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課題・解決手段

本発明は、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法に関し、この方法は、酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で1以上のL−ヌクレオチドを第一のL−核酸と反応させる段階を含み、この酵素活性は、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる。

概要

背景

概要

本発明は、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法に関し、この方法は、酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で1以上のL−ヌクレオチドを第一のL−核酸と反応させる段階を含み、この酵素活性は、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる。なし

目的

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請求項1

第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法であって、酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で1以上のL−ヌクレオチドを第一のL−核酸と反応させる段階を含み、前記酵素活性が前記第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる、方法。

請求項2

前記酵素活性提示部分が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部分である、請求項1および2の何れか1項に記載の方法。

請求項4

前記酵素活性がポリメラーゼ活性である、請求項1から3の何れか1項に記載の方法。

請求項5

前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項4に記載の方法。

請求項6

前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも300個のアミノ酸を含む、請求項3から5の何れか1項に記載の方法。

請求項7

前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個のアミノ酸を含む、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記ポリメラーゼ活性がDNA−ポリメラーゼ活性である、請求項4から7の何れか1項に記載の方法。

請求項9

前記DNA−ポリメラーゼ活性がDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である、請求項8に記載の方法。

請求項10

前記酵素活性提示部分が酵素である、請求項1から9の何れか1項に記載の方法。

請求項11

前記ポリメラーゼ活性提示部分がポリメラーゼである、請求項3から9の何れか1項に記載の方法。

請求項12

前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマスサーモフィラス(Thermusthermophilus)ポリメラーゼXコアドメインラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である、請求項1から4および8から11の何れか1項に記載の方法。

請求項13

前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcuslitoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcussp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカスフリオサス(Pyrococcusfuriosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturboポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobussolfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナウス(Thermococcusgorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、TaqポリメラーゼTthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taqポリメラーゼ、LA−Taqポリメラーゼ、Expandポリメラーゼ、PlatinumTaqポリメラーゼ、Hi−Fiポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、Stoffel断片、9°NmDNAポリメラーゼ、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelityポリメラーゼ、Paq5000、Pfx−50、Proofstart、FideliTaq、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、好ましくは、前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項1から11の何れか1項に記載の方法。

請求項14

反応させる段階が、前記第一のL−核酸への少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの付加を可能にし、好ましくは5から20,000個のL−ヌクレオチドの付加を可能にし、好ましくは10から2,000個のL−ヌクレオチド、より好ましくは50から500個のL−ヌクレオチド、最も好ましくは50から100個のL−ヌクレオチドの付加を可能にする条件下で行われる、請求項1から13の何れか1項に記載の方法。

請求項15

前記第一のL−核酸への前記少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの付加が、好ましくは前記第一のL−核酸の3’OHと前記少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの1つの5’リン酸との間で3’−5’ホスホジエステル結合を形成させることによる、前記第一のL−核酸への前記少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの共有結合である、請求項1から14の何れか1項に記載の方法。

請求項16

前記第一のL−核酸が、DNA、RNA、修飾DNA、修飾RNAまたはそれらの組み合わせからなるプライマーである、請求項1から15の何れか1項に記載の方法。

請求項17

前記第一のL−核酸が、L−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる、請求項1から16の何れか1項に記載の方法。

請求項18

前記第一のL−核酸がL−ヌクレオチドからなる、請求項1から17の何れか1項に記載の方法。

請求項19

前記反応が、第二のL−核酸をさらに含み、前記第一のL−核酸の1つの分子が、好ましくはワトソンクリック塩基対形成を通じて前記第二のL−核酸の1つの分子とハイブリッド形成する、請求項1から18の何れか1項に記載の方法。

請求項20

前記ポリメラーゼ活性提示部分が、前記第二のL−核酸に相補的である第三のL−核酸を合成し、前記第三のL−核酸が前記第一のL−核酸を含み、L−ヌクレオチドが前記第一のL−核酸の3’末端に付加される、請求項19に記載の方法。

請求項21

L−ヌクレオチドおよび酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的L−核酸を増幅するための方法であって、前記酵素活性が前記標的L−核酸を増幅させることができる、方法。

請求項22

前記酵素活性提示部分が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、請求項21に記載の方法。

請求項23

前記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部分である、請求項21および22の何れか1項に記載の方法。

請求項24

前記酵素活性がポリメラーゼ活性である、請求項21から23の何れか1項に記載の方法。

請求項25

前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項24に記載の方法。

請求項26

前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも300個のアミノ酸を含む、請求項23から25の何れか1項に記載の方法。

請求項27

前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個の間のアミノ酸を含む、請求項26に記載の方法。

請求項28

前記ポリメラーゼ活性がDNA−ポリメラーゼ活性である、請求項24から26の何れか1項に記載の方法。

請求項29

前記DNA−ポリメラーゼ活性がDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である、請求項28に記載の方法。

請求項30

前記酵素活性提示部分が酵素である、請求項21から29の何れか1項に記載の方法。

請求項31

前記ポリメラーゼ活性提示部分がポリメラーゼである、請求項23から29の何れか1項に記載の方法。

請求項32

前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermusthermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物オリメラーゼ(olymerase)β、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である、請求項21から24および28から31の何れか1項に記載の方法。

請求項33

前記ポリメラーゼ活性提示部分部分が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcuslitoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcussp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcusfuriosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturboポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobussolfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcusgorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taqポリメラーゼ、LA−Taqポリメラーゼ、Expandポリメラーゼ、PlatinumTaqポリメラーゼ、Hi−Fiポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、Stoffel断片、9°NmDNAポリメラーゼ、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelityポリメラーゼ、Paq5000、Pfx−50、Proofstart、FideliTaq、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項21から31の何れか1項に記載の方法。

請求項34

反応させる段階が、前記標的L−核酸の増幅を可能にする条件下で行われる、請求項21から33の何れか1項に記載の方法。

請求項35

少なくとも1つのプライマー、好ましくは2つのプライマーを利用し、前記少なくとも1つのプライマーが、L−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる、請求項21から34の何れか1項に記載の方法。

請求項36

前記プライマーがL−ヌクレオチドからなる、請求項35に記載の方法。

請求項37

前記標的L−核酸がL−ヌクレオチドからなる、請求項21から36の何れか1項に記載の方法。

請求項38

ポリメラーゼ連鎖反応である、請求項21から37の何れか1項に記載の方法。

請求項39

前記標的L−核酸がL−DNAからなる、請求項21から38の何れか1項に記載の方法。

請求項40

前記標的L−核酸が、20から20,000個のL−ヌクレオチド、好ましくは30から2,000個のL−ヌクレオチド、より好ましくは40から500個のL−ヌクレオチド、最も好ましくは50から100個のL−ヌクレオチドからなる、請求項21から39の何れか1項に記載の方法。

請求項41

酵素活性提示部分を含むタンパク質であって、前記酵素活性提示部分が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなり、前記酵素活性が第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる、タンパク質。

請求項42

前記酵素活性提示部分がポリメラーゼ活性提示部分である、請求項41に記載のタンパク質。

請求項43

前記酵素活性がポリメラーゼ活性である、請求項41に記載のタンパク質。

請求項44

前記ポリメラーゼ活性が温度安定性のポリメラーゼ活性である、請求項43に記載のタンパク質。

請求項45

前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が少なくとも300個のアミノ酸を含む、請求項42から44の何れか1項に記載のタンパク質。

請求項46

前記ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列が、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個の間のアミノ酸を含む、請求項45に記載のタンパク質。

請求項47

前記ポリメラーゼ活性がDNA−ポリメラーゼ活性である、請求項43から46の何れか1項に記載のタンパク質。

請求項48

前記DNA−ポリメラーゼ活性がDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である、請求項47に記載のタンパク質。

請求項49

前記酵素活性提示部分が酵素である、請求項41から48の何れか1項に記載のタンパク質。

請求項50

前記ポリメラーゼ活性提示部分がポリメラーゼである、請求項42から48の何れか1項に記載のタンパク質。

請求項51

前記ポリメラーゼ活性提示部分が、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermusthermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、好ましくは、前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である、請求項41から43および47から50の何れか1項に記載のタンパク質。

請求項52

前記ポリメラーゼ活性提示部分が、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcuslitoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcussp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcusfuriosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturboポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobussolfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcusgorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taqポリメラーゼ、LA−Taqポリメラーゼ、Expandポリメラーゼ、PlatinumTaqポリメラーゼ、Hi−Fiポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、Stoffel断片、9°NmDNAポリメラーゼ、Therminator、TherminatorII、PhusionHighFidelityポリメラーゼ、Paq5000、Pfx−50、Proofstart、FideliTaq、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、好ましくは前記ポリメラーゼ活性提示部分が、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である、請求項41から50の何れか1項に記載のタンパク質。

請求項53

配列番号15に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、ポリメラーゼ。

請求項54

配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼであって、前記アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、ポリメラーゼ。

請求項55

野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが配列番号15に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体が、ポリメラーゼ活性、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性を有する、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。

請求項56

前記ポリメラーゼ変異体が、少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、請求項55に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項57

前記ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列が、1または2のアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる、請求項55から56の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項58

アミノ酸配列が、配列番号15に記載のアミノ酸配列のアミノ酸位置155および/または203またはそれらに対応するアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なり、好ましくは位置155および/または203のアミノ酸がシステインにより置換されている、請求項55から57の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項59

配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列および配列番号18に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項55から58の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項60

配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項55から57の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項61

アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、請求項55から60の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項62

アミノ酸配列のアミノ酸がL−アミノ酸である、請求項55から60の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項63

野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体であって、前記野生型ポリメラーゼが、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなり、前記ポリメラーゼ変異体がポリメラーゼ活性を有する、野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体。

請求項64

少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む、請求項63に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項65

アミノ酸配列が1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる、請求項63から64の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項66

アミノ酸配列が、少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なり、前記少なくとも1つのアミノ酸位置が、配列番号1に記載のアミノ酸配列の、アミノ酸位置80、アミノ酸位置86およびアミノ酸位置124それぞれまたはそれに対応するアミノ酸位置から選択される、請求項63から65の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項67

配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項63から66の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項68

アミノ酸配列のアミノ酸がD−アミノ酸である、請求項63から67の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項69

アミノ酸配列のアミノ酸がL−アミノ酸である、請求項63から67の何れか1項に記載のポリメラーゼ変異体。

請求項70

L−核酸の3’末端に対して1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法における、酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用。

請求項71

L−ヌクレオチドの存在下で標的L−核酸を増幅するための方法における、酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用。

請求項72

標的L−核酸を増幅するための方法がポリメラーゼ連鎖反応である、請求項71に記載の使用。

請求項73

前記タンパク質が、請求項41から69の何れか1項に記載のタンパク質であり、前記タンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、請求項70から72の何れか1項に記載の使用。

請求項74

標的分子結合L−核酸分子の同定のための方法であって、次の段階:(a)L−核酸分子の不均一集団を作製し;(b)段階(a)の前記L−核酸分子の不均一集団を前記標的分子と接触させ;(c)前記標的分子が結合しないL−核酸分子を分離し;(d)前記標的分子が結合するL−核酸分子を増幅させることを含み、前記増幅段階が請求項41から69の何れか1項に記載のタンパク質を使用し、前記タンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、方法。

請求項75

(e)前記標的分子が結合するL−核酸分子の配列決定を行い;(f)ヌクレオチド配列が、段階(e)で配列決定したL−核酸分子のヌクレオチド配列と同一である核酸分子を合成する、段階をさらに含む、請求項74に記載の方法。

請求項76

段階(a)のL−核酸分子の不均一集団の核酸分子が、それらの5’末端およびそれらの3’末端にプライマー結合部位および、それぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応により段階(d)で得られたL−核酸分子の増幅を可能とするプライマー結合部位に相補的である配列を含み、前記ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるポリメラーゼが、請求項40から69の何れか1項に記載のタンパク質であり、前記ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるプライマーがL−ヌクレオチドからなり、前記ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるヌクレオチドがL−ヌクレオチドである、請求項74から75の何れか1項に記載の方法。

請求項77

段階(d)後に、次の段階:(da)増幅された核酸分子を前記標的分子と接触させることが導入され、段階(b)および場合によっては段階(c)および/または(d)が段階(e)の前に行われ、段階(da)、(b)、(c)および場合によっては(d)がこの順序で1回または数回行われる、請求項74から76の何れか1項に記載の方法。

請求項78

前記標的分子結合L−核酸がDNAである、請求項74から77の何れか1項に記載の方法。

請求項79

前記標的分子結合L−核酸分子がL−ヌクレオチドからなる、請求項74から78の何れか1項に記載の方法。

請求項80

請求項41から69の何れかに記載のタンパク質を作製するための方法であって、a)請求項41から69の何れかに記載のタンパク質の2以上の断片が化学的に合成され、それによって、前記断片が全体として前記タンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくは前記断片が固相ペプチド合成により合成され、b)段階a)の断片が、セグメント縮合ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせにより互いに対して連結され、前記タンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、方法。

請求項81

請求項80に記載のタンパク質を作製するための方法であって、酵素性ライゲーションにおいて使用される酵素がクロストリパインである、方法。

請求項82

酵素性ライゲーションによって第一のD−ペプチドまたは第一のD−タンパク質および第二のD−ペプチドまたは第二のD−タンパク質を互いに対して連結させるための方法であって、前記第一のD−ペプチドまたは前記第一のD−タンパク質が保護基によってそのN−末端で保護され、そのC−末端で4−グアニジノフェニルエステル基により保護され、前記第二のD−ペプチドまたは前記第二のD−タンパク質が、自由N−末端および、そのC−末端でチオアルキルエステルまたはチオアリールエステル基を含む、方法。

