図面 (/)

技術 複数の宿主−共生生物アソシエーションをスクリーニングすることによる共生体の選択

出願人 アグリカルチャービクトリアサービシーズプロプライエタリーリミテッド
発明者 ジャーマン・カルロス・スパンゲンバーグジョン・ホワイト・フォースターノエル・コーガンイドン・ランジョン・グレゴリー・メイソンティモシー・アイヴァー・ソーブリッジベン・ヘイズマシュー・ジェームズ・ヘイデンキャスリン・ミカエラ・ガスリッジシモーネ・ジェーン・ロックフォートベン・コックスハンス・ディーター・デトワイラー
出願日 2013年5月29日 (6年8ヶ月経過) 出願番号 2015-514286
公開日 2015年7月6日 (4年7ヶ月経過) 公開番号 2015-518725
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 層状空気流 リード対 減衰パターン 構造改革 漂白剤処理 一次生産 選択実施 植物データ
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年7月6日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、生物、特に、共生生物との共生挙動を呈する生物を選択および育種する新しい方法、ならびに植物または草とエンドファイト共生体などの、それによって開発される新しい生物および共生体に関する。複数の共生生物が複数の生物内に展開され、育種プロセスの早期に改善された共生適合性およびパフォーマンスについて選択される。方法は、宿主生物遺伝資源ライブラリーに共生生物ライブラリーから選択される共生生物を接種し、所望の共生体特性を呈する改善された宿主生物を選択することによって、遺伝資源から改善された生物を産生する工程、ならびに生物または生物-共生生物アソシエーション由来する核酸ライブラリーメタゲノム分析による、所望の遺伝子プロファイルおよび代謝プロファイルを有する生物-共生生物アソシエーションの選択を含む。

概要

背景

家畜農作物、および牧草の多くの種の表現型は、個体の遺伝子型共生生物の遺伝子型との間の相互作用に依存する。飼料草、マメ科植物樹木低木、およびつる植物を含めた重要な植物は、真菌、細菌、ウイルス、および微生物を含めたエンドファイトとのアソシエーション(association)で一般に見つかる。同様に、ウシヒツジブタヤギなどを含めた重要な動物は、それらの腸および第1胃内に存在するマイクロバイオームを有する。

水および栄養素ストレスに対する寛容性の改善、ならびに害虫に対する耐性を含めた、有益および有害の両方の園芸的、農学的、および獣医学的性質は、このようなアソシエーションから生じる。

例えば、ライグラス植物は、正しい遺伝型の真菌エンドファイトが植物にコロニー形成する場合、改善された乾燥寛容性および持続性を示すことができる。同様に、草において、虫害抵抗性が、エンドファイトによって産生される特定の代謝産物、特に、ロリンアルカロイドおよびペラミンによってもたらされうる。真菌エンドファイトによって産生される他の代謝産物、例えば、ロリトレムおよび麦角アルカロイドは、草食動物(grazing animal)に有害であり得、草食動物(herbivore)の摂食を低減しうる。

共生生物の代謝産物プロファイルにおいて相当なバリエーションが存在することが知られている。例えば、動物毒素のいずれか、または両方を欠く真菌エンドファイト株が、市販のライグラスの品種中に導入された。

細菌マイクロバイオームも、植物のパフォーマンス(例えば、ライグラス、コムギにおける)に影響する。

動物では、腸内に存在する微生物が動物の消化関与する。反芻動物は、自己の第1において極めて大きくて複雑な多数の微生物を宿し、反芻動物が低品質の飼料を肉および乳の形態でヒトが消費するための高品質のタンパク質および脂質に転換するのを可能にするのはこの微生物群である。このプロセスの間に、強力な温室ガスであるメタンが産生される。第1胃微生物-ウシ共生体は、例えば、餌転換効率を改善し、メタン産生を低減することにおいて重要となりうる。反芻動物では、芳しくない質の餌の順調な消化は、特定の第1胃マイクロバイオームプロファイルを有することに依存しうる。宿主ゲノムの領域が、第1胃微生物プロファイルにおける差異と関連することを実証することができれば、それを、メタン放出がより少なく、餌転換効率が改善されたウシを繁殖させるのに活用することができる。

単純配列反復(SSR)マーカーなどの分子遺伝子マーカーが、共生生物分類群間で区別し、分類群内の遺伝的変異を検出するための診断検査として開発された。例えば、マーカーを、異なる毒素プロファイルを有する共生生物株を識別するのに使用することができる。

しかし、共生生物との共生挙動を呈する生物を同定、単離し、かつ/または特徴付ける方法の必要性が残っている。これらの共生体を人工的に育種することが困難であるため、その有用性が制限される。例えば、牧草ベース農業に有益であることが知られている新規エンドファイトの多くは、低接種頻度を呈し、優良遺伝資源においてより不安定である。

さらに、伝統的な育種技法において、例えば、ペレニアルライグラスおよびトールフェスクなどの飼料草では、草の品種は、古典的な交雑育種技法を使用して育種され、草遺伝子型は、複数年の期間にわたるこれらのパフォーマンスを監視した後、これらの優れた特性について選択される。次いで、実験的な品種を形成する選択された草遺伝子型に、単一エンドファイトが接種され、得られる草-エンドファイトアソシエーションが、虫害抵抗性などの任意の好都合な特性について評価される。次いで、自己の中に単一エンドファイトを展開させた個々の実験的な合成品種は、数年の期間にわたって農業パフォーマンスおよび草食動物による得られる動物パフォーマンスについて評価される。この評価プロセスは、異なる実験的な合成品種中に展開されている単一エンドファイトが、これらの品種のいくつかにおいて栄養安定性および/もしくは世代間の安定性を示すことができず、または単一エンドファイトによって付与される所望のアルカロイドプロファイルが、異なる合成品種間で変動し、適切なレベルの虫害抵抗性を付与することに失敗し、動物の中毒を引き起こしうることを露呈する場合がある。この時間のかかるプロセスを加速し、または他の方法で改善することができれば、当技術分野において著しい発展となるはずである。

概要

本発明は、生物、特に、共生生物との共生挙動を呈する生物を選択および育種する新しい方法、ならびに植物または草とエンドファイトの共生体などの、それによって開発される新しい生物および共生体に関する。複数の共生生物が複数の生物内に展開され、育種プロセスの早期に改善された共生適合性およびパフォーマンスについて選択される。方法は、宿主生物遺伝資源ライブラリーに共生生物ライブラリーから選択される共生生物を接種し、所望の共生体特性を呈する改善された宿主生物を選択することによって、遺伝資源から改善された生物を産生する工程、ならびに生物または生物-共生生物アソシエーションに由来する核酸ライブラリーメタゲノム分析による、所望の遺伝子プロファイルおよび代謝プロファイルを有する生物-共生生物アソシエーションの選択を含む。

目的

本発明の目的は、先行技術に関連する困難または欠陥の1つまたは複数を克服し、または少なくとも軽減することである

効果

実績

技術文献被引用数
- 件
牽制数
- 件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

該当するデータがありません

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

改善された生物を産生するための方法であって、(i)生物の遺伝資源ライブラリー、および共生生物のライブラリーを準備する工程と、(ii)遺伝資源ライブラリーに、共生生物ライブラリーから選択される1種または複数の共生生物を接種して、共生体を生成する工程と、(iii)所望の共生体特性について、接種された遺伝資源または共生体を育種、選択、スクリーニング、および/または評価する工程と、(iv)所望の特性を呈する共生体を引き続いて同定、培養、または他の方法で使用して、改善された生物を産生する工程とを含む、方法。

請求項2

生物が植物または動物である、請求項1に記載の方法。

請求項3

共生生物が、植物または動物と共生アソシエーションを形成することができる、請求項2に記載の方法。

請求項4

共生生物が、真菌ウイルス、細菌、および他の微生物のうちの1種または複数から選択される、請求項3に記載の方法。

請求項5

共生生物が、共生生物形質移入を増強するために選択された遺伝的変異を含む、請求項4に記載の方法。

請求項6

遺伝的変異が、ランダム突然変異誘発、2倍数化/多倍数化、標的突然変異生成、シスジェネシス、トランスジェネシス、イントラジェネシスのうちの1つまたは複数を介して導入される、請求項5に記載の方法。

請求項7

生物が、エンドファイトとの共生適合性を有する植物である、請求項2に記載の方法。

請求項8

植物遺伝資源がとして存在する、請求項7に記載の方法。

請求項9

胚を共生生物含有被覆層で被覆して、人工種子を形成する、請求項8に記載の方法。

請求項10

胚を処理して、共生生物の1つまたは複数の侵入点を創製する、請求項9に記載の方法。

請求項11

植物遺伝資源の集団に共生生物の集団を接種し、その結果、好都合宿主-共生生物アソシエーションを同定することができる、請求項1に記載の方法。

請求項12

スクリーニング工程(iii)が、加速エージングによって適合性および/または安定性について人工種子および/またはこれらの子孫をスクリーニングする工程、ならびに所望の特性を呈する共生体を選択する工程を含む、請求項1に記載の方法。

請求項13

選択された共生体を迅速なエンドファイト生存アッセイに付す工程をさらに含む、請求項12に記載の方法。

請求項14

生物が植物であり、方法が、(i)植物遺伝資源のライブラリー、ならびにエンドファイト、および/または植物着生生物、および/または植物アソシエートマイクロバイオームのライブラリーを準備する工程と、(ii)植物遺伝資源ライブラリーに、ライブラリーから選択される1種または複数のエンドファイト、および/または植物着生生物、および/または植物アソシエートマイクロバイオームを接種して共生体を生成する工程と、(iii)所望の共生体特性について、共生体を育種、選択、スクリーニング、および/または評価する工程と、(iv)所望の特性を呈する共生体を同定、培養、または他の方法で使用して、改善された植物を産生する工程とを含む、請求項2に記載の方法。

請求項15

植物が草またはマメ科植物である、請求項14に記載の方法。

請求項16

生物が動物であり、方法が、(i)動物遺伝資源のライブラリー、および共生生物のライブラリーを準備する工程と、(ii)動物遺伝資源ライブラリーに共生生物ライブラリーから選択される1種または複数の共生生物を接種して、共生体を生成する工程と、(iii)所望の共生体特性について、共生体を育種、選択、スクリーニング、および/または評価する工程と、(iv)所望の特性を呈する共生体を同定、培養、または他の方法で使用して、改善された動物を産生する工程とを含む、請求項2に記載の方法。

請求項17

所望の特性を呈する動物共生体を、分子遺伝子型判定および/または表現型判定に付す工程を含む、請求項13に記載の方法。

請求項18

請求項1から17のいずれか一項に記載の方法を使用して産生される、共生生物を有する改善された生物。

請求項19

生物が植物である、請求項18に記載の改善された生物。

請求項20

請求項19に記載の植物に由来し、エンドファイトに安定に感染した植物、植物種子、または他の植物部分

請求項21

生物-共生生物アソシエーションのゲノム選択の方法であって、(i)前記生物または前記生物-共生生物アソシエーションから核酸試料のライブラリーを準備する工程と、(ii)メタノミクスを使用して前記試料分析して、各試料の遺伝子プロファイルを得る工程と、(iii)所望の遺伝子プロファイルおよび代謝プロファイルを有する生物-共生生物アソシエーションを選択する工程とを含む、方法。

請求項22

(i)生物-共生生物アソシエーションを準備する事前工程と、(ii)1つまたは複数の環境条件に前記生物-共生生物アソシエーションを曝す事前工程と、(iii)環境的に処理された生物-共生生物アソシエーションのそれぞれから核酸試料のライラリーを調製する事前工程とを含む、請求項21に記載の方法。

請求項23

前記生物が植物であり、前記共生生物が細菌マイクロバイオームである、請求項21または22に記載の方法。

請求項24

図面または実施例のいずれか1つを参照して実質的に前述された、請求項1または21に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、生物、特に、真菌エンドファイト、または植物着生生物、または植物中の細菌マイクロバイオームなど、および反芻家畜中の第1マイクロバイオームなどの共生生物との共生挙動を呈する生物を選択および育種する新しい方法、ならびにそれによって開発される新しい生物および共生体に関する。

背景技術

0002

家畜農作物、および牧草の多くの種の表現型は、個体の遺伝子型と共生生物の遺伝子型との間の相互作用に依存する。飼料草、マメ科植物樹木低木、およびつる植物を含めた重要な植物は、真菌、細菌、ウイルス、および微生物を含めたエンドファイトとのアソシエーション(association)で一般に見つかる。同様に、ウシヒツジブタヤギなどを含めた重要な動物は、それらの腸および第1胃内に存在するマイクロバイオームを有する。

0003

水および栄養素ストレスに対する寛容性の改善、ならびに害虫に対する耐性を含めた、有益および有害の両方の園芸的、農学的、および獣医学的性質は、このようなアソシエーションから生じる。

0004

例えば、ライグラス植物は、正しい遺伝型の真菌エンドファイトが植物にコロニー形成する場合、改善された乾燥寛容性および持続性を示すことができる。同様に、草において、虫害抵抗性が、エンドファイトによって産生される特定の代謝産物、特に、ロリンアルカロイドおよびペラミンによってもたらされうる。真菌エンドファイトによって産生される他の代謝産物、例えば、ロリトレムおよび麦角アルカロイドは、草食動物(grazing animal)に有害であり得、草食動物(herbivore)の摂食を低減しうる。

0005

共生生物の代謝産物プロファイルにおいて相当なバリエーションが存在することが知られている。例えば、動物毒素のいずれか、または両方を欠く真菌エンドファイト株が、市販のライグラスの品種中に導入された。

0006

細菌マイクロバイオームも、植物のパフォーマンス(例えば、ライグラス、コムギにおける)に影響する。

0007

動物では、腸内に存在する微生物が動物の消化関与する。反芻動物は、自己の第1胃において極めて大きくて複雑な多数の微生物を宿し、反芻動物が低品質の飼料を肉および乳の形態でヒトが消費するための高品質のタンパク質および脂質に転換するのを可能にするのはこの微生物群である。このプロセスの間に、強力な温室ガスであるメタンが産生される。第1胃微生物-ウシ共生体は、例えば、餌転換効率を改善し、メタン産生を低減することにおいて重要となりうる。反芻動物では、芳しくない質の餌の順調な消化は、特定の第1胃マイクロバイオームプロファイルを有することに依存しうる。宿主ゲノムの領域が、第1胃微生物プロファイルにおける差異と関連することを実証することができれば、それを、メタン放出がより少なく、餌転換効率が改善されたウシを繁殖させるのに活用することができる。

0008

単純配列反復(SSR)マーカーなどの分子遺伝子マーカーが、共生生物分類群間で区別し、分類群内の遺伝的変異を検出するための診断検査として開発された。例えば、マーカーを、異なる毒素プロファイルを有する共生生物株を識別するのに使用することができる。

0009

しかし、共生生物との共生挙動を呈する生物を同定、単離し、かつ/または特徴付ける方法の必要性が残っている。これらの共生体を人工的に育種することが困難であるため、その有用性が制限される。例えば、牧草ベース農業に有益であることが知られている新規エンドファイトの多くは、低接種頻度を呈し、優良遺伝資源においてより不安定である。

0010

さらに、伝統的な育種技法において、例えば、ペレニアルライグラスおよびトールフェスクなどの飼料草では、草の品種は、古典的な交雑育種技法を使用して育種され、草遺伝子型は、複数年の期間にわたるこれらのパフォーマンスを監視した後、これらの優れた特性について選択される。次いで、実験的な品種を形成する選択された草遺伝子型に、単一エンドファイトが接種され、得られる草-エンドファイトアソシエーションが、虫害抵抗性などの任意の好都合な特性について評価される。次いで、自己の中に単一エンドファイトを展開させた個々の実験的な合成品種は、数年の期間にわたって農業パフォーマンスおよび草食動物による得られる動物パフォーマンスについて評価される。この評価プロセスは、異なる実験的な合成品種中に展開されている単一エンドファイトが、これらの品種のいくつかにおいて栄養安定性および/もしくは世代間の安定性を示すことができず、または単一エンドファイトによって付与される所望のアルカロイドプロファイルが、異なる合成品種間で変動し、適切なレベルの虫害抵抗性を付与することに失敗し、動物の中毒を引き起こしうることを露呈する場合がある。この時間のかかるプロセスを加速し、または他の方法で改善することができれば、当技術分野において著しい発展となるはずである。

0011

オーストラリア特許出願第2011902393号
国際特許出願第PCT/AU2011/000020号

先行技術

0012

Elshireら、2011年5月、PlosOne

発明が解決しようとする課題

0013

したがって本発明の目的は、先行技術に関連する困難または欠陥の1つまたは複数を克服し、または少なくとも軽減することである。

課題を解決するための手段

0014

したがって、本発明の第1の態様では、改善された生物を産生するための方法であって、
(i)生物の遺伝資源のライブラリー、および
共生生物のライブラリーを準備する工程と、
(ii)遺伝資源ライブラリーに、共生生物ライブラリーから選択される1種または複数の共生生物を接種して、共生体を生成する工程と、
(iii)所望の共生体特性について、接種された遺伝資源または共生体を育種、選択、スクリーニング、および/または評価する工程と、
(iv)所望の特性を呈する共生体を引き続いて同定、培養、または他の方法で使用して、改善された生物を産生する工程と
を含む、方法が提供される。

