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt−1)タンパク質をコードする核酸を含むベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象において、AMDなどの眼の血管新生を防止または処置するための組成物および方法を提示する。ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、VEGF阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。

目的

本開示は、ヒト対象のAMDの滲出形態において見出されるCNVなどのCNVを処置するための組成物および方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

ヒト対象における眼の血管新生処置または予防における使用のための、VEGF阻害剤をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。

請求項2

前記VEGF阻害剤が、抗VEGF抗体またはその機能的断片である、請求項1に記載の使用のための核酸。

請求項3

前記VEGF阻害剤が、可溶性受容体融合タンパク質、またはこれらの断片である、請求項1に記載の使用のための核酸。

請求項4

ヒト対象における眼の血管新生の処置または予防における使用のための、sFLT−1をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸。

請求項5

前記sFLT−1が、VEGF阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、VEGF阻害の結果として生じる、請求項4に記載の使用のための核酸。

請求項6

前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT−1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への前記医薬組成物の投与後の少なくとも72時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のsFLT−1タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能である、請求項4に記載の使用のための核酸。

請求項7

前記sFLT−1を含む前記核酸が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルスヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス単純ヘルペスウイルスレンチウイルスポックスウイルスセンダイウイルスHVJ)−リポソーム複合体モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項8

前記組換えウイルスが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択されるAAVである、請求項7に記載の使用のための核酸。

請求項9

前記sFLT−1をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーターCAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項10

プラスミドであるか、またはウイルスベクターにより送達される、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項11

前記使用が、処置または低減を必要とする前記ヒト対象への、1または複数のさらなるVEGF阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるVEGF阻害剤が、ラニビズマブベバシズマブ、またはアフリベルセプトである、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項12

前記使用が、前記医薬組成物を、少なくとも55のヒト対象へと投与するステップを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項13

前記使用が、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項14

ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの、処置を必要とする前記ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、有効量の前記医薬組成物の前記投与後において、少なくとも1、2、3、4、または5行改善する、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項15

前記医薬組成物の前記投与により、他の抗VEGF療法の投与頻度が低減される、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項16

他の抗VEGF療法の前記投与が、3カ月当たり1回未満、または6カ月当たり1回未満、または1年当たり1回未満である、請求項15に記載の核酸。

請求項17

前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒトにおいて、1年間に3回未満の頻度で実施される、前記請求項のいずれかに記載の使用のための核酸。

請求項18

組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記単位が少なくとも1×1010〜3×1012のベクターゲノムを含み、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結した前記sFLT−1をコードする核酸を含み、前記単位用量が、ヒト対象の硝子体中のsFLT−1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも7日後に上昇させることが可能である、単位用量の医薬組成物。

請求項19

組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物であって、各組換えウイルスまたはプラスミドが核酸を含み、前記核酸が、プロモーター配列に作動的に連結したsFLT−1導入遺伝子配列を含み、前記医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT−1タンパク質のレベルを、前記ヒト対象への投与後の少なくとも7日後に上昇させることが可能である、医薬組成物。

請求項20

前記プロモーター配列と、前記sFLT−1導入遺伝子配列とが、300塩基対を超える配列により隔てられている、請求項19に記載の医薬組成物。

請求項21

前記プロモーター配列と、前記sFLT−1導入遺伝子配列とが、UTR配列により隔てられている、請求項19に記載の医薬組成物。

請求項22

以下の順序:a.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32からなる群から選択されるプロモーター配列;b.配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107配列番号108または配列番号122からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;c.配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119または配列番号120からなるイントロン配列;d.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;およびe.配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列核酸エレメントを含む医薬組成物。

請求項23

以下の順序:a.配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59からなる群から選択されるITR配列;b.配列番号60、配列番号63、配列番号68、配列番号72、配列番号76、配列番号77、および配列番号84からなる群から選択されるリンカー配列;c.配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31および配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46および配列番号47からなる群から選択されるプロモーター配列;d.配列番号60、配列番号64、配列番号70、配列番号71、配列番号73、配列番号74、配列番号87からなる群から選択されるリンカー配列;e.配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119および配列番号120からなるイントロン配列;f.配列番号60、配列番号64、配列番号65、配列番号75、配列番号79、配列番号81、配列番号82、および配列番号89からなる群から選択されるリンカー配列;g.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;ならびにh.配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号107、配列番号108および配列番号122からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;i.配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;j.配列番号60、配列番号62、配列番号66、配列番号67、配列番号69、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86からなる群から選択されるリンカー配列;k.配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列;l.配列番号60、配列番号61、配列番号80、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90からなる群から選択されるリンカー配列;ならびにm.配列番号56、配列番号57、配列番号58、および配列番号59からなる群から選択されるITR配列で核酸エレメントを含む医薬組成物。

請求項24

細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、a.sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、b.前記組換えウイルスを精製するステップとを含む方法。

請求項25

組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞。

請求項26

ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。

請求項27

前記VEGF阻害剤が、VEGFに対する抗VEGF抗体またはその機能的断片である、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記VEGF阻害剤が、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である、請求項26に記載の方法。

請求項29

ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、sFLT−1をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法。

請求項30

前記ヒト対象が、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、請求項29に記載の方法。

請求項31

前記ヒト対象が、増殖性糖尿病性網膜症網膜静脈閉塞症網膜中心静脈閉塞症分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる、請求項29に記載の方法。

請求項32

前記医薬組成物が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む、請求項29に記載の方法。

請求項33

前記sFLT−1をコードする前記核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、請求項29に記載の方法。

請求項34

前記sFLT−1核酸が、少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする、請求項29に記載の方法。

請求項35

前記核酸が、原核生物調節配列を含有しない、請求項29に記載の方法。

請求項36

前記核酸が、原核生物調節配列を含有する、請求項29に記載の方法。

請求項37

前記核酸が、プラスミドであるか、またはウイルスにより送達される、請求項29に記載の方法。

請求項38

前記ヒト対象への、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置の投与をさらに含む、請求項29に記載の方法。

請求項39

前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与から30日以内、90日以内、または180日以内に投与する、請求項38に記載の方法。

請求項40

前記医薬組成物と前記VEGF阻害剤とを、少なくとも24時間隔てて投与する、請求項38に記載の方法。

請求項41

前記医薬組成物を、少なくとも55歳のヒト対象へと投与する、請求項29に記載の方法。

請求項42

前記投与を中心窩の外側で実施する、請求項29に記載の方法。

請求項43

ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの前記ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物の前記投与後において少なくとも1、2、3、4、または5行改善する、請求項29に記載の方法。

請求項44

ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物の前記投与後において15文字より少なく低下する、請求項29に記載の方法。

請求項45

前記医薬組成物の投与を、前記医薬組成物を一方の眼に投与する条件、前記医薬組成物を2つの眼に逐次的に投与する条件、および前記医薬組成物を2つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下で実施する、請求項29に記載の方法。

請求項46

フルオレセイン血管造影FA)により観察したときの血管新生の低減が、前記医薬組成物の前記投与に後続する、請求項29に記載の方法。

請求項47

注射の少なくとも1週間後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候がいずれも存在しない、請求項29に記載の方法。

請求項48

前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与後少なくとも30、60、90、120、180、270、または365日間にわたり救済処置を必要としない、請求項29に記載の方法。

請求項49

前記投与ステップ後において、抗AAV細胞傷害性T細胞応答の増大が測定されない、請求項32に記載の方法。

請求項50

ウイルスが、前記医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後において、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中にも検出されない、請求項32に記載の方法。

請求項51

前記ヒト対象に前記医薬組成物を投与した7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約500〜5,000pg/mlである、請求項29に記載の方法。

請求項52

前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置を施されている、請求項29に記載の方法。

請求項53

前記ヒト対象が、前記医薬組成物の前記投与の前に、VEGF阻害剤による処置をあらかじめ施されていない、請求項29に記載の方法。

請求項54

前記医薬組成物の前記投与が、前記ヒト対象において、1年間に3回未満の頻度で実施される、請求項29に記載の方法。

請求項55

前記医薬組成物の前記投与により、前記ヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度が低減される、請求項29に記載の方法。

請求項56

前記医薬組成物の前記投与の7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定する場合に、前記ヒト対象の前記硝子体中のsFLT−1タンパク質の濃度が上昇する、請求項29に記載の方法。

請求項57

前記薬剤の前記投与の前に、または前記投与の1週間以内に前記ヒト対象の硝子体ゲルが除去されている、請求項29に記載の方法。

請求項58

前記薬理作用剤を、20ゲージより小さい硝子体切除ステムを使用して投与する、請求項29に記載の方法。

請求項59

前記薬理作用剤を、39ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与する、請求項29に記載の方法。

請求項60

前記薬理作用剤による処置後12カ月以内における、前記対象の網膜中心厚が、50ミクロン、100ミクロン、または250ミクロンを超えて増大しない、請求項29に記載の方法。

請求項61

前記ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が進行しない、請求項29に記載の方法。

請求項62

前記ヒト対象が、ペニシリンに対する感受性またはアレルギーを有する、請求項29に記載の方法。

請求項63

前記ヒト対象のVEGF阻害剤の全身レベルが増大しない、請求項29に記載の方法。

請求項64

sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記sFLT−1導入遺伝子配列とが、300塩基対を超える配列により隔てられている、医薬組成物。

請求項65

sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含み、前記プロモーター配列と、前記sFLT−1導入遺伝子配列とが、UTR配列により隔てられている、医薬組成物。

請求項66

前記UTR配列が、少なくとも10塩基対を含む、請求項65に記載の医薬組成物。

請求項67

前記核酸が、各々が少なくとも50塩基対を含む、少なくとも3つのリンカー配列を含む、請求項66に記載の医薬組成物。

請求項68

1×1010〜3×1012のベクターゲノムの組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したsFLT−1をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。

請求項69

細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、a.sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、b.前記組換えウイルスを精製するステップとを含む方法。

請求項70

前記核酸配列が、ベータ−ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない、請求項69に記載の方法。

請求項71

HEK293細胞に、1×104〜1×106の感染多重度形質導入した72時間後において測定した場合、前記組換えウイルスが、sFLT−1タンパク質を、100〜10,000pg/mLの範囲で産生する、請求項69に記載の方法。

請求項72

前記組換えウイルスが、ヒト臍帯血内皮細胞(HUVEC)の増殖を阻害する、請求項69に記載の方法。

請求項73

組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞。

請求項74

前記医薬組成物を投与した1週間後または3、6、9、もしくは12カ月後の前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、請求項29に記載の方法。

請求項75

前記ヒト対象が、前記医薬組成物を投与した後で、視力喪失、IOPの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答のいずれも経験しない、請求項29に記載の方法。

請求項76

前記ヒト対象が、VEGF阻害剤による処置に対して耐性である、請求項29に記載の方法。

請求項77

前記薬理作用剤を、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与する、請求項29に記載の方法。

請求項78

前記薬理作用剤の前記投与の後に、硝子体腔内ガス液体交換を行う、請求項29に記載の方法。

請求項79

ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップを含む方法。

請求項80

ヒト対象における眼の血管新生を処置または低減するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップを含む方法。

請求項81

ヒト対象における眼の血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップを含む方法。

請求項82

AMDを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を処置または低減するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象に網膜下投与するステップを含む方法。

請求項83

萎縮型AMDを伴うヒト対象における脈絡膜血管新生を防止するための方法であって、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、ヒト対象に網膜下投与するステップを含む方法。

請求項84

前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項85

前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項86

前記組換えウイルスを、カナマイシン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項87

前記組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項88

前記組換えウイルスを、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列を含むプラスミドから生成する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項89

前記組換えウイルスを、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列を含まないプラスミドから生成する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項90

前記組換えウイルスが、アンピシリン耐性マーカーを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項91

前記組換えウイルスが、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列を含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項92

前記組換えウイルスが、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列を含まない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項93

前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項94

前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項95

前記組換えウイルスが、キメライントロンを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項96

前記組換えウイルスが、SV40ポリA配列を含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項97

前記組換えウイルスが、ヒトsFLT−1タンパク質またはその機能的断片を含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項98

前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記sFLT−1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項99

前記医薬組成物が、約1×106〜約1×1015個の組換えウイルスを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項100

前記医薬組成物が、約1×107〜約1×1014個の組換えウイルスを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項101

前記医薬組成物が、約1×108〜約1×1013個の組換えウイルスを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項102

前記医薬組成物が、約1×109〜約1×1012個の組換えウイルスを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項103

前記医薬組成物が、約1×1010〜約1×1012個の組換えウイルスを含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項104

前記医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項105

前記ヒト対象へと、薬学的有効量のVEGF阻害剤を投与するステップをさらに含む、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項106

前記VEGF阻害剤が、VEGFに対する抗体またはその機能的断片を含む、請求項105に記載の方法。

請求項107

前記VEGF阻害剤が、ラニビズマブを含む、請求項105に記載の方法。

請求項108

前記医薬組成物を、前記VEGF阻害剤の投与の90日以内に投与する、請求項105に記載の方法。

請求項109

前記医薬組成物を、前記VEGF阻害剤を投与した、少なくとも5、6、7、または8日後に投与する、請求項105に記載の方法。

請求項110

前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物を投与する前に少なくとも1回投与する、請求項105に記載の方法。

請求項111

前記VEGF阻害剤を、前記医薬組成物の投与後に少なくとも1回投与する、請求項105に記載の方法。

請求項112

前記VEGF阻害剤を、前記VEGF阻害剤の投与の90日以内に少なくとも2回投与する、請求項105に記載の方法。

請求項113

前記VEGF阻害剤を、6〜7週間の期間にわたり投与する、請求項105に記載の方法。

請求項114

前記AMDが、滲出型AMDである、請求項82に記載の方法。

請求項115

前記ヒト対象が、加齢黄斑変性を発症する危険性がある、請求項81に記載の方法。

請求項116

前記ヒト対象が、早期加齢黄斑変性の症状を提示する、請求項81に記載の方法。

請求項117

前記ヒト対象が、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤であらかじめ処置されている、請求項80または82に記載の方法。

請求項118

前記ヒト対象の前記処置された眼が、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤であらかじめ処置されていない、請求項81または83に記載の方法。

請求項119

AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも5回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、請求項80または82に記載の方法。

請求項120

AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも10回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、請求項80または82に記載の方法。

請求項121

AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも15回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、請求項80または82に記載の方法。

請求項122

AMDを処置するためのVEGF阻害剤による少なくとも20回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている、請求項80または82に記載の方法。

請求項123

ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、前記医薬組成物による前記処置後において15文字より少なく低下した、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項124

ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が、ラニビズマブによる前記処置後において2行未満改善された、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項125

前記ヒト対象が、萎縮型加齢黄斑変性を発症する危険性がある、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項126

前記ヒト対象が、早期萎縮型加齢黄斑変性の症状を提示する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項127

前記処置を、12カ月当たり1回未満の頻度で投与する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項128

前記処置を、6カ月当たり1回未満の頻度で投与する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項129

前記処置を、18カ月当たり1回未満の頻度で投与する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項130

前記投与ステップを、20歳以上の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項131

前記投与ステップを、40歳以上の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項132

前記投与ステップを、50歳以上の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項133

前記投与ステップを、65歳以上の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項134

前記投与が、中心窩を含まない部位への投与である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項135

前記投与が、中心窩に隣接する中心網膜における投与である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項136