請求項83

前記酵素性ライゲーションで使用される酵素がクロストリパインである、請求項82に記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法、標的L−核酸を増幅するための方法、酵素活性提示部分を含むタンパク質アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列を含むポリメラーゼ、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ変異体、1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法における酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用、標的L−核酸を増幅するための方法における酵素活性提示部分を含むタンパク質の使用、標的分子結合L−核酸分子の同定のための方法、タンパク質およびポリメラーゼをそれぞれ作製するための方法および第一のD−ペプチドまたは第一のD−タンパク質および第二のD−ペプチドまたは第二のD−タンパク質を互いに対して連結するための方法に関する。

0002

より広い意味での遺伝子技術の使用は、医学および診断の分野において、ならびに基礎研究においてこの数十年にわたりなされた進歩に大いに貢献した。遺伝子技術によりもたらされる合成能力は、1つの化学合成を上回るものである。遺伝子技術および遺伝子工学によって、特に、原核および真核細胞酵素機構を利用する事実上無制限量のL−ペプチドおよびL−タンパク質の産生が可能である。酵素およびポリメラーゼは特に、野生型であれ、またはこのような野生型の変異体であれ、理論的収率でないにせよ、化学合成によって達成可能である長さまでこのようなD−核酸の基本単位、すなわちD−ヌクレオチドを連結する、D−核酸の合成が可能である。

0003

遺伝子技術において使用される酵素は、それぞれ、キラル特異性ゆえに、そのキラリティーがそれら自身のキラリティーに適合する基本単位および基質しか利用できない。キラリティーが逆である基本単位および基質は、それぞれ、酵素の活性に対する対象になり得ない。キラル相反性の原理のため、逆キラリティーの基本単位および基質それぞれのプロセシングには、酵素が逆キラリティーを有することも必要とされる。

0004

このキラル相反性の原理は、例えば、シュピーゲルマーとしても知られ、このように呼ばれる標的結合L−核酸の作製において集中的に使用される。現在のところ、シュピーゲルマーは、D−ペプチドまたはD−タンパク質などの標的分子または標的構造鏡像異性型に対するインビトロ選択のために第一段階でD−核酸ライブラリを使用する過程によって同定される。第二段階において、標的分子または標的構造の鏡像異性型に結合する、このように同定されたD−核酸を、対応するL−核酸として調製する。キラル相反性の原理の結果として、これらのL−核酸、すなわちシュピーゲルマーは、L−ペプチドまたはL−タンパク質などの真のまたは現実の標的分子に結合でき、選択過程に対して使用されるD−ペプチドまたはD−タンパク質などのその鏡像異性型には結合できない。好ましくは、このような真のまたは現実の標的分子または標的構造は、ヒトまたは動物体などの生体系で存在するような標的分子または標的構造である。このようなシュピーゲルマーの調製のための方法は、例えば「The Aptamer Handbook」(eds.Klussmann,2006)」に記載されている。

0005

シュピーゲルマーを同定する過程をより容易するある方法は、真のまたは現実の標的分子または標的構造により示される鏡像異性型において標的分子または標的構造を用いてL−核酸ライブラリからL−核酸が直接選択されるように過程を再設計することであり得る。この過程の一部は、標的分子および標的構造それぞれに最初に結合するL−核酸の増幅なので、ポリメラーゼが、L−プライマーに少なくとも1つのヌクレオチドを付加することが必要である。現在まで、このようなことが可能なL−アミノ酸からなるポリメラーゼは知られていない。このため、D−アミノ酸からなるポリメラーゼおよび同様の酵素が必要とされている。遺伝子技術は、D−アミノ酸からなるこのような機能的に活性のあるポリメラーゼを提供できないので、化学合成が必要である。しかし、D−タンパク質またはD−ポリペプチドの合成は、比較的低分子に限定される。今までのところ合成された最大のD−タンパク質は、102個のD−アミノ酸からなる血管由来タンパク質血管内皮増殖因子略称VEGF−A)のD−タンパク質型であるが(Mandalら、2012)、ポリメラーゼは一般に300個を超えるアミノ酸からなる。

0006

したがって、本発明の根本となる問題は、プライマーなどのL−核酸への少なくとも1個のヌクレオチドの付加を可能にする方法の提供である。本発明の根本となるさらなる問題は、L−ヌクレオチドを利用する標的L−核酸を増幅するための方法の提供である。本発明の根本となるまたさらなる問題は、このような方法の実施を可能にする手段の提供である。

0007

本発明の根本となるこれらおよび他の問題は、添付される独立した特許請求の範囲の対象により解決される。好ましい実施形態は、添付される独立した特許請求の範囲から導かれ得る。

0008

本願の根本となる問題はまた、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法であって、酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で1以上のL−ヌクレオチドを第一のL−核酸と反応させる段階を含み、その酵素活性が、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加できるという方法によって、第一の態様の第一の実施形態でもある第一の態様において解決される。

0009

第一の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第二の実施形態において、酵素活性提示部分は、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる。

0010

第一の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第三の実施形態において、酵素活性提示部分はポリメラーゼ活性提示部分である。

0011

第一の態様の第一の、第二の、および第一の態様の第三の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第四の実施形態において、酵素活性は、ポリメラーゼ活性である。

0012

第一の態様の第四の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ活性は温度安定性のポリメラーゼ活性である。

0013

第一の態様の第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、少なくとも300個のアミノ酸を含む。

0014

第一の態様の第六の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個のアミノ酸を含む。

0015

第一の態様の第四の、第五の、第六のおよび第七の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第八の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、DNA−ポリメラーゼ活性である。

0016

第一の態様の第八の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第九の実施形態において、DNA−ポリメラーゼ活性は、DNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である。

0017

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十の実施形態において、酵素活性提示部分は、酵素である。

0018

第一の態様の第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十一の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼである。

0019

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十二の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマスサーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメインラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である。

0020

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十三の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカスフリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturboポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、TaqポリメラーゼTthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taqポリメラーゼ、LA−Taqポリメラーゼ、Expandポリメラーゼ、Platinum Taqポリメラーゼ、Hi−Fiポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、Stoffel断片、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminator、Therminator II、Phusion High Fidelityポリメラーゼ、Paq5000、Pfx−50、Proofstart、FideliTaq、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である。

0021

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二のおよび第十三の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十四の実施形態において、反応させる段階は、第一のL−核酸への少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの付加を可能にする、好ましくは5から20,000個のL−ヌクレオチド、好ましくは10から2,000個のL−ヌクレオチド、より好ましくは50から500個のL−ヌクレオチド、最も好ましくは50から100個のL−ヌクレオチドの付加を可能にする条件下で行われる。

0022

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三のおよび第十四の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十五の実施形態において、少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの第一のL−核酸への付加は、好ましくは第一のL−核酸の3’OHと少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの1つの5’リン酸との間で3’−5’ホスホジエステル結合を形成させることによる、第一のL−核酸への少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの共有結合である。

0023

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四のおよび第十五の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十六の実施形態において、第一のL−核酸は、DNA、RNA、修飾DNA、修飾RNAまたはそれらの組み合わせからなるプライマーである。

0024

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十七の実施形態において、第一のL−核酸は、L−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。

0025

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六のおよび第十七の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十八の実施形態において、第一のL−核酸は、L−ヌクレオチドからなる。

0026

第一の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六の、第十七のおよび第十八の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第十九の実施形態において、反応は第二のL−核酸をさらに含み、第一のL−核酸の1個の分子が好ましくはワトソンクリック塩基対形成を通じて第二のL−核酸の1個の分子とハイブリッド形成する。

0027

第一の態様の第十九の実施形態の実施形態でもある第一の態様の第二十の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、第二のL−核酸と相補的である第三のL−核酸を合成し、この第三のL−核酸は、第一のL−核酸を含み、第一のL−核酸の3’末端にL−ヌクレオチドが付加される。

0028

本願の根本となる問題はまた、L−ヌクレオチドおよび酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で標的L−核酸を増幅するための方法であって、この酵素活性が標的L−核酸を増幅することができる方法によって、第二の態様の第一の実施形態でもある第二の態様においても解決される。

0029

第二の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第二の実施形態において、酵素活性提示部分は、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる。

0030

第二の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第三の実施形態において、酵素活性提示部分は、ポリメラーゼ活性提示部分である。

0031

第二の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第四の実施形態において、酵素活性は、ポリメラーゼ活性である。

0032

第二の態様の第四の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、温度安定性のポリメラーゼ活性である。

0033

第二の態様の第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、少なくとも300個のアミノ酸を含む。

0034

第二の態様の第六の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個の間のアミノ酸を含む。

0035

第二の態様の第四の、第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第八の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、DNA−ポリメラーゼ活性である。

0036

第二の態様の第八の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第九の実施形態において、DNA−ポリメラーゼ活性は、DNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である。

0037

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十の実施形態において、酵素活性提示部分は、酵素である。

0038

第二の態様の第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八のおよび第九の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十一の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼである。

0039

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十二の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物オリメラーゼ(olymerase)β、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である。

0040

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十のおよび第十一の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十三の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分部分は、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturboポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taqポリメラーゼ、LA−Taqポリメラーゼ、Expandポリメラーゼ、Platinum Taqポリメラーゼ、Hi−Fiポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、Stoffel断片、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminator、Therminator II、Phusion High Fidelityポリメラーゼ、Paq5000、Pfx−50、Proofstart、FideliTaq、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である。

0041

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二のおよび第十三の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十四の実施形態において、反応させる段階は、標的L−核酸の増幅を可能にする条件下で行われる。

0042

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三のおよび第十四の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十五の実施形態において、本方法は、少なくとも1つのプライマー、好ましくは2つのプライマーを利用し、この少なくとも1つのプライマーは、L−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。

0043

第二の態様の第十五の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十六の実施形態において、プライマーはL−ヌクレオチドからなる。

0044

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五のおよび第十六の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十七の実施形態において、標的L−核酸はL−ヌクレオチドからなる。

0045

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五の、第十六のおよび第十七の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十八の実施形態において、本方法はポリメラーゼ連鎖反応である。

0046

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五の、第十六の、第十七のおよび第十八の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十九の実施形態において、標的L−核酸はL−DNAからなる。

0047

第二の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、第十の、第十一の、第十二の、第十三の、第十四の、第十五の、第十六の、第十七の、第十八のおよび第十九の実施形態の実施形態でもある第二の態様の第十の実施形態において、標的L−核酸は、20から20,000個のL−ヌクレオチド、好ましくは30から2,000個のL−ヌクレオチド、より好ましくは40から500個のL−ヌクレオチド、最も好ましくは50から100個のL−ヌクレオチドからなる。

0048

本願の根本となる問題はまた、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなり、酵素活性が、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる、酵素活性提示部分を含むタンパク質によって、第三の態様の第一の実施形態でもある第三の態様においても解決される。

0049

第三の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第二の実施形態において、酵素活性提示部分は、ポリメラーゼ活性提示部分である。

0050

第三の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第三の実施形態において、酵素活性は、ポリメラーゼ活性である。

0051

第三の態様の第三の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第四の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、温度安定性のポリメラーゼ活性である。

0052

第三の態様の第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、少なくとも300個のアミノ酸を含む。

0053

第三の態様の第五の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個の間のアミノ酸を含む。

0054

第三の態様の第三の、第四の、第五の、および第六の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ活性は、DNA−ポリメラーゼ活性である。

0055

第三の態様の第七の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第八の実施形態において、DNA−ポリメラーゼ活性は、DNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である。

0056

第三の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七のおよび第八の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第九の実施形態において、酵素活性提示部分は、酵素である。

0057

第三の態様の第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七のおよび第八の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第十の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼである。

0058

第三の態様の第一の、第二の、第三の、第七の、第八の、第九のおよび第十の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第十一の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλおよびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号1に記載のアミノ酸配列、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXまたはその変異体である。

0059

第三の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五の、第六の、第七の、第八の、第九の、および第十の実施形態の実施形態でもある第三の態様の第十二の実施形態において、ポリメラーゼ活性提示部分は、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturboポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taqポリメラーゼ、LA−Taqポリメラーゼ、Expandポリメラーゼ、Platinum Taqポリメラーゼ、Hi−Fiポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq、Stoffel断片、9°Nm DNAポリメラーゼ、Therminator、Therminator II、Phusion High Fidelityポリメラーゼ、Paq5000、Pfx−50、Proofstart、FideliTaq、エロンガーゼおよびそれらの変異体の群から選択され、
好ましくはポリメラーゼ活性提示部分は、配列番号15に記載のアミノ酸配列、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなる、Dpo4ポリメラーゼまたはその変異体である。

0060

本願の根本となる問題はまた、アミノ酸がD−アミノ酸である配列番号15に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼによって、第四の態様の第一の実施形態でもある第四の態様においても解決される。

0061

本願の根本となる問題はまた、アミノ酸がD−アミノ酸である配列番号1に記載のアミノ酸配列を含むポリメラーゼによって、第五の態様の第一の実施形態でもある第五の態様においても解決される。

0062

本願の根本となる問題はまた、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼの、ポリメラーゼ活性、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体によって、第六の態様の第一の実施形態でもある第六の態様においても解決される。

0063

第六の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第二の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。

0064

第六の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第三の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列と1または2つのアミノ酸位置で異なる。

0065

第六の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第四の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、配列番号15に記載のアミノ酸配列のアミノ酸位置155および/または203で、またはそれに対応するアミノ酸位置で、野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なり、好ましくは位置155および/または203のアミノ酸がシステインにより置換されている。

0066

第六の態様の第一の、第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列および配列番号18に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

0067

第六の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

0068

第六の態様の第一の、第二の、第三の、第四の第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、D−アミノ酸である。

0069

第六の態様の第一の、第二の、第三の、第四の第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第六の態様の第八の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、L−アミノ酸である。

0070

本願の根本となる問題はまた、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる野生型ポリメラーゼの、ポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼ変異体によって、第七の態様の第一の実施形態でもある第七の態様においても解決される。

0071

第七の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第二の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、少なくとも1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。

0072

第七の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第三の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、1つのアミノ酸位置で野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる。

