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技術 二重特異性を有する融合タンパク質産生のための共有結合したホモ二量体化モジュールとしてのIgMおよびIgE重鎖ドメイン2

出願人 ウニヴェルズィテートシュトゥットガルト
発明者 ローラント・コンテルマンオリヴァー・ザイフェルトアリーネ・プラッパート
出願日 2013年4月16日 (6年6ヶ月経過) 出願番号 2015-506119
公開日 2015年5月21日 (4年4ヶ月経過) 公開番号 2015-514405
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 動物,微生物物質含有医薬 ペプチド又は蛋白質 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 固形添加物 延長モジュール モジュラーシステム 融合モジュール マルコフ確率場 自給自足 アンカー点 自己完結型
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年5月21日)のものです。
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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、IgMまたはIgEからの重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むポリペプチド、それらの複合体および治療および予防のためのそれらの使用を提供する。

概要

背景

背景
抗体、サイトカインおよび増殖因子のような治療用タンパク質ホモ二量体化モジュールへの融合は、一般的に、結合価の増加による効果の改善だけでなく、薬物動態特性の改善も示す二価分子を産生する(Deyev & Lebedenkov, 2008; Cuesta et al., 2010; Kontermann, 2010)。さらに、2個の異なるエフェクター分子の組み合わせは、二重特異性を有する分子の産生を可能にする。このような多価分子は、二重特異性抗体を使用するまたはエフェクター分子と抗体部分から成る二機能性分子を使用する二重標的化手法に適用できる(Mueller & Kontermann, 2010; Schrama et al., 2006; Deckert, 2009)。種々のホモ二量体化および多量体化モジュールが確立されており、免疫グロブリンFc領域ならびにCH3およびCκドメインだけでなく(Jazayeri & Carroll, 2008; Hu et al., 1996; Giersberg et al., 2011)、例えばストレプトアビジン、p53、ウテログロビンテネイシンおよびコラーゲン由来の、他のタンパク質ドメインおよびペプチドも含む(Ventura et al., 2009; Duebel et al., 1995; Pack & Plueckthun, 1992; Rheinnecker et al., 1996; Wueest et al., 2002; Fan et al., 2008)。しかしながら、これらのモジュールの多くは非ヒトであり、それゆえに免疫応答を誘発し得る。さらに、これらのモジュールの多くはジスルフィド結合により共有結合しておらず、それゆえに安定性が低く、製造が困難である。最後に、これらの多量体化ドメインのいくつか、例えばIgGのFc領域は望まないADCC(抗体依存性細胞傷害)またはCDC(補体依存性細胞傷害)エフェクター機能を誘発し、望まない副作用の原因となる。

概要

本発明は、IgMまたはIgEからの重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むポリペプチド、それらの複合体および治療および予防のためのそれらの使用を提供する。

目的

本発明は、IgMまたはIgE由来の重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むポリペプチド、それらの複合体および治療および予防におけるそれらの使用を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
1件

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請求項1

IgMまたはIgE由来重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むが、ただし、該薬学的活性部分がIgMまたはIgE由来のFabまたはFcフラグメントではない、ポリペプチド

請求項2

HD2ドメインが配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列またはその二量体化変異体を含む、請求項1に記載のポリペプチド。

請求項3

少なくとも1個の薬学的活性部分がHD2のN末端および/またはC末端に連結している、請求項1または2に記載のポリペプチド。

請求項4

少なくとも1個の薬学的活性部分がHD2に直接的にまたは1個以上のリンカーを介して間接的に連結している、請求項1〜3のいずれかに記載のポリペプチド。

請求項5

1個以上のリンカーがペプチドリンカー、好ましくは可動性ペプチドリンカーを含む、請求項4に記載のポリペプチド。

請求項6

1個以上のリンカーが1箇所以上の開裂部位、好ましくは1箇所以上のエンドペプチダーゼ開裂部位を含む、請求項5に記載のポリペプチド。

請求項7

少なくとも2個の同一のまたは少なくとも2個の異なる薬学的活性部分がHD2に連結している、請求項1〜6のいずれかに記載のポリペプチド。

請求項8

少なくとも1個の薬学的活性部分がリガンドエフェクター分子半減期延長モジュールおよび造影分子から成る群から選択される、請求項1〜7のいずれかに記載のポリペプチド。

請求項9

リガンドが抗原結合分子足場タンパク質天然リガンド、リガンド結合受容体フラグメントおよびアプタマーから成る群から選択される、請求項8に記載のポリペプチド。

請求項10

抗原結合分子が抗体フラグメントFabフラグメント、Fab’フラグメント、重鎖抗体シングルドメイン抗体(sdAb)、重鎖抗体の可変ドメイン、VHH、ナノボディ、単一鎖可変フラグメント(scFv)、直列型scFv、二重特異性細胞エンゲージャー(BITEs)、二重特異性抗体、単一鎖二重特異性抗体、DARTトリプルディナノ抗体代替足場タンパク質およびその融合タンパク質から成る群から選択される、請求項9に記載のポリペプチド。

請求項11

scFvが抗HER2または抗EGFRscFv、好ましくは配列番号2または4に従うものまたはその変異体である、請求項10に記載のポリペプチド。

請求項12

エフェクター分子がサイトカインケモカイン、免疫(共)刺激性分子、免疫抑制性分子、デスリガンド、アポトーシス誘発タンパク質キナーゼプロドラッグ変換酵素RNaseアゴニスト抗体または抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、毒素増殖因子ホルモン凝固因子線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチドおよびそのフラグメントから成る群から選択される、融合タンパク質または誘導体、請求項8に記載のポリペプチド。

請求項13

サイトカインが腫瘍壊死因子(TNF)、好ましくは配列番号5に従うものまたはその変異体である、請求項12に記載のポリペプチド。

請求項14

サイトカインがTNF関連アポトーシス誘発因子(TRAIL)、好ましくは配列番号6に従うものまたはその変異体である、請求項12に記載のポリペプチド。

請求項15

半減期延長モジュールが免疫グロブリン結合ドメイン(IgBD)、アルブミン、アルブミン結合ドメイン(ABD)、ペプチド、小分子、脂肪酸、抗体フラグメント、シングルドメイン抗体、VHH、足場タンパク質および長期循環血漿タンパク質に対する親和性を示す天然リガンドからなる群から選択され、これらは所望によりペグ化、ヘシル化、ポリシアル化、N−グリコシル化、O−グリコシル化またはPEG模倣ポリペプチドであってよい、請求項8に記載のポリペプチド。

請求項16

造影分子が生物発光試薬化学発光試薬蛍光造影剤光増感剤キレート試薬および放射性部分から成る群から選択される、請求項8に記載のポリペプチド。

請求項17

請求項1〜16のいずれかに記載のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸分子

請求項18

請求項17に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター

請求項19

請求項1〜16のいずれかに記載の少なくとも2個のポリペプチドを含む、複合体。

請求項20

少なくとも2個のポリペプチドがそれらのHD2ドメインを介して連結している、請求項19に記載の複合体。

請求項21

少なくとも2個のポリペプチドが共有結合性または非共有結合性結合を介して連結している、請求項請求項19または20に記載の複合体。

請求項22

共有結合性結合がジスルフィド結合である、請求項21に記載の複合体。

請求項23

少なくとも2個のポリペプチドが同一または異なる、請求項19〜22のいずれかに記載の複合体。

請求項24

請求項1〜16のいずれかに記載のポリペプチド、請求項17に記載の核酸分子、請求項18に記載のベクターまたは請求項19〜23のいずれかに記載の複合体を含む、細胞。

請求項25

請求項1〜16のいずれかに記載のポリペプチド、請求項17に記載の核酸分子、請求項18に記載のベクター、請求項19〜23のいずれかに記載の複合体または請求項24に記載の細胞を含む、医薬組成物

請求項26

さらに薬学的に許容される担体および/または添加物および所望により1種以上の付加的活性物質を含む、請求項25に記載の医薬組成物。

技術分野

0001

本発明は、IgMまたはIgE由来重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むポリペプチド、それらの複合体および治療および予防におけるそれらの使用を提供する。

背景技術

0002

背景
抗体、サイトカインおよび増殖因子のような治療用タンパク質ホモ二量体化モジュールへの融合は、一般的に、結合価の増加による効果の改善だけでなく、薬物動態特性の改善も示す二価分子を産生する(Deyev & Lebedenkov, 2008; Cuesta et al., 2010; Kontermann, 2010)。さらに、2個の異なるエフェクター分子の組み合わせは、二重特異性を有する分子の産生を可能にする。このような多価分子は、二重特異性抗体を使用するまたはエフェクター分子と抗体部分から成る二機能性分子を使用する二重標的化手法に適用できる(Mueller & Kontermann, 2010; Schrama et al., 2006; Deckert, 2009)。種々のホモ二量体化および多量体化モジュールが確立されており、免疫グロブリンFc領域ならびにCH3およびCκドメインだけでなく(Jazayeri & Carroll, 2008; Hu et al., 1996; Giersberg et al., 2011)、例えばストレプトアビジン、p53、ウテログロビンテネイシンおよびコラーゲン由来の、他のタンパク質ドメインおよびペプチドも含む(Ventura et al., 2009; Duebel et al., 1995; Pack & Plueckthun, 1992; Rheinnecker et al., 1996; Wueest et al., 2002; Fan et al., 2008)。しかしながら、これらのモジュールの多くは非ヒトであり、それゆえに免疫応答を誘発し得る。さらに、これらのモジュールの多くはジスルフィド結合により共有結合しておらず、それゆえに安定性が低く、製造が困難である。最後に、これらの多量体化ドメインのいくつか、例えばIgGのFc領域は望まないADCC(抗体依存性細胞傷害)またはCDC(補体依存性細胞傷害)エフェクター機能を誘発し、望まない副作用の原因となる。

先行技術

0003

Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N, & Nagamune, T. (2001); Design of linkers which effectively seperate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Engineering. 14, 8, 529-532.
Carter, P., Presta, L., Gorman, C.M., Ridgway, J.B.B., Henner, D., Wong, W.L.T., Rowland, A.M., Kotts, C., Carver, M.E. & Shepard, H.M. (1992) Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285-4289.
Cuesta, A.M., Sainz-Pastor, N., Bonet, J., Oliva, B. & Alvarez-Vallina, L. (2010) Multivalent antibodies: when design surpasses evolution. TrendsBiotechnol. 28, 355-362.
Deckert, P.M. (2009) Current constructs and targets in clinical development for antibody-based cancer therapy. Curr. Drug Targets 10, 158-175.
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George, R.A., & Heringa, J. (2003), An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding. Protein Engineering. 15, 11, 871879.
Goldstein, N.I., Prewett, M., Zuklys, K., Rockwell, P. & Mendelsohn, J. (1995) Biological efficacy of a chimeric antibody to the epidermal growth factor receptor in a human tumor xengraft model. Clin. Cancer Res. 1, 1311-1318.
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発明が解決しようとする課題