投与が、中心網膜の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、請求項80に記載の方法。

請求項137

投与が、黄斑の外側の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項138

前記投与が、黄斑の内側の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項139

前記投与が、網膜色素上皮細胞への投与である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項140

前記投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項141

前記投与ステップを、両眼において同時に実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項142

前記投与ステップを、両眼において逐次的に実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項143

前記投与ステップを、一方の眼において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項144

対の眼がAMDの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項145

前記投与ステップを、ペニシリンに対して耐性の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項146

前記投与ステップを、ペニシリンに対して感受性の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項147

前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性の前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項148

前記投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でない前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項149

前記医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後において、ベクターが、前記ヒト対象の血液、唾液、または尿のいずれの試料中でも検出されない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項150

前記ウイルスベクターの存在を、qPCRまたはELISAにより検出する、請求項149に記載の方法。

請求項151

前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約500〜5,000pg/mlである、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項152

前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、ま365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約600〜4,000pg/mlである、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項153

前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約800〜3,000pg/mlである、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項154

前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約900〜2,000pg/mlである、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項155

前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約1,000〜1,800pg/mlである、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項156

前記医薬組成物を投与した7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、365日後において、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが、約4,00〜1,000pg/mlである、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項157

前記ヒト対象が、少なくとも2カ月間の期間にわたる連続的な眼検査により評価したときに、臨床的に重大な網膜毒性を示さない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項158

少なくとも2カ月間の期間にわたり、前記ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体のいずれにおける炎症の徴候も存在しない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項159

前記ヒト対象が、前記投与後少なくとも120日間にわたり救済処置を必要としない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項160

前記投与後少なくとも120日間にわたり、前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答のいずれの証拠も見られない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項161

前記投与ステップ後において、生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により、硝子体の炎症が観察されない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項162

細胞傷害性T細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項163

正常範囲の10%以内の細胞傷害性T細胞応答が、前記投与ステップに後続しない、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項164

ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定したときの最高矯正視力(BCVA)が前記投与ステップ後に改善する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項165

BCVAが、1行以上改善する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項166

BCVAが、少なくとも2行以上改善する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項167

BCVAが、少なくとも3行以上改善する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項168

BCVAが、少なくとも4行以上改善する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項169

BCVAが、少なくとも5行以上改善する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項170

フルオレセイン血管造影(FA)により観察したときの血管新生の低減が、前記投与ステップに後続する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項171

他の抗VEGF療法の投与頻度が低減される、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項172

他の抗VEGF療法の投与頻度が月1回未満である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項173

他の抗VEGF療法の投与頻度が3カ月未満である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項174

他の抗VEGF療法の投与頻度が6カ月未満である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項175

他の抗VEGF療法の投与頻度が1年未満である、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項176

約1×106〜1×1015個の組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、前記各組換えウイルスが、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質をコードする核酸を含む、単位用量の医薬組成物。

請求項177

約1×1010〜約3×1012個の組換えウイルスを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項178

約1×107〜約1×1014個の組換えウイルスを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項179

約1×108〜約1×1013個の組換えウイルスを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項180

約1×109〜約1×1012個の組換えウイルスを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項181

約1×1010〜約1×1012個の組換えウイルスを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項182

前記sFLT−1タンパク質が、ヒトsFLT−1タンパク質またはその機能的断片を含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項183

前記ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項184

前記AAVが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項185

前記組換えウイルスが、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項186

前記組換えウイルスが、エンハンサーを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項187

前記組換えウイルスが、イントロンを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項188

前記組換えウイルスが、SV40ポリAを含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項189

前記組換えウイルスが、眼細胞内の前記sFLT−1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項190

前記組換えウイルスが、界面活性剤と共に製剤化される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項191

前記組換えウイルスが、プロデューサークローン法を使用して製造される、請求項168に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項192

前記組換えウイルスが、組換えバキュロウイルスを使用して製造される、請求項168に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項193

前記組換えウイルスが、Ad−AAVを使用して製造される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項194

前記組換えウイルスが、HEK293細胞を使用して製造される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項195

前記組換えウイルスが、昆虫細胞を使用して製造される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項196

前記組換えウイルスが、ヘルペスヘルパーウイルスを使用して製造される、請求項176に記載の単位用量の医薬組成物。

請求項197

ヒト対象における眼の血管新生または黄斑浮腫を処置、低減、または防止する方法であって、薬学的有効量の、抗血管形成性因子の発現を指示する組換えAAV遺伝子送達ベクターを含む医薬組成物を、前記ベクターの投与がヒト対象における血管新生または黄斑浮腫を阻害するように網膜下投与するステップを含む方法。

請求項198

前記投与ステップを、B型肝炎またはC型肝炎のいずれによる感染歴もない前記ヒト対象において実行する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

請求項199

前記医薬組成物の投与の7、14、21または30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定したときに、前記ヒト対象の硝子体中の前記sFLT−1タンパク質レベルが上昇する、請求項79、80、81、82、または83に記載の方法。

技術分野

0001

配列表
本出願は、EFS−Webを介するASCIIフォーマット提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2013年5月1日に作成された前記ASCIIコピーは、43016−702.201_SL.txtと名付けられ、84,779バイトのサイズである。

背景技術

0002

加齢黄斑変性(AMD:age−related macular degeneration)は、50を超える人々における視覚不可逆的な損傷の主要な原因のうちの1つである。AMDは、臨床的に「萎縮型」および「滲出型」という2つの種類へと分けられる。AMDの滲出形態は、急速に発症する可能性があり、失明を結果としてもたらすことが多い。疾患の病理学的変化は、重度視覚機能障害を引き起こしうる。AMDの症状は、黄斑帯域内の網膜色素上皮(RPE:retinal pigment epithelial)細胞機能不全および脈絡膜血管新生(CNV:choroidal neovascularization)を含みうるがこれらに限定されない。重度の症例では、流体漏出、RPEまたは神経上皮剥離、および破裂した血管からの出血も生じうる。その中に血管内皮成長因子VEGF:vascular endothelial growth factor)、VEGF受容体(VEGFR:VEGF receptor)、血小板由来成長因子(PDGF)、低酸素誘導因子(HIF)、アンジオポエチン(Ang)および他のサイトカインマイトジェン活性タンパク質キナーゼMAPK)などを含みうるがこれらに限定されない、多くの細胞因子が、CNV発生の調節において重要な役割を果たすことが見出されている。

0003

現在承認されている、滲出型AMDのための1つの処置は、Lucentis(登録商標)である。Lucentis(登録商標)とは、抗血管形成剤であり、血管内皮成長因子(VEGF)の全てのアイソフォームを標的とする。臨床研究は、処置を施された患者のうちの約60%と比較して、Lucentis(登録商標)投与された患者のうちの約95%における視覚の改善または安定を示している。Lucentis(登録商標)は、視覚を改善することが最初に承認された薬剤であるが、最適な視覚への有益性のためには、4週間ごとの硝子体内投与を要求する。Eylea(登録商標)とは、滲出型AMDを処置することが承認されている、別のVEGF阻害剤である。Eylea(登録商標)もまた、最適な視覚への有益性のためには、4〜8週間ごとに高頻度硝子体内注射を要求する。硝子体内投与経路は、投与の反復と共にそれらの累積的な危険性が増大する、感染性眼内炎および網膜剥離などの重篤合併症に対する危険性を増大させる可能性がある。眼内圧の増大、外傷性白内障、および網膜裂傷もまた報告されている。最後に、処置が眼科医により送達される場合、処置頻度は、患者、医師、および医療システム一般に対する負担を決定し、可能な程度までこれを低減すべきである。当技術分野では、AMDに続発するCNVのために現在利用可能な治療限界から、要求される高頻度の処置および処置手順侵襲性に取り組む代替的な手法に対する必要が創出された。VEGFの上昇を伴う血管新生はまた、糖尿病性網膜症糖尿病性黄斑浮腫DME:diabetic macular edema)、および網膜静脈閉塞症RVO:retinal vein occlusion)など、他の眼病態ももたらしうる。これらの疾患は、網膜血管新生および視覚喪失をもたらす。Lucentis(登録商標)などのVEGF阻害剤は、DMEおよびRVOにおける有効性裏付けているが、有益性を維持するためには、滲出型AMDの場合と同様に、高頻度の硝子体内投与を要求する。

課題を解決するための手段

0004

本開示は、ヒト対象のAMDの滲出形態において見出されるCNVなどのCNVを処置するための組成物および方法を提供する。

0005

一態様において、本開示は、薬学的有効量の、VEGF阻害剤を含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象へと網膜下投与するステップを含む、ヒト対象におけるAMDを処置するための組成物および方法を提供する。一態様において、医薬組成物は、組換えウイルスを含む。別の態様では、VEGF阻害剤は、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1:soluble Fms−related tyrosine kinase−1)タンパク質をコードする核酸を含む。

0006

一態様において、本開示は、薬学的有効量の、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質をコードする核酸を含む組換えウイルスを含む医薬組成物を、AMDの処置を必要とするヒト対象へと網膜下投与するステップを含む、AMDを有するヒト対象におけるCNVを防止するための組成物および方法を提供する。

0007

一部の態様では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス(AAV:adeno−associated virus)、ヘルパー依存性アデノウイルスレトロウイルス単純ヘルペスウイルスレンチウイルスポックスウイルスセンダイウイルスHVJ)−リポソーム複合体モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスから選択される。一部の態様では、AAVカプシドまたは逆位末端配列(ITR:inverted terminal repeats)は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される。

0008

一部の態様では、組換えウイルスは、サイトメガロウイルス(CMV:cytomegalovirus)プロモーターラウス肉腫ウイルス(RSV:Rous sarcoma virus)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーターCAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。

0009

一部の態様では、組換えウイルスは、エンハンサーを含む。

0010

一部の態様では、組換えウイルスは、イントロンまたはキメライントロンを含む。

0011

一部の態様では、組換えウイルスは、SV40ポリA配列を含む。

0012

一部の態様では、組換えウイルスは、ヒトsFlt−1タンパク質またはその機能的断片を含む。

0013

一部の態様では、組換えウイルスを、アンピシリン耐性マーカーまたは非アンピシリン耐性マーカーを含むプラスミドから生成する。

0014

一部の態様では、組換えウイルスは、T7RNAポリメラーゼプロモーターなどの細菌性調節配列を含む。

0015

一部の態様では、組換えウイルスは、T7RNAポリメラーゼプロモーターなどの細菌性調節配列を欠く

0016

一部の態様では、組換えウイルスは、眼細胞内のsFlt−1タンパク質またはその機能的断片の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む。

0017

一部の態様では、医薬組成物は、約1×106〜約1×1015の組換えウイルスベクターゲノム、約1×107〜約1×1014の組換えウイルスベクターゲノム、約1×108〜約1×1013の組換えウイルスベクターゲノム、約1×109〜約3×1012の組換えウイルスベクターゲノム、または約1×1010〜約3×1012の組換えウイルスベクターゲノムを含む。

0018

一部の態様では、医薬組成物を、網膜下注射を介して投与する。

0019

一部の態様では、方法は、薬学的有効量のVEGF阻害剤をヒト対象に投与するステップをさらに含む。一部の態様では、VEGF阻害剤は、VEGFに対する抗体またはその機能的断片を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤は、ラニビズマブを含む。一部の態様では、医薬組成物を、VEGF阻害剤を投与した、少なくとも5、6、7、または8日後に投与する。一部の態様では、医薬組成物を、VEGF阻害剤の投与後30、60、または90日以内に投与する。

0020

一部の態様では、組換えウイルスを含む医薬組成物を投与する前に、VEGF阻害剤を1回投与し、投与後にも1〜2回投与する。一部の態様では、医薬組成物を投与する前に、VEGF阻害剤を、少なくとも2回にわたり投与し、投与後にも1〜2回投与する。一部の態様では、VEGF阻害剤を、6〜7週間にわたり投与する。

0021

一部の態様では、VEGF阻害剤は、ベバシズマブまたはラニビズマブなどの抗VEGF抗体である。他の態様では、VEGF阻害剤は、アフリベルセプトまたはsFLT01など、可溶性受容体融合タンパク質、またはこれらの断片である。

0022

一部の態様では、AMDは、滲出型AMDである。

0023

一部の態様では、AMDは、萎縮型AMDである。

0024

一部の態様では、ヒト対象は、滲出型AMDの危険性がある。

0025

一部の態様では、ヒト対象は、早期滲出型AMDの症状を提示する。

0026

一部の態様では、AMDを処置するための異なるVEGF阻害剤による少なくとも3、5、10、15、または20回の処置が、前記ヒト対象へとあらかじめ投与されている。

0027

一部の態様では、ラニビズマブによる前記処置後において、最高矯正視力(BCVA:best corrected visual acuity)は、改善しなかった。

0028

一部の態様では、ラニビズマブによる前記処置後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究(Early Treatment Diabetic Retinopathy Study))文字により測定される最高矯正視力(BCVA)の改善は、1行を超える。

0029

一部の態様では、ヒト対象は、早期萎縮型AMDの症状を提示する。

0030

一部の態様では、処置を、少なくとも半年ごとに1回の頻度で投与する。

0031

一部の態様では、投与ステップを、20、40、50、55、または65歳以上である前記ヒト対象において実行する。

0032

一部の態様では、投与は、中心窩の外側の部位への投与である。

0033

一部の態様では、投与は、中心網膜の網膜下腔の1または複数の細胞への投与である。

0034

一部の態様では、投与は、黄斑の外側の1または複数の細胞への投与である。

0035

一部の態様では、投与は、黄斑の内側の1または複数の細胞への投与である。

0036

一部の態様では、投与は、網膜色素上皮細胞への投与である。

0037

一部の態様では、投与が、中心網膜の機能または中心網膜の構造に有害な影響を及ぼさない。

0038

一部の態様では、投与は、ヒト対象におけるVEGF阻害剤の全身レベルを増大させない。

0039

一部の態様では、投与は、ヒト対象におけるsFlt−1の全身レベルを増大させない。

0040

一部の態様では、投与ステップを、両方の眼において同時にまたは逐次的に実行する。

0041

一部の態様では、投与ステップを、一方の眼において実行する。

0042

一部の態様では、対の眼がAMDの症状を提示する場合、投与ステップを一方の眼においても実行する。

0043

一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対して耐性のヒト対象において実行する。

0044

一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対して感受性のヒト対象において実行する。

0045

一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性のヒト対象において実行する。

0046

一部の態様では、投与ステップを、ペニシリンに対してアレルギー性でないヒト対象において実行する。

0047

一部の態様では、投与ステップは、投与ステップ後において生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により観察される、硝子体の炎症を引き起こさない。

0048

一部の態様では、投与ステップは、細胞傷害性T細胞応答を引き起こさない。

0049

一部の態様では、投与ステップは、ベースラインの範囲を10%未満超える細胞傷害性T細胞の増大を尺度とする、細胞傷害性T細胞応答を引き起こさない。

0050

一部の態様では、T細胞は、投与ステップ後において、活性化したエフェクター表現型を提示しない。

0051

一部の態様では、投与ステップ後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定される最高矯正視力(BCVA)は、1、2、3、4、または5行以上改善する。

0052

一部の態様では、血管新生の低減は、投与ステップ後において、フルオレセイン血管造影FA:fluorscein angiography)を使用して観察される。

0053

一部の態様では、ラニビズマブの投与頻度は、1年間当たり12回未満まで低減される。一部の態様では、アフリベルセプトの投与頻度は、1年間当たり6回未満まで低減される。