0073

第七の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第四の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号1に記載のアミノ酸配列の、アミノ酸位置80、アミノ酸位置86およびアミノ酸位置124から選択される少なくとも1つのアミノ酸位置またはそれに対応するアミノ酸位置で、野生型ポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なる。

0074

第七の態様の第一の、第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第五の実施形態において、ポリメラーゼ変異体は、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる。

0075

第七の態様の第一の、第二の、第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第六の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、D−アミノ酸である。

0076

第七の態様の第一の、第二の、第三の、第四の、第五のおよび第六の実施形態の実施形態でもある第七の態様の第七の実施形態において、ポリメラーゼ変異体のアミノ酸配列のアミノ酸は、L−アミノ酸である。

0077

本願の根本となる問題はまた、L−核酸の3’末端への1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法において酵素活性提示部分を含むタンパク質を使用することによって、第八の態様の第一の実施形態でもある第八の態様においても解決される。

0078

本願の根本となる問題はまた、L−ヌクレオチドの存在下で標的L−核酸を増幅するための方法において酵素活性提示部分を含むタンパク質を使用することによって、第九の態様の第一の実施形態でもある第九の態様においても解決される。

0079

第九の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第九の態様の第二の実施形態において、標的L−核酸を増幅するための方法は、ポリメラーゼ連鎖反応である。

0080

第八の態様の第一の実施形態および第九の態様の第三の実施形態の実施形態でもある第八の態様の第二の実施形態において、タンパクは、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質である。

0081

本願の根本となる問題はまた、次の段階:
(a)L−核酸分子の不均一集団を作製し;
(b)段階(a)のL−核酸分子の不均一集団を標的分子と接触させ;
(c)標的分子が結合しないL−核酸分子を分離し;
(d)標的分子が結合するL−核酸分子を増幅させること
を含み、
増幅の段階が、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質を使用し、
このタンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、
標的分子結合L−核酸分子の同定のための方法によって、第十の態様の第一の実施形態でもある第十の態様においても解決される。

0082

第十の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第二の実施形態において、本方法は、
(e)標的分子が結合するL−核酸分子の配列決定を行い;
(f)核酸分子、段階(e)で配列決定したL−核酸分子のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を合成する、段階をさらに含む。

0083

第十の態様の第一および第二の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第三の実施形態において、段階(a)のL−核酸分子の不均一集団の核酸分子は、それらの5’末端およびそれらの3’末端においてプライマー結合部位および、それぞれ、ポリメラーゼ連鎖反応によって段階(d)で得られるL−核酸分子の増幅を可能とするプライマー結合部位に相補的である配列を含み、ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるポリメラーゼは、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質であり、ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるプライマーは、L−ヌクレオチドからなり、ポリメラーゼ連鎖反応で使用されるヌクレオチドはL−ヌクレオチドである。

0084

第十の態様の第一の、第二の、および第三の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第四の実施形態において、段階(d)の後、次の段階:
(da)増幅された核酸分子を標的分子と接触させる段階
が導入され、
ここで、段階(b)および場合によっては段階(c)および/または(d)が段階(e)の前に行われ、段階(da)、(b)、(c)および場合によっては(d)は、この順序で1回または数回行われる。

0085

第十の態様の第一の、第二の、第三のおよび第四の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第五の実施形態において、標的分子結合L−核酸は、DNAである。

0086

第十の態様の第一の、第二の、第三の、第四のおよび第五の実施形態の実施形態でもある第十の態様の第六の実施形態において、標的分子結合L−核酸分子は、L−ヌクレオチドからなる。

0087

本願の根本となる問題はまた、第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質を作製するための方法であって、
a)第三の、第四の、第五の、第六のおよび第七の態様の何れかの実施形態によるタンパク質の2以上の断片が化学的に合成され、それによって断片がそれらの全体としてタンパク質のアミノ酸配列を形成し、好ましくはこの断片が固相ペプチド合成により合成され、
b)段階a)の断片が、セグメント縮合ネイティブ化学ライゲーション、酵素性ライゲーションまたはそれらの組み合わせによって互いに対して連結され、
このタンパク質が、アミノ酸がD−アミノ酸であるアミノ酸配列からなる、
方法によって、第十一の態様の第一の実施形態でもある第十一の態様においても解決される。

0088

第十一の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第十一の態様の第二の実施形態において、酵素性ライゲーションで使用される酵素は、クロストリパインである。

0089

本願の根本となる問題はまた、第一のD−ペプチドまたは第一のD−タンパク質および第二のD−ペプチドまたは第二のD−タンパク質を酵素性ライゲーションによって互いに対して連結させるための方法であって、
この第一のD−ペプチドまたは第一のD−タンパク質が、そのN−末端で保護基によって保護され、そのC−末端で4−グアニジノフェニルエステル基によって保護され、
この第二のD−ペプチドまたは第二のD−タンパク質が、自由N−末端および、そのC−末端でチオアルキルエステルまたはチオアリールエステル基を含む、
方法によって、第十二の態様の第一の実施形態でもある第十二の態様においても解決される。

0090

第十二の態様の第一の実施形態の実施形態でもある第十二の態様の第二の実施形態において、酵素性ライゲーションで使用される酵素はクロストリパインである。

0091

発明者らは、驚くべきことに、機能的に活性のあるD−アミノ酸からなるタンパク質を化学的に合成することが可能であり、それによって、このようなタンパク質が一般的にはポリメラーゼにより示されるようなサイズを有するようになることを見出した。より具体的には、発明者らは、このようなD−タンパク質およびD−ポリメラーゼ、すなわちポリメラーゼとして活性のあるD−アミノ酸からなるポリメラーゼの合成を可能にする方法に気付いた。この驚くべき知見に基づき、L−核酸およびL−核酸分子の酵素性合成に必要とされるタンパク質および酵素活性が今や利用可能である。L−核酸およびL−核酸分子のこのような酵素性合成は、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法および、L−核酸としてのL−ヌクレオチドの存在下で標的L−核酸を増幅するための、すなわち増幅産物がL−核酸である方法を含むが、これらに限定されない。

0092

これらの方法および酵素活性は、利用するシュピーゲルマーを同定する代替的過程の一部であるので、シュピーゲルマーを同定するこのような代替的過程が現在、実現できる。

0093

発明者らは、酵素活性が、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加することができる酵素活性提示部分を含むタンパク質の存在下で、1以上のL−ヌクレオチドを第一のL−核酸と反応させる段階を含む、第一のL−核酸の3’末端に対して1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法を開発した。

0094

好ましい実施形態において、酵素活性は、第一のL−核酸の3’末端に5から20,000個のL−ヌクレオチド、好ましくは10から2,000個のL−ヌクレオチド、より好ましくは50から500個のL−ヌクレオチド、最も好ましくは50から100個のL−ヌクレオチドを付加することができる。

0095

「付加する」という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、好ましくは第一のL−核酸の3’OHと少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの1つの5’リン酸との間に3’−5’ホスホジエステル結合を形成させることによる、本発明による、分子間の共有結合、L−核酸の共有結合およびL−核酸への少なくとも1以上のL−ヌクレオチドの共有結合である。本発明によると、L−核酸に付加されるL−ヌクレオチドは、L−ヌクレオチドにより延長されるL−核酸の3’末端を形成する。

0096

好ましい実施形態において、第一のL−核酸の3’末端に1以上のL−ヌクレオチドを付加するための方法は、第二のL−核酸を含み、ここで、好ましくはワトソン−クリック塩基対形成を通じて、第一のL−核酸の1つの分子が第二のL−核酸の1つの分子とハイブリッド形成する。より好ましい実施形態において、本方法によって、第二のL−核酸と相補的である第三のL−核酸の合成が可能となり、この第三のL−核酸は、第一のL−核酸と、第一のL−核酸の3’末端、すなわち第一のL−核酸に付加されるL−ヌクレオチドと、を含み、1以上のL−ヌクレオチドが第一のL−核酸の3’末端に付加され、その結果、第三のL−核酸が得られる。

0097

本発明による酵素活性提示部分を含むタンパク質は、酵素活性提示部分のみを有するタンパク質および酵素活性提示部分と他の残基または部分とを有するタンパク質を含み、ここでタンパク質の他の残基または部分には酵素活性がない。本発明によると、酵素活性提示部分のアミノ酸配列は、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個のアミノ酸を含む。

0098

本発明による酵素活性提示部分を含むタンパク質は、好ましくはポリメラーゼ活性提示部分である。本発明によるポリメラーゼ活性提示部分を含むタンパク質は、ポリメラーゼ活性提示部分のみを有するポリメラーゼおよびポリメラーゼ活性提示部分と他の残基または部分とを有するポリメラーゼを含み、ここでポリメラーゼの他の残基または部分にはポリメラーゼ活性がない。本発明によると、ポリメラーゼ活性提示部分のアミノ酸配列は、300から900個の間のアミノ酸、好ましくは300から600個の間のアミノ酸、より好ましくは300から360個の間のアミノ酸、最も好ましくは340から360個のアミノ酸を含む。

0099

本発明によるポリメラーゼ活性提示部分は、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性提示部分、より好ましくは温度安定性のDNAポリメラーゼ活性提示部分および最も好ましくは温度安定性のDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性提示部分である。

0100

本発明によるポリメラーゼ活性提示部分は、好ましくは、DNA−ポリメラーゼ活性提示部分、より好ましくはDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性提示部分または温度安定性のDNA−ポリメラーゼ活性提示部分、最も好ましくは温度安定性のDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性提示部分である。

0101

酵素活性という用語は、本明細書中で使用される場合、特異的な反応の触媒であり、好ましくは1以上のヌクレオチドを核酸の3’末端に付加すること、核酸および/またはポリメラーゼ活性のアンプリケーション(amplication)、より好ましくは1以上のL−ヌクレオチドをL−核酸の3’末端に付加すること、L−核酸のアンプリケーション(amplication)である。

0102

本発明によるポリメラーゼ活性という用語は、L−ヌクレオチドの重合および/またはL−核酸へのL−ヌクレオチドの重合の、酵素の性能であり、ここで好ましくはL−ヌクレオチドはL−ヌクレオシド三リン酸である。

0103

本発明によるポリメラーゼ活性は、好ましくは温度安定性のポリメラーゼ活性、より好ましくは温度安定性のDNAポリメラーゼ活性および最も好ましくは温度安定性のDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である。

0104

本発明によるポリメラーゼ活性は、好ましくはDNA−ポリメラーゼ活性、より好ましくはDNA依存性DNA−ポリメラーゼまたは温度安定性のDNA−ポリメラーゼ活性、最も好ましくは温度安定性のDNA依存性DNA−ポリメラーゼ活性である。

0105

既知のポリメラーゼは、天然由来であるかまたは天然源からのポリメラーゼの最適化もしくは突然変異誘導された変異体である。ポリメラーゼは、キラルな基本単位、すなわちL−アミノ酸からなる。結果的に、ポリメラーゼの構造は、本質的にキラルでもあり、その結果、立体特異的な基質認識が起こる。ゆえに、これらの酵素は、適正な、すなわち対応するキラル立体配置基質分子のみを受容する。したがって、既知のポリメラーゼは、D−ヌクレオチドまたはD−ヌクレオシド三リン酸を重合させ、ここで、これらは、D−ヌクレオチドからなる相補的D−核酸鎖を合成するために、鋳型鎖として、D−ヌクレオチドからなるD−核酸を使用する。さらに、鋳型鎖に対して、ポリメラーゼは、場合によっては、鋳型鎖とハイブリッド形成し、D−ヌクレオチドからなるプライマーを使用する。天然の核酸は、D−ヌクレオチドから構成され、特にL−アミノ酸からなるタンパク質および酵素によって、処理、例えば増幅され得るので、それぞれL−アミノ酸からなるこのようなタンパク質および酵素によってL−核酸は認識されない。したがって、標的分子または標的構造に結合するL−核酸は、シュピーゲルマーとも呼ばれ、このような標的分子または標的構造の天然型を用いてインビトロ選択過程によって直接得ることができない。

0106

発明者らは、驚くべきことに、L−核酸鋳型鎖とハイブリッド形成するL−ヌクレオチドからなるプライマーにL−核酸ヌクレオチドを付加し得るポリメラーゼを作製することができることを見出した。さらに、発明者らは、驚くべきことに、好ましくはポリメラーゼ−連鎖反応(略称PCR)として知られる過程においてL−核酸の増幅のために使用され得るポリメラーゼを作製することが可能であることを見出した。

0107

ポリメラーゼは、ヌクレオシド三リン酸を重合させる酵素である。ポリメラーゼは、鋳型核酸鎖に相補的である核酸鎖鎖を合成するために、鋳型核酸鎖を使用する。鋳型核酸鎖に加えて、ポリメラーゼは、場合によっては、鋳型核酸鎖に対して塩基相補性に基づきハイブリッド形成するプライマーを使用する。鋳型核酸鎖、プライマーおよびポリメラーゼにより合成される核酸鎖は、独立にDNAまたはRNAの何れかであり得る。ポリメラーゼは、本明細書中で好ましく使用される場合、DNAポルメラーゼ(polmerase)およびRNA−ポリメラーゼ、好ましくはDNA依存性DNAポリメラーゼ、RNA依存性DNAポリメラーゼ、例えば逆転写酵素など、RNA依存性RNAポリメラーゼおよびRNA依存性DNAポリメラーゼを含む。より好ましくは、ポリメラーゼは温度安定性のポリメラーゼである。ポリメラーゼは、対応するネイティブまたは野生型酵素で見出されるアミノ酸の全てを含有する必要はないが、ポリメラーゼが所望の触媒活性遂行するのを可能にするのに十分であるもののみ必要である。ある実施形態において、ポリメラーゼ活性は、例えば、5’−3’重合化、5’−3’エキソヌクレアーゼおよび3’−5’エキソヌクレアーゼ活性を含む触媒活性を含む群から選択される触媒活性である。