0004

先行技術のこのような欠点を克服するために、本発明者らは、代替多量体化モジュールの使用を検討した。驚くべきことに、本発明により、2個の重鎖を連結するヒンジ領域を他のIg分子に置き換えたIgMCH2ドメイン(MHD2)およびIgECH2ドメイン(EHD2)が、2個のMHD2間または2個のEHD2間のジスルフィド結合形成により、安定な二量体の産生を可能にすることが判明した。MHD2およびEHD2がそれぞれIgMまたはIgE重鎖内でさらなる重鎖配列を両端に含み中心に位置することにより、両ドメインは、いずれかのHD2のN末端および/またはC末端に融合したタンパク質から成る二量体融合タンパク質の産生に理想的に適していることが判明した。それゆえに、MHD2またはEHD2ドメインの使用は、共有結合した二量体化ドメインMHD2またはEHD2によりまとめられた多価および二機能性分子の産生を可能にする。このような二量体は、その可動性を維持しながら特に安定であることが証明された。さらに、二量体化モジュールとしてのその使用はADCCまたはCDCエフェクター機能と関連しない。それらは天然血漿タンパク質由来であるため、高収量での産生が容易である。これらのドメインの天然に生じるN−グリコシル化は、さらに生理学的条件下で安定性および溶解度を改善する。

課題を解決するための手段

0005

発明の要約
第一の面において、本発明は、IgMまたはIgE由来の重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むが、該薬学的活性部分がIgMまたはIgE由来のFabまたはFcフラグメントではない、ポリペプチドを提供する。

0006

第二の面において、本発明は、第一の面のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸分子を提供する。

0007

第三の面において、本発明は、第二の面の核酸分子を含む、ベクターを提供する。

0008

第四の面において、本発明は、第一の面の少なくとも2個のポリペプチドを含む、複合体を提供する。

0009

第五の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクターまたは第四の面の複合体を含む、細胞を提供する。

0010

第六の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞を含む、組成物を提供する。

0011

第七の面において、本発明は、医薬として使用するための、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞を提供する。

図面の簡単な説明

0012

IgM重鎖ドメイン2(MHD2)およびIgE重鎖ドメイン2(EHD2)を共有結合したホモ二量体化モジュールとして使用する。さらなるモジュールをN末端もしくはC末端または両端に融合できる。モジュールX1、X2...XmならびにY1、Y2...Ynのいずれも同一でも異なってもよい。融合モジュールの数は1〜nの間であり、N末端およびC末端融合で同一である必要はない。

0013

ヒトMHD2およびEHD2の配列解析ならびに2個の配列のアライメント。ドメイン間およびドメイン内システイン結合ならびに潜在的N−グリコシル化部位(NIT、NAS)に印を付す。

0014

a)二価または四価scFv−MHD2融合タンパク質アセンブリ。二価の単一特異性scFv−MHD2融合タンパク質を、scFvを、それぞれMHD2のN末端またはC末端に融合することにより産生する。四価の二重特異性scFv−MHD2融合タンパク質を、抗原Aに対するscFvをMHD2のN末端におよび抗原Bに対する他のscFvをMHD2のC末端に融合することにより産生する。b)scFvの可変ドメインおよびMHD2の概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はN末端リーダー配列(L)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにC末端ヘキサヒスチジンタグ(His6)を含む。c)EGFRもしくはHER2または両抗原に対する精製MHD2融合タンパク質のSDS−PAGE分析。タンパク質は還元(1〜3)または非還元(4〜6)条件下で分析した(1および3、scFvEGFR−MHD2;2および5、MHD2−scFvHER2;3および6、scFvEGFR−MHD2−scFvHER2)。ゲルクーマシーブリリアントブルーG250で染色した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で見られる上部バンドにより示される。

0015

scFv−MHD2融合タンパク質の生理活性。a)ELISAにおける抗体−MHD2融合タンパク質の固定化受容体Fc融合タンパク質への結合。3個のscFv−MHD2融合タンパク質が、各EGFR−およびまたはHER2−Fc融合タンパク質への結合を示した。ネガティブコントロールとして含ませたHER3−Fc融合タンパク質での結合は見られなかった。b)scFv−MHD2融合タンパク質の示す種々の細胞株への結合は、フローサイトメトリーにより分析した。結合したタンパク質は、FITC標識抗Hisタグ抗体で検出した。

0016

a)MHD2−scTNF、scFv−MHD2−scTNFおよびscFv−MHD2融合タンパク質のアセンブリ。二価MHD2−scTNF融合タンパク質を、scTNFのMHD2のC末端への融合により産生する。scFv−MHD2−scTNF融合タンパク質を、scFvのMHD2のN末端へのおよびscTNFのMHD2のC末端への融合により産生する。b)融合タンパク質におけるscFvの可変ドメイン、MHD2およびscTNFの概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はN末端リーダー配列(L)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにC末端ヘキサヒスチジンタグ(His6)を含む。c)精製融合タンパク質の還元(1〜4)または非還元(5〜8)条件下のSDS−PAGE分析(1および5、scTNF;2および6、scFvEGFR−MHD2;3および7、MHD2−scTNF;4および8、scFvEGFR−MHD2−scTNF)。ゲルをクーマシーブリリアントブルーG250で染色した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン6〜8)。c)scTNFの分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)。d)MHD2−scTNFのSEC。e)scFvEGFR−MHD2−scTNFのSEC。この分析は、さらに融合タンパク質の二量体アセンブリを証明する。f)動的光散乱によるscFvEGFR−MHD2−scTNFの融解温度の決定。

0017

a)ELISAにおけるscFvEGFR−MHD2−scTNF、MHD2−scTNFおよびscFvEGFR−MHD2のEGFR−Fc融合タンパク質への結合。HER2−FcおよびHER3−Fcはネガティブコントロールとして含ませた。抗ヒトFc抗体をコーティングコントロールとして使用した。b)フローサイトメトリーにより分析した、モノクローナル抗体(抗EGFRセツキシマブ、抗HERトラスツマブ)存在下または非存在下のscFvEGFR−MHD2−scTNF融合タンパク質の種々の細胞株(A431、NCI−H460)への結合(灰色、細胞のみ、太線;scFvEGFR−MHD2−scTNFとインキュベートした細胞;細線、scFvEGFR−MHD2−scTNFおよび過剰量のセツキシマブまたはトラスツマブとインキュベートした細胞)。c)MEF−TNFR1細胞の死滅に対する融合タンパク質の効果。d)MEF−TNFR2細胞の死滅に対する融合タンパク質の効果。ここで、二量体MHD2−scTNF融合タンパク質のみがTNFR2介在細胞死滅を誘発できる。e)scFvEGFR−MHD−scTNF、MHD2−scTNFおよびscTNFの濃度上昇により誘発されたHT1080細胞からのIL−8遊離(n=4、+/−SD)。scFvEGFR−MHDをネガティブコントロールとして含ませた。f)過剰量の抗EGFR抗体セツキシマブ(660nM)によるscFvEGFR−MHD2−scTNF(20pM)誘発IL−8分泌の阻害。MHD2−scTNFおよびscTNF各々でIL−8遊離誘発に対する効果は見られなかった。トラスツマブ(抗HER2)をネガティブコントロールとして含ませた。

0018

a)MHD2−scTRAILおよびscFv−MHD2−scTRAIL融合タンパク質のアセンブリ。二価MHD2−scTRAIL融合タンパク質をscTRAILのMHD2のC末端への融合により産生する。scFv−MHD2−scTRAIL融合タンパク質を、scFvのMHD2のN末端へのおよびscTRAILのMHD2のC末端への融合により産生する。b)融合タンパク質におけるscFvの可変ドメイン、MHD2およびscTRAILの概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はN末端リーダー配列(L)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにN末端FLAGタグ(FLAGタグ)を含む。c)精製融合タンパク質の還元(1〜4)または非還元(5〜8)条件下のSDS−PAGE分析(1および4、scTRAIL;2および5、MHD2−scTRAIL;3および6、scFvEGFR−MHD2−scTRAIL)。ゲルをクーマシーブリリアントブルーG250で染色した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン4〜6)。

0019

250ng/mlボルテゾミブ存在下のNCI−H460(a)およびColo205(b)細胞に対するscTRAILおよびMHD2−scTRAILの細胞傷害性活性。細胞を該タンパク質と24時間インキュベートし、細胞傷害性残存細胞クリスタルバイオレット染色により決定した。MHD2−scTRAILは、scTRAILと比較して、10〜50倍高い細胞傷害性活性を示した。

0020

a)EHD2−scTRAIL、scFv−EHD2−scTRAILおよびscFv−EHD2融合タンパク質のアセンブリ。二価scFv−EHD2融合タンパク質を、EGFRに対するscFvのEHD2のN末端への融合により産生する。二価EHD2−scTRAIL融合タンパク質は、scTRAILのEHD2のC末端への融合により産生する。scFv−EHD2−scTRAIL融合タンパク質は、scFvのEHD2のN末端へのおよびscTRAILのEHD2のC末端への融合により産生する。b)融合タンパク質におけるscFvの可変ドメイン、EHD2およびscTRAILの概略図。細胞培養上清への分泌のために、融合タンパク質はN末端リーダー配列(L)を含む。精製および検出のために融合タンパク質はさらにN末端FLAGタグ(FLAGタグ)を含む。c)非還元(1)または還元(2)条件下にscFv−EHD2について発現プラスミド一過性トランスフェクトしたHEK293細胞の細胞培養上清の免疫ブロット分析。融合タンパク質を抗FLAGタグ抗体または抗Hisタグ抗体を用いて検出した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン1)。d)非還元(1)または還元(2)条件下でEHD2−scTRAILについて発現プラスミドで一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞の細胞培養上清の免疫ブロット分析。融合タンパク質を抗FLAGタグ抗体を用いて検出した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン1)。e)非還元(1)または還元(2)条件下でscFv−EHD2−scTRAILについて発現プラスミドで一過性のトランスフェクトしたHEK293細胞の細胞培養上清の免疫ブロット分析。融合タンパク質を抗FLAGタグ抗体を用いて検出した。融合タンパク質の二量体アセンブリは、ジスルフィド結合で結合した二量体に対応する非還元条件下で可視の上部バンドにより示される(レーン1)。

0021

ヒトIgG1(GHD3)(a)、ヒトMHD2ドメイン(b)およびヒトEHD2ドメイン(c)の組み換えCH3ドメインの比較。精製タンパク質のSDS−PAGE分析を還元(1)および非還元(2)条件下で実施した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーG250で染色した。二量体アセンブリおよびジスルフィド結合による結合がMHD2およびEHD2について証明された。還元および非還元条件下それぞれで2〜3バンドにより示されるN−グリコシル化に関する不均一性も、MHD2およびEHD2で観察された。分子ふるいクロマトグラフィーは、GHD3ドメインより大きい見かけの大きさで移動する2個のN−グリコシル化ドメイン(MHD2、EHD2)と共に、これらドメインの二量体アセンブリを確認した。動的光散乱による融解温度の決定は、IgG1のCH3について、約50℃の最初の融解温度(おそらくドメイン解離による)および75℃での第二の主要な融解温度(おそらく完全な変性による)を確認したが、MHD2についてシグナルの鋭い増加はなく、約56℃から開始する漸増が観察され、本タンパク質は92℃の温度までむしろ安定であることが示された。EHD2について、約80〜82℃の単一変中点が決定された。

0022

抗HER2 scFv(4D5)の核酸およびアミノ酸配列リーダーペプチド下線を付す。

0023

抗EGFRscFv(hu225)の核酸およびアミノ酸配列。リーダーペプチドに下線を付す。

0024

scTNFの核酸およびアミノ酸配列。個別のTRAIL単量体を連結するリンカーに下線を付す。

0025

scTRAILの核酸およびアミノ酸配列。個別のTRAIL単量体を連結するリンカーに下線を付す。

0026

scFvEGFR−MHD2の核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0027

MHD2−scFvHER2の核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0028

scFvEGFR−MHD2−scFvHER2の核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0029

