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技術 非肺標的細胞へのmRNAの経肺送達

出願人 シャイアーヒューマンジェネティックセラピーズインコーポレイテッドエスリスゲーエムベーハー
発明者 ハートレイン,マイケルギルド,ブレイドンチャールズデローサ,フランクルドルフ,カルステンプランク,クリスティアン
出願日 2013年6月7日 (6年8ヶ月経過) 出願番号 2015-516249
公開日 2015年7月16日 (4年7ヶ月経過) 公開番号 2015-520195
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 連結節 本発明発明 液体噴霧器 プロットデータ 層状体 中性塩基 バッファシステム フリート
関連する未来課題
重要な関連分野

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課題・解決手段

肺細胞または組織へのmRNAおよび/またはコードされたタンパク質送達のための経肺投与および関連する方法のために製剤化されたmRNAを含む組成物。組成物および方法は、mRNAがコードするタンパク質に関連する疾患の症状を予防または改善するために使用され得る。本発明は非侵襲的な経肺投与を使用するmRNA遺伝子治療薬の送達方法を提供する。とりわけ、本発明は疾患の治療および/または予防のための方法において使用可能なタンパク質をコードするmRNA送達を提供する。

概要

背景

従来の遺伝子治療は、宿主細胞への望ましい遺伝情報の挿入のためのDNAの使用を含む。細胞導入されたDNAは通常1つ以上の核酸導入された細胞ゲノム統合され、宿主で導入された遺伝物質の長期にわたる作用を可能にする。相当な利益がそのような持続作用にあり得る一方で、外因性DNAの宿主ゲノムへの統合は多くの有害作用もまた有し得る。例えば、導入されたDNAを無損傷の遺伝子に挿入することが可能であるが、内因性遺伝子の機能を妨げるか、または全く排除さえする突然変異をもたらす。このように、DNAでの遺伝子治療は、例えば、必須酵素の除去または有害な減少した生産または細胞増殖の調節のための重要な遺伝子の中断などの、治療を受けている宿主における不可欠な遺伝子の機能の減退をもたらす場合があり、未制御またはガン性の細胞増殖をもたらす。さらに、従来のDNAに基づく遺伝子治療で、強いプロモーター配列を含むために望ましい遺伝子産物の効果的発現が必要であり、また細胞内の通常の遺伝子発現の調節における望ましくない変化に至るかもしれない。DNAに基づく遺伝物質は、望ましくない抗DNA抗体の誘発をもらたすことも可能性があり、順番に、致命的な免疫反応を引き起こし得る。

DNAと対照的に、遺伝子治療剤としてのRNAの使用は(1)RNAが、核酸導入された細胞のゲノムに安定して統合する危険を含まないため、導入された遺伝物質が必須遺伝子の通常の機能を損なうか、有害または発癌性影響をもたらす突然変異を引き起こすという懸念を取り除き、(2)無関係なプロモーター配列が、コードされたタンパク質の効果的な翻訳のために必要とされず、起こり得る有害な副作用を避けられ、(3)プラスミドDNA(pDNA)と対照的に、反RNA抗体が発生しないように、メッセンジャーRNAmRNA)が免疫原性CpGのモチーフ欠けており、(4)遺伝子治療に基づくmRNAから生じるどんな悪影響も、RNAの比較的短い半減期のために、限られた期間であるため、実質的に安全である。さらに多くの適用において、細胞へのmRNA移動の一時的な性質は、すなわち、どんな治療効果の期間でも、細胞内のmRNAおよびタンパク質生成物寿命により制限され、DNAに基づく遺伝子治療を使用して得られる潜在的により長い永続的な効果よりも、望ましい。さらに、mRNAがその機能を実行するために核に入ることが必要ではなく、このようにDNAに基づく遺伝子治療に対する大きな障害を避ける。

過去にmRNAに基づく遺伝子治療がもっと使用されなかった1つの理由は、特にそれが細胞の細胞質に達して、酵素分解にさらされるとき、mRNAはDNAよりもはるかに安定性に欠けることである。mRNAの糖部分の第二炭素水酸基の存在は、mRNAがDNAのより安定した二重らせん構造を形成することを防ぎ、このようにmRNAをより加水分解劣化し易くする立体障害を引き起こす。その結果、最近まで、mRNAが不安定なため、核酸導入プロトコルに耐えられないと広く考えられてきた。

RNA安定化修飾の進歩は、遺伝子治療においてプラスミドDNAの代わりにmRNAの使用に対するより多くの関心を沸かせた。それでも、修飾mRNAの増加した安定性にもかかわらず、mRNAのタンパク質生産の治療レベルを可能にする方法でのインビボ細胞への送達は、特に全長タンパク質をコードするmRNAに対して、まだ課題である。mRNAを宿主に導入するためにウイルスベクターを使用することで若干の成功は収められたが、ウイルスベクターを使用するmRNA核酸導入が逆免疫反応をもたらす可能性もある。いくつかの状況では、ウイルスベクターは、宿主ゲノムにさえ統合されるかもしれない。さらに、臨床級ウイルスベクターの生産は、高価でもあり、時間もかかる。ウイルスベクターを使用する導入された遺伝物質の標的送達は、制御が難しくもあり得る。

mRNAの非ウイルス送達はネイキッド核酸の注射、ポリプレックスリポプレックス、または、リポソーム封入mRNA、遺伝子ガンによるバイオリスティック送達、微粒子担体媒介の送達、および電気穿孔を使用して得ることができる。非ウイルス核酸導入または送達媒体は、一般に毒性が少なく、より抗原性が低く、より容易で、mRNAの送達のためのウイルスベクターより調製するのにより費用がかからない。カチオン性脂質またはポリマー送達媒体などの特定の送達媒体は、核酸導入するmRNAを内在性RNA分解酵素から保護することも助け得る。

カプセル化されるプラスミドDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉RNAおよびマイクロRNAに基づく治療法の部位特異的送達の実施手段として、核酸のリポソーム型送達は、用いられた。しかし、効率的で、治療上有効な、標的細胞および組織へのmRNAの送達、ならびにそのような標的細胞および組織のその後の核酸導入は、特に全長タンパク質をコードするmRNAの送達にとって技術的な挑戦が残る。望ましい標的細胞に達する十分な安定性および治療上有効なレベルで機能的なタンパク質の翻訳を可能にするためにそのような標的細胞に効率的にそれらのカプセル化される物質を放出する能力を提供するリポソーム型送達系を設計することは重要である。

治療上有効な量のカプセル化される製剤を送達するために使用されるとき、そのようなリポソーム系送達媒体を構築するために用いられる多くのカチオン性脂質は標的細胞に対して有毒である。したがって、特にうまく治療上有効な量のmRNAを標的細胞に届けるのに必要な量において、カチオン性脂質と関連した毒性は、非ウイルス送達媒体としてのそれらの一般的な使用に対する大きな障害を意味する。

現在まで、特に翻訳の低水準制限因子ではない場合、例えばmRNAコード抗原による免疫化の場合、mRNA遺伝子治療を使用し著しい進歩が用途において見えてきた。ネイキッドまたはプロタミン複合型のmRNAの皮内注入によって腫瘍抗原に対する予防接種を含む臨床試験は、実現可能性、毒性の不足および有望な結果を示した。X.Su et al.Mol.Pharmaceutics 8:774−787(2011)。しかし、翻訳の低レベルは、長期間の生物学的または治療効果を働かせるためにタンパク質をコードするmRNAの持続的安定性のより高いレベルが要求する他の適用で、mRNAに基づく遺伝子治療の実施を制限することができる。

さらに、mRNA遺伝子治療の利点は繰り返される投与、および典型的には注射によるDNAに基づく遺伝子治療と比較して比較的一時的であるため、しばしば長期間の効果を提供するよう要求される。このように、インビボのより効果的な核酸導入および非侵襲的におよび/または粘膜イトにmRNAを送達する能力は、mRNA遺伝子治療の成功した適用の見通しを改善する。

概要

肺細胞または組織へのmRNAおよび/またはコードされたタンパク質の送達のための経肺投与および関連する方法のために製剤化されたmRNAを含む組成物。組成物および方法は、mRNAがコードするタンパク質に関連する疾患の症状を予防または改善するために使用され得る。本発明は非侵襲的な経肺投与を使用するmRNA遺伝子治療薬の送達方法を提供する。とりわけ、本発明は疾患の治療および/または予防のための方法において使用可能なタンパク質をコードするmRNA送達を提供する。

目的

それでも、修飾mRNAの増加した安定性にもかかわらず、mRNAのタンパク質生産の治療レベルを可能にする方法でのインビボ細胞への送達は、特に全長タンパク質をコードするmRNAに対して、まだ課題である

効果

実績

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請求項1

タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物投与することを含む、非長細胞または組織へのメッセンジャーRNA(mRNA)の送達方法であって、肺への前記投与が、前記mRNAおよび/または前記タンパク質の非肺細胞または組織への送達をもたらす、方法。

請求項2

前記組成物がエアロゾル化吸入噴霧化点滴注入によって前記肺に投与される、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記組成物が気管内エアロゾル化によって前記肺に投与される、請求項1または2に記載の方法。

請求項4

前記非肺細胞が、肝細胞上皮細胞造血細胞、上皮細胞、内皮細胞骨細胞幹細胞間葉細胞神経細胞心臓細胞脂肪細胞血管平滑筋細胞心筋細胞骨格筋細胞β細胞下垂体細胞滑液管壁細胞卵巣細胞睾丸細胞、線維芽細胞B細胞、T細胞、網状赤血球白血球顆粒白血球、マクロファージ好中球抗原提示細胞樹状細胞)、線維芽細胞、腫瘍細胞、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。

請求項5

前記非肺細胞が肝細胞である、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記非肺組織が、心臓肝臓脾臓腎臓骨格筋リンパ節、皮膚、脳、脳脊髄液血漿、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。

請求項7

前記非肺細胞が肝臓である、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記非肺細胞が心臓である、請求項6に記載の方法。

請求項9

前記非肺細胞が脾臓である、請求項6に記載の方法。

請求項10

前記mRNAが細胞質タンパク質をコードする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。

請求項11

前記細胞質タンパク質が酵素転写因子シャペロン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項10に記載の方法。

請求項12

前記mRNAが分泌性タンパク質をコードする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。

請求項13

前記mRNAが治療タンパク質をコードする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。

請求項14

前記治療タンパク質が、αガラクトシダーゼエリスロポエチン、α1−アンチトリプシンカルボキシペプチダーゼN、α−L−イズロニダーゼイズロネート−2−スルファターゼN−アセチルグルコサミン−1−リン酸トランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニダーゼリソソーム酸性リパーゼアリールスルファターゼ−Aα−グルコミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ、β−グルコシダーゼガラクトース−6−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼβ−グルクロニダーゼグルコセレブロシダーゼヘパランスルファミダーゼヒアルロニダーゼガラクトレブシダーゼ、ヒト成長ホルモンオルニチントランスカルバミルラーゼ(OTC)、カルバミルリン酸合成酵素−1(CPS1)、アルギニノコハク酸合成酵素−1(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ−1(ARG1)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ヘパラン−N−スルファターゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項13に記載の方法。

請求項15

前記タンパク質が、前記非肺細胞または組織で肺への前記投与後少なくとも約1日間検出可能である、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。

請求項16

前記タンパク質が、前記非肺細胞または組織で肺への前記投与後少なくとも約2日間検出可能である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。

請求項17

前記mRNAが投与量当たり約0.5mg/kgを超えるmRNAの量で送達される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。

請求項18

前記脂質担体媒体がリポソームである、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。

請求項19

前記リポソームが1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質および1つ以上のPEG修飾脂質を含む、請求項18に記載の方法。

請求項20

前記1つ以上のカチオン性脂質がC12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、ICE、DLinKC2−DMADODAP、DODMA、DLinDMA、CLinDMAおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項19に記載の方法。

請求項21

前記組成物が1つ以上の肺胞界面活性物質をさらに含む、請求項1〜20のいずれか1項に記載の方法。

請求項22

前記組成物が呼吸粒子として製剤化される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。

請求項23

前記呼吸域粒子が約500μm未満の粒径を有する、請求項22に記載の方法。

請求項24

前記組成物が噴霧可能な脂質として製剤化される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。

請求項25

前記組成物が乾燥粉末として製剤化される、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。

請求項26

治療タンパク質が非肺細胞または組織に送達されるように、前記治療タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む、被験者の非肺細胞または組織への前記治療タンパク質を送達する方法。

請求項27

治療タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む被験者の非肺細胞内で治療タンパク質の生産を誘発する方法。

請求項28

疾患または障害治療する方法であって、治療タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することと、肺への前記投与が、疾患または障害によって罹患した非肺細胞または組織に治療タンパク質の送達をもたらすことと、を含む方法。

請求項29

前記疾患または障害が表4から選択される、請求項28に記載の方法。

請求項30

タンパク質をコードするmRNAを含むメッセンジャーRNA(mRNA)および脂質担体媒体の経肺送達のための組成物であって、一度肺に投与されるように組成物が製剤化されると、非肺細胞または組織にmRNAおよび/またはタンパク質の前記送達をもたらす方法。

請求項31

タンパク質を生産するために非肺細胞を誘発可能な組成物であって、タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含み、前記組成物が経肺送達のために製剤化される、組成物。

請求項32

前記脂質担体媒体がリポソームである、請求項30または31に記載の組成物。

請求項33

前記リポソームが1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質および1つ以上のPEG修飾脂質を含む、請求項32に記載の組成物。

請求項34

前記1つ以上のカチオン性脂質がC12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、ICE、DLinKC2−DMA、DODAP、DODMA、DLinDMA、CLinDMAおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項33に記載の組成物。

請求項35

前記組成物が1つ以上の肺胞界面活性物質をさらに含む、請求項30〜34のうちのいずれか1項に記載の組成物。

請求項36

前記組成物が呼吸域粒子として製剤化される、請求項30〜34のうちのいずれか1項に記載の組成物。

請求項37

前記呼吸域粒子が約500μm未満の粒径を有する、請求項36に記載の組成物。

請求項38

前記組成物が噴霧可能な脂質として製剤化される、請求項30〜34のうちのいずれか1項に記載の組成物。

請求項39

前記組成物が吸入のための乾燥粉末として製剤化される、請求項30〜34のいずれか1項に記載の組成物。

請求項40

前記mRNAが細胞質タンパク質をコードする、請求項30〜39のいずれか1項に記載の組成物。

請求項41

前記細胞質タンパク質が酵素、転写因子、シャペロン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項40に記載の組成物。

請求項42

前記mRNAが分泌性タンパク質をコードする、請求項30〜39のいずれか1項に記載の組成物。

請求項43

前記mRNAが治療タンパク質をコードする、請求項30〜42のいずれか1項に記載の組成物。

請求項44

前記治療タンパク質が、αガラクトシダーゼ、エリスロポエチン、α1−アンチトリプシン、カルボキシペプチダーゼN、α−L−イズロニダーゼ、イズロネート−2−スルファターゼ、N−アセチルグルコサミン−1−リン酸トランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、アリールスルファターゼ−Aα−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−6−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ヒト成長ホルモン、オルニチントランスカルバミルラーゼ(OTC)、カルバミルリン酸塩合成酵素−1(CPS1)、アルギニノコハク酸合成酵素−1(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ−1(ARG1)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ヘパラン−N−スルファターゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項43に記載の組成物。

技術分野

0001

関連出願
本出願は、2012年6月8日に出願された米国仮出願第61/657,452号の利益を主張するものであり、その開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