0108

本発明によるポリメラーゼは、D−アミノ酸からなり、L−ヌクレオチドまたはL−ヌクレオシド三リン酸を重合化し、この本発明によるポリメラーゼは、L−ヌクレオチドからなる相補的L−核酸鎖を合成するために、鋳型鎖としてL−ヌクレオチドからなるL−核酸を使用する。さらに、鋳型鎖に対して、本発明によるポリメラーゼは、場合によっては鋳型鎖とハイブリッド形成し、L−ヌクレオチドからなるプライマーを使用する。鋳型鎖、プライマーおよび合成核酸鎖は独立にL−DNAまたはL−RNAの何れかであり得る。本発明によるポリメラーゼは、D−アミノ酸からなるDNAポルメラーゼ(polmerase)およびD−アミノ酸からなるRNA−ポリメラーゼ、好ましくはD−アミノ酸からなるDNA依存性DNAポリメラーゼ、D−アミノ酸からなる逆転写酵素などのRNA依存性DNAポリメラーゼ、D−アミノ酸からなるRNA依存性RNAポリメラーゼおよびD−アミノ酸からなるRNA依存性DNAポリメラーゼを含む。より好ましくは、本発明によるポリメラーゼは、D−アミノ酸からなる温度安定性のポリメラーゼである。本発明によるポリメラーゼは、ネイティブ酵素で見出されるアミノ酸の全てを含有する必要はないが、本発明によるポリメラーゼが所望の触媒活性を遂行するのを可能にするのに十分であるもののみ必要である。触媒活性としては、例えば、5’−3’重合化、5’−3’エキソヌクレアーゼおよび3’−5’エキソヌクレアーゼ活性が挙げられる。

0109

L−アミノ酸のみからなるポリメラーゼは、好ましくは本明細書中で「全L−ポリメラーゼ」と呼ばれる。

0110

D−アミノ酸のみからなるポリメラーゼは、好ましくは本明細書中で「全−Dポリメラーゼ」と呼ばれる。

0111

好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼX、サーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)ポリメラーゼXコアドメイン、ラットポリメラーゼβ、真核生物ポリメラーゼβ、クレノウ断片、クレノウエキソポリメラーゼ、T4DNAポリメラーゼ、Phi29DNAポリメラーゼ、シーケナーゼ、T7DNAポリメラーゼ、SP6ポリメラーゼ、DNAポリメラーゼI、ポリメラーゼλ、ポリメラーゼDPO4、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス属(Pyrococcus sp.)DNAポリメラーゼ、パイロコッカス・フリオサス(Pyrococcus furiosus)DNAポリメラーゼ、Pfuturbo(商標)ポリメラーゼ、スルホロブス・ソルファタリカス(Sulfolobus solfataricus)DNAポリメラーゼ、サーモコッカス・ゴルゴナリウス(Thermococcus gorgonarius)DNAポリメラーゼ、KODポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、Tthポリメラーゼ、Pyrobestポリメラーゼ、Pwoポリメラーゼ、Sacポリメラーゼ、Bstポリメラーゼ、Pocポリメラーゼ、Pabポリメラーゼ、Mthポリメラーゼ、Phoポリメラーゼ、ES4ポリメラーゼ、EX−Taq(商標)ポリメラーゼ、LA−Taq(商標)ポリメラーゼ、Expand(商標)ポリメラーゼ、Platinum(商標)Taqポリメラーゼ、Hi−Fi(商標)ポリメラーゼ、Tbrポリメラーゼ、Tflポリメラーゼ、Truポリメラーゼ、Tacポリメラーゼ、Tneポリルネラーゼ(polyrnerase)、Tmaポリメラーゼ、Tihポリメラーゼ、Tfiポリメラーゼ、AmpliTaq(商標)、Stoffel断片、9°Nm(商標)DNAポリメラーゼ、Therminator(商標)、Therminator II(商標)、Phusion High Fidelity(商標)ポリメラーゼ、Paq5000(商標)、Pfx−50(商標)、Proofstart(商標)、FideliTaq(商標)、エロンガーゼ(商標)およびそれらのそれぞれおよび何れかの変異体の群から選択される。

0112

より好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、配列番号1に記載のアミノ酸配列からなるアフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXである。別のより好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、アフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXの変異体、最も好ましくは、配列番号2に記載のアミノ酸配列、配列番号3に記載のアミノ酸配列および配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列のアフリカブタ熱ウイルスポリメラーゼXの変異体である。

0113

より好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、配列番号15に記載のアミノ酸配列からなるポリメラーゼDpo4である。別のより好ましい実施形態において、本発明によるポリメラーゼは、ポリメラーゼDpo4の変異体、最も好ましくは配列番号16に記載のアミノ酸配列、配列番号17に記載のアミノ酸配列、配列番号18に記載のアミノ酸配列、配列番号19に記載のアミノ酸配列、配列番号20に記載のアミノ酸配列、配列番号21に記載のアミノ酸配列および配列番号22に記載のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の選択されるアミノ酸配列からなるポリメラーゼDpo4の変異体である。

0114

ポリメラーゼの変異体は、1以上のアミノ酸位置でこのポリメラーゼのアミノ酸配列とは異なるポリメラーゼである。アミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、好ましくはポリメラーゼのN−末端およびC−末端に対するその位置および/またはそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置により決定され、
a)ポリメラーゼがN−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、ポリメラーゼのC−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
b)ポリメラーゼがC−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、ポリメラーゼのN−末端に対するその位置により、およびそのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対して決定され、
b)ポリメラーゼがN−末端およびC−末端で短縮される場合、アミノ酸の位置は、そのアミノ酸の周囲のアミノ酸に対するその位置によって決定されるようになる。

0115

温度安定性である本発明によるポリメラーゼは、温度上昇によって比較的影響を受けにくい。ある具体的な非限定例において、温度安定性であるポリメラーゼは、少なくとも50℃、例えば、50℃の温度、60℃、75℃、80℃、82℃、85℃、88℃、90℃、92℃、95℃以上の温度により影響を受けない。

0116

L−ヌクレオシド三リン酸のポリメルセーション(polymersation)の過程内で、本ポリメラーゼは、1個のヌクレオシド三リン酸を別のヌクレオシド三リン酸に付加し、好ましくはその結果、核酸とも呼ばれるオリゴヌクレオチドが得られる。好ましい実施形態において、本ポリメラーゼは、1個のヌクレオシド三リン酸のみを1個のヌクレオシド三リン酸にまたは、例えばヌクレオチドが連鎖停止剤ヌクレオチド、例えばジデオキシヌクレオチドである場合、核酸の末端ヌクレオチドに付加する。このような連鎖停止剤ヌクレオチドは、核酸の配列決定を行うために使用され、当業者により知られている。

0117

L−核酸、好ましくは標的L−核酸を増幅するために、L−ヌクレオシド三リン酸のポリメルセーション(polymersation)の過程が使用され得る。

0118

増幅は、核酸、好ましくは標的L−核酸のコピー数を増加させる何らかの過程である。

0119

好ましい実施形態において、標的L−核酸は、20から20,000個のL−ヌクレオチド、好ましくは30から2,000個のL−ヌクレオチド、より好ましくは40から500個のL−ヌクレオチド、最も好ましくは50から100個のL−ヌクレオチドからなる。

0120

増幅の例は、核酸鋳型に対するプライマーのハイブリッド形成を可能にする条件下で、核酸をプライマー対と接触させるものである。適切な条件下でプライマーに1以上のヌクレオシド三リン酸を付加することによってポリメラーゼによりプライマーを伸長させ、核酸鋳型から解離させ、次いで再アニーリングさせ、伸長させ、解離させて核酸分子のコピー数を増幅させる。インビトロ増幅の産物は、標準的技術を用いて、電気泳動制限エンドヌクレアーゼ切断パターン、オリゴヌクレオチドハイブリッド形成またはライゲーションおよび/または核酸配列決定によって特徴を調べることができる。

0121

代替的なインビトロ増幅技術は当業者にとって公知であり、転写フリー等温性増幅、鎖置換増幅およびNASBA(商標)RNA転写フリー増幅を含む。

0122

増幅方法の一部は、核酸、好ましくは2本鎖核酸融解させるための反応の加熱および冷却の反復のサイクルからなる温度サイクリングおよび核酸の酵素性複製に依存する。これらの温度サイクリング段階は、核酸融解と呼ばれる過程において高温で2本鎖核酸の2本の鎖を最初に物理的に分離させるために必要である。次に、より低い温度で、標的核酸を選択的に増幅させるためのポリメラーゼによる核酸合成において、各鎖が鋳型として使用される。ポリメラーゼとともに標的領域に相補的な配列を含有するプライマー(この後この方法を示す。)は、選択的および反復性の増幅を可能にする重要な構成要素である。温度サイクリング進行に基づく増幅方法として、作製される核酸はそれ自身、複製のための鋳型として使用され、核酸鋳型が指数関数的に増幅される連鎖反応を引き起こす。

0123

温度性の増幅による最も著名な増幅方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(略称PCR)である。

0124

プライマーは、DNAもしくはRNAまたはそれらの組み合わせ、好ましくは、長さが10ヌクレオチド以上のDNAオリゴヌクレオチドからなる短い核酸分子である。より好ましくは、より長いプライマーは、長さが約15、20または25ヌクレオチド以上であり得る。核酸ハイブリッド形成によって相補的標的核酸鎖とプライマーをアニーリングさせ、プライマーと標的核酸鎖との間でハイブリッドを形成させることができ、次いで、ポリメラーゼプライマー対によって標的核酸鎖に沿って伸長させたプライマーを、例えばPCRまたは当技術分野で公知の他の核酸増幅方法による核酸の増幅のために使用し得る。

0125

D−アミノ酸からなる本発明のポリメラーゼの使用によって、プライマーおよび相補的標的核酸鎖がL−ヌクレオチドからなるようにすることが必要となる。好ましくは少なくとも1つのプライマーは、L−ヌクレオチドおよび場合によっては修飾からなる。

0126

核酸プライマーおよびプローブを調製し、使用するための方法は、例えばSambrookら(Sambrockら、1989)に記載されている。PCRプライマー対は、例えばプライマーなど、その目的を対象としたコンピュータプログラムを用いることにより、既知の配列由来となることがある。当業者にとって当然のことながら、特定のプローブまたはプライマーの特異性は、その長さに伴い向上する。

0127

そのため、本発明によるポリメラーゼはD−アミノ酸からなる。D−アミノ酸からなる本発明によるポリメラーゼは、天然源から単離することができず、細菌、酵母真菌ウイルスまたは動物細胞を用いた組み換え発現により作製できず、化学的過程、好ましくはライゲーション法と組み合わせた固相ペプチド合成(略称SPPS)などによって作製しなければならない。

0128

固相ペプチド合成は、ペプチドまたはタンパク質断片の合成に対する最新の技術であり:不溶性であるが多孔性の小型の固形ビーズペプチド鎖構築され得る機能的単位(「リンカー」)で処理する。ペプチドは、無水フッ化水素またはトリフルオロ酢酸などの試薬によりビーズから切断されるまで、ビーズに共有結合したままである。したがって、ペプチドは固相上に「固定化」されており、ろ過過程中に保持され得、一方で、液相試薬および合成の副産物が除去される。SPPSの全般的な原理は、カップリング洗浄−脱保護−洗浄の1反復サイクルである。固相連結ペプチドの自由N末端アミンを1個のN−保護アミノ酸単位にカップリングさせる(下記参照)。次に、この単位を脱保護し、これにより、さらなるアミノ酸が連結され得る新しいN末端アミンが現れる。この技術の優位性は、一部には、関心のある伸長中のペプチドが全て不溶性樹脂に共有結合されたまま、過剰な試薬を除去する各反応後の洗浄サイクルを行うことができることにある。SPPSの主要な使用形態は2種類、FmocおよびBocがある。アミノ酸単量体のN末端は、これらの2つの基の何れかにより保護され、脱保護されたアミノ酸鎖上に付加される。SPPSは収率により限定され、一般的には70個のアミノ酸の範囲のペプチドおよびタンパク質が合成の利用能限界となっている。合成の困難性は配列にも依存する。2個のペプチドを一緒にカップリングするために、断片縮合、ネイティブ化学ライゲーションまたは酵素性ライゲーションなどのライゲーション法を用いることによって、より大きな合成オリゴペプチドおよびタンパク質が得られるようになり得る。しかし、今までに合成された最大のD−タンパク質は、102個のD−アミノ酸からなる血管由来タンパク質血管内皮増殖因子(略称VEGF−A)のD−タンパク質型である(Mandalら、2012)。
断片縮合は、ペプチドのアミノ酸のその鎖が化学基で完全に保護されているペプチドを使用し、そのペプチドは溶液中でカップリングされる。

0129

ネイティブ化学ライゲーションは水溶液中で行われる。必要な非保護ペプチドチオエステル基本単位の調製は難関である。ネイティブ化学ライゲーションにおいて、非保護ペプチド2のN末端システイン残基チオレート基は、pH7.0、20℃<T<37℃の水性緩衝液中で第二の非保護ペプチド1のC末端チオエステル攻撃する。この可逆的トランスチオエステル化段階は、化学選択的であり、位置選択的であり、チオエステル中間体3の形成につながる。この中間体は、分子内S,N−アシルシフトにより再編成し、その結果、ライゲーション部位でネイティブアミド(「ペプチド」)結合4が形成される。

0130

実施例で示されるように、驚くべきことに、発明者らは、ネイティブ化学ライゲーションに必要なC末端チオエステルが、酵素性ライゲーション条件下で安定であるので、ネイティブ化学ライゲーションおよび酵素性ライゲーションを組み合わせて使用し得ることを示すことができた。