MHD2−scTNFの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0030

scFvEGFR−MHD2−scTNFの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0031

MHD2−scTRAILの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0032

scFvEGFR−MHD2−scTRAILの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0033

scDbEpCAMxEGFR−MHD2−scTRAILの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0034

scFvEGFR−EHD2の核酸およびアミノ酸配列。EHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0035

EHD2−scTRAILの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0036

scFvEGFR−EHD2−scTRAILの核酸およびアミノ酸配列。MHD2を灰色で示す。リーダーペプチドおよび個別のドメインを連結するリンカーに下線を付す。

0037

a)scFv−EHD2融合タンパク質の概略図(L=リーダーペプチド;His6=ヘキサヒスチジンタグ)。b)scFv−EHD2融合タンパク質の概略構造(EHD2ドメインを白色で示す)。c)抗HER3 scFv−EHD2融合タンパク質の発現を示す免疫ブロッティング実験(レーン1)。タンパク質を12%SDS−PAGEで還元条件下に分離し、HRP結合抗Hisタグ抗体で検出した。融合タンパク質は約40〜45kDaの予測したサイズを有した。検出した二重バンドはグリコシル化および非グリコシル化タンパク質を示す。

0038

a)二重特異性scDb−EHD2融合タンパク質の概略図(L=リーダーペプチド;His6=ヘキサヒスチジンタグ)。b)scDb−EHD2融合タンパク質の概略構造(EHD2ドメインを白色で示す)。c)還元または非還元条件下の精製融合タンパク質のSDS−PAGE。ゲルをクーマシーで染色した。d)固定化CEAに対するscFv−EHD2およびscDb−EHD2のELISA(3μg/ml)。結合抗体をHRP結合抗Hisタグ抗体を用いて検出した。

0039

a)リンカー配列の3位としてシステインを有するscFv−L3−EHD2融合タンパク質の産生のために使用したscFv−L3フラグメントの模式的組成。b)scFv−L3−EHD2およびscFv−L3−EHD2−scFv融合タンパク質の概略構造(EHD2ドメインを白色で示す)。c)一過性にトランスフェクトしたHEK293細胞の上清における抗FAP scFv−L3(レーン1)、二重特異性抗体Db−Cys(レーン2)、scFv−L3−EHD2(レーン3)およびscFv−L3−EHD3−scFvの発現を示す免疫ブロッティング実験。タンパク質を12%SDS−PAGEで還元条件下に分離し、HRP結合抗Hisタグ抗体で検出した。全てのタンパク質は予測したサイズを有した。

0040

a)種々のEHD2融合タンパク質の略図。b)還元(レーン1〜3)または非還元(レーン4〜6)条件下の精製融合タンパク質のSDS−PAGE分析(scFv−EHD2、レーン1、4;EHD2−scTRAIL、レーン2、5;scFv−EHD2−scTRAIL、レーン3、6)。c)精製融合タンパク質のSEC分析。d)組み換え受容体−Fc融合タンパク質を使用したEGFRおよびTRAIL受容体1および2に対する融合タンパク質の結合についてのELISA。HER2−Fcをネガティブコントロールとして含ませた。e)固定化EGFRに対する結合についてのELISAにおけるEGFRに対するscFv−EHD2およびscFvの抗体価測定。

0041

フローサイトメトリーにより分析したEGFR発現細胞株に対するEHD2融合タンパク質の結合。a)検出に抗FLAGタグ抗体を使用した、EHD2−scTRAILおよびscFv−EHD2−scTRAILのColo205、NCI−H460およびHEK293への結合。b)検出に抗Hisタグ抗体を使用した、scFv−EHD2のColo205、NCI−H460およびHEK293への結合。

0042

scTRAILと比較したEHD2−scTRAILおよびscFv−EHD2−scTRAILのインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、ボルテゾミブ(250ng/ml)非存在下または存在下、2種の細胞株(NCI−H460、Colo205)で分析した。細胞を、融合タンパク質と16時間インキュベートし、生存可能細胞をクリスタルバイオレット染色により決定した。

0043

セツキシマブ非存在下または存在下のEHD2−scTRAILおよびscFv−EHD2−scTRAILのインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、抗EGFRscFvの細胞への結合を遮断する100倍モル濃度過剰のセツキシマブ(Cet.)の存在下または非存在下、ボルテゾミブ(250ng/ml)の存在下に、2種の細胞株(NCI−H460、Colo205)で分析した。細胞を、融合タンパク質と16時間インキュベートし、生存可能細胞をクリスタルバイオレット染色により決定した。

0044

scFv−scTRAILと比較したscFv−EHD2−scTRAILのインビトロ細胞傷害性。細胞傷害性を、ボルテゾミブ(250ng/ml)非存在下または存在下、2種の細胞株(NCI−H460、Colo205)で分析した。細胞を、融合タンパク質と16時間インキュベートし、生存可能細胞をクリスタルバイオレット染色により決定した。

0045

マウスにおけるEHD2融合タンパク質の薬物動態。scTRAILおよびEHD2融合タンパク質(25μg/動物)を、CD1マウス(n=3)に静脈内注射し、血清濃度をELISAにより決定した。

0046

a)scTRAILと比較したEHD2−scTRAILおよびscFv−EHD2−scTRAILのインビボ抗腫瘍活性。皮下Colo205異種移植腫瘍担持MRIヌードマウスは、4日毎にタンパク質(0.35nmolの融合タンパク質および0.7nmolのscTRAIL)の静脈注射4回ならびに2日毎にボルテゾミブ(Brt、5μg/注射)の腹腔内注射8回を受けた。a)腫瘍増殖。b)13日目の腫瘍体積。c)scFv−EHD2およびボルテゾミブ処置と比較したscFv−EHD2−scTRAILのインビボ抗腫瘍活性。皮下Colo205異種移植腫瘍担持NMRIヌードマウスはタンパク質(1nmolの融合タンパク質)の静脈注射4回ならびに2日毎にボルテゾミブ(Brt、5μg/注射)の腹腔内注射8回を受けた。b)21日目の腫瘍体積。e)ALTアッセイを、CD1マウスへのscFv−EHD2−scTRAIL(1nmol、i.v.)とボルテゾミブ(5μg、i.p.)の同時の注射4時間または24時間後に行った。PBSコントロールと比較して、統計学有意差は観察されなかった。全値は50U/Lの閾値より低かった。

0047

a〜c)精製TNF変異体(a:MHD2−scTNFR2、b:EHD2とscTNFR2の間に16aaリンカーを有するEHD2−scTNFR2ならびにc:EHD2とscTNFR2の間に28aaリンカーを有するEHD2−scTNFR2)を、還元(+2−ME)または非還元(−2−ME)条件下、クーマシーで染色して、8%SDS−PAGEで分析した。d)TNFR2−Fc融合タンパク質との結合試験プレートを1μg/ml TNFR2−Fc融合タンパク質(エンブレル)で被覆した。TNF融合タンパク質を1時間、RTでインキュベートし、結合TNF融合タンパク質をHRP結合抗TNF抗体およびTMB基質を使用して検出した(n=2)。

0048

抗CEAscFv−EHD2の核酸およびアミノ酸配列。

0049

抗HER2 scFv−EHD2の核酸およびアミノ酸配列。

0050

抗HER3 scFv−EHD2の核酸およびアミノ酸配列。

0051

抗CEAxCD3 scDb−EHD2の核酸およびアミノ酸配列。

0052

抗EGFRscFv−L3−EHD2の核酸およびアミノ酸配列。

0053

抗EGFRscFv−L3−EHD2−scFvの核酸およびアミノ酸配列。

0054

MHD2−scTNFR2の核酸およびアミノ酸配列。

0055

EHD2−scTNFR2−L16aaの核酸およびアミノ酸配列。

0056

EHD2−scTNFR2−L28aaの核酸およびアミノ酸配列。

0057

詳細な記載
下に本発明を詳細に記載する前に、本発明は、ここに記載する特定の方法、プロトコールおよび試薬が、変わり得るものであるために、これらに限定されるべきではないことが理解されるべきである。ここで使用する用語は特定の態様を記載することのみを目的とし、添付する特許請求の範囲でのみ限定される本発明の範囲を限定する意図はないことも理解されるべきである。特に定義しない限り、ここで使用する全ての技術的および科学的用語は、当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。

0058

好ましくは、ここで使用する用語は、“A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)”, Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. and Koelbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland)に記載のとおりに定義される。

0059

いくつかの文献が本明細書の本文中で引用されている。ここに定義する文献の各々(全ての特許、特許出願、科学出版物製造業者仕様書、指示、GenBank配列寄託受入番号などを含む)は、本明細書中における引用によりその全体を本明細書に包含させる。本明細書の如何なる記載も、先行発明の開示により本発明が先行されていることを認めるものと解釈してはならない。

0060

定義
明細書および添付する特許請求の範囲を通して、文脈上他の解釈が必要でない限り、用語“含む”および“含み”および“含んで”のようなその変形は、それぞれの整数もしくは工程または整数もしくは工程の群を包含することを意図するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群のいずれも排除しないと理解されるべきである。

0061

用語“タンパク質”および“ポリペプチド”はここでは交換可能に使用し、鎖長または翻訳後修飾に拘わらず、あらゆるペプチド結合により結合したアミノ酸の鎖をいう。本発明で使用可能なタンパク質(タンパク質誘導体タンパク質変異体タンパク質フラグメントタンパク質セグメントタンパク質エピトープおよびタンパク質ドメインを含む)を、化学修飾によりさらに修飾できる。これは、このような化学修飾したポリペプチドが、20種の天然起源アミノ酸以外の他の化学基を含むことを意味する。このような他の化学基の例は、グリコシル化アミノ酸およびリン酸化アミノ酸を含むが、これらに限定されない。ポリペプチドの化学修飾は、親ポリペプチドと比較して有利な特性、例えば安定性増加、生物学的半減期延長または水溶性増加の一つ以上を提供し得る。

0062

用語“ポリヌクレオチド”および“核酸”はここでは交換可能に使用し、ヌクレオチド単量体から成る重合体またはオリゴマー高分子として理解される。ヌクレオチド単量体は、核酸塩基、5炭素糖(例えばリボースまたは2’−デオキシリボースであるが、これらに限定されない)および1〜3個のリン酸基から成る。典型的に、ポリヌクレオチドは、個別のヌクレオチド単量体間ホスホジエステル結合により形成される。核酸は、例えば化学的に、例えばホスホトリエステル法によって製造できる(例えば、Uhlmann & Peyman (1990) Chemical Reviews 90:543-584参照)。

0063

ここで使用する用語“変異体”は、その鎖長または配列の1個以上の変化により、元のポリヌクレオチドまたはタンパク質と比較して異なっている、ポリヌクレオチドまたはタンパク質をいう。タンパク質または核酸変異体が由来するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、親または親のポリペプチドまたはポリヌクレオチドとしても知られる。ここでいう“二量体化変異体”は、上記のとおりその鎖長または配列の1個以上の変化により、該親の二量体化ドメインと異なる、親の二量体化ドメインの変異体である。用語“変異体”または“二量体化変異体”は、親分子の“フラグメント”または“誘導体”を含む。典型的に、“フラグメント”は、親分子より長さが短くまたはサイズが小さく、一方“誘導体”は、親分子と比較してその配列に1個以上の違いがある。またここに包含されるのは、翻訳後修飾タンパク質(例えばグリコシル化、ビオチニル化リン酸化ユビキチン化パルミトイル化されたまたはタンパク分解により切断されたタンパク質)のような、しかしこれらに限定されない修飾分子およびメチル化DNAのような修飾核酸である。RNA−DNAハイブリッドのような、しかしこれに限定されない異なる分子の混合物も用語“変異体”または“二量体化変異体”に包含される。典型的に、変異体または二量体化変異体は人為的に、好ましくは遺伝子工学的手段により構築されるが、親ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは野生型タンパク質またはポリヌクレオチドである。しかしながら、天然起源変異体も、ここで使用する用語“変異体”または“二量体化変異体”に包含されると理解すべきである。さらに、本発明で使用可能な変異体または二量体化変異体はまた、変異体または二量体化変異体が親分子の少なくとも1個の生物活性を示す限り、すなわち機能的活性である限り、親分子のホモログオルソログまたはパラログまたは人為的に構築された変異体に由来してもよい。

