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課題

全てのストレプトコッカスニューモニエ(S.ニューモニエ)株に対して防御をもたらすことができる、S.ニューモニエが原因の疾患の予防および治療用の安全で有効なワクチンがないこと(万能肺炎球菌ワクチンがないこと)。

解決手段

:ストレプトコッカス・ニューモニエの保存タンパク質免疫原性エピトープ:PspA、Spr1895、およびPsaA、ならびに安全なアジュバントとして機能するフラゲリン成分(FliC1、FliC2)、および従って、これらのアミノ酸配列に従って60%以上相同のタンパク質もしくはペプチド相同体からなり、これらが可動性リンカーを介して融合している、キメラタンパク質に基づくワクチンを提供する。安全、有効、しかも予防および治療の両方の効果が示される。

概要

背景

ハイブリッド(またはキメラタンパク質」という用語は、複数の異なる遺伝子のコード配列を1つの読み枠に結合させた組換えDNA分子発現の結果として得られるタンパク質を示す。

肺炎同義語発熱)は、成人および子供のどちらにもよく見られる疾患であり、入念な診断および治療を必要とする。医療統計によれば、毎年百万人を超えるロシア人が肺炎にかかっており、患者の5%は、この疾患により命を落としている(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/ru/index.html)。

「肺炎」という用語は、広範囲の疾患を示し、肺炎に含まれる疾患のそれぞれが、疾患独自の病因発症機序、臨床像、X線特性、検査値、および専用療法を有し、そして独立した疾患として、または他の疾患から続発するものとして進行する可能性がある。

肺炎とは、ヒト呼吸器系の炎症状態である。肺炎の原因物質には、ウイルスおよび真菌もあるが、この疾患は、細菌により引き起こされることが最も多い。細菌性肺炎を引き起こす最も一般的な病原は、肺炎球菌(S.ニューモニエ)である。咽頭細菌叢検査から、健常者の5〜25%は肺炎球菌の保菌者であることが明らかになった。

肺炎球菌は、厚い多糖莢膜を特徴とし、この莢膜は、微生物を、オプソニン化およびそれに続く食作用から保護している。肺炎球菌にとって莢膜が免疫系に認識される主要な表面構造となるという事実の結果、莢膜の多糖類は非常に高い変異性を特徴とする。現在までに、91種類の異なる莢膜型の肺炎球菌が検出されている;しかしながら、侵襲性肺炎球菌疾患の大部分(90%超)は、特に広汎な23種類の血清型のものにより引き起こされる。莢膜の多糖類に非常に多数の免疫学的変異が存在するということが、有効な多糖類ワクチンの製造を複雑にする要因となっている。

全ての人に肺炎球菌感染症に罹る可能性があるが、リスク群がいくつか存在し、リスク群ではこの疾患に罹りやすくなる。そのようなリスク群とは、65以上の人、小さい乳児、特定の健康上の問題を抱えている人、免疫系が弱っている人、喫煙者である。

多くの場合、肺炎球菌感染症は治療があまり奏功せず、その一方で、流行を繰り返す多数の肺炎球菌株は複数の抗生物質耐性を発現する。予防目的で、ワクチンが用いられる。WHO(世界保健機構)およびロシア呼吸器学会によれば、「ワクチンが、肺炎球菌感染経路を防ぐ唯一の可能性である」。最近、FDA食品医薬品局)が、2種類のワクチンを承認した:肺炎球菌結合型ワクチンおよび肺炎球菌多糖類ワクチンである(http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/pneumococcalinfections.html)。ロシア連邦では、以下のワクチンが承認されている:Pneumo23(PPSV23)−Sanofi Pasteur(France)製の23価肺炎球菌多糖類ワクチン、およびPrevenar(登録商標)(PCV7)−Wyeth Pharmaceuticals Inc.(USA)製の7価抱合型肺炎球菌多糖類ワクチン。

肺炎球菌多糖類ワクチン(PPSV)は、成人向けである。PPSVをワクチン接種した成人の大部分は、接種から2〜3週間後に、大部分の細菌株に対する抵抗力を発現する(それらの抗原がワクチンに存在している)。高齢者、2歳未満の子供、および慢性疾患を有する人の中では、ワクチン接種は、持続的な免疫性の発生を導かないか、またはこの疾患に対する免疫性が完全には発現されない可能性がある(http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/languages/pneumococcalinfections.html#Russian)。そのうえ、ワクチン接種は、紅斑注射部位発痛、発熱、筋肉痛、または重篤局所反応などの合併症を引き起こす可能性がある(DonalisioMR, RodriguesSM, Mendes ET, Krutman M. Adverse events after pneumococcal vaccination. J Bras Pneumol. 2007 Feb;33(1):51−6)(非特許文献1)。

しかしながら、PPSVは、肺炎球菌疾患にかかるリスクの低い人々の間でのみ顕著に有効であることがわかった。2歳未満の子供の場合、ワクチン接種の間、抗生物質での同時予防を採用することが推奨される(Bacle A, Diot P, Lemarie E. Anti−pneumococcal vaccine: justifications and results. Rev Pneumol Clin. 1997;53(3):128−37)(非特許文献2)。

PPSVは、肺炎の発生率およびその致死率下げることはできず、重篤な肺炎球菌感染症にかかる危険性を下げるだけであったと思われる。現行のワクチンでは、高濃度ペニシリンでなければ効かない肺炎球菌株を防ぐことができなかったことも示された(Pneumococcal vaccine:a second look. Solution for SC orIMinjection: pneumococcal vaccine. Prescrire Int. 1998 Feb;7(33):16−8)(非特許文献3)。そのような結果は、65歳を超える人々でも報告された(Pneumococcal vaccination for elderly subjects: license extension. Still no proof of clinical efficacy. Prescrire Int. 2000 Aug;9(48):106−9)(非特許文献4)。

PPSVの活性成分は、肺炎球菌が病因の侵襲性疾患のうち90%までもの原因となっている23種の血清型の連鎖球菌多糖類混合物である。多糖は、T細胞反応に関わる抗原であり、したがって、免疫記憶を形成することなく、短期免疫化だけを発現させる;上記の成分のみを含有するワクチンは、有効ではなく、そのことは2歳未満の子供で示されている(Greenwood B M et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74:756−760;国際出願公開第2010120921号、優先日2009年4月16日)(非特許文献5および特許文献1)。肺炎球菌に90種を超える血清型が存在するという事実もまた、感染病原体世界各地によって様々に異なることから、万能多糖類系ワクチンの製造を複雑にしている。