0131

D−ペプチドの酵素性ライゲーションは、次の段階を含むプロテアーゼの使用により作用する:(a)独自にD−ペプチドであるアミノ構成要素の調製、(b)脱離基を含み、独自にD−ペプチドであるカルボキシ構成要素の調製および(c)独自にD−ポリペプチドを与えるための、脱離基の切断によりアミノ構成要素とカルボキシ構成要素との間でペプチド結合を形成させるためのプロテアーゼ存在下でのアミノ構成要素およびカルボキシ構成要素の反応(WO2003047743参照)。好ましくはプロテアーゼはクロストリパインである。

0132

本発明のポリメラーゼはまた、本発明のポリメラーゼ、および特に本明細書中で開示される特定の配列と基本的に相同であるポリメラーゼも含む。実質的に相同である、という用語は、相同性が少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは90%および最も好ましくは95%、96%、97%、98%または99%を超えるものなどと理解されたい。

0133

本発明のポリメラーゼ活性提示部分はまた、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示される特定の配列と基本的に相同であるポリメラーゼ活性提示部分も含む。実質的に相同である、という用語は、相同性が少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは90%および最も好ましくは95%、96%、97%、98%または99%を超えるものなどと理解されたい。

0134

本発明のポリメラーゼまたは本発明発明のポリメラーゼ活性提示部分に存在する相同アミノ酸の実際のパーセンテージは、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に存在するアミノ酸の総数に依存する。%修飾は、ポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に存在するアミノ酸の総数に基づき得る。

0135

2つのポリメラーゼまたは2つのポリメラーゼ活性提示部分間の相同性は、当業者にとって公知のように決定され得る。より具体的には、指定のプログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列についてのパーセント配列相同性を計算するために配列比較アルゴリズムを使用し得る。試験配列は、好ましくは、相同であると言われるかまたは相同であるか否か、相同である場合は、異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分に対してどの程度相同であるかを試験しようとするポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分であり、そのため、このような異なるポリメラーゼまたはポリメラーゼ活性提示部分は相同性参照配列とも呼ばれる。例えばSmithおよびWatermanのローカル相同性アルゴリズム(Smith & Waterman,1981)によって、NeedlemanおよびWunschの相同性アラインメントアルゴリズム(Needleman & Wunsch,1970)によって、PearsonおよびLipmanの類似度法に対する検索(Pearson & Lipman,1988)によって、これらのアルゴリズムのコンピュータでの実行によって(Wisconsin Genetics Software Package,Genetics Computer Group,575 Science Dr.,Madison,Wis.における、GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)または目視によって、比較のためのポリメラーゼのアミノ酸配列の最適アラインメントを行い得る。

0136

パーセント配列同一性を決定するために適切であるアルゴリズムの一例は、ベーシック・ローカル・アラインメント検索ツール(本明細書中で以後、「BLAST」)において使用されるアルゴリズムであり、例えばAltschulら(Altschulら、1990およびAltschulら、1997)参照。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(本明細書中で以後「NCBI」)を通じて公開されている。NCBIから入手可能なソフトウェア、例えば、BLASTN(ヌクレオチド配列用)およびBLASTP(アミノ酸配列用)を用いて配列同一性を決定する際に使用される初期設定パラメーターは、McGinnisら(McGinnisら、2004)に記載されている。

0137

本発明のポリメラーゼはまた、本発明のポリメラーゼおよび特に本明細書中で開示される本発明の特定のポリメラーゼに対してある一定の同一性を有し、それらのアミノ酸配列によって定められるポリメラーゼも含む。より好ましくは、本発明はまた、本発明のポリメラーゼおよび特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列またはその一部により定められる本発明の特定のポリメラーゼ対して少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは90%および最も好ましくは95%、96%、97%、98%または99%を超える同一性を有し、それらのアミノ酸配列またはそれらの一部により定められるポリメラーゼも含む。

0138

本発明のポリメラーゼ活性提示部分は、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列により定められる本発明の特定のポリメラーゼ活性提示部分に対してある一定の同一性を有するポリメラーゼ活性提示部分も含む。より好ましくは、本発明はまた、本発明のポリメラーゼ活性提示部分および特に本明細書中で開示され、それらのアミノ酸配列またはそれらの一部により定められる本発明の特定のポリメラーゼ活性提示部に対して、少なくとも75%、好ましくは85%、より好ましくは90%および最も好ましくは95%、96%、97%、98%または99%を超える同一性を有するポリメラーゼ活性提示部分も含む。

0139

本願に関連して、核酸分子および核酸という用語は、別段の断りが明確に示されない場合は交換可能に使用される。

0140

好ましく本明細書中で使用される場合、「核酸(nucleic aicdおよびnucleic acids)」は、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸(略称DNA)およびリボ核酸(略称RNA)などを指す。さらに「核酸」という用語は複数の核酸を含む。「核酸(nucleic aicdおよびnucleic acids)」という用語はまた、ヌクレオチド類似体、1本鎖(センスまたはアンチセンス)および2本鎖のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドからなるRNAまたはDNAの何れかの同等物、変異体および類似体を含むとも理解されたい。デオキシリボヌクレオチドには、デオキシアデノシンデオキシシチジンデオキシグアノシンおよびデオキシチミジンが含まれる。リボヌクレオチドには、アデノシンシチジングアノシンおよびウリジンが含まれる。「ポリヌクレオチド」としての核酸分子への言及は、1本鎖のまたは2本鎖の分子を含む、共有結合により連結される2以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにその広義の意味で使用される。「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、共有結合によって連結される2以上のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を意味するためにも本明細書中で使用されるが、本明細書中で定義されるように、オリゴヌクレオチドは、100ヌクレオチド未満を含む。

0141

核酸は、核酸を形成する連続ヌクレオチド全てが互いに1以上の共有結合により連結または結合されることを特徴とする。より具体的には、このようなヌクレオチドのそれぞれは、2個の他のヌクレオチドに、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通じて連結または結合され、一続きの連続ヌクレオチドを形成する。しかし、このような配置において、このような配置が直鎖状であり、環状配置でなく、したがって環状分子でなく直鎖状であるという前提下で、2つの末端ヌクレオチド、すなわち好ましくは5’末端および3’末端のヌクレオチドは、それぞれ1個のヌクレオチドにのみ連結される。

0142

本願の別の実施形態において、核酸は少なくとも2つの連続ヌクレオチド群を含み、それにより連続ヌクレオチドの各群内で、各ヌクレオチドが2個の他のヌクレオチドに、好ましくはホスホジエステル結合または他の結合を通じて連結または結合され、一続きの連続ヌクレオチドが形成される。しかし、このような配置において、2個の末端ヌクレオチド、すなわち好ましくは5’末端および3’末端のヌクレオチドは、それぞれ1個のヌクレオチドにのみ連結される。しかし、このような実施形態において、連続ヌクレオチドの2つの群は、共有結合を通じて互いに連結または結合されず、共有結合、好ましくはこの2つのヌクレオチドの一方の糖部分とこの2つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの他のホスホール部分との間で形成される共有結合を通じて、一方の群の1ヌクレオチドおよび別のまたは他方の群の1ヌクレオチドを連結する。しかし、代替的な実施形態において、連続ヌクレオチドの2つの群は、共有結合、好ましくはこの2つのヌクレオチドの一方の糖部分とこの2つのヌクレオチドまたはヌクレオシドの他方のホスホール部分との間で形成される共有結合を通じて1つの群の1ヌクレオチドおよび別のまたは他の群の1ヌクレオチドを連結する共有結合を通じて互いに対して連結または結合される。好ましくは、連続ヌクレオチドの少なくとも2群は共有結合を通じて連結されることはない。別の好ましい実施形態において、ホスホジエステル結合とは異なる共有結合を通じて少なくとも2群が連結される。

0143

核酸という用語は、好ましくはD−核酸またはL−核酸の何れかも包含する。好ましくは、核酸はL−核酸である。さらに、核酸の1または数個の部分がD−核酸として存在し、核酸の少なくとも1または数個の部分がL−核酸であり得る。核酸の「一部分」という用語は、1ヌクレオチドのような小さいものを意味する。このような核酸は、一般に本明細書中でそれぞれD−およびL−核酸と呼ばれる。したがって、好ましい実施形態において、本発明による核酸は、L−ヌクレオチドからなり、少なくとも1つのD−ヌクレオチドを含む。好ましくは、このようなD−ヌクレオチドは、一続きの何れかおよび何れかの核酸の末端に連結される。

0144

L−核酸は、本明細書中で使用される場合、L−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にL−ヌクレオチドからなる核酸である。

0145

D−核酸は、本明細書中で使用される場合、D−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にD−ヌクレオチドからなる核酸である。

0146

また、別段の指示がない場合、何れのヌクレオチド配列も、本明細書中で5’→3’方向に示される。

0147

核酸が、D−ヌクレオチド、L−ヌクレオチドまたは、例えば無作為である両者の組み合わせまたは少なくとも1つのL−ヌクレオチドおよび少なくとも1つのD−核酸からなる一続きの定められた配列からなるか否かに関わりなく、核酸分子は、デスオキシリボヌクレオチド(desoxyribonucleotide)、リボヌクレオチドまたはそれらの組み合わせからなり得る。

0148

核酸が、D−ヌクレオチド、L−ヌクレオチド、これらの混合物、DNAまたはRNAまたはそれぞれおよび何らかのそれらの組み合わせであるか否かにかかわらず、核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、1本鎖核酸および2本鎖核酸も包含し、それにより好ましくは本発明による方法に供される場合の核酸分子は1本鎖核酸である。

0149

核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、修飾核酸も包含する。修飾核酸は、ヌクレオチド−修飾RNAまたはヌクレオチド−修飾DNA分子であり得、それにより、ヌクレアーゼ耐性基、例えば、2’−アミノ、2’−C−アリル、2’−フルオロ、2’−O−メチル、2’−H(概説についてはUsman & Cedergren,1992参照)での修飾により安定性を促進するために、RNAまたはDNA分子は個々のヌクレオチドにおいて大規模に修飾される。

0150

核酸という用語は、本明細書中で好ましく使用される場合、完全に閉じた核酸も包含する。核酸に対する、完全に閉じた、すなわち環状構造は、ヌクレオチド配列が本発明により決定されるべきである核酸が、好ましくは共有結合を通じて閉じている場合に認められ、それによって、より好ましくはこのような共有結合は、本明細書中で開示されるように、核酸分子配列の5’末端と3’末端との間で形成される。

0151

核酸という用語は、好ましく使用される場合、非核酸分子部分を含むあらゆる核酸分子も包含する。このような非核酸分子部分は、次でより詳細に概説するように、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、様々な基を含む群から選択され得る。したがって、核酸という用語は、少なくとも1つの核酸部分および、細胞など、生体系への核酸分子の送達を促進するために使用され得る少なくとも1つのさらなる部分を含む複合物および/または複合体も包含する。提供される複合物および複合体は、細胞膜を横切って治療化合物移送し、薬物動態を変化させ、および/または本発明の核酸の局在性を調節することによって治療活性を付与し得る。これらの種類の複合物および複合体は、好ましくは、細胞膜を横切る、低分子、脂質、リン脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸、抗体、毒素負電荷ポリマーおよび他のポリマー、例えばタンパク質、ペプチド、ホルモン、炭水化物、ポリエチレングリコールまたはポリアミンを含むがこれらに限定されない分子の送達に適切である。一般に、記載される輸送体は、分解性リンカーありまたはなしで、個別にまたは多構成要素系の一部としての何れかで使用されるように設計される。これらの化合物は、血清の存在下または非存在下で、異なる組織由来の多くの細胞タイプへの核酸分子の送達および/または局在を向上させると予想される(米国特許第US5,854,038号参照)。本明細書中に記載の分子の複合物は、生体分解性核酸リンカー分子など、生体分解性であるリンカーを介して生物学的活性分子に結合させ得る。

0152

配列を決定しようとする核酸に関する次の記述で詳述されるように、非核酸部分は、PEG部分、すなわちポリ(エチレングリコール)部分またはHES部分、すなわちヒドロキシエチルデンプン部分であり得る。

0153

直接的にまたはリンカーを通じて、の何れかで、非核酸部分および好ましくはPEGおよび/またはHES部分を核酸分子に結合させ得る。核酸分子が1以上の修飾、好ましくは1以上のPEGおよび/またはHES部分を含むことも本発明の範囲内である。実施形態において、個別のリンカー分子によって、複数のPEG部分またはHES部分が核酸分子に結合される。本発明に関連して使用されるリンカーは、それ自身、直鎖状または分岐状の何れかであり得る。これらの種類のリンカーは、当業者にとって公知であり、特許出願WO2005/074993およびWO2003/035665にさらに記載されている。

0154

好ましい実施形態において、リンカーは生体分解性リンカーである。生体分解性リンカーによって、とりわけ、動物の身体、核酸分子からの修飾物の放出ゆえに、好ましくはヒトの身体における、滞留時間に関して、核酸分子の特徴を改変することが可能となる。生体分解性リンカーの使用によって、核酸分子の滞留時間をより良好に制御できるようになり得る。このような生体分解性リンカーの好ましい実施形態は、国際特許出願WO2006/052790、WO2008/034122、WO2004/092191およびWO2005/099768に記載のものなどであるがそれらに限定されない生体分解性リンカーであり、したがって、国際特許出願WO2004/092191およびWO2005/099768において、リンカーは、本明細書中で記載のような1または2個の修飾物、核酸分子およびその間の生体分解性リンカーからなる、ポリマー性オリゴヌクレオチドプロドラッグの一部である。