0015

「共生体(symbiotum)」[または複数形の共生体(symbiota)]とは、生物の共生生物とのアソシエーションを表す超生物(supra-organism)を意味する。例えば、共生体は、接種された植物遺伝資源でありうる。

0016

「ライブラリー」とは、共生生物のコレクションなどの資源を意味する。

0017

出願人らは、複数の生物内に複数の共生生物を展開させ、育種プロセスの早期に改善された共生適合性およびパフォーマンスの改善について選択することが可能であることを立証した。すなわち、共生生物-生物の遺伝子型の組合せが、非経験的に、共生体の適合性およびパフォーマンスの改善を含めた所望の特性について育種およびスクリーニングされる。これは、生物宿主、例えば、草の品種が、ある時間にわたって育種および選択され、その後共生生物接種が品種開発の後期に単一共生生物を用いて行われる先行技術の技法と対比することができる。

0018

本願において、用語「生物」は、限定することなく動物および植物を含めた真核多細胞生物を指す。特定の実施形態では、動物は、哺乳動物またはトリでありうる。特に重要なのは、腸または第1胃内にマイクロバイオームを持つ農業的意義のある哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギなどである。特定の実施形態では、生物は、限定することなく単子葉植物および双子葉植物を含めた植物である。植物の具体的なタイプとしては、限定することなく、多年生草、マメ科植物、装飾樹または結実木、つる植物、低木および灌木、ハーブ、ならびに装飾花または食用の花がある。

0019

本発明のこの態様の好適な実施形態では、生物は、植物であっても動物であってもよく、共生生物は、その植物または動物と共生的アソシエーションを形成することができる。好ましくは、生物は、エンドファイトと共生的アソシエーションを確立する植物である。

0020

「共生生物」とは、多細胞生物とアソシエートした微生物を意味する。

0021

「とアソシエートした」とは、共生生物が生物上、生物内、または生物にごく接近して生きることを意味する。例えば、共生生物は、別の生物の体内もしくは細胞内、または生物の表面、例えば、植物と密接に付随している生物膜上もしくはそれと密接にアソシエートして生きる微生物でありうる。植物の場合では、共生生物は、例えば、植物の内部組織内で生きる内部寄生性であり得、またはこれは、例えば、植物上で外部に成長する着生性でありうる。

0022

共生生物は、真菌、ウイルス、細菌、および他の微生物の1種または複数から選択することができる。例えば、これは、真菌もしくは細菌エンドファイトなどのエンドファイト、真菌もしくは細菌植物着生生物などの植物着生生物、細菌マイクロバイオーム、またはアーバスキュラー菌根などの菌根でありうる。

0023

したがって、本発明の好適な実施形態では、生物が植物であり、方法が、
(i)植物遺伝資源のライブラリー、ならびに
エンドファイト、および/または植物着生生物、および/または植物アソシエートマイクロバイオームのライブラリーを準備する工程と、
(ii)植物遺伝資源ライブラリーに、ライブラリーから選択される1種または複数のエンドファイト、および/または植物着生生物、および/または植物アソシエートマイクロバイオームを接種して共生体を生成する工程と、
(iii)所望の共生体特性について、共生体を育種、選択、スクリーニング、および/または評価する工程と、
(iv)所望の特性を呈する共生体を同定、培養、または他の方法で使用して、改善された植物を産生する工程と
を含む、上述した方法が提供される。

0024

好適な実施形態では、本方法は、所望の特性を呈する改善された共生体品種を開発するのに使用することができる。

0025

本発明のさらなる態様では、生物-共生生物アソシエーションのゲノム選択の方法であって、
(i)前記生物または前記生物-共生生物アソシエーションから核酸試料のライブラリーを準備する工程と、
(ii)メタノミクスを使用して前記試料分析することによって、各試料の遺伝子プロファイルを得る工程と、
(iii)所望の遺伝子プロファイルおよび/または代謝プロファイルを有する生物または生物-共生生物アソシエーションを選択する工程と
を含む方法が提供される。

0026

好適な実施形態では、本方法は、
(i)生物-共生生物アソシエーションを準備する事前工程と、
(ii)1つまたは複数の環境条件に前記生物-共生生物アソシエーションを曝す事前工程と、
(iii)環境的に処理された生物-共生生物アソシエーションのそれぞれから核酸試料のライラリーを調製する事前工程と
を含みうる。

0027

本発明のこの態様の好適な実施形態では、生物は、植物であっても動物であってもよく、共生生物は、細菌マイクロバイオームでありうる。

0028

好適な実施形態では、本方法は、所望の特性を呈する改善された共生体品種を開発するのに使用することができる。

0029

植物は、草、好ましくは多年草、マメ科植物、つる植物、低木、樹木、ハーブ、花、低木、または灌木でありうる。本発明のこの態様による方法は、草およびマメ科植物に特に適用可能である。

0030

エンドファイトは、真菌または細菌エンドファイトでありうる。植物着生生物は、真菌または細菌植物着生生物でありうる。好適な実施形態では、ライブラリーは、細菌マイクロバイオームでありうる。

0031

好適な実施形態では、共生生物は、真菌もしくは細菌エンドファイト、真菌もしくは細菌植物着生生物、または細菌マイクロバイオームでありうる。

0032

「メタゲノミクスによって前記試料を分析すること」とは、サンプリングされたアソシエーションのメンバーのかなりの割合、好ましくは実質的にすべてに由来するかなりの割合、好ましくは実質的にすべての遺伝子の概ね無作為の試料が分析されるように、生物、または生物-共生生物アソシエーションから、好ましくは生物、または生物-共生生物アソシエーションから直接回収される遺伝物質を分析することを意味する。

0033

この分析は、単純配列反復(SSR)または交配型遺伝子マーカーなどの多型マーカーの存在または非存在を検出することができる。

0034

代替としてまたは追加的に、この分析は、ゲノムおよび/またはミトコンドリアのDNAおよび/またはリボソームRNA配列決定し、公知の核酸配列、例えば、細菌遺伝子を示す16SrRNA配列のデータベースと配列比較を実施することができる。

0035

前記生物-共生生物アソシエーションが曝されうる1つまたは複数の環境条件としては、それだけに限らないが、栄養素ストレスなどの異なる栄養条件、例えば、低窒素または低リン、および異なる光、温度、または水の条件、例えば、それぞれ、低光、低温ストレス、または水分ストレスなどがある。

0036

本発明の好適な実施形態では、共生生物は、共生体の安定性、共生体の非生物的ストレス寛容性(例えば、水分ストレス)、共生体の生物的ストレス寛容性(例えば、耐病性)、共生体の養分利用効率(例えば、リン利用効率窒素利用効率)を増強するため、および例えば、反芻家畜種などの動物における共生生物形質移入について、共生体(すなわち、自己の第1胃マイクロバイオームを有する反芻家畜生物)の飼料転換効率を増強するため、または共生体からのメタン生成を軽減するための遺伝的変異を含みうる。

0037

遺伝的変異は、任意の標準的な技法を利用して、例えば、ランダム突然変異誘発、2倍数化/多倍数化、標的突然変異生成、シスジェネシス、トランスジェネシス、イントラジェネシスのうちの1つまたは複数を介して導入することができる。

0038

遺伝子分析は、上述したように行うことができる。実生は、例えば、細菌16SrRNA配列についてスクリーニングすることができる。

0039

共生体は、接種された植物種子発芽種子、実生、小植物、植物などを含めた任意の適当な形態のものでありうる。

0040

好適な形態では、核酸試料は、実生の葉、より好ましくは、実生の上胚軸胚軸、または同様の胚性シュートから抽出されうる。草では、DNA/RNAは、分げつから抽出されうる。別の好適な形態では、核酸試料は、根試料から抽出されうる。代わりに、核酸試料は、全発芽種子または実生から抽出されうる。

0041

好ましくは、核酸試料は、RNA試料であり、次いでこれらを、cDNAライブラリーを構築するのに使用することができる。

0042

本発明のこの態様による方法は、共生体パフォーマンスを評価し、かつ/または所望の特性を維持するために選択された共生体集団を表現型判定に付す工程、および例えば多交雑によって合成共生体品種を生成するために共生体を選択する工程をさらに含みうる。

0043

例えば、選択された共生体品種を、共生生物同定アッセイ、その後、次世代の種子を生成するための多交雑に付すことができる。任意選択で、上記工程を繰り返して、次世代、例えば、次の種子世代における共生体の安定性、所望の特性、共生生物の素性、および/または共生生物の発生率を確認することができる。

0044

したがって、本発明のさらなる態様では、上述した方法を利用して産生される1種または複数の共生生物を含有する1種または複数の生物を含む改善された共生体が提供される。

0045

したがって、本発明のさらなる態様では、共生生物を含み、上述した方法を利用して産生される共生体を呈する改善された生物が提供される。

0046

改善された生物は、植物であっても動物であってもよい。

0047

生物が植物である場合、植物は、草、樹木、花、ハーブ、低木もしくは灌木、つる植物もしくはマメ科植物、またはこれらの産物でありうる。

0048

植物材料は、種子、実生、胚などの形態でありうる。

0049

上述した方法工程は、共生体の種子、植物、または動物の後の世代を発生させるのに繰り返すことができる。

0050

さらなる態様では、本発明は、本発明の種子または植物に由来し、共生生物に安定に感染した植物、植物種子、または他の植物部分を提供する。

0051

好ましくは、植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分は、草、より好ましくは飼料、芝生、またはバイオエネルギー草、例えば、ホソムギ(L. perenne)およびヒロハノウシノケグサ(L. arundinaceum)を含めたロリウム(Lolium)属およびウシノケグサ(Festuca)属のもの、ならびに熱帯牧草ブリザンタ(B. brizantha)、シグナルグラス(B. decumbens)、B.フミジコラ(B. humidicola)、およびU.モサンセンシス(U. mosambicensis)を含めたブラキアリア(Brachiaria)属およびウロクロア(Urochloa)属のものなどである。

0052

「植物細胞」とは、半透膜によって囲まれた、プラスチドを含有する任意の自己増殖細胞を意味する。このような細胞は、さらなる増殖が望まれる場合、細胞壁も必要とした。植物細胞としては、本明細書において、限定することなく、種子懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体胞子体花粉、および小胞子がある。

0053

真菌エンドファイト株のライブラリーを確立するために、大規模エンドファイト発見プログラムが行われた。ペレニアルライグラスおよびトールフェスクアクセションのコレクションが確立された。

0054

植物遺伝資源に接種するのに選択されるエンドファイトは、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Novel Endophytes」という表題の2012年6月1日に出願されたオーストラリア仮特許出願に記載の技法を利用して選択することができる。該出願に記載の新規エンドファイトが特に好適である。

0055

これらのアクセション中のエンドファイトを遺伝子分析すると、いくつかの新規エンドファイト株が同定された。これらの新規エンドファイト株は、公知のエンドファイト株と遺伝的に異なる。これらの株の毒素プロファイルを判定するのに、代謝プロファイリングを行うことができる。

0056

SSRマーカーを用いた植物中のエンドファイトの特異的検出を使用して、例えば、草本、品種、および栽培品種中に人工的に接種されたエンドファイト株の存在および素性を確認することができる。

0057

本発明のこの態様の方法によるスクリーニング工程(iii)において、接種された遺伝資源を、遺伝子分析および/または代謝プロファイリングによってスクリーニングすることができる。例えば、「Novel Endophytes」という表題のオーストラリア仮特許出願に記載の遺伝子分析の技法を使用することができる。

0058

代替としてまたは追加的に、接種された遺伝資源を遺伝子分析に付す(遺伝的に特徴付ける)ことによって、公知の共生生物-遺伝子型共生体からの遺伝的な区別を実証し、例えば、草本、品種、栽培品種中に人工的に接種された共生生物株の素性を確認することができる。

0059

「遺伝子分析」とは、共生生物の核および/またはミトコンドリアのDNAを分析することを意味する。

0060

この分析は、単純配列反復(SSR)または交配型マーカーなどの多型マーカーの存在または非存在を検出することができる。SSRは、マイクロサテライトとも呼ばれ、縦列反復した1〜7のヌクレオチドコアエレメント、より一般的には、1〜4のヌクレオチドコアエレメントに基づく。SSRアレイは、複雑なフランキングDNA配列内に埋め込まれている。マイクロサテライトは、複製スリップ性質に起因して生じると考えられており、複製スリップでは、DNAポリメラーゼ酵素一時停止し、その鋳型に関して短い間スリップし、その結果、短い隣接配列が繰り返される。いくつかの配列モチーフは、他のものよりスリップを起こしやすく、異なるモチーフタイプに基づいてSSR遺伝子座相対数におけるバリエーションを生じる。重複した後、SSRアレイは、さらなるスリップおよび/または不等姉妹染色分体交換に起因してさらに拡張(または収縮)しうる。SSR部位の総数は高く、その結果原理上は、このような遺伝子座は、任意の連鎖遺伝子のタグをもたらすことができる。

0061

SSRは、繰り返し数のバリエーションに起因して高度に多型であり、共優性的に遺伝する。SSRの検出は、ほんの少量のDNAを必要とし、自動化に適したポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づく。これらは、真菌および植物のゲノムを含めた真核生物内で遍在しており、植物ゲノム内で21〜65kbごとに存在することが判明している。したがって、SSRは、広い範囲の用途、例えば、遺伝的多様性解析遺伝子型同定、ゲノムマッピング形質マッピング、およびマーカー支援選択などの理想的なマーカーである。

0062

ペレニアルライグラス中のエンドファイト多様性を調査するのに使用することができる公知のSSRマーカーは、van Zijll de Jongら(2003)に記載されている。

0063

代替としてまたは追加的に、遺伝子分析では、共生生物間の遺伝的変異を評価するために、ゲノムおよび/またはミトコンドリアのDNAを配列決定し、配列比較を実施することができる。

0064

接種された遺伝資源または生物-共生生物アソシエーションは、所望の代謝形質の存在を同定するために代謝分析に付すことができる。

0065

「代謝分析」とは、共生生物によって産生される代謝産物、特に毒素を分析することを意味する。好ましくは、これは、共生生物のそれぞれについての接種された植物の生成、ならびに例えば、植物体中の毒素レベル、害虫および/もしくは疾患に対する耐性、または水および/もしくは栄養素ストレスに対する寛容性の測定によって行われる。より好ましくは、これは、エンドファイトのそれぞれについての同質遺伝子的に接種された植物の生成、および植物体中の毒素レベルの測定によって行われる。

0066

「所望の遺伝子および代謝プロファイル」とは、共生生物が、共生生物を保有し、または別の方法でそれとアソシエートした生物において有益な表現型をもたらす遺伝子特性および/または代謝特性を有することを意味する。

0067

このような有益な性質としては、例えば、共生生物を欠いている、または標準的毒性(ST)エンドファイトなどの対照共生生物を含有する対照植物と比べて、共生生物がアソシエートした植物における、水分および/または栄養素ストレスに対する改善された寛容性、害虫および/または疾患に対する改善された耐性、増強した生物的ストレス寛容性、増強した乾燥寛容性、増強した水利用効率、両極端の温度に対する増強した寛容性、低減した毒性、増強した養分利用性、ならびに増強した成長力がある。

0068

このような有益な性質には、草食動物に対するアソシエートした植物の低減した毒性も含まれる。

0069

例えば、水分および/または栄養素ストレスに対する寛容性は、STエンドファイトなどの対照共生生物または無共生生物対照植物と比べて、少なくともおよそ5%、より好ましくは少なくともおよそ10%、より好ましくは少なくともおよそ25%、より好ましくは少なくともおよそ50%、より好ましくは少なくともおよそ100%増大されうる。好ましくは、水分および/または栄養素ストレスに対する寛容性は、STエンドファイトなどの対照共生生物または無共生生物対照植物と比べて、およそ5%からおよそ50%の間、より好ましくは、およそ10%からおよそ25%の間で増大されうる。

0070

例えば、害虫および/または疾患に対する植物の耐性は、対照植物と比べて、少なくともおよそ5%、より好ましくは少なくともおよそ10%、より好ましくは少なくともおよそ25%、より好ましくは少なくともおよそ50%、より好ましくは少なくともおよそ100%増大されうる。好ましくは、疾患および/または害虫に対する植物の耐性は、対照植物と比べて、およそ5%からおよそ50%の間、より好ましくは、およそ10%からおよそ25%の間で増大されうる。

0071

例えば、水利用効率および/または植物の成長力は、STエンドファイトなどの対照共生生物または無共生生物対照植物と比べて、少なくともおよそ5%、より好ましくは少なくともおよそ10%、より好ましくは少なくともおよそ25%、より好ましくは少なくともおよそ50%、より好ましくは少なくともおよそ100%増大されうる。好ましくは、水分および/または栄養素ストレスに対する寛容性は、STエンドファイトなどの対照共生生物または無共生生物対照植物と比べておよそ5%からおよそ50%の間、より好ましくは、およそ10%からおよそ25%の間で増大されうる。