子供で最も頻繁に疾患を引き起こす7種の肺炎球菌血清型の多糖類を用いた、子供用結合型ワクチンは、キャリアタンパク質CRM197(ジフテリア毒素変異体)を含有しており、このタンパク質はアジュバント役割を果たす。ワクチンにアジュバントが存在するため、この抗原複合体は、持続性免疫を保証するT細胞によく認識される(Schneerson R, Barrera O, Sutton A, RobbinsJB. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide−protein conjugates. J Exp Med. 1980 Aug 1;152(2):361−76)(非特許文献6)。CRM197は、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)と結合する。CRM197の毒性がジフテリア毒素の毒性の約106倍に弱まっているという事実にも関わらず、その使用は、特に高用量のときには、注意が必要である(Takuya Kageyama, Minako Ohishi1, Shingo Miyamoto, Hiroto Mizushima, Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada. Diphtheria Toxin Mutant CRM197 Possesses Weak EF2−ADP−ribosyl Activity that Potentiates its Anti−tumorigenic Activity. Received April 16, 2007. Accepted May 2, 2007)(非特許文献7)。それに加えて、ワクチン接種は、以下の合併症を引き起こす可能性がある:紅斑、注射部位での皮膚痛および硬化体温の38〜39℃(100.4〜102.2°F)への上昇、ならびに焦燥感、眠気、および食欲減少。そのうえ、2歳齢なら4回、2〜5歳の年齢では子供の年齢に応じた回数で、接種することが推奨される。子供にワクチン接種するのに、合計で、少なくとも4回の投与が必要であるが、これは費用がかかるとともに安全ではない。

ワクチンは、2種類の主成分を含有することが知られている:N.メニンギティディス表在性多糖およびS.ニューモニエのPsaA−タンパク質である(PspA−タンパク質も使用することができる)(国際出願公開第2010120921号、優先日2009年4月16日)(特許文献1)。多糖類に対して免疫記憶を発現することが不可能であることを考慮すると、ワクチン成分にN.メニンギティディスの表在性多糖を利用するのは不適切であると思われる。次にPsaAおよびPspAタンパク質については、それらの利用は、理にかなっている:それらは、肺炎球菌の表在性抗原であり、免疫応答および免疫記憶の両方を誘導することができる。

特許請求しようとしているワクチンの効果は、強力な免疫応答の誘導およびそれに続く免疫記憶の発現に基づいている。したがって、本発明の中心を占めるのは、多糖類ではなく、分子生物学および組換えDNAに基づく方法を用いて得られる肺炎球菌タンパク質である。文献のデータによれば、最も有望なタンパク質系抗原は、以下の3種の表在性タンパク質である:PsaA、PspA、Spr1895。

PsaA−タンパク質は、国際出願公開第2004102199号(優先日2003年5月16日)(特許文献2)の著者らによっても、有望な免疫源であると見なされている。この著者らは、PsaAタンパク質および他の複数のタンパク質(SlrA(すなわちリポタンパク質ロタマーゼ)、IgA1(すなわちプロテアーゼ)、PpmA(すなわち連鎖球菌成熟化タンパク質))またはそれらの複合物を、ワクチン製造の主成分として述べている。しかしながら、本発明者らは、S.ニューモニエが持つ他の表在性タンパク質(PsaA、PspA、およびSpr1895以外)を使用するアプローチの方が有望であると考える。

コレラ毒素のPsaAおよびBサブユニットをアジュバント機能と共に含有するキメラタンパク質が記載されている(AreasAP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, HoPL. Expression and characterization of cholera toxin B−pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB−PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Aug 13;321(1):192−6)(非特許文献8)。しかしながら、ワクチン成分としてコレラ毒素またはその複合物を使用することは、フラゲリンに比べて安全性が劣ると思われる、一方で人体はコレラ毒素に対して非常に敏感であるので、たった8μgの毒素でもひどい下痢を引き起こす可能性がある。

研究により、肺炎球菌ワクチンを作るための主成分にPsaAタンパク質およびPspAタンパク質を用いることは理にかなっていることがわかった。PsaAタンパク質は、様々な血清型の肺炎球菌の間で高度に保存されており、細菌接着および細菌の病原性をもたらしている(Berry AM, and Paton JC: Sequence heterogeneity of PsaA, a 37−kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 1996;64:5255−5262)(非特許文献9)。PsaA特異的抗体が、S.ニューモニエの全ての血清型に対して架橋活性を有することが、わかった。

PspAは、コリン結合性表面抗原であり、この抗原は、補体独立性食作用を阻害し、ラクトフェリンと結合し、また細菌細胞のラクトフェリン独立性排除を防ぐ(Hammerschmidt S, Bethe G, Remane PH, Chhatwal GS(1999) Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin−binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 67:1683−1687)(非特許文献10)。この論文では、PsaA−タンパク質がワクチンの製造に有望であると述べられている。著者らは、また、肺炎球菌感染症に対するワクチンを製造する候補として幅広いタンパク質を示している;しかしながら、本発明者らは、2種の特定のタンパク質、PsaAおよびPspAが肺炎球菌の複数の血清型の間で、および他の細菌の間でも保存されていることを考慮して、PsaAおよびPspAを使用することが理にかなっていると考える。

提案するワクチンの主成分の1つは、リン酸結合タンパク質、すなわちリン酸ABC輸送体の遺伝子がコードするSpr1895タンパク質である。このタンパク質は、細菌の生存能および定常性に必須であり、このことから、このタンパク質は、S.ニューモニエが原因の疾患に対する肺炎球菌ワクチンの製造に選択される成分となっている。

本発明では、フラゲリンタンパク質(FliC)がアジュバントの機能を果たす。FliCとToll様受容体5(TLR−5)との相互作用おかげで、FliCは、マクロファージおよび樹状細胞の成熟を刺激し、その結果、免疫応答が発達する(Mc Dermott P.F..High−affinity interaction between Gram−negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun. −2000. −V.68. −p.:5525−5529; Means T.K. et al. The Toll−like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J.Immunol. −2003. −V.170. −p.:5165−5175)(非特許文献11および12)。

現在、フラゲリンは、最も有望で十分に特性決定なされた次世代アジュバントであると見なされている。調査の結果から、フラゲリンと一緒注入された遺伝子組換えタンパク質は、向上した免疫原性および抗原性特性を保持することが示されている。それらに対する反応が記録されるのも早くなるし、もたらされる細胞性および体液性免疫応答も強くなる(Balaram, 2008)。

本発明では、フラゲリン成分がアジュバントとして機能し得ることが示される。2つの受容体活性ドメインが、フラゲリンの末端領域で発見されている(79−117番アミノ酸および408−439番アミノ酸)(Tonyia, 2001)。