0155

本明細書中で好ましく使用される場合、「ヌクレオチド」は、天然のDNAヌクレオシド一−、二−および三リン酸:デオキシアデノシン一−、二−および三リン酸;デオキシグアノシン一−、二−および三リン酸;デオキシチミジン一−、二−および三リン酸;およびデオキシシチジン一−、二−および三リン酸を含むがこれらに限定されない。(本明細書中で、それぞれdA、dG、dTおよびdCまたはA、G、TおよびCと呼ぶ。)。ヌクレオチドという用語はまた、天然のRNAヌクレオシド一−、二−および三リン酸:アデノシン一−、二−および三リン酸;グアニン一−、二−および三リン酸;ウリジン一−、二−および三リン酸;シチジン一−、二−および三リン酸(本明細書中でそれぞれA、G、UおよびCと呼ぶ。)も含み;核酸分子、すなわちDNA分子およびRNA分子単量体の単位である塩基−糖−リン酸の組み合わせを指す。しかし、言い換えると、「ヌクレオチド」という用語は、環状フラノシド型糖(RNA中のp−D/L−リボースおよびDNA中のP−D/L−2’−デオキシリボース)を含有する何らかの化合物を指し、これは、5’位置でリン酸化されており、−グリコシルC1’−N結合を介してC−1’糖位置に連結されるプリンまたはピリミジン型塩基の何れかを有する。ヌクレオチドは、とりわけ修飾塩基(例えば5−メチルシトシン)および修飾糖基(例えば2’−O−メチルリボシル、2’−O−メトキシエチルリボシル、2’−フルオロリボシル、2’−アミノリボシルなど)による修飾ヌクレオチドを有するヌクレオチドを含むマス修飾ヌクレオチドを含め、天然または合成であり得る。

0156

核酸塩基」という用語は、天然の核酸塩基アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)およびウラシル(U)ならびに非天然の核酸塩基、例えばキサンチンジアミノプリン、8−オキソ−N6−メチルアデニン、7−デアザキサンチン、7−デアザグアニン、N4,N4−エタノシトシン、N6,N6−エタノ−2,6−ジアミノプリン、5−メチルシトシン、5〜(C3−C6)−アルキニル−シトシン、5−フルオロウラシル5−ブロモウラシルシューイソシトシン、2−ヒドロキシ−5−メチル−4−トリアゾロピリジン、イソシトシン、イソグアニン、イノシンなど、およびFreier & Altmann(Freier & Altmann,1997)の刊行物における米国特許US5,432,272号に記載の「非天然の」核酸塩基を包含する。したがって、「核酸塩基」という用語は、既知のプリンおよびピリミジン複素環だけでなく、複素環類似体およびその互変異性体も含む。

0157

1本鎖核酸が個別および安定な三次元構造を形成し得、抗体のような標的分子に特異的に結合し得ることは本発明の範囲内である。D−ヌクレオチドから構成されるこのような核酸分子はアプタマーと呼ばれる。アプタマーは、いくつかの標的分子、例えば低分子、タンパク質、核酸に対して、および細胞、組織および生物に対しても同定され得、特異的な標的分子のインビトロおよび/またはインビボ機能を阻害し得る。アプタマーは通常、インビトロ選択と呼ばれる標的に対する選択過程または指数関数的進化によるリガンド系統的進化(Systematic Evolution of LigandsbyExponential Enrichment、略称SELEX)(Bockら、1992;Ellington & Szostak,1990;Tuerk & Gold,1990)によって同定される。主に、ヌクレアーゼ分解および腎臓による身体からのクリアランスゆえに、非修飾アプタマーは血量から迅速に排除され、半減期は分単位から時間単位であるが、これはアプタマーが本質的に低分子量であるからである。それゆえに、アプタマーを治療に使用するためには、糖の2’位(例えばリボース)骨格でこれらが修飾されねばならない(Burmesterら、2006)。

0158

アプタマーの不安定性の主因である偏在ヌクレアーゼは、キラル基本単位、すなわちL−アミノ酸からなる。結果的に、ヌクレアーゼの構造は、本質的にキラルでもあり、その結果、立体特異的な基質認識が起こる。それゆえに、これらの酵素は、適正なキラル立体配置の基質分子のみを受容する。アプタマーおよび天然の核酸分子はD−ヌクレオチドから構成されるので、L−オリゴヌクレオチドは、酵素的認識および続く分解から逃れるはずである。残念ながら、同じ原理ゆえに、この場合では、このような鏡像核酸を増幅するための酵素活性が自然には得られなかった。したがって、SELEX過程を使用して、L−核酸アプタマーを直接得ることができない。とはいえ、立体化学の原理から、所望の機能的L−核酸アプタマーへと最終的につながる迂回路が明らかとなる。

0159

インビトロで選択された(D−)アプタマーがその天然の標的に結合する場合、このアプタマーの構造鏡像は、天然標的の鏡像と同じ特徴により結合する。ここで、両相互作用パートナーは、同じ(非天然)キラリティーを有する。生命体および殆どの生化学的化合物ホモキラリティーゆえに、このようなエナンチオ−RNAリガンドは、当然ではあるが、実際の使用には制限がある。一方で、(非天然)鏡像標的に対してSELEX過程が行われる場合、この(非天然)標的を認識するアプタマーが得られる。このアプタマー−所望のL−アプタマーの対応する鏡像立体配置は、同様に天然標的を認識する。生体安定性核酸分子の生成のためのこの鏡像選択過程は、最初に1996年(Klussmannら、1996;Nolteら、1996)に公開され、これにより、ある標的分子に対する高い親和性および特異性だけでなく、同時に生体安定性も示す、機能性の鏡像核酸分子リガンドが生成される。1本鎖核酸分子が、「シュピーゲルマー」(ドイツ語の「Spiegel」鏡より)と呼ばれるこのようなリガンド−結合L−核酸であることは本発明の範囲内である(「The Aptamer Handbook」;eds.Klussmann,2006参照)。

0160

とりわけ、本発明による核酸は、好ましくは本発明による核酸の検出を可能にする修飾を含み得る。このような修飾は、好ましくは放射性、酵素性および蛍光標識を含む群から選択される。このような修飾はまた、それ自身、放射性、酵素性および蛍光標識を含む群から選択される修飾により修飾され得るD−ヌクレオチドからも選択される。

0161

本明細書中で使用される場合の、核酸、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質の様々な配列番号、化学的性質、その実際の配列および内部参照番号を次の表でまとめる。
表1(A)本願において参照される配列

0162

上記のものは、それらが本発明と関連して使用された場合、分子の代表であることを理解されたい。添付の配列リストは、単にアミノ酸またはそのヌクレオチド配列を反映するだけのものであり、上記の表で示されるようなその分子のさらなる特性を何ら反映するものではない。

0163

本発明は、さらなる特性、実施形態および長所が汲み取られ得る、図面、実施例および配列表によりさらに説明される。

図面の簡単な説明

0164

図1Aは、L−ポリメラーゼXの活性試験のための1−ギャップD−DNA鋳型の組成を示す。
図1Bは、L−ポリメラーゼXの活性試験のための6−ギャップD−DNA鋳型の組成を示す。
図2A−Bは、UPLC(A)および質量分析(B)による、合成D−ポリペプチド生成物Ac−MLTIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSL−OGp(1)の分析を示す。
図3A−Bは、UPLC(A)および質量分析(B)による、合成D−ポリペプチド生成物H−RREEKLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA−SMe(2)の分析を示す。
図4A−Bは、UPLC(A)および質量分析(B)による、合成D−ポリペプチド生成物H‐CGERCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELGFTYRIPKKRL−OH(3)の分析を示す。
図5A−Bは、UPLC(A)および質量分析(B)による、合成D−ポリペプチド生成物Ac−MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA−SMe(4)の分析を示す。
図6A−Bは、SDS−PAGE(A)および質量分析(B)による、ネイティブ化学ライゲーションD−ポリペプチド生成物Ac−MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKACGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELGFTYRIPKKRL−OH(5)の分析を示す。
図7は、D−ポリメラーゼXの活性試験のための1−ギャップL−DNA鋳型の組成を示す。
図8は、1−ギャップ基質におけるD−ポリメラーゼXのL−DNA伸長活性アッセイゲル電気泳動を示す。
図9Aは、D−ポリメラーゼXの活性試験のための6−ギャップL−DNA鋳型の組成を示す。
図9Bは、6−ギャップ基質におけるD−ポリメラーゼXのL−DNA伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
図10Aは、L−ポリメラーゼXの活性アッセイのためのプライマー−鋳型複合D−DNA基質を示す。
図10Bは、一定温度で行われたL−ポリメラーゼXのD−DNA伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
図10Cは、温度サイクリング用いて行われたL−ポリメラーゼXのD−DNA伸長活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
図11A−Bは、SDS−PAGE(A)およびLC−ESI質量分析(B)による合成全−L−ポリメラーゼdpo4変異体A155Cの分析を示す。
図12Aは、L−ポリメラーゼdpo4変異体A155C、V203C、C31SおよびA155C/V203CのD−DNAPCR活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
図12Bは、組み換えおよび合成L−ポリメラーゼdpo4のD−DNA PCR活性アッセイのゲル電気泳動を示す。
図13は、質量分析による合成D−ポリペプチド生成物H−RTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2(1)の分析を示す。
図14は、質量分析による合成D−ポリペプチド生成物Boc−VDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRG−OH(2)の分析を示す。
図15は、質量分析による断片縮合D−ポリペプチド生成物H−VDTLSIEFDKLKGMIGEAKAKYLISLARDEYNEPIRTRVRKSIGRIVTMKRNSRNLEEIKPYLFRAIEESYYKLDKRIPKAIHVVAVTEDLDIVSRGRTFPHGISKETAYSESVKLLQKILEEDERKIRRIGVRFSKFIEAIGLDKFFDT−NH2(3)の分析を示す。
図16A−Bは、RP−HPLC(A)および質量分析(B)による合成D−ポリペプチド生成物Z−CDMAKPNGIKVIDDEVKRLIRELDIADVPGIGNITAEKLKKLGINKL−ベンジル−チオエステル(4)の分析を示す。
図17A−Bは、UPLC(A)および質量分析(B)による合成D−ポリペプチド生成物H−RKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA−SMe(7)の分析を示す。
図18A−Bは、UPLC(A)および質量分析(B)による合成D−ポリペプチド生成物Ac−MIVLFDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPM−OGp(6)の分析を示す。
図19A−Bは、SDS−PAGE(A)およびESI質量分析(B)によるクロストリパインが介在するD−ポリペプチドライゲーション生成物Ac‐MIVLFVDFDYFYAQVEEVLNPSLKGKPVVVCVFSGRFEDSGAVATANYEARKFGVKAGIPIVEAKKILPNAVYLPMRKEVYQQVSSRIMNLLREYSEKIEIASIDEAYLDISDKVRDYREAYNLGLEIKNKILEKEKITVTVGISKNKVFAKIA−SMe(8)の分析を示す。
図20A−Bは、SDS−PAGE(A)およびLC−ESI質量分析(B)による、全−L−ポリメラーゼdpo4断片155−352(V203C)のネイティブ化学ライゲーション生成物の分析を示す。

0165

(実施例)
実施例で使用される場合の略語
ACNアセトニトリル(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
DCMジクロロメタン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
DIPEA N,N−ジイソプロピルアミン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
EDT(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
Fmoc 9−フルオレニルメトキシカルボニル
HATU (2−(7−アザ−1H−ベンゾトリアゾール−1−イル)−1,1,3,3−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート)(CreoSalus,Louisville KY,USA)
HFIP 1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロホスフェート(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
HPLC高速液体クロマトグラフィー高圧液体クロマトグラフィーと呼ばれることもある。)
MeImメチルイミダゾール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
MeOHメタノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
MSNT1−(メシチレン−2−スルホニル)−3−ニトロ−1,2,4−トリアゾール(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)
NMP N−メチル−ピロリドン(Iris Biotech GmbH,Marktredwitz,Deutschland)
PyBOP(ベンゾトリアゾール−1−イルオキシトリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート(Merck KGAA,DARMSTADT,GERMANY)
SDSドデシル硫酸ナトリウム(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
BTU O−(ベンゾトリアゾール−1−イル)−N,N,N’,N’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート(Merck KGaA,Darmstadt,Germany)
tBu (tert.−ブチル−)
TFAトリフルオロ酢酸(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TFE 1,1,1−トリフルオロエタノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
THF(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TIS(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
TLC薄層クロマトグラフィー
Tris トリス(ヒドロキシメチルアミノメタン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)
UPLC超高速液体クロマトグラフィー

0166

(実施例1)−ポリメラーゼXの野生型および変異体の組み換え発現および精製
アフリカブタ熱ウイルス(略称ASFV)からのポリメラーゼXは、1997年にOliverosらにより記載され、特徴が調べられた。ポリメラーゼXの野生型遺伝子は、開始コドンおよび終止コドンを含む、僅か525塩基対オープンリーディングフレーム(略称ORF)を有する(Oliverosら、1997)。コードされるタンパク質の長さは僅か174アミノ酸である。この例は、どのようにポリメラーゼXならびにそれらの変異体がE.コリ(E.coli)で発現され、His6−Tagを用いて精製されたかを説明する。

0167

1.1発現コンストラクト
ASFVのコドン使用はE.コリ(E.coli)と異なるので、ポリメラーゼXに対するE.コリ(E.coli)−コドン最適化合成遺伝子をGeneArt AG(Regensburg,Germany)から購入した。本合成遺伝子配列は、pCR4−Blunt−TOPOベクター(元の会社:Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中で提供された。開始コドンおよび2つの終止コドンを含むコドン最適化オープンリーディングフレームは、次の配列:ATGCTGACCCTGATTCAGGGCAAAAAAATCGTGAACCATCTGCGTAGCCGTCTGGCCTTTGAATATAACGGCCAGCTGATTAAAATTCTGAGCAAAAACATTGTGGCGGTGGGCAGCCTGCGTCGTGAAGAAAAAATGCTGAACGATGTGGATCTGCTGATTATTGTGCCGGAAAAAAAACTGCTGAAACATGTGCTGCCGAACATTCGTATTAAAGGCCTGAGCTTTAGCGTGAAAGTGTGCGGCGAACGTAAATGCGTGCTGTTTATCGAATGGGAAAAAAAAACCTACCAGCTGGACCTGTTTACCGCGCTGGCCGAAGAAAAACCGTATGCGATCTTTCATTTTACCGGTCCGGTGAGCTATCTGATTCGTATTCGTGCGGCGCTGAAAAAAAAAAACTACAAACTGAACCAGTATGGCCTGTTTAAAAACCAGACCCTGGTGCCGCTGAAAATTACCACCGAAAAAGAACTGATTAAAGAACTGGGCTTTACCTATCGCATTCCGAAAAAACGCCTGTAATAAを有した。