0072

例えば、毒性は、STエンドファイトなどの対照共生生物または無共生生物対照植物と比べて、少なくともおよそ5%、より好ましくは少なくともおよそ10%、より好ましくは少なくともおよそ25%、より好ましくは少なくともおよそ50%、より好ましくは少なくともおよそ100%低減されうる。好ましくは、毒性は、STエンドファイトなどの対照共生生物または無共生生物対照植物と比べて、およそ5%からおよそ100%の間、より好ましくは、およそ50%からおよそ100%の間で低減されうる。

0073

好適な実施形態では、毒性は、無視できる量または実質的にゼロの毒性まで低減されうる。

0074

好適な実施形態では、エンドファイトは、所望の毒素プロファイルを呈することができる。

0075

好ましくは、エンドファイトは、ウシノケグサ種、好ましくは、トールフェスクから単離される。

0076

好ましくは、エンドファイトは、ネオティディウム(Neotyphodium)属のものであり、より好ましくは、これは、N ウンシナツム(N uncinatum)、N コエノフィアルム(N coenophialum)、およびN ロリイ(N lolii)からなる群から選択される種、最も好ましくは N コエノフィアルムに由来する。エンドファイトは、Eティフィナ(E typhina)、E バコニイ(E baconii)、およびE.フェスツカエ(E festucae)を含めたエピクロエ(Epichloe)属にも由来しうる。エンドファイトは、非エピクロエ外群のものであってもよい。エンドファイトは、FaTG-3およびFaTG-3様、ならびにFaTG-2およびFaTG-2様からなる群から選択される種に由来してもよい。

0077

エンドファイトは、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、本出願人の「Fungi and associated methods」という表題のオーストラリア特許出願第2011902393号に記載されているように、A.インプリカツム(A. implicatum)を含めたアクレモニウム(Acremonium)属、およびブラキアリア(Brachiaria)-ウロクロア(Urochloa)草に由来するエンドファイトにも由来しうる。

0078

「所望の毒素プロファイル」とは、共生生物が、対照生物よりかなり毒性が低い化合物および/または著しくより有益な化合物を産生することを意味する。例えば、植物の場合では、エンドファイトは、標準的毒性(ST)エンドファイトなどの対照エンドファイトを接種された植物と比較して、エルバリンなどのかなり毒性が低いアルカロイド、ならびに/またはやはりSTなどの対照エンドファイトを接種された植物もしくは無エンドファイト対照植物と比較した場合、エンドファイトがアソシエートした植物において、有益な性質、例えば、水分および/もしくは栄養素ストレスに対する改善された寛容性ならびに害虫および/もしくは疾患に対する改善された耐性などを付与する著しくより多くのアルカロイド、例えば、ペラミン、N-ホルミルロリン、N-アセチルロリン、およびノルロリンなどを産生することができる。

0079

特に好適な実施形態では、エンドファイトは、それぞれ受託番号V10/000001、V10/000002、V10/000003、およびV10/000004で2010年1月5日に国立計測研究所に寄託され、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許出願第PCT/AU2011/000020号に記載されている、E1、NEA10、NEA11、およびNEA12からなる群から選択することができる。

0080

特に好適な実施形態では、エンドファイトは、それぞれ受託番号V12/001413、V12/001414、V12/001415、V12/001416、V12/001417、V12/001418、およびV12/001419で2012年4月3日に国立計測研究所に寄託され、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Novel endophytes」という表題で2012年6月1日に出願されたオーストラリア特許出願に記載されている、NEA16、NEA17、NEA18、NEA19、NEA20、NEA21、およびNEA23からなる群から選択することができる。

0081

特に好適な実施形態では、エンドファイトは、それぞれ受託番号V11/011370、V11/011371、V11/011372、V11/011373、およびV11/011374で2011年6月15日に国立計測研究所に寄託され、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Fungi and associated methods」という表題のオーストラリア特許出願第2011902393号に記載されている、アクレモニウム1.1.A(1.1A)、3.3.A(3.3A)、5.1.B(5.1B)、9.2.A(9.2A)、および12.1.A(12.1A)からなる群から選択することができる。

0082

このようなエンドファイトは、前述した所望の毒素プロファイルを有しうる。

0083

本発明の好適な実施形態では、共生生物は、例えば、草などの植物におけるエンドファイト形質移入について、共生体の栄養安定性、共生体の世代間安定性、共生体の非生物的ストレス寛容性(例えば、水分ストレス)、共生体の生物的ストレス寛容性(例えば、耐病性)、共生体の養分利用効率(例えば、リン利用効率、窒素利用効率)を増強するため、および例えば、反芻家畜種などの動物における共生生物形質移入について、共生体(すなわち、自己の第1胃マイクロバイオームを有する反芻家畜生物)の飼料転換効率を増強するため、または共生体からのメタン生成を軽減するための遺伝的変異を含みうる。

0084

遺伝的変異は、任意の標準的な技法を利用して、例えば、ランダム突然変異誘発、2倍数化/多倍数化、標的突然変異生成、シスジェネシス、トランスジェネシス、イントラジェネシスのうちの1つまたは複数を介して導入することができる。

0085

好適な実施形態では、エンドファイトは、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Designer Endophytes」という表題で2012年6月1日に出願されたオーストラリア特許出願に記載のエンドファイトバリアントでありうる。

0086

特に好適な実施形態では、エンドファイトは、それぞれ受託番号V12/001408、V12/001409、V12/001410、V12/001411、およびV12/001412で2012年4月3日に国立計測研究所に寄託されたNEA12dh5、NEA12dh6、NEA12dh13、NEA12dh14、およびNEA12dh17からなる群から選択されるエンドファイトバリアントからなるから選択することができる。

0087

このようなエンドファイトは、前述した所望の毒素プロファイルを有しうる。

0088

好ましくは、生物は、感染、育種、交雑ハイブリダイゼーション、およびこれらの組合せからなる群から選択される方法によって共生生物を接種されている。

0089

一実施形態では、植物は、同質遺伝子接種によって接種されうる。これは、エンドファイトの表現型効果を、宿主特異的遺伝作用の非存在下で評価することができるという利点を有する。より具体的には、エンドファイトの複数の接種を、植物遺伝資源、および培養液中で再生された小植物中に、土壌または他の成長培地に移す前に行うことができる。

0090

別の実施形態では、植物遺伝資源のライブラリーに複数のエンドファイトを接種することができる。これは、好都合な宿主-エンドファイトアソシエーションを同定することを可能にするという利点を有する。

0091

植物体において高度に適合性で安定である反対の交配型のエンドファイトを同定すると、ペレニアルライグラスのエンドファイトを分子育種するための手段がもたらされる。好ましくは、植物は、ハイパー接種(hyper-inoculation)によって感染させることができる。

0092

反対の交配型のエンドファイト株間菌糸融合すると、好ましくはハイパー接種を介して宿主植物中に好都合な形質を送達する手段がもたらされる。このような株は、好ましくは、高接種頻度、および広範囲の遺伝資源、好ましくは優良ペレニアルライグラスおよび/またはトールフェスク宿主遺伝資源との高適合性という好都合な特性を呈するエンドファイト株、ならびに低接種頻度および低適合性を呈するが、高度に好都合なアルカロイド毒素プロファイルを有するエンドファイトを含む群から選択される。

0093

エンドファイト感染植物は、公知の技法によって培養することができる。当業者は、培養される植物に応じた適切な培養条件を容易に決定することができる。

0094

スクリーニング工程(iii)は、植物代謝産物を分析する工程を含みうる。代謝産物は、公知の技法、例えば、クロマトグラフィー技法または質量分析法、例えば、LCMSまたはHPLCなどによって分析することができる。特に好適な実施形態では、エンドファイト感染植物は、逆相液体クロマトグラフィー質量分析法(LCMS)によって分析されうる。この逆相法は、単一のエンドファイト感染植物抽出物から1回のLCMSクロマトグラフィーの実行で特定の代謝産物(ロリン、ペラミン、エルゴバリン、ロリトレム、ならびにジャンチトレム、例えば、ジャンチトレムI、ジャンチトレムG、およびジャンチトレムFなどを含む)の分析を可能にしうる。

0095

特に好適な実施形態では、エンドファイトは、NEA2、NEA3、NEA6、NEA10、NEA11、NEA12、E1、NEA17、NEA21、NEA23、NEA18、NEA19、NEA16、NEA20、NEA12dh5、NEA12dh6、NEA12dh13、NEA12dh14、NEA12dh17、NEA12-DsRed、およびIRM1-35からなる群から選択することができる。

0096

別の特に好適な実施形態では、EIC(抽出イオンクロマトグラム)分析を含むLCMSは、少量のエンドファイト感染植物材料からのアルカロイド代謝産物の検出を可能にしうる。代謝産物の素性は、純粋な毒素、もしくは実質的に同じ条件下で分析された公知の毒素プロファイルを有するエンドファイト感染植物の抽出物の保持時間と保持時間を比較し、かつ/または、例えば、生成された、質量断片化パターンを比較することによって確認することができる。

0097

上述したように、本発明のこの態様による方法では、選択される生物は、植物であっても、動物であってもよく、好ましくは植物である。生物が植物である場合、植物遺伝資源は、胚として存在することができ、胚は、人工種子を形成するように処理することができる。

0098

したがって、好適な実施形態では、人工種子を調製するための方法であって、
植物種子の源を準備する工程と、
種子を表面滅菌工程に付す工程と、
表面滅菌した種子から種子胚を単離する工程と、
胚を被覆剤被覆して人工種子を形成する工程と
を含む、方法が提供される。

0099

人工種子は、「Method for large scale generation of symbiota」という表題で2012年6月1日および2012年9月7日に出願されたオーストラリア仮特許出願に記載の技法を利用して調製することができる。これらの出願の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれている。

0100

種子は、任意の適当な植物に由来しうる。植物は、草、好ましくは多年草、マメ科植物、つる植物、低木、樹木、ハーブ、花、低木、または灌木でありうる。本発明のこの態様による方法は、草およびマメ科植物に特に適用可能である。

0101

種子は、任意の適当な技法によって表面滅菌することができる。好ましくは、種子は、塩酸などの酸および次亜塩素酸ナトリウムなどの漂白剤でこれらを処理することによって滅菌される。好ましくは、酸および漂白剤の処理は、順次実施される。酸処理は、1時間〜24時間の期間、好ましくは一晩とすることができる。漂白剤処理は、5分〜1時間の期間、好ましくはおよそ20分とすることができる。漂白剤処理は、連日に2回実施される場合があり、種子は、例えば、滅菌蒸留水を使用して各処理後に洗浄され、およそ4〜30℃、好ましくはおよそ24℃で貯蔵される。

0102

胚は、当業者に公知の技法によって処理済み種子から単離することができる。

0103

好適な実施形態では、胚を処理して、共生生物、例えば、エンドファイトの1つまたは複数の侵入点を創製することができる。例えば、スクラッチングまたはエッチングによって、例えば、胚を穿刺し、またはその表面を他の方法で損傷させて、共生生物の侵入を促進することができる。特に好適な実施形態では、皮下針または同様のものを使用して、胚の表面に単独で、または複数の穿刺孔を創製することができる。

0104

被覆剤は、アルギネート寒天、polyco2133、カルボキシメチルセルロースカラギーナンゲルライトグアーガムペクチン酸ナトリウムトラガカントガムなどを含めた胚を被包する任意の適当なタイプのものとすることができる。好適な実施形態では、被覆剤は、アルギネート、より具体的には、アルギン酸カルシウムである。

0105

好適な実施形態では、胚を被覆剤と混合し、個々の胚を含有する被覆剤の液滴を、好ましくは撹拌しながら塩化カルシウム溶液などの重合溶液中に入れて人工種子を形成することができる。人工種子は、およそ1〜60分撹拌した後、好ましくは、およそ15分撹拌した後に収集することができる。

0106

好適な実施形態では、被覆する前に真菌エンドファイトなどの共生生物を胚に接種することができる。好適な形態では、胚にエンドファイト菌糸体直接接種することができる。

0107

代わりに、特に好適な実施形態では、単離胚を、真菌エンドファイト含有被覆層などの共生生物含有被覆層で被覆することができる。

0108

この実施形態では、接種工程は、
種子胚の源を準備する工程と、
胚に真菌エンドファイトなどの1種または複数の共生生物を接種する工程と、
接種された胚を被覆剤で被覆して人工種子を形成する工程と
を含みうる。

0109

代わりに、接種工程は、
種子胚の源を準備する工程と、
胚を真菌エンドファイトなどの共生生物を含有する被覆剤で被覆して人工種子を形成する工程と
とを含みうる。

0110

好適な実施形態では、種子は二重被覆されうる。好ましくは、第2の被覆層は、アルギネート、より好ましくはアルギン酸カルシウム、さらにより好ましくは着色されたアルギン酸カルシウムである。好適な実施形態では、第1の被覆層を有する人工種子は、第2の層で被覆される前に空気乾燥されうる。

0111

好適な実施形態では、本方法は、人工種子を第2の被覆層で被覆する工程をさらに含むことができ、前記第2の被覆層は、胚および/または共生生物を維持するのに適した添加された栄養分を好ましくは含有する。

0112

代わりに、第2の被覆層は、添加された栄養分を含有しない場合があり、この栄養分欠乏層は、例えば、発中のエンドファイトアウトグロースを低減し、胚にごく接近してエンドファイトが増殖するのを制限するように設計されている。

0113

好適な実施形態では、本方法は、
人工種子を成長させて小植物または実生を形成する工程と、
真菌エンドファイトの存在などの共生生物の存在について小植物または実生をスクリーニングする工程と
をさらに含みうる。

0114

人工種子を成長させる工程は、任意の適当な成長培地を使用して行うことができる。発芽培地、例えば、MS(Murashige and Skoog、ムラシゲ&スクーグ)、改変MS、またはMS+BAP(6-ベンジルアミノプリン)などが特に好適である。

0115

遺伝子分析は、上述したように行うことができる。実生は、例えば、共生生物特異的、例えば、エンドファイト特異的単純配列反復(SSR)についてスクリーニングすることができる。

0116

代替としてまたは追加的に、実生を、分子表現型判定を介して好都合な共生体の存在についてスクリーニングすることができる。分子表現型判定は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Molecular phenotypingmethod」という表題で2012年6月1日に出願されたオーストラリア仮特許出願に記載の方法を利用して実施することができる。

0117

この方法では、実生を、分子表現型判定を介して好都合な共生体の存在についてスクリーニングすることができる。実生は、例えば、アルカロイド産生の改善および/または水溶性炭水化物:タンパク質比の改善について評価することができる。このような技法は、酵素アッセイ、比色アッセイ、SSRマーカー、および/またはメタボロミクス分析を利用することができる。このような分析は、半自動化または実質的に完全に自動化されうる。

0118

したがって、本方法は、望ましい特性の存在について共生体をスクリーニングする工程を含み得、前記方法は、共生体の集団を分子表現型判定する工程を含む。

0119

好適な実施形態では、本方法は、アルカロイド産生および/または水溶性炭水化物(WSC):タンパク質比について共生体の集団を評価する工程を含みうる。好ましくは、この評価は、酵素アッセイ、比色アッセイ、SSRマーカー、およびメタボロミクス分析からなる群から選択される1つまたは複数の方法を使用して行われる。

0120

好適な実施形態では、アルカロイド産生の評価は、集団中のアルカロイドプロファイルおよび/または含量の測定を含む。好適なアルカロイドとしては、ペラミン、ロリトレムB、およびエルゴバリンがある。好適な実施形態では、アルカロイドは、SSRマーカーによって推測し、メタボロミクス分析によって検出することができ、より好ましくはSSRマーカーとメタボロミクス分析の組合せが使用される。

0121

別の好適な実施形態では、WSC:タンパク質比を評価することができる。WSCは、酵素アッセイを使用して定量化されうる。好適な実施形態では、スクロースグルコースフルクトース、およびフルクタンの個々の濃度を判定することができる。タンパク質は、比色アッセイを使用して定量化されうる。

0122

特に好適な実施形態では、タンパク質は、
NaOH、好ましくは弱NaOH溶液などのアルカリを使用して共生体からタンパク質を抽出する工程と、
ブラッドフォードアッセイなどの比色アッセイを使用してタンパク質を定量化する工程と
を含む方法によって定量化されうる。

0123

検出は、例えば、プレートリーダーを使用して実施することができる。

0124

共生体は、接種された胚、植物種子、発芽種子、実生、小植物、植物などを含めた任意の適当な形態のものとすることができる。

0125

好ましくは、種子は、エンドファイト感染植物、すなわち、植物/エンドファイト共生体に由来する。

0126

本発明のこの態様による方法では、スクリーニング工程(iii)は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Method for selection of stable symbiota」という表題で2012年6月1日に出願されたオーストラリア特許出願に記載されている加速エージングによって人工種子をスクリーニングする工程を含みうる。