0054

一部の態様では、ラニビズマブもしくはアフリベルセプトまたは他のVEGF阻害剤を、頻度を低減させて投与するか、またはもはや投与しない。

0055

一部の態様では、ウイルスは、ヒトsFLT−1遺伝子配列に対する配列相同性が≧90%であるsFLT−1遺伝子またはその機能的断片を含む。

0056

一部の態様では、投与されるウイルスは、sFLT−1遺伝子、遺伝子変異体、または遺伝子断片を含む。

0057

一部の態様では、医薬組成物を投与した7、14、21、または30日後において、ヒト対象の涙液、血液、唾液、または尿試料中ベクターが検出されない。

0058

一部の態様では、ウイルスベクターの存在を、qPCRまたはELISAにより検出する。

0059

一部の態様では、ヒト対象の硝子体中のsFlt−1タンパク質レベルは、医薬組成物を投与した7、14、21、または30日後において、約500〜5,000pg/ml、約600〜4,000pg/ml、約800〜3,000pg/ml、約900〜2,000pg/ml、または約1,000〜1,800pg/mlである。一部の態様では、医薬組成物を投与した7、14、31、30、60、90、180、270、および365日後において、ヒト対象の硝子体中の、sFlt−1タンパク質濃度ともまた称しうるsFlt−1タンパク質レベルは上昇する。

0060

一部の態様では、ヒト対象は、少なくとも2カ月間にわたる連続的な眼検査により評価される通り、臨床的に重大な網膜毒性を示さない。

0061

一部の態様では、少なくとも2カ月間にわたり、ヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しない。

0062

一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスを投与した、少なくとも120日後において、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの前記投与の少なくとも180日後または少なくとも210日後において、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの投与後少なくとも270日間にわたり、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。一部の態様では、ヒト対象は、組換えウイルスの投与後少なくとも365日間にわたり、VEGF阻害剤による救済処置を必要としない。

0063

一部の態様では、組換えウイルスの前記投与の少なくとも180日後または少なくとも210日後の前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。一部の態様では、組換えウイルスを投与した、少なくとも365日後の前記ヒト対象において、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、または任意の眼内もしくは全身免疫応答の証拠が見られない。

0064

別の態様では、本開示は、約1×106〜約1×1015個の組換えウイルスを含む医薬組成物であって、組換えウイルスの各々が、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt−1)タンパク質をコードする核酸を含む医薬組成物を提供する。

0065

一部の態様では、本開示は、ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、sFLT−1をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法を提供する。

0066

一部の態様では、本開示は、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、脈絡膜血管新生、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される1または複数の状態を有するか、または有することが疑われるヒト対象を提供する。場合によって、ヒト対象は、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症分枝性網膜静脈閉塞症、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、虚血性網膜症、および糖尿病性網膜浮腫からなる群から選択される、1または複数の状態を有するか、または有することが疑われる。

0067

一部の態様では、本開示は、組換えウイルスを含む医薬組成物であって、ウイルスが、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される医薬組成物を提供する。

0068

一部の態様では、本開示は、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結した、sFLT−1をコードする核酸を提供する。

0069

一部の態様では、本開示は、sFLT−1が少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする、sFLT−1核酸を提供する。場合によって、sFLT−1核酸は、原核生物調節配列を含有しない。場合によって、sFLT−1核酸は、原核生物調節配列を含有する。

0070

一部の態様では、本開示は、ウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物を提供する。

0071

一部の態様では、本開示は、ヒト対象への、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置の投与を提供する。場合によって、VEGF阻害剤を、医薬組成物の投与から30、90、または180日以内に投与する。場合によって、本開示の医薬組成物とVEGF阻害剤とを、少なくとも24時間隔てて投与する。

0072

一部の態様では、本開示は、少なくとも55歳のヒト対象に投与される医薬組成物を提供する。

0073

一部の態様では、本開示は、中心窩の外側への、医薬組成物の投与を提供する。

0074

一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定される、ヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、少なくとも1、2、3、4、または5行改善することを提供する。

0075

一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)により測定される、最高矯正視力(BCVA)の低下が、15文字より少ないことを提供する。

0076

一部の態様では、本開示は、医薬組成物を一方の眼に投与する条件、医薬組成物を2つの眼に逐次的に投与する条件、および医薬組成物を2つの眼に同時に投与する条件からなる群から選択される条件下における医薬組成物の投与を提供する。

0077

一部の態様では、本開示は、フルオレセイン血管造影(FA)により観察される血管新生の低減が、医薬組成物の投与に後続することを提供する。

0078

一部の態様では、本開示は、注射の少なくとも1週間後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候は存在しないことを提供する。

0079

一部の態様では、本開示は、医薬組成物を投与した1週間後または3、6、9、もしくは12カ月後のヒト対象において、表面、前眼部、または硝子体における炎症の徴候が存在しないことを提供する。

0080

一部の態様では、本開示は、ヒト対象が、医薬組成物の投与後少なくとも30、60、90、120、180、270、または365日間にわたり、救済処置を必要としないことを提供する。

0081

一部の態様では、本開示は、ヒト対象が、医薬組成物を投与した後で、視力の喪失、IOPの上昇、網膜剥離、眼内または全身免疫応答を経ないことを提供する。

0082

一部の態様では、本開示は、投与ステップ後において、抗AAV細胞傷害性T細胞応答の増大が測定されないことを提供する。

0083

一部の態様では、本開示は、ウイルスが、医薬組成物を投与した3、7、14、21、または30日後のヒト対象の血液、唾液、または尿試料中に検出されないことを提供する。

0084

一部の態様では、本開示は、ヒト対象に医薬組成物を投与した7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において、ヒト対象の硝子体中のsFLT−1タンパク質レベルが約500〜5,000pg/mlであることを提供する。

0085

一部の態様では、本開示は、ヒト対象に、医薬組成物の投与の前に、VEGF阻害剤による1回または複数回の処置を施すことを提供する。

0086

一部の態様では、本開示は、VEGF阻害剤による処置に対して耐性であるものとしてのヒト対象を提供する。

0087

一部の態様では、本開示は、医薬組成物を投与する前に、VEGF阻害剤をあらかじめ施されていないヒト対象を提供する。

0088

一部の態様では、本開示は、ヒト対象における、1年間に3回未満の頻度の医薬組成物の投与を提供する。

0089

一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与により、ヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度が低減されることを提供する。

0090

一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与の7、14、21、30、60、90、120、150、180、270、または365日後において測定する場合に、ヒト対象の硝子体中のsFLT−1タンパク質の濃度が上昇することを提供する。

0091

一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与の前に、またはその1日以内もしくは1週間以内に硝子体ゲルが除去されているヒト対象を提供する。

0092

一部の態様では、本開示は、20ゲージより小さい硝子体切除ステムを使用して投与される医薬組成物を提供する。

0093

一部の態様では、本開示は、縫合を必要としない硝子体切除システムを使用して投与される医薬組成物を提供する。

0094

一部の態様では、本開示は、39ゲージより小さいカニューレチップを使用して投与される医薬組成物を提供する。

0095

一部の態様では、本開示は、硝子体腔内ガス液体交換を後続させる医薬組成物を提供する。

0096

一部の態様では、本開示は、前記薬理作用剤による処置後12カ月以内における対象の網膜中心厚が、50ミクロン、100ミクロン、または250ミクロンを超えて増大しないことを提供する。

0097

一部の態様では、本開示は、ヒト対象の罹患眼において、地図状萎縮が、処置されていないヒト対象の罹患眼と比較して進行しないことを提供する。

0098

一部の態様では、本開示は、sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した、少なくとも1つのプロモーター配列を含む核酸を含む組換えウイルスまたはプラスミドを含む医薬組成物を提供する。場合によって、本開示の医薬組成物は、300塩基対を超える配列により隔てられたプロモーター配列とsFLT−1導入遺伝子配列とを含む。場合によって、本開示の医薬組成物は、UTR配列により隔てられたプロモーター配列とsFLT−1導入遺伝子配列とを含む。場合によって、UTR配列は、少なくとも10塩基対を含む。場合によって、医薬組成物は、各々が少なくとも50塩基対を含む、少なくとも3つのリンカー配列を含む。

0099

一部の態様では、本開示は、sFlt−1核酸が、少なくとも1つの二量体化ドメインをコードする医薬組成物を提供する。

0100

一部の態様では、本開示は、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号340、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、および配列番号47からなる群から選択されるプロモーター配列;配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、および配列番号108からなる群から選択される、VEGF阻害剤をコードする配列;配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、および配列番号119からなるイントロン配列;配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101からなる群から選択されるUTR配列;ならびに配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55からなる群から選択される終結配列を含む医薬組成物を提供する。

0101

一部の態様では、本開示は、1×106〜1×1015のベクターゲノムを有する組換えウイルスを含む単位用量の医薬組成物であって、組換えウイルスが、プロモーターに作動的に連結したsFLT−1をコードする核酸を含む単位用量の医薬組成物を提供する。場合によって、単位用量の医薬組成物は、1×1010〜3×1012のベクターゲノムを含む。

0102

一部の態様では、本開示は、細胞内で組換えウイルスを生成する方法であって、sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーター配列、ITR配列、およびUTR配列を含む核酸を細胞に導入するステップと、組換えウイルスを精製するステップとを含む方法を提供する。場合によって、UTR配列は、ヒトUTR配列である。場合によって、核酸配列は、ベータ−ラクタム抗生剤耐性配列を含有しない。場合によって、HEK293細胞に、1×106の感染多重度MOI:multiplicity of infection)で形質導入した72時間後において測定した場合、組換えウイルスは、sFLT−1タンパク質を、100〜10,000pg/mLの範囲で産生する。場合によって、組換えウイルスは、ヒト臍帯血内皮細胞(HUVEC:human umbilical vascular endothelial cell)の増殖を阻害する。

0103

一部の態様では、本開示は、組換えウイルスベクターを生成するための細胞であって、sFLT−1導入遺伝子配列に作動的に連結した少なくとも1つのプロモーターポリヌクレオチド配列、ITRポリヌクレオチド配列、およびUTRポリヌクレオチド配列を含む細胞を提供する。

0104

一部の態様では、本開示は、ヒトにおける眼の血管新生の処置または予防における使用のための、sFLT−1をコードする配列を含む核酸であって、前記使用が、それを必要とするヒト対象における1または複数の網膜下部位へと、前記ヒト対象に有効量の医薬組成物を直接投与するステップを含み、前記医薬組成物が、前記核酸を含む核酸を提供する。

0105

一部の態様では、本開示は、前記sFLT−1が、VEGF阻害剤であり、眼の血管新生の可能性の前記処置または低減が、VEGF阻害の結果として生じる使用のための核酸を提供する。

0106

一部の態様では、本開示は、医薬組成物が、ヒト対象の硝子体中のsFLT−1タンパク質のレベルを、前記医薬組成物の、前記ヒト対象への投与の少なくとも72時間後に、前記投与前における前記ヒトの硝子体中のsFLT−1タンパク質のレベルと比較して上昇させることが可能な使用のための核酸を提供する。

0107

一部の態様では、本開示は、前記sFLT−1を含む核酸が、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスからなる群から選択される組換えウイルスを含む使用のための核酸を提供する。

0108

一部の態様では、本開示は、sFLT−1をコードする核酸が、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、MMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動的に連結している、使用のための核酸を提供する。

0109

一部の態様では、本開示は、核酸がウイルスによりパッケージングされるか、またはプラスミドDNAである使用のための核酸を提供する。

0110

一部の態様では、本開示は、使用のための核酸を提供する。前記使用が、処置または低減を必要とするヒト対象への、1または複数のさらなるVEGF阻害剤の投与をさらに含み、必要に応じて、前記さらなるVEGF阻害剤は、ラニビズマブまたはベバシズマブである。

0111

一部の態様では、本開示は、前記医薬組成物を、少なくとも50、55、または65歳のヒト対象に投与するステップを含む使用のための核酸を提供する。

0112

一部の態様では、本開示は、前記医薬組成物を中心窩の外側に投与するステップを含む使用のための核酸を提供する。

0113

一部の態様では、本開示は、有効量の医薬組成物の投与後において、ETDRS(糖尿病網膜症早期治療研究)文字により測定される、処置を必要とするヒト対象の最高矯正視力(BCVA)が、少なくとも1、2、3、4、または5行改善する使用のための核酸を提供する。

0114

一部の態様では、本開示は、処置を必要とするヒト対象において、医薬組成物の投与を、3、6、9、12、18、または24カ月ごとに少なくとも1回の頻度で実施する使用のための核酸を提供する。

0115

一部の態様では、本開示は、医薬組成物の投与を、ヒト対象において、1年間に3回未満の頻度で実施するか、またはヒト対象における、さらなるVEGF阻害剤による処置の投与頻度を低減する頻度で実施する使用のための核酸を提供する。

0116

一部の態様では、本開示は、約1×106〜1×1015または1×1010〜3×1012のベクターゲノムを含む単位用量の医薬組成物を提供する。一部の態様では、組換えウイルスは、プロモーターに作動的に連結した、sFLT−1をコードする核酸またはその機能的断片を含む。

0117

一部の態様では、本開示は、ヒト対象における眼の血管新生を処置または予防するための方法であって、薬学的有効量の、VEGF阻害剤をコードする核酸を含む医薬組成物を、処置を必要とするヒト対象の1または複数の網膜下部位へと投与するステップを含む方法を提供する。一部の態様では、VEGF阻害剤は、抗VEGF抗体またはその機能的断片である。一部の態様では、VEGF阻害剤は、可溶性受容体、融合タンパク質、またはこれらの機能的断片である。

0118

参照による組込み
本明細書において言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により組み込まれることが具体的かつ個別に指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

0119

本開示の新規の特色は、付属の特許請求の範囲において詳密に示される。本開示の特色および利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な態様を示す、以下の詳細な記載、および添付される図面を参照することにより得られるであろう。