つまり、フラゲリンの限定的成分を使用するアプローチは理にかなっている(FliCドメイン1、FliCドメイン2)。

TLR−5は、自然免疫の細胞、上皮細胞、および内皮細胞の表面で発現する(Sebastiani G. et al. Cloning and characterization of the murine Toll−like receptor 5 (Tlr5) gene: sequence andmRNAexpression studies in Salmonella−susceptibleMOLF/Eimice. Genomics. −2000. −V.64. −p.230−240; Zarember K.A. and Godowski P.J. Tissue expression of human Toll−like receptors and differential regulation of Toll−like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunol. −2002. −V.168. −p.554−561;Delneste, 2007)(非特許文献13および14)。このことを考慮すると、免疫化に粘膜を利用することは理にかなっている、粘膜は免疫原輸送を顕著に促進する。

このようにして、国際公開第WO2004102199号(特許文献2)に記載される発明および上記論文に記載されるコンストラクトCTB−PsaAは、本発明と最も似通っていると言うことができる。しかしながら、上記国際出願では、タンパク質またはその機能ユニットを、独立したワクチン成分として用いることが提案されている。本発明は、さらに、キメラタンパク質に基づいており、このキメラタンパク質は、その特定S.ニューモニエタンパク質構成成分を除いて、アジュバントも含む。したがって、本発明の原型は、ブラジルの著者らが記載したキメラタンパク質である。

キメラタンパク質CTB−PsaAは、血清型6BのS.ニューモニエのPsaA(289番アミノ酸)ならびにアジュバントとしてコレラ毒素の機能を持つBサブユニットを含む(AreasAP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, HoPL. Expression and characterization of cholera toxin B−pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB−PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Aug 13;321(1):192−6)(非特許文献8)。しかしながら、正しい分子折り畳みを提供するためには、全長タンパク質ではなくてタンパク質断片、すなわち抗原性決定基を用いる方がより有益で簡単である。まさにこのアプローチ(最も免疫原性のあるタンパク質断片の利用)を用いて、本発明はなされた。本発明者らはまた、ワクチン成分にコレラ毒素またはその成分を使用することは、フラゲリンと比較して安全性が低いと考える、なぜなら、人々はコレラ毒素に対して非常に敏感であるので、たった8μgの毒素でもひどい下痢を引き起こす可能性がある。このキメラタンパク質の製造方法については、PsaAタンパク質をコードする遺伝子をプラスミドとは別に増幅し(プラスミドに遺伝子を後から挿入し)、続いてCTBコード遺伝子を含有するベクター制限酵素部位を介してクローン化した。本発明者らの場合、キメラタンパク質をコードする全長遺伝子の合成を用いた。

概要

全てのストレプトコッカス・ニューモニエ(S.ニューモニエ)株に対して防御をもたらすことができる、S.ニューモニエが原因の疾患の予防および治療用の安全で有効なワクチンがないこと(万能肺炎球菌ワクチンがないこと)。 :ストレプトコッカス・ニューモニエの保存タンパク質の免疫原性エピトープ:PspA、Spr1895、およびPsaA、ならびに安全なアジュバントとして機能するフラゲリン成分(FliC1、FliC2)、および従って、これらのアミノ酸配列に従って60%以上相同のタンパク質もしくはペプチド相同体からなり、これらが可動性リンカーを介して融合している、キメラタンパク質に基づくワクチンを提供する。安全、有効、しかも予防および治療の両方の効果が示される。なし

目的

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請求項1

ストレプトコッカスニューモニエタンパク質の断片:PspA(160−262番アミノ酸、gb|EHD89266.1|)、Spr1895(94−161番アミノ酸、ref|ZP_01836139.1|)、およびPsaA(238−309番アミノ酸、gb|AAF70667.1|)、ならびにアジュバントとして機能するフラゲリン成分(1−169番アミノ酸、gb|AAB33952.1|および311−405番アミノ酸、gb|AAB33952.1|)、および従って、これらのアミノ酸配列に従って60%以上相同の該タンパク質もしくは該ペプチド相同体を含有し、これらが可動性リンカーを介して融合している、キメラタンパク質(配列番号1)に基づく、ストレプトコッカス・ニューモニエに対する肺炎球菌ワクチン

請求項2

前記キメラタンパク質(請求項1)をコードする組換えDNAを製造し、該DNAを、エシェリヒアコリ細菌細胞において高レベルでの発現をもたらすベクターコンストラクトに挿入し、該ベクターコンストラクトをエシェリヒア・コリ細菌細胞に移し、該生命体で該キメラタンパク質を産生させ、それを抽出し、精製し、そして生理学的に許容可能なキャリアと混合した結果、製造されることを特徴とする、請求項1に記載の肺炎球菌ワクチン。

技術分野

0001

本発明は、医薬薬理学生命工学に関連するもので、肺炎球菌ストレプトコッカスニューモニエ(S.ニューモニエ))による肺炎の予防および治療両方に用いることができる。

背景技術

0002

ハイブリッド(またはキメラタンパク質」という用語は、複数の異なる遺伝子のコード配列を1つの読み枠に結合させた組換えDNA分子発現の結果として得られるタンパク質を示す。

0003

肺炎(同義語発熱)は、成人および子供のどちらにもよく見られる疾患であり、入念な診断および治療を必要とする。医療統計によれば、毎年百万人を超えるロシア人が肺炎にかかっており、患者の5%は、この疾患により命を落としている(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs331/ru/index.html)。

0004

「肺炎」という用語は、広範囲の疾患を示し、肺炎に含まれる疾患のそれぞれが、疾患独自の病因発症機序、臨床像、X線特性、検査値、および専用療法を有し、そして独立した疾患として、または他の疾患から続発するものとして進行する可能性がある。

0005

肺炎とは、ヒト呼吸器系の炎症状態である。肺炎の原因物質には、ウイルスおよび真菌もあるが、この疾患は、細菌により引き起こされることが最も多い。細菌性肺炎を引き起こす最も一般的な病原は、肺炎球菌(S.ニューモニエ)である。咽頭細菌叢検査から、健常者の5〜25%は肺炎球菌の保菌者であることが明らかになった。

0006

肺炎球菌は、厚い多糖莢膜を特徴とし、この莢膜は、微生物を、オプソニン化およびそれに続く食作用から保護している。肺炎球菌にとって莢膜が免疫系に認識される主要な表面構造となるという事実の結果、莢膜の多糖類は非常に高い変異性を特徴とする。現在までに、91種類の異なる莢膜型の肺炎球菌が検出されている;しかしながら、侵襲性肺炎球菌疾患の大部分(90%超)は、特に広汎な23種類の血清型のものにより引き起こされる。莢膜の多糖類に非常に多数の免疫学的変異が存在するということが、有効な多糖類ワクチンの製造を複雑にする要因となっている。

0007

全ての人に肺炎球菌感染症に罹る可能性があるが、リスク群がいくつか存在し、リスク群ではこの疾患に罹りやすくなる。そのようなリスク群とは、65以上の人、小さい乳児、特定の健康上の問題を抱えている人、免疫系が弱っている人、喫煙者である。