0127

したがって、本発明は、植物/エンドファイト共生体の適合性および/または安定性を評価する方法であって、
真菌エンドファイト接種植物胚などの共生生物を含む種子の源を準備する工程と、
植物-真菌エンドファイト共生体などの植物/共生生物アソシエーション(すなわち、共生体)の適合性および/または安定性について種子および/またはこれらの子孫を、これらに加速エージングを施すことによってスクリーニングする工程と
を含む方法を提供する。

0128

加速エージング手順では、種子またはこれらの子孫を、好ましくは高温および/または水分含量の増加によって劣化的条件に曝すことができる。特に好適な実施形態では、種子を高相対湿度の環境に曝露することができる。例えば、種子を、およそ-20〜50℃、好ましくは10〜45℃、より好ましくは15〜40℃、さらにより好ましくは25〜40℃の温度に、かつ/またはおよそ60%〜100%、好ましくは80%〜100%の湿度レベルに、例えば、およそ1〜30日、好ましくは2〜10日、より好ましくは4〜7日間曝露することができる。

0129

加速エージングにより、エンドファイト生存能が低減し、すなわち、これにより、不安定なアソシエーションの対抗選択が可能になり、共生体の安定性に基づいてこれらのランキングが可能になる。

0130

好ましくは、本方法は、選択された共生体集団を、迅速な真菌エンドファイトなどの共生生物生存能アッセイに付すさらなる工程を含む。

0131

したがって、本発明の方法は、植物-真菌エンドファイト共生体などの植物/共生生物アソシエーション(すなわち、共生体)の適合性および/または安定性を評価する工程であって、
共生生物、例えば、真菌エンドファイト接種植物胚を含む種子の源を準備する工程と、
植物-真菌エンドファイト共生体などの植物/共生生物アソシエーション(すなわち、共生体)の適合性および/または安定性について種子および/またはこれらの子孫を、これらに加速エージングを施すことによってスクリーニングする工程と
選択された共生体集団を迅速な真菌エンドファイトなどの共生生物生存能アッセイに付す工程と
を含む、工程をさらに含みうる。

0132

本発明のこの態様による生存能アッセイ工程は、
種子を培養して小植物、実生、または発芽種子を生成する工程と、
小植物、実生、または発芽種子からDNAおよび/またはRNAを抽出する工程と、
抽出したDNAおよび/またはRNAを、真菌エンドファイト特異的遺伝子などの植物体内発現される共生生物特異的遺伝子についてのアッセイに付す工程と
を含みうる。

0133

好ましくは、種子は、真菌エンドファイト接種植物などの共生生物接種植物に由来する。

0134

好ましくは、種子は、前述した人工種子である。

0135

迅速なエンドファイト生存能アッセイは、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれている、「Method for rapid endophyte viability assessment」という表題で2012年6月1日に出願されたオーストラリア特許出願に記載されている。

0136

好ましくは、種子は、真菌エンドファイト生存能などの共生生物生存能の迅速な評価を得ることができるように、相対的に短時間培養される。好ましくは、種子は、およそ1〜10日、より好ましくは3〜10日、より好ましくは3〜7日、より好ましくは3〜5日間培養される。

0137

出願人らは、エンドファイト特異的遺伝子がこの時間枠内で発現され、早期植物体内エンドファイト生存能評価を可能にすることを見出した。

0138

好適な形態では、DNA/RNAは、実生の葉から、より好ましくは実生の上胚軸、胚軸、または同様の胚性シュートから抽出されうる。草では、DNA/RNAは、分げつから抽出されうる。別の好適な形態では、DNA/RNAは、発芽種子全体から抽出されうる。

0139

好ましくは、RNAおよびDNAは、好ましくは単一工程で同時抽出されうる。好ましくは、DNA/RNAは、プロセスを加速するために、1〜10日齢、好ましくは3〜10日齢、より好ましくは3〜7日齢、より好ましくは3〜5日齢の、実生の上胚軸、胚軸、または同様の胚性シュートから抽出されうる。

0140

アッセイは、抽出されたDNA/RNA中の標的DNA/RNA分子増幅し、同時に定量化するのに使用されるアッセイでありうる。好ましくは、アッセイは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(Q-PCR/qRT-PCR)アッセイ、または動的ポリメラーゼ連鎖反応(KPCR)アッセイである。特に好適な形態では、アッセイは、TaqManまたは同様のアッセイとすることができる。

0141

エンドファイト特異的遺伝子は、任意の適当なタイプのものでありうる。好ましくは、これは、植物体内で唯一、主にまたは高度に発現される。タンパク質7490、8263、0005、および2232をコードする遺伝子が特に好適である。

0142

プライマーは、当業者に公知の方法によって標的遺伝子を増幅するために設計される。

0143

種子は、任意の適当な植物に由来しうる。植物は、草、好ましくは多年草、マメ科植物、つる植物、低木、樹木、ハーブ、花、低木、または灌木でありうる。本発明のこの態様による方法は、草およびマメ科植物に特に適用可能である。

0144

好ましくは、種子は、共生生物、例えば、エンドファイト感染植物、例えば、植物/エンドファイト共生体に由来する。

0145

好ましくは、種子は人工種子である。

0146

本発明のこの態様による方法は、選択された共生体集団を共生体パフォーマンスおよび/または所望の特性の維持を評価するための表現型判定に付す工程と、例えば、多交雑によって合成共生体品種を生成するために共生体を選択する工程とをさらに含みうる。

0147

例えば、選択された共生体品種を、共生生物同定アッセイ、その後、次世代の種子を生成するための多交雑に付すことができる。任意選択で、上記工程を繰り返して、次世代、例えば、次の種子世代における共生体の安定性、所望の特性、共生生物、例えば真菌エンドファイトの素性、および/または共生生物、例えば真菌エンドファイトの発生率を確認することができる。

0148

したがって、本発明のさらなる態様では、上述した方法を利用して産生される1種または複数の共生生物を含有する1種または複数の生物を含む改善された共生体が提供される。

0149

したがって、本発明のさらなる態様では、共生生物を含み、上述した方法を利用して産生される共生体を呈する改善された生物が提供される。

0150

改善された生物は、植物であっても動物であってもよい。

0151

生物が植物である場合、植物は、草、樹木、花、ハーブ、低木もしくは灌木、つる植物もしくはマメ科植物、またはこれらの産物でありうる。

0152

植物材料は、種子、実生、胚などの形態でありうる。

0153

上述した方法工程は、共生体の種子、植物、または動物の後の世代を発生させるのに繰り返すことができる。

0154

さらなる態様では、本発明は、本発明の種子または植物に由来し、共生生物、例えば、エンドファイトに安定に感染した植物、植物種子、または他の植物部分を提供する。

0155

好ましくは、植物細胞、植物、植物種子、または他の植物部分は、草、より好ましくは飼料、芝生、またはバイオエネルギー草、例えば、ホソムギおよびL.アルンジナセウムを含めたロリウム属およびウシノケグサ属のもの、ならびに熱帯牧草ブリザンタ、シグナルグラス、B.フミジコラ、およびU.モサンビセンシスを含めたブラキアリア属およびウロクロア属のものなどである。

0156

「植物細胞」とは、半透膜によって囲まれた、プラスチドを含有する任意の自己増殖細胞を意味する。このような細胞は、さらなる増殖が望まれる場合、細胞壁も必要とした。植物細胞としては、本明細書において、限定することなく、種子懸濁培養物、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子がある。

0157

本発明の代替の実施形態では、生物は、好ましくはウシ、ヒツジ、ヤギ、シカなどから選択される動物でありうる。

0158

したがって、本発明の好適な実施形態では、生物が動物であり、方法が、
(i)動物遺伝資源のライブラリー、および
共生生物のライブラリーを準備する工程と、
(ii)動物遺伝資源ライブラリーに共生生物ライブラリーから選択される1種または複数の共生生物を接種して、共生体を生成する工程と、
(iii)所望の共生体特性について、共生体を育種、選択、スクリーニング、および/または評価する工程と、
(iv)所望の特性を呈する共生体を同定、培養、または他の方法で使用して、改善された動物を産生する工程と
を含む、上述した方法が提供される。

0159

本発明のさらなる態様では、生物中の第1胃微生物プロファイルに影響する宿主生物のゲノムの領域をマッピングする方法であって、
(i)宿主ゲノムの多型のライブラリーを準備する工程と、
(ii)アソシエーション試験を実施することによって多型の第1胃マイクロバイオームプロファイルに対する効果を同定する工程と、
(iii)生物中の第1胃微生物プロファイルに影響する宿主ゲノムの1つまたは複数の領域を同定する工程と
を含む、方法が提供される。

0160

好適な実施形態では、生物はウシでありうる。

0161

さらなる態様では、本発明は、共生生物のゲノムに由来するポリペプチドまたは転写因子をコードする遺伝子を含む核酸を同定および/またはクローニングする工程を含む。

0162

このような遺伝子をコードする核酸を同定および/またはクローニングするための方法は、当業者に公知であり、cDNAもしくはゲノムライブラリーなどの核酸ライブラリーを創製する工程、および例えば、所望のタイプの遺伝子のプローブを使用してこのようなライブラリーをスクリーニングする工程、または例えば、化学的もしくはトランスポゾン突然変異誘発を使用して本発明の共生生物のゲノムを突然変異させる工程、対象とするポリペプチドまたは転写因子の生成の変化を同定し、したがってこのようなポリペプチドまたは転写因子をコードする遺伝子を同定する工程を含む。

0163

したがって、本発明のさらなる態様では、本発明の共生生物のゲノムに由来するポリペプチドまたは転写因子をコードする実質的に精製または単離された核酸が提供される。

0164

「核酸」とは、遺伝情報担持することができるヌクレオチドの鎖を意味する。この用語は一般に、遺伝子またはこれらの機能的に活性な断片もしくはバリアント、および/あるいは自己の表現型に影響及ぼす生物のゲノム内の他の配列を指す。用語「核酸」は、合成、非天然の、または変更されたヌクレオチド塩基を任意選択で含有する一本鎖または二本鎖であるDNA(cDNAまたはゲノムDNAなど)およびRNA(mRNAまたはマイクロRNAなど) 、合成核酸、ならびにこれらの組合せを含む。

0165

「ポリペプチドまたは転写因子をコードする核酸」とは、本発明の共生生物内に通常存在する酵素または転写因子をコードする核酸を意味する。

0166

本発明は、本発明の核酸の機能的に活性な断片およびバリアントを包含する。核酸に関して「機能的に活性な」とは、断片またはバリアント(類似体誘導体、または突然変異体など)が、例えば、共生生物中の該当する経路に関与するステップ触媒もしくは制御し、または経路を別段に制御することができる酵素または転写因子に翻訳されることによって、コードされるポリペプチドの機能を操作することができることを意味する。このようなバリアントには、天然に存在する対立遺伝子バリアントおよび天然に存在しないバリアントが含まれる。ヌクレオチドの1つまたは複数の付加、欠失置換、および誘導体化は、その修飾が断片またはバリアントの機能活性喪失させない限り企図されている。好ましくは、機能的に活性な断片またはバリアントは、その断片またはバリアントが対応する上述した配列の該当する部分と少なくともおよそ80%の同一性、より好ましくは少なくともおよそ90%の同一性、さらにより好ましくは少なくともおよそ95%の同一性、最も好ましくは少なくともおよそ98%の同一性を有する。このような機能的に活性なバリアントおよび断片には、例えば、保存的な核酸変化を有するものが含まれる。

0167

好ましくは、断片は、少なくとも20ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも50ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも100ヌクレオチドのサイズを有する。

0168

好ましくは、前記断片は、発現される場合、元の遺伝子と同じ活性を生じることができる。好ましくは、前記断片は、コンセンサス配列内に保存領域を維持する。

0169

好ましくは、前記バリアントは、保存された置換、または例えば、およそ5%以下、より好ましくは1%以下のレベルまでのコンセンサス配列中の制限された修飾をもたらす指定された配列のバリアントである。

0170

例えば、Xをコードする配列の断片およびバリアントとして、Xをコードする種Zに由来する野生型配列、Xをコードし、種Zに由来するコンセンサス配列中に保存領域を保持する野生型配列の断片、X活性をコードし、保存的な置換のみを有する野生型配列のバリアントもしくは断片、およびX活性をコードし、配列が、コンセンサス配列を組み立てるのに使用される1つまたは複数の寄与配列(contributing sequence)中に見つかる置換によってのみ異なるバリアントX'、またはX活性をコードし、バリアントが、野生型配列または断片からおよそ95%以下のアミノ酸バリエーション、より好ましくはおよそ99%以下のアミノ酸バリエーションを有するバリアントX''を挙げることができる。

0171

「保存的な核酸変化」または「保存された置換」とは、遺伝子コード縮退に起因してコードされるタンパク質中のアミノ酸が保存される核酸置換を意味する。このような機能的に活性なバリアントおよび断片には、例えば、対応するアミノ酸配列中の1つまたは複数の残基の保存的アミノ酸置換をもたらす核酸変化を有するものも含まれる。

0172

「保存的アミノ酸置換」とは、同じクラスの別のものによるアミノ酸の置換を意味し、諸クラスは、以下の通りである:
非極性: Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Met、Phe、Trp
荷電極性: Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、Gln
酸性: Asp、Glu
塩基性: Lys、Arg、His

0173

他の保存的アミノ酸置換も以下の通り行うことができる:
芳香族: Phe、Tyr、His
プロトン供与体: Asn、Gln、Lys、Arg、His、Trp
プロトン受容体: Glu、Asp、Thr、Ser、Tyr、Asn、Gln

0174

本発明のさらなる態様では、本発明による核酸を含む遺伝子コンストラクトが提供される。

0175

「遺伝子コンストラクト」とは、組換え核酸分子を意味する。

0176

好適な実施形態では、本発明による遺伝子コンストラクトは、ベクターでありうる。

0177

「ベクター」とは、遺伝物質を標的細胞に移すのに使用される遺伝子コンストラクトを意味する。

0178

ベクターは、任意の適当なタイプのものとすることができ、ウイルスであっても、非ウイルスであってもよい。ベクターは、発現ベクターでありうる。このようなベクターとしては、染色体、非染色体、および合成核酸配列、例えば、植物ウイルスの誘導体;細菌プラスミド;アグロバクテリウムツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)由来のTiプラスミドの誘導体;アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)由来のRiプラスミドの誘導体;ファージDNA;酵母人工染色体;細菌人工染色体;バイナリー細菌人工染色体;プラスミドとファージDNAの組合せに由来するベクターがある。しかし、任意の他のベクターも、それが標的細胞内に複製可能または組込み可能または生存可能である限り使用することができる。

0179

本発明のこの態様の好適な実施形態では、遺伝子コンストラクトは、プロモーターおよびターミネーターをさらに含むことができ、前記プロモーター、遺伝子、およびターミネーターは、作動可能に連結されている。

0180

「プロモーター」とは、作動可能に連結した核酸配列を直接転写するのに十分な核酸配列を意味する。

0181

「作動可能に連結した」とは、核酸、およびプロモーターなどの制御配列が、適切な条件下で、例えば、転写活性化因子タンパク質などの適切な分子が制御配列に結合しているとき、前記核酸の発現を可能にするように連結されていることを意味する。好ましくは、作動可能に連結したプロモーターは、付随する核酸の上流である。

0182

「上流」とは、核酸に沿って3'→5'方向を意味する。

0183

プロモーターおよびターミネーターは、任意の適当なタイプのものとすることができ、標的細胞に対して内因性であってもよく、またはこれらが標的細胞内で機能的であるという条件で外因性であってもよい。

0184

本発明の遺伝子コンストラクト中に使用されうる様々なターミネーターも当業者に周知である。ターミネーターは、プロモーター配列と同じ遺伝子に由来しても、異なる遺伝子に由来してもよい。特に適当なターミネーターは、(CaMV)35S polyAなどのポリアデニル化シグナル、ならびにノパリン合成酵素(nos)およびオクトピン合成酵素(ocs)の遺伝子に由来する他のターミネーターである。

0185

遺伝子コンストラクトは、プロモーター、遺伝子、およびターミネーターに加えて、様々な組合せで核酸の発現に必要なさらなるエレメント、例えば、ベクター骨格複製起点(ori)、複数のクローニング部位スペーサー配列エンハンサーイントロン抗生物質耐性遺伝子、ならびに他の選択可能マーカー遺伝子[ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(nptII)遺伝子、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(hph)遺伝子、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(barまたはpat)遺伝子など]、ならびにレポーター遺伝子[ベータ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子(gusA)および緑色蛍光タンパク質(GFP)遺伝子(gfp)など]を含みうる。遺伝子コンストラクトは、翻訳開始のためのリボソーム結合部位も含有しうる。遺伝子コンストラクトは、発現を増幅するための適切な配列も含みうる。

0186

当業者は、前記核酸の発現をもたらすように、遺伝子コンストラクトの様々なコンポーネントが作動可能に連結していることを理解するであろう。本発明の遺伝子コンストラクトのコンポーネントを作動可能に連結するための技法は、当業者に周知である。このような技法には、例えば、1つまたは複数の制限酵素部位を含む、合成リンカーなどのリンカーの使用が含まれる。