背景技術

0002

従来の遺伝子治療は、宿主細胞への望ましい遺伝情報の挿入のためのDNAの使用を含む。細胞導入されたDNAは通常1つ以上の核酸導入された細胞ゲノム統合され、宿主で導入された遺伝物質の長期にわたる作用を可能にする。相当な利益がそのような持続作用にあり得る一方で、外因性DNAの宿主ゲノムへの統合は多くの有害作用もまた有し得る。例えば、導入されたDNAを無損傷の遺伝子に挿入することが可能であるが、内因性遺伝子の機能を妨げるか、または全く排除さえする突然変異をもたらす。このように、DNAでの遺伝子治療は、例えば、必須酵素の除去または有害な減少した生産または細胞増殖の調節のための重要な遺伝子の中断などの、治療を受けている宿主における不可欠な遺伝子の機能の減退をもたらす場合があり、未制御またはガン性の細胞増殖をもたらす。さらに、従来のDNAに基づく遺伝子治療で、強いプロモーター配列を含むために望ましい遺伝子産物の効果的発現が必要であり、また細胞内の通常の遺伝子発現の調節における望ましくない変化に至るかもしれない。DNAに基づく遺伝物質は、望ましくない抗DNA抗体の誘発をもらたすことも可能性があり、順番に、致命的な免疫反応を引き起こし得る。

0003

DNAと対照的に、遺伝子治療剤としてのRNAの使用は(1)RNAが、核酸導入された細胞のゲノムに安定して統合する危険を含まないため、導入された遺伝物質が必須遺伝子の通常の機能を損なうか、有害または発癌性影響をもたらす突然変異を引き起こすという懸念を取り除き、(2)無関係なプロモーター配列が、コードされたタンパク質の効果的な翻訳のために必要とされず、起こり得る有害な副作用を避けられ、(3)プラスミドDNA(pDNA)と対照的に、反RNA抗体が発生しないように、メッセンジャーRNAmRNA)が免疫原性CpGのモチーフ欠けており、(4)遺伝子治療に基づくmRNAから生じるどんな悪影響も、RNAの比較的短い半減期のために、限られた期間であるため、実質的に安全である。さらに多くの適用において、細胞へのmRNA移動の一時的な性質は、すなわち、どんな治療効果の期間でも、細胞内のmRNAおよびタンパク質生成物寿命により制限され、DNAに基づく遺伝子治療を使用して得られる潜在的により長い永続的な効果よりも、望ましい。さらに、mRNAがその機能を実行するために核に入ることが必要ではなく、このようにDNAに基づく遺伝子治療に対する大きな障害を避ける。

0004

過去にmRNAに基づく遺伝子治療がもっと使用されなかった1つの理由は、特にそれが細胞の細胞質に達して、酵素分解にさらされるとき、mRNAはDNAよりもはるかに安定性に欠けることである。mRNAの糖部分の第二炭素水酸基の存在は、mRNAがDNAのより安定した二重らせん構造を形成することを防ぎ、このようにmRNAをより加水分解劣化し易くする立体障害を引き起こす。その結果、最近まで、mRNAが不安定なため、核酸導入プロトコルに耐えられないと広く考えられてきた。

0005

RNA安定化修飾の進歩は、遺伝子治療においてプラスミドDNAの代わりにmRNAの使用に対するより多くの関心を沸かせた。それでも、修飾mRNAの増加した安定性にもかかわらず、mRNAのタンパク質生産の治療レベルを可能にする方法でのインビボ細胞への送達は、特に全長タンパク質をコードするmRNAに対して、まだ課題である。mRNAを宿主に導入するためにウイルスベクターを使用することで若干の成功は収められたが、ウイルスベクターを使用するmRNA核酸導入が逆免疫反応をもたらす可能性もある。いくつかの状況では、ウイルスベクターは、宿主ゲノムにさえ統合されるかもしれない。さらに、臨床級ウイルスベクターの生産は、高価でもあり、時間もかかる。ウイルスベクターを使用する導入された遺伝物質の標的送達は、制御が難しくもあり得る。

0006

mRNAの非ウイルス送達はネイキッド核酸の注射、ポリプレックスリポプレックス、または、リポソーム封入mRNA、遺伝子ガンによるバイオリスティック送達、微粒子担体媒介の送達、および電気穿孔を使用して得ることができる。非ウイルス核酸導入または送達媒体は、一般に毒性が少なく、より抗原性が低く、より容易で、mRNAの送達のためのウイルスベクターより調製するのにより費用がかからない。カチオン性脂質またはポリマー送達媒体などの特定の送達媒体は、核酸導入するmRNAを内在性RNA分解酵素から保護することも助け得る。

0007

カプセル化されるプラスミドDNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、短干渉RNAおよびマイクロRNAに基づく治療法の部位特異的送達の実施手段として、核酸のリポソーム型送達は、用いられた。しかし、効率的で、治療上有効な、標的細胞および組織へのmRNAの送達、ならびにそのような標的細胞および組織のその後の核酸導入は、特に全長タンパク質をコードするmRNAの送達にとって技術的な挑戦が残る。望ましい標的細胞に達する十分な安定性および治療上有効なレベルで機能的なタンパク質の翻訳を可能にするためにそのような標的細胞に効率的にそれらのカプセル化される物質を放出する能力を提供するリポソーム型送達系を設計することは重要である。

0008

治療上有効な量のカプセル化される製剤を送達するために使用されるとき、そのようなリポソーム系送達媒体を構築するために用いられる多くのカチオン性脂質は標的細胞に対して有毒である。したがって、特にうまく治療上有効な量のmRNAを標的細胞に届けるのに必要な量において、カチオン性脂質と関連した毒性は、非ウイルス送達媒体としてのそれらの一般的な使用に対する大きな障害を意味する。

0009

現在まで、特に翻訳の低水準制限因子ではない場合、例えばmRNAコード抗原による免疫化の場合、mRNA遺伝子治療を使用し著しい進歩が用途において見えてきた。ネイキッドまたはプロタミン複合型のmRNAの皮内注入によって腫瘍抗原に対する予防接種を含む臨床試験は、実現可能性、毒性の不足および有望な結果を示した。X.Su et al.Mol.Pharmaceutics 8:774−787(2011)。しかし、翻訳の低レベルは、長期間の生物学的または治療効果を働かせるためにタンパク質をコードするmRNAの持続的安定性のより高いレベルが要求する他の適用で、mRNAに基づく遺伝子治療の実施を制限することができる。

0010

さらに、mRNA遺伝子治療の利点は繰り返される投与、および典型的には注射によるDNAに基づく遺伝子治療と比較して比較的一時的であるため、しばしば長期間の効果を提供するよう要求される。このように、インビボのより効果的な核酸導入および非侵襲的におよび/または粘膜イトにmRNAを送達する能力は、mRNA遺伝子治療の成功した適用の見通しを改善する。

先行技術

0011

X.Su et al.Mol.Pharmaceutics 8:774−787(2011)

課題を解決するための手段

0012

本発明は、mRNAのナノ粒子に基づく製剤が以下の経送達を転位することができるという驚くべき発見、すなわち、肺から全身血液供給への能動的または受動的な手段による変化しない移動、続いて例えば、肝臓などの異なる非肺細胞または組織の中に沈着されることを含む。例えば、β−ガラクトシダーゼなどの治療タンパク質をコードするmRNAを含むナノ粒子のこの転位は、全身的に到達可能な非肺細胞または組織に機能的なタンパク質の生産をもたらすために、肺の外の有効医薬成分の非侵襲的な全身的送達を構成する。

0013

このように、本発明は非侵襲的な経肺投与を使用するmRNA遺伝子治療薬の送達方法を提供する。とりわけ、本発明は疾患の治療および/または予防のための方法において使用可能なタンパク質をコードするmRNA送達を提供する。1つの特定の態様では、本発明はタンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む非肺細胞または組織へのにメッセンジャーRNA(mRNA)の送達方法を提供し、肺への投与は、非肺細胞または組織にmRNAおよび/またはタンパク質の送達をもたらす。

0014

別の態様では、本発明は、治療タンパク質が非肺細胞または組織に送達されるように、治療タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む被験者の非肺細胞または組織へ治療タンパク質の送達方法を提供する。

0015

別の態様では、本発明は治療タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む被験者の非肺細胞または組織内で治療タンパク質の生産を誘発する方法を提供する。

0016

別の態様では、本発明は治療タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を肺に投与することを含む疾患または障害の治療方法を提供し、肺への投与は、疾患または障害によって罹患した非肺細胞または組織に治療タンパク質の送達をもたらす。

0017

別の態様では、本発明はタンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含むメッセンジャーRNA(mRNA)の経肺送達のための組成物を提供し、一度肺に投与されるように組成物が製剤化されると、非肺細胞または組織にmRNAおよび/またはタンパク質の送達をもたらす。

0018

いくつかの実施形態では、組成物はエアロゾル化によって肺に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は気管内のエアロゾル化によって肺に送達される。いくつかの実施形態では、組成物は噴霧化によって投与される。いくつかの実施形態では、組成物は点滴注入によって肺に投与される。いくつかの特定の実施形態では、組成物は定量吸入器ジェット噴霧器超音波噴霧器乾燥粉吸入器噴射剤に基づく吸入器または注入器からなる群から選択された装置を使用して被験者の肺に投与される。

0019

いくつかの実施形態では、mRNAは1つ以上のタンパク質をコードする複数のmRNA種を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは各々が異なるタンパク質をコードする少なくとも2つのmRNA種を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは全長タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは自然発生の全長タンパク質の切断されたバージョンをコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは単一転写の1つ以上のタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAはキメラタンパク質をコードし、その中で1つ以上のタンパク質配列天然タンパク質とは自然に関連せず、発現の間、結果として生じるキメラタンパク質でペプチド結合によって連鎖される。いくつかの実施形態では、本発明に適切なmRNAは約0.5kb、1kb、1.5kb、2.0kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb、4.5kb、または5.0kbの長さまたはそれを超える長さを有する。

0020

いくつかの実施形態では、mRNAは細胞内タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞質タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAはアクチン細胞骨格と関連したタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは形質膜と関連したタンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、mRNAは膜貫通タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、mRNAはイオンチャネルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは核周囲タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは核タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、mRNAは転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAはシャペロンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞内酵素をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは、細胞代謝、DNA修復転写および/または翻訳を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞外タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞外基質に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態ではmRNAは分泌性タンパク質をコードする。

0021

いくつかの実施形態では、mRNAは表1、2、3または4に記載のタンパク質(すなわち、治療タンパク質)をコードする。いくつかの特定の実施形態では、タンパク質は、αガラクトシダーゼエリスロポエチン、α1−アンチトリプシンカルボキシペプチダーゼN、α−L−イズロニダーゼイズロネート−2−スルファターゼN−アセチルグルコサミン−1−リン酸トランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニダーゼリソソーム酸性リパーゼアリールスルファターゼ−Aα−グルコミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ、β−グルコシダーゼガラクトース−6−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼグルコセレブロシダーゼヘパランスルファミダーゼヒアルロニダーゼガラクトレブシダーゼ、ヒト成長ホルモンオルニチントランスカルバミルラーゼ(OTC)、カルバミルリン酸合成酵素−1(CPS1)、アルギニノコハク酸合成酵素−1(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ−1(ARG1)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ヘパラン−N−スルファターゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、タンパク質は、オルニチントランスカルバミルラーゼ(OTC)、カルバミルリン酸塩合成酵素−1(CPS1)、アルギニノコハク酸合成酵素−1(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ−1(ARG1)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、細胞内また膜貫通型タンパク質である。

0022

いくつかの実施形態では、mRNAは表4に記載の疾患または障害(すなわち、適応症)に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、方法において使用するタンパク質は表4に記載の疾患または障害(すなわち、適応症)に罹患した被験者を予防、治療および/または治癒する能力に基づいて選択される。特定の実施形態では、疾患または障害は、SMN1関連脊髄筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症ALS)、GALT関連ガラクトース血症嚢胞性線維症(CF)、SLC3A1関連障害シスチン尿症、COL4A5関連障害、アルポート症候群、ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症X連鎖副腎白質ジストロフィー副腎脊髄神経障害フリートライ失調症ペリツェウスメルツバッハー病、TSC1またはTSC2関連結節硬化症B型サンフィリポ症候群(MPS IIIB)、CTNS関連シスチン症FMR1関連障害、脆弱X症候群を含む、脆弱X関連振動運動失調症候群、脆弱X早期卵巣不全症候群、プラデル−ウィ症候群ファブリー病、遺伝出血性毛細管拡張症(AT)、ニーマンピック病1型、神経セロイドリポフスチン関連疾患、若年型神経セロイドリポフスチン症(JNCL)、若年性バッテン病、サンタヴォリハルティア病、ヤンスキービールショースキー病PTT−1欠乏症、TPP1欠乏症、EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4、およびEIF2B5関連中枢神経ミエリン形成不全消滅白質による小児運動失調、CACNA1AおよびCACNB4関連発性運動失調症2型、MECP2関連障害、古典的なレット症候群、MECP2関連重度新生児脳症、PPM−X症候群、CDKL5関連非定型レット症候群、ケネディ病(SBMA)、Notch−3関連皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳常染色体優性動脈疾患CADASIL)、SCN1AおよびSCN1B関連発作疾患、ポリメラーゼG関連障害、アルパース−フッテンロッハー症候群、POLG関連感覚失調性神経障害構音障害、眼不全麻痺ミトコンドリアDNA削除による常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺、X連鎖副腎形成不全、X連鎖無ガンマグロブリン血症ウィルソン病および血液凝固障害からなる群から選択される。

0023

いくつかの実施形態では、肺への送達に続いて、mRNAおよび/またはタンパク質非肺組織に送達される。いくつかの実施形態では、非肺組織は肺以外の体の任意の器官および/または器官系統を含む。いくつかの特定の実施形態では、非肺組織は、心臓、肝臓、脾臓腎臓骨格筋リンパ節、脳皮膚、脳脊髄液血漿およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、非肺組織は肝臓である。いくつかの特定の実施形態では、非肺組織は心臓である。いくつかの特定の実施形態では、非肺組織は脾臓である。

0024

いくつかの実施形態では、肺への送達に続いて、mRNAおよび/またはタンパク質は非肺細胞に送達される。いくつかの実施形態では、非肺細胞は、肝細胞上皮細胞造血細胞、上皮細胞、内皮細胞骨細胞幹細胞間葉細胞神経細胞心臓細胞脂肪細胞血管平滑筋細胞心筋細胞骨格筋細胞β細胞下垂体細胞滑液管壁細胞卵巣細胞睾丸細胞、線維芽細胞B細胞、T細胞、網状赤血球白血球顆粒白血球、腫瘍細胞マクロファージ好中球抗原提示細胞樹状細胞)、線維芽細胞およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、非肺細胞は肝細胞である。

0025

いくつかの実施形態では、mRNAおよび/またはタンパク質は非肺細胞および/または組織で、肺への投与後、少なくとも約4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、18時間、24時間、またはより長い間で検出可能である。いくつかの実施形態では、mRNAおよび/またはタンパク質は非肺細胞および/または組織で、肺への投与後、少なくとも約1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間または10日間で検出可能である。いくつかの実施形態では、mRNAおよび/またはタンパク質は非肺細胞および/または組織で、肺への投与後、少なくとも約1週間、2週間、3週間、4週間、5週間または6週間で検出可能である。いくつかの実施形態では、mRNAは原位置ハイブリッド形成RTPCR、実時間RT−PCR、ノーザンブロット法ヌクレアーゼプロテクションアッセイおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を使用して検出される。いくつかの実施形態では、タンパク質はウエスタンブロット法ELISA免疫沈降、BCAアッセイ、免疫組織化学法およびそれらの組み合わせからなる群から選択される方法を使用して検出される。