0064

ヌクレオチドまたはアミノ酸配列における変化は、ヌクレオチドまたはアミノ酸交換、挿入、欠失、5’または3’短縮化、N末端またはC末端短縮化またはこれらの変化の任意の組み合わせであってよく、これは、1箇所または数箇所で起こってよい。好ましい態様において、本発明で使用可能な変異体は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列に合計で150個まで(1個まで、2個まで、3個まで、4個まで、5個まで、6個まで、7個まで、8個まで、9個まで、10個まで、15個まで、20個まで、25個まで、30個まで、35個まで、40個まで、45個まで、50個まで、55個まで、60個まで、65個まで、70個まで、75個まで、80個まで、85個まで、90個まで、95個まで、100個まで、110個まで、120個まで、130個まで、140個までまたは150個まで)の変化(すなわち交換、挿入、欠失および/または短縮化)を有してよい。アミノ酸交換は保存的および/または非保存的であり得る。典型的置換は、脂肪族アミノ酸間、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸間、酸性残基を有するアミノ酸間、アミド誘導体間、塩基性残基を有するアミノ酸間または芳香族残基を有するアミノ酸間である。典型的な半保存的および保存的置換は次のとおりである。

0065

A、F、H、I、L、M、P、V、WまたはYからCへの変換は、新しいシステインが遊離チオールとして残存するならば、半保存的である。さらに、当業者が理解しているように、立体的に厳しい位置のグリシンは置換されるべきでなく、Pはアルファらせんまたはベータシート構造を有するタンパク質の部分に導入されるべきでない。

0066

これとは別にまたはこれに加えて、ここで使用する“変異体”または“二量体化変異体”は、それが由来する親ポリペプチドまたは親ポリヌクレオチドとのある程度の配列同一性により特徴づけられ得る。より正確にいうと、本発明におけるタンパク質変異体は、親ポリペプチドに少なくとも70%配列同一性を示す。本発明におけるポリヌクレオチド変異体は、親ポリヌクレオチドに少なくとも70%配列同一性を示す。好ましくは、タンパク質変異体の配列同一性は、連続する20個、30個、40個、45個、50個、60個、70個、80個、90個、100個以上のアミノ酸に係る。好ましくは、ポリヌクレオチド変異体の配列同一性は、連続する60個、90個、120個、135個、150個、180個、210個、240個、270個、300個以上のヌクレオチドに係る。

0067

用語“少なくとも70%配列同一性”は、本明細書をとおして、ポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列比較に関して使用する。この表現は、好ましくは各対照ポリペプチドまたは各対照ポリヌクレオチドに対して、少なくとも70%、少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%の配列同一性をいう。

0068

2個の配列を比較し、配列同一性パーセンテージの計算の基準である対照配列比較対照として特定されていないときは、配列同一性は、他に特定して指示されていない限り、比較する2個の配列の長い方を対照として計算されるべきである。対照配列が示されているときは、配列同一性は、他に特定して指示されていない限り、配列番号により示す対照配列の完全長に基づき決定する。例えば、ヒトMHD2ドメインのアミノ酸配列と比較して、90アミノ酸から成るペプチド配列は、81.08%(90/111)の最大配列同一性パーセンテージ示す可能性があり、一方78アミノ酸長の配列は、70.03%(78/111)の最大配列同一性パーセンテージを示す可能性がある。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列の類似性、すなわち配列同一性のパーセンテージは配列アライメントを介して決定できる。このようなアライメントは、数種の当業者に知られたアルゴリズム、好ましくはKarlinおよびAltschulの数学アルゴリズム(Karlin & Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)、hmmalign(HMMERパッケージ、http://hmmer.wustl.edu/)またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/ or on http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlまたはhttp://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_clustalw.htmlから入手可能なCLUSTALアルゴリズム(Thompson et al. (1994) Nucleic AcidsRes. 22:4673-4680)を用いて実施できる。使用する好ましいパラメータは、http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/またはhttp://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlに設定されているような、デフォルトパラメータである。配列同一性(配列整合)の程度を、例えばBLAST、BLATまたはBlastZ(またはBlastX)を使用して計算できる。類似のアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTNおよびBLASTPプログラムに取り込まれている。BLASTポリヌクレオチド探索はBLASTNプログラム、スコア=100、語長=12で実施する。BLASTタンパク質探索は、BLASTPプログラム、スコア=50、語長=3で実施する。比較目的のギャップドアライメントを得るために、ギャップドBLASTをAltschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載のとおり使用する。BLASTおよびギャップドBLASTプログラムを使用するとき、各プログラムのデフォルトパラメータを使用する。配列整合分析は、Shuffle-LAGAN(Brudno M. (2003b) Bioinformatics 19 Suppl 1:I54-I62)またはマルコフ確率場のような確立された相同性マッピング技術を補ってよい。配列同一性パーセンテージを本明細書中で言及するとき、これらのパーセンテージは、他に具体的指示が無い限り、長い配列の完全長に対して計算する。

0069

ハイブリダイゼーション”も、2個の核酸配列の配列同一性または相同性の指標として使用できる。ハイブリダイゼーション条件は当業者に知られており、例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991に見られる。“中程度ハイブリダイゼーション条件”は、2×塩化ナトリウムクエン酸ナトリウム(SSC)中で30℃においてハイブリダイゼーションさせ、次いで1×SSC、0.1%SDSで50℃において洗浄するのに相当すると定義されている。“高ストリンジェントな条件”は、6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)中で45℃においてハイブリダイゼーションさせ、次いで0.2×SSC、0.1%SDSで65℃において洗浄するのに相当すると定義されている。

0070

ここで使用する用語“免疫グロブリン(Ig)”は、免疫グロブリンスーパーファミリー糖タンパク質がもたらす免疫をいう。“表面免疫グロブリン”は、膜貫通型領域によりエフェクター細胞の膜に結合しており、B細胞受容体、T細胞受容体クラスIおよびII主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質、ベータ−2ミクログロブリン(β2M)、CD3、CD4およびCD8のような、しかしこれらに限定されない分子を含む。典型的に、ここで使用する用語“抗体”は、膜貫通型領域を欠き、それゆえに、血流および体腔に放出され得る、分泌免疫グロブリンをいう。ヒト抗体は、その重鎖によって、異なるアイソタイプ分類できる。ギリシャ文字α、δ、ε、γおよびμで表示される5タイプのヒトIg重鎖がある。重鎖のタイプは抗体のクラスを規定し、これらの鎖がそれぞれIgA抗体IgD抗体、IgE抗体IgG抗体およびIgM抗体に存在し、それぞれ異なる役割を有し、異なるタイプの抗原に対して適切な免疫応答を指示する。それぞれの重鎖はサイズおよび組成が異なり、αおよびγは約450アミノ酸を有し、μおよびεは約550アミノ酸を有する(Janeway et al. (2001) Immunobiology, Garland Science)。IgAは、消化管気道および尿生殖路のような粘膜領域ならびに唾液涙液および母乳に存在し、病原体によるコロニー形成を阻止する(Underdown & Schiff (1986) Annu. Rev. Immunol. 4:389-417)。IgDは、主に抗原に曝されていないB細胞上の抗原受容体として機能し、抗微生物因子を産生させるために好塩基球および肥満細胞活性化に関与する(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437; Chen et al. (2009) Nat. Immunol. 10:889-898)。IgEは、肥満細胞および好塩基球からのヒスタミン遊離を誘発するアレルゲンへの結合を介して、アレルギー反応に関与する。IgEはまた寄生虫に対する防御にも関与する(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASMPress)。IgGは、侵入してきた病原体に対する抗体ベースの免疫の大部分を提供し、胎児受動免疫を与えるために胎盤を通過できる唯一の抗体アイソタイプである(Pier et al. (2004) Immunology, Infection, and Immunity, ASM Press)。ヒトでは、4種のIgGサブクラス(IgG1、2、3および4)があり、血清中のその存在量の順に命名され、IgG1が最も豊富であり(〜66%)、続いてIgG2(〜23%)、IgG3(〜7%)、そしてIgG(〜4%)である。異なるIgGクラス生物学的プロファイルは、各ヒンジ領域の構造により決定される。IgMは、極めて強い抗原親和性を有していて、単量体型でB細胞表面に発現し、五量体型で分泌される。IgMは、十分なIgGが産生される前の、B細胞介在(液性)免疫の初期段階での病原体排除に関与する(Geisberger et al. (2006) Immunology 118:429-437)。

0071

抗体は単量体として存在するだけでなく、2個のIg単位(例えばIgA)の二量体、4個のIg単位の四量体(例えば硬骨魚のIgM)または5個のIg単位の五量体(例えば哺乳動物IgM)を形成することも知られている。抗体は、典型的にジスルフィド結合を介して連結された2個の同一重鎖および2個の同一軽鎖を含む4ポリペプチド鎖から成り、“Y字”型高分子のように見える。鎖の各々は、数個免疫グロブリンドメインを含み、そのうちの幾つかは定常ドメインであり、残りは可変ドメインである。免疫グロブリンドメインは、2個のβシートの間に7〜9個の逆平行β鎖が配置された2層サンドイッチから成っている。典型的に、抗体の“重鎖”は、4個のIgドメインを有し、そのうち3個は定常領域(CH1、CH2、CH3)であり、1個は可変領域(VH)である。IgMおよびIgEは例外であって、1個の可変領域(VH)および4個の定常領域(CH1、CH2、CH3、CH4)を含んでいる。IgM分子およびIgE分子の重鎖の付加的ドメイン(CH2:Cμ2、Cε2)は、他のIg分子に含まれるヒンジ領域に代って、2個の重鎖を連結している(Perkins et al., 1991; Beavil et al., 1995;Wan et al., 2002)。“軽鎖”は、典型的に1個の定常Igドメイン(CL)と1個の可変Igドメイン(VL)を含む。ヒトIgM重鎖の場合は、N末端からC末端にかけてVH−CH1−CH2−CH3−CH4(VH−Cμ1−Cμ2−Cμ3−Cμ4ともいう)の順で結合した4個のIgドメインから成り、一方ヒトIgM軽鎖は、N末端からC末端にかけてVL−CLの順で結合した2個の免疫グロブリンドメインから成り、カッパタイプまたはラムダタイプ(Vκ−CκまたはVλ−Cλ)のいずれかである。