0187

好ましくは、遺伝子コンストラクトは、実質的に精製または単離されている。

0188

「実質的に精製された」とは、遺伝子コンストラクトが、本発明の核酸またはプロモーターが由来する生物の天然に存在するゲノム内で、核酸またはプロモーターに隣接する遺伝子を含まないことを意味する。したがってこの用語は、例えば、ベクター;自律複製プラスミドもしくはウイルス;または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNA中に組み込まれた、あるいは他の配列と独立した別個の分子(例えば、PCRまたは制限エンドヌクレアーゼ消化によって産生されるcDNAまたはゲノムもしくはcDNA断片)として存在する遺伝子コンストラクトを含む。この用語は、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である遺伝子コンストラクトも含む。

0189

好ましくは、実質的に精製された遺伝子コンストラクトは、少なくともおよそ90%純粋、より好ましくは少なくともおよそ95%純粋、さらにより好ましくは少なくともおよそ98%純粋である。

0190

用語「単離された」とは、材料が、その元の環境(例えば、これが天然に存在する場合、自然環境)から離されていることを意味する。例えば、生きた植物中に存在する天然に存在する核酸は、単離されていないが、自然系内で同時に存在する材料のいくつか、またはすべてから分離された同じ核酸は、単離されている。このような核酸は、ベクターの一部であり得、かつ/または組成物の一部であり得るが、このようなベクターまたは組成物は、その自然環境の一部でないという点で依然として単離されている。

0191

形質転換宿主細胞を選択するのに表現型形質を提供するために選択可能マーカー遺伝子を使用することの代替案として、形質転換細胞内の遺伝子コンストラクトの存在を、他の当技術分野で周知の技法、例えば、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)、サザンブロットハイブリダイゼーション分析、組織化学的アッセイ(例えば、GUSアッセイ)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、ノーザンおよびウエスタンブロットハイブリダイゼーション分析などによって判定することができる。

0192

本発明の遺伝子コンストラクトは、任意の適当な技法によって生物、例えば、植物、動物、微生物、または真菌中に導入することができる。植物細胞または真菌細胞内に本発明の遺伝子コンストラクトを組み込む(例えば、トランスダクショントランスフェクション形質転換、または遺伝子ターゲッティングによって)ための技法は、当業者に周知である。このような技法としては、アグロバクテリウム媒介導入、根粒菌媒介導入、組織、細胞、およびプロトプラストへの電気穿孔プロトプラスト融合生殖器への注射、未成熟胚への注射、ならびに細胞、組織、カルス、未成熟および成熟胚への高速発射体導入法、微粒子銃形質転換、Whiskers形質転換、ならびにこれらの組合せがある。技法の選択は、形質転換される植物または真菌のタイプに概ね依存することになり、適切な当業者によって容易に決定することができる。プロトプラストの形質転換については、PEG媒介形質転換が特に好適である。真菌の形質転換については、PEG媒介形質転換、およびプロトプラストの電気穿孔、および菌糸外植片のアグロバクテリウム媒介形質転換が特に好適である。

0193

本発明の遺伝子コンストラクトを組み込む細胞は、以下に記載するように選択し、次いで当技術分野で周知の技法を使用して適切な培地中で培養することによって形質転換植物または真菌を再生することができる。温度、pHなどの培養条件は、当業者に明らかとなるであろう。得られる植物または真菌を、当技術分野で周知の方法を使用して有性的に、または無性生殖的に再生して、代々の形質転換植物または真菌を産生することができる。

0194

本明細書において、脈絡により別段に要求される場合を除いて、用語「含む(comprise)」ならびにこの用語の変形、例えば、「含む(comprising)」「含む(comprises)」、および「含んだ」などは、さらなる付加物、コンポーネント、整数、または工程を除外するように意図されていない。

0195

明細書中の任意の先行技術への言及は、この先行技術がオーストラリアもしくは任意の他の管轄区域における共通の一般的な知識の一部を形成する、またはこの先行技術が当業者によって妥当であると確認され、理解され、見なされるように合理的に予期されうることの承認または任意の形態の示唆ではなく、そのように解釈されるべきでない。