0168

全−LポリメラーゼXとも呼ばれるポリメラーゼXに対する発現コンストラクトを得るために、BamHIおよびPstIによってポリメラーゼXの遺伝子をpCR4−Blunt−TOPOから切り出し、pRSET−Aベクター(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)中でサブクローニングした。付加したHis6−TagをN−末端にサブクローニングし、この遺伝子をT7プロモーターの調節下に置いた。コンストラクトをpMJ14と名付け、E.コリ(E.coli)での全−LポリメラーゼXの発現のために使用した。pMJ14から発現されたタンパク質ポリメラーゼXは210個のアミノ酸の次の配列:MRGSHHHHHHGMASMTGGQQMGRDLYDDDDKDRWGSMLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKVCGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELGFTYRIPKKRLを有した。

0169

最初の36個のアミノ酸は、数個のスペーサーアミノ酸およびいくつかの他の配列タグを含むHis6−Tagに相当した(T7遺伝子10リーダー、抗発現エピトープ)。最後の174個のアミノ酸部分は、ASFVで見られるようなポリメラーゼXタンパク質配列と同一であった。

0170

製造者プロトコールに従い、市販のQuikChangeキット(Stratagene GmbH,Waldbronn,Germany)を用いて、全−LポリメラーゼXの変異体に対する発現コンストラクトを作製した。プラスミドpMJ14を鋳型とした。QuikChangeに必要なオリゴヌクレオチドは、NOXXONの施設で合成したか(QC10_up、QC10_low)、またはPurimex(Grebenstein,Germany)から購入したか(QC26_up、QC26_low、QC27_up、QC27_low、QC31_up、QC31_low)の何れかであった。次の変異体発現コンストラクトを作製し、E.コリ(E.coli)での全−Lポリメラーゼの変異体の発現のために使用した。

0171

1.2 E.コリ(E.coli)におけるタンパク質発現
発現コンストラクトpMJ14を用いてE.コリ(E.coli)で全−L−ポリメラーゼXを発現させた。pMJ130、pMJ356、pMJ357またはpMJ412から全−L−ポリメラーゼXの変異体を発現させた。発現のために、コンピーテントE.コリ(E.coli)株の「BL−21(DE3)pLysS’」(Novagen/VWR、Dresden,Germany)において適切な発現コンストラクトを形質転換し、抗生物質アンピシリンを用いて維持した。600nmでの光学密度がおよそ0.6に到達するまで、2YT培地中で培養物を37℃で増殖させた。次いで、0.4mMの最終濃度まで、イソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(略称IPTG)を添加することによって、タンパク質発現を誘導した。30℃で発現を4時間行った。遠心によって細胞を回収し、−80℃で保存するか、またはすぐに処理した。

0172

1.3タンパク質精製
「溶解および結合(lyse and bind)緩衝液」(50mM Na−リン酸、pH7.5、500mM NaCl、40mMイミダゾール)中、新鮮または凍結E.コリ(E.coli)細胞を上で再懸濁し、「フレンチプレス」(G.Heinemann,Schwabisch Gmund,Germany)細胞破壊装置を用いて溶解させた。「Ni−NTA Superflow」材料(Qiagen、Hilden,Germany)を用いて4℃で精製を行った。溶出緩衝液(50mM Na−リン酸、pH7.5、500mM NaCl、200mMイミダゾール)を用いて、段階溶出を行った。SDS−PAGE(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用いて分画を分析し、プールし、必要に応じて「Q Sepharose fast flow」材料(GE healthcare,Freiburg,Germany)を用いて「AKTA purifier」システム上で陰イオンイオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。MALDI質量分析によってタンパク質同一性を確認し、的確な分画をプールし、濃縮し、再緩衝化した。25mM Na−リン酸、pH7.5、250mM NaCl、50%グリセロールからなる緩衝液中で精製タンパク質を−20℃で保存した。ウシ血清アルブミン(略称BSA)標準物質を用いてBCA−タンパク質アッセイ(Pierce/Perbio Science,Bonn,Germany)によってタンパク質濃度を評価した。

0173

実施例2−ポリメラーゼXおよびポリメラーゼXの変異体の活性確認
オリゴヌクレオチドにより形成される様々なタイプの基質複合体を用いて、全−L−ポリメラーゼXおよび全−L−ポリメラーゼXの変異体(実施例1参照)に対する活性アッセイを行ったが、この基質およびオリゴヌクレオチドはD−DNA−ヌクレオチドからなる。

0174

2.1 1−ヌクレオチドギャップを有する基質における活性アッセイ
1−ギャップ基質に対するオリゴヌクレオチドのリスト

0175

33個のヌクレオチドからなるDNAオリゴヌクレオチドの鋳型鎖(下鎖(lower strand)とも呼ばれる。)をそれぞれ15および17個のヌクレオチドからなる2つの異なるDNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それぞれその5’−末端および3’末端で鋳型鎖とハイブリッド形成させ、その結果、上鎖(upper strand)において1つのヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質複合体を作製した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でA、C、GまたはTの何れかを含有した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、15個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドSP−1をその5’−末端で32Pにより放射性標識した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中でアニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare)での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。

0176

活性アッセイにおいて、全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体をD−立体配置1−ギャップ基質複合体と合わせた(図1A参照)。陰性対照として、各基質を全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体およびD−デスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(dNTP’s)なしでも温置した。1−ギャップ複合体内の鋳型塩基によって、アッセイ中に対応するD−dNTPのみを添加した。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.7ng/μL L−全−L−ポリメラーゼXまたはそれらの変異体、8μMの1つのD−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。Rovalab(Teltow,Germany)からD−dNTPを購入した。温置時間は、37℃で30分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、4時間分離した。このゲルをKodak Kスクリーンに−80℃で一晩曝露し、BioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。

0177

全−L−ポリメラーゼXおよび変異体I124G、V80AおよびV80Gは、これらの条件下で活性があり、2本の上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチド間の1つのヌクレオチドギャップが充填された。

0178

2.2 6−ヌクレオチドギャップを有する基質における活性アッセイ
6−ギャップ基質に対するオリゴヌクレオチドのリスト:

0179

33個のヌクレオチドからなるDNAオリゴヌクレオチドの鋳型鎖(下鎖(lower strand)と呼ばれる。)をそれぞれ15および12個のヌクレオチドからなる2つの異なるDNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、それぞれその5’−末端および3’末端で鋳型鎖とハイブリッド形成させ、その結果、上鎖(upper strand)の6個のヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質複合体を作製した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、15個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドSP−1をその5’−末端で32Pにより放射性標識した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中でアニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。

0180

活性アッセイにおいて、全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体をD−立体配置6−ギャップ基質複合体と合わせた(図1B)。陰性対照として、基質を全−L−ポリメラーゼXまたはそれらの変異体およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸塩(D-dNTP’s)なしでも温置した。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−L−ポリメラーゼXまたはそれらの変異体、8μMの各D−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。Rovalab(Teltow,Germany)からD−dNTPを購入した。典型的な温置時間は、37℃で30分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、4時間分離した。このゲルをKodak Kスクリーンに−80℃で一晩曝露し、BioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。

0181

全−L−ポリメラーゼXおよび変異体(C86Sを除く。)はこれらの条件下で活性があり、2本の上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチド間の6ヌクレオチドギャップが充填された。

0182

実施例3−D−アミノ酸からなるポリメラーゼPolXの変異体の合成

0183

本実施例内で、全−DポリメラーゼX変異体V80Aの合成を記載する。全−DポリメラーゼX変異体V80Aのアミノ酸配列は、Ac−MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKACGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELGFTYRIPKKRL−OHであった。

0184

固相ペプチド合成Fmoc/tBu−ストラテジーの必須要件に従い(Eric Athertonら、1981)使用する全アミノ酸を保護する。使用される全アミノ酸がD−アミノ酸である(Bachem,Bubendorf,Switzerland)。

0185

3.1 HO−Gp(Boc)2の合成
Sekizakiら(Sekizakiら、1996)と同様に、tert−ブチルオキシカルボニル−保護4−グアニジノフェノールを合成した。これに従い、40mmole N,N’−Bis−(tert−ブチルオキシカルボニル)−S−メチルイソチオウレア(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)および60mmole 4−アミノフェノール(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)を500mL丸底フラスコ中、250mL THF中で溶解させた。この後、溶液にアルゴンを10分間吹き付け、CaCl2チューブ密封しながら120時間撹拌し続けた。

0186

溶媒蒸発させた後、氷冷メタノールを用いて残渣を沈殿させた。P4O10上で沈殿物真空下で乾燥させた。最後に、DCMとともにフラッシュクロマトグラフィーを用いて生成物を精製した。生成物含有分画を合わせ、溶媒を減圧下で蒸発させた。TLC、逆相HPLC、質量分析およびNMRを分析のために使用した。実験により決定された質量は、351Daの計算質量に対応する。

0187

3.2 H−D−Leu−OGp(Boc)2の合成
1mmole Z−D−Leu−OH(Bachem,Bubendorf,Switzerland)、0.9eq.TBTUおよび0.9eq.HO−Gp(Boc)2を10mLDMF中で溶解させた。2eq.DIPEAの添加後、溶液を2時間撹拌した。溶媒を蒸発させた後、DCMを用いて粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーで精製した。Z−D−Leu−OGp(Boc)2の純粋な分画を合わせ、溶媒を蒸発させた。

0188

Z−D−Leu−OGp(Boc)2を10mL MeOH中で溶解させ、アルゴンを吹き付けた。2時間で、Pd/C触媒およびH2の添加によって、N末端Z−基の加水分解性切断を達成した。H−D−Leu−OGp(Boc)2をろ別した後、MeOHを減圧下で蒸発させた。逆相HPLCおよび質量分析を用いて分析を行った。生成物に対する465Daの正確な質量が見いだされ、計算質量と対応した。

0189

3.3 全−D−ペプチドAcMLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSL−OGp(1)の合成
Barlosら(Barlosら、1989)により記載のように、0.10mmole TentaGel−R−Tritylレジン(Rapp Polymere,Tubingen,Deutschland)をFmoc−D−Ser(tBu)−OH(Bachem,Bubendorf,Switzerland)とともに載せた。したがって、0.10mmolレジンを0.6mmole塩化チオニルとともに、30分間、2回温置し、その後DCMで洗浄した。この後、6mL DCM中で、0.6mmole Fmoc−D−Ser(tBu)−OH、2.4mmolDIPEとともに90分間レジンを温置した。その後、DCM中の10%MeOH(v/v)、10%DIPEA(v/v)の溶液を用いて、レジンを10分間、3回ブロッキング処理し、DCMで洗浄した。FASTmocプロトコールとともにABI433(Applied Biosystems,FosterCity,USA)を用いて、自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジン(Sigma−Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Deutschland)を用いてFmoc−脱保護化を7分間、3回行った。

0190

2時間にわたり、10mLのDCM中30%(v/v)HFIP中でぺプチジルレジンを2回温置することによって、完全保護化ペプチド酸の切断を達成した。ペプチドをろ別した後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドを単離し、乾燥させた。

0191

6mL NMP中で、0.01mmole完全保護化ペプチド、4eq.PyBOPおよび5eq.H−D−Leu−OGp(Boc)2を溶解させた。10eq.DIPEAの添加後、混合物を4時間撹拌した。この後、溶媒を還元気化(reduced evaporated)させ、氷冷ジエチルエーテルによって残渣を沈殿させた。沈殿ペプチドエステルを乾燥させ、その後、2時間にわたり、TFA中、2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて保護基を切り離した。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルを用いてペプチドを沈殿させた。ACN/水勾配を用いて、C18カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)上でペプチドエステルの逆相HPLC精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。

0192

HPLC/UPLC(図2A)および質量分析(図2B)によって最終生成物の特徴を調べた。4654,7Daの生成物に対する測定質量は、4652,7Daの理論質量と一致した。

0193

3.4 全−D−ペプチドH−RREEKLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA−SMe(2)の合成
6mL NMP中で45分間にわたり、5eq.アミノ酸、eq.4.9eq.HATUおよび10eq.DIPEAを用いて、Fmoc−D−Ala−OHを0.10mmole TentaGel−R−NH2レジン(Rapp Polymere,Tubingen,Deutschland)に充填した。その後に、レジンをTHFで洗浄した。80℃で2時間、THF中の4eq.Lawesson試薬と温置することによって、Fmoc−D−Ala−Ψ[CS−NH]−R−TentaGelへの変換を達成した。この後、レジンをNMPで洗浄した。その後、既に記載のとおり(実施例1.3参照)、そのように調製したレジンを自動化ペプチド合成において使用した。この後、Sharmaら(Sharmaら、2011)に従い、DMF中ヨウ化メチルと一晩温置することによって、対応するチオエステルを生成させた。レジンのろ過後、ペプチドチオエステルを含有する溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。TFA中2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて2時間にわたり、側鎖保護基の切断を行った。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルでペプチドを沈殿させた。ACN/水勾配を用いて、C18カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)上でペプチドチオエステルの逆相HPLC精製を行った。生成物を含有する分画を合わせ、凍結乾燥させた。

0194

HPLC/UPLC(図3A)および質量分析(図3B)によって最終生成物の特徴を調べた。生成物に対して実験により決定された質量(4683,8Da)は、4681,7Daの理論値と一致する。