0072

例えば、ヒトIgMの定常鎖は、452個のアミノ酸を含む。本明細書および特許請求の範囲を通じて、免疫グロブリンのアミノ酸の位置番号はKabat, E. A., Wu, T.T., Perry, H. M., Gottesman, K. S., and Foeller, C., (1991) Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed. U.S. Department of Health and Human Service, National Institutes of Health, Bethesda, MDの“EU指標”によるものである。“KabatにおけるEU指標”は、ヒトIgM EU抗体の残基番号付けをいう。したがって、IgMにおけるCHドメインは次のとおりである:“CH1”はKabatによるEU指標でアミノ酸位118〜215を意味し、“CH2”はKabatによるEU指標でアミノ酸位231〜340を意味し、“CH3”はKabatによるEU指標でアミノ酸位341〜446を意味する。“CH4”は、KabatによるEU指標でアミノ酸位447〜558を意味する。

0073

ヒトIgA、IgGおよびIgD分子においては2個の重鎖がヒンジ領域を介して結合するが、IgEおよびIgM抗体はこのようなヒンジ領域を含まない。その代わり、IgEおよびIgM抗体は、2個の重鎖間の二量体化ドメインとして機能する付加的IgドメインであるCH2ドメインを有している。他の抗体のかなり可動性で線形のヒンジ領域とは対照的に、IgEおよびIgMのCH2ドメインは、cタイプ免疫グロブリン折りたたみを形成するドメイン内ジスルフィド結合により安定化される2個のベータシートから成る(Bork et al., 1994; Wan et al., 2002)。さらに、MHD2およびEHD2ドメインは2個のN−グリコシル化部位を含む。

0074

“ヒトIgE重鎖ドメイン2”(“EHD2”)は106個のアミノ酸残基から成る。本ドメインは、Cys261とCys321(KabatによるEU番号付け)の間に形成されたドメイン内ジスルフィド結合を含む。典型的に、2個のEHD2ドメインは、Cys247とCys337の間の2個のドメイン間ジスルフィド結合により共有結合する。EHD2はAsn275にN−グリコシル化部位を有する(図2)。
ヒトEHD2のアミノ酸配列は配列番号2に示す。

0075

“IgM重鎖ドメイン2”(“MHD2”)は、2個のドメインのシステイン残基337間に形成されたジスルフィド結合により共有結合で相互に結合されたホモ二量体を形成する111個のアミノ酸残基(12.2kDa)から成っている(Davis et al., 1989;Davis & Shulman, 1989)。本ドメインは、Cys261とCys321の間に形成されたドメイン内ジスルフィド結合によりさらに安定化される。典型的に、2個のMHD2ドメインは、両者のCys337間のドメイン間ジスルフィド結合により共有結合する。MHD2はAsn333にN−グリコシル化部位を有する(図2)。
ヒトMHD2のアミノ酸配列を配列番号1に提供する。
ヒトMHD2およびEHD2は約25%配列同一性を有する(図2)。

0076

抗体のパパイン消化は、各々1個の抗原結合部位を有する“Fabフラグメント”(“Fab部分”または“Fab領域”ともいう)と呼ばれる2個の同一抗原結合フラグメントならびに容易に結晶化できる能力を反映した名称を有する残存“Fcフラグメント”(“Fc部分”または“Fc領域”とも呼ばれる)を産生する。ヒトIgGFc領域の結晶構造は決定されている(Deisenhofer (1981) Biochemistry 20:2361-2370)。IgG、IgAおよびIgDアイソタイプにおいて、Fc領域は、抗体の2個の重鎖のCH2ドメインおよびCH3ドメインに由来する2個の同一タンパク質フラグメントから成り、IgMおよびIgEアイソタイプにおいて、Fc領域は各ポリペプチド鎖における3個の重鎖定常ドメイン(CH2−4)を含む。さらに、小さい免疫グロブリン分子が天然に存在し、または人工的に構築されている。用語“Fab’フラグメント”は、Ig分子のヒンジ領域をさらに含むFabフラグメントをいい、一方“F(ab’)2フラグメント”は、化学的に結合したまたはジスルフィド結合を介して連結した2個のFab’フラグメントを含むと理解される。“単一ドメイン抗体(sdAb)”(Desmyter et al. (1996) Nat. Structure Biol. 3:803-811)および“ナノボディ”は単一VHドメインのみを含み、“単一鎖Fv(scFv)”フラグメントは、短リンカーペプチドを介して軽鎖可変ドメインに結合した重鎖可変ドメインを含む(Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883)。二価単一鎖可変フラグメント(ジ−scFv)は、2個のscFvの結合(scFvA−scFvB)により製造され得る。これは、2個のVH領域および2個のVL領域を有する単一ペプチド鎖を製造し、“直列型scFv”(VHA−VLA−VHB−VLB)を産生することにより実施できる。今ひとつの可能性は、2個の可変領域が一緒に折りたたまれるには短すぎ、scFvを二量体化させる、リンカーを有するscFvの生成である。通常5残基長のリンカーがこれらの二量体の産生に使用される。このタイプは“ディアボディ”として知られる。VHドメインとVLドメイン間のさらに短いリンカー(1個または2個のアミノ酸)は、単一特異性三量体、いわゆる“トリアボディ”または“トリボディ”の形成に至る。二重特異性ディアボディは、それぞれVHA−VLBおよびVHB−VLAまたはVLA−VHBおよびVLB−VHAの配置を有する2個の鎖の発現により形成される。単一鎖二重特異性抗体(scDb)は、12〜20個のアミノ酸、好ましくは14個のアミノ酸のリンカーペプチド(P)により結合したVHA−VLBおよびVHB−VLAフラグメントを含む(VHA−VLB−P−VHB−VLA)。“二重特異性T細胞エンゲージャー(BiTE)”は、異なる抗体の2個のscFvから成る融合タンパク質であり、ここで、scFvの一方がCD3受容体を介してT細胞に結合し、他方が腫瘍特異的分子を介して腫瘍細胞に結合する(Kufer et al. (2004) TrendsBiotechnol. 22:238-244)。二重親和性再標的化分子(“DART”分子)は、C末端ジスルフィド架橋を介してさらに安定化された二重特異性抗体である。

0077

ここで使用する用語“薬学的活性部分”は、予防、治療および/または診断効果を含むが、これらに限定されない薬理効果仲介する、高分子または複合体、すなわちポリペプチド、ポリヌクレオチドまたはその複合体の一部または部分をいうと理解される。

0078

ここで使用する疾患または障害の“予防”、“予防する”、“予防の”または“予防法”は、このような疾患または障害が患者で生じるのを阻止することを意味する。したがって、予防効果を有する部分は、患者における疾患または障害の発症を阻止する。

0079

ここで使用する疾患または障害の“処置”、“処置する”、“処置法”または“治療”は、次の1個以上の達成を意味する:(a)障害の重症度の軽減;(b)処置中の障害の特徴である症状の発症の制限または阻止;(c)処置中の障害の特徴である症状の悪化の阻止;(d)以前障害を有していた個体における障害の再発の制限または阻止;および(e)先に障害が症候性であった個体における症状の再発の制限または阻止。したがって、治療効果を有する部分は、上記効果(a)〜(e)の1個以上の達成により、疾患または障害の症状を処置する。

0080

用語疾患または障害の“同定”、“同定する”、“鑑別”または“診断”は、ここでは、疾患または障害の性質および原因の決定をいう。したがって、診断効果を有する部分は、疾患または障害の性質および原因の決定を可能にする。

0081

疾患または障害の“症状”は、このような疾患または障害を有する組織臓器または生物に顕著な疾患または障害の影響であり、組織、臓器または個体の疼痛脱力圧痛過労硬直および攣縮ならびにバイオマーカーまたは分子マーカーのような特異的指標の存在、不在、上昇、低下を含むが、これらに限定されない。ここで使用する用語“疾患”および“障害”は、病気または傷害のような異常状態、特に医学的異常状態をいい、ここで、組織、臓器または個体はその機能をもはや効率的に全うできない。典型的に、しかし必定ではなく、疾患または障害は、このような疾患または障害の存在を示す特異的症状または徴候と関連する。疾患または障害は、自己免疫性疾患アレルギー性疾患癌タイプ疾患、皮膚状態内分泌疾患、血液疾患および障害、眼疾患および障害、遺伝性障害、炎症性疾患感染症消化器系疾患神経障害および精神疾患を含むが、これらに限定されない。自己免疫性疾患の例は、I型糖尿病リウマチ性関節炎乾癬クローン病自己免疫性心筋症自己免疫性肝炎橋本甲状腺炎およびシェーグレン症候群を含むが、これらに限定されない。アレルギー性疾患の例は、アレルギー性鼻炎喘息アトピー性湿疹アナフィラキシー昆虫アレルギー薬物アレルギーおよび食物アレルギーを含むが、これらに限定されない。癌タイプ疾患の例は、基底細胞癌膀胱癌骨癌脳腫瘍乳癌バーキットリンパ腫子宮頸癌結腸癌皮膚T細胞リンパ腫食道癌網膜芽細胞腫胃癌消化器間質腫瘍神経膠腫ホジキンリンパ腫カポジ肉腫白血病リンパ腫黒色腫中咽頭癌卵巣癌膵癌胸膜肺芽腫前立腺癌咽頭癌甲状腺癌および尿道癌を含むが、これらに限定されない。皮膚状態の例は、アクネ皮膚炎湿疹皮膚付属器の状態、皮下脂肪の状態、色素沈着障害上皮母斑、上皮新生物、上皮嚢腫紅斑凍傷遺伝性皮膚症ムチン沈着症、神経皮膚状態(例えばウィスコット・アルドリッチ症候群)および乾癬を含むが、これらに限定されない。内分泌疾患の例は、I型およびII型糖尿病骨粗鬆症およびクッシング病を含むが、これらに限定されない。血液疾患および障害の例は、凝固障害(血友病A血友病Bなど)、線維素溶解性障害、補体欠損症、免疫グロブリン欠損症および貧血を含むが、これらに限定されない。遺伝性障害の例は、色覚異常嚢胞性線維症ダウン症候群鎌状赤血球疾患およびターナー症候群を含むが、これらに限定されない。炎症性疾患の例は、リウマチ性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎強直性脊椎炎粥状動脈硬化変形性関節症および喘息を含むが、これらに限定されない。感染症の例は、アフリカ睡眠病、AIDS、HIV感染炭疽ボレリア症カリシウイルス感染(ノロウイルスおよびサポウイルス)、水痘クラミジア感染コレラクロストリジウム感染、コロラドダニ熱(CTF)、感冒クロイツフェルトヤコブ病デング熱(DEN−1、DEN−2、DEN−3およびDEN−4)、エボラエンテロウイルス感染、ヒトヘルペスウイルス6(HHV−6)およびヒトヘルペスウイルス7(HHV−7)の感染、淋病連鎖球菌感染(A群およびB群)、手足口病(HFMD)、ヘリコバクターピロリ感染肝炎(A型、B型C型およびD型)、ヘルペス感染パピローマウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザラッサ熱マールブルグ熱、麻疹髄膜炎流行性耳下腺炎パスツレラ症シラミ属感染、ペスト肺炎球菌感染呼吸器多核体ウイルス感染、ロタウイルス感染風疹ウイルス感染、サルモネラ食中毒および感染、SARS、疥癬感染、住血吸虫症天然痘ブドウ球菌食中毒および感染、梅毒破傷風白癬菌感染、結核チフス、ベネズエラウマ脳炎および黄色熱のようなウイルス、細菌、寄生虫、プリオンまたは他の病原体または寄生生物が原因の感染疾患を含むが、これらに限定されない。消化器系疾患の疾患は、胃腸炎イレウス回腸炎大腸炎虫垂炎セリアック病過敏性腸症候群憩室性疾患、下痢ポリープおよび潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。神経障害の例は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病脳損傷、クロイツフェルト・ヤコブ病、クッシング症候群失読症脳炎癲癇頭痛ハンチントン病片頭痛多発性硬化症パーキンソン病ポリオ狂犬病統合失調症および卒中を含むが、これらに限定されない。精神疾患の例は、急性ストレス障害注意欠損過活動障害(ADHD)、自閉症性障害、境界人格障害神経性過食症、燃え尽き症候群、統合失調症、鬱病認知障害コミュニケーション障害摂食障害窃盗癖学習障害男性勃起障害抑欝強迫性障害(OCD)、妄想性障害、病的賭博外傷後ストレス障害(PTSD)、精神病性障害過眠症不眠症およびトゥレット症候群を含むが、これらに限定されない。