0026

いくつかの実施形態では、mRNAは、投与量当たり約0.5mg/kgを超える(例えば約1.0mg/kg、1.5mg/kg、2.0mg/kg、2.5mg/kg、3.0mg/kg、4.0mg/kg、5.0mg/kg、6.0mg/kg、7.0mg/kg、8.0mg/kg、9.0mg/kgまたは10.0mg/kgを超える)(体重)mRNAの量で送達される。いくつかの実施形態では、mRNAは、投与量当たり約0.1〜100mg/kg(例えば約0.1〜90mg/kg、0.1〜80mg/kg、0.1〜70mg/kg、0.1〜60mg/kg、0.1〜50mg/kg、0.1〜40mg/kg、0.1〜30mg/kg、0.1〜20mg/kg、0.1〜10mg/kg)(体重)の範囲のmRNAの量で送達される。いくつかの実施形態では、mRNAは、投与量当たり約1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、または500mg、またはそれらを超える量で送達される。

0027

いくつかの実施形態では、mRNAは単一の脂質担体媒体でカプセル化される。いくつかの実施形態では、mRNAは1つ以上の脂質担体媒体でカプセル化される。いくつかの実施形態では、mRNAは1つ以上の脂質担体媒体でカプセル化され、それらの脂質組成物脂質成分モル比粒径電荷ゼータ電位標的配位子およびそれらの組み合わせとは異なる。

0028

いくつかの実施形態では、脂質担体媒体はリポソームである。いくつかの実施形態では、リポソームは1つ以上のカチオン性脂質、1つ以上の非カチオン性脂質、1つ以上のコレステロール系脂質および1つ以上のPEG修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のカチオン性脂質はイオン化脂質である。いくつかの実施形態では、1つ以上のカチオン性脂質は切断可能な脂質である。いくつかの実施形態では、1つ以上のカチオン性脂質はコレステロール由来のカチオン性脂質である。いくつかの実施形態では、1つ以上のカチオン性脂質はC12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、RE−1、RE−2、RE−3、ICE、GL−67、DLinKC2−DMADODAP、DODMA、DLinDMA、CLinDMAおよびそれらの組み合わせから選択される。

0029

いくつかの実施形態では、組成物はさらに肺表面活性物質を含む。いくつかの実施形態では、組成物は呼吸粒子として製剤化される。いくつかの実施形態では、呼吸域粒子は約500μm未満の粒径を有する(例えば約450μm、400μm、350μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm、または50μm未満)。いくつかの実施形態では、組成物は噴霧可能な脂質として製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は乾燥粉末として製剤化される。

0030

様々な実施形態では、本発明はまた非肺細胞または組織へのメッセンジャーRNA(mRNA)の送達方法での使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は被験者の肺に組成物を投与するステップを含み、さらに肺への投与は、非肺細胞または組織にmRNAおよび/またはタンパク質の送達をもたらす。

0031

様々な実施形態では、本発明は非肺細胞または組織への治療タンパク質の送達のための方法での使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は被験者の肺に組成物を投与するステップを含む。

0032

様々な実施形態では、本発明は非肺細胞または組織内のタンパク質の生産を誘発するための方法での使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は肺に組成物を投与するステップを含む。

0033

様々な実施形態では、本発明は疾患または障害を治療するための使用に対して本明細書に記載のように、タンパク質をコードするmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物を提供し、その方法は被験者の肺に組成物を投与するステップを含み、さらに肺への投与は、疾患または障害によって罹患した非肺細胞または組織にmRNAおよび/またはタンパク質の送達をもたらす。

0034

本出願で使用されるように、「約」および「およそ」という用語は同義語として使用される。「約」/「およそ」が付く場合でもまたは付かない場合でも、本出願で使用される任意の数字を当業者が理解するように任意の通常の変動を網羅することを意図する。

0035

本発明の他の特徴、目的および利点は後に続く詳細な説明で明らかになる。しかし、詳細な説明は本発明実施形態を示すものであるが、限定ではなく例示によってのみ表されることが理解されるべきである。本発明の範疇にある様々な変更および修正は、詳細な説明から当業者に明らかになる。

図面の簡単な説明

0036

気管内(IT)スプレー適用の6時間後のマウス生物発光イメージングBLI)を示す。(A)パネル1、2、3は、パネル4、5、6中のC12−200:DOPE:コレステロール:DMG−PEG2000(40:30:25:5)ナノ粒子(NP)中のFFLmRNAで処置されたマウスにおけるタンパク質生成と比較した、ネイキッドFFL mRNAで治療されたマウスにおけるタンパク質生成を示す。(B)パネル3、4、5(C12−200系NP中の修飾FFL mRNA)と比較したパネル1、2(ネイキッド修飾FFL mRNA)。
BLIを使用した気管内スプレー適用の6時間後のBLIを示す。パネル4、5、6(C12−200系NP中の修飾FFL mRNA)と比較したパネル1、2、3(C12−200系NP中のFFL mRNA)。
気管内スプレー適用後のマウスのBLIイメージを示す。(A)すべてのマウス(C12−200系NPのFFL mRNA)、6時間後のパネル4、5、6と比較した24時間後のパネル1、2、3。(B)すべてのマウス(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)、6時間後のパネル3、4、5と比較した24時間後のパネル1、2。(C)24時間後のパネル3、4、5(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)と比較したパネル1、2(C12−200系NPのFFL mRNA)。
適用後24時間でのネイキッドFFL mRNAで治療されるマウスのBLIイメージを示す。パネル1、2(第1の適用後24時間)、パネル3、4(第2の適用後24時間)、パネル5、6(第3の適用後24時間)。
適用後24時間でのネイキッド修飾FFL mRNAで治療されるマウスのBLIイメージを示す。パネル(第1の適用後24時間)、パネル3、4(第2の適用後24時間)、パネル5、6(第3の適用後24時間)。
気管内スプレー適用後6時間でのマウスのBLIイメージを示す。(A)パネル1、2(C12−200系NPのFFL mRNA(10μg/マウス))、パネル3、4(C12−200系NPのFFL mRNA(5μg/マウス)。(B)パネル1(C12−200系NPの修飾FFL mRNA(10μg/マウス))、パネル2、3(C12−200系NPの修飾FFL mRNA(5μg/マウス)。
10μg/マウスの投与量で気管内スプレー適用後6時間および24時間でのマウスのBLIイメージを示す。(A)すべてのマウス(C12−200系NPのFFL mRNA)、パネル1、2(24時間)、パネル3、4(6時間)。(B)すべてのマウス(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)、パネル1(24時間)、パネル2(6時間)。(C)気管内スプレー後24時間でのパネル1、2(C12−200系NPのFFL mRNA)とパネル3(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)の比較。
気管内スプレー後5または10μg/マウスの投与量でのFFLの生体内分布およびC12−200系NPの修飾FFL mRNA。
気管内スプレー適用後6時間でのマウスのBLIイメージを示す。パネル1、2、3(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)、パネル4、5(HGT5001系NPの修飾FFL mRNA)
10μg/マウスの投与量でHGT5001、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2000(40:20:35:5)ナノ粒子の修飾FFL mRNAの気管内スプレー適用後6時間(パネル1、2)および24時間(パネル3、4)でのマウスのBLIイメージを示す。
気管内スプレー適用後24時間でのマウスのBLIイメージを示す。(A)毛皮を取り除かれたマウス(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)。(B)無傷の毛皮を持つマウス(C12−200系NPの修飾FFL mRNA)。
mRNAカプセル化脂質ナノ粒子配合物、C12−200:DOPE:コレステロール:DMG−PEG2000(40:30:25:5)およびHGT5001:DOPE:コレステロール:DMG−PEG2000(40:20:35:5)の単一の、静脈注射治療の後のマウスの肺、肝臓に検出されるFFL発光を示す。マウスは投与後6時間および24時間で屠殺された。
PEI系NPで修飾FFL mRNA(パネル1、2)およびFFL mRNA(パネル3、4)で噴霧療法後6時間でのマウスのBLIイメージを示す。

0037

定義
本発明がより容易に理解されるために、特定の用語を以下で最初に定義する。続く用語および他の用語の追加の定義は明細書を通して説明する。

0038

アミノ酸:本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」という用語は最も広義では、ポリペプチド鎖に組み込み可能な任意の配合物および/または物質を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は一般構造H2N−C(H)(R)−COOHを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は自然発生のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はd−アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はl−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は自然発生のペプチドに一般的に存在する20種類のl−アミノ酸のいずれをも意味する。「非標準アミノ酸」は合成的に調製されたかまたは天然ソースから得られたかに関係なく、標準アミノ酸以外のアミノ酸のいずれをも意味する。本明細書で用いられる場合、「合成アミノ酸」は化学修飾アミノ酸を含み、塩に限定されず、アミノ酸誘導体アミドなど)、および/または代用物を含む。ペプチド中のカルボキシおよび/またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、ペプチドの循環する半減期を変えることができる他の化学基で、それらの活動に悪影響を与えることなくメチル化アミド化アセチル化保護基および/または代用物によって修飾可能である。アミノ酸はジスルフィド結合関与し得る。アミノ酸は1つ以上の化学物質との連携(例えば、メチレン基アセテート基アセチル基リン酸基ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸塩基ポリエチレングリコール部分脂質部分炭水化物部分ビオチン部分など)の1つ以上の翻訳後修飾を含み得る。「アミノ酸」という用語は「アミノ酸残基」と同一の意味で使用され、遊離アミノ酸および/またはペプチドのアミノ酸残基を意味し得る。その用語が遊離アミノ酸またはペプチドの残基を意味するのかどうかは文脈から明らかである。

0039

動物:本明細書で用いられる場合、「動物」という用語は動物界の任意のメンバーを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は発育の任意の段階のヒトを意味する。いくつかの実施形態では、「動物」は発育の任意の段階の非ヒト動物を意味する。特定の実施形態では、非ヒト動物は哺乳類(例えば、げっ歯動物、マウス、ネズミウサギサルイヌネコヒツジウシ霊長類および/またはブタ)である。いくつかの実施形態では、動物は哺乳類、鳥類爬虫類両生類魚類昆虫類および/または虫類を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、動物は遺伝子導入動物遺伝子改変動物、および/またはクローンであり得る。

0040

「およそ」または「約」:本明細書で用いられる場合、「およそ」または「約」という用語は1つ以上の着目の値に適用され、定まった基準値と類似している値を意味する。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特別に記載されるかまたは文脈(そのような数値が所定の数値の100%を超える場合を除き)から明白である場合を除き、どちらかの方向(超えるかまたは未満)で記載の基準値の25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、またはそれ未満に収まる値の範囲を指す。

0041

投与計画:本明細書で用いられる「投与計画」(または「治療計画」)という用語は、被験者に個々に投与される、典型的には期間に分離される、一組の単回投与(典型的に1回を超える)である。いくつかの実施形態では、所与治療薬は1つ以上の投与を含み得る、推奨される投与計画を有する。いくつかの実施形態では、投与計画は同一の長さの期間までに互いから分離される複数の投与を含み、いくつかの実施形態では、投与計画は複数の投与および個々の投与を分離する少なくとも2つの異なる期間を含む。

0042

発現:本明細書で用いられる場合、核酸配列の「発現」は、以下のイベントの1つ以上を意味する:(1)DNA配列(例えば、転写によって)からのRNAテンプレートの生産、(2)RNA転写の処理(例えば、組換え編集、5′キャップ形成、および/または3′終点形成)、(3)ポリペプチドまたはタンパク質へのRNAの翻訳、および/または(4)ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。本出願では、「発現」および「生産」という用語、および文法上の同義語は同一の意味で使用される。

0043

改良、増加または減少:本明細書で用いられる場合、「改良」、「増加」または「減少」という用語、または文法上の同義語は、本明細書に記載の治療の開始より前の同一の個体の測定、または本明細書に記載の無治療の1対照被験者(または複数の対照被験者)の測定などの基線測定と比較して値を示す。「対照被験者」は被験者が治療される同一の病気の形を患う被験者であり、その人は被験者が治療されるのとおよそ同一の年齢である。

0044

インビトロ:本明細書で用いられる場合、「インビトロ」という用語は人工的な環境、例えば、多細胞生物内でよりもむしろ、試験管または反応容器細胞培養などで起こるイベントを意味する。

0045

インビボ:本明細書で用いられる場合、「インビボ」という用語はヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こるイベントを意味する。細胞に基づくシステムの文脈では、生きている細胞内(例えばインビトロ系とは対照的に、)で起こるイベントを意味するのに、この用語は使用し得る。

0046

メッセンジャーRNA(mRNA):本明細書で用いられる場合、「メッセンジャーRNA (mRNA)」という用語は少なくとも1つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。mRNAは本明細書で用いられる場合、修飾および非修飾RNAの両方を含む。mRNAは、1つ以上のコードおよび非コード領域を含み得る。

0047

核酸:本明細書で用いられる場合、「核酸」という用語は最も広義では、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込み可能な任意の配合物および/または物質を意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、リン酸ジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれる、または組み込み可能な配合物および/または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基(例えば、ヌクレオチドおよび/またはヌクレオシド)を意味する。いくつかの実施形態では、「核酸」は個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を意味する。いくつかの実施形態では、「核酸」はRNAならびに一本および/または二本鎖DNAおよび/またはcDNAを含む。さらに、「核酸」、「DNA」、「RNA」という用語、および/または類似の用語は核酸類似体、すなわち、リン酸ジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で周知であり、骨格のリン酸ジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明の範囲内と考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は互いの縮退したバージョンであるか、かつ/または同一のアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および/またはRNAはイントロンを含み得る。核酸は天然ソースからの精製、組換発現系を使用した生成および任意の精製、化学的合成などが可能である。適切には、例えば化学的に合成した分子の場合、核酸は化学修飾塩基または糖、骨格修飾などの類似体を有するヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、別様が指示されない限り、5′〜3′方向に提示される。いくつかの実施形態では、核酸は天然のヌクレオシド(例えば、アデノシンチミジングアノシンシチジンウリジンデオキシアデノシンデオキシチミジンデオキシグアノシン、およびデオキシシチジン)、ヌクレオシド類似体(例えば、2−アミノアデノシン、2−チオチミジン、イノシンピロロピリミジン、3−メチルアデノシン、5−メチルシチジン、C−5プロピニル−シチジン、C−5プロピニル−ウリジン、2−アミノアデノシン、C5−ブロモウリジン、C5−フルオロウリジン、C5−ヨードウリジン、C5−プロピニル−ウリジン、C5−プロピニル−シチジン、C5−メチルシチジン、2−アミノアデノシン、7−デアザアデノシン、7−デアザグアノシン、8−オキソアデノシン、8−オキソグアノシン、O(6)−メチルグアニン、および2−チオシチジン)、化学修飾塩基、生物学的修飾塩基(例えば、メチル化塩基)、層間塩基、修飾糖質(例えば、2′−フルオロリボース、リボース、2′−デオキシリボースアラビノース、および六炭糖)、および/または修飾リン酸基(例えば、ホスホロチオネートおよび5′−N−ホスホラミダイト結合)であるか、それらを含む。いくつかの実施形態では、本発明は核酸(ヌクレオチドおよび/またはヌクレオシドを含む、例えば、ポリヌクレオチドおよび残基)が送達を促進するか、または達成するために、化学的に修飾されていないことを意味する「非修飾核酸」を特に対象とする。

0048

患者:本明細書で用いられる場合、「患者」または「被験者」という用語は、提供される組成物が例えば、実験的、診断的、予防的、美容的および/または、治療目的のために投与され得る任意の生物体を意味する。典型的な患者は動物(例えば、マウス、ネズミ、ウサギ、非ヒト霊長類などの哺乳類、および/またはヒト)を含む。いくつかの実施形態では、患者はヒトである。ヒトは出生前後の形態を含む。

0049

薬学的に許容される:「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で用いられる場合、健全医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用アレルギー反応、または他の問題または合併症を伴わず、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に適切であり、妥当損益比に相応する物質を意味する。