図面の簡単な説明

0196

標的ウシノケグサ遺伝資源コレクションに由来するアクセション中のエンドファイト内容物の遺伝子型分析を示す図である。
トールフェスクエンドファイトの遺伝的多様性解析を示す図である。
宿主およびエンドファイトの多様性解析を示す図である。
代謝プロファイリング、エンドファイト単離、および同質遺伝子接種のためのウシノケグサ-エンドファイトの組合せの選択を示す図である。
代謝プロファイリング、エンドファイト単離、および同質遺伝子接種のためのウシノケグサ-エンドファイトの組合せの選択を示す図である。
トールフェスクエンドファイトの所望の毒素プロファイルを示す図である。
代謝プロファイル分析を示す図である。
代謝産物を半定量分析するために選択されるエンドファイトを示す図である。
ウシノケグサエンドファイトのメタボロミクス分析を示す図である。
ウシノケグサエンドファイトのメタボロミクス分析を示す図である。
温度/水分ストレス下での代謝プロファイルの半定量分析を示す図である。
同質遺伝子接種のために選択されるエンドファイトを示す図である。
同質遺伝子接種の前の単離されたエンドファイト培養物のSSRベース遺伝子型判定を示す図である。
トールフェスクおよびペレニアルライグラスの宿主遺伝子型におけるエンドファイトの栄養安定性(接種後12カ月における安定性)を示す図である。
同質遺伝子接種のために選択されるエンドファイトを示す図である。
同質遺伝子的トールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイリングを示す図である。
同質遺伝子的トールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイリングを示す図である。
同質遺伝子的トールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイリングを示す図である。
同質遺伝子的トールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイリングを示す図である。
ウシノケグサエンドファイトの抗真菌バイオアッセイを示す図である。列1 コレトトリクム・グラミニコラ(Colletotrichum graminicola)、列2 ドレクスレラ・ブリザエ(Drechslera brizae)、列3リゾクトニア・セレアリス(Rhizoctonia cerealis)。
選択された新規ウシノケグサエンドファイトの配列決定を示す図である。
ペラミン生合成経路を示す図である。
非エピクロエ外群エンドファイト内のperA遺伝子の存在を示す図である(NEA17)。
非エピクロエ外群エンドファイト内のperA遺伝子の存在を示す図である(NEA18)。
非エピクロエ外群エンドファイト内のperA遺伝子の存在を示す図である(NEA19)。
エルゴバリン生合成経路を示す図である。
eas遺伝子クラスター内の遺伝子を示す図である。
エンドファイト株内のエルゴバリン生合成のためのdmaW遺伝子の存在を示す図である(NEA17)。
エンドファイト株内のエルゴバリン生合成のためのdmaW遺伝子の存在を示す図である(NEA16)。
エンドファイト株内のエルゴバリン生合成のためのdmaW遺伝子の存在を示す図である(AR542)。
エンドファイト株内のエルゴバリン生合成のためのdmaW遺伝子の存在を示す図である(NEA20)。
エルゴバリン生合成のためのeas遺伝子クラスターの存在を示す図である。FaTG-2 NEA17(287819)。
エルゴバリン生合成のためのeas遺伝子クラスターの存在を示す図である。非エピクロエ外群NEA18(FEtc6-75)。
エルゴバリン生合成のためのeas遺伝子クラスターの存在を示す図である。FATG-3 NEA21(231557)。
エルゴバリン生合成のためのeas遺伝子クラスターの存在を示す図である。N.コエノフィアルムNEA16(FEtc7-342)。
ロリトレムB生合成経路を示す図である。
ロリトレムB生合成遺伝子クラスター内の遺伝子を示す図である。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター1(ltmG、ltmM、およびltmK)の存在を示す図である。FaTG-2 NEA17(287819)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター1(ltmG、ltmM、およびltmK)の存在を示す図である。非エピクロエ外群NEA18 (FEtc6-75)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター1(ltmG、ltmM、およびltmK)の存在を示す図である。FATG-3 NEA21(231557)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター1(ltmG、ltmM、およびltmK)の存在を示す図である。N.コエノフィアルムNEA16(FEtc7-342)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター2(ltmB、ltmQ、ltmP、ltmF、およびltmC)の存在を示す図である。FaTG-2 NEA17(287819)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター2(ltmB、ltmQ、ltmP、ltmF、およびltmC)の存在を示す図である。非エピクロエ外群NEA18(FEtc6-75)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター2(ltmB、ltmQ、ltmP、ltmF、およびltmC)の存在を示す図である。FATG-3 NEA21(231557)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター2(ltmB、ltmQ、ltmP、ltmF、およびltmC)の存在を示す図である。N.コエノフィアルムNEA16(FEtc7-342)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター3(ltmEおよびltmJ)の存在を示す図である。FaTG-2 NEA17(287819)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター3(ltmEおよびltmJ)の存在を示す図である。非エピクロエ外群NEA18(FEtc6-75)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター3(ltmEおよびltmJ)の存在を示す図である。FATG-3 NEA21(231557)。
エンドファイト株内のロリトレムB生合成遺伝子クラスター3(ltmEおよびltmJ)の存在を示す図である。N.コエノフィアルムNEA16(FEtc7-342)。
ロリン生合成経路を示す図である。
ロリン生合成遺伝子クラスターを示す図である。
エンドファイト株内のロリン生合成遺伝子クラスターの存在を示す図である。FaTG-2 NEA17(287819)。
エンドファイト株内のロリン生合成遺伝子クラスターの存在を示す図である。非エピクロエ外群NEA18(FEtc6-75)。
エンドファイト株内のロリン生合成遺伝子クラスターの存在を示す図である。FATG-3 NEA21(231557)。
エンドファイト株内のロリン生合成遺伝子クラスターの存在を示す図である。N.コエノフィアルムNEA16(FEtc7-342)。
エンドファイト株NEA23(269850)のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す図である。ロリン遺伝子クラスターの存在。
エンドファイト株NEA23(269850)のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す図である。ペラミン遺伝子の存在。
エンドファイト株NEA23(269850)のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す図である。ロリトレム遺伝子クラスター01の分析。
エンドファイト株NEA23(269850)のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す図である。ロリトレム遺伝子クラスター02および03の分析。
エンドファイト株NEA23(269850)のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す図である。エルゴバリン産生のためのdmaW遺伝子の分析。
エンドファイト株NEA23(269850)のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す図である。エルゴバリン産生のためのeas遺伝子クラスターの分析。
NEA23およびNEA21の遺伝子型分析を示す図である。
NEA16およびNEA20の遺伝子型分析を示す図である。
ペレニアルライグラスエンドファイトの所望の毒素プロファイルを示す図である。
標的ライグラス遺伝資源コレクションに由来するアクセション中のエンドファイト内容物の遺伝子型分析を示す図である。
標的ライグラス遺伝資源コレクションに由来するアクセション中のエンドファイト内容物の遺伝子型分析を示す図である。灰色円 - 候補;黒色円 -対照。
同質遺伝子宿主植物遺伝子型栽培品種の「ライクネス(likeness)」判定を示す図である。
同質遺伝子宿主植物遺伝子型栽培品種の「ライクネス」判定を示す図である。
宿主-エンドファイトアソシエーションのQCのための宿主-パネル分子遺伝子検査の展開を示す図である。
多様なライグラス宿主パネルの成長点培養物への候補エンドファイトの接種を示す図である。
選択されたエンドファイトを示す図である。
既知の既知およびこれらの前駆体の詳細な特徴付けを示す図である。
宿主-パネル同定試験を示す図である。
新規同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションの綿密な代謝プロファイリングを示す図である。
新規同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションの綿密な代謝プロファイリングを示す図である。
LEPJ:既知の既知を示す図である。
LEPJの正確な質量を示す図である。
LEPJの同定を示す図である。抽出イオンクロマトグラムを示すBro08_ST_1のアソシエーションの一複製のLCMS分析。(A)陽イオン抽出、(B)ペラミン、(C)エルゴバリン、(D)ロリトレムB、(E)ジャンチトレム、(F)陰イオン抽出。
LEPJの同定を示す図である。抽出イオンクロマトグラムを示すTolosa_NEA12のアソシエーションの一複製のLCMS分析。(A)陽イオン抽出、(B)ペラミン、(C)エルゴバリン、(D)ロリトレムB、(E)ジャンチトレム、(F)陰イオン抽出。
LEPJの定量化を示す図である。保持時間およびスペクトル(A)ペラミン;(B)エルゴバリン;(C)ロリトレムB;(D)ジャンチトレムによるアルカロイド含量のLCquant分析。
E+対E-宿主植物の半定量的アルカロイド(LEPJ)プロファイルの比較を示す図である。Yエラーバーは、標準誤差を表し;各カラムの上の文字は、同じエンドファイトを保有する異なる宿主間の有意な差異を示し;*は、異なるエンドファイトを保有する同じ宿主間の有意な差異を示し;**比の値は、Bronsyn STに対してである。
同質遺伝子宿主(Imp04)内の多様なエンドファイトの半定量的アルカロイドプロファイルの比較を示す図である。Yエラーバーは、標準誤差を表し;*は、異なるエンドファイトを保有する同じ宿主間の有意な差異を示す。
異なる同質遺伝子宿主にわたる選択されたエンドファイトのアルカロイド(LEPJ)プロファイルの安定性の評価を示す図である。Yエラーバーは、標準誤差を表し;各カラムの上の文字は、同じエンドファイトを保有する異なる宿主間の有意な差異を示す。*は、異なるエンドファイトを保有する同じ宿主間の有意な差異を示し; **比の値は、Impactに対してである。
ロリトレムB生合成を示す図である。
エルゴバリン生合成を示す図である。
ロリトレムB生合成経路の分析を示す図である。
パスパリニン-Aトレモルゲン(tremorgen)経路を示す図である。
経路分析:パスパリニン-Aトレモルゲンを示す図である。
共生体中のロリトレムおよびパスパリニンの存在を示す図である。
ペラミンがペラミン産生エンドファイトの非存在下で微量で植物体中に存在することを示す図である。
エンドファイトによって媒介される宿主表現型に対する変化を評価するのに使用される手順を示す図である。1 同質遺伝子宿主: Impact (Imp04); 5 宿主-エンドファイトアソシエーション:NEA10、NEA11、NEA12、ST、E-; 6クローンの複製。
共生体のパフォーマンスに対するエンドファイトの効果を示す図である。A.分げつ数中間灰色 - 0.5mMのNO3- 濃灰色 - 2.5mMのNO3-薄灰色- 10.0mMのNO3-
共生体のパフォーマンスに対するエンドファイトの効果を示す図である。B.シュートの新鮮質量中間灰色 - 0.5mMのNO3- 濃灰色 - 2.5mMのNO3- 薄灰色 - 10.0mMのNO3-
共生体のパフォーマンスに対するエンドファイトの効果を示す図である。C.根の新鮮質量中間灰色 - 0.5mMのNO3- 濃灰色 - 2.5mMのNO3- 薄灰色 - 10.0mMのNO3-
共生体のパフォーマンスに対するエンドファイトの効果を示す図である。D.根の乾燥質量中間灰色 - 0.5mMのNO3- 濃灰色 - 2.5mMのNO3- 薄灰色 - 10.0mMのNO3-
T1収穫の前の植物を示す図である。
分げつ数によって測定されるパフォーマンスを示す図である。
454配列決定プラットフォームを使用する配列分析を示す図である。
Illumina配列決定プラットフォームを使用する配列分析を示す図である。
配列決定されたペレニアルライグラスエンドファイトゲノムの要約を示す図である。全収率=84.8ギガベース(GAII:7.4Gb、HiSeq:77.4Gb);HiSeqに対する平均収率=1株当たり2.2Gb;GAIIに対する平均収率=1株当たり373Mb
配列決定されたペレニアルライグラスエンドファイトゲノムの要約を示す図である。リードの総数=436,920,622ペア;HiSeqに対するペアリードの平均数=1株当たり12,844,656;GAIIに対するペアリードの平均数=1株当たり1,863,852
Illuminaリード対454コンティグを示す図である。
Illuminaリード対454コンティグを示す図である。
Illuminaリード対454コンティグを示す図である。
Illuminaリード対454コンティグを示す図である。
Illuminaリード対454コンティグを示す図である。
454FLX対454Titanium対Illumina GAIIのカバー率の表示を示す図である。
454FLX対454Titanium対Illumina GAII対Hi Seqのカバー率の表示を示す図である。
ホモポリマー補正:グラフカルビューを示す図である。
ホモポリマー補正:ベースビューを示す図である。
パン-ゲノムSNPコーリング:グラフィカルビュー、リードレベルを示す図である。
類似性によって順序付けられた77の独立した配列決定実行を示す図である。
独立した配列決定実行が株特異的な欠失も表示することができることを示す図である。
独立した配列決定実行がSNPデータからアミノ酸変化予測することができることを示す図である。
コンティグ数がアセンブリー微調整ラウンドとともに減少することを示す図である。
N50がアセンブリー微調整のラウンドとともに増加することを示す図である。
アセンブリー微調整が足場、および単一の「足場を組んでいない」コンティグの数を減少させることを示す図である。
1コンティグ当たりの塩基の平均数がアセンブリー微調整とともに増加することを示す図である。
望ましい毒素プロファイルが示された、ロリトレムB、エルゴバリン、およびペラミンの構造を示す図である。
ネオティホディウムエンドファイトの抗真菌活性を評価するためのin vitroバイオアッセイを示す図である。
ネオティホディウムエンドファイトを含む、および含まないペレニアルライグラス植物の冠さび病(プッシニアコロナタ(Puccinia coronata)病菌ロリイ)に対する耐性を評価する脱離葉アッセイを示す図である。
ネオティホディウムエンドファイトを含む、および含まないペレニアルライグラス植物の乾燥寛容性および水利用効率のガラス温室およびフィールドトライアルスクリーニングを示す図である。
細胞分裂に関与するステップを示す図である。
エンドファイト細胞の染色体倍加の実験ワークフローを示す図である。
ネオティホディウムエンドファイト株中のDNA含量評価のフローサイトメトリー較正を示す図である。ピークは、相対的な核DNA含量を示す。
NEA12dhネオティホディウムエンドファイト株のフローサイトメトリー分析を示す図である。
対照エンドファイト株と比較したNEA12dhネオティホディウムエンドファイト株の8週間後の培養物中の増殖速度の分析を示す図である。
対照エンドファイト株と比較したNEA12dhネオティホディウムエンドファイト株の5週間後の培養物中の増殖速度の分析を示す図である。
NEA12dhネオティホディウムエンドファイト株の抗真菌バイオアッセイを示す図である。
NEA12dhネオティホディウムエンドファイト株の抗真菌バイオアッセイを示す図である。
コルヒチン処理ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム調査配列決定リード深度の分析を示す図である。
NEA12ゲノム調査配列アセンブリーにマッピングするゲノム調査配列決定リードの分析を示す図である。
X線突然変異誘発の実験ワークフローを示す図である。
ネオティホディウムエンドファイトのインドール-ジテルペン生合成経路を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のin vitro増殖を示す図である。
ネオティホディウムエンドファイトのltm遺伝子クラスターを示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列バリエーションの判定を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列内の一塩基多型(SNP)を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列内の小さい挿入/欠失(INDEL)を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列内の欠失を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列の遺伝子領域内のSNPの数を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列の遺伝子領域内のINDELの数を示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列内のゲノム配列変化(欠失)のスペクトルを示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株のゲノム配列内で観察されたゲノム配列変化の数に基づいたX線照射株の突然変異誘発指数を示す図である。
NEA12dhネオティホディウムエンドファイト株の代謝プロファイリングを示す図である。
X線照射ネオティホディウムエンドファイト株の代謝プロファイリングを示す図である。
栄養分が添加されていないCa-アルギネートマトリックスを用いた被覆を使用してペレニアルライグラス胚をCa-アルギネート被覆することによって生成される人工種子を示す図である。
着色されたCa-アルギネートマトリックスを用いた被覆を使用してペレニアルライグラス胚をCa-アルギネート被覆して人工種子にすることを示す図である。Queen Green(90610)で着色されたペレニアルライグラスの人工種子;a)空気乾燥された人工種子;b)発芽培地上に蒔かれた人工種子。Queen Pink(92330)で着色されたペレニアルライグラスの人工種子;c)空気乾燥された人工種子;d)発芽培地上に蒔かれた人工種子。
複数のCa-アルギネートマトリックス層を用いた被覆を使用してペレニアルライグラス胚をCa-アルギネート被覆して人工種子にすることを示す図である。a)栄養分が添加された第1の被覆(非着色)Ca-アルギネート層(層A)で被覆されたペレニアルライグラスの人工種子。b)栄養分が添加された2つの(第1の層A;非着色と第2の層B;Queen Greenで着色された)Ca-アルギネート層で被覆されたペレニアルライグラスの人工種子;c)発芽培地上に置かれた二重被覆された人工種子。
複数のCa-アルギネートマトリックス層を用いた被覆を使用してペレニアルライグラス胚をCa-アルギネート被覆して人工種子にすることを示す図である。a)〜c)第1の被覆(非着色)Ca-アルギネート層(層A)およびQueen-PinkまたはQueen-Greenで着色されたCa-アルギネート層(層B)を含む第2の被覆で被覆されたペレニアルライグラスの人工種子の断面。d)〜e)第1の被覆(非着色)Ca-アルギネート層(層A)およびQueen-Greenで着色されたCa-アルギネート層(層B)を含む第2の被覆で被覆されたペレニアルライグラスの人工種子の断面。
ペレニアルライグラス栽培品種Bronsyn E-(エンドファイトフリー、2668種子のバッチ)の種子、胚、および人工種子の発芽を示す図である。a)元の種子:濾紙で1%の発芽頻度;b)表面滅菌種子:濾紙で10%の発芽頻度;c)単離胚:発芽培地で48%の発芽頻度;d)人工種子(発芽培地を用いた):MS培地で40%の発芽頻度。
ペレニアルライグラス栽培品種Bronsyn E+(エンドファイトプラス、2667種子のバッチ)の種子、胚、および人工種子の発芽を示す図である。a)元の種子:濾紙で10%の発芽頻度;b)表面滅菌種子:濾紙で30%の発芽頻度;c)単離胚:発芽培地で90%の発芽頻度;d)人工種子(発芽培地を用いた):MS培地で81%の発芽頻度。
ペレニアルライグラスにおける人工種子の発芽および人工種子由来実生の発生を示す図である。
a)96ウェルのウェル中に個々に配置し、c)Ca-アルギネート層で被覆した人工種子を産生する前に、b)個々のウェルにエンドファイト菌糸体懸濁液を添加し、層流下で部分的に空気乾燥させたペレニアルライグラスの新鮮単離種子由来胚を示す図である。
方法1によって産生される人工種子を示す図である。
方法1によって産生される発芽人工種子を示す図である。
方法2によって産生される人工種子を示す図である。
エンドファイトアウトグロースとともに方法2によって産生される人工種子を示す図である。
方法3によって産生される人工種子を示す図である。
エンドファイトアウトグロースとともに方法3によって産生される人工種子を示す図である。
方法3によって産生される発芽人工種子を示す図である。
加速エージングの概略を示す図である。
種子を加速エージング処理し、その後種子を貯蔵した後の、異なるエンドファイトを有するペレニアルライグラス栽培品種Bronsynの種子発芽率を示す図である。
種子を加速エージング処理し、その後種子を貯蔵した後の、異なるエンドファイトを有するペレニアルライグラス栽培品種Bronsyn由来の種子中のエンドファイト生存能を示す図である。
種子を加速エージング処理した後の、異なる宿主遺伝的バックグラウンド中の異なるエンドファイトを代表する共生体の種子発芽率を示す図である。
種子を加速エージング処理した後の、異なる宿主遺伝的バックグラウンド中の異なるエンドファイトのエンドファイト生存能を示す図である。Alto、Trojan、およびBealeyのグラフのそれぞれにおいて、バーは、エンドファイトNEA10、NEA11、NEA12、およびE1を左から右へのその順序で表す。Bronsynのグラフのそれぞれにおいて、バーは、エンドファイトAR1、NEA10、NEA11、NEA12、E1、およびSTを左から右へのその順序で表す。
種子を加速エージング処理した後の、異なる宿主遺伝的バックグラウンド中の異なるエンドファイトのエンドファイト生存能を示す図である。
TaqManアッセイのために設計したプライマーを示す図である。
エンドファイト特異的遺伝子LtmJのTaqManプライマー機能性を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子7490のTaqManプライマー機能性を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子8263のTaqManプライマー機能性を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子0005のTaqManプライマー機能性を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子2232のTaqManプライマー機能性を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
TaqManアッセイ対照 -鋳型無しを示す図である。
TaqManアッセイ対照 - 植物GAPDHを示す図である。RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子7490の同時抽出DNA/RNAプール試料における検出を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子0005の同時抽出DNA/RNAプール試料における検出を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
同時抽出DNA/RNAプール試料における検出のための対照(鋳型無し)を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子2232の個々の10日齢の上胚軸からの同時抽出DNA/RNA試料における検出を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子7490の個々の10日齢の上胚軸からの同時抽出DNA/RNA試料における検出を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子0005の個々の10日齢の上胚軸からの同時抽出DNA/RNA試料における検出を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
個々の10日齢の上胚軸からの同時抽出DNA/RNA試料における検出のための対照(鋳型)を示す図である;RNAおよびDNAはラベルが付けられている。
エンドファイト特異的遺伝子2232の3、5、および7日齢のプールした上胚軸からの同時抽出DNA/RNAにおける検出を示す図である。円=日齢7 E+ プール;正方形=日齢5 E+ プール;三角形=日齢3 E+ プール;菱形=日齢7 E- プール。
エンドファイト特異的遺伝子7490の3、5、および7日齢のプールした上胚軸からの同時抽出DNA/RNAにおける検出を示す図である。円=日齢7 E+ プール;正方形=日齢5 E+ プール;三角形=日齢3 E+ プール;菱形=日齢7 E- プール。
エンドファイト特異的遺伝子0005の3、5、および7日齢のプールした上胚軸からの同時抽出DNA/RNAにおける検出を示す図である。円=日齢7 E+ プール;正方形=日齢5 E+ プール;三角形=日齢3 E+ プール;菱形=日齢7 E- プール。
非経験的に育種および選択を可能にするための共生体の集団の代謝プロファイリングを示す図である。
上位20のペラミン産生植物を示す。
非経験的に育種および選択を可能にするための共生体の集団の分子表現型判定を示す図である。
グルコースからのグルコース-6-リン酸の産生を示す図である。
共生体の集団中の水溶性炭水化物の存在を示す図である。
タンパク質の定量化を示す図である。
遺伝資源間の遺伝子の多様性および関連性を示す図である。
遺伝資源間の遺伝子の多様性および関連性を示す図である。
配列決定による遺伝子型判定を示す図である。
配列決定によって遺伝子型判定するための手順を示す図である。
現在の市販のライグラス育種プログラムの一般的なスキームを示す図である。
ゲノム選択試験のための遺伝子型判定および表現型判定される個体の数の要件と、特定の形質の遺伝率の値との間の関係の略図を示す図である。
ライグラス育種プログラムにおけるゲノム選択実施のスキームを示す図である。
ペレニアルライグラス[ホソムギ(Lolium perenne)]中のマイクロバイオームの特徴付けを示す図である。縦軸は、データベース1中の非植物データベース配列にマッピングした後の完全栄養条件下で成長させたペレニアルライグラス-マイクロバイオーム共生体のcDNAライブラリーからマッピングされた配列の%を示す。横軸は、分析した試料を示す:L=葉;R=根;FR=エンドファイト無し;ST=標準的毒性エンドファイト。
ペレニアルライグラス(ホソムギ)中のマイクロバイオームの16S分析を示す図である。図は、ホソムギマイクロバイオーム内で代表される微生物の分類学分布を示す。
ペレニアルライグラス(ホソムギ)中の葉および根のマイクロバイオームを示す図である。グラフは、それぞれ葉および根からの配列リード数の細菌クラスによる合計をプロットする。
ペレニアルライグラス(ホソムギ)中の葉および根のマイクロバイオームを示す図である。図は、試料セット階層的クラスタリングによって作成したサンプツリーを示す。
ペレニアルライグラス(ホソムギ)中の葉および根のマイクロバイオームを示す図である。図は、10超の遺伝子を含有する11クラスターの2つを示す:クラスター5 - 低NH4で誘導された。
ペレニアルライグラス(ホソムギ)中の葉および根のマイクロバイオームを示す図である。図は、10超の遺伝子を含有する11クラスターの2つを示す:クラスター3 - 低Nで抑制された。
ペレニアルライグラス(ホソムギ)中の葉および根のマイクロバイオームを示す図である。図は、アゾスピリルム(Azospirillum)種としてアノテートされる配列にマッピングするリードを示す。
ナンキョクコメススキ(Antarctic hairgrass)[ナンキョクコメススキ(Deschampsia antarctica)]における葉および根のマクロバイオームを示す図である。図は、ナンキョクコメススキの葉および根のマイクロバイオームにおいて代表される微生物の分類学的分布を示す。
ナンキョクコメススキ(Antarctic hairgrass)[ナンキョクコメススキ(Deschampsia antarctica)]における葉および根のマクロバイオームを示す図である。図は、シュートおよび根中の細菌種優位性の差異を表示するヒートマップを示す。
ナンキョクコメススキ(Antarctic hairgrass)[ナンキョクコメススキ(Deschampsia antarctica)]における根のマクロバイオームを示す図である。図は、根試料中の異なる栄養状態応答した細菌種の優位性の差異を表示するヒートマップの拡大領域を示す。
ナンキョクコメススキ(Antarctic hairgrass)[ナンキョクコメススキ(Deschampsia antarctica)]における葉のマクロバイオームを示す図である。図は、葉試料中の異なる栄養状態に応答した細菌種の優位性の差異を表示するヒートマップの拡大領域を示す。
ナンキョクコメススキ(Antarctic hairgrass)[ナンキョクコメススキ(Deschampsia antarctica)]における葉および根のマクロバイオームを示す図である。図は、一緒クラスター化されたアゾスピリルム種を表示するヒートマップの拡大領域を示す。
異なる希釈率のエンドファイト懸濁液を示す図である。
自己の第1胃マイクロバイオームプロファイルに対する宿主(15頭の乳牛)中の624930多型の効果を評価するためのゲノムワイド関連研究を示す図である。5つのコンティグの結果が示されている。灰色は、奇数番号の染色体を示し、黒色は偶数番号の染色体を示す。

0197

次に本発明を以下の非限定例を参照して説明する。

0198

飼料草育種における新しいパラダイム
古いパラダイム:
草の育種および選択後に単一のエンドファイト接種および共生体評価のみが続き、単一の選択されていないエンドファイトを展開させる合成草品種に至る。

0199

新しいパラダイム:
草-エンドファイト共生体の非経験的育種および選択後に共生体評価が続き、複数のエンドファイトを展開させる合成共生体品種に至る。

0200

ロリウム/ウシノケグサおよびブラキアリア/ウロクロアにおける適用のため。

0201

草-エンドファイト共生体の次世代の非経験的分子育種。

0202

0203

新しい原理および手法
共生体、すなわち、草宿主およびエンドファイトの両パートナーに合成品種の概念を拡張する
最適な共生体の適合性およびパフォーマンスについて選択された集団内に複数のエンドファイトおよび草遺伝子型を展開させる

0204

非経験的に植物遺伝子型Xエンドファイト遺伝子型効果を捕捉する

0205

草宿主を育種および選択した後、エンドファイト接種および共生体評価のみが続くのではなく、最適な共生体の適合性およびパフォーマンスについて非経験的に共生体を育種及び選択する

0206

共生体パフォーマンスに対するより広いエンドファイト遺伝子型効果を捕捉し、活用する

0207

害虫耐性(および低減した動物中毒)よりはるかに優れた共生体パフォーマンスに対する著しいエンドファイト遺伝子型効果を活用する

0208

全体的な新規エンドファイト遺伝的多様性を捕捉および活用する[工程1]

0209

品種開発プロセスにおける後期に単一ブランドのエンドファイトではなく、非経験的に複数の新規エンドファイトを展開させ、したがって広い範囲のエンドファイト遺伝子型多様性[すなわち、「エンドファイト遺伝資源コレクション」]を活用する

0210

新規エンドファイト遺伝的多様性を生成および活用する[工程2]

0211

新規遺伝的変異[すなわち、ランダム突然変異誘発(例えば、イオン化放射線);2倍数化/多倍数化(例えば、コルヒチン処理);標的突然変異生成(例えば、ExZact-DeleteおよびExZact-Edit);シスジェネシス;トランスジェネシス;イントラジェネシス;草-エンドファイト共生体を大規模に定着させるのにエンドファイト形質移入を増強するための新規エンドファイトにおける統合的ゲノム編集(例えば、ExZact-Add)]を生成する[すなわち、「デザイナーエンドファイトの育種」]

0212

非経験的に共生体を育種するために共生体集団内で広い遺伝子型の草およびエンドファイトの多様性を捕捉する[工程3]

0213

共生体を非経験的に育種および選択するために、数百〜数千の草遺伝子型内に数十〜数百のエンドファイト遺伝子型を伴う大規模共生体集団を確立する

0214

異なるエンドファイトを直接接種され、その後アルギネート層で被覆された、またはエンドファイト含有アルギネート層で被覆された単離された草胚から生成される人工種子[すなわち、「共生体人工種子」]に基づく大規模エンドファイト接種のための方法を活用する

0215

ブラキアリア/ウロクロア草遺伝子型について、(特に、アポミクシスの)草宿主遺伝子型において、単一のエンドファイトを接種し、また複数のエンドファイトを同時接種する
非経験的に共生体の育種および選択を行う[工程4〜8]

0216

選択ツールとしての共生体人工種子および/またはこれらの子孫に加速エージングを適用することによって適合性および安定性について、数百〜数千の草遺伝子型内に数十〜数百のエンドファイト遺伝子型を伴う大規模共生体集団を選択する[工程4]