図面の簡単な説明

0120

図1は、例示的なプラスミドの概略表示を描示する。
図2は、rAAV.sflt−1を形質導入した細胞に由来するsFLT−1の発現、分泌、および生物学的活性を描示する。(a)Ad.sFlt−1を形質導入した293細胞(レーン1)、rAAV.sFlt−1を形質導入したD407細胞(レーン2)、rAAV.sFlt−1を形質導入した293細胞(レーン3)、およびAAV.gfpを形質導入したD407細胞(レーン4)に由来する馴化培地についてのウェスタンブロット解析である。(b)rAAV.sFlt−1を形質導入した細胞に由来する馴化培地による、VEGFに誘導されるHUVEC増殖の阻害である。HUVECは、飢餓培地カラム1)中、組換えVEGFを含有する培地中(カラム2)、VEGFを含有する培地およびrAAV.sFlt−1を形質導入した293細胞に由来する40μLの馴化培地中(カラム3)、VEGFを含有する培地およびrAAV.sFlt−1を形質導入した293細胞に由来する80μLの馴化培地中(カラム4)、ならびにVEGFを含有する培地およびrAAV.gfpを形質導入した293細胞に由来する80μLの馴化培地中(カラム5)で培養した。(VEGFに加えたrAAV.sFlt−1と、VEGFだけとの差異について、*P<0.02、**P<0.005)
図3Aは、左眼にrAAV.sFlt−1(サル8514、サル8530、サル8523、サル8524、およびサル999)、rAAV.gfp(サル8297およびサル8532)を注射されたサル、両方の眼に組換えsFlt−1タンパク質(サル8294)を注射されたサル、および対照の注射されなかったサル(対照)の硝子体中のヒトsFlt−1(hsFlt−1:human sFlt−1)発現を示すグラフを描示する。対照およびサル8294およびサル999は、注射の3カ月後に安楽死させ、サル8524は、注射の9カ月後に安楽死させ、サル8297、サル8532、サル8514、サル8530、およびサル8523は、注射の12カ月後に安楽死させた。*は、rAAV.sFlt−1を注射された眼において有意に高い(P<0.05)sFLT−1タンパク質レベルを表示する。
図3Bは、注射後の異なる時点のrAAV.sFlt−1を注射された(999、8524、8523、8530、および8514)サル、rAAV.gfpを注射された(8297および8532)サル、組換えsFlt−1タンパク質を注射された(8294)サル、および注射されなかった(対照)サルにおけるhsFLT−1レベルを示すグラフを描示する。
図4マウスの眼における免疫細胞サブセット集団である。グラフは、注射後の異なる時点における免疫細胞サブセット集団を示す。
図5:マウスの脾臓における免疫細胞サブセット集団である。グラフは、注射後の異なる時点における免疫細胞サブセット集団を示す。
図6は、注射後の異なる時点の異なるマウスにおけるCD4+T細胞内のKi67応答を比較する概略図を描示する。
図7A図7Dは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
図7A図7Dは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
図7A図7Dは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
図7A図7Dは、多様な例示的な複製起点配列を描示する。
図8A図8Fは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
図8A図8Fは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
図8A図8Fは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
図8A図8Fは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
図8A図8Fは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
図8A図8Fは、多様な例示的なプロモーターの配列を描示する。
図9A図9Cは、多様な例示的なイントロン、ポリA配列、およびITR領域の配列を描示する。
図9A図9Cは、多様な例示的なイントロン、ポリA配列、およびITR領域の配列を描示する。
図9A図9Cは、多様な例示的なイントロン、ポリA配列、およびITR領域の配列を描示する。
図9D図9Fは、多様な例示的なリンカー配列の配列を描示する。
図9D図9Fは、多様な例示的なリンカー配列の配列を描示する。
図9D図9Fは、多様な例示的なリンカー配列の配列を描示する。
図9G図9Hは、多様な例示的なUTR配列の配列を描示する。
図9G図9Hは、多様な例示的なUTR配列の配列を描示する。
図10A図10Cは、多様な例示的な抗VEGFタンパク質をコードする配列を描示する。
図10A図10Cは、多様な例示的な抗VEGFタンパク質をコードする配列を描示する。
図10A図10Cは、多様な例示的な抗VEGFタンパク質をコードする配列を描示する。
図11Aは、sFLT−1のアミノ酸配列を描示する。
図11Bは、sFLT−1の機能的断片である、sFLT−1のドメイン2のアミノ酸配列を描示する。
図11Cは、sFLT−1のドメイン2をコードする核酸配列を描示する。
図12A図12Bは、多様な例示的な抗生剤耐性遺伝子の配列を描示する。
図12A図12Bは、多様な例示的な抗生剤耐性遺伝子の配列を描示する。
図13は、1つの例示的な組成物(rAAV.sFlt−1)のPKであって、6〜8週間後において、rAAV.sFlt−1が最適な抗VEGF発現に到達するPKを描示する。RBZとは、ラニビズマブなどの抗VEGFによる標準的なケアである。「RBZ救済」は、救済処置を意味する。
図14は、患者の眼科評価を描示する。炎症は、生体顕微鏡法(BE)および間接検眼鏡法(IOE)により査定した。Unrem:顕徴なし。
図15Aおよび図15Bは、視力結果を描示する。
図15Aおよび図15Bは、視力結果を描示する。
図16は、既に24回にわたるLucentis注射を施された患者の網膜厚の測定を描示する。
図17は、生体内分布:sFLT−1配列についてのqPCR(検出されたコピー数)を描示する。
図18は、生体内分布:ELISA、1mL当たりのカプシド数単位のAAV力価により測定されるAAVカプシドを描示する。
図19は、ELISAにより測定されるsFLT−1の生体内分布を描示する。ヒトsFLT−1濃度(pg/mL)が示される。
図20Aおよび図20Bは、低用量のrAAV.sFlt−1(R1、R2、R4)または高用量のrAAV.sFlt−1(R5、R6、およびR8)を投与された患者のOCT評価を描示する。
図20Aおよび図20Bは、低用量のrAAV.sFlt−1(R1、R2、R4)または高用量のrAAV.sFlt−1(R5、R6、およびR8)を投与された患者のOCT評価を描示する。
図21Aおよび図21Bは、処置の180日後における、rAAV.sFlt−1で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
図21Aおよび図21Bは、処置の180日後における、rAAV.sFlt−1で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
図22Aおよび図22Bは、処置の1年後における、rAAV.sFlt−1で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
図22Aおよび図22Bは、処置の1年後における、rAAV.sFlt−1で処置されたヒト対象の視力結果を、処置されていない対照の患者の視力結果と対比して描示する。
図23は、rAAV.sFlt−1についての臨床研究における、Lucentisの救済注射(VEGF阻害剤の再投与)を施されたヒト対象についての表を週ごとに描示する。
図24は、rAAV.sFlt−1についての臨床研究における、rAAV.sFlt−1で処置されたヒト対象についての視力およびSD−OCT画像を週ごとに描示する。
図25Aおよび図25Bは、ELISAにより検出される、ヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞内のヒトsFlt−1タンパク質の産生についてのデータを描示する。rAAV.sFlt−1は、HEK293細胞内のプラスミドによるトランスフェクションを使用して産生させた。第2の構築物であるrAAV(bv).sFlt−1は、Sf9昆虫細胞内の組換えバキュロウイルスを使用して産生させた。sFlt−1タンパク質濃度は、多様なMOIで、72時間後におけるELISAにより測定した。
図25Aおよび図25Bは、ELISAにより検出される、ヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞内のヒトsFlt−1タンパク質の産生についてのデータを描示する。rAAV.sFlt−1は、HEK293細胞内のプラスミドによるトランスフェクションを使用して産生させた。第2の構築物であるrAAV(bv).sFlt−1は、Sf9昆虫細胞内の組換えバキュロウイルスを使用して産生させた。sFlt−1タンパク質濃度は、多様なMOIで、72時間後におけるELISAにより測定した。

0121

本開示は、可溶性Fms関連チロシンキナーゼ1(sFlt−1)タンパク質をコードする核酸を含む、薬学的有効量のベクターを含む医薬組成物を、ヒト対象へと網膜下投与することにより、ヒト対象における、AMDなどの眼の血管新生の防止または処置のための組成物および方法を提供する。

0122

以下では、例示のための実施例の適用を参照しながら、本開示のいくつかの態様について記載する。本開示の十分な理解をもたらすために、多数の具体的な詳細、関連性、および方法を示すことを理解されたい。しかし、当業者は、本開示を、具体的な詳細のうちの1または複数を伴わずに実施することもでき、他の方法により実施することもできることをたやすく認識するであろう。一部の行為は、異なる順序で、かつ/または他の行為または事象と共時的に生じる可能性があるので、本開示は、行為または事象の例示される順序づけにより限定されない。さらに、全ての例示される行為または事象が、本開示に従い、方法を実装するように要求されるわけでもない。

0123

本開示の用語法は、特定の場合について記載することだけを目的とするものであり、本開示の方法および組成物を限定することを意図するものではない。

0124

別段に指し示されない限り、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法は、当業者の技術の範囲内にある、分子生物学(組換え技法を含む)、細胞生物学生化学免疫化学、および眼科法の従来の技法および記載を援用しうる。このような従来の技法は、網膜、または対象における視覚を観察および解析するための方法、組換えウイルスのクローニングおよび繁殖、医薬組成物の製剤化、ならびに生化学的精製および免疫化学を含む。適切な技法の具体的な例示は、本明細書の実施例を参照することにより与えられる。しかし、当然ながら、同等な従来の手順もまた、使用することができる。このような従来の技法および記載は、それらの全てが、全ての目的で、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Greenら編、「Genome Analysis: A Laboratory Manual Series」(I〜IV巻)(1999年); Weinerら編、「Genetic Variation: A Laboratory Manual」(2007年); Dieffenbach、Dveksler編、「PCRPrimer: A Laboratory Manual」(2003年); BowtellおよびSambrook、「DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual」(2003年); Mount、「Bioinformatics: Sequence and Genome Analysis」(2004年); SambrookおよびRussell、「Condensed Protocols from Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2006年);ならびにSambrookおよびRussell、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(2002年)(全て、Cold Spring Harbor Laboratory Pressによる); Stryer, L.、「Biochemistry」(4版)、W.H. Freeman、N.Y.(1995年); Gait、「Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach」、IRL Press、London(1984年); NelsonおよびCox、「Lehninger, Principles of Biochemistry」、3版、W.H. Freeman Pub.、New York(2000年);およびBergら、「Biochemistry」、5版、W.H. Freeman Pub.、New York(2002年)などの標準的な実験室マニュアルにおいて見出すことができる。本組成物、本研究ツール、および本方法について記載する前に、本開示は、記載される具体的な方法、組成物、目標、および使用は、当然ながら、変化しうるので、これらに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、特定の態様だけについて記載することを目的とするものであり、付属の特許請求の範囲だけにより限定される本開示の範囲を限定することを意図するものではないことも理解されたい。

0125

本明細書で使用される単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、文脈によりそうでないことが別段に指し示されない限りにおいて、複数形もまた含むことを意図する。さらに「〜を含む(including)」、「〜を含む(includes)」、「〜を有する(having)」、「〜を有する(has)」、「〜を伴う」という用語、またはこれらの変化形が、詳細な記載および/または特許請求の範囲において使用される程度において、このような用語は「〜を含む(comprising)」という用語と同様の様式で包含的であることを意図する。

0126

本明細書では、範囲を「約」1つの特定の値から、かつ/または「約」別の特定の値までとして表す場合がある。このような範囲を表すとき、別の場合は、1つの特定の値から、かつ/または他の特定の値までを含む。同様に、前置される「約」を使用することにより値を概数として表すときも、特定の値は、別の場合をなすことが理解されるであろう。範囲の各々の端点は、他の端点との関連で、かつ、他の端点とは独立に有意であることもさらに理解されるであろう。本明細書で使用される「約」という用語は、特定の用法の文脈内では、言明された数値に15%を加えるかまたは言明された数値から15%を減じた範囲を指す。例えば、約10ならば、8.5〜11.5の範囲を含むであろう。「約」という用語はまた、値の測定における典型的な誤差または不正確も表す。

0127

I.AMD
AMDとは、50歳を超える患者における失明の主要な原因であり、黄斑における光受容体、網膜の外側、および網膜色素上皮の進行性変性を特徴とする。AMDの末期「滲出」形態(新生血管形態または滲出性形態)は、それほど一般的ではないが、患者における、急速で、かつ、実質的であることが多い、中心視覚の喪失を高頻度で引き起こしうる。AMDの滲出形態では、脈絡膜血管新生が形成され、網膜色素上皮下および網膜色素上皮内で成長しうる血管のネットワークへと発達する。これは、血漿漏出および/または網膜下腔への出血を伴うので、これが黄斑内で生じれば、重度で突発的な中心視覚の喪失が見られる場合もあろう。

0128

別段に指定されない限り「AMD」という用語は、萎縮型AMDの場合もあり、滲出型AMDの場合もある。本開示は、AMD、滲出型AMD、および/または萎縮型AMDの処置または防止を想定する。

0129

当技術分野では既に公知の通り、AMDは、単一の原因を有さないことが示されている。この高度に複雑な疾患は、年齢遺伝的素因、および環境、またはこれらの組合せを含むがこれらに限定されない、様々な寄与から生じうる。例えば、ヒトでは、確立された疫学的危険性因子は、喫煙食餌女性白色人種、およびAMDの家族歴を含みうるがこれらに限定されない。AMDは、50歳より若齢の個体ではまれであるため、唯一不可避的な危険性因子は、AMDの発症機序において正常な老化随伴する多数の細胞変化関与させる年齢である。

0130

AMDの病因的複雑性は、有効な療法、予防戦略、およびそれを研究するための好適な動物モデルの相対的貧弱さに反映されている。疾患の複雑性および不完全特徴付けに起因して、AMDの動物におけるモデル化は不完全である。これは、動物の網膜と長動物の網膜とにおける解剖学的差異に部分的に起因するほか、疾患が発症するのに長期にわたる時間が必要とされることにも起因する。ヒトによる分子的遺伝的研究および動物研究からの証拠は、正常な光受容体−RPE生理学の一因となる多数の機構ホメオスタシスの変化が、疾患を誘発しうるという考えを裏付ける。少なくとも分子レベルでは、疾患を動物モデルにおいて探索することができ、場合によっては、その遺伝子欠損がヒトにおけるAMDの主要な原因ではない患者においてもなお探索することができる。

0131

かつての遺伝的研究ならびに綿密な病理学的解析は、多様なAMD動物モデルには、AMDについての単純な遺伝パターンは一般的でなく、1つの病理も一般的でないことを明らかにしている。当技術分野では、非ヒト霊長動物モデルが、ヒトにおけるCNVを、マウスモデルまたはラットモデルより良好に近似することが公知であるが、非ヒト霊長動物の網膜の解剖学、組織学における根本的な差異は、異なる種特異的病態をもたらし、遺伝学における根本的な差異もなお、異なる種特異的病態をもたらしている。

0132

さらに、そして、本明細書で記載される通り、レーザー光凝固を使用して、動物モデルにおける1つのAMD様症状であるCNVを誘導することができる。場合によって、レーザー処置は、ブルッフ膜破断させ、脈絡膜に由来する線維血管性の増殖性応答を惹起する。この応答は、後期AMDにおける脈絡膜血管新生をモデル化するための基盤であり、アカゲザルおよびカニクイザルにおいて開発された。

0133

アルゴンレーザーを使用して、スポット微小に保ち、ブルッフ膜を破断させるのに十分な出力で誘導する。これは、眼底鏡では、光凝固の時点においてバブルとして目視可能である。光凝固は、脈絡膜血管血栓形成続き、48時間後における再内皮化、および1週間後までの網膜下腔への新たな血管の成長を誘導する。新たに形成された血管は透過可能性が大きいため、新生血管の発生は、蛍光眼底血管造影法モニタリングして、血管漏出を評価することができる。

0134

新生血管の自然退縮フルオレセイン漏出の減少により指し示される)は、約3〜7週間後に始まり、次いで、漏出がその部位にもはや現れなくなるまで、徐々に進行する(約2〜13カ月にわたり)。

0135

血管化が低度な瘢痕化と比較した新たな血管成長の程度は、全てのモデルにおいて可変的な場合があり、種、網膜内の損傷の位置、およびレーザービームの強度の影響を受ける。種間の処置の差異に固有可変性は、1つの動物モデルがヒトにおけるAMDを十分に捉えることはないという考えをさらに裏付ける。

0136

AMDのための療法は、タンパク質のVEGFに結合するアプタマー、抗体、および可溶性受容体デコイ利用可能性と共に過去数年間で変化してきた。VEGFタンパク質またはVEGFリガンドは、VEGF受容体を含む細胞内受容体への結合を介して、新たな血管の形成(すなわち、血管形成)を刺激することが示されている。当技術分野で公知の通り、抗VEGF剤は、滲出型AMDにおいて生じる血管新生および血管形成をある程度防止しうる。Macugen(登録商標)またはLucentis(登録商標)またはEylea(登録商標)(抗VEGF剤)の眼内注射は高価であり、大半の症例において、Eylea(登録商標)の場合は、4〜6週間ごとまたは8週間ごとに処置を反復しなければならない。例えば、Lucentisは、毎月注射1回当たり約1950ドル費用がかかるVEGF抗体断片である。Avastin(VEGF抗体)は、未承認で使用されており、Eylea(VEGFトラップ)は、注射1回当たり約1850ドルの費用がかかり、2カ月ごとに投与する。これらの医薬の全ては、薬物動態プロファイルの低下という一般的問題を共有し、したがって、眼注射の反復を要求する。