0050

ポリペプチド:本明細書で用いられる場合、「ポリペプチド」は、一般的に、ペプチド結合によって互いに付着する少なくとも2つのアミノ酸の列である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも3〜5のアミノ酸を含み得、それらの各々は少なくとも1つのペプチド結合によって互いに付着する。当業者はポリペプチドが任意に、ポリペプチド鎖に統合可能であるにもかかわらず「非天然」アミノ酸または他の物質を含むことがあることを理解するであろう。

0051

タンパク質:本明細書で用いられる場合、「タンパク質」または「治療タンパク質」という用語はポリペプチド(すなわち、ペプチド結合によって互いに連鎖する少なくとも2つのアミノ酸の列)を意味する。タンパク質はアミノ酸(例えば、糖タンパク質プロテオグリカン、など)以外の部分を含み得、かつ/またはそうでなければ処理または修正し得る。当業者は「タンパク質」は細胞(単一配列を伴うかまたは伴わない)によって生成される完全なポリペプチド鎖またはそれらの特徴的な部分であり得ることを理解するであろう。当業者はタンパク質が、例えば1つ以上のジスルフィド結合に連鎖されるか、または他の手段で関連付けられる、1つを超えるポリペプチド鎖を含み得ることがあることを理解するであろう。ポリペプチドはl−アミノ酸、d−アミノ酸、または両方および当技術分野で周知である任意の各種アミノ酸修飾または類似体を含み得る。有用な修飾は、例えば、末端のアセチル化、アミド化、メチル化を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成アミノ酸およびそれらの組み合わせを含み得る。「ペプチド」という用語は一般的に、約100未満のアミノ酸、約50未満のアミノ酸、20未満のアミノ酸、または10未満のアミノ酸の長さを有するポリペプチドを意味するために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗体、抗体断片、それらの生物学的に活性な部分、および/またはそれらの特徴的な部分である。

0052

被験者:本明細書で用いられる場合、「被験者」という用語はヒトまたは任意の非ヒト動物(例えば、マウス、ネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類)を意味する。ヒトは出生前後の形態を含む。多くの実施形態では、被験者はヒトである。被験者は患者であり得、診断または疾患の治療のために医療提供者に現れているヒトを意味する。本明細書で用いられる「被験者」という用語は「個人」または「患者」と同一の意味で使用される。被験者は疾患または障害を患っているか、感染し易い可能性があるが、疾患または障害の徴候を示さないかもしれない。

0053

治療上有効な量:本明細書で用いられる場合、治療薬の「治療上有効な量」という用語は、疾患、障害、および/または状態の治療、診断、予防、および/または症状(複数可)の発症を遅らせるために疾患、障害、および/または状態に悩まされているかまたは感染し易い被験者に対して投与するときに、十分な量を意味する。当業者は治療上有効な量は、典型的に少なくとも1回の投与単位を含む投与計画を介して投与されることを理解するであろう。

0054

治療:本明細書で用いられる場合、「治療」(また「治療する」もしくは「治療している」)という用語は、部分的にまたは完全に1つ以上の症状、症候、および/または特定の疾患の原因、障害、および/または状態(例えば、インフルエンザ)を緩和し、回復させ、蘇生させ、阻害し、発症を遅らせ、重症度を減少させ、かつ/または発生率を減少させる任意の物質の投与(例えば、提供される組成物)を意味する。そのような治療は関連する疾患、障害、および/または状態の徴候を示さない被験者および/または疾患、障害、および/または状態の初期の徴候を示す被験者のためであり得る。あるいはまたはさらに、そのような治療は関連する疾患、障害および/または状態の1つ以上の確立した徴候を示す患者のためであり得る。いくつかの実施形態では、治療は関連する疾患、障害および/または状態に悩まされていると診断される被験者のためであり得る。いくつかの実施形態では、治療は関連する疾患、障害および/または状態の発生の増加する危険性が統計学的に相関される1つ以上の感染性因子を有すると周知の被験者のためであり得る。

0055

詳細な説明
本発明、とりわけ、経肺送達に基づいてmRNAおよび/またはそのタンパク質生成物の全身的な送達のための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、非肺細胞および組織へのmRNAおよび/またはタンパク質の送達のために、被験者の肺へのmRNAおよび脂質担体媒体を含む組成物の投与方法を提供する。いくつかの実施形態では、単一のタンパク質をコードするmRNAが送達される。いくつかの実施形態では、1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上のmRNA種が送達される。いくつかの実施形態では、mRNAは単一の脂質担体媒体(例えばリポソームまたは脂質由来ナノ粒子)を使用して送達される。いくつかの実施形態ではmRNAは1つ以上の脂質担体媒体を使用して送達される。

0056

本発明の様々な態様は後に続く節で詳細に説明される。節の使用は、本発明を制限するものではない。各節は本発明のどんな態様にも適用できる。本出願では、「または」の使用は、明言されない限り「および/または」を意味する。
mRNAおよびmRNA合成物

0057

本発明に従うmRNAは任意の各種周知の方法に従い合成され得る。例えば、本発明に従うmRNAはインビトロ転写(IVT)を介して合成され得る。簡潔に言えば、IVTは典型的にプロモーターを含む直鎖または環状DNAテンプレート、リボヌクレオチド三リン酸プール、DTTおよびマグネシウムイオンを含み得るバッファシステム、および適切なRNAポリメラーゼ(例えば、T3、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ)、DNAse I、ピロホスファターゼ、および/またはRNAse阻害剤で実施される。正確な状態は、特定の適用に従い変化する。

0058

いくつかの実施形態では、本発明に従うmRNAの調製のために、DNAテンプレートはインビトロで転写される。適切なDNAテンプレートは、典型的にはプロモーター、例えば、インビトロで転写のためのT3、T7またはSP6プロモーターを有し、望ましいmRNAおよび終結信号のための望ましいヌクレオチド配列がそれに続く。

0059

本発明に従うmRNA配列は、標準方法を使用してDNAテンプレートに決定しかつ組み込むことができる。例えば、望ましいアミノ酸配列から始まり、仮想逆翻訳は遺伝子コードの縮退に基づいて実施される。最適化アルゴリズムは続いて、適切なコドンの選択のために使用できる。典型的に、G/C含量は一方で可能な限り高いG/C含量に達するよう最適化され、他方でコドン使用頻度に従ってtRNA頻度最大限考慮に入れる。最適化されたRNA配列は、例えば、適切な表示装置を使用し、かつ第1の(野生型)配列と比較して設置かつ表示可能である。第2の構造はまた、安定化または不安定化特性、またはそれぞれRNAの領域を計算するために分析可能である。

0060

本発明に従うmRNAは、非修飾または修飾mRNAとして合成され得る。いくつかの実施形態では、免疫原性を減らし、ならびにmRNAの安定性を改善するためにトール様受容体TLR3、TLR7、TLR8およびレチノイド誘導性遺伝子I(RIG−I)でmRNA相互作用廃止するために、mRNAは1つ以上の化学的または構造修飾を含み得る。

0061

例えば、特定の実施形態では、1つ以上のプソイドウリジン残基を含むために、米国特許公報第2009/0286852号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載されるように、mRNAは修飾され得る。Kormannら、Nature Biotechnology29(2):154−157(2011)は、2−チオウリジンおよび5−メチルシチジンでウリジンおよびシチジンの置換を記載し、mRNA結合を相乗効果的に減少させ、認識受容体TLR3、TLR7、TLR8およびRIG−Iをパターン化して、mRNAの安定性を増す。EP2459231を参照されたい。さらに他の実施形態では、欧州出願第EP10742089号(参照により本明細書に組み込まれる)で記載される免疫原性を減らすために、mRNAは修飾され得る。

0062

他の実施形態では、mRNAの修飾は、例えば、RNAのヌクレオチドの修飾を含むことができる。本発明に従う修飾されたmRNAは、例えば、骨格修飾、糖修飾または塩基修飾をこのように含むことができる。いくつかの実施形態では、関心のタンパク質をコードするmRNAは、自然発生のヌクレオチドやヌクレオチド類似物(修飾ヌクレオチド)から合成され得、プリンアデニン(A)、グアニン(G)またはピリミジン(チミン(T)、シトシン(C)、ウラシル(U)、および例えば1−メチル−アデニン、2−メチル−アデニン、2−メチルチオ−N−6−イソペンテニル−アデニン、N6−メチル−アデニン、N6−イソペンテニル−アデニン、2−チオ−シトシン、3−メチル−シトシン、4−アセチル−シトシン、5−メチル−シトシン、2,6−ジアミノプリン、1−メチル−グアニン、2−メチル−グアニン、2,2−ジメチル−グアニン、7−メチル−グアニン、イノシン、1−メチル−イノシン、プソイドウラシル(5−ウラシル)、ジヒドロ−ウラシル、2−チオ−ウラシル、4−チオ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオ−ウラシル、5−(カルボキシヒドロキシメチル)−ウラシル、5−フルオロ−ウラシル、5−ブロモ−ウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−ウラシル、5−メチル−2−チオ−ウラシル、5−メチル−ウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、5−メチルアミノメチル−ウラシル、5−メトキシルアミノメチル−2−チオ−ウラシル、5′−メトキシルカルボキシメチル−ウラシル、5−メトキシル−ウラシル、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸(v)、1−メチル−プソイドウラシル、クエオシン、β−D−マンノシル−クエオシン、ワイブトキソシンなどの修飾ヌクレオチド類似体またはプリンおよびピリミジン誘導体、およびホスホロアミド酸、ホスホロチオネート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホン酸、7−デアザグアノシン、5−メチルシトシンおよびイノシンを含むがこれに限定されない。そのような類似体の調製は当業者にとって、例えば、米国特許第4,373,071号、米国特許第4,401,796号、米国特許第4,415,732号、米国特許第4,458,066号、米国特許第4,500,707号、米国特許第4,668,777号、米国特許第4,973,679号、米国特許第5,047,524号、米国特許第5,132,418号、米国特許第5,153,319号、米国特許第5,262,530号および第5,700,642号から周知であり、参照によりその開示の全体が本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる、G.Tavernierら、J.Controlled Release 150:238−247(2011)およびWO2010/053572を参照されたい。修飾ヌクレオシド広範囲リストを提供するUS2009/0286852の¶¶55および68−75、およびmRNAの安定性およびタンパク質生産を増やすために多数のmRNAの修飾を記述するWO2008/052770(参照により本明細書に組み込まれる)もまた参照されたい。

0063

いくつかの実施形態では、mRNAはRNA骨格修飾を含み得る。典型的に、骨格修飾は、その中でRNAに含まれるヌクレオチドの骨格のリン酸塩が化学的に修飾される修飾である。代表的な骨格修飾は典型的に他のアニオン性カチオン性、または中性塩基によってリン酸ジエステル結合を置換することによって意味する、メチルホスホン酸、メチルホスホロアミド酸、ホスホロアミド酸、ホスホロチオエート(例えば、シチジン5′−O−(1−チオリン酸塩)、ボラノリン酸、正帯電グアニジウム基などからなる群からの修飾を含むがこれらに限定されない。

0064

いくつかの実施形態では、mRNAは糖修飾を含み得る。典型的な糖修飾はmRNAが含むヌクレオチドの糖の化学的修飾であり、2′−デオキシ−2′−フルオロ−オリゴリボヌクレオチド(2′−フルオロ−2′−デオキシシチジン5′−三リン酸、2′−フルオロ−2′−デオキシウリジン5′−三リン酸)、2′−デオキシ−2′−ジアミン−オリゴリボヌクレオチド(2′−アミノ−2′−デオキシシチジン5′−三リン酸、2′−アミノ−2′−デオキシウリジン5′−三リン酸)、2′−O−アルキルオリゴリボヌクレオチド、2′−デオキシ−2′−C−アルキルオリゴリボヌクレオチド(2′−O−メチルシチジン5′−三リン酸、2′−メチルウリジン5′−三リン酸)、2′−C−アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびそれらの異性体(2′−アラシチジン5′−三リン酸、2′−アラウリジン5′−三リン酸)、またはアジド三リン酸(2′−アジド−2′−デオキシシチジン5′−三リン酸、2′−アジド−2′−デオキシウリジン5′−三リン酸)からなる群から選択される糖修飾を含むがこれらに限定されない。

0065

いくつかの実施形態では、mRNAはヌクレオチドの塩基の修飾(塩基修飾)を含み得る。塩基修飾を含む修飾ヌクレオチドは塩基修飾ヌクレオチドとも呼ばれる。そのような塩基修飾ヌクレオチドの例は、2−アミノ−6−クロロプリンリボシド5′−三リン酸、2−アミノアデノシン5′−三リン酸、2−チオシチジン5′−三リン酸、2−チオウリジン5′−三リン酸、4−チオウリジン5′−三リン酸、5−アミノアリルシジン5′−三リン酸、5−アミノアリルウリジン5′−三リン酸、5−ブロモシチジン5′−三リン酸、5−ブロモウリジン5′−三リン酸、5−ヨードシチジン5′−三リン酸、5−ヨードウリジン5′−三リン酸、5−メチルシチジン5′−三リン酸、5−メチルウリジン5′−三リン酸、6−アザシチジン5′−三リン酸、6−アザウリジン5′−三リン酸、6−クロロプリンリボシド5′−三リン酸、7−デアザアデノシン5′−三リン酸、7−デアザグアノシン5′−三リン酸、8−アザアデノシン5′−三リン酸、8−アジドアデノシン5′−三リン酸、ベンズイミダゾールリボシド5′−三リン酸、N1−メチルアデノシン5′−三リン酸、N1−メチルグアノシン5′−三リン酸、N6−メチルアデノシン5′−三リン酸、O6−メチルグアノシン5′−三リン酸、プソイドウリジン5′−三リン酸、プロマイシン5′−三リン酸またはキサントシン5′−三リン酸を含むがこれらに限定されない。

0066

特定の実施形態では、安定化修飾はmRNAの3′および5′末端の一方または両方に作製され得、例えば、終点キャップポリテール、不安定な非コード配列の置換(アデニル酸ウリジル酸リッチ領域(ARE)または追加または安定mRNAの3′または5′非翻訳配列(例えば、βグロビンアクチン、GAPDH、チューブリンヒストン、またはクエン酸回路酵素mRNAなど)を含む。安定化修飾はまたmRNA内で作製され得、例えば、コドン最適化および/またはコザック配列の修飾および/または修飾ヌクレオシドの取り込み(例えば、ピロロ−ピリミジン、C5−ヨードウリジン、2−アミノアデノシン、および2−チオチオチミジンなど)を含む。特定の実施形態では、方法で使用される修飾mRNAおよび本発明の組成物はCMV最初期1(IE1)遺伝子からの5′非翻訳配列:
XCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCUCCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACGを含み、式中X、現在がGGAの場合(配列番号1)、または少なくとも90%または少なくとも95%配列番号1と同一である配列、および/またはヒト成長ホルモン(hGH)からの3′非翻訳配列:
CGGGUGGCAUCCCUGUGACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCAGUGCCCACCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(配列番号2)、またはヌクレアーゼ耐性を改善しかつ/またはmRNAの半減期を改善するために少なくとも90%または少なくとも95%配列番号2と同一である配列。mRNAポリヌクレオチド配列の増加した安定性に加えて、驚くべきことにCMV最初期1(IE1)遺伝子の非翻訳配列および/またはhGH遺伝子からの非翻訳配列の包含はmRNAの翻訳をさらに強化することが発見された。

0067

典型的に、mRNA合成物はN−末端(5′)終点に対する「キャップ」、およびC−末端(3′)終点に対する「鎖」の追加を含む。キャップの存在は、大部分の真核細胞に見られるヌクレアーゼへの耐性を提供するのに重要である。「鎖」の存在は、エキソヌクレアーゼ分解からmRNAを保護する役割を果たす。