0008

多くの場合、肺炎球菌感染症は治療があまり奏功せず、その一方で、流行を繰り返す多数の肺炎球菌株は複数の抗生物質耐性を発現する。予防目的で、ワクチンが用いられる。WHO(世界保健機構)およびロシア呼吸器学会によれば、「ワクチンが、肺炎球菌感染経路を防ぐ唯一の可能性である」。最近、FDA食品医薬品局)が、2種類のワクチンを承認した:肺炎球菌結合型ワクチンおよび肺炎球菌多糖類ワクチンである(http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/pneumococcalinfections.html)。ロシア連邦では、以下のワクチンが承認されている:Pneumo23(PPSV23)−Sanofi Pasteur(France)製の23価肺炎球菌多糖類ワクチン、およびPrevenar(登録商標)(PCV7)−Wyeth Pharmaceuticals Inc.(USA)製の7価抱合型肺炎球菌多糖類ワクチン。

0009

肺炎球菌多糖類ワクチン(PPSV)は、成人向けである。PPSVをワクチン接種した成人の大部分は、接種から2〜3週間後に、大部分の細菌株に対する抵抗力を発現する(それらの抗原がワクチンに存在している)。高齢者、2歳未満の子供、および慢性疾患を有する人の中では、ワクチン接種は、持続的な免疫性の発生を導かないか、またはこの疾患に対する免疫性が完全には発現されない可能性がある(http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/languages/pneumococcalinfections.html#Russian)。そのうえ、ワクチン接種は、紅斑注射部位発痛、発熱、筋肉痛、または重篤局所反応などの合併症を引き起こす可能性がある(DonalisioMR, RodriguesSM, Mendes ET, Krutman M. Adverse events after pneumococcal vaccination. J Bras Pneumol. 2007 Feb;33(1):51−6)(非特許文献1)。

0010

しかしながら、PPSVは、肺炎球菌疾患にかかるリスクの低い人々の間でのみ顕著に有効であることがわかった。2歳未満の子供の場合、ワクチン接種の間、抗生物質での同時予防を採用することが推奨される(Bacle A, Diot P, Lemarie E. Anti−pneumococcal vaccine: justifications and results. Rev Pneumol Clin. 1997;53(3):128−37)(非特許文献2)。

0011

PPSVは、肺炎の発生率およびその致死率下げることはできず、重篤な肺炎球菌感染症にかかる危険性を下げるだけであったと思われる。現行のワクチンでは、高濃度ペニシリンでなければ効かない肺炎球菌株を防ぐことができなかったことも示された(Pneumococcal vaccine:a second look. Solution for SC orIMinjection: pneumococcal vaccine. Prescrire Int. 1998 Feb;7(33):16−8)(非特許文献3)。そのような結果は、65歳を超える人々でも報告された(Pneumococcal vaccination for elderly subjects: license extension. Still no proof of clinical efficacy. Prescrire Int. 2000 Aug;9(48):106−9)(非特許文献4)。

0012

PPSVの活性成分は、肺炎球菌が病因の侵襲性疾患のうち90%までもの原因となっている23種の血清型の連鎖球菌多糖類混合物である。多糖は、T細胞反応に関わる抗原であり、したがって、免疫記憶を形成することなく、短期免疫化だけを発現させる;上記の成分のみを含有するワクチンは、有効ではなく、そのことは2歳未満の子供で示されている(Greenwood B M et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74:756−760;国際出願公開第2010120921号、優先日2009年4月16日)(非特許文献5および特許文献1)。肺炎球菌に90種を超える血清型が存在するという事実もまた、感染病原体世界各地によって様々に異なることから、万能多糖類系ワクチンの製造を複雑にしている。

0013

子供で最も頻繁に疾患を引き起こす7種の肺炎球菌血清型の多糖類を用いた、子供用結合型ワクチンは、キャリアタンパク質CRM197(ジフテリア毒素変異体)を含有しており、このタンパク質はアジュバント役割を果たす。ワクチンにアジュバントが存在するため、この抗原複合体は、持続性免疫を保証するT細胞によく認識される(Schneerson R, Barrera O, Sutton A, RobbinsJB. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide−protein conjugates. J Exp Med. 1980 Aug 1;152(2):361−76)(非特許文献6)。CRM197は、ヘパリン結合性EGF様増殖因子(HB−EGF)と結合する。CRM197の毒性がジフテリア毒素の毒性の約106倍に弱まっているという事実にも関わらず、その使用は、特に高用量のときには、注意が必要である(Takuya Kageyama, Minako Ohishi1, Shingo Miyamoto, Hiroto Mizushima, Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada. Diphtheria Toxin Mutant CRM197 Possesses Weak EF2−ADP−ribosyl Activity that Potentiates its Anti−tumorigenic Activity. Received April 16, 2007. Accepted May 2, 2007)(非特許文献7)。それに加えて、ワクチン接種は、以下の合併症を引き起こす可能性がある:紅斑、注射部位での皮膚痛および硬化体温の38〜39℃(100.4〜102.2°F)への上昇、ならびに焦燥感、眠気、および食欲減少。そのうえ、2歳齢なら4回、2〜5歳の年齢では子供の年齢に応じた回数で、接種することが推奨される。子供にワクチン接種するのに、合計で、少なくとも4回の投与が必要であるが、これは費用がかかるとともに安全ではない。

0014

ワクチンは、2種類の主成分を含有することが知られている:N.メニンギティディス表在性多糖およびS.ニューモニエのPsaA−タンパク質である(PspA−タンパク質も使用することができる)(国際出願公開第2010120921号、優先日2009年4月16日)(特許文献1)。多糖類に対して免疫記憶を発現することが不可能であることを考慮すると、ワクチン成分にN.メニンギティディスの表在性多糖を利用するのは不適切であると思われる。次にPsaAおよびPspAタンパク質については、それらの利用は、理にかなっている:それらは、肺炎球菌の表在性抗原であり、免疫応答および免疫記憶の両方を誘導することができる。

0015

特許請求しようとしているワクチンの効果は、強力な免疫応答の誘導およびそれに続く免疫記憶の発現に基づいている。したがって、本発明の中心を占めるのは、多糖類ではなく、分子生物学および組換えDNAに基づく方法を用いて得られる肺炎球菌タンパク質である。文献のデータによれば、最も有望なタンパク質系抗原は、以下の3種の表在性タンパク質である:PsaA、PspA、Spr1895。

0016

PsaA−タンパク質は、国際出願公開第2004102199号(優先日2003年5月16日)(特許文献2)の著者らによっても、有望な免疫源であると見なされている。この著者らは、PsaAタンパク質および他の複数のタンパク質(SlrA(すなわちリポタンパク質ロタマーゼ)、IgA1(すなわちプロテアーゼ)、PpmA(すなわち連鎖球菌成熟化タンパク質))またはそれらの複合物を、ワクチン製造の主成分として述べている。しかしながら、本発明者らは、S.ニューモニエが持つ他の表在性タンパク質(PsaA、PspA、およびSpr1895以外)を使用するアプローチの方が有望であると考える。