0137

当技術分野では、実践的で、経済的に実現可能で、長期持続的な処置戦略が必要とされている。本開示は、これらの必要のうちのいくつかに取り組む新規の治療剤を提供する。

0138

本開示は、任意の適切なベクター(例えば、組換えウイルス系)により、AMDまたは類縁の新生血管性網膜疾患を有するか、またはこれを有することが疑われるヒト対象の網膜へと送達される、sFLT−1などの抗VEGF分子を提供する。場合によって、sFLT−1は、VEGFの強力で直接的な結合性タンパク質でありうる。場合によって、sFLT−1はまた、VEGF活性遮断または阻害することも可能である。

0139

例えば、当技術分野で公知のsFLT−1(本明細書でさらに記載される)は、VEGFタンパク質の二量体に、Kd=10pMで結合することが観察されている。

0140

本発明はまた、rAAVに媒介された眼への遺伝子送達に関する組成物および方法も提供する。AAVベースの系については、イヌの眼(>8歳)における長期にわたる遺伝子発現が観察されている。網膜内のsFLT−1mRNA発現は、少なくとも18カ月間にわたり維持されている。レーバー先天性黒内障についての3つのヒト試験が行われ、これらにより、LCAなどの網膜変性疾患の文脈におけるAAVベースの送達系の安全性が裏付けられた。

0141

II.VEGFおよびFms関連チロシンキナーゼ1(sFLT−1)タンパク質
A.VEGF
血管内皮成長因子(本明細書では「VEGF」または「VEGFリガンド」と称する)とは、生理学的血管形成において鍵となる役割を果たす強力な内皮細胞特異的マイトジェンである。場合によって、VEGF活性は、VEGFリガンドの、細胞内の1または複数のVEGF受容体への結合から生じる。VEGFリガンドの、VEGF受容体への結合は、下流における多数の細胞効果および生化学的効果であって、組織内の血管形成を含むがこれらに限定されない細胞効果および生化学的効果を及ぼしうる。VEGFは、がん虚血症、および炎症と関連する障害を含む、事実上あらゆる種類の血管形成性障害または新生血管性障害に関与している。加えて、VEGFは、虚血性網膜症、眼内血管新生、加齢黄斑変性(AMD)、滲出型AMD、萎縮型AMD、網膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜虚血症、糖尿病性網膜浮腫、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、網膜中心静脈閉塞症、網膜静脈分枝閉塞症を含むがこれらに限定されない眼疾患にも関与している。さらに、本明細書で記載される、本開示の組成物および方法を含む抗VEGF処置は、本明細書で記載されるこれらの疾患のうちの1または複数の処置において使用することができる。

0142

近年のデータは、VEGFが、AMDの滲出形態の発症機序における主要な血管形成性成長因子であることを示唆する。

0143

46kDaのホモ二量体糖ペプチドであるVEGFは、色素上皮細胞、周皮細胞血管内皮細胞神経膠細胞、および神経節細胞を含むがこれらに限定されない、複数の異なる眼細胞型が発現させる。場合によって、VEGFは、網膜の発生時に、特殊な空間的パターンおよび時間的パターンで発現する。場合によって、VEGFのヒトアイソフォームは、単量体1つ当たり206、189、183、165、148、145、および121アミノ酸のタンパク質を含みうるが、主要なヒトVEGFアイソフォームは、VEGF121、VEGF165、VEGF189、およびVEGF206を含むがこれらに限定されない。これらのタンパク質は、VEGFmRNAの代替的なスプライシングにより産生され、ヘパリンおよび特異的なVEGF受容体またはVEGF共受容体ニューロピリン)に結合するそれらの能力が異なる。VEGF遺伝子のエクソン1〜5によりコードされるドメインは、公知のVEGF受容体であるKDR/FLK−1およびFLT−1の認識に要求される情報を含有する。このドメインは、全てのVEGFアイソフォームに存在する。VEGFは、高アフィニティー受容体チロシンキナーゼであるこれらの受容体を介して作用し、内皮細胞増殖遊走、および血管透過性の増大をもたらす。

0144

VEGFは、血管形成の複雑な過程に関与する複数の因子のうちの1つであり、血管内皮細胞に対して極めて高い特異性を有する。VEGFは、胚形成骨格成長、および生殖機能などの過程における生理学的血管形成の調節因子であるが、また、がん、胎盤障害、および他の状態などの疾患と関連する病理学的血管形成にも関与している。VEGFの潜在的な生物学的効果は、特異的なfms様膜貫通受容体であるFLT−1およびFLK−1/KDRにより媒介されうる。場合によって、これらの自然発生のVEGFの結合パートナーは、VEGFの、VEGF受容体への結合に影響を及ぼし、これにより、VEGF受容体および後続の下流における経路の活性化をモジュレートすることが可能である。

0145

がんとの関連では、VEGFに対するヒト化モノクローナル抗体(rhuMab VEGF)を含む複数のVEGF阻害剤、抗VEGFR−2抗体、VEGFR−2によるシグナル伝達を阻害する低分子、および可溶性VEGF受容体は、ある程度の治療特性を示している。

0146

糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、または加齢黄斑変性など、眼内血管新生性疾患との関連では、いくつかのVEGFアンタゴニストは、高頻度の投与に対する必要にもかかわらず、治療効果を示している。

0147

B.抗VEGF
本開示の組換えウイルスは、米国特許第5,712,380号、同第5,861,484号、および同第7,071,159号において開示されている、VEGF結合性タンパク質またはそれらの機能的断片、ならびに米国特許第7,635,474号において開示されている、VEGF結合性融合タンパク質を含むがこれらに限定されない、抗VEGFタンパク質をコードする配列を含む。抗VEGFタンパク質はまた、本明細書で記載されるsFLT−1タンパク質も含みうる。

0148

本開示の組換えウイルスまたはプラスミドは、米国特許第5,861,484号において記載されている、自然発生のタンパク質であるsFlt−1、および配列番号109により記載されている配列を含む、抗VEGFタンパク質をコードする配列を含みうる。本開示の組換えウイルスまたはプラスミドはまた、sFlt−1のドメイン2の配列または配列番号121に示される配列のほか、米国特許第7,635,474号において開示されている、VEGF結合性融合タンパク質などの類縁の構築物を含む、その機能的断片も含むがこれらに限定されない。抗VEGFタンパク質はまた、本明細書で記載されるsFLT−1タンパク質も含みうる。これらの配列は、遺伝子コード、当業者により理解されている標準的な技法を使用して、このような配列をコードするDNAから発現させることができる。当業者により察知されうる通り、遺伝子コードの縮重性のために、抗VEGFタンパク質配列は、いくつかの異なるDNA配列からたやすく発現させることができる。

0149

本明細書では「sFlt−1タンパク質」とは、sFlt−1タンパク質またはsFlt−1ポリペプチドが、VEGFおよび/またはVEGF受容体に結合するように、自然発生のヒトsFLT−1配列に対する少なくとも90%以上の相同性を伴うポリペプチド配列、またはその機能的断片を指す。相同性とは、2つの配列の間のアライメントの残基の保存%を指す。自然発生のヒトsFLT−1タンパク質は、機能的断片、挿入、欠失置換、偽断片、偽遺伝子スプライス変異体、または人工最適化配列を含む配列を含むがこれらに限定されない、sFLT−1の任意の適切な変異体を含みうる。場合によって「sFLT−1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT−1タンパク質配列に対して、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%相同でありうる。場合によって「sFLT−1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT−1タンパク質配列に対して、最大で約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%空間的に相同でありうる。場合によって「sFLT−1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT−1タンパク質のコンフォメーションに対して、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%相同でありうる。場合によって「sFLT−1タンパク質」は、自然発生のヒトsFLT−1タンパク質のコンフォメーションに対して、最大で約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または100%空間的に相同でありうる。

0150

さらに、VEGF受容体FLT−1の可溶性切断形態であるsFLT−1は、VEGFの唯一の公知の内因性特異的阻害剤である。天然では、sFLT−1は、代替的なmRNAスプライシングにより生成し、膜近位免疫グロブリン様ドメイン膜貫通領域、および細胞内チロシンキナーゼドメインを欠く。構造的に、FLT−1タンパク質およびsFLT−1タンパク質はいずれも、複数の機能的ドメインを含みうる。いくつかの変異体では、FLTタンパク質およびsFLTタンパク質は一般に、6つの連結ドメイン;タンパク質の二量体化に関与する3つのドメイン;およびVEGFなどのリガンドの結合に関与する3つのドメインを共有する。

0151

sFLT−1は、FLT−1の可溶性切断形態であり、内因的に発現する。本明細書で記載される「可溶性」FLT−1またはsFLT−1とは、細胞膜限局されないFLT−1を指す。非結合のsFLT−1は、細胞外腔内または溶液中に遊離して拡散しうる

0152

sFLT−1は、VEGFの唯一の公知の内因性の特異的阻害剤である。この相互作用は、特異的であり、100倍過剰の非標識VEGFと競合しうる。場合によって、sFLT−1の血管新生抑制活性は、2つの機構:i)それが高アフィニティーで結合するVEGFの隔離、およびii)VEGF受容体であるFLTt−1およびFLK−1/KDRの膜貫通アイソフォームとの、不活性のヘテロ二量体の形成によるVEGFの阻害から生じうる。当技術分野で公知の通り、in vitro結合アッセイは、sFLT−1がVEGFに高アフィニティーで結合し、また、ヒト臍帯血管内皮細胞の、VEGFに駆動される増殖も阻害することを指し示している。がんについての動物モデルでは、sFLT−1は、腫瘍の成長を阻害する。場合によって、細胞外腔内の過剰なVEGFは、VEGF受容体に結合し、その後これを活性化することを阻止されうるので、sFLT−1は、化学量論未満の様式またはドミナントネガティブの様式で機能しうる。sFLT−1のこれらの特性は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、KendallおよびThomas、1993年、Proc Natl Acad Sci.、90巻:10705〜10709頁において記載されている。当技術分野で公知の通り、sFLT−1の機能的断片は、全長タンパク質の代わりに使用することができる。より具体的には、VEGF結合性ドメイン(ドメイン2)、または代替的に、sFLT−1のドメイン2に加えて、sFLT1、KDR、または別のファミリーメンバーに由来するドメイン3を使用して、VEGFに結合させ、これを不活化することができる。このような機能的断片は、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、Wiesmannら、1997年、Cell、91巻:695〜704頁において記載されている。「sFLT−1」および「sFLT−1の機能的断片」という用語は、同義であり、本明細書では互換的に使用される。

0153

III.ベクターおよび組換えウイルス
本開示の組成物および方法は、抗VEGF(例えば、sFLT−1タンパク質)をコードする核酸の、それを必要とするヒト対象または患者における細胞への送達を提供する。場合によって、核酸の送達は、遺伝子治療と称する場合がある。

0154

本開示の組成物および方法は、抗VEGF核酸(例えば、sFLT−1)を送達するための任意の適切な方法を提供する。場合によって、核酸の送達は、任意の適切な「ベクター」(場合によって、「遺伝子送達」または「遺伝子移入ビヒクル」ともまた称する)を使用して実施することもできる。ベクター、送達ビヒクル遺伝子送達ビヒクル、または遺伝子移入ビヒクルは、標的細胞へと送達されるポリヌクレオチドを含む任意の適切な高分子または分子の複合体を指す場合がある。場合によって、標的細胞は、核酸または遺伝子が送達される任意の細胞でありうる。送達されるポリヌクレオチドは、sFLT−1遺伝子など、遺伝子治療における対象のコード配列を含みうる。

0155

例えば、適切なベクターは、ポリヌクレオチドの標的細胞への送達を媒介することが可能な、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、およびレトロウイルスなどのウイルスベクター、リポソーム、他の脂質含有複合体、および他の高分子複合体を含みうるがこれらに限定されない。

0156

場合によって、ベクターは、有機分子の場合もあり、無機分子の場合もある。場合によって、ベクターは、低分子(すなわち、<5kD)の場合もあり、高分子(すなわち>5kD)の場合もある。例えば、ベクターは、不活性の分子、金属粒子などの生物学的不活性分子を含みうるがこれらに限定されない。場合によって、ベクターは、金粒子でありうる。

0157

場合によって、ベクターは、生物学的活性分子を含みうる。例えば、ベクターは、デンドリマーなどの重合化させた高分子を含みうる。

0158

場合によって、ベクターは、1または複数の核酸を組み込む組換えウイルスベクターを含みうる。本明細書で記載される核酸とは、ポリヌクレオチドを指す場合がある。核酸とポリヌクレオチドとは、互換的に使用することができる。場合によって、核酸は、DNAを含む場合もあり、RNAを含む場合もある。場合によって、核酸は、sFLT−1を発現させるためのDNAを含む場合もあり、sFLT−1を発現させるためのRNAを含む場合もある。場合によって、RNA核酸は、対象の遺伝子(例えば、sFLT−1)の転写物、イントロン、非翻訳領域、終結配列などを含みうるがこれらに限定されない。他の場合には、DNA核酸は、ハイブリッドプロモーター遺伝子配列、強い構成的プロモーター配列、対象の遺伝子(例えば、sFLT−1)、非翻訳領域、終結配列などの配列を含みうるがこれらに限定されない。場合によって、DNAとRNAとの組合せも、使用することができる。

0159

本明細書の本開示で記載される「発現構築物」という用語は、遺伝子産物をコードする核酸またはポリヌクレオチドを含有する任意の種類の遺伝子構築物であって、配列をコードする核酸の一部または全部の転写が可能な遺伝子構築物を含むことを意味する。転写物は、タンパク質へと翻訳されうる。場合によって、転写物は、部分的に翻訳される場合もあり、翻訳されない場合もある。ある特定の態様では、発現は、遺伝子の転写およびmRNAの遺伝子産物への翻訳の両方を含む。他の態様では、発現は、対象の遺伝子をコードする核酸の転写だけを含む。

0160

一態様において、本開示は、アデノ随伴ウイルス(rAAV)などの組換えウイルスを、sFLT−1の発現を媒介するベクターとして提供する。

0161

場合によって、本開示のウイルスベクターは、pfu(プラーク形成単位:plaque forming units)として測定することができる。場合によって、本開示の組成物および方法の組換えウイルスまたはウイルスベクターのpfuは、約108〜約5×1010pfuでありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、および5×1010pfuである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、および5×1010pfuである。

0162

場合によって、本開示のウイルスベクターは、ベクターゲノムとして測定することができる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×1010〜3×1012のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×109〜3×1013のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108〜3×1014のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108〜3×1014のベクターゲノムである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のベクターゲノムである。

0163

場合によって、本開示のウイルスベクターは、感染多重度(MOI)を使用して測定することができる。場合によって、MOIとは、ベクターまたはウイルスゲノムの、核酸を送達しうる細胞に対する比または倍数を指す場合がある。場合によって、MOIは、1×106でありうる。場合によって、MOIは、1×105〜1×107でありうる。場合によって、MOIは、1×104〜1×108でありうる。場合によって、本開示の組換えウイルスは、少なくとも約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のMOIである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、1×108〜3×1014のMOIである。場合によって、本開示の組換えウイルスは、最大で約1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017、および1×1018のMOIである。