0068

このように、いくつかの実施形態では、本発明のmRNAは5′キャップ構造を含む。5′キャップは典型的に次のように追加される:最初に、RNA末端ホスファターゼは5′ヌクレオチドからの末端リン酸基の1つを除去し、2つの末端リン酸を残し、グアノシン三リン酸GTP)は続いてグアニリルトランスフェラーゼを通して末端リン酸に追加され、5′5′5三リン酸結合を生成し、グアニンの7−窒素メチルトランスフェラーゼによってメチル化される。キャップ構造の例はm7G(5′)ppp(5′(A,G(5′)ppp(5′)AおよびG(5′)ppp(5′)Gを含むがこれらに限定されない。

0069

いくつかの実施形態では、本発明のmRNAは3′ポリ(A)鎖構造を含む。mRNAの3′末端上のポリA鎖は典型的に約10〜300のアデノシンヌクレオチド(例えば、約10〜200のアデノシンヌクレオチド、約10〜150のアデノシンヌクレオチド、約10〜100のアデノシンヌクレオチド、約20〜70のアデノシンヌクレオチド、または約20〜60のアデノシンヌクレオチド)を含む。いくつかの実施形態では、本発明のmRNAは3′ポリ(C)鎖構造を含む。mRNAの3′末端上の適切なポリC鎖は典型的に約10〜200のシトシンヌクレオチド(例えば、約10〜150のシトシンヌクレオチド、約10〜100のシトシンヌクレオチド、約20〜70のシトシンヌクレオチド、約20〜60のシトシンヌクレオチド、または約10〜40のシトシンヌクレオチド)を含む。ポリC鎖はポリA鎖に追加可能であるか、またはポリA鎖を置換し得る。

0070

いくつかの実施形態では、本発明のmRNAは5′および/または3′非翻訳領域を含む。いくつかの実施形態では、5′非翻訳領域はmRNAの安定性または翻訳に影響する1つ以上の要素、例えば、鉄応答要素を含む。いくつかの実施形態では、5′非翻訳領域は約50〜500の間のヌクレオチドの長さであり得る。

0071

いくつかの実施形態では、3′非翻訳領域はポリアデニル化シグナルの1つ以上、細胞内での配置のmRNAの安定性に影響するタンパク質の1つの結合部位、マイクロRNAの1つ以上の結合部位を含む。いくつかの実施形態では、3′非翻訳領域は50〜500の間のヌクレオチドの長さまたはそれより長くあり得る。
mRNAによってコードされるタンパク質

0072

本発明の組成物および方法で使用されるmRNAは、非肺組織および細胞への送達のために全長、切断、天然または修飾タンパク質を発現するために使用され得る。いくつかの実施形態では、mRNAはタンパク質(すなわち、治療タンパク質)をコードする少なくとも1つのmRNA種を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは1つ以上の遺伝子産物をコードする複数のmRNA種を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは、各々が異なる遺伝子産物をコードする少なくとも2つのmRNA種を含む。いくつかの実施形態では、mRNAは全長タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは自然発生の全長タンパク質の切断されたバージョンをコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは単一転写の異なる遺伝子産物からの1つ以上の切断タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAはキメラタンパク質をコードし、その中で1つ以上のタンパク質配列は天然タンパク質とは自然に関連せず、発現の間、結果として生じるキメラタンパク質でペプチド結合によって連鎖される。いくつかの実施形態では、mRNAは天然タンパク質以上のレベルの細胞活動を含む部分または全長タンパク質を発現するために使用され得る。いくつかの実施形態では、mRNAは天然タンパク質以下のレベルの細胞活動で部分または全長タンパク質を発現するために使用され得る。

0073

いくつかの実施形態では、mRNAは細胞内タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞質タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAはアクチン細胞骨格と関連したタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは形質膜と関連したタンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、mRNAは膜貫通タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、mRNAはイオンチャネルタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは核周囲タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは核タンパク質をコードする。いくつかの特定の実施形態では、mRNAは転写因子をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAはシャペロンタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNA細胞内酵素(例えば、尿素回路またはリソソーム貯蔵代謝性障害に関連した酵素をコードするmRNA)をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは、細胞代謝、DNA修復、転写および/または翻訳を含むタンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞外タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは細胞外基質に関連するタンパク質をコードする。いくつかの実施形態ではmRNAは分泌性タンパク質をコードする。特定の実施形態では、組成物で使用されるmRNAおよび本発明の方法は、1つ以上の標的細胞によって、周囲の細胞外液(例えば、ホルモンおよび神経伝達物質をコードするmRNA)に排出または分泌される機能的なタンパク質または酵素を発現するために使用され得る。

0074

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、分泌性タンパク質をコードするmRNAの送達を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表1に記載の1つ以上の分泌性タンパク質をコードするmRNA送達を提供し、このように、本発明の組成物は本明細書に規定の他の成分とともに、表1(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のタンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに、表1(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のタンパク質をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。

0075

表1で説明されるユニプロットIDは、各々の記載されるタンパク質および配列がユニプロットデータベースから入手可能なヒトのバージョンを意味する。記載されたタンパク質の配列は、一般に様々な哺乳類および様々な動物および獣医学の動物または産業的対象を含む、様々な動物にも利用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表1に記載される分泌性タンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれる1つ以上のタンパク質をコードする1つ以上のmRNAの送達を提供し、このように、本発明の組成物は、本明細書に規定の他の成分とともに表1に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに表1に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、哺乳類の相同体は、マウス、ラットハムスタースナネズミ、ウマ、ブタ、ウシ、ラマアルパカミンク、イヌ、ネコ、フェレット、ヒツジ、ヤギ、またはラクダの相同体から選択される。いくつかの実施形態では、獣医学の動物または産業的対象は上述の哺乳類および/またはニワトリカモシチメンチョウサケナマズ、またはティラピアから選択される。

0076

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表2に記載の1つ以上の追加の代表的なタンパク質をコードする1つ以上のmRNA送達を提供し、このように、本発明の組成物は本明細書に規定の他の成分とともに、表2(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のタンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに、表2(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のタンパク質から選択されたタンパク質をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。

0077

表2で説明されるユニプロットIDは、各々の記載される仮想タンパク質および配列がユニプロットデータベースから入手可能なヒトのバージョンを意味する。記載されたタンパク質の配列は、様々な哺乳類および様々な動物および獣医学の動物または産業的対象を含む、様々な動物にも利用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表2に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードする1つ以上のmRNAの送達を提供し、このように、本発明の組成物は、本明細書に規定の他の成分とともに表2に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに表2に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、哺乳類の相同体は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウマ、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカ、ミンク、イヌ、ネコ、フェレット、ヒツジ、ヤギ、またはラクダの相同体から選択される。いくつかの実施形態では、獣医学の動物または産業的対象は上述の哺乳類および/またはニワトリ、カモ、シチメンチョウ、サケ、ナマズ、またはティラピアから選択される。

0078

実施形態では、本発明の組成物および方法は、表3から選択されるリソソームタンパク質をコードするmRNAの送達を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表3に記載の1つ以上のリソソームおよび/または関連するタンパク質をコードする1つ以上のmRNA送達を提供し、このように、本発明の組成物は本明細書に規定の他の成分とともに、表3(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のタンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに、表3(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のタンパク質から選択されたタンパク質をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。

0079

リソソームタンパク質に関する情報はLubkeら、“Proteomics of the Lysosome,”Biochim Biophys Acta.(2009)1793:625-635から入手可能である。いくつかの実施形態では、表3に記載され、本発明の組成物および方法においてmRNAでコードされたタンパク質はヒトタンパク質である。記載されたタンパク質の配列は、様々な哺乳類および様々な動物および獣医学の動物または産業的対象を含む、様々な動物にも利用可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表3に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードする1つ以上のmRNAの送達を提供し、このように、本発明の組成物は、本明細書に規定の他の成分とともに表3に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は本明細書に規定の他の成分とともに表S3に記載されるタンパク質の獣医学の動物または産業的対象から哺乳類の相同体または相同体から選ばれるタンパク質をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、哺乳類の相同体は、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ、ウマ、ブタ、ウシ、ラマ、アルパカ、ミンク、イヌ、ネコ、フェレット、ヒツジ、ヤギ、またはラクダの相同体から選択される。いくつかの実施形態では、獣医学の動物または産業的対象は上述の哺乳類および/またはニワトリ、カモ、シチメンチョウ、サケ、ナマズ、またはティラピアから選択される。

0080

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表4に記載される治療タンパク質(例えば、細胞質、膜貫通または分泌性)をコードするmRNAの送達を提供する。いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は、表4に記載の疾患または障害(すなわち、適応症)を治療するための有用な治療タンパク質をコードするmRNA送達を提供し、このように、本発明の組成物は、表4に記載の疾患または障害(すなわち、適応症)を治療するための本明細書に規定の他の成分とともに、表4(またはそれらの相同体、後述のように)に記載のまたは記載されない治療タンパク質をコードするmRNAを含み得、本発明の方法は、表4に記載の疾患または障害の治療のために本明細書に規定の他の成分とともに、そのようなタンパク質(またはそれらの相同体、後述のように)をコードするmRNAを含む組成物を調製および/または投与することを含み得る。

0081

いくつかの実施形態では、本発明の1つ以上の治療タンパク質は表1、2、3または4から選択される。いくつかの特定の実施形態では、1つ以上の治療タンパク質は、αガラクトシダーゼ、エリスロポエチン、α1−アンチトリプシン、カルボキシペプチダーゼN、α−L−イズロニダーゼ、イズロネート−2−スルファターゼ、N−アセチルグルコサミン−1−リン酸トランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミニダーゼ、リソソーム酸性リパーゼ、アリールスルファターゼ−Aα−グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、N−アセチルガラクトサミン−4−スルファターゼ、β−グルコシダーゼ、ガラクトース−6−硫酸塩スルファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、ヘパランスルファミダーゼ、ヒアルロニダーゼ、ガラクトセレブロシダーゼ、ヒト成長ホルモン、オルニチントランスカルバミルラーゼ(OTC)、カルバミルリン酸塩合成酵素−1(CPS1)、アルギニノコハク酸合成酵素−1(ASS1)、アルギニノコハク酸リアーゼ(ASL)、アルギナーゼ−1(ARG1)、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子(CFTR)、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、ヘパラン−N−スルファターゼおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。

0082

いくつかの実施形態では、本発明は表1、2、3または4に記載のタンパク質で記載または関連付けられる疾患または障害に罹患した被験者を予防、治療および/または治癒するために使用される。本発明の組成物および方法が用いられ得る疾患または障害は、SMN1関連脊髄筋萎縮症(SMA)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、GALT関連ガラクトース血症、嚢胞性線維症(CF)、SLC3A1関連障害、シスチン尿症、COL4A5関連障害、アルポート症候群、ガラクトセレブロシダーゼ欠乏症、X連鎖副腎脳白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、フリートライヒ失調症、ペリツェウス‐メルツバッハー病、TSC1またはTSC2関連結節性硬化症、B型サンフィリポ症候群(MPS IIIB)、CTNS関連シスチン症、FMR1関連障害、脆弱X症候群を含む、脆弱X関連振動/運動失調症候群、脆弱X早期卵巣不全症候群、プラデル−ウィリ症候群、ファブリー病、遺伝出血性毛細管拡張症(AT)、ニーマンピック病C1型、神経セロイドリポフスチン関連疾患、若年型神経セロイドリポフスチン症(JNCL)、若年性バッテン病、サンタヴォリハルティア病、ヤンスキービールショースキー病、PTT−1欠乏症、TPP1欠乏症、EIF2B1、EIF2B2、EIF2B3、EIF2B4、およびEIF2B5関連中枢神経系ミエリン形成不全/消滅白質による小児運動失調、CACNA1AおよびCACNB4関連発作性運動失調症2型、MECP2関連障害、古典的なレット症候群、MECP2関連重度の新生児脳症、PPM−X症候群、CDKL5関連非定型レット症候群、ケネディ病(SBMA)、Notch−3関連皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳常染色体優性動脈疾患(CADASIL)、SCN1AおよびSCN1B関連発作疾患、ポリメラーゼG関連障害、アルパース−フッテンロッハー症候群、POLG関連感覚性失調性神経障害、構音障害、眼不全麻痺、ミトコンドリアDNA削除による常染色体優性および劣性進行性外眼筋麻痺、X連鎖副腎形成不全、X連鎖無ガンマグロブリン血症、ウィルソン病および血液凝固障害などの障害を含むがこれらに限定されない。

0083

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法で使用されるmRNAは、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、mRNAは1つを超える遺伝子によってコードされるサブユニットからなるタンパク質をコードする。例えば、タンパク質はヘテロ二量体であり得、その各鎖またはサブユニットは別個の遺伝子によってコードされる。あるいは、単一のmRNAは1つを超えるサブユニットをコードするために操作され得る。ある実施形態において、mRNAは被験者に免疫を与えるために、全長抗体可変部および定常部重鎖および軽鎖の両方)または抗体の断片(例えば、Fab、Fv、または単鎖Fv(scFv))をコードし得る。

0084

本明細書で用いられる場合、「重鎖」という用語は免疫グロブリンの異なるクラスのすべての型の自然発生の重鎖を含み、IgM(μ)、IgD(δ)、IgG(γ)、IgA(α)、およびIgE(ε)、および生物学的に活性であるそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。典型的に、本発明に従う重鎖は抗原認識の役割を果たすN−末端可変部を含み、典型的にCDR1、CDR2およびCDR3を含み、4つのフレームワーク部(FR1、FR2、FR2、およびFR4)で分離される。典型的に、N−末端可変部は約100〜110またはそれらを超えるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、本発明に従う重鎖は定常部ドメイン(例えば、CH1、CH2、および/またはCH3)の1つ以上を含む。いくつかの実施形態では、抗体の重鎖をコードするmRNAは0.3kb、0.5kb、0.75kb、1.0kb、1.25kb、1.5kb、1.75kb、2.0kb、2.5kb、3.0kb、3.5kb、4.0kb以上の長さである。

0085

本明細書で用いられる場合、「軽鎖」という用語は免疫グロブリンの異なるクラスのすべての型の自然発生の重鎖を含み、κまたはλアイソタイプおよび生物学的に活性であるそれらの変異体を含むが、これらに限定されない。典型的に、本発明に従う軽鎖はN−末端可変ドメイン(VL)を含む。いくつかの実施形態では、本発明に従う軽鎖はC−末端定常部ドメイン(CL)を含む。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、抗体の軽鎖をコードするmRNAは0.1kb、0.2kb、0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1.0kb、1.25kb、1.5kb、1.75kb、2.0kb、2.5kb、または3.0kb以上の長さである。

0086

本発明に従い、抗体の重鎖および軽鎖は単一mRNAまたは分離mRNAによってコードされ、かつ送達され得る。十分に集められた機能的な抗体の生産を最適化するために様々な比率でmRNAをコードする重鎖およびmRNAをコードする軽鎖を送達することが有利な場合があると意図される。

0087

いくつかの実施形態では、mRNAは付加的に1つの抗体、抗体断片(複数可)、または他のタンパク質(複数可)に操作可能に連鎖され、かつそれらの直接的な分泌である1つ以上の分泌リーダー配列をコードし得る。適切な分泌リーダー配列は、例えば、US2008/0286834A1に記載される。本発明発明の一実施形態は被験者に免疫を与えるために有用な方法および組成物に関するが(例えば、機能的な抗体をコードするmRNAの翻訳を通して)、本明細書に開示され、ここに意図される発明は広く適用可能である。他の実施形態では、本発明の組成物は被験者の機能的反応に一時的または慢性的に作用するために使用され得る抗体をコードする。例えば、本発明のmRNAは、モノクローナルまたはポリクローナル抗体をコードし得、標的細胞からの翻訳および分泌において生物学的標的(例えば、腫瘍壊死因子受容体などの刺激性サイトカイン)を標的および/または不活性化するために使用され得る。
脂質担体媒体