0017

コレラ毒素のPsaAおよびBサブユニットをアジュバント機能と共に含有するキメラタンパク質が記載されている(AreasAP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, HoPL. Expression and characterization of cholera toxin B−pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB−PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Aug 13;321(1):192−6)(非特許文献8)。しかしながら、ワクチン成分としてコレラ毒素またはその複合物を使用することは、フラゲリンに比べて安全性が劣ると思われる、一方で人体はコレラ毒素に対して非常に敏感であるので、たった8μgの毒素でもひどい下痢を引き起こす可能性がある。

0018

研究により、肺炎球菌ワクチンを作るための主成分にPsaAタンパク質およびPspAタンパク質を用いることは理にかなっていることがわかった。PsaAタンパク質は、様々な血清型の肺炎球菌の間で高度に保存されており、細菌接着および細菌の病原性をもたらしている(Berry AM, and Paton JC: Sequence heterogeneity of PsaA, a 37−kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 1996;64:5255−5262)(非特許文献9)。PsaA特異的抗体が、S.ニューモニエの全ての血清型に対して架橋活性を有することが、わかった。

0019

PspAは、コリン結合性表面抗原であり、この抗原は、補体独立性食作用を阻害し、ラクトフェリンと結合し、また細菌細胞のラクトフェリン独立性排除を防ぐ(Hammerschmidt S, Bethe G, Remane PH, Chhatwal GS(1999) Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin−binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 67:1683−1687)(非特許文献10)。この論文では、PsaA−タンパク質がワクチンの製造に有望であると述べられている。著者らは、また、肺炎球菌感染症に対するワクチンを製造する候補として幅広いタンパク質を示している;しかしながら、本発明者らは、2種の特定のタンパク質、PsaAおよびPspAが肺炎球菌の複数の血清型の間で、および他の細菌の間でも保存されていることを考慮して、PsaAおよびPspAを使用することが理にかなっていると考える。

0020

提案するワクチンの主成分の1つは、リン酸結合タンパク質、すなわちリン酸ABC輸送体の遺伝子がコードするSpr1895タンパク質である。このタンパク質は、細菌の生存能および定常性に必須であり、このことから、このタンパク質は、S.ニューモニエが原因の疾患に対する肺炎球菌ワクチンの製造に選択される成分となっている。

0021

本発明では、フラゲリンタンパク質(FliC)がアジュバントの機能を果たす。FliCとToll様受容体5(TLR−5)との相互作用おかげで、FliCは、マクロファージおよび樹状細胞の成熟を刺激し、その結果、免疫応答が発達する(Mc Dermott P.F..High−affinity interaction between Gram−negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun. −2000. −V.68. −p.:5525−5529; Means T.K. et al. The Toll−like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cells. J.Immunol. −2003. −V.170. −p.:5165−5175)(非特許文献11および12)。

0022

現在、フラゲリンは、最も有望で十分に特性決定なされた次世代アジュバントであると見なされている。調査の結果から、フラゲリンと一緒注入された遺伝子組換えタンパク質は、向上した免疫原性および抗原性特性を保持することが示されている。それらに対する反応が記録されるのも早くなるし、もたらされる細胞性および体液性免疫応答も強くなる(Balaram, 2008)。

0023

本発明では、フラゲリン成分がアジュバントとして機能し得ることが示される。2つの受容体活性ドメインが、フラゲリンの末端領域で発見されている(79−117番アミノ酸および408−439番アミノ酸)(Tonyia, 2001)。

0024

つまり、フラゲリンの限定的成分を使用するアプローチは理にかなっている(FliCドメイン1、FliCドメイン2)。

0025

TLR−5は、自然免疫の細胞、上皮細胞、および内皮細胞の表面で発現する(Sebastiani G. et al. Cloning and characterization of the murine Toll−like receptor 5 (Tlr5) gene: sequence andmRNAexpression studies in Salmonella−susceptibleMOLF/Eimice. Genomics. −2000. −V.64. −p.230−240; Zarember K.A. and Godowski P.J. Tissue expression of human Toll−like receptors and differential regulation of Toll−like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunol. −2002. −V.168. −p.554−561;Delneste, 2007)(非特許文献13および14)。このことを考慮すると、免疫化に粘膜を利用することは理にかなっている、粘膜は免疫原輸送を顕著に促進する。

0026

このようにして、国際公開第WO2004102199号(特許文献2)に記載される発明および上記論文に記載されるコンストラクトCTB−PsaAは、本発明と最も似通っていると言うことができる。しかしながら、上記国際出願では、タンパク質またはその機能ユニットを、独立したワクチン成分として用いることが提案されている。本発明は、さらに、キメラタンパク質に基づいており、このキメラタンパク質は、その特定S.ニューモニエタンパク質構成成分を除いて、アジュバントも含む。したがって、本発明の原型は、ブラジルの著者らが記載したキメラタンパク質である。

0027

キメラタンパク質CTB−PsaAは、血清型6BのS.ニューモニエのPsaA(289番アミノ酸)ならびにアジュバントとしてコレラ毒素の機能を持つBサブユニットを含む(AreasAP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, HoPL. Expression and characterization of cholera toxin B−pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB−PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Aug 13;321(1):192−6)(非特許文献8)。しかしながら、正しい分子折り畳みを提供するためには、全長タンパク質ではなくてタンパク質断片、すなわち抗原性決定基を用いる方がより有益で簡単である。まさにこのアプローチ(最も免疫原性のあるタンパク質断片の利用)を用いて、本発明はなされた。本発明者らはまた、ワクチン成分にコレラ毒素またはその成分を使用することは、フラゲリンと比較して安全性が低いと考える、なぜなら、人々はコレラ毒素に対して非常に敏感であるので、たった8μgの毒素でもひどい下痢を引き起こす可能性がある。このキメラタンパク質の製造方法については、PsaAタンパク質をコードする遺伝子をプラスミドとは別に増幅し(プラスミドに遺伝子を後から挿入し)、続いてCTBコード遺伝子を含有するベクター制限酵素部位を介してクローン化した。本発明者らの場合、キメラタンパク質をコードする全長遺伝子の合成を用いた。