0164

一部の態様では、核酸は、ウイルスを使用せずに(すなわち、非ウイルスベクターにより)送達することができ、核酸量として測定することができる。一般に、任意の適切な核酸量を、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。場合によって、核酸は、少なくとも約1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g、または5gでありうる。場合によって、核酸は、最大で約1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g、または5gでありうる。

0165

一部の態様では、自己相補性ベクター(sc)を使用することができる。参照により本明細書に組み込まれる、Wu、Hum Gene Ther.、2007年、18巻(2号):171〜82頁により提供される通り、自己相補性AAVベクターを使用することにより、ウイルス性第2鎖DNAの合成に対する要求を迂回することができ、導入遺伝子タンパク質の発現速度の増大をもたらすことができる。

0166

一部の態様では、複数のAAVベクターを生成して、最適な血清型、プロモーター、および導入遺伝子の選択を可能とすることができる。

0167

場合によって、ベクターは、標的化ベクター、とりわけ、がん細胞または腫瘍細胞または眼細胞などの特異的な細胞に選択的に結合する標的化ベクターでありうる。本開示における使用のためのウイルスベクターは、標的細胞に対して低毒性を呈示し、治療的有用量の抗VEGFタンパク質の産生を細胞特異的な様式で誘導するウイルスベクターを含みうる。

0168

本開示の組成物および方法は、アデノ随伴ウイルス(AAV)、アデノウイルス、ヘルパー依存性アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス(HVJ)−リポソーム複合体、モロニーマウス白血病ウイルス、およびHIVベースのウイルスのうちの少なくとも1つの使用を含むがこれらに限定されない、任意の適切なウイルス性核酸送達系を提供する。好ましくは、ウイルスベクターは、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された強い真核細胞プロモーター、例えば、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターを含む。

0169

一般に、任意の適切なウイルスベクターは、本開示の組成物および方法を伴う使用に最適化されるように操作することができる。例えば、アデノウイルス(Ad)またはアデノ随伴ウイルス(AAV)に由来するウイルスベクターを使用することができる。ヒトウイルスベクターおよび非ヒトウイルスベクターのいずれも使用することができ、組換えウイルスベクターは、ヒトにおいて複製欠損でありうるように変化させることができる。ベクターがアデノウイルスである場合、ベクターは、抗VEGFタンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターを有するポリヌクレオチドを含むことが可能であり、ヒトにおいて複製欠損である。

0170

2つのウイルスベクター系の有利な特性を組み合わせるために、ハイブリッドウイルスベクターを使用して、sFLT−1タンパク質をコードする核酸を標的細胞または標的組織へと送達することができる。当業者には、ハイブリッドベクター構築するための標準的な技法が周知である。このような技法は、例えば、Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor、N.Y.または組換えDNA技術について論じる任意の数の実験室マニュアルにおいて見出すことができる。AAV ITRとアデノウイルスITRとの組合せを含有するアデノウイルスカプシド内の二本鎖AAVゲノムを使用して、細胞に形質導入することができる。別の変化形では、AAVベクターを、「ガットレスアデノウイルスベクター、「ヘルパー依存型」アデノウイルスベクター、または「高容量」アデノウイルスベクターに入れることができる。アデノウイルス/AAVハイブリッドベクターは、Lieberら、J. Virol.、73巻:9314〜9324頁、1999年において論じられている。レトロウイルス/アデノウイルスハイブリッドベクターは、Zhengら、Nature Biotechnol.、18巻:176〜186頁、2000年において論じられている。

0171

アデノウイルス内に含有されるレトロウイルスゲノムは、標的細胞ゲノム内に組み込み、安定的な遺伝子発現を実行することができる。

0172

複製欠損組換えアデノウイルスベクターは、公知の技法に従い産生することができる。Quantinら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、89巻:2581〜2584頁(1992年); Stratford−Perricadetら、J. Clin. Invest.、90巻:626〜630頁(1992年);およびRosenfeldら、Cell、68巻:143〜155頁(1992年)を参照されたい。

0173

加えて好ましいベクターは、ウイルスベクター、融合タンパク質、および化学コンジュゲートを含みうるがこれらに限定されない。レトロウイルスベクターは、モロニーマウス白血病ウイルスおよびHIVベースのウイルスを含む。場合によって、HIVベースのウイルスベクターであって、gag遺伝子およびpol遺伝子がHIVゲノムに由来し、env遺伝子が別のウイルスに由来する、少なくとも2つのベクターを含むウイルスベクターを使用することができる。DNAウイルスベクターを使用することができる。これらのベクターは、オルソポックスベクターまたはアビポックスベクターなどのポックスベクター、I型単純ヘルペスウイルス(HSV)ベクターなどのヘルペスウイルスベクター[参照により本明細書に組み込まれる、Geller, A.I.ら、J. Neurochem、64巻:487頁(1995年); Lim, F.ら、「DNA Cloning: Mammalian Systems」、D. Glover編(Oxford Univ. Press、Oxford England)(1995年); Geller, A.I.ら、Proc Natl. Acad. Sci. : U.S.A.:90巻、7603頁(1993年); Geller, A.I.ら、Proc Natl. Acad. Sci USA、87巻:1149頁(1990年)]、アデノウイルスベクター[参照により本明細書に組み込まれる、LeGal LaSalleら、Science、259巻:988頁(1993年); Davidsonら、Nat. Genet.、3巻:219頁(1993年); Yangら、J. Virol.、69巻:2004頁(1995年)]、およびアデノ随伴ウイルスベクター[参照により本明細書に組み込まれる、Kaplitt, M.G.ら、Nat. Genet.、8巻:148頁(1994年)]を含む。

0174

本開示に従い使用しうる、他のウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルス(HSV)ベースのベクターを含む。1または複数の前初期遺伝子IE)を欠失させたHSVベクターは一般に、非細胞傷害性であり、標的細胞内の潜伏性と類似の状態で存続し、効率的な標的細胞への形質導入をもたらすために有利である。組換えHSVベクターは、約30kb異種核酸を組み込むことができる。

0175

本開示ではまた、C型レトロウイルスなどのレトロウイルスおよびレンチウイルスも使用することができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、HuおよびPathak、Pharmacol. Rev.、52巻:493511頁、2000年;およびFongら、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst.、17巻:1〜60頁、2000年により提供される通り、レトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス(MLV)に基づきうる。MLVベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最大で8kbの異種(治療的)DNAを含有しうる。異種DNAは、組織特異的プロモーターおよび抗VEGFタンパク質核酸を含みうる。新生物細胞への送達法では、異種DNAはまた、組織特異的な受容体へのリガンドもコードする。

0176

参照により本明細書に組み込まれる、VignaおよびNaldini、J. Gene Med.、5巻:308〜316頁、2000年;ならびにMiyoshiら、J. Virol.、72巻:8150〜8157頁、1998年により提供される通り、ヒト免疫不全(HIV)ベースのベクターを含む複製欠損レンチウイルスベースのベクターを含むがこれらに限定されない、さらなるレトロウイルスベクターも使用することができる。レンチウイルスベクターは、活性分裂細胞および非分裂細胞のいずれにも感染することが可能な点で有利でありうる。それらははまた、ヒト上皮細胞に形質導入するときにも高度に効率的でありうる。

0177

本開示における使用のためのレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスおよび非ヒト(SIVを含む)レンチウイルスに由来しうる。レンチウイルスベクターの例は、ベクターの繁殖に要求される核酸配列のほか、抗VEGFタンパク質遺伝子に作動可能に連結された組織特異的プロモーターも含む。核酸配列は、ウイルスLTRプライマー結合性部位ポリプリントラクト、att部位、およびカプシド形成部位を含みうる。

0178

レンチウイルスベクターは、任意の適切なレンチウイルスカプシドへとパッケージングすることができる。1つの粒子タンパク質の、異なるウイルスに由来する別の粒子タンパク質による置換を、「シュードタイピング」と称する。ベクターカプシドは、マウス白血病ウイルス(MLV:murine leukemia virus)または水疱性口内炎ウイルス(VSV:vesicular stomatitis virus)を含む、他のウイルスに由来するウイルスエンベロープタンパク質を含有しうる。VSVGタンパク質を使用することにより、高ベクター力価がもたらされ、ベクターウイルス粒子の安定性の増大が結果としてもたらされる。

0179

本開示ではまた、セムリキ森林熱ウイルス(SFV)およびシンドビスウイルス(SIN)から作製されたアルファウイルスベースのベクターなど、アルファウイルスベースのベクターも使用することができる。アルファウイルスの使用は、参照により本明細書に組み込まれる、Lundstrom, K.、Intervirology、43巻:247〜257頁、2000年;およびPerriら、Journal of Virology、74巻:9802〜9807頁、2000年において記載されている。

0180

組換えの複製欠損アルファウイルスベクターは、高レベルの異種(治療的)遺伝子発現が可能であり、広範な標的細胞範囲に感染しうるため、有利でありうる。アルファウイルスのレプリコンは、それらのビリオン表面上に、コグネイトの結合パートナーを発現させる標的細胞への選択的結合を可能とする機能的な異種リガンドまたは結合性ドメインを提示させることにより、特異的な細胞型へと標的化することができる。アルファウイルスのレプリコンは、潜伏性を確立することが可能であり、したがって、長期にわたる標的細胞内の異種核酸の発現を確立することが可能である。レプリコンははまた、標的細胞内の一過性の異種核酸の発現も呈示しうる。

0181

ポックスウイルスベクターは、遺伝子を、細胞の細胞質へと導入しうる。アビポックスウイルスベクターは、遺伝子または核酸の短期間の発現だけを結果としてもたらしうる。アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルス(HSV:herpes simplex virus)ベクターは、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。一部の態様では、アデノウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスより短期間の発現(例えば、約1カ月間未満)を結果としてもたらす場合もあるがはるかに長期にわたる発現も呈示しうる。選択される特定のベクターは、標的細胞および処置される状態に依存しうる。

0182

アデノ随伴ウイルス(AAV)とは、小型の非エンベロープ一本鎖DNAウイルスである。AAVは、非病原性ヒトパルボウイルスであり、複製のためのヘルパーウイルスであって、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびCMVを含むヘルパーウイルスに依存しうる。野生型(wt)AAVへの曝露は、いかなるヒト病態とも関連しないか、またはいかなるヒト病態を引き起こすことも公知ではなく、一般的な集団内に一般的であり、通常は生後最初の10年間にアデノウイルス感染と関連して生じる。

0183

本明細書で記載される「AAV」とは、アデノ随伴ウイルスを指し、「rAAV」とは、組換えアデノ随伴ウイルスを指す。

0184

場合によって、野生型のAAVは、rep遺伝子およびcap遺伝子をコードする。rep遺伝子は、ウイルスの複製に要求され、cap遺伝子は、カプシドタンパク質の合成に要求される。代替的な翻訳開始部位とスプライシング部位とを組み合わせることにより、小型ゲノムは、4つのrep遺伝子産物および3つのcap遺伝子産物を発現させることが可能でありうる。逆位末端配列(ゲノムを挟む145bpのITR)内のrep遺伝子産物およびrep遺伝子配列は、この過程において極めて重要でありうる。現在のところ、AAVの11の血清型が単離されている。AAV2は、本開示の組成物および方法と共に使用することができる。本開示の組成物および方法は、任意の適切なAAV血清型の使用を提供する。一部の態様では、AAVは、AAV1、AAV2、AAV2.5、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、rh10、およびこれらのハイブリッドからなる群から選択される。

0185

一部の態様では、本開示は、切断型可溶性VEGF受容体1(sFLT−1)のヒト形態をさらに含む核酸を含む組換えウイルスであって、rAAV.sFlt−1と名付けられた組換えウイルスを提供する。ベクターは、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。別の態様では、ベクターは、rAAV.sFlt−1と名付けられた、血清型2の組換え複製欠損アデノ随伴ウイルス性(rAAV)ベクターである。

0186

AAV2は、特徴付けが最もよくなされている。rAAV2は、多くの動物種の眼における長期にわたる導入遺伝子発現を媒介することが可能なことが示されている。ラットでは、rAAVに媒介されたレポーター遺伝子緑色蛍光タンパク質)は、注射の18カ月後においてもなお存在した。サルでは、同じレポート遺伝子が、注射の17カ月後において存在した。同様に、rAAV.sFlt−1を注射されたサルの眼の硝子体中でも、高sFLT−1タンパク質レベルが、注射の15カ月後において存在した。

0187

rAAV.sFlt−1は、動物モデルにおいて、眼内血管新生性障害について調べられている。rAAV.sFlt−1は、角膜血管新生および網膜血管新生の動物モデルにおいて、血管新生の進行を遅らせると考えられた。興味深いことに、rAAVを媒介するsFlt−1は、脈絡膜血管新生のサルモデル(加齢黄斑変性またはAMDの滲出形態についてのモデル)において、血管新生のある程度の阻害を指し示した。本研究では、rAAV.sFlt−1構築物の存在は、サルの眼において低レベルのsFLT−1の発現を示し、サルの健全性または網膜機能には影響を及ぼさなかった。rAAV.sFlt−1への全身曝露と関連するいかなる安全性問題を示唆する証拠も見られない。これらの研究におけるrAAVベクターの全体的な肯定所見および毒性の欠如のほか、脈絡膜血管新生/AMDの哺乳動物モデルにおけるrAAV.sFlt−1による所見は、ベクターが、眼へと投与されると、好適な安全性プロファイルを示すことを裏付ける広範なデータをもたらしている。

0188

サルモデルにおいて、AMDのある種の症状を改善するrAAV.sFlt−1の能力にもかかわらず、網膜内のsFLT−1タンパク質レベルは予測外に低い。当技術分野では、構成的に活性の哺乳動物プロモーターにより駆動されるsFLT−1の発現レベルは、多数の細胞型において高レベルのタンパク質の発現をもたらすことが示されている。理論に束縛されることなく述べると、この予測されるより低い発現レベルについては、複数の可能性が存在しうる。大型のマルチドメインタンパク質としてのsFLT−1は、早期のタンパク質分解に対して感受性である可能性もあり、発現の反応速度が低い可能性もあり、分取が最適でない可能性もある。後者に関しては、分泌されたタンパク質としてのsFLT−1は、細胞内で組換えにより発現すると、分泌経路に入る。RPE細胞を含む網膜細胞では、sFLT−1は、タンパク質のERによる分取またはゴルジ体による分取に応じて、尖端側に分泌される場合もあり、基底側方に分泌される場合もある。場合によって、最適でない分取は、分子を望ましくない基底側方膜へと分泌させ、したがって、VEGFによるシグナル伝達およびRPE細胞層の尖端表面上の新生血管性血管形成を阻害するのに利用可能なsFLT−1分子の濃度を低下させる場合がある。

0189

加えて、当技術分野では、この予測外に低いsFLT−1のレベルが、ヒトにおける実際のAMD疾患の処置に対する薬物の有効性にいかなる影響を及ぼしうるのかについても知られていなかった。サルモデルにおいて高レベルとなることがまれでありながらもAMDの症状を改善する有望な徴候が示されたが、AMD疾患についてのサロゲートを供するのはAMDについてのサルによる動物モデルだけである。本明細書で記載されるAMDの症状は、網膜内で人為的に誘導される(レーザーを介する)。このモデルは、多様な解析に適するが、サルモデルにおける症状の処置における実際の薬物の有効性をヒトにおける疾患の処置へと外挿することは難しい。予測外なことに、rAAV.sFlt−1によりもたらされる低タンパク質レベルは、ヒトにおける実験を伴わずにこれを評価することの困難をさらに増大させる。