0217

迅速なエンドファイト生存能アッセイを適用することによって生存能について工程4からの共生体集団を選択する[工程5]

0218

共生体パフォーマンスおよびアルカロイド産生について工程5からの共生体集団を包括的な複数年の表現型判定に付す[工程6]

0219

合成共生体実験品種を生成するための多交雑のために工程6からのSyn0共生体を選択し[工程7]、その後エンドファイト発生率および同一性を判定する[工程8]

0220

次世代の非経験的草-エンドファイト共生体の分子育種- エンドファイトワークフロー
エンドファイト遺伝資源
工程1:新規エンドファイトの全体的な多様性の発見
工程2:新規エンドファイト多様性の新規生成

0221

共生体の確立
工程3:草-エンドファイト共生体の大規模生成

0222

安定性、所望のアルカロイドプロファイル、およびパフォーマンスについての共生体の選択
工程4:共生体安定性のための選択ツール
工程5:迅速なエンドファイト生存能アッセイ
工程6:共生体の複数年の表現型判定(分子を含む)
工程7:包括的な評価用の実験合成品種を生成するための多交雑のためのSyn0共生体親の選択
工程8:エンドファイトIDアッセイ

0223

Syn0共生体親の多交雑
工程9:公知のエンドファイト素性および発生率の選択された共生体親(Syn0)の多交雑ならびにSyn1種子の回収

0224

共生体の安定性、アルカロイドプロファイル、ならびにエンドファイトの素性および発生率の確認
工程10:共生体安定性のための選択ツール
工程11:迅速なエンドファイト生存能アッセイ
工程12:共生体の分子表現型判定*
工程13:エンドファイトIDアッセイ*

0225

Syn1共生体の評価
工程14:農業パフォーマンスについての共生体(Syn1)実験合成品種の評価
*Syn1生成時のプールした試料に対するアルカロイドプロファイルならびにエンドファイトの素性および発生率の評価

0226

Syn1共生体植物の多交雑
工程15:公知のエンドファイト素性および発生率の共生体(Syn1)の多交雑の進行ならびにSyn2種子の回収
工程16:共生体安定性の選択ツール
工程17:迅速なエンドファイト生存能アッセイ
工程18:共生体の分子表現型判定*
工程19:エンドファイトIDアッセイ*

0227

Syn2共生体の評価
工程20:農業パフォーマンスおよび動物パフォーマンスについての共生体(Syn2)実験合成品種の評価
*Syn2生成時のプールした試料に対するアルカロイドプロファイルならびにエンドファイトの素性および発生率の評価

0228

トールフェスクエンドファイトの発見
トールフェスク(ヒロハノウシノケグサ)中のエンドファイトの発見および特徴付けについての本研究の目的は、
1.遺伝資源内の評価のための新規トールフェスクエンドファイトの同定および特徴付け、
2.新規エンドファイトと優良遺伝資源との間の最適化されたアソシエーションの開発および評価
であった。

0229

エンドファイト発見は、エンドファイト陽性植物を同定するための568のアクセションのスクリーニング、その後のトールフェスク中の新規エンドファイトを同定するための210のエンドファイトの遺伝子型判定に基づいた。

0230

トールフェスクに由来する新規エンドファイトの植物体の特徴付けは、以下の工程に基づいた:
・ トールフェスク栽培品種の成長点培養を同質遺伝子宿主パネルについて確立した
・内因性代謝プロファイルを48試料について判定した
・ 38エンドファイトの単離を行った
・ 同質遺伝子宿主パネルへの15〜20エンドファイトの接種を行った
・ 同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションを特徴付けた

0231

標的化ウシノケグサ遺伝資源コレクションに由来するアクセション中のエンドファイト内容物の遺伝子型分析
最初に、30カ国からの472アクセションをエンドファイト発生率について試験し、1アクセション当たり各バルク中6〜10の種子の2つの複製物を分析で使用し、エンドファイト発生率を6種のSSRで評価した。

0232

過小評価地理起源(under-represented geographic origin)からの新しいアクセションを分析に含め、40カ国からの合計568アクセションをエンドファイト発生率について試験した。

0233

0234

標的化ウシノケグサ遺伝資源コレクションに由来するアクション中のエンドファイト内容物の遺伝子型分析を、Table 1(表2)に示す。233のエンドファイト陽性アクセション(41%)が検出された。地理的起源は、エンドファイト発生率評価において表されている。

0235

トールフェスクエンドファイトの遺伝的多様性解析を図2に示す。210アクセションの選択されたセットを、トールフェスクエンドファイトの遺伝的多様性を評価するのに使用した。遺伝的多様性は、38種のSSRマーカーで評価した。6つの異なる分類群が検出された。大部分は、N.コエノフィアルムであった。20は、FaTG-2であった。6つは、推定上のFaTG-3であった。13は、FaTG-3様であった。

0236

宿主およびエンドファイトの多様性を図3に示す。

0237

代謝プロファイリング、エンドファイト単離、および同質遺伝子接種のためのウシノケグサ-エンドファイトの組合せの選択を図4に示す。52アクセションを、代謝プロファイリングおよびエンドファイト単離のために最初に選択した。エンドファイトの存在は、25アクセション中に一貫して検出された(赤色)。過小評価クラスターに由来する追加の48アクセションをガラス温室内で定着させ、エンドファイトの存在についてスクリーニングした。20アクセションがエンドファイト陽性であり(青色)、さらなる分析のために選択した。

0238

代謝プロファイリング、エンドファイト単離、および同質遺伝子接種のためのウシノケグサ-エンドファイトの組合せの選択を図5に示す。初期の選択を赤色で示す。追加の選択を青色で示す。

0239

トールフェスクエンドファイトの所望の毒素プロファイルを図6に示す。

0240

代謝プロファイリング
内因性宿主バックグラウンド内でアルカロイド産生を検出するためにトールフェスク-エンドファイトアソシエーションを半定量的代謝プロファイル分析するのに使用される実験設計を以下に記載する。

0241

代謝産物の半定量分析の実験設計

0242

0243

エルゴバリンおよびペラミンを検出するための代謝プロファイル分析を図7に示す。

0244

代謝産物を半定量分析するために選択したエンドファイトを図8に示す。

0245

異なるウシノケグサエンドファイトのアルカロイド産生を検出するための代謝プロファイル分析
内因性宿主バックグラウンド内の、ロリン、ロリンホルメート、ペラミン、エルゴバリン、およびロリトレムBを含めたアルカロイド産生を検出するためのトールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝分析を図9に示す。異なるエンドファイト種に属する一連のエンドファイト株についての内因性宿主バックグラウンド内のトールフェスク-エンドファイトアソシエーションのアルカロイドプロファイル(すなわち、ロリン、ペラミン、エルゴバリン、およびロリトレムB)をTable 2(表4)に示す。

0246

0247

ウシノケグサエンドファイトのさらなる代謝分析を図10に示す。

0248

温度/水分ストレス下の代謝プロファイルの半定量分析
内因性宿主バックグラウンド内のエンドファイトによって付与されるアルカロイド産生を検出するための標準条件下で成長させたトールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝分析に加えて(図7〜図10)、高温および水分ストレス条件下で成長させたトールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイルの半定量分析を行った。対応するトールフェスク-エンドファイトアソシエーションを、16時間の明期および30℃;18時間の暗期および20℃の下で成長させ、次いで、以下に記載するように、アルカロイドプロファイル分析のためにサンプリングした:
・収穫(対照) →凍結乾燥材料50mg → 80%のメタノール抽出 →LCMS分析
回復および水分ストレス
・ 第2の収穫(ストレス) → 凍結乾燥 →SSRにより植物材料のすべてを再び確認。

0249

これは、必要に応じて軽く散水しながら条件をシミュレートするコントロールされた(成長チャンバー)環境内で実施した。1アクセション当たり9コピーを一般的なポッティングミックス内に植えた。サブサンプリングとともに無作為化完全ブロックを使用した。

0250

図11は、高温および水分ストレス条件下で成長させたトールフェスク-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイルの半定量分析を示す。

0251

新規エンドファイトを有するトールフェスク内の植物体での同質遺伝子的接種
要約:
Table 3(表5)に記載したように、合計36種のウシノケグサエンドファイトを異なる地理的起源に由来する一連のウシノケグサアクセションから単離し、以下の異なる分類群に属することが判明した:これらのうちの19種は、N.コエノフィアルムであり、これらのうちの5種は、FaTG-2であり、これらのうちの3種は、外群であり、これらのうちの3種は、FaTG-3であり、これらのうちの3種は、FaTG-3様であり、これらのうちの3種はN.ウンシナツムである。

0252

0253

ウシノケグサエンドファイトの植物体での接種のための多様なウシノケグサ宿主パネルの成長点培養の確立
Table 4(表6)は、ウシノケグサエンドファイトの植物体での接種のための多様な宿主パネルに含まれる代表的な植物遺伝型を同定するのに使用した選択されたトールフェスクおよびペレニアルライグラス栽培品種を示す。すべての選択された植物遺伝子型は、80%超の高い再生頻度を有する。

0254

0255

多様な宿主パネル中への植物体での同質遺伝子接種のために選択されるエンドファイト含有ウシノケグサアクセションから単離された真菌エンドファイトを図12に示す。図13は、単離されたエンドファイト培養物の、これらの素性を確認するための植物体での同質遺伝子接種の前のSSRベース遺伝子型判定を示す。

0256

異なるウシノケグサエンドファイト株の異なるSSRマーカーの対立遺伝子数およびサイズを示すSSR遺伝子型判定からの結果をTable 5(表7)に示す。

0257

0258

エンドファイト含有ウシノケグサアクセションに由来する選択された単離真菌エンドファイトの多様な宿主パネル中への植物体での同質遺伝子接種からの結果をTable 6(表8)に示す。試験した接種の数、順調な接種の数、および順調な接種の%についてのデータを、トールフェスクおよびペレニアルライグラス宿主内へのトールフェスクエンドファイトの接種能力を例示するためにTable 6(表8)に提供する。

0259

0260

トールフェスクおよびペレニアルライグラス宿主遺伝子型におけるエンドファイト栄養安定性
ウシノケグサアクセションに由来する一連の選択された単離エンドファイトを植物体に同質遺伝子接種した後、異なるトールフェスクおよび多年生の宿主遺伝子型(すなわち、BRO08、BARI27、DOV24)中のこれらのエンドファイトのエンドファイト栄養安定性を評価し、
・ いくつかのトールフェスクエンドファイト(例えば、NEA17、NEA18、NEA19)は、ペレニアルライグラス(BRO08)において安定であった
・ BARI27はmNEA15を除くすべてのエンドファイトと安定なアソシエーションを形成した
・ NEA15は、試験した宿主遺伝子型のいずれとも安定なアソシエーションを形成することに失敗した
・ DOV24は、少数の安定なアソシエーションを形成した
ことを示した。

0261

多様な宿主パネルに由来する異なるトールフェスクおよびペレニアルライグラス遺伝子型における接種された新規トールフェスクエンドファイトのこれらのアソシエーションの安定性を、接種して12カ月後に評価した。対応する結果をTable 7(表9)に示す。

0262

0263

図14は、多様な宿主パネルに由来するトールフェスクおよびペレニアルライグラス宿主遺伝子型における選択されたエンドファイトの接種後12カ月での安定性を示す。

0264

植物体での同質遺伝子接種のために選択された新規ウシノケグサエンドファイトの範囲を図15に示す。

0265

表8は、以下の選択基準:
1.ほとんどまたはまったくエルゴバリンを産生しない、
2.ロリトレムBをまったく産生しない
3.ロリンおよび/またはペラミンを産生する
に基づいて多様な宿主パネルに由来するトールフェスク遺伝子型(すなわち、BARI27、JESS01、およびQUAN17)における植物体での同質遺伝子接種のために選択された追加の新規トールフェスクエンドファイト(例えば、NEA20、NEA21、NEA22など)を示す。

0266

0267

多様な宿主パネルに由来するトールフェスク遺伝子型における新規トールフェスクエンドファイトの植物体での同質遺伝子接種後に定着したエンドファイト-トールフェスクアソシエーションの代謝プロファイリング
多様な宿主パネルに由来するトールフェスク遺伝子型における新規トールフェスクエンドファイトの植物体での同質遺伝子接種後に定着したエンドファイト-トールフェスクアソシエーションの代謝プロファイリングを図16、図18、および図19に示す。これらの図は、
・ 異なる同質遺伝子宿主にわたって選択されたエンドファイトの半定量的アルカロイドプロファイルを比較し、
・ 同質遺伝子宿主中の多様なエンドファイトの半定量的アルカロイドプロファイルを比較し、
・ペレニアルライグラス遺伝子型Bro08中のトールフェスクおよびペレニアルライグラスエンドファイトの半定量的アルカロイドプロファイルを比較する。

0268

図17は、多様な宿主パネルに由来するトールフェスク遺伝子型における新規トールフェスクエンドファイトの植物体での同質遺伝子接種後に定着したエンドファイト-トールフェスクアソシエーション中のペラミンおよびエルゴバリンの存在を示す。

0269

Table 9(表11)は、多様な宿主パネルに由来するトールフェスク遺伝子型における新規トールフェスクエンドファイトの植物体での同質遺伝子接種後に定着したエンドファイト-トールフェスクアソシエーションの代謝プロファイリングを示す。確認されたエンドファイト陽性(E+)植物を5つの複製物に分割し、一様に剪定して分げつを促進した。4カ月後、E+植物を12の複製物で植え替えした。1カ月後、9未満の陽性コピーがその時利用可能であった場合、E+植物を植え替えした。エンドファイト状態を、各植え替え後にSSRマーカーを使用して試験した。

0270

0271

多様な宿主パネルに由来するトールフェスク遺伝子型における新規トールフェスクエンドファイトの植物体での同質遺伝子接種後に定着した一連のエンドファイト-トールフェスクアソシエーションを代謝プロファイリングのために選択した[Table 9(表11)]。合計で29の同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションを、以下に記載の実験設計に従ってLCMS分析に付した。

0272

実験設計
・ 植物を剪定し、植え替えする
・ 16時間の明期、30℃;18時間の暗期、20℃
・収穫(対照) →凍結乾燥→偽茎材料50mg → 80%のメタノール抽出 →LCMS分析
・回復および水分ストレス
・ 第2の収穫(ストレスをかけた) → 凍結乾燥 → 偽茎材料50mg → 80%のメタノール抽出 → LCMS分析

0273

これは、必要に応じて軽く散水しながら夏条件をシミュレートするコントロールされた(成長チャンバー)環境内で実施した。1アクセション当たり9コピーを一般的なポッティングミックス内に植えた。サブサンプリングとともに無作為化完全ブロックを使用した。

0274

ウシノケグサエンドファイトのバイオ保護的性質
一連の真菌疾患を引き起こし、一連の様々な植物宿主に感染する3種の真菌病原体(すなわち、コレトトリクム・グラミニコラ、ドレクスレラ・ブリザエ、およびリゾクトニア・セレアリス)を、単離されたウシノケグサエンドファイトの潜在的な抗真菌活性を分析するのに使用した抗真菌バイオアッセイに含めた。図20は、単離されたウシノケグサエンドファイトの抗真菌バイオアッセイからの結果を示す。抗真菌バイオアッセイの結果をTable 10(表12)にも示す。一連のエンドファイトは、高度(H)および中程度の(M)抗真菌活性を有することが判明した[Table 10(表12)]。

0275

0276

新規トールフェスクエンドファイトのゲノム調査配列決定
一連の新規トールフェスクエンドファイトをゲノム調査配列決定(GSS)に付した。

0277

図21は、選択された新規ウシノケグサエンドファイトのGSSのストラテジーを示す。GSS分析に付した新規ウシノケグサエンドファイトのアルカロイドプロファイルをTable 11(表13)に示す。

0278

0279

図22は、ペラミン生合成経路を示す。PerAは、すべての生合成ステップを触媒する単一多機能酵素をコードする。GenBank受託番号: AB205145。非エピクロエ外群エンドファイト中のperA遺伝子の存在を図23に示す。

0280

図24は、エルゴバリン生合成経路を示す。エルゴバリン生合成に関与するeas遺伝子クラスター内の遺伝子を図25およびTable 12(表14)に示す。dmaW遺伝子は、エルゴバリン生合成における第1の関与段階を触媒するDMATシンターゼ酵素をコードする。新規ウシノケグサエンドファイト中のdmaW遺伝子の存在を図26に示し、新規ウシノケグサエンドファイト中のeas遺伝子クラスターの存在を図27に示す。

0281

0282

図28は、ロリトレムB生合成経路を示す。ロリトレムB生合成に関与する遺伝子クラスター内の遺伝子を図29およびTable 13(表15)に示す。エンドファイト中の遺伝子クラスター1(ltmG、ltmM、およびltmK)の存在を図30に示し、遺伝子クラスター2(ltmB、ltmQ、ltmP、ltmF、およびltmC)の存在を図31に示し。遺伝子クラスター3(ltmEおよびltmJ)の存在を図32に示す。