0028

国際出願公開第2010120921号パンフレット
国際出願公開第2004102199号パンフレット

先行技術

0029

DonalisioMR, RodriguesSM, Mendes ET, Krutman M. Adverse events after pneumococcal vaccination. J Bras Pneumol. 2007 Feb;33(1):51−6
Bacle A, Diot P, Lemarie E. Anti−pneumococcal vaccine: justifications and results. Rev Pneumol Clin. 1997;53(3):128−37
Pneumococcal vaccine:a second look. Solution for SC orIMinjection: pneumococcal vaccine. Prescrire Int. 1998 Feb;7(33):16−8
Pneumococcal vaccination for elderly subjects: license extension. Still no proof of clinical efficacy. Prescrire Int. 2000 Aug;9(48):106−9
Greenwood B M et al., Trans R Soc Trop Med Hyg, 1980, 74:756−760
Schneerson R, Barrera O, Sutton A, RobbinsJB. Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide−protein conjugates. J Exp Med. 1980 Aug 1;152(2):361−76
Takuya Kageyama, Minako Ohishi1, Shingo Miyamoto, Hiroto Mizushima, Ryo Iwamoto and Eisuke Mekada. Diphtheria Toxin Mutant CRM197 Possesses Weak EF2−ADP−ribosyl Activity that Potentiates its Anti−tumorigenic Activity. Received April 16, 2007. Accepted May 2, 2007
AreasAP, Oliveira ML, Miyaji EN, Leite LC, Aires KA, Dias WO, HoPL. Expression and characterization of cholera toxin B−pneumococcal surface adhesin A fusion protein in Escherichia coli: ability of CTB−PsaA to induce humoral immune response in mice. Biochem Biophys Res Commun. 2004 Aug 13;321(1):192−6
Berry AM, and Paton JC: Sequence heterogeneity of PsaA, a 37−kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 1996;64:5255−5262
Hammerschmidt S, Bethe G, Remane PH, Chhatwal GS(1999) Identification of pneumococcal surface protein A as a lactoferrin−binding protein of Streptococcus pneumoniae. Infect Immun 67:1683−1687
Mc Dermott P.F..High−affinity interaction between Gram−negative flagellin and a cell surface polypeptide results in human monocyte activation. Infect. Immun. −2000. −V.68. −p.:5525−5529
Means T.K. et al. The Toll−like receptor 5 stimulus bacterial flagellin induces maturation and chemokine production in human dendritic cell. J.Immunol. −2003. −V.170. −p.:5165−5175
Sebastiani G. et al. Cloning and characterization of the murine Toll−like receptor 5 (Tlr5) gene: sequence andmRNAexpression studies in Salmonella−susceptibleMOLF/Eimice. Genomics. −2000. −V.64. −p.230−240
Zarember K.A. and Godowski P.J. Tissue expression of human Toll−like receptors and differential regulation of Toll−like receptor mRNAs in leukocytes in response to microbes, their products, and cytokines. J.Immunol. −2002. −V.168. −p.554−561;Delneste, 2007

課題を解決するための手段

0030

本発明は、タンパク質PspAの免疫原性断片(160−262番アミノ酸、gb|EHD89266.1|肺炎球菌表面タンパク質A[ストレプトコッカス・ニューモニエ])、Spr1895の免疫原性断片(94−161番アミノ酸、ref|ZP 01836139.1|LysMドメインタンパク質[ストレプトコッカス・ニューモニエ])、およびPsaAの免疫原性断片(238−309番アミノ酸、gb|AAF70667.1|PsaA[ストレプトコッカス・ニューモニエ])、ならびにアジュバントの機能を持つフラゲリン成分(1−169番アミノ酸、gb|AAB33952.1|フラゲリン{選択的にスプライシングされたもの}[サルモネラ・チフィリウム]、311−405番アミノ酸、gb|AAB33952.1|フラゲリン{選択的にスプライシングされたもの}[サルモネラ・チフィリウム])、または上記のものに対してそのアミノ酸配列に従って60%以上相同のタンパク質相同体を含有し、これらが可動性リンカーを介して融合している、高精製されたキメラタンパク質(配列番号1)に基づくワクチンを具現化した。本発明によるワクチンは、上記のキメラタンパク質をコードする組換えDNAを製造し、そのようなDNAを、エシェリヒアコリ(E.コリ)細菌において高レベルでの発現をもたらすベクターコンストラクトに挿入し、この生命体でキメラタンパク質を産生させ、それを抽出し、精製し、そして生理学的に許容可能なキャリアと混合した結果、得られる。

図面の簡単な説明

0031

本発明を以下の図面で図示する:
キメラタンパク質、αヘリックス、およびβシート三次元構造を示す。
キメラタンパク質、アミノ酸残基の三次元構造を示す。
1LDのS.ニューモニエで感染後のマウス生存率(%)の動態(予防モデル)。
1LDのS.ニューモニエで感染後のマウス生存率(%)の動態(治療モデル)。

0032

本発明に一致したキメラタンパク質を製造するには、分子生物学および微生物学標準方法を用いることができ、そのような方法は、当業者にとってなじみ深いものである。そのような方法は、科学文献に十分に記載されている。

0033

ワクチンが導入されると、生命体は、ワクチンのキメラタンパク質に存在する細菌表面タンパク質のエピトープに対する抗体を産生し、S.ニューモニエの進入に反応して抗体を産生する能力を獲得する。肺炎球菌の全ての血清型に存在する肺炎球菌保存タンパク質の抗原性決定基は、ワクチンのキメラタンパク質に表現されている;したがって、ワクチン接種後、どの肺炎球菌血清型に対峙した際にも免疫応答が発現するだろう。複数のタンパク質のエピトープの利用は、ワクチン効力を向上させるだろう。ヒト血清中にS.ニューモニエの感染防御抗体が存在することで、ヒトは病気にならないか、または病気になってもあまり悪くならずにすむだろう。

0034

本ワクチンは、予防および治療の両方の効果を有する。

0035

本発明を用いると、タンパク質が、複数の肺炎球菌保存タンパク質の免疫原性エピトープにより表現されており、そのタンパク質で特定の免疫応答が免疫記憶形成を伴って起こるという事実に従って、S.ニューモニエにより引き起こされる疾患に関して予防および治療の両方の効果が得られるので、技術的な結果として、世界的な肺炎球菌の防御になる。

0036

本発明を用いると、フラゲリン成分または60%以上相同性のタンパク質で表されるアジュバントがコンストラクトに用いられているので、技術的な結果として、ワクチン活性成分に対する免疫応答も増強される。

0037

無毒作用剤、すなわちアジュバント(フラゲリン成分または60%以上相同性のタンパク質)の使用に従い、技術的な結果として、ワクチン安全性も向上する。

0038

キメラタンパク質のモデル設計
キメラポリペプチドとして計画したのは、複合マルチドメインタンパク質(5つのドメイン:FliC1、FliC2、PspA、PsaA、Spr1895)である。マルチドメインタンパク質のモデル設計のため、以下の手順を用いた:ドメイン乗り込み体見積もり、ドメイン配向見積もるための全タンパク質モデルの構築、各ドメインについてのモデルの構築(三次元構造の例およびアブニシオに基づくモデル設計を使用)、全タンパク質モデルを用いた各モデルの結合。