0190

加えて、英国および米国では、rAAV2骨格を使用して、レーバー先天性黒内障(LCA:Lebers Congenital Amaurosis)についての3つの臨床試験も行われている。LCAとは、出生時または生後最初の数カ月間に現れるまれな遺伝性眼疾患であり、眼球振とう瞳孔反射が遅いかまたは見られないこと、および重度の視覚喪失または失明を特徴とする。現在のところ、rAAV2構築物の、これらの2つの試験の6例の参加者の網膜下腔への注射後における安全性問題は報告されていない。臨床試験に関与するいずれのチームも、それらの所見により、LCA患者におけるさらなる遺伝子治療研究が支持されることを結論付けた。

0191

サルにおいて、sFLT−1の実質的または持続的な高レベルをもたらすことの見かけ上の技術的困難踏まえると、rAAV.sFlt−1を導入した後における網膜内の、sFlt−1の低タンパク質レベルに伏在する技術的問題のうちの1または複数に取り組むために、多様な最適化戦略をとることができる。場合によって、本開示の組成物および方法により提供される最適化戦略を含む最適化戦略は、sFlt−1タンパク質配列もしくはsFlt−1タンパク質ドメインを最適化すること、制御エレメントを導入して、網膜細胞内の発現後における適正な分取を指示すること、またはsFlt−1タンパク質のレベルを上昇させて、これらの可能な因子のうちのいずれかを補償することを含みうる。場合によって、本開示の組成物および方法は、後者へと方向付けられた特異的な戦略であって、ヒト網膜におけるタンパク質レベルを、かつてサル研究において観察されたsFlt−1レベルを上回って上昇させることへと方向付けられた特異的な核酸配列の組込みを伴う戦略を提供する。本明細書で記載される、多様な配列、リンカー、UTR、イントロン、sFLT−1変異体、またはこれらの組合せを使用して、rAAV.sFlt−1へと曝露した後における、網膜内のsFlt−1タンパク質のタンパク質レベルを上昇させることができる。

0192

ベクターは、遺伝子送達および/もしくは遺伝子発現をさらにモジュレートするか、または標的とされる細胞に他の形で有益な特性をもたらす成分または機能性を含みうる。このような他の成分は、例えば、細胞への結合または標的化に影響を及ぼす成分(細胞型特異的結合または組織特異的結合を媒介する成分を含む);細胞によるベクター核酸取込みに影響を及ぼす成分;取込み後における細胞内のポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分(核局在化を媒介する薬剤など);およびポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分を含む。このような成分はまた、ベクターにより送達される核酸を取り込み、発現させる細胞を検出または選択するのに使用しうる、検出用マーカーおよび/または選択用マーカーなどのマーカーも含みうるであろう。このような成分は、ベクター(結合および取込みを媒介する成分または機能性を有する、ある種のウイルスベクターの使用など)の天然の特色としてもたらすこともでき、ベクターを、このような機能性をもたらすように修飾することもできる。

0193

選択用マーカーは、陽性の場合もあり、陰性の場合もあり、二機能性の場合もありう
る。陽性の選択用マーカーが、マーカーを保有する細胞の選択を可能とするのに対し、陰性の選択用マーカーは、マーカーを保有する細胞を、選択的に除外することを可能とする。二機能性(すなわち、陽性/陰性)マーカー(例えば、1992年5月29日に公開されたLupton, S.、WO92/08796;および1994年12月8日に公開されたLupton, S.、WO94/28143を参照されたい)を含む、様々なこのようなマーカー遺伝子について記載されている。陰性の選択用マーカーの例は、耐性遺伝子の、アンピシリンまたはカナマイシンなどの抗生剤への組入れを含みうる。このようなマーカー遺伝子は、遺伝子治療の文脈において有利でありうる、さらなる制御尺度をもたらしうる。当技術分野では、多種多様なこのようなベクターが公知であり、一般に利用可能である。

0194

場合によって、抗生剤耐性マーカーをコードする核酸は、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、または配列番号114などの配列を含みうるがこれらに限定されない。

0195

本開示の方法に適合的なウイルスベクターの多くでは、1または複数のプロモーターを、ベクター内に組み入れて、ベクターが複数の異種遺伝子を発現させることを可能とすることができる。さらに、ベクターは、抗VEGFタンパク質の標的細胞からの発現を容易とするシグナルペプチドまたは他の部分をコードする配列も含みうる。

0196

遺伝子産物をコードする核酸は、プロモーターによる転写制御下に置くことができる。本明細書で提供される「プロモーター」とは、遺伝子の転写を開始するのに要求される適切なDNA配列を指す。「転写制御下の」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼによる開始および遺伝子の発現を制御する核酸との関連で適正な位置および配向性にあることを意味する。場合によって、プロモーターは、「強い」プロモーターまたは構成的に活性のプロモーターを含みうる。例えば、CMVプロモーターは、当技術分野で公知の、構成的に活性のプロモーターとして使用することができる。場合によって、CMVプロモーターは、発現を促進するためのさらなる調節エレメントを含みうる。場合によって、CMVプロモーターは、前初期CMVプロモーターを含みうる。

0197

場合によって、プロモーターは、「弱い」プロモーターまたは強いプロモーターより低レベルのsFLT−1タンパク質をもたらす配列を指す場合もある。場合によって、プロモーターは、sFLT−1の選択的発現を駆動するように使用することもできる。場合によって、本明細書で記載される他の配列と組み合わせて使用されるプロモーターまたは他の調節エレメントを使用して、眼細胞内また眼組織内のsFLT−1の選択的発現を駆動することもできる。

0198

加えて、本明細書ではまた、「プロモーター」104を、任意のさらなる適切な転写制御モジュールであって、RNAポリメラーゼの開始部位の近傍に存在しうる転写制御モジュールを指すのに互換的に使用することもできる。本開示の組成物および方法では、導入遺伝子106を発現させるために、任意の適切なプロモーターおよび転写制御モジュールを使用することができる。さらなる転写制御モジュールは、HSVチミジンキナーゼ(tk:thymidine kinase)およびSV40初期転写単位などのエレメントを含みうるがこれらに限定されない。一般に、プロモーターは、各々が約7〜20bpのDNA、または20〜5000bpのDNAからなる不連続な機能的モジュールからなることが可能であり、転写活性化因子タンパク質または転写抑制因子タンパク質に対する1または複数の認識部位を含有しうる。本開示の組成物および方法は、任意の適切な調節配列、またはこれらの組合せを提供する。場合によって、これらの転写制御モジュール配列は、エンハンサー配列またはリプレッサー配列と称するかまたは同定することができる。

0199

各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成の開始部位の位置を定めるように機能する。1つの例は、TATAボックスである。他の例は、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびSV40後期遺伝子のプロモーターなど、TATAボックスを欠くいくつかのプロモーターを含むことが可能であり、開始部位自体を占める不連続なエレメントは、開始位置を固定する一助となる。

0200

さらなるプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。いくつかのプロモーターは、開始部位の下流にもまた機能的エレメントを含有しうるが、一般には、プロモーターエレメントは、開始部位の30〜110bp上流の領域に位置する。プロモーターエレメントの間の間隔はしばしば、エレメントを互いに対して反転させるかまたは移動させた場合にプロモーター機能が保存されるように、柔軟でありうる。tkプロモーターでは、例えば、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間の間隔を、50bpの隔たりへと増大させることができる。プロモーターに応じて、転写活性化させるのに共作動的または独立に機能するように、個別のエレメントの位置を定めることができる。

0201

本開示の組成物および方法は、標的とされる細胞内の対象の核酸配列の発現を制御するための任意の適切な配列を提供する。したがって、ヒト細胞を標的とする場合、核酸のコード領域の配列を、ヒト細胞内で発現することが可能なプロモーターに隣接し、その制御下にあるように操作することができる。一般に、このようなプロモーターは、ヒトプロモーターを含む場合もあり、ウイルスプロモーターを含む場合もあろう。

0202

本開示の多様な態様では、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)前初期遺伝子プロモーター(ie−CMV)、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、β−アクチン、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼを使用して、対象のコード配列(例えば、sFLT−1)の高レベルの発現を得ることができる。発現レベルが所与の目的に十分であるという条件で、対象のコード配列の発現を達成することが当技術分野で周知な、他のウイルスプロモーターまたは哺乳動物細胞プロモーターまたは細菌ファージプロモーターの使用もまた想定される。一部の態様では、T7RNAポリメラーゼプロモーター配列などの原核生物調節配列を、ベクター内に存在させることができる。他の態様では、ベクターは、このような調節配列を含まない。公知の特性を伴うプロモーターを援用することにより、トランスフェクションまたは形質転換後における、対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを、最適化することができる。

0203

特異的な生理学的シグナルまたは合成についてのシグナルに応答して調節されるプロモーターの選択は、遺伝子産物の誘導性発現を可能としうる。例えば、マルチシストロニックベクターを利用するときに、1または複数の導入遺伝子の発現が、その中でベクターが産生される細胞に対して毒性である場合、導入遺伝子のうちの1または複数の発現を阻止または低減することが所望でありうる。産生細胞系に対して毒性でありうる導入遺伝子の例は、アポトーシス促進性遺伝子およびサイトカイン遺伝子である。導入遺伝子産物が毒性でありうる場合に、ウイルスベクターを産生させるための、複数の誘導的プロモーター系が利用可能である。本開示の組成物および方法は、プロモーター配列、調節配列、および導入遺伝子の任意の適切な組合せを提供する。場合によって、配列の組合せは、細胞に対する毒性を結果としてもたらさない可能性がある。場合によって、配列の組合せは、細胞に対する高い毒性を結果としてもたらす可能性もある。場合によって、配列の組合せは、細胞内で中等レベルの毒性を結果としてもたらす可能性もある。

0204

エクジソン系(Invitrogen、Carlsbad、Calif)は、導入遺伝子を発現させるための1つのこのような系である。この系は、哺乳動物細胞内の対象の遺伝子の発現の調節を可能とするようにデザインされている。エクジソン系は、導入遺伝子の基礎レベルの発現であるが、200倍を超える誘導性を伴う発現を可能とする、緊密に調節された発現機構からなる。エクジソン系は、Drosophila属のヘテロ二量体のエクジソン受容体に基づき、エクジソンまたはムリステロンAなどの類似体が、受容体に結合すると、受容体がプロモーターを活性化させて、下流における導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのmRNA転写物が得られる。この系では、ヘテロ二量体の受容体のうちの単量体のいずれもが、1つのベクターから構成的に発現するのに対し、対象の遺伝子の発現を駆動するエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にある。この種類の系の、対象の遺伝子移入ベクターへの操作は、本開示の組成物および方法において使用することができる。次いで、対象の遺伝子と受容体の単量体とを含有するプラスミドを、産生細胞系へと共トランスフェクションすれば、潜在的に毒性の導入遺伝子を発現させずに、遺伝子移入ベクターの産生が可能となるであろう。適切な時点で、エクジソンまたはムリステロンAにより、導入遺伝子の発現を活性化しうるであろう。

0205

一部の状況では、遺伝子治療ベクター内の導入遺伝子の発現を調節することが所望でありうる。例えば、所望の発現レベルに応じて、活性の強度を変化させる、異なるウイルスプロモーターを利用することができる。哺乳動物細胞内の、CMV前初期遺伝子プロモーターを使用して、強い転写の活性化をもたらすことができる。低レベルの導入遺伝子の発現が所望される場合にはまた、それほど強力ではないCMVプロモーターの修飾形も使用されている。造血細胞内の導入遺伝子の発現が所望される場合は、MLVまたはMMTVに由来するLTR(長末端反復:long terminal repeat)などのレトロウイルスプロモーターを使用することが多い。所望の効果に応じて使用されうる他のウイルスプロモーターは、SV40、RSVLTR、HIV−1 LTRおよびHIV−2 LTR、E1A領域、E2A領域、またはMLP領域に由来するアデノウイルスプロモーターなどのアデノウイルスプロモーター、AAV LTR、カリフラワーモザイクウイルス、HSV−TK、およびニワトリ肉腫ウイルスを含む。

0206

一部の態様では、標的とされない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない作用を低減するように、組織特異的プロモーターを使用して、特異的な組織内または細胞内で転写させる。例えば、PSA、プロバシン前立腺酸性ホスファターゼ、または前立腺特異的腺性カリクレイン(hK2)などのプロモーターを使用して、前立腺内の遺伝子発現を標的化することができる。

0207

場合によって、プロモーターまたは調節配列エレメントを使用して、眼細胞内または眼組織内の選択的発現を指示することができる。例えば、網膜色素上皮細胞などの特異的な眼細胞型内で見出されるプロモーター、配列エレメント、または調節配列は、適切な発現構築物(例えば、RPE65プロモーターまたはVMD2プロモーター)において使用することができる。

0208

適切なプロモーターの選択は、たやすく達成することができる。場合によって、高発現または強いプロモーターを使用することができる。適切なプロモーターの例は、763塩基対のサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターである。ラウス肉腫ウイルス(RSV)(Davisら、Hum Gene Ther、4巻:151頁(1993年))およびMMTプロモーターもまた、使用することができる。ある種のタンパク質は、それらの天然のプロモーターを使用して発現させることができる。エンハンサーなど、発現を増強しうる他のエレメント、またはtat遺伝子およびtarエレメントなど、高レベルの発現を結果としてもたらしうる系もまた、組み入れることができる。次いで、このカセットを、ベクター、例えば、pUC19、pUC118、pBR322、または、例えば、E.coliの複製起点を含む、他の公知のプラスミドベクターなどのプラスミドベクターへと挿入することができる。Sambrookら、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory press(1989年)を参照されたい。プロモーターは、前出において論じられている。プラスミドベクターはまた、マーカーポリペプチドが、処置される生物の代謝に有害な影響を及ぼさないという条件で、アンピシリン耐性についてのβ−ラクタマーゼ遺伝子などの選択用マーカーも含みうる。カセットはまた、参照により本明細書に組み込まれる、WO95/22618において開示されている系など、合成による送達系内で、核酸結合性部分へと結合させることもできる。一般に、プロモーター配列および/または任意の関連する調節配列は、少なくとも約150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、または10000bpを含みうる。プロモーター配列および任意の関連する調節配列は、最大で約150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、5000bp、または10000bpを含みうる。

0209

一部の態様では、組換えウイルスまたはプラスミドは、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーター、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター、およびMMTプロモーター、EF−1アルファプロモーター、UB6プロモーター、ニワトリベータ−アクチンプロモーター、CAGプロモーター、RPE65プロモーター、およびオプシンプロモーターから選択されるプロモーターを含む。一般に、本開示により提供されるプロモーター配列およびプロモーター/エンハンサー配列は、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号340、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、および配列番号47から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。