0283

0284

図33は、ロリン生合成経路を示す。ロリン生合成に関与する遺伝子クラスター内の遺伝子を図34およびTable 14(表16)に示す。新規ウシノケグサエンドファイト中のロリン生合成遺伝子クラスターの存在を図35に示す。

0285

0286

図36は、エンドファイト株NEA23のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す。Table 15(表17)およびTable 16(表18)は、様々なエンドファイト株のアルカロイド生合成遺伝子分析を示す。Table 15(表17)は、異なるアルカロイド生合成遺伝子/遺伝子クラスターに対応するゲノム調査配列リードをマッピングすることによる、異なるエンドファイトのアルカロイド生合成遺伝子の存在/非存在の評価からの結果を示す。

0287

0288

0289

Table 16(表18)は、対応するトールフェスク-エンドファイトアソシエーションについて観察された異なるアルカロイド生合成遺伝子/遺伝子クラスターおよび対応するアルカロイドプロファイルに対応するゲノム調査配列リードをマッピングすることによる異なるエンドファイトのアルカロイド生合成遺伝子の存在/非存在の評価からの結果を示す。

0290

0291

Table 17(表19)は、好都合な毒素プロファイルを有する新規ウシノケグサエンドファイト(NEA16、NEA18、NEA19、NEA20、NEA21、およびNEA23)を示す。

0292

0293

新規ウシノケグサエンドファイトNEA23およびNEA21の遺伝子型分析を図37に示す。

0294

ペレニアルライグラスエンドファイトの発見および特徴付け
目的は、
1.遺伝資源において評価するための新規ペレニアルライグラスエンドファイトの同定および特徴付け
2.新規エンドファイトと優良遺伝資源との間の最適化されたアソシエーションの開発および評価
であった。

0295

実験ストラテジー
1.独自の遺伝資源において評価するための新規ペレニアルライグラスエンドファイトの同定および特徴付け
活動:新規エンドファイト株の独自の「ライブラリー」の確立
・ 遺伝資源コレクションの標的化
・ 遺伝資源試料の遺伝子型分析
・ 遺伝資源試料のメタボロミクス分析
真菌培養物の単離および接種
・ 接種された植物のメタボロミクス分析
・ エンドファイト安定性の評価
2.新規エンドファイトと優良遺伝資源との間の最適化されたアソシエーションの開発および評価
活動:遺伝資源改善プロセスへの新規エンドファイトの送達
・ 選択されたエンドファイトの大規模接種
・ 選択された宿主-エンドファイトアソシエーションの遺伝子分析
・ 選択された宿主-エンドファイトアソシエーションの表現型分析

0296

ペレニアルライグラスエンドファイトの所望の毒素プロファイルを図6に示す。

0297

エンドファイト安定性の成果の要件は、以下の通りである:
世代間の安定性
・ 1世代当たり最大5%未満の損失
・理想的には1世代当たり2〜3%の損失
種子の貯蔵安定性
・種子中で3年

0298

エンドファイト発見のためのライグラス遺伝資源コレクションの確立- 244アクセションの同定および確立
図40は、標的化ライグラス遺伝資源コレクションからのアクセション中のエンドファイト内容物の遺伝子型分析を示す。

0299

図41は、標的化ライグラス遺伝資源コレクションからのアクセション中のエンドファイト内容物の分析を示す。遺伝的にユニーク;遺伝子型予測に基づく要求される制限内の毒素産生

0300

選択されたライグラス-エンドファイトアソシエーションからの真菌培養物の単離
・確立された候補エンドファイトおよび確認された遺伝子型のin vitro培養
・定着したエンドファイト培養物の長期間凍結保存

0301

0302

ペレニアルライグラスエンドファイトの同質遺伝子接種

0303

0304

図42は、同質遺伝子宿主植物遺伝子型栽培品種の「ライクネス」判定を示す。
・ BronsynおよびTolosa(96個体)を、58種のペレニアルライグラスSSRマーカーを使用して遺伝的多様性について評価した。
・ BronsynおよびTolosa栽培品種は、容易に区別された。

0305

図43は、同質遺伝子宿主植物遺伝子型栽培品種の「ライクネス」判定を示す。

0306

96のImpact、Bealey、およびBarsandra遺伝子型を、56種のペレニアルライグラス由来SSRマーカーを使用して遺伝的多様性について評価した。

0307

図44は、宿主-エンドファイトアソシエーションのQCについての宿主-パネル分子遺伝子検査の展開を示す。
・ 5種のペレニアルライグラスSSRマーカーのパネルを同定して異なる宿主-パネル遺伝子型を区別した
・同質遺伝子宿主植物およびエンドファイトの完全なQC能力

0308

図45は、多様なライグラス宿主パネルの成長点培養物への候補エンドファイトの接種を示す。

0309

成熟した同質遺伝子ライグラス-エンドファイトアソシエーションの再生
定量的スコアを使用してエンドファイト接種頻度を評価する
・ 3種の診断SSRマーカーを使用してエンドファイトの存在および素性を判定し、試料に0〜3のスケールスコアを付ける
・ 定量的スコアは、種子の純度試験ならびにエンドファイトの存在および素性試験にも使用する

0310

0311

・ すべてのエンドファイト-宿主組合せにわたって15%の平均接種頻度

0312

接種成功率

0313

0314

0315

0316

図46は、選択されたエンドファイトを示す。

0317

優先ライグラス宿主パネル遺伝子型におけるエンドファイト栄養安定性
・ 植物を、最初に接種して6〜12か月後(トップライン)に再サンプリングし、最初に接種して2年後および3年後(ボトムライン)に再び再サンプリングした
・ NEA11エンドファイトは、すべての宿主植物にわたって高度に安定である
・ NEA12は、様々な程度の安定性を呈する

0318

0319

ペレニアルライグラスの同質遺伝子接種
エンドファイトNEA10およびNEA12は、接種に不応性であり、順調な接種の頻度が低い。
NEA10は、ImpactおよびBronsynにのみ適合性である
NEA12は、Impact、Barsandra、およびTolosaにのみ適合性である。

0320

0321

以前に形成された安定なアソシエーション
不安定なアソシエーション
エンドファイトNEA3、NEA2、およびE34は、順調に接種されなかった
E1は広く適合性である

0322

0323

優先ライグラス宿主パネル遺伝子型中のE1エンドファイトの栄養安定性

0324

0325

同質遺伝子宿主アソシエーション中のエンドファイト安定性の要約
・ 宿主およびエンドファイト特異的効果が観察された。
-新規エンドファイトの安定な宿主-エンドファイトアソシエーションを同定し、デザイナーアソシエーションを確立した
・ 例えば、Impact - NEA10; Tolosa - NEA12; Barsandra - E1
・ 有意な遺伝子型×遺伝子型(G×G)効果は共生体の育種の重要性を強調する
- BronsynおよびImpactは、より高い接種成功率- より良好な範囲の適合性を呈した
- E1は、高い割合の順調な接種を呈し、中程度の適合性を有する
- NEA11、NEA10、およびSTエンドファイトは、経時的に高度に安定である
- NEA12に関する栄養安定性の問題
・ 高度に有益なアソシエーションを維持し、特徴付けることに対する強調

0326

同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションの代謝プロファイリング

0327

0328

新規同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションの綿密な代謝プロファイリング
図47は、既知の既知およびこれらの前駆体の詳細な特徴付けを示す。

0329

手順:
1.公知のアルカロイド(LEPJ)を半定量分析するための方法を確立する
2.E+対E-宿主植物の半定量的アルカロイド(LEPJ)プロファイルを比較する
3.同質遺伝子宿主中の多様なエンドファイトの半定量的アルカロイドプロファイルを比較する
4.様々な同質遺伝子宿主にわたって選択されたエンドファイトのアルカロイド(LEPJ)プロファイルの安定性を評価する

0330

宿主遺伝子型を、宿主-パネル同定試験を使用して確認した(図48)。

0331

各宿主-エンドファイトアソシエーションの10の複製物を試験した。
・ 4複製物に分割した2種の確認されたエンドファイト陽性植物
・分げつを促進するために一様に剪定された植物
・ 2年後(Table 29(表31)の第1列) - 植物を植え替えして10の複製物にした
・ 2カ月後(Table 29(表31)の第2列) - エンドファイト陽性植物を植え替えして15の複製物にした
・SSRマーカーを使用してエンドファイト状態を試験した

0332

0333

図49および図50は、新規同質遺伝子宿主-エンドファイトアソシエーションの綿密な代謝プロファイリングを示す
・ 1宿主-エンドファイトアソシエーション当たり10の複製物(20*10=200試料)。
・ 完全無作為化ブロックデザイン
・コントロールされた条件下で6週間成長させた後、2つの器官(偽茎および葉)を収穫した
・ 6週間再成長させた後、第2の収穫をした
・ 給水: 50ml/日
・ 14時間の明期(620mmolm-2s-1の光強度)/21℃
・ 10時間の暗期/16℃

0334

成果:
エンドファイト、宿主植物、および器官のタイプ間での代謝変動のパターンを判定するため。
試料調製 → LC/MS分析→LEPJアルカロイドプロファイル
QQQ分析アルカロイド経路分析
アルカロイド単離および定量的特徴付け

0335

現在の研究:
凍結乾燥させた偽茎材料
凍結乾燥粉末50mg
メタノール:水(80:20、v:v)1ml中に2回抽出した

0336

図51は、LEPJ:既知の既知を示す。

0337

図52は、LEPJの正確な質量を示す。

0338

0339

図53および図54は、LEPJの同定を示す。

0340

図55は、LEPJの定量化を示す。

0341

図56は、E+対E-宿主植物の半定量的アルカロイド(LEPJ)プロファイルの比較を示す。

0342

図57は、同質遺伝子宿主(Imp04)中の多様なエンドファイトの半定量的アルカロイドプロファイルの比較を示す。

0343

図58は、様々な同質遺伝子宿主にわたって選択されたエンドファイトのアルカロイド(LEPJ)プロファイルの安定性の評価を示す。
・ 有意な遺伝子型×遺伝子型(G×G)効果は共生体の育種の重要性を強調する
・ 特定のLEPJアルカロイド産生は、同じ同質遺伝子宿主内に接種された異なるエンドファイト間で変動する
・ 例えば、Impact(Imp04)内に接種されたNEA11は、同じ宿主遺伝子型内に接種されたNEA10より多くのペラミンおよび少ないエルゴバリンを産生する
・ LEPJアルカロイド産生は、同じエンドファイトを保有する異なる宿主植物間で変動し、宿主遺伝子型効果を示す
・ 例えば、エルゴバリンは、STおよびNEA11を接種されたBealey(Bea02)およびBarsandra(San02)中で検出されず、同じエンドファイトを接種されたBronsyn(Bro08)中で相対的に高い量で検出された

0344

仕様と一致し、遺伝資源プールにわたって安定であるエンドファイトの評価。

0345

遺伝子含量を使用してロリトレムBの存在/非存在を予測することができる

0346

半定量的LC-MSを使用して遺伝資源プールにわたるLEPJの相対量を評価することができる。
・ NEA12は、いくつかの遺伝資源バックグラウンドと安定なアソシエーションを形成し、評価した宿主にわたってJを産生し、LEPを産生せず、広範囲の抗真菌活性を呈する
・ NEA11は、一連の宿主バックグラウンドにわたってSTより相対的に少ないPおよびより多いEを産生するが、LJをまったく産生しない、高度に適合性のエンドファイトである
・ E1は、Imp04おいてLEPJを産生せず、Bro08においてJを産生しない、高度に適合性のエンドファイトである
・ NEA10は、限定された宿主バックグラウンド内で安定なアソシエーションを形成し、NEA11(および推定によりST)より多くのEおよび少ないPを産生する

0347

0348

経路分析
・ ロリトレムBおよびエルゴバリン生合成経路は、N.ロリイにおいて公知である
遺伝子欠失が既知の既知(LPEJ)の前駆体の産生を変化させ、他の公知の毒素の合成に流れを向けるか否かを判定するために経路分析を実施する

0349

図59は、ロリトレムB生合成を示す。

0350

0351

0352

0353

0354

0355

図61は、ロリトレムB生合成経路の分析を示す。

0356

図62は、パスパリニン-Aトレモルゲン経路を示す。

0357

図63は、経路分析:パスパリニン-Aトレモルゲンを示す。

0358

図64は、共生体中のロリトレムおよびパスパリニンの存在を示す。

0359

0360

0361

0362

図65は、ペラミンが、ペラミン産生エンドファイトの非存在下で微量で植物体に存在することを示す。

0363

共生体パフォーマンスに対するエンドファイト効果
同質遺伝子宿主バックグラウンドにおける共生体パフォーマンスに対するエンドファイト効果の評価を、
・分げつ数
・シュート質量
・ 根質量
・ 根の長さ
・ 根:シュート比
の測定によって行う。

0364

図66は、エンドファイトによって媒介される宿主表現型の変化を評価するのに使用した手順を示す。

0365

図67は、共生体パフォーマンスに対するエンドファイト効果を示す。

0366

ANOVA
・ すべての測定した形質に対する有意なエンドファイト効果
・ 有意なエンドファイト/硝酸塩の組合せの効果無し
・ エンドファイト栄養安定性に対する硝酸塩の効果無し

0367

0368

1同質遺伝子アソシエーション当たり8つの複製物を表現型パフォーマンスについて評価した
植物を砂の内で4週間成長させて定着させた
乾燥および浸水処置を4週目に施した。
8週間で収穫1
12週間で収穫2

0369

図68は、T1収穫の前の植物を示す。

0370

図69は、分げつ数によって測定したパフォーマンスを示す。

0371

有意な遺伝子型×遺伝子型(G×G)効果があった
・宿主植物間で有意な変動
・パフォーマンスに対するエンドファイトの有意な効果

0372

これは、共生体を非経験的に育種および選択することの重要性を強調する。

0373

エンドファイトのゲノム調査配列決定
異なる配列決定プラットフォームのパフォーマンスの進展
Roche454
・ 400〜500bpのリード
・ 1実行当たり100万のリード
・ 12倍のカバー率
Illumina GAIIx
・ 150bpのペアエンドリード
・ 1フローセル当たり8レーン
・ 1レーン当たり2000万のペアエンドリード
・ 1レーン当たり12試料
・ 1試料当たり10倍のカバー率
Illumina HiSeq2000
・ 100bpのペアエンドリード
・ 1フローセル当たり8レーン
・ 1実行当たり2フローセル
・ 1レーン当たり2億5000万のペアエンドリード
・ 1レーン当たり24試料
・ 1試料当たり20〜30倍のカバー率

0374

ネオティホディウムエンドファイトのパンゲノム分析
454配列決定プラットフォームを使用する配列分析
10種のN.ロリイおよび非N.ロリイゲノムを配列決定した
N.ロリイの参照ゲノムを生成した
遺伝子含量を含めた核構造を特徴付けた
種内多型を同定し、異なるN.ロリイゲノムを配列決定することの重要性を強調した
いくつかの毒素の代謝多様性と遺伝子損失-利得との関係を同定した
関連性的形態との比較により、表現型多様性の源としての両リネージからの遺伝子損失が明らかになった
バッカキン科(Clavicipitaceae)の別のメンバーとのミトコンドリアゲノム配列の比較により、これが遺伝子間領域およびイントロン領域内のインデルに起因するゲノムサイズの差異を伴って高度に保存されていることが明らかになった

0375

図70は、454配列決定プラットフォームを使用する配列分析を示す。

0376

Illumina配列決定プラットフォームを使用する配列分析
23種のペレニアルライグラスエンドファイト株を配列決定した:
・ 16種のN.ロリイ
・ 3種のLpTG-2
・ 4種の非N.ロリイ
参照ゲノム構築- ST
パン-ゲノム分析のための多様なペレニアルライグラスエンドファイトの代表
現在の市販のエンドファイト
NEA2、NEA3、NEA4、AR1
将来の(潜在的に)市販のエンドファイト
NEA10、NEA11、NEA12、E1
遺伝的多様性のクラスター分析
異なる地理的起源に由来するエンドファイト
・ ST(GrasslandsSamson) - NA6(モロッコ)およびC9(スペイン)
いくつかの地理的起源に由来するエンドファイト
・ NEA12(フランス) - 15310および15311

0377

図71は、Illumina配列決定プラットフォームを使用する配列分析を示す。

0378

図72は、配列決定されたペレニアルライグラスエンドファイトゲノムの要約を示す。

0379

図73は、配列決定されたペレニアルライグラスエンドファイトゲノムの要約を示す。

0380

重要な研究活動
・ 様々なエンドファイト株および遺伝子をアセンブルおよびマッピングするためのGAIIおよびHiSeqデータの組込み
・ STエンドファイトの参照ゲノム配列アセンブリーの完了
・ 「同一の」株の高分解能ゲノム配列分析
・ 多様なペレニアルライグラスエンドファイトを代表するエンドファイト株のパン-ゲノム配列分析

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

該当するデータがありません

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

この 技術と関連性が強い技術

該当するデータがありません

この 技術と関連性が強い法人

該当するデータがありません

この 技術と関連性が強い人物

該当するデータがありません

この 技術と関連する社会課題

該当するデータがありません

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