0039

計画したキメラポリペプチドにおいて、2つのドメインには原型が存在したが、3つのドメインはアブイニシオに基づくモデル設計が必要であった;そのうえ、アブイニシオに基づくモデル設計を行ううちに、ドメイン間に可動性リンカーを形成させなければいけなくなった。

0040

自動モードで現実的な結果を得るため、I−Tasserアルゴリズムを用いた。このアルゴリズムは、過去3回のCASP(タンパク質構造予測批判的評価)、すなわちタンパク質モデリングコンテスト最良のものであったと判断されている。この解析は3日間行われた。しかしながら、この強力なアルゴリズムを持ってしても、ドメインおよびそれらの乗り込み体のアブイニシオに基づくモデル設計を含むマルチドメインタンパク質についての現実的なデータ生成は、完全には有効性が保証されない(70%)。

0041

より正確なデータを生成させる目的で、マルチドメインタンパク質を、使用されているドメインに分解し、それからI−Tasserを用いて各ドメインのモデル設計を行い、続いてそれらを結合させた。

0042

上記の工程全てを行って、得られた構造を図1図2に示す。

0043

モデル設計されたキメラタンパク質は、536のアミノ酸残基からなる;そのアミノ酸配列を配列番号1に示す。ProtParamプログラム(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)によるこのタンパク質のアミノ酸配列の分析から、キメラタンパク質の分子量は、56.6kDa、pIは4.56であることがわかった。

0044

キメラタンパク質をコードするヌクレオチド配列の生成。
PspA、Spr1895、PsaA、FliCドメイン1、FliCドメイン2を含むキメラタンパク質のアミノ酸配列を、ヌクレオチド配列(1623bp)に翻訳し、次いでE.コリ細胞で発現するのに最適であるように変更した。

0045

このヌクレオチド配列の合成は、文献に記載されている方法(Majumder, 1992)に従って、重複するオリゴヌクレオチド延長させるやり方で行った。オリゴヌクレオチドは、キメラ遺伝子の断片を表しており、70ヌクレオチドの長さがあって、その中に20ヌクレオチドの重複領域が含まれていた。主なプライマー必要条件は以下の通りであった:プライマー長は60ヌクレオチドを超えてはならず、その一方でハイブリッド形成部位は20ヌクレオチドより短くてはならない。そのうえさらに、長い末端G/C繰返しは存在してはならなかった。場合によっては、最適プライマーの選択は、プライマー・テンプレート運動を介して、またはプライマーの長さを3〜6ヌクレオチドぶん変えることで、経験的に行われた。まとめると、1623bp長のキメラ遺伝子を合成するために、59のプライマーを用いた。合成した断片(各300bp)を、ゲル電気泳動で抽出して、プラスミドベクターpGEM−TEasyにクローン導入した。クローン導入は、制限部位Kpnl、SacII、EcoRV、BamHIを含めて、または場合によっては平滑末端を介して行った。配列決定後、断片を増幅させ、次いで、ポリメラーゼ連鎖反応法PCR)によりつなぎ合わせてキメラタンパク質のヌクレオチド配列にした。断片の連結によるキメラ遺伝子合成の最終段階後、人工遺伝子をKpnIおよびSacI制限部位を介してpGEM−Tベクターにクローン導入した。製造された遺伝子は、さらなる制限部位と隣接した:5'末端でEcoRI、および3'末端でXhoIである。次に、人工遺伝子を、EcoRIおよびXhoI制限部位を介して発現ベクターpET24aに再度クローン導入した。

0046

キメラタンパク質をコードするプラスミドDNAの生成。
実施例2に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチン製造用のヌクレオチド配列を得た。

0047

得られる遺伝子を、その後の発現用に、pET24aプラスミドにクローン導入した。そのため、遺伝子とpET24aベクターの連結を、適切な緩衝液およびリガーゼを用いて行った。反応は、+20℃で2時間行った。

0048

合物を+95℃で10分間加温し、ついで、孔径0.025μmのニトロセルロース膜フィルター(Millipore、USA)で透析することで塩類を除去した。透析は、0.5mMのEDTAを含有する10%グリセロール溶液に対して10分間行った。

0049

キメラ遺伝子をコードするプラスミドDNAを増幅させるためのE.コリ株の生成。
実施例3に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチンを作るための遺伝子のヌクレオチド配列が生成したので、それをpET24aベクターにクローン導入した。以下の遺伝子型を有する株DH10B/R(GibkoBRL、США)由来のE.コリ細胞を、得られたプラスミドで、電気穿孔法により形質転換した:F−mcrAΔ(mrr−hsdRMS−mcrBC)φ80dlacZΔM 15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ(ara、leu)769 galU galKλ− rpsL nupG。

0050

形質転換後、細胞を、SOC培地(2%のbacto−tryptone、0.5%の酵母菌抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース)中、+37℃で40分間インキュベートした。

0051

プラスミドの存在を同定するため選択培地(LB寒天および100μg/mlのアンピシリン含有)中でE.コリ細胞のスクリーニングを行い、適切なE.コリ細胞を試料採取することで、キメラ遺伝子含有プラスミドDNAをその後に増幅するためのE.コリ株を得た。

0052

増殖したクローンから、Wizard Minipreps DNA Purification Systemキット(Promega、USA)を用いて、プラスミドDNAを抽出した。

0053

精製したプラスミドDNAは、必要としていたものであることが、限定解析および配列決定から証明された。調査の課程において、プラスミド中に必要な大きさのDNAフラグメントを含有するクローンを試料採取した。次に、そのようなプラスミドを、その後の遺伝子発現誘導のために抽出した。

0054

キメラタンパク質産生E.コリ株の獲得。
実施例4に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチンを製造するためのタンパク質のヌクレオチド配列が得られたので、これをpET24aプラスミドにクローン導入した;得られたプラスミドをDH10B/R株由来のE.コリ細胞で増幅させ、次いで抽出した。

0055

タンパク質を発現させるため、以下の遺伝子型を持つ株BL21 Star(DE3)(Invitrogen、USA)由来のE.コリ細胞を用いた:F−ompT hsdSB(rB−mB−)gal dcm rne131(DE3)、ゲノム中にλDe3溶原菌およびrne131変異を含有。変異rwe遺伝子(rne131)は、RNA分解酵素Eの短略型をコードし、この短略型は、細胞内mRNA解重合を減少させ、そうすることでその発酵定性を高める。プロテアーゼ遺伝子のlon変異およびompT変異は、タンパク質分解されていない組換えタンパク質を高収率で得ることを可能にする。