0210

一部の態様では、抗生剤マーカーを、組換えウイルスを産生させるための過程において使用する。組換えウイルスを生成するときに、抗生剤耐性マーカーを使用して、陽性のトランスジェニック細胞を同定することができる。一部の態様では、抗生剤マーカーは、図8Aおよび図8Bに示される配列を含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される配列など、抗生剤耐性遺伝子をコードする配列を含む。例えば、耐性を付与するマーカーは、カナマイシン、ゲンタマイシン、アンピシリン、クロラムフェニコールテトラサイクリンドキシサイクリン、またはハイグロマイシンを含みうるがこれらに限定されない。一部の態様では、抗生剤耐性遺伝子は、カナマイシンなど、非ベータ−ラクタム抗生剤耐性遺伝子である。

0211

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供される複製起点配列などの複製起点配列をコードする配列を含む。複製起点配列は一般に、プラスミドを繁殖させるのに有用な配列を提供する。一般に、本開示により提供される複製起点配列は、図7A図7B図7Cおよび図7Dに提供される配列から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。

0212

一部の態様では、起点配列または複製起点配列は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、または配列番号17などの配列を含みうるがこれらに限定されない。

0213

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供されるエンハンサーなどのエンハンサーを含む。

0214

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供され、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第7635474号において開示されている、キメライントロンまたはイントロンなどのキメライントロンまたはイントロン105を含む。本明細書では、イントロンまたはキメライントロンを互換的に使用することができる。場合によって、イントロンは、転写される可能性はあるが翻訳されない任意の配列を指す場合がある。場合によって、イントロンは、転写される可能性はあるが細胞内の成熟RNA転写物からは除去される任意の配列を指す場合がある。場合によって、イントロンは、少なくとも約1bp、50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、または5000bpを含みうる。場合によって、イントロンは、少なくとも約1bp、50bp、100bp、150bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1000bp、2000bp、3000bp、4000bp、または5000bpを含みうる。場合によって、イントロンは、約300bpでありうる。場合によって、イントロンは、約200〜400bpでありうる。場合によって、キメライントロンは、約100〜500bpでありうる。場合によって、イントロンは、約50〜200bpでありうる。場合によって、イントロンは、無傷の自然発生のイントロンまたはキメライントロンでありうる。

0215

一部の態様では、イントロンは、配列番号48、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118、配列番号119、または配列番号120などの配列を含みうるがこれらに限定されない。

0216

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、本明細書で提供されるポリA(ポリアデニル化)配列(例えば、SV40ポリA配列)などのポリA(ポリアデニル化)配列107を含む。一般に、導入遺伝子(すなわち、sFLT−1)の所望の発現のための、任意の適切なポリA配列を使用することができる。例えば、場合によって、本開示は、SV40ポリA配列またはSV40ポリA配列の一部を含む配列を提供する。場合によっては、ヒトゲノム配列において見出される、ヒトsFLT−1遺伝子の下流に見出される天然のポリA配列(3’UTR)を使用することができる。他の場合には、sFLT−1以外の遺伝子の下流に見出されるポリA配列を使用することができる。他の場合には、本開示は、1または複数のポリA配列またはポリA配列エレメントの組合せを含むポリA配列を提供する。場合によっては、ポリA配列を使用しない。場合によって、1または複数のポリA配列は、非翻訳領域(UTR:untranslated region)、3’UTR、または終結配列と称する場合がある。

0217

本開示のある特定の態様では、内部リボソーム進入部位(IRES:internal ribosome entry site)または口蹄病ウイルス(FMDV:foot−mouth disease virus)エレメントを使用して、多重遺伝子またはポリシストロニックのメッセージを創出することができる。IRESエレメントは、5’メチル化キャップ依存型翻訳のリボソーム走査モデルを迂回し、内部部位で翻訳を始めることが可能である。ピコルナウイルスファミリーの2つのメンバーポリオウイルスおよび脳心筋炎ウイルス)に由来するIRESエレメントのほか、哺乳動物メッセージに由来するIRESも記載されている。IRESエレメントは、異種オープンリーディングフレームへと連結することができる。各々がIRESにより隔てられた複数のオープンリーディングフレームは、併せて転写して、ポリシストロニックのメッセージを創出することが可能である。IRESエレメントにより、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセス可能となりうる。単一のメッセージを転写するように、単一のプロモーター/エンハンサーを使用して、複数の遺伝子を効率的に発現させることができる。遺伝子治療の送達ベクターにおいて2つのタンパク質を共発現させるための代替的な系は、FMDV 2A系である。FMDV 2A系は、2つの遺伝子をピコルナウイルスの口蹄病ウイルスに由来する2A配列をコードするヌクレオチドへ配列と連結しうる、レトロウイルスによるプラスミドベクターを援用する。転写および翻訳は、バイシストロニックのmRNAおよび2つの独立のタンパク質産物をもたらす。

0218

任意の異種オープンリーディングフレームを、IRESエレメントへと連結することができる。これは、独立の遺伝子によりコードされる分泌タンパク質であるマルチサブユニットタンパク質である、細胞内タンパク質または膜結合タンパク質および選択用マーカーの遺伝子を含みうる。この様式で、複数のタンパク質の発現を、単一の構築物および単一の選択用マーカーにより、細胞へと同時に操作することができる。

0219

ポリA配列は、1〜10bp、10〜20bp、20〜50bp、50〜100bp、100〜500bp、500bp〜1Kb、1Kb〜2Kb、2Kb〜3Kb、3Kb〜4Kb、4Kb〜5Kb、5Kb〜6Kb、6Kb〜7Kb、7Kb〜8Kb、8Kb〜9Kb、および9Kb〜10Kbの長さを含みうる。ポリA配列は、少なくとも1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。ポリA配列は、最大で1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。

0220

場合によって、ポリA配列または終結配列は、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、および配列番号55などの配列を含みうるがこれらに限定されない。

0221

一般に、本開示により提供されるポリA配列は、図9Aおよび図9Bに提供されるポリA領域1〜10から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。

0222

場合によって、ポリA配列は、細胞内の導入遺伝子のmRNAの半減期、導入遺伝子のmRNAの安定性、または転写の調節を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、ポリA配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物を増大させ、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、ポリA配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の半減期を短縮し、この結果としてタンパク質の発現を減少させることができる。

0223

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、ヒトsFLT−1タンパク質またはその機能的断片をコードするポリヌクレオチドを含む。場合によって、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、別の抗VEGFタンパク質またはVEGF阻害剤をコードする核酸を含む。

0224

場合によって、VEGF阻害剤は、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、または配列番号122などの配列を含みうるがこれらに限定されない。

0225

場合によって、VEGF阻害剤の核酸は、配列番号109、または配列番号121などのポリペプチド配列を含みうるがこれらに限定されないポリペプチド配列をコードしうる。

0226

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、眼細胞内のsFLT−1タンパク質の選択的発現を指示することが可能な調節性核酸断片を含む。場合によって、眼細胞は、網膜色素上皮細胞(RPE)を含みうる。

0227

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、1または複数の非翻訳領域(UTR)またはUTR配列を含みうる。一般に、導入遺伝子(すなわち、sFLT−1)の所望の最適な発現のために、任意の適切なUTR配列を使用することができる。例えば、場合によって、UTR領域またはUTR配列は、天然の配列を含みうる。場合によって、UTR配列は、ヒトゲノム配列またはその一部において見出されるヒトsFLT−1遺伝子の上流(5’UTR)または下流(3’UTR)に見出される配列でありうる。他の場合には、UTR配列は、sFLT−1以外の遺伝子の上流または下流に見出される非天然の配列などの非天然の配列を含む場合もあり、本明細書でさらに記載される1または複数のUTR配列エレメントの組合せをさらに含む配列含む場合もある。場合によって、5’UTR配列だけを使用する。場合によって、3’UTR配列だけを使用する。場合によって、UTR配列は使用しない。

0228

UTR配列は、1〜10bp、10〜20bp、20〜50bp、50〜100bp、100〜500bp、500bp〜1Kb、1Kb〜2Kb、2Kb〜3Kb、3Kb〜4Kb、4Kb〜5Kb、5Kb〜6Kb、6Kb〜7Kb、7Kb〜8Kb、8Kb〜9Kb、および9Kb〜10Kbの長さを含みうる。UTR配列は、少なくとも1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。UTR配列は、最大で1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。

0229

一般に、本開示により提供されるUTR配列は、配列番号91、配列番号2、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、および配列番号101を含むがこれらに限定されない任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。

0230

場合によって、5’UTRおよび/または3’UTRの変化形は、所望のレベルのタンパク質の発現について最適化することができる。場合によって、3’UTR配列は、細胞内の導入遺伝子のmRNAの半減期、導入遺伝子のmRNAの安定性もしくは二次構造、または条件的調節(例えば、翻訳をモジュレートする多様な因子の結合)を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、3’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の半減期を延長し、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、3’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の半減期を短縮し、この結果としてタンパク質の発現を減少させることもできる。

0231

一般に、3’UTR配列は、多様な配列エレメントを含みうる。本開示は、1または複数のポリアデニル化シグナル、リンカー配列、スペーサー配列、SECISエレメント、AUに富む配列もしくはARE配列またはmiRNA結合性配列もしくはRNAi結合性配列、転写ターミネーター配列3’終結配列またはそれらの変異体および/もしくは組合せなどの配列エレメントを含みうるがこれらに限定されない、3’UTR配列を提供する。

0232

場合によって、5’UTR配列は、細胞内の導入遺伝子のmRNAの半減期、導入遺伝子のmRNAの安定性もしくは二次構造、または転写の調節を含むがこれらに限定されない、タンパク質の発現に影響を及ぼす多様なパラメータについて最適化することができる。例えば、5’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の翻訳効率を増大させ、この結果としてタンパク質の発現を増大させることができる。場合によって、5’UTR配列を変化させて、導入遺伝子のmRNA転写物の翻訳効率を減少させ、この結果としてタンパク質の発現を減少させることができる。

0233

一般に、5’UTR配列は、多様な配列エレメントを含みうる。本開示は、1または複数のリボソーム結合性部位(RBS)、リンカー配列、スペーサー配列、調節配列、調節応答エレメント、リボスイッチ、翻訳開始を促進または阻害する配列、mRNA輸送のための調節配列またはそれらの変異体および/もしくは組合せなどの配列エレメントを含みうるがこれらに限定されない、5’UTR配列を提供する。

0234

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、1または複数のリンカー配列またはスペーサー配列を含みうる。本明細書で記載されるリンカー配列またはスペーサー配列は、互換的に使用することができる。一般に、リンカー配列またはスペーサー配列は、少なくとも2つの配列エレメントの間の非隣接配列を創出するのに使用される任意の適切な配列でありうる。例えば、本開示の一態様では、リンカー配列は、図1Aに反映される通り、ITR−1(108)配列、またはITR−2(103)、および抗生剤耐性遺伝子配列106の間に挿入されて見出されうる。別の例では、リンカー配列は、ITR配列、プロモーター配列もしくはプロモーター/エンハンサー配列、イントロン配列、導入遺伝子配列、およびポリA領域配列を含む、組換えウイルスまたは組換えウイルスをコードするプラスミドの任意の配列エレメントに隣接させて挿入することができる。一般に、任意の適切なリンカー配列またはスペーサー配列を使用して、非隣接配列を創出することができる。例えば、場合によっては、リンカー配列は、ランダムに生成された配列でありうる。場合によって、リンカー配列は、タンパク質の発現に有害な影響を及ぼしうる二次構造または分子内相互作用の形成を防止するように最適化された、非特異的な配列でありうる。場合によって、リンカー配列は、イントロン、調節配列、エンハンサーなどを含むがこれらに限定されない、任意のさらなる機能的配列エレメントを含みうる。リンカー配列内の機能的エレメントを、ウイルスの所望の最適な産生および/または導入遺伝子の発現のために使用することができる。場合によって、リンカー配列は、クローニング部位先行するクローニング部位の残余部分、または他の重要でない配列であり、任意の2つの配列エレメントの間におけるこのようなリンカーの挿入は必要に応じてである。

0235

一般に、本開示により提供されるリンカー配列は、図9D図9E、および図9Fに提供される配列から選択される任意の配列を含みうるがこれらに限定されない。

0236

場合によって、リンカー配列の長さは、ウイルスの所望の最適な産生および/または導入遺伝子の発現のために最適化することができる。場合によって、ウイルスゲノム内またはプラスミド内の1または複数の部位に配置される1または複数のリンカー配列の長さは、所望の最適なタンパク質の発現をもたらすように変化させることができる。例えば、リンカー配列は、本明細書で記載されるイントロンと導入遺伝子(すなわち、sFLT−1)との間に見出すことができる。細胞内の導入遺伝子の転写および後続の翻訳に対する効果を変化させるように、リンカー配列の長さを変化させることができる。

0237

リンカー配列は、1〜10bp、10〜20bp、20〜50bp、50〜100bp、100〜500bp、500bp〜1Kb、1Kb〜2Kb、2Kb〜3Kb、3Kb〜4Kb、4Kb〜5Kb、5Kb〜6Kb、6Kb〜7Kb、7Kb〜8Kb、8Kb〜9Kb、および9Kb〜10Kbの長さを含みうる。リンカー配列は、少なくとも1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。リンカー配列は、最大で1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、6bp、7bp、8bp、9bp、10bp、20bp、30bp、40bp、50bp、60bp、70bp、80bp、90bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp、1Kb、2Kb、3Kb、4Kb、5Kb、6Kb、7Kb、8Kb、9Kb、および10Kbの長さを含みうる。

0238

場合によって、リンカー配列またはスペーサー配列は、配列番号60、配列番号61、配列番号62、配列番号63、配列番号64、配列番号65、配列番号66、配列番号67、配列番号68、配列番号69、配列番号70、配列番号71、配列番号72、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、および配列番号90を含みうるがこれらに限定されない。

0239

一部の態様では、組換えウイルスは、組換え遺伝子発現カセットを、ウイルスベクターのビリオンへとパッケージングするために使用される逆位末端配列(ITR)を含む。場合によって、ITRは、アデノ随伴ウイルス(AAV)に由来する。場合によって、ITRは、AAV血清型2に由来する。場合によって、ITRは、配列番号56、配列番号57、配列番号58、または配列番号59を含みうるがこれらに限定されない。

0240

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、以下:a)第1のITR配列;b)プロモーター配列;c)イントロン配列;d)第1のUTR配列;e)VEGF阻害剤をコードする配列;f)第2のUTR配列;g)ポリA配列;およびh)第2のITR配列の順序で核酸エレメントを含む。組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドの一部の態様では、プロモーター配列は、プロモーター/エンハンサー配列を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤をコードする配列は、ヒトsFLT−1タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。他の態様では、組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、複製起点配列102をさらに含む。一部の態様では、プラスミドは、本明細書で提供される抗生剤耐性遺伝子の配列をさらに含む。

0241

一部の態様では、組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、以下:a)第1のITR配列;b)第1のリンカー配列;c)プロモーター配列;d)第2のリンカー配列;e)イントロン配列;f)第3のリンカー配列;g)第1のUTR配列;h)VEGF阻害剤をコードする配列; i)第2のUTR配列;j)第4のリンカー配列;k)ポリA配列;l)第5のリンカー配列;およびm)第2のITR配列の順序で核酸エレメントを含む。組換えウイルスおよび/または組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドの一部の態様では、プロモーター配列は、プロモーター/エンハンサー配列を含む。一部の態様では、VEGF阻害剤をコードする配列は、ヒトsFLT−1タンパク質またはその機能的断片をコードする配列を含む。他の態様では、組換えウイルスを生成するのに使用されるプラスミドは、複製起点配列をさらに含む。一部の態様では、プラスミドは、本明細書で提供される抗生剤耐性遺伝子の配列をさらに含む。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