0082

“薬学的活性部分”は、典型的に生物製剤および/または合成医薬、例えばリガンド、エフェクター分子、半減期延長モジュールおよび造影分子を含む。用語“リガンド”は、特異的生物学的機能を発揮するために他の分子と複合体を形成する化学物質または生物学的物質をいう。リガンドは、抗原結合分子足場タンパク質天然リガンド、リガンド結合受容体フラグメントおよびアプタマーのような基質、阻害剤およびアクティベーターを含むが、これらに限定されない。用語“エフェクター分子”は、典型的にタンパク質と結合し、それによりそのタンパク質の活性を変える小分子、ペプチドまたはポリペプチドをいう。これはサイトカイン、ケモカイン、免疫(共)刺激性分子、免疫抑制性分子、デスリガンド、アポトーシス誘発タンパク質キナーゼプロドラッグ変換酵素RNaseアゴニスト抗体または抗体フラグメントアンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチドおよびそのフラグメント、融合タンパク質または誘導体を含むが、これらに限定されない。“半減期延長モジュール”は、化学物質または生物学的物質の半減期、例えば“血漿半減期”または“血清半減期”を延長する。造影分子は、特異的標的分子に結合し、それにより、その分子の位置を可視化できるものである。

0083

“合成医薬”は、典型的に障害または疾患の予防、処置または診断に有効な人為的に合成された化合物をいうと理解される。

0084

“生物製剤”は、典型的に生物工学的手段を使用して製造され、予防、治療および/またはインビボ診断目的で使用される医薬をいうと理解される。生物製剤は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および核酸(例えばDNA、RNAまたはそのハイブリッド)を含むが、これらに限定されない。承認された治療用生物製剤は、ホルモン(例えばインスリン、hGH、FSHグルカゴン様ペプチド1、副甲状腺ホルモンカルシトニンルトロピングルカゴン)、増殖因子(例えばエリスロポエチン、G−CSFGM−CSF、IGF−1)、インターフェロン(例えばIFN−α、IFN−β、IFN−γ)、インターロイキン(例えばIL−2、IL−11、IL−1Ra)、凝固因子(例えば第VIII因子、第IX因子、第VIIa因子トロンビン)、血栓溶解剤および抗凝固剤(例えばt−PA、ヒルジン、活性化プロテインC)、酵素(例えばα−グルコシダーゼグルコセレブロシダーゼイズロン酸−2−スルファターゼガラクトシダーゼ尿酸オキシダーゼ、DNase)、抗体および抗体フラグメント(例えばIgG、Fab)のような抗原結合分子およびその融合タンパク質(例えばTNFR2−Fc、TMP−Fc、CTLA−4−Fc、IL−1R−Fc、LFA−3−Fc、IL−2−DT)を含むが、これらに限定されない。

0085

本発明における“ペプチドリンカー”は、複合体の2個の部分または成分、例えば2個のペプチドまたはタンパク質を立体的に分けるアミノ酸配列をいう。典型的にこのようなリンカーは、最小で少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30アミノ酸長および最大で少なくとも100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16または15アミノ酸長またはそれ未満を有する1〜100アミノ酸から成る。本発明によるペプチドリンカーの示される好ましい最小および最大長は、組み合わせが数学的意味をなすならば組み合わせてよく、例えばこのようなリンカーは1〜15または12〜40または25〜75または1〜100アミノ酸を有し得る。ペプチドリンカーはまた一緒に結合する2個の部分の間に可動性も提供し得る。このような可動性は、アミノ酸が小さければ一般的に増加する。したがって、可動性ペプチドリンカーは、小アミノ酸、特にグリシンおよび/またはアラニンおよび/またはセリンスレオニンアスパラギンおよびグルタミンのような親水性アミノ酸含量が多い。好ましくは、ペプチドリンカーの20%、30%、40%、50%、60%以上のアミノ酸が小アミノ酸である。

0086

ここで使用する用語“開裂部位”は、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列をいい、ここで、この配列は、例えば、開裂酵素により認識され、または開裂できるために、複合体または高分子(例えば核酸またはタンパク質)の開裂を指示される。典型的に、ポリペプチド鎖はアミノ酸を結合する1個以上のペプチド結合の加水分解により開裂され、ポリヌクレオチド鎖はヌクレオチド間の1個以上のホスホジエステル結合の加水分解により開裂される。ペプチド結合またはホスホジエステル結合の開裂は、化学または酵素開裂により生じ得る。酵素開裂は、制限エンドヌクレアーゼ(例えばI型、II型III型IV型または人工的制限酵素)およびエンドまたはエキソペプチダーゼまたはプロテアーゼ(例えばセリン−プロテアーゼ、システイン−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼグルタミン酸プロテアーゼ)を含むが、これらに限定されないタンパク分解性酵素により達成されるような開裂をいう。典型的に、酵素開裂は、自己開裂により起こるかまたは独立したタンパク分解酵素により実行される。タンパク質またはポリペプチドの酵素開裂は、翻訳時または翻訳後に起こり得る。したがって、ここで使用する用語“エンドペプチダーゼ開裂部位”は、アミノ酸またはヌクレオチド配列内の開裂部位をいい、ここで、この配列はエンドペプチダーゼ(例えばトリプシンペプシンエラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼフューリンサーモリシン、エンドペプチダーゼV8、カテプシン)により開裂されまたは開裂可能である。

0087

ここで使用する用語“自己開裂部位”は、アミノ酸配列内の開裂部位をいい、ここで、この配列は、何らかの付加的分子が関与するような開裂を行わずに開裂されまたは開裂可能である。開裂部位は、典型的に数アミノ酸を含むと理解される。それゆえに、開裂部位はまたペプチドリンカーとして、すなわち2個のペプチドまたはタンパク質を立体的に分離する目的でも役立ち得る。

0088

ここで使用する用語“ベクター”は、細胞に導入され得るまたはその中に含まれるタンパク質および/または核酸を細胞に導入できるタンパク質またはポリヌクレオチドまたはその混合物をいう。本発明において、導入されたポリヌクレオチドによりコードされる目的の遺伝子が、1種以上のベクターの導入により細胞内で発現されるのが好ましい。適切なベクターの例は、プラスミドコスミドファージ、ウイルスまたは人工染色体を含むが、これらに限定されない。

0089

ここで使用する用語“複合体”は、互いに極めて接近しており、共通のまたは相互に関連する機能を発揮する、数個の個別の成分、部分または一部分を含む全体をいう。複合体の個別の部分は性質が同一でも異なってもよく、すなわちそれらはヌクレオチド、アミノ酸、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物および/または脂質のような、しかしこれらに限定されない同一の、類似のまたは異なる化学物質から成ってよい。複合体の例は、数個の関連タンパク質または1種以上のタンパク質および1種以上の核酸の混合物または1種以上のタンパク質および1種以上の脂質および/または炭水化物の混合物から成り得る。同一の、類似のまたは異なる化学物質の任意の組み合わせも包含されると理解される。複合体の個別の部分は相互連結していても、していなくてもよい。典型的に、複合体の個別の部分は共有結合性または非共有結合性結合を介して連結する。

0090

ここで使用する用語“多量体化”は、2個以上の分子、例えばタンパク質または核酸の高分子複合体(すなわち2個、3個、4個、5個またはそれ以上の分子)の形成をいい、一方ここで使用する用語“二量体化”は、2個の分子、例えばタンパク質または核酸の高分子複合体化を特にいう。ホモ二量体は2個の同一分子(いわゆる“ホモ二量体化”)により形成され、一方ヘテロ二量体は2個の異なる高分子(いわゆる“ヘテロ二量体化”)により形成される。典型的に、“二量体”において、2個の高分子は、非共有結合性または共有結合性結合、例えばジスルフィド結合(R−S−S−R)を介して結合する。本発明において、MHD2またはEHD2は、それぞれ、2個のMHD2ドメインの2個のCys337間のジスルフィド結合または2個のEHD2ドメインの2個のCys247およびCys337間のジスルフィド結合(一方のドメインのCys247は他方のドメインのCys337と対形成する)を介して2個のMHD2ドメイン間または2個のEHD2ドメイン間でホモ二量体が形成される点で、“二量体化ツール”として役立ち得る。IgM分子またはIgE分子の重鎖内のMHD2またはEHD2の中心の位置のために、これらのHD2ドメインのN末端および/またはC末端にさらにモジュールを融合できる。これらのモジュールは、上におよび/または下に定義する1種以上の薬学的活性部分を含み得る。したがって、MHD2およびEHD2は、共有結合した二量体化ドメインによりまとめられた多価および二機能性分子の産生を可能にする共有結合した“ホモ二量体化モジュール”として使用される。

0091

ここで使用する用語“モジュラーシステム”は、個々に創製でき、その後複数機能性を駆動するように異なるシステムで使用される、小さい部分(“モジュール”)に細分されるシステムをいう。典型的に、個々のモジュールは孤立した、自己完結型機能要素であり、これは個別の拡張性のある、再利用可能なモジュールに機能的に分割できる。本発明において、用語“モジュール”は、特に高分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは複合体の自給自足部分または分離可能成分をいう。典型的に、モジュールは高分子または複合体の残りと無関係に進化でき、機能できおよび/または存在でき、1個〜数ドメインから成り、その各々は安定かつ独立的に折りたたまれている3次元構造である。このようなモジュールは、典型的に高分子または複合体内に独立した機能単位を形成する。

0092

用語“薬剤”、“医薬”および“薬物”はここでは交換可能に使用し、疾患または障害の鑑別、予防または処置に使用される物質および/または物質の組み合わせをいう。

0093

用語“製剤”および“組成物”は、活性成分が他の担体を伴わずまたは伴って、担体により囲まれた封入体を提供する担体として、すなわち、活性化合物と関連している、封入材料を伴う、活性化合物の製剤を含むことを意図する。

0094

薬学的に許容される”は、動物およびより具体的にヒトにおける使用について、連邦政府または州政府の規制当局により承認されたまたは米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局方に記載されていることを意味する。

0095

用語“活性成分”は、生物学的に活性である、すなわち薬剤価値を提供する医薬組成物または製剤中の物質をいう。医薬組成物は、互いに関連して作用しても独立して作用してもよい1種以上の活性成分を含み得る。活性成分は、中性または塩形態として製剤できる。薬学的に許容される塩は、塩酸リン酸酢酸シュウ酸酒石酸などに由来するものを含むが、これらに限定されない遊離アミノ基と形成されるものおよびナトリウムカリウムアンモニウムカルシウム三価鉄水酸化物イソプロピルアミントリエチルアミン、2−エチルアミノエタノールヒスチジンプロカインなどに由来するものを含むが、これらに限定されない遊離カルボキシル基と形成されるものを含む。