0195

3.5 全−D−ペプチドH−CGERKCVLFIEWEKKTYQLDLFTALAEEKPYAIFHFTGPVSYLIRIRAALKKKNYKLNQYGLFKNQTLVPLKITTEKELIKELGFTYRIPKKRL−OH(3)の合成
DCM中6eq.アミノ酸、6eq.MSNTおよび4.5eq MeImを用いて、0.10mmole TentaGel−R−PHBレジン(Rapp Polymere,Tubingen,Deutschland)にFmoc−D−Leu−OHを充填した。FASTmocプロトコールとともにABI433を用いて自動化合成を行った。NMP中9eq.HATUおよび20eq.DIPEAを用いて10eq.アミノ酸を活性化した。カップリング時間は45分間であり、NMP中20%(v/v)ピペリジンを用いて7分間にわたりFmoc−脱保護化を3回行った。42アミノ酸後、二重カップリング段階を行った。TFA中2.5%EDT、2.5%水、2.5%TISを用いて2時間にわたり、N末端Fmoc−保護化ペプチドの切断を達成した。TFAの蒸発後、氷冷ジエチルエーテルによりペプチドを沈殿させた。C18カラム上でACN/水勾配を用いて、粗製N末端保護化ペプチドの逆相HPLC精製を行った。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。その後、Fmoc−保護化ペプチドを溶解させ、N末端Fmoc−基を切り離すために、DMF中20%ピペリン中で撹拌した。20分後、溶媒を蒸発させ、氷冷ジエチルエーテルを用いて残渣を沈殿させた。その後に、ACN/水勾配とともにC18カラムにより逆相HPLCを用いて、沈殿粗製ペプチドを精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。

0196

HPLC/UPLC(図4A)および質量分析(図4B)によって最終生成物の特徴を調べた。生成物の決定質量(11184,3Da)は、11178,2Daの理論質量と一致する。

0197

3.6ペプチド2とのペプチド1のプロテアーゼ触媒ライゲーションによる、全−D−ペプチドAc−MLTLIQGKKIVNHLRSRLAFEYNGQLIKILSKNIVAVGSLRREEKMLNDVDLLIIVPEKKLLKHVLPNIRIKGLSFSVKA−SMe(4)の合成
2%TritonX100(Sigma Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Germany)を含有するリン酸ナトリウム緩衝液(100mM、pH8.5、100mM NaCl入り)中で、ペプチド1を0.2mMに、ペプチド2を0.6mMに溶解させた。20μMクロストリパイン(Endoprotease Arg−C,Worthington Biochemical Corporation,Lakewood,N.J.,USA)の添加後、反応混合物を37℃で一晩振盪した。沈殿ペプチドを遠心し、H20/ACN/ギ酸60/40/0.5中で溶解させ、30分内の30%から60%の水中ACNの勾配でRP−18−カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)を用いて、逆相HPLCによって精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。

0198

逆相UPLC(図5A)およびESI−質量分析(図5B)によって最終ペプチドを分析した。理論分子量(Mtheor=9199.3Da)は、実測分子量(Mobs=9199.4Da)と一致する。

0199

3.7ペプチド3とのペプチド4のネイティブ化学ライゲーションによる全−DポリメラーゼX変異体V80Aの合成

0200

6MグアニジンHCl(Sigma Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Germany)、200mMメルカプトフェニル酢酸(Sigma Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Germany)および5mm Tris(2−カルボキシエチルホスフィン塩酸塩(Sigma Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Germany)を含有するTRIS−緩衝液(pH8.6)中でペプチド3および4の両方を0.2M溶解させた。反応混合物を室温で72時間振盪した。その後、30分内で30%から60%の水中ACNの勾配でRP−8−カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)を用いて、逆相HPLCによって混合物を精製した。ライゲーション生成物を含有した分画をプールし、乾燥させた。乾燥粉末を水中で溶解させ、溶出液としてのリン酸ナトリウム緩衝液(Sigma Aldrich Chemie GmbH,Schnelldorf,Germany)(50mM、pH6.8、0.5%SDS)とともにSEC3000−カラム(Phenomenex,Aschaffenburg,Germany)を用いて、サイズ排除クロマトグラフィーにより精製した。生成物含有分画を合わせ、凍結乾燥させた。

0201

最終生成物をSDS−PAGE(図6A)およびESI−質量分析(図6B)により分析した。レーン7で14.4kDaと21.5kDaとの間で明確なバンドが見られ、このことから、純粋な全長ポリメラーゼが示唆された。理論分子量(Mtheor=20342Da)は、ESI−MSにより示されるような実測分子量(Mobs=20361Da)と一致する。

0202

実施例4−D−アミノ酸からなる合成ポリメラーゼX変異体の活性確認
6Mグアニジウム塩酸塩中で実施例3による乾燥全−DポリメラーゼX変異体V80Aを溶解させ、3,500分子量カットオフの市販の透析装置(Pierce/PerBio,Bonn,Germany)中での段階的な透析によって4℃で再折り畳みを行った。最終緩衝液は、50mMリン酸ナトリウム、500mM塩化ナトリウム、pH7.5であった。プレキャストゲル(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)上で標準的な一連の既知のタンパク質濃度を用いてドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を行い、続いてSYPRO−RED染色(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)およびBioRad Fxスキャナー機器上での密度バンド分析を行うことによってタンパク質濃度を推定した。

0203

2種類の異なる基質タイプを用いて、全−DポリメラーゼX変異体V80Aに対する活性アッセイを行った。

0204

4.1 1−ヌクレオチドギャップがある基質における活性アッセイ
33マー下鎖(lower strand)DNAオリゴヌクレオチドを2本の17マー上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果、上鎖(upper strand)で1ヌクレオチドギャップを生じさせることによって、基質を作製した。L−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(Gamma−32P−ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的キナーゼ反応によって、32Pにより17マーの上鎖(upper strand)オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDをその5’−末端で放射性標識した。L−オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に、2つのD−立体配置グアノシン塩基を5’末端に付加した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中でアニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)上での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。この複合体は、ギャップ内の鋳型位置でA、C、GまたはTの何れかを含有した。基質複合体の仕組みについては、図7参照。

0205

活性アッセイにおいて、合成全−DポリメラーゼX変異体V80AをL−立体配置1−ギャップ基質複合体と合わせた。陰性対照として、各基質を全−DポリメラーゼX変異体V80AおよびL−デスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(dNTP’s)なしでも温置した。1−ギャップ複合体内の鋳型塩基に依存して、アッセイ中に対応するL−dNTPのみが付加された。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.7ng/μL全−DポリメラーゼX変異体V80A、8μMの1つのL−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。L−dNTPをRasayan,Inc.(Encinitas,CA,USA)によるカスタム合成として購入した。温置時間は37℃で30分間であった。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、4時間分離した。ゲルを−80℃で一晩Kodak Kスクリーンに曝露し、BioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。

0206

図8から見られ得るように、全−DポリメラーゼX変異体V80Aにより、L−DNA1−ギャップ基質上で伸長生成物がもたらされ、したがって、合成タンパク質の活性を確認した。特すべきことに、L−基質およびL−dNTPと組み合わせた全−DポリメラーゼX変異体V80Aのみが何らかの伸長生成物をもたらした。また、それらの鋳型塩基に対応するL−dNTPを含有する試料のみが伸長生成物をもたらした。これは、A−複合体上でのdTTPヌクレオチド、C−複合体でのdGTPヌクレオチド、G−複合体でのdCTPヌクレオチドおよびT−複合体でのdATPヌクレオチドが何らかの伸長生成物を与えるために存在しなければならなかったことを意味する。

0207

4.2 6−ヌクレオチドギャップがある基質における活性アッセイ
33マー下鎖(lower strand)DNAオリゴヌクレオチドを2つの17マーおよび12−マー上鎖(upper strand)DNAオリゴヌクレオチドとアニーリングさせ、その結果上鎖(upper strand)において6ヌクレオチドのギャップを生じさせることによって、基質を作製した。L−立体配置でオリゴヌクレオチドを合成した。アニーリング前に、Gamma−32P−アデノシン−三リン酸(ATP)およびT4ポリヌクレオチドキナーゼを用いた標準的なキナーゼ反応によって、17マー上鎖(upper strand)オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MD(L−立体配置)をその5’−末端で32Pにより放射性標識した。L−オリゴヌクレオチドMJ_1_58_MDのキナーゼ反応を促進するために、オリゴヌクレオチド合成中に2つのD−立体配置グアノシン塩基を5’末端に付加した。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中で、アニーリングを行った。NAP−カラム(GE healthcare,Freiburg,Germany)上での精製によって、組み込まれなかったgamma−32P−ATPを除去した。基質複合体の仕組みについては、図9Aを参照。

0208

活性アッセイにおいて、合成全−DポリメラーゼX変異体V80AをL−立体配置6−ギャップ基質複合体と合わせた。陰性対照として、基質を全−DポリメラーゼX変異体V80Aおよびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(L−dNTP)なしでも温置した。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−DポリメラーゼX変異体V80A、8μMの各L−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。Rasayan,Inc.(Encinitas,CA,USA)によるカスタム合成としてL−dNTPを購入した。典型的な温置時間は37℃で30分間であったが、そのバッチの活性に依存して、より長時間、温置を行った。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性配列決定ゲル上に載せ、4時間分離した。ゲルを−80℃で一晩、Kodak Kスクリーンに曝露し、BioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。

0209

図9Bから見られ得るように、合成全−DポリメラーゼX変異体V80Aにより、L−DNA6−ギャップ基質上でN+6伸長生成物がもたらされ、したがって、合成タンパク質の活性を確認した。しかし、N+6伸長生成物の合成は、同じ6−ギャップ複合体上でのN+1伸長生成物よりも明確ではなかった。また、6−ギャップを充填するために温置時間の延長が必要であった。特筆すべきことに、何らかの伸長生成物を与えたのは、L−基質+L−dNTPと合わせた全−DポリメラーゼX変異体V80Aのみであった。

0210

実施例5−ポリメラーゼXおよびポリメラーゼXの変異体によるDNA合成
アフリカブタ熱ウイルス(略称ASFV)からのポリメラーゼXは、ギャップ修復機能がある非常に離散性の高い酵素として文献(Oliveros,1997)に記載されている。実施例2で示されるように、全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体は、ギャップのある基質上でのそれぞれの開始後、非常に僅かなヌクレオチドのみの組み込みを触媒することが示された。ここで、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXおよび変異体を用いてより長いDNAを合成することを可能にする方法を開示し、83マー鎖の完全な重合化を示す。

0211

5.1プライマー−鋳型基質
全−L−ポリメラーゼXおよびそれらの変異体の活性を試験するために、プライマー−鋳型複合体を使用した。全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GおよびV80Aを試験するためにも同じ複合体を使用した。

0212

gapのないプライマー−鋳型複合体に対するD−オリゴヌクレオチドのリスト:

0213

19個のヌクレオチドからなるDNAオリゴヌクレオチドと83個のヌクレオチドからなる鋳型鎖DNAオリゴヌクレオチド(MJ_1_1_DD)をアニーリングさせることによって、基質を作製した。NOXXONでオリゴヌクレオチドを合成した。オリゴヌクレオチドMJ_1_33_DDは、蛍光色素Atto−532(AttoTec,Siegen,Germany)を有する。65℃で10分間加熱し、ゆっくりと冷却することによって、10mM Tris−HCl、5mM MgCl2、pH8.0中でアニーリングを行った。プライマー−鋳型複合体を図10Aで示す。

0214

5.2 一定温度での反応
活性アッセイにおいて、全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GまたはV80AをD−立体配置プライマー−鋳型複合体と合わせた。典型的な6μLアッセイは、50nM基質複合体、1.3ng/μL以下の全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GもしくはV80A、8μMの各D−dNTPおよび緩衝液(50mM Tris−HCl、10mM MgCl2、4%グリセロール、0.1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)、pH7.5)を含有した。Rovalab(Teltow,Germany)からD−dNTPを購入した。Pol−X試料に対して、温置時間は37℃で30分間であった。陰性対照として、基質を全−L−ポリメラーゼXまたは全−L−ポリメラーゼXの変異体V80GもしくはV80Aなし、およびデスオキシ−ヌクレオチド−三リン酸(D−dNTP)なしでも温置した。製造者により供給されたTaq緩衝液中0.083U/μLの最終濃度でTaqポリメラーゼ(Invitrogen,Karlsruhe,Germany)を用いて陽性対照を遂行した。Taq試料を60℃で30分間温置した。アッセイ体積全体を試料緩衝液/色素と混合し、変性ゲル上で分離した。ゲルをBioRad Fxホスホイメージャーシステムを用いて読み取った。

0215

全−L−ポリメラーゼXまたは変異体V80GまたはV80A全−L−ポリメラーゼXは、活性があったが、全長83マー鋳型の重合化を完遂することはできなかった。Taqポリメラーゼ陽性対照は、83マー鋳型の完全な重合化を示し、図10Bを参照のこと。

0216

5.3温度サイクリング条件下での反応
開始後の全−L−ポリメラーゼXが僅か1個のヌクレオチドの組み込みを触媒し、次いでDNA基質上に留まりながら停止するという仮定のもと、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXが鋳型から解離し、鋳型に再会合できるように、加熱パルス(50℃、2分間)を繰り返し行った。この温度サイクリング手順を繰り返して、発明者らは、全−L−ポリメラーゼXを用いて、83マーの完全な重合化を行うことができた。全−L−ポリメラーゼX試料に対する温度プロファイルを次のように行ったことを除き、一定温度に対して上に記載のように反応および対照を設定した:
5から25サイクルの(20℃で30分間//50℃で2分間)
次いで20℃で30分間の最終段階

0217

15サイクルを超えてから、全−L−ポリメラーゼXは、陽性対照と同様に、全長83マー鋳型鎖を重合化することができたことが観察されたが、図10Cを参照のこと。

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