0088

標的細胞に核酸の送達を促進する脂質担体媒体の使用は本発明によって意図される。脂質担体媒体(例えば、リポソームおよび脂質由来のナノ粒子)は、一般的に研究、産業、および医学における様々な用途、特にインビボで診断または治療的配合物の移動媒体としてのそれらの使用において有用であり、(Lasic,TrendsBiotechnol.,16:307−321,1998;Drummondら、Pharmacol.Rev.,51:691−743,1999)通常1つ以上の二分子層の膜による外部媒体から隔離された内部の水スペースを有する微細小胞として特徴付けられる。リポソームの二分子層膜は、典型的に空間的に分離された親水的および疎水的ドメインを含む合成脂質または天然物由来物などの両親媒性分子によって形成される(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307−321,1998)。リポソームの二分子層膜は、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤(例えば、ポリマーソームニオソーム、など)によっても形成できる。

0089

本発明の文脈では、脂質担体媒体は典型的にmRNAを標的細胞に移送する役割を果たす。本発明の1つの予期しない、有利な特色は、脂質担体媒体内でカプセル化されるmRNAの経肺投与が、非肺細胞および組織へのmRNAおよび/またはタンパク質の送達をもたらすという観察であった。本発明の目的のために、リポソーム型移動媒体は望ましい核酸を含むよう調製される。リポソームへの望ましい実体(例えば、核酸)の取り込み処理はしばしば「積み込み」(Lasicら、FEBSLett.,312:255−258,1992)と言及される。リポソーム取り込み核酸はリポソームの内部スペースに完全にまたは部分的に配置され得、リポソームの二分子層膜の内部、またはリポソーム膜の外面に付着する。リポソームへの核酸の取り込みは本明細書で「カプセル化」として言及され、核酸はリポソームの内部のスペースの中で、完全に含まれる。リポソームなどの移動媒体にmRNAを取り込む目的は、しばしば核酸の急速な排出を引き起こす核酸および/または系統または受容体を分解する酵素または化学物質を含み得る環境から核酸を保護することにある。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、選択された移動媒体はそれに含まれるmRNAの安定性を増強することが可能である。リポソームは、カプセル化されるmRNAが標的細胞に達することを可能にし、かつ/または優先的に、経肺送達の後、カプセル化されるmRNAが非肺組織および細胞に達することを可能にする。

0090

いくつかの実施形態では、適切な脂質担体媒体は脂質ナノ粒子として製剤化される。本明細書で用いられる場合、「脂質ナノ粒子」および「脂質担体媒体」および「脂質由来ナノ粒子」というは、すべて同一の意味で使用され、1つ以上の脂質(例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質およびPEG修飾脂質)を含む送達媒体を意味する。意図される脂質ナノ粒子は1つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質およびPEG修飾脂質を用いて変化する比率の複数成分脂質混合物を含むことによって調製され得る。適切な脂質の例は、例えば、ホスファチジル配合物(例えば、ホスファチジルグリセロールホスファチジルコリンホスファチジルセリンホスファチジルエタノールアミンスフィンゴ脂質セレブロシド、およびガングリオシド)を含む。

0091

カチオン性リポソーム/mRNA複合体は、mRNAを酵素的分解から保護し、負帯電性細胞膜と相互作用することによって細胞内送達を促進できる。しかし、インビボでリポプレックスの半減期を減らすために役立つ負帯電性タンパク質で、これらのリポプレックスのカチオン性表面も、強い相互作用を媒介する。カチオン性リポソーム/mRNA複合体および負帯電性タンパク質の間の相互作用を減らすためにメカニズムの1つ以上を用いることによって、この影響は減らされるかもしれない。大部分の実施形態において、本発明の組成物および方法で使用される送達媒体は、中性またはヘルパー脂質およびPEG修飾脂質などの1つ以上のカチオン性脂質、非カチオン性脂質組み合わせから構築されるナノ粒子を含む。

0092

脂質ナノ粒子

0093

いくつかの実施形態では、適切な送達媒体は脂質ナノ粒子として製剤化される。本発明の脂質ナノ粒子は1つ以上の脂質(例えば、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール系脂質およびPEG修飾脂質)を含む。送達媒体としてのポリマーの使用も、単独で、または他の送達媒体と組み合わせることが意図される。いくつかの実施形態では、送達媒体は非肺組織に経肺送達および転位を促進するその能力に基づいて、選択される。

0094

本明細書で用いられる場合、リポソーム型送達媒体、例えば脂質ナノ粒子は、通常1つ以上の二分子層の膜による外部媒体から隔離された内部の水スペースを有する微細な小胞として特徴付けられる。リポソームの二分子層膜は、典型的に空間的に分離された親水的および疎水的ドメインを含む合成脂質または天然物由来物などの両親媒性分子によって形成される(Lasic,TrendsBiotechnol.,16:307−321,1998)。リポソームの二分子層膜は、両染性ポリマーおよび界面活性剤(例えば、ポリマーソーム、ニオソーム、など)によっても形成できる。本発明の文脈では、リポソーム型送達媒体は典型的に望ましいmRNAを標的組織に移送する役割を果たす。リポソームへの核酸の取り込みは本明細書で「カプセル化」として言及され、核酸はリポソームの内部のスペースの中で、完全に含まれる。リポソームなどの移動媒体にmRNAを取り込む目的は、しばしば核酸の急速な排出を引き起こす核酸および/または系統または受容体を分解する酵素または化学物質を含み得る環境から核酸を保護することにある。したがって、いくつかの実施形態では、適切な送達媒体はそれに含まれるmRNAの安定性を増強することが可能であり、かつ/または標的細胞または組織へのmRNAの送達を促進する。

0095

本発明の特定の実施形態では、担体は、担体として単独で、または他の担体と組み合わせてポリマーを使用して製剤化される。適切なポリマーは、例えば、ポリアクリレートポリアルシアノアクリレートポリラクチド、ポリラクチド−ポリグリコリドコポリマーポリカプロラクトンデクトランアルブミンゼラチンアルギン酸コラーゲンキトサンシクロデキストリン、プロタミン、PEG化プロタミン、PLL、PEG化PLLおよびポリエチレンイミン(PEI)を含み得る。PEIが存在する場合、10から40kDAにわたる分子量の分枝PEI、例えば、25kDaの分枝PEI(Sigma#408727)である場合がある。

0096

いくつかの実施形態では、適切な送達媒体はカチオン性脂質を含む。本明細書で用いられる場合、「カチオン性脂質」という句は、生理的pHなどの選択されたpHで正味正電荷を有する任意の数の脂質種を意味する。いくつかのカチオン性脂質は文献に記載され、それらの多くは商業的に利用可能である。特に本発明の組成物および方法で使用する適切なカチオン性脂質は国際特許公開WO2010/053572(および特に、[00225]項に記載のCI2−200)およびWO2012/170930に記載のそれらを含み、それらの両方は参照により本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は2012年3月29日に出願された米国特許仮出願第61/617,468号(参照により本明細書に組み込まれる)に記載の(15Z,18Z)−N,N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9、12−ジエン−l−イルテトラコサ−15,18−ジエン−1−アミン(HGT5000)、例えば(15Z,18Z)−N、N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9、12−ジエン−1−イル)テトラコサ−4,15,18−トリエン−l−アミン(HGT5001)、および(15Z,18Z)−N、N−ジメチル−6−(9Z,12Z)−オクタデカ−9、12−ジエン−1−イル)テトラコサ−5,15,18−トリエン−1−アミン(HGT5002)などのイオン化カチオン性脂質を含む脂質ナノ粒子を用いる。

0097

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質N−[l−(2,3−ジオレイルオキシプロピル]−N,N,N−トリメチルアンモニウム塩化物または「DOTMA」が使用される。(Feigner et al.(Proc.Nat′l Acad.Sci.84,7413(1987);米国特許第4,897,355号)。DOTMAは単独で製剤化されるかまたはリポソーム型移動媒体または脂質ナノ粒子に中性脂質、ジオレオイルホスファチジル−エタノールアミンまたは「DOPE」または他のカチオン性または非カチオン性脂質と組み合わせることが可能であり、そのようなリポソームは標的細胞に核酸の送達を促進するよう使用できる。他の適切なカチオン性脂質は、例えば、5−カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミドまたは「DOGS」、2,3−ジオレイルオキシ−N−[2(スペルミンカルボキシアミドエチル]−N,N−ジメチル−l−プロパンアミニウムまたは「DOSPA」(Behret al.Proc.Nat.′l Acad.Sci.86,6982(1989)、米国特許第5,171,678号、米国特許第5,334,761号)、1,2−ジオレオイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパンまたは「DODAP」、l,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパンまたは「DOTAP」を含む。意図されるカチオン性脂質ははまたl,2−ジステアリ-ルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DSDMA」、1,2−ジオレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DODMA」、1,2−ジリノールイロキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DLinDMA」、l,2−ジリノールニロキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパンまたは「DLenDMA」、N−ジオレイル−N,N−ジメチルアンモニウム塩化物または「DODAC」、N,N−ジステアリル−N,N−ジメチルアンモニウム臭化物または「DDAB」、N−(l,2−ジミリスチルオキシプロプ−3−イル)−N,N−ジメチル−N−ヒドロキシエチルアンモニウム臭化物または「DMRIE」、3−ジメチルアミノ−2−(コレスト−5−エン−3−β−オキシブタン−4−オキシ)−l−(ci s,cis−9,12−オクタデカジエンオキシ)プロパンまたは「CLinDMA」、2−[5′−(コレスト−5−エン−3−β−オキシ)−3′−オキサペントキシ)−3−ジメチル−l−(cis,cis−9′、l−2′−オクタデカジエンオキシ)プロパンまたは「CpLinDMA」、N,N−ジメチル−3,4−ジオレイルオキシベンジルアミンまたは「RE−1」(ジ(Z)−ノン−2−エン−1−イル)9−(4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタデカネジオアート)または「RE−2」(6Z,25Z)−ジエチル16−(4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘントリアコンタ−6,25−ジエンエジオエート)または「RE−3」(9Z,28Z)−ジメチル19−(4−(ジメチルアミノ)ブタノイル)オキシ)ヘプタトリアコンタ−9,28−ジエンエジオエート)(US2012/0027803を参照、本明細書に参考として組み込まれる)または「GL−67」(Andries et al.Molecular Pharmaceutics,9:2136−2145(2012)、Zhao et al.、「Cationic Liposomes in Different Structural Levels for Gene Delivery」、Non−Vrial Gene Therapy、InTech publishing、13:293−318(2011)、それらの両方が本明細書に参考として組み込まれる)または「DMOBA」、1,2−N,N′−ジオレイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパンまたは「DOcarbDAP」、2,3−ジリノールオイロキシ−Ν,Ν−ジメチルプロピルアミンまたは「DLinDAP」、l,2−N,N′−ジリノールイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパンまたは「DLincarbDAP」、l,2−ジリノールイルカルバミル−3−ジメチルアミノプロパンまたは「DLinCDAP」、2,2−ジリノールイル−4−ジメチルアミノメチル−[l,3]−ジオキソランまたは「DLin− −DMA」、2,2−ジリノールイル−4−ジメチルアミノエチル−[l,3]−ジオキソラン または「DLin−K−XTC2−DMA」、および2−(2,2−ジ(9Z,12Z)−オクタデカ−9,l 2−ジエン−1−イル)−l,3−ジオキソラン−4−イル)−N,N−ジメチルエタンアミン(DLin−KC2−DMA))(WO2010/042877を参照、Sempleら、Nature Biotech.28:172−176(2010))、またはそれらの混合物を含む。(Heyes、Jら、J Controlled Release 107:276−287(2005)、Morrissey、DVら、Nat.Biotechnol.23(8):1003−1007(2005)、PCT公開WO2005/121348A1)。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は「GL−67」ではない。

0098

いくつかの実施形態では、そのような組成物に存在するカチオン性脂質の1つ以上は、少なくともイミダゾールジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の1つである。

0099

いくつかの実施形態では、そのような組成物に存在するカチオン性脂質の1つ以上はXTC(2,2−ジリノールイ1−4−ジメチルアミノエチ1−[1,3]−ジオキソラン)、MC3(6Z,9Z,28Z,31Z)−ヘプタトリアコンタ−6,9,28,31−テトラエン−19−イル4−(ジメチルアミノ)ブタノエート)、ALNY−100(3aR,5s,6aS)−N,N−ジメチル−2,2−ジ(9Z,12Z)−オクタデカ−9,12−ジエンイル)テトラヒドロ−3aH−シクロペンタ[d][1,3]ジオキソール−5−アミン)、NC98−5(4,7,13−トリス(3−オクソ−3−(ウンデシルアミノ)プロピル)−N1,N16−ジウンデシル−4,7,10,13−テトラアザヘキサデカン−1,16−ジアミド)、DODAP(1,2−ジオレイル−3−ジメチルアンモニウムプロパン)、HGT4003(WO2012/170889、参照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる)、ICE(WO2011/068810、参照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる)、HGT5000(米国特許仮出願第61/617,468号、参照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる)またはHGT5001(cisまたはtrans)(米国特許仮出願第61/617,468号)、WO2010/053572に記載の、DOTAP(1,2−ジオレイル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DOTMA(1,2−ジ−O−オクタデセニル−3−トリメチルアンモニウムプロパン)、DLinDMA(Heyes,J.;Palmer,L.;Bremner,K.;MacLachlan,I.“Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids”J.Contr.Rel.2005,107,276−287)、DLin−KC2−DMA(Semple,S.C.et al.“Rational Design of Cationic Lipids for siRNA Delivery”Nature Biotech.2010,28,172−176)、C12−200(Love,K.T.et al.“Lipid−like materials for low−dose in vivo gene silencing”PNAS2010,107,1864−1869)などのアミノアルコールリピドイドから選ばれる。

0100

いくつかの実施形態では、適切な送達媒体は1つ以上の非カチオン性脂質を含み、いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は中性脂質、すなわち、組成物が製剤化されかつ/または投与される状況下で、正味荷電を保有しない脂質である。そのような例示的な非カチオン性およびはDSPC(1,2−ジ脂肪酸−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DPPC(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン)、DOPE(1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DPPE(1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DMPE(1,2−ジミリストイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン)、DOPG(1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホ−(1′−rac−グリセロール)、およびコレステロールから選択可能である。

0101

コレステロール系カチオン性脂質の使用はまた本発明によって意図される。そのようなコレステロール系カチオン性脂質は、単独でまたは他のカチオン性または非カチオン性脂質と組み合わせて使用可能である。適切なコレステロール系カチオン性脂質は、例えば、DC−Choi(N,N−ジメチル−N−エチルカルボキシアミドコレステロール)、l,4−ビス(3−N−オレイルアミノ−プロピル)ピペラジン(Gao et al.Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)、Wolf et al.BioTechniques23,139(1997)、米国特許第5,744,335号)、またはICEを含む。

0102

他の実施形態では、適切な脂質ナノ粒子は、米国仮出願第61/494,745号にさらに記載のように、例えば、切断可能なジスルフィド(S−S)官能基(例えば、HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004およびHGT4005)を含む1つ以上のカチオン性脂質または配合物などの1つ以上の切断可能な脂質を含み、参照によりその教示の全体が本明細書に組み込まれる。

0103

さらに、いくつかの試薬は核酸導入有効性を促進するため商業的に利用可能である。適切な例はLIPOFECTIN(DOTMA:DOPE)(Invitrogen,Carlsbad,Calif.)、LIPOFECTA INE(DOSPA:DOPE)(Invitrogen)、LIPOFECTAMINE2000.(Invitrogen)、FUGENE、TRANSFECTAM(DOGS)、およびEFFECTENEである。

0104

いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は移動媒体に存在する全脂質の約1%〜約90%、約2%〜約70%、約5%〜約50%、約10%〜約40%、または好適には移動媒体に存在する全脂質の約20%〜約70%のモル比を含む。