0096

ここで使用する用語“担体”は、治療的活性成分と一緒に投与する希釈剤添加物界面活性剤安定化剤生理学緩衝液または媒体のようなしかしこれらに限定されない薬理学不活性物質をいう。このような医薬担体液体または固体であり得る。液体担体は、水中およびピーナツ油、ダイズ油鉱油ゴマ油などのような石油、動物、植物または合成起源のものを含むが、これらに限定されない油中塩類溶液(saline solution)のような無菌液体を含むが、これらに限定されない。塩類溶液およびデキストロースおよびグリセロール水溶液も、特に注射溶液のために、液体担体として使用できる。医薬組成物を静脈内投与するとき、塩類溶液が好ましい担体である。適切な医薬担体の例は、“Remington's Pharmaceutical Sciences” by E. W. Martinに記載されている。

0098

“界面活性剤”はデオキシコール酸ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム、Triton X−100およびポリソルベート20、ポリソルベート40、ポリソルベート60、ポリソルベート65およびポリソルベート80のようなポリソルベート類のような、しかしこれらに限定されないアニオン性カチオン性および非イオン性界面活性剤を含む。

0099

“安定化剤”は、マンニトール、スクロース、トレハロースアルブミンならびにプロテアーゼおよび/またはヌクレアーゼアンタゴニストを含むが、これらに限定されない。

0100

“生理学的緩衝液”は、塩化ナトリウム溶液脱塩水ならびにリン酸緩衝液クエン酸緩衝液、tris緩衝液(トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、HEPES緩衝液([4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジノ]エタンスルホン酸)またはMOPS緩衝液(3−モルホリノ−1−プロパンスルホン酸)のようなしかしこれらに限定されない適切な有機または無機緩衝液を含むが、これらに限定されない。各緩衝液の選択は、一般に所望の緩衝液モル濃度による。リン酸緩衝液は、例えば、注射および点滴溶液に適切である。

0101

用語“アジュバント”は、細胞レベルまたは液性レベルで組成物の活性成分に対する免疫応答を増大、刺激、活性化、増強または調節する薬剤をいい、例えば免疫性アジュバントは、実際の抗原に対する免疫系の応答を刺激するが、それ自体免疫学的効果はない。このようなアジュバントの例は、無機アジュバント(例えばリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムのような無機金属塩)、有機アジュバント(例えばサポニンまたはスクアレン)、油性アジュバント(例えばフロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント)、サイトカイン(例えばIL−1β、IL−2、IL−7、IL−12、IL−18、GM−CFSおよびINF−γ)、粒子アジュバント(例えば免疫賦活性複合体(ISCOMS)、リポソームまたは生分解性マイクロスフェア)、ビロソーム、細菌アジュバント(例えばモノホスホリルリピドAまたはムラミルペプチド)、合成アジュバント(例えば非イオン性ブロックコポリマー、ムラミルペプチドアナログまたは合成リピドA)または合成ポリヌクレオチドアジュバント(例えばポリアルギニンまたはポリリシン)を含むが、これらに限定されない。

0102

“有効量”または“治療有効量”は、意図する目的を達成するのに十分な治療剤の量である。ある治療剤の有効量は薬剤の性質、投与経路、治療剤を受ける動物の大きさおよび種および投与目的のような因子により変わる。各個別の例における有効量は、当分野で確立された方法に従い、当業者により経験的に決定され得る。

0103

態様
第一の面において、本発明は、IgMまたはIgE由来の重鎖ドメイン2(HD2)および少なくとも1個の薬学的活性部分を含むポリペプチドを提供する。該薬学的活性部分が、IgMまたはIgEのFabまたはFcフラグメントまたはその一部であることは想定されておらず、すなわち本発明は天然起源IgMまたはIgEを含まない。

0104

好ましい態様において、このようなポリペプチドはIgMまたはIgEアイソタイプの重鎖定常ドメインCH1、CH3および/またはCH4の1個以上を含まず、すなわちポリペプチドはCH1、CH3、CH4、CH1およびCH3、CH1およびCH4、CH3およびCH4またはCH1、CH3およびCH4を含まない。

0105

該ポリペプチドがIgEまたはIgMの重鎖ドメイン2 CH2(HD2)のみを含むのが特に好ましい。好ましくは、IgEまたはIgMのさらなる部分は含まない。したがって、該ポリペプチドがIgEまたはIgMの唯一のドメインとしてIgEまたはIgMのHD2ドメインを含むことが想定される。

0106

好ましくは、このようなポリペプチドは、ペプチド結合により結合されたアミノ酸鎖を模倣し、これは所望により化学修飾されていてよく、例えばグリコシル化アミノ酸および/またはリン酸化アミノ酸を含んでよくおよび/またはペグ化、ヘシル化および/またはポリシアル化されていてよい。好ましい態様において、IgMまたはIgEからのHD2は1個以上のシステイン残基を含む。IgMのHD2(MHD2)が少なくとも3個のシステイン残基を含み、好ましくは2個のシステイン残基がドメイン内ジスルフィド結合を形成し、3番目のものがドメイン間ジスルフィド結合の形成を可能にするのが特に好ましい。好ましい態様において、これらのジスルフィド結合は、MHD2のドメイン内および/またはドメイン間安定性を改善する。好ましくは、これらのシステイン残基は、MHD2の261位、321位および337位(KabatによるEU番号)に位置する。さらなる態様において、IgEのHD2(EHD2)が少なくとも4個のシステイン残基を含み、好ましくは2個のシステイン残基がドメイン内ジスルフィド結合を形成し、2個のシステイン残基がドメイン間ジスルフィド結合の形成を可能にするのが好ましい。好ましい態様において、これらのジスルフィド結合は、EHD2のドメイン内および/またはドメイン間安定性を改善する。好ましくは、これらのシステイン残基は、それぞれEHD2の261位および321位および247位および337位(KabatによるEU番号)に位置する。

0107

好ましい態様において、HD2ドメインは配列番号1または配列番号2のアミノ酸配列またはその二量体化変異体を含む。

0108

好ましくは、MHD2は配列番号1に示すアミノ酸配列:AELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDまたはその変異体を含む。

0109

好ましくは、EHD2は配列番号2に示すアミノ酸配列:DFTPPTVKILQSSCDGGGHFPPTIQLLCLVSGYTPGTINITWLEDGQVMDVDLSTASTTQEGELASTQSELTLSQKHWLSDRTYTCQVTYQGHTFEDSTKKCADSNまたはその二量体化変異体を含む。

0110

好ましい態様において、二量体化変異体は、それぞれ配列番号1または配列番号2のMHD2またはEHD2に少なくとも70%配列同一性を有する。変異体がそれぞれ配列番号1または配列番号2のMHD2またはEHD2に少なくとも71%、少なくとも72%、少なくとも73%、少なくとも74%、少なくとも75%、少なくとも76%、少なくとも77%、少なくとも78%、少なくとも79%、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%または少なくとも99%配列同一性を有するのが特に好ましい。特に好ましい態様において、変異体はそれぞれ配列番号1または配列番号2のMHD2またはEHD2に少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%配列同一性を有する。該二量体化変異体が親MHD2またはEHD2の少なくとも1種の生物活性を示す、すなわち機能的活性であるのが好ましい。該二量体化変異体が、第二のMHD2またはEHD2またはその二量体化変異体と二量体化できることにより機能的活性であるのが特に好ましい。

0111

好ましい態様において、該二量体化変異体はアミノ酸交換、好ましくは保存的および/または非保存的アミノ酸交換、アミノ酸欠失および/またはアミノ酸付加を示し得る。好ましくは、これらのアミノ酸交換、欠失および/または付加は、オルソロガスまたはパラロガス配列にほとんどまたはまったく保存されない配列領域内である。好ましくは、保存されたおよび/または高度に保存された配列領域は変更されない。それぞれMHD2およびEHD2のシステイン残基が維持されるのが特に好ましい。

0112

IgM分子またはIgE分子において、HD2は重鎖内の中央部分を占拠し、さらなる重鎖配列が、HD2ドメインのC末端およびN末端で連結されている。これらの連結された重鎖配列は、HD2がその二量体化への機能を発揮する能力に影響しない、変えないまたは阻害しない。したがって、HD2が二量体化する能力に影響せず、変更せずまたは阻害せず、HD2ドメインのN末端および/またはC末端にさらなるモジュールを融合し得ることが想定される。それゆえに、両ドメインとも、化学および生物学的分子(例えば小化学物質、ペプチド、タンパク質、タンパク質ドメイン、タンパク質フラグメント、核酸またはそのハイブリッド)のような、しかしこれらに限定されない、さらなる個別のまたは複数の機能的に異なるモジュールを含むモジュラーシステムにおけるアンカー点として適切である。好ましくは、該モジュールは、HD2の二量体化における機能に影響しない、変えないまたは阻害しないようなサイズ、表面電荷および機能を有する。HD2の機能を妨害するモジュールは、干渉効果を最小化および/または消滅させるためにリンカーペプチドを介して融合させ得る。好ましい態様において、IgMまたはIgEのHD2のC末端および/またはN末端に融合したモジュールは、少なくとも1個の薬学的活性部分を含む。それゆえに、好ましい態様において、少なくとも1個の薬学的活性部分は、HD2のN末端および/またはC末端に連結している。

0113

好ましくは少なくとも1個の薬学的活性部分を含む融合モジュールの数は、HD2のN末端および/またはC末端で1個以上、すなわち1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個以上であり得る。融合モジュールの数は、主に得られたポリペプチドの所望の機能ならびに得られたポリペプチドのサイズまたは表面電荷による機能的または立体的制限により制限されることは当業者により理解される。典型的にこのような得られたポリペプチドは最大サイズ1000kDa、すなわち5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、50kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa、500kDa、550kDa、600kDa、650kDa、700kDa、750kDa、800kDa、850kDa、900kDa、950kDaまたは1000kDaであるが、各状況で適切であるならば、さらに大きくてもよい。

0114

さらなる態様において、好ましくは少なくとも2個の薬学的活性部分を含む、少なくとも2個のモジュールは、IgMまたはIgEのHD2のN末端および/またはC末端のいずれかまたは両者に連結している。各XおよびYモジュールは、それぞれ同一または異なるモジュール、好ましくは同一または異なる薬学的活性部分であり得る。それゆえに、XmモジュールがMHD2またはEHD2ドメインのN末端に連結し、YnモジュールがMHD2またはEHD2ドメインのC末端に連結していることが想定される(ここで、mは好ましくは0〜10、すなわち0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、nは好ましくは0〜10、すなわち0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であるが、mおよびnの少なくとも1個が1以上である)。mおよびnは同一でも異なってもよい。