0056

遺伝子型F−ompT hsdSB(rB−mB−)gal dcm rne131(DE3)を持つ株BL21由来のE.コリ細胞を、以下のとおり調製した。細胞を、5mlのLブロス(1%のトリプトン、1%の酵母菌抽出物、および1%の塩化ナトリウム含有)中で、+37℃で一晩インキュベートした。培養物を、新たなLブロスで50〜100倍に希釈し、震盪撹拌インキュベーターに入れて、波長590nmでの吸光度OD)が0.2〜0.3になるまで、+37℃で培養した。0.3ODに達したら、培養物を新たなLブロスで0.1ODまで希釈し、30分間培養した。100ml体積の培養物を、滅菌遠心管に移し、+4℃、5000gで10分間、細胞のペレット化を行った。上清廃棄し、細胞を脱イオン水再懸濁させ、最初の体積にして、引き続き遠心を行った。この洗浄工程を3回繰り返した。洗浄後、細胞ペレットを少量の脱イオン水に再懸濁させ、懸濁液を微量遠心機にて、5000rpmで30秒間遠心した。

0057

コンピテント細胞の形質転換は、電気穿孔法により行った。そのため、コンピテント細胞12μlに1μlのプラスミドDNAを添加し、懸濁液を混合した。その後の電気穿孔法は、滅菌室中で、パルス発生器GVI−1(ΓΒИ−1)(サンクトテルブルク工科大学、St.Petersburg)を用いて、10kV/cmで4msec間行った。

0058

形質転換後、細胞を、SOC培地(2%のbacto tryptone、0.5%の酵母菌抽出物、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl2、10mMのMgSO4、20mMのグルコース)中、+37℃で40分間インキュベートした。プラスミドを持つクローン(生産株)を選択するため、細胞懸濁液10〜100μlを、アンピシリン(100μg/ml)含有選択LB培地(GibkoBRL、USA)に移した。

0059

コンピテントE.コリ細胞の形質転換後に得られたプラスミドは、コードされた組換えタンパク質を高レベルで発現した。

0060

Studier法に従い0.2%のラクトースによりタンパク質合成を誘導することで、E.コリ細胞において、肺炎球菌ワクチン製造用のキメラタンパク質を産生させる。
実施例5に記載の方法に従って、肺炎球菌ワクチン製造用のキメラタンパク質のヌクレオチド配列が得られたので、これをpET24aプラスミドにクローン導入した;得られたプラスミドをDH10B/R株由来のE.コリ細胞で増幅させ、抽出し、それを用いて、標的遺伝子発現の誘導を目的として、BL21株由来のE.コリ細胞を形質転換した。

0061

得られた産生株を培養する目的で、非特異的発現を遮断するためのアンピシリン(100μg/ml)および1%グルコースを含有する標準の寒天LB培地を用いた。

0062

細胞培養物の吸光度が600nmで0.6〜0.8ODに到達してから、発現誘導を行った。

0063

誘導剤として、0.2%ラクトースを用いた(Studier, 2005)。

0064

Studierの方法(Studier, 2005)に従って発現を自動誘導するため、1%のペプトン(Gibco、USA)、0.5%の酵母菌抽出物(Gibco、USA)、50mMのNa2HPO4、50mMのK2HPO4、25mMの(NH4)2SO4、2mMのMgSO4、0.5%のグリセロール、0.05%のグルコース、および0.2%のラクトースを含有するPYP−5052培地を用いた。

0065

単独の産生株コロニーを、アンピシリン(100μg/ml)含有PYP−5052培地に播種した。発酵は、恒温シェーカーに入れて、250rpmで、1時間あたりのOD600に明らかな変化が記録されなくなるまで、20時間+37℃で行った。ワクチンタンパク質をコードする遺伝子の発現解析を目的として、細胞を一定分量取り分けた。発現解析は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により行った。バイオマスの残りの分は、9000gで遠心してペレットにした。

0066

タンパク質は、細胞溶解によりE.コリ細胞から抽出した。細胞を、緩衝液5〜7mlあたり細胞1gを基準として、溶解緩衝液(20mMのtris−HCl(pH7.5)、5mMのEDTA、および1mMのフェノキシメチルスルホニルフルオリドPMSF)を含有)に再懸濁させた。細胞懸濁液に30秒間隔で30秒間の超音波処理を7回行った(22kHz)。溶解液を、+4℃、5000gで10分間遠心した。上清を廃棄し、ペレットを1Mの尿素溶液に、細胞1gあたり10mlを基準として加えて、激しく混合することにより、再懸濁させた。遠心工程を繰返した。上清を廃棄し、ペレットを同体積の2Mの尿素溶液に再懸濁させた。遠心工程を繰返した。上清を廃棄した。

0067

SDS−Page(ドデシル硫酸ナトリウムを用いるポリアクリルアミドゲル電気泳動)データによれば、得られた生成物には、約97%のキメラタンパク質が含まれており、濃度は1mg/mlであった。

0068

抽出および精製条件は実験的に調整されたものであって、当業者になじみある範囲である程度変更することができる。

0069

致死性S.ニューモニエ感染の予防モデルにおける、PspA、Spr1895、PsaA、FliCドメイン1、FliCドメイン2含有キメラタンパク質に基づくワクチンの予防効果
キメラタンパク質の予防効果を見積もるため、マウスを用いた。

0070

対照群および実験群は、7〜8週齢メスのBalb/cマウス(体重18〜20g)30匹で構成された。キメラタンパク質10μgを各マウスに導入した。接種の1週間後、マウスを肺炎球菌に感染させた:マウス1匹あたりS.ニューモニエ104cfu(コロニー形成単位)を腹部注射した(これはマウスにとって最小致死量である)。生存実験を、肺炎球菌の致死量注射の直後から開始し、14日間継続した(図3)。

0071

組換えキメラタンパク質に基づくワクチンで免疫化されたマウスは、感染から1週間後に80%、および14日目に68%の生存率を示した。対照群の生存率は、5日目に0%になった。

0072

つまり、提供するワクチンは、保護効果を有している。そのうえ、試験した用量のワクチン(10μg/マウス)は、マウスにまったく毒作用を示さなかった。

0073

致死性S.ニューモニエ感染の治療モデルにおける、PspA、Spr1895、PsaA、FliCドメイン1、FliCドメイン2含有キメラタンパク質に基づくワクチンの予防効果。
対照群および実験群は、7〜8週齢のメスのBalb/cマウス(体重18〜20g)30匹で構成された。マウスを肺炎球菌に感染させた:マウス1匹あたりS.ニューモニエ104cfu(コロニー形成単位)を腹部注射した(これはマウスにとって最小致死量である)。同日、キメラタンパク質10μgを各マウスに接種した。生存実験を、肺炎球菌の致死量注射の直後から開始し、14日間継続した。

0074

肺炎球菌およびキメラタンパク質に基づくワクチンの両方を同時導入した後、マウスは、導入から1週間後に76%、および14日目に65%の生存率を示した。対照群の生存率は、5日目に0%になった。

実施例

0075

このような結果は、本発明が提供するワクチンの高い免疫原性を証明している。したがって、本ワクチンは、肺炎球菌感染症の治療に用いることができる。

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