0105

N−オクタノイルスフィンゴシン−l−[サクシニルメトキシポリエチレングリコール)−2000](C8PEG−2000セラミド)を含む、誘導体化セラルミド(PEG−CER)などのなどのポリエチレングリコール(PEG)修飾リン脂質および誘導体化脂質はまた、単独かまたは好適には移動媒体(例えば、脂質ナノ粒子)を含む他の脂質とともに組み合わせて本発明によって意図される。意図されるPEG修飾脂質は、C6−C20長のアルキル鎖(複数可)で共有結合された長さ最大5kDaのポリエチレングリコール鎖を含むが、これに限定されない。そのような成分の追加は複合体の凝集を防ぎ得、循環寿命および脂質核酸組成物の標的細胞への送達を増加させる手段を提供し得、(Klibanov et al.(1990)FEBSLetters,268(1):235−237)、またはそれらは、インビボで製剤から急速に交換するように選択され得る(米国特許第5,885,613号を参照)。

0106

特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖を有するPEG−セラミドである(例えば、C14またはC18)。本発明のPEG修飾リン脂質および誘導体化脂質はリポソーム型移動媒体に存在する全脂質の約0%〜約20%、約0.5%〜約20%、約1%〜約15%、約4%〜約10%または約2%のモル比を含み得る。

0107

本発明はまた非カチオン性脂質の使用を考察する。本明細書で用いられる場合、「非カチオン性脂質」という句は任意の中性、両性イオン性またはアニオン性の脂質を意味する。本明細書で用いられる場合、「アニオン性脂質」という句は、生理的pHなどの選択されたHで正味負電荷を保有する任意の数の脂質種を意味する。非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン4−(N−マレイミドメチル)−シクロヘキサン−l−カルボキシレート(DOPE−マル)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジ脂肪酸−ホスファチジル−エタノールアミン(DSPE)、16−O−モノメチルPE、16−O−ジメチルPE、18−1−トランスPE、l−脂肪酸−2−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、コレステロール、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。そのような非カチオン性脂質は、単独で使用され得るが、好適には他の賦形剤、例えばとカチオン性脂質と組み合わせて使用される。カチオン性脂質と組み合わせて使用する場合、非カチオン性脂質は、移動媒体に存在する全脂質の約5%〜約90%、または好適には約10%〜約70%のモル比を含む。

0108

特定の実施形態では、適切な移動媒体(例えば、脂質ナノ粒子)は、複数の脂質および/またはポリマー成分を結合することによって調製される。例えば、移動媒体は40:30:25:5のモル比でC12−200、DOPE、chol、DMG−PEG2K、または18:56:20:6のモル比でDODAP、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K、または40:20:35:5のモル比でHGT5000、DOPE、chol、DMG−PEG2K、40:20:35:5のモル比でHGT5001、DOPE、chol、DMG−PEG2Kを使用して調製され得る。脂質ナノ粒子を含むカチオン性脂質、非カチオン性脂質および/またはPEG修飾脂質の選択、ならびに互いに対するそのような脂質の相対的なモル比は、選択される脂質(複数可)の特徴、意図された標的細胞の性質、送達されるmRNAの特徴に基づく。さらなる考慮点は、例えば、選択される脂質(複数可)のアルキル鎖の飽和、ならびに粒径、電荷、pH、pKa、膜融合性および毒性を含む。このように、モル比は適宜調製され得る。例えば、ある実施形態では、脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質の割合は、10%を超える、20%を超える、30%を超える、40%を超える、50%を超える、60%を超える、または70%を超え得る。脂質ナノ粒子中の非カチオン性脂質の割合は、5%を超える、10%を超える、20%を超える、30%を超える、または40%を超え得る。脂質ナノ粒子中のコレステロールの割合は、10%を超える、20%を超える、30%を超える、または40%を超え得る。脂質ナノ粒子中のPEG修飾脂質の割合は、1%を超える、2%を超える、5%を超える、10%を超える、または20%を超え得る。

0109

特定の実施形態では、本発明の適切な脂質ナノ粒子は少なくとも次のカチオン性脂質のうちの1つを含む:C12−200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、RE−1、RE−2、RE3、GL−67およびICE。いくつかの特定の実施形態では、適切な脂質ナノ粒子はカチオン性脂質GL−67を使用せずに製剤化される。いくつかの実施形態では、適切な移動媒体はコレステロールおよび/またはPEG修飾脂質を含む。いくつかの実施形態では、適切な移動媒体はDMG−PEG2Kを含む。いくつかの実施形態では、適切な移動媒体は次の脂質の組み合わせのうちの1つを含む:C12−200、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K、DODAP、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K:HGT5000、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K:HGT5001、DOPE、コレステロール、DMG−PEG2K:XTC、DSPC、コレステロール、PEG−DMG:MC3、DSPC、コレステロール、PEG−DMG:およびALNY−100、DSPC、コレステロール、DLinKC2−DMA、DODMA、DLinDMA、CLinDMA PEG−DSG。

0110

本発明の組成物で使用する脂質担体媒体は、現在当技術分野で周知の様々な技術によって調製可能である。複層状小胞(MLV)は、従来の技術、例えば適切な溶剤の脂質が溶解することによって適切な器または容器内壁面に選択された脂質が沈着し、次いで噴霧乾燥によって器の内面に薄いフィルムが残るように蒸発させることにより調製し得る。次いで、水相をMLVの形成をもたらすボルテックス運動を容器に添加してもよい。単層状小胞(ULV)は、次いで、均質化超音波処理または多層状小胞の押し出しによって形成することができる。また、単層状小胞は、洗浄剤除去技術によって形成することができる。

0111

本発明の特定の実施形態では、本発明の組成物は移動媒体を含み、mRNAは、移動媒体の表面の両方に関連し、同一の移動媒体内にカプセル化される。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソーム型移動媒体は、静電相互作用を通してmRNAと関連付け得る。例えば、本発明の組成物の調製中に、カチオン性リポソーム型移動媒体は、静電相互作用を通してmRNAと関連付け得る。

0112

いくつかの実施形態では、本発明の組成物および方法は脂質担体媒体でカプセル化されるmRNAを含む。いくつかの実施形態では、1つ以上のmRNA種は同一の脂質担体媒体でカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、1つ以上のmRNA種は異なる脂質担体媒体でカプセル化され得る。いくつかの実施形態では、mRNAは1つ以上の脂質担体媒体でカプセル化され、それらの脂質組成物、脂質成分のモル比、粒径、電荷(ゼータ電位)標的配位子および/またはそれらの組み合わせとは異なる。いくつかの実施形態では、1つ以上の脂質担体媒体は、カチオン性脂質、中性脂質、PEG修飾脂質および/またはそれらの組み合わせの異なる組成物を有し得る。いくつかの実施形態では、1つ以上の脂質担体媒体は、カチオン性脂質、中性脂質、コレステロールおよび脂質担体媒体を生成するために使用されるPEG修飾脂質の異なるモル比を有し得る。
送達方法

0113

本発明の方法において使用される送達経路は、本発明の治療用組成物の非侵襲的な自己投与を可能にする。本発明の方法は、上述のように適切な核酸導入または脂質担体媒体中に治療タンパク質をコードするmRNAを含む組成物のエアロゾル化、噴霧化、または点滴注入による気管内または経肺投与を含む。

0114

肺の局所細胞および組織は、mRNAによってコードされるタンパク質の生産および分泌のために、生物学的デポまたはリザーバーとして機能することができる潜在的な標的を表しているが、出願人は、エアロゾル化、噴霧化または点滴注入を介した肺への本発明の組成物の投与が肺細胞外の非分泌性タンパク質でさえも分布をもたらすことを発見した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、肺気道血液関門を通して本発明のパスナノ粒子組成物は、例えば、心臓、肝臓、脾臓などの非肺細胞および組織に無傷のナノ粒子の翻訳をもたらすことが意図されており、そこではこれらの非肺組織におけるコードされたタンパク質生産をもたらす。従って、本発明の組成物および方法の有用性は、肺の肺細胞および組織中の治療タンパク質の生産を超えて拡大し、非肺の標的細胞および/または組織への送達のために使用することができる。それらは、多数の疾患の管理および治療において、そして分泌性および非分泌性両方のタンパク質および/または酵素欠損症(例えば、1つ以上のリソソーム貯蔵障害)から生じる特定の末梢性疾患において有用である。特定の実施形態では、本発明の方法において使用される本発明の組成物は、肝臓、脾臓、心臓、および/または他の非肺細胞におけるmRNAカプセル化されたナノ粒子の分布およびコードされたタンパク質の生産をもたらす。例えば、肺へのエアロゾル化、噴霧化または点滴注入によるβガラクトシダーゼ(非分泌性タンパク質)をコードする化するmRNAを含むナノ粒子などの本発明の組成物の投与は、組成物自体を生じさせ、そのタンパク質生成物(例えば、機能的βガラクトシダーゼタンパク質)は、非肺細胞へのmRNAおよび送達媒体の転位の結果として、肺の局所細胞および組織の両方において、ならびに末梢標的細胞、組織および器官において検出可能であろう。

0115

特定の実施形態では、本発明の組成物は、特に末梢細胞または組織を標的とする本発明の方法で用いることができる。経肺送達に続いて、本発明の組成物は、肺気道血液関門を通過し、局所肺細胞以外の細胞に分布することが意図される。したがって、本明細書に開示される組成物は、当業者に周知の様々な手法(例えば、吸入による)を用いて、投与の経肺経路を介して被験者に投与され得、肺の局所標的細胞および組織の両方、ならびに末梢非肺細胞および組織(例えば、肝臓、脾臓、腎臓、心臓、骨格筋、リンパ節、脳、脳脊髄液、および血漿の細胞)に分布され得る。結果として、肺の局所細胞および末梢非肺細胞の両方は、1つ以上のポリヌクレオチドによってコードされる翻訳生成物を生産および/または分泌することができる生物学的リザーバーまたはデポとして機能することができる。したがって、本発明は肺疾患または状態の治療に限定されるのではなく、むしろ全身投与によって達成されるであろう末梢器官、組織および細胞(例えば、肝細胞)において、ポリヌクレオチドの送達またはその結果コードされる酵素およびタンパク質の生産を促進する非侵襲的手段として使用可能である。例示的な末梢非肺細胞は、肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、内皮細胞、骨細胞、幹細胞、間葉細胞、神経細胞、心臓細胞、脂肪細胞、血管平滑筋細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、β細胞、下垂体細胞、滑膜細胞、卵巣細胞、精巣細胞、線維芽細胞、B細胞、T細胞、網状赤血球、白血球、顆粒球、および腫瘍細胞を含むが、これらに限定されない。

0116

被験者への組成物の投与に続いて、mRNAによりコードされるタンパク質生成物(例えば、機能的なタンパク質または酵素)は、被験者への組成物の投与後少なくとも約1日〜7日またはより長く、末梢標的組織において検出可能である。治療効果を達成するために必要なタンパク質生成物の量は、治療される状態、コードされたタンパク質、および患者の状態に依存して変化する。例えば、タンパク質生成物は末梢標的組織において、少なくとも0.025〜1.5μg/ml(例えば、少なくとも0.050μg/ml、少なくとも0.075μg/ml、少なくとも0.1μg/ml、少なくとも0.2μg/ml、少なくとも0.3μg/ml、少なくとも0.4μg/ml、少なくとも0.5μg/ml、少なくとも0.6μg/ml、少なくとも0.7μg/ml、少なくとも0.8μg/ml、少なくとも0.9μg/ml、少なくとも1.0μg/ml、少なくとも1.1μg/ml、少なくとも1.2μg/ml、少なくとも1.3μg/ml、少なくとも1.4μg/ml、または少なくとも1.5μg/ml)の濃度で(例えば、治療濃度)、被験体への組成物の投与後少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45日以上で検出され得る。

0117

参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第5,780,014号に記載のように、核酸は液体噴霧器または乾燥粉末装置を使用して生成されるエアロゾルミストの核酸組成および吸入の液体懸濁液の気管内投与により肺に送達可能であることが実証されている。

0118

特定の実施形態において、本発明の組成物は、それらがエアロゾル化、またはそうでなければ被験者への投与の前または投与の際に、粒子の液体、または固体として送達され得るように製剤化され得る。そのような組成物は、被験者によって容易に呼吸可能または吸入可能な粒子を生成するために固体または液体の粒子状組成物(例えば、エアロゾル化された水溶液または懸濁液など)を投与するための1つ以上の適切な装置の助けを借りて投与され得る。いくつかの実施形態において、そのような装置(例えば、定量吸入器、ジェット噴霧器、超音波噴霧器、乾燥粉吸入器、噴射剤に基づく吸入器および注入器)は、被験者に組成物(例えば投与量当たりmRNAの約0.5mg/kg)の所定の質量、体積または用量の投与を促進する。例えば、特定の実施形態では、本発明の組成物は、組成物および適切な噴射剤を含む懸濁液または溶液を含む定量吸入器を使用して被験体に投与される。特定の実施形態では、本発明の組成物は、吸入のために意図された微粒子粉末(例えば、呼吸用乾燥粒子)として製剤化することができる。特定の実施形態では、呼吸域粒子として製剤化される本発明の組成物は、適宜それらが被験者に呼吸可能で、適切な装置を使用して送達され得るような粒径にする(例えば約500μm未満、400μm、300μm、250μm、200μm、150μm、100μm、75μm、50μm、25μm、20μm、15μm、12.5μM、10μm、5μm、2.5μM、またはそれ以下の平均D50またはD90の粒径)。さらに他の実施形態では、本発明の組成物は、1つまたは複数の肺胞界面活性物質(例えば、層状体)を含むように製剤化される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも0.05mg/kg、少なくとも0.1mg/kg、少なくとも0.5mg/kg、少なくとも1.0mg/kg、少なくとも2.0mg/kg、少なくとも3.0mg/kg、少なくとも4.0mg/kg、少なくとも5.0mg/kg、少なくとも6.0mg/kg、少なくとも7.0mg/kg、少なくとも8.0mg/kg、少なくとも9.0mg/kg、少なくとも10mg/kg、少なくとも15mg/kg、少なくとも20mg/kg、少なくとも25mg/kg、少なくとも30mg/kg、少なくとも35mg/kg、少なくとも40mg/kg、少なくとも45mg/kg、少なくとも50mg/kg、少なくとも55mg/kg、少なくとも60mg/kg、少なくとも65mg/kg、少なくとも70mg/kg、少なくとも75mg/kg、少なくとも80mg/kg、少なくとも85mg/kg、少なくとも90mg/kg、少なくとも95mg/kg、または少なくとも100mg/kgの体重の濃度で、単一の投与量投与されるように、被験者に投与される。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、少なくとも0.1mg、少なくとも0.5mg、少なくとも1.0mg、少なくとも2.0mg、少なくとも3.0mg、少なくとも4.0mg、少なくとも5.0mg、少なくとも6.0mg、少なくとも7.0mg、少なくとも8.0mg、少なくとも9.0mg、少なくとも10mg、少なくとも15mg、少なくとも20mg、少なくとも25mg、少なくとも30mg、少なくとも35mg、少なくとも40mg、少なくとも45mg、少なくとも50mg、少なくとも55mg、少なくとも60mg、少なくとも65mg、少なくとも70mg、少なくとも75mg、少なくとも80mg、少なくとも85mg、少なくとも90mg、少なくとも95mgまたは少なくとも100mgのmRNAの総量で1つまたは複数のの投与量投与されるように、被験者に投与される。

0119

実施例1:ネイキッド形態で、または気管内投与によるナノ粒子で非修飾および修飾mRNAの比較
概要:マウスは、気管内(IT)は、ネイキッド形態または単回投与のための脂質系ナノ粒子(NP)にカプセル化されたどちらかをホタルルシフェラーゼ(FFL)に対してコードする、非修飾または修飾mRNA(シチジン−5′−三リン酸およびウリジン−5′−三リン酸の両方の25%が5−メチルシチジン−5′−三リン酸および2−チオウリジン−5′−三リン酸にそれぞれ置換された)のどちらかで気管内(IT)スプレーされた。ルシフェラーゼ生産は気管内スプレー後の異なる時点でのインビボ生物発光イメージング(BLI)によって測定された。20μg/マウスに達する用量でC12−200系NPで処置したマウス由来の器官は、病理組織的分析のために調製された。気管内スプレー後の複合体の生体内分布を評価するために、インビトロでのルシフェラーゼ生産は、マウス当たり5および10μgのC12−200系NPに対応する用量で処置し安楽死させたマウスから調製した器官で測定された。
A.C12−200系ナノ粒子にネイキッドmRNAおよびmRNAの気管内スプレー−マウス当たり20μg

0120

脂質ナノ粒子製剤:C12−200、DOPE、コレステロール、およびDMG−PEG2000の50mg/mLエタノール溶液の培養は、40:30:25:5のモル比でそれぞれ混合され、エタノールで3mLの最終的な容量に希釈された。これとは別に、FFLの水性緩衝液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)または修飾FFLmRNAは1mg/mLストックから調製された。脂質溶液水性のmRNA溶液中に急速に注入し、20%エタノール中の最終懸濁液を得るために振盪された。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルター(diafiltrate)し、2〜8℃で濃縮し、格納した。

0121

メッセンジャーRNAは、所定の非翻訳領域でFFLタンパク質をコードしたcDNA鋳型を使用してインビトロ転写処理を介して合成した。得られたRNA構築物はさらに5′終点のキャップ1構造体および約200アデノシン塩基のポリ−Aテールの長さを組み込んで処理された。

0122

修飾メッセンジャーRNAは、2−チオウリジン三リン酸で置換されるウリジン塩基の25%および5−メチルシチジン三リン酸で置換されるシチジン塩基の25%で、上述のように、同様の方法で合成した。

0123

雌のBalb/c系マウスをElevage−Janvier、フランスから購入した。マウスは、実験の開始時に10週齢であった。マウスは、実験の開始に先立って計量され、次の4つの群(n=1群当たり6匹のマウス)の1つに割り当てられた:群I−FFLmRNAを含む気管内スプレー、群II−修飾FFL mRNAを含む気管内スプレー、群III−C12−200系脂質ナノ粒子でFFL−mRNAを含む気管内スプレー、群IV−C12−200系脂質ナノ粒子で修飾FFL−mRNAを含む気管内スプレー。各マウスは、それぞれmRNA/NPの20μgでスプレーされた。群ごとのmRNA/NPの必要量は、50μl/マウスの総容積に対して、DEPC処置された(0.1%)RNaseを含まない水(Serva、カタログ番号:39798、ロットP060383)での適用の直前に懸濁された。NPはまた、粒径およびゼータ電位測定によって特徴付けられた。これらの測定は、水中で実施され、表5で示す表にする。

0124

ルシフェラーゼ生産は適用後6時間でインビボBLIによって測定された。外因性mRNA由来のタンパク質のほんのわずかな量は、ネイキッドmRNAで検出することができたのに対し、ナノ粒子製剤は、修飾とは無関係に全体の胸部および上腹部(図1)におけるルシフェラーゼ生産の重要なレベルを示した。修飾FFLと比較して、非修飾FFL mRNAは約6時間(図2)でおよそ2〜3倍のより高い発光が生じた。

0125

図1AおよびB)、非常に低い(背景に近い)レベルの発光は、ネイキッドmRNAで検出することができた。脂質ナノ粒子で処置したマウスでは、修飾とは無関係に6時間の時点と比較して、増加したルシフェラーゼ生産(約2〜3倍)は、24時間の処置後に観察された(図3AおよびB)。FFLまたは修飾FFL mRNA(図3C)からのルシフェラーゼ生産の間で著しい相違は観察されなかった。

0126

ネイキッドmRNAで処置したマウスは、実験でさらに追跡し、毎週間隔で2回追加の用量を適用した。BLIは、適用後の異なる時点で実施された。適用後24時間のBLI画像、最大発光の時点(図3)は、図4(ネイキッドFFL mRNA)および図5(ネイキッド修飾FFL mRNA)に示されている。若干の例外はあるものの、目立ったルシフェラーゼ生産は、測定されたマウス(図3で図4および図5スケールを比較)のいずれにも認められなかった。
B.C12−200系ナノ粒子でマウス当たり−5μgおよびマウス当たり10μgのFFLおよび修飾FFL mRNAの気管内スプレー

0127

気管内スプレー実験は、5および10μgの/マウスの減少した用量をで実施した。C12−200系ナノ粒子製剤は実施例1に記載された。

0128

実験計画:雌のBalb/c系マウスをElevage−Janvier、フランスから購入した。マウスは、実験の開始時に19週齢であった。マウスは、実験の開始に先立って計量された。C12−200系脂質ナノ粒子は、50μl/マウスの総容積に対して、DEPC処置された(0.1%)RNaseを含まない水(Serva、カタログ番号:39798、ロトP060383)での適用の直前に懸濁された。次の4つの群(n=1群当たり5匹のマウス)が試験された:群I−C12−200系脂質ナノ粒子(5μg/マウス)でFFLmRNAを含む気管内スプレー、群II−C12−200系脂質ナノ粒子(10μg/マウス)でFFL mRNAを含む気管内スプレー、群III−C12−200系脂質ナノ粒子(5μg/マウス)でFFL mRNAを含む気管内スプレー、群IV−C12−200系脂質ナノ粒子(10μg/マウス)で修飾FFL mRNAを含む気管内スプレー。気管内スプレー中に群IIIおよびIVからの1匹のマウスが死亡した。このように、これらのグループの動物の残りの数は4であった。適用後6時間後では、すべての動物は、立毛を示し、運動性が減少した。また、より高い用量群(群IIおよびIV)のそれぞれから1匹のマウスが、この時点で死んでいた。BLIイメージングは適用後6時間後でマウスに実施された。

0129

5μg/マウスの用量でのFFLmRNAの使用は、ルシフェラーゼ生産の非常に低いレベルをもたらした。10μg/マウスの用量で、より大きな生産は、肝臓(図6A)に濃縮されたことが観察された。適用量の相違は、修飾FFL mRNA群(図6B)ではそれほど明白ではなかった。群IV(修飾FFL mRNA)を持つ群II(FFL mRNA)からマウスを比較すると、前の場合(図6Bのパネル1で図6Aのパネル1、2を比較)により高い発光を明らかにした。

0130

24時間でのルシフェラーゼ生産が、気管内スプレー後6時間と比較して著しく強化された(図7Aおよび7B)。さらに、修飾FFLmRNA(図7C)と比較して、より高い生産がFFL mRNAを使用して観察された。実施例1では、同様の結果が20μg/マウスの用量で得られた。臓器(心臓、肝臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓)は、インビトロのルシフェラーゼ測定のために液体窒素中で凍結された。

0131

気管内スプレー後の体内分布:単離された器官は、乳鉢および乳棒を使用して、凍結状態で均質化され、量され、溶解用緩衝液(25 mM TRIS−Cl0、1% Triton x−100;pH7.4))および完全なプロテアーゼ阻害剤(Roche)を含む溶液中で溶解した。肺と肝臓は400μlで溶解したのに対し、脾臓、心臓、腎臓は、250μlで溶解した。20分間上でインキュベートした後、サンプルを、10,000rpmで、10分間、4℃で遠心分離した。ルシフェラーゼ活性は、100μlの上澄部を使用して測定した。各サンプルを重複で測定し、重複からの平均値を分析に使用した。腎臓以外のすべての臓器は、ルシフェラーゼ活性(図8)について陽性であった。我々のBLIデータに従って、最大発光は、肝臓および肺で観察された。FFL−mRNAは修飾−FFL−mRNAに比べて高いタンパク質生産をもたらし、用量依存性は明らかであった。
C.HGT5001系ナノ粒子で修飾FFL mRNAの気管内スプレー−マウス当たり20μg

0132

気管内スプレー実験はHGT5001系ナノ粒子製剤で実施された。

0133

脂質ナノ粒子製剤:HGT5001、DOPE、コレステロール、およびDMG−PEG2Kの50mg/mLエタノール溶液の培養は、40:20:35:5のモル比でそれぞれ混合され、エタノールで3mLの最終的な容量に希釈された。これとは別に、FFLの水性緩衝液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)または修飾FFLmRNAは1mg/mLストックから調製された。脂質溶液は水性のmRNA溶液中に急速に注入し、20%エタノール中の最終懸濁液を得るために振盪された。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルター(diafiltrate)し、その後RNaseを含まない水で蒸留し、2〜8℃で濃縮し、格納した。

0134

実験計画:雌のBalb/c系マウスをElevage−Janvier、フランスから購入した。マウスは、実験の開始時に13週齢であった。マウスは、実験の開始に先立って計量された。脂質ナノ粒子は、50μl/マウスの総容積に対して、DEPC処置された(0.1%)RNaseを含まない水(Serva、カタログ番号:39798、ロットP060383)での適用の直前に懸濁された。

0135

気管内スプレーおよびBLI:各マウスは、50μl/マウスの総容積のHGT5001系ナノ粒子製剤の20μgで気管内スプレーされた。BLIイメージングは適用の6時間後にマウスに実施された。

0136

C12−200系ナノ粒子で対応する時点を比較した場合、著しく低い蛍光値がHGT5001系ナノ粒子で観察され、観察された6〜24時間(図9および図10)のタンパク質生産の増加はなかった。

0137

C12−200とHGT5001系ナノ粒子製剤を試験する独立した実験では、以下のBLIイメージング(図11)はて、マウスを安楽死させ、器官(心臓、肺、肝臓、脾臓および腎臓)は組織学図12)によって評価された。FFL生産はC12−200系NPおよびHGT5011系NPの両方のための肺と肝臓で確認された。

D.修飾FFLmRNAの気管内スプレー−−非ナノ粒子送達

0138

ネイキッドmRNAは、パーフルオロカーボン治療なしで低い効率性に終わった。カプセル化されたmRNAの気管内エアロゾル化は、肺、肝臓、脾臓、および心臓でのタンパク質生産に至る。FFLおよび修飾FFLはタンパク質生産に関して、用量反応と同じように効率的であった。

0139

ポレチレニミン(polethylenimines)(L−PEI22kDa、br−PEI 25 kDa)オリゴのコポリマー(エチレングリコールメチルエーテルメタクリレート(OEGMA)およびN,N−ジメチルアミノエチルメタクリレート(DMAEMA)MLRI:DOPE、DOTAP、DMRIE−C、およびリポフェクタミンを含む様々な送達媒体を試験し、非肺細胞での発光を示さなかった。対照的に、C12−200およびHGT5001系脂質ナノ粒子製剤は、経肺送達に続いて非肺細胞における著しいタンパク質生産をもたらした。

0140

これらの観察は、ナノ粒子に基づく製剤だけが肺から全身的血液供給への能動的または受動的な手段によって、そのまま転位可能であり、続いて肝臓などの異なる組織の中に沈着される。細胞質タンパク質、ホタルルシフェラーゼをコードする無損傷のmRNAを含むナノ粒子のこの転位は、全身的に到達可能な非肺細胞または組織に機能的なタンパク質の生産をもたらすために、肺の外の有効医薬成分の非侵襲的な全身的送達を構成する。
E.PEI系脂質ナノ粒子での修飾FFL mRNAの噴霧化

0141

PEI系ナノ粒子中の修飾FFLmRNAを受けたマウスは、肺での発光を示した(図13)。ルシフェラーゼ生産は、非修飾FFLのmRNA(パネル3、4)と比較して修飾FFL mRNA(パネル1、2)でより大きかった。
実施例2:非肺の標的細胞の脂質を測定することによるナノ粒子の移行の評価

0142

非肺組織で無損傷のナノ粒子の通過を識別するために、C12−200、DOPE、CholでDMG−PEG2000および1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−(リサミンローダミンスルホニル)(アンモニウム塩)の50mg/mLのエタノール溶液の培養は、40:29:25:5:1のモル比でそれぞれ混合され、エタノールで3mLの最終的な容量に希釈された。これとは別に、β−ガラクトシダーゼまたはFFL(修飾または非修飾)mRNAなどの非分泌性タンパク質の水性緩衝液(10mMクエン酸/150mM NaCl、pH4.5)は1mg/mLストックから調製された。脂質溶液は水性のmRNA溶液中に急速に注入し、20%エタノール中の最終懸濁液を得るために振盪される。得られたナノ粒子懸濁液を濾過し、1×PBS(pH7.4)でダイアフィルター(diafiltrate)し、2〜8℃で濃縮し、格納する。

0143

メッセンジャーRNAは、所定の非翻訳領域でβ−ガラクトシダーゼまたはFFLタンパク質をコードしたcDNA鋳型を使用してインビトロ転写処理を介して合成する。得られたmRNA構築物はさらに5′終点のキャップ1構造体および約200アデノシン塩基のポリ−Aテールの長さを組み込んで処理される。

0144

修飾メッセンジャーRNAは、2−チオウリジン三リン酸で置換されるウリジン塩基の25%および5−メチルシチジン三リン酸で置換されるシチジン塩基の25%で、上述のように、同様の方法で合成する。

0145

雌のBalb/c系マウスをElevage−Janvier、フランスから購入する。マウスは、実験の開始時に10週齢である。マウスは、実験の開始に先立って計量される。各マウスは、蛍光標識されたC12−200系脂質ナノ粒子の修飾および非修飾mRNAそれぞれのmRNA/NPの20μgでスプレーされる。mRNAカプセル化される脂質ナノ粒子は、50μl/マウスの総容積に対して、DEPC処置された(0.1%)RNaseを含まない水(Serva、カタログ番号39798、ロットP060383)での適用の直前に懸濁される。処置後6時間でマウスは殺され、臓器が6μmの凍結切片上の蛍光顕微鏡によってNP分布の組織学的検査のために切除される。

0146

あるいは、mRNAは、Commerfordの方法に従い、Terebesiらによって詳細にされるように、(Terebesi J,Kwok KY,Rice KG.Anal Biochem.1998 Oct 1;263(1):120−3)例えばI123放射線で標識される。標識混合物を、溶離液として水をPD−10ゲル濾過カラム(Amersham Biosciences, Freiburg, Germany)を使用して分離する。ヨウ素化されたmRNAは、標識されていないmRNAと混合され、上述のように脂質で製剤化されるmRNAの望ましい量およびマウスの肺に気管内エアロゾル化をもたらす。望ましい時点で、マウスを屠殺し、臓器の放射能を、ガンマカウンターを使用して測定する。

0147

上記の実施例は、mRNAが本明細書に記載される方法および組成物を使用して経肺投与を介して、非肺細胞または組織に効率的に送達可能であることを実証する。上記の代表的な実施例では、mRNAの送達は、修飾mRNAのコドン最適化配列によってコードされた蛍光ホタルルシフェラーゼレポータータンパク質を使用して評価された。しかし、そのような実施例は、単に本発明に従って送達することができるmRNAおよびタンパク質の広い範囲の代表例に過ぎないことを、当業者は理解するであろう。特に、本発明の組成物および方法は、関連する疾患、障害または状態の治療のために被験者内の非肺細胞または組織に様々な治療タンパク質をコードする送達mRNAに使用され得ることが当業者には容易に明らかであろう。

0148

上述の説明から、当業者は容易に本発明の本質的な特徴を確認することができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、様々な用途および条件に適合させるために、本発明の様々な変更および修正を行うことができる。

実施例

0149

出願において引用されるすべての参考文献、特許または出願、米国または諸外国は参照することにより全体が記載されているかのように本明細書に組み込まれる。矛盾が生じた場合には、本明細書で開示された文字通りの資料統制する。

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