0115

したがって、このようなポリペプチドは次の構造の一つを有し得る:Xm−MHD2−Yn、より好ましくはX1−MHD2、MHD2−Y1、X1−X2−MHD2、X1−[X]m−1−MHD2、MHD2−Y1−Y2、MHD2−Y1−[Y]n−1、X1−MHD2−Y1、X1−X2−MHD2−Y1−Y2、X1−[X]m−1−MHD2−Y1−[Y]n−1、X1−MHD2−Y1−Y2、X1−MHD2−Y1−[Y]n−1、X1−X2−MHD2−Y1またはX1−[X]m−1−MHD2−Y1;Xm−EHD2−Yn、より好ましくはX1−EHD2、EHD2−Y1、X1−X2−EHD2、X1−[X]m−1−EHD2、EHD2−Y1−Y2、EHD2−Y1−[Y]n−1、X1−EHD2−Y1、X1−X2−EHD2−Y1−Y2、X1−[X]m−1−EHD2−Y1−[Y]n−1、X1−EHD2−Y1−Y2、X1−EHD2−Y1−[Y]n−1、X1−X2−EHD2−Y1またはX1−[X]m−1−EHD2−Y1(ここで、mは好ましくは0〜10、すなわち0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であり、nは好ましくは0〜10、すなわち0、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10であるが、ただし、mおよびnの少なくとも1個が1以上である)。Mおよびnは同一でも異なってもよい。mおよびnの特に好ましい組み合わせは次のものである:m=1およびn=0;m=0およびn=1、m=1およびn=1;m=1およびn=2;m=1およびn=3;m=1およびn=4;m=1およびn=5;m=1およびn=6;m=1およびn=7;m=1およびn=8;m=1およびn=9;m=1およびn=10;m=2およびn=1;m=2およびn=2;m=2およびn=3;m=2およびn=4;m=2およびn=5;m=2およびn=6;m=2およびn=7;m=2およびn=8;m=2およびn=9;m=2およびn=10;m=3およびn=1;m=3およびn=2;m=3およびn=3;m=3およびn=4;m=3およびn=5;m=3およびn=6;m=3およびn=7;m=3およびn=8;m=3およびn=9;m=3およびn=10;m=4およびn=1;m=4およびn=2;m=4およびn=3;m=4およびn=4;m=4およびn=5;m=4およびn=6;m=4およびn=7;m=4およびn=8;m=4およびn=9;m=4およびn=10;m=5およびn=1;m=5およびn=2;m=5およびn=3;m=5およびn=4;m=5およびn=5;m=5およびn=6;m=5およびn=7;m=5およびn=8;m=5およびn=9;m=5およびn=10;m=6およびn=1;m=6およびn=2;m=6およびn=3;m=6およびn=4;m=6およびn=5;m=6およびn=6;m=6およびn=7;m=6およびn=8;m=6およびn=9;m=6およびn=10;m=7およびn=1;m=7およびn=2;m=7およびn=3;m=7およびn=4;m=7およびn=5;m=7およびn=6;m=7およびn=7;m=7およびn=8;m=7およびn=9;m=7およびn=10;m=8およびn=1;m=8およびn=2;m=8およびn=3;m=8およびn=4;m=8およびn=5;m=8およびn=6;m=8およびn=7;m=8およびn=8;m=8およびn=9;m=8およびn=10;m=9およびn=1;m=9およびn=2;m=9およびn=3;m=9およびn=4;m=9およびn=5;m=9およびn=6;m=9およびn=7;m=9およびn=8;m=9およびn=9;m=9およびn=10;m=10およびn=1;m=10およびn=2;m=10およびn=3;m=10およびn=4;m=10およびn=5;m=10およびn=6;m=10およびn=7;m=10およびn=8;m=10およびn=9;m=10およびn=10。

0116

モジュール、好ましくは薬学的活性部分は、MHD2またはEHD2に直接連結してよくまたは1個以上のリンカー(L)を介して間接的に連結してよい。1個を超えるモジュールがHD2ドメインに連結している態様において、個々のモジュールは互いに直接的に連結してよくまたは1個以上のリンカー(L)を介して間接的に連結してよい。MHD2およびEHD2それぞれの二量体化またはさらに連結したモジュールの機能を妨害するモジュールは、好ましくはリンカーを介して間接的に連結する。同様に、MHD2およびEHD2の二量体化が薬学的活性部分の薬剤活性を妨害するならば、リンカーを介して連結する間接的連結の使用が好ましい。それゆえに、好ましい態様において、少なくとも1個の薬学的活性部分をHD2に直接的にまたは1個以上のリンカーを介して間接的に連結している。

0117

好ましくは、1個以上のリンカーは、連結したモジュール、好ましくは薬学的活性部分をHD2ドメインと立体的に分離するペプチドリンカーを含む。1個を超えるモジュール、好ましくは薬学的活性部分がHD2ドメインに連結している態様において、リンカーは、異なる連結しているモジュールを互いに立体的に分離するペプチドリンカーを含む。

0118

好ましくは、ペプチドリンカーは5〜40アミノ酸長(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40アミノ酸長)、より好ましくは5〜20アミノ酸長(すなわち1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20アミノ酸長)、最も好ましくは8〜15アミノ酸長(すなわち8、9、10、11、12、13、14、15アミノ酸長)を有する。融合モジュールとHD2ドメインまたはさらに連結したモジュールの立体的分離を可能にする適切な長さのリンカーは、当分野で周知の慣用法を使用して当業者が選択できる(Arai et al., 2001;George & Heringa et al., 2003; Wriggers et al., 2005;Tanaka et al., 2005)。

0119

特に好ましいのは可動性ペプチドリンカーである。可動性リンカーは、アミノ酸鎖の回転または屈曲を妨害する嵩高い側鎖を有しないアミノ酸から成る。可動性リンカーは、好ましくはG残基、S残基、T残基およびA残基を含む。好ましくは可動性リンカーペプチドの少なくとも50%のアミノ酸が、G、S、TおよびAから成る群から選択されるアミノ酸から成る。より好ましくはリンカーの少なくとも60%、70%、80%、90%、95%または100%のアミノ酸がG、S、TおよびAから成る群から選択されるアミノ酸から成る。

0120

HD2ドメインとモジュール、好ましくは薬学的活性部分を立体的に分離するのに適する数多くのペプチドリンカーが文献に記載されている(Robinson & Sauer, 1998; Voelkel et al., 2001; Kavoosi et al., 2007; Watanabe et al., 2011)。好ましいペプチドリンカーは、リンカーペプチド1:GGGGS(配列番号18)、リンカーペプチド2:GGGGSGGGGS(配列番号19)、リンカーペプチド3:GGGGSGGGGSGGGGS(配列番号20)、リンカーペプチド4:GSLGGSGG(配列番号21)、リンカーペプチド5:GGGSGGGT(配列番号22)、リンカーペプチド6:GGGSGGGTGS(配列番号23)、リンカーペプチド7:GGGSGGGTGSGG(配列番号24)、リンカーペプチド8:GGGSGGGS(配列番号25)、リンカーペプチド9:EFTRG(配列番号26)およびリンカーペプチド10:AAA(配列番号27)またはその多量体、誘導体およびフラグメントを含むが、これらに限定されない。

0121

さらに好ましい態様において、1個以上のリンカーは1箇所以上の開裂部位、すなわちリンカー配列が1個以上のペプチド結合の分割により化学的または酵素的に開裂し得る1個以上の配列領域を含む。開裂部位が、意図する目的地に到達したら、薬学的活性部分の遊離を可能にするのが好ましい。酵素開裂は、制限エンドヌクレアーゼ(例えばI型、II型、III型、IV型または人工的制限酵素)およびエンドまたはエキソペプチダーゼまたはプロテアーゼ(例えばセリン−プロテアーゼ、システイン−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ)を含むが、これらに限定されないタンパク分解性酵素により達成され得る。特に好ましい態様において、一箇所以上の開裂部位は、一箇所以上のエンドペプチダーゼ開裂部位、すなわち配列がトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、トロンビン、コラゲナーゼ、フューリン、サーモリシン、エンドペプチダーゼV8および/またはカテプシンのような、しかしこれらに限定されないエンドペプチダーゼにより開裂されるまたは開裂可能である場所を含む。

0122

何個のモジュールがHD2に結合するかによって、ペプチドリンカーはHD2ドメインのC末端および/またはN末端の間ならびに異なるモジュール間に位置し得ることも想定される。1個を超えるリンカーが異なるモジュールおよび/またはHD2ドメイン間に存在する態様において、これらのリンカーは同一でも互いに異なってもよい。したがって、このようなポリペプチドは次の構造の1個を有し得る:
X1−L−MHD2、X1−X2−L−MHD2、X1−L−X2−L−MHD2、X1−L−X2−MHD2、X1−[X]m−1−L−MHD2、X1−L−[X]m−1−L−MHD2、X1−L−[X]m−1−MHD2、Y1−L−MHD2、Y1−Y2−L−MHD2、Y1−L−Y2−L−MHD2、Y1−L−Y2−MHD2、Y1−[Y]n−1−L−MHD2、Y1−L−[Y]n−1−L−MHD2、Y1−L−[Y]n−1−MHD2、X1−L−MHD2−L−Y1、X1−MHD2−L−Y1、X1−L−MHD2−Y1、X1−X2−L−MHD2−L−Y1−Y2、X1−X2−MHD2−L−Y1−Y2、X1−X2−L−MHD2−Y1−Y2、X1−L−X2−L−MHD2−L−Y1−L−Y2、X1−X2−L−MHD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−MHD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−MHD2−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−MHD2−L−Y1−Y2、X1−L−X2−MHD2−Y1−L−Y2、X1−X2−MHD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−MHD2−Y1−Y2、X1−[X]n−1−L−MHD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−[X]m−1−MHD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−[X]m−1−L−MHD2−Y1−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−L−MHD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−[X]m−1−L−MHD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−MHD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−X2−L−MHD2−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−L−MHD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−MHD2−Y1−L−[Y]n−1、X1−[X]m−1−MHD2−L−Y1−L−[Y]n−1またはX1−L−[X]m−1−L−MHD2−Y1−[Y]m−1;
X1−L−EHD2、X1−X2−L−EHD2、X1−L−X2−L−EHD2、X1−L−X2−EHD2、X1−[X]m−1−L−EHD2、X1−L−[X]m−1−L−EHD2、X1−L−[X]m−1−EHD2、Y1−L−EHD2、Y1−Y2−L−EHD2、Y1−L−Y2−L−EHD2、Y1−L−Y2−EHD2、Y1−[Y]n−1−L−EHD2、Y1−L−[Y]n−1−L−EHD2、Y1−L−[Y]n−1−EHD2、X1−L−EHD2−L−Y1、X1−EHD2−L−Y1、X1−L−EHD2−Y1、X1−X2−L−EHD2−L−Y1−Y2、X1−X2−EHD2−L−Y1−Y2、X1−X2−L−EHD2−Y1−Y2、X1−L−X2−L−EHD2−L−Y1−L−Y2、X1−X2−L−EHD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−EHD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−EHD2−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−EHD2−L−Y1−Y2、X1−L−X2−EHD2−Y1−L−Y2、X1−X2−EHD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−EHD2−Y1−Y2、X1−[X]m−1−L−EHD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−[X]m−1−EHD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−[X]m−1−L−EHD2−Y1−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−L−EHD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−[X]m−1−L−EHD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−EHD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−X2−L−EHD2−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−L−EHD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−EHD2−Y1−L−[Y]n−1、X1−[X]m−1−EHD2−L−Y1−L−[Y]n−1またはX1−L−[X]m−1−L−EHD2−Y1−[Y]n−1。mおよびnは各場合上記の好ましいおよび特にこのまし意味を有する。

0123

好ましい態様において、少なくとも1個の薬学的活性部分は合成医薬または生物製剤である。少なくとも1個の薬学的活性部分が生物製剤である態様において、このような生物製剤がペプチド、ポリペプチド、タンパク質および/または核酸(例えばDNA、RNAまたはそのハイブリッド)であるのが好ましい。特に好ましい態様において、このような生物製剤はホルモン(例えばインスリン、hGH、FSH、グルカゴン様ペプチド1、副甲状腺ホルモン、カルシトニン、ルトロピン、グルカゴン);増殖因子(例えばエリスロポエチン、トロンボポエチン、G−CSF/GM−CSF、IGF−1);インターフェロン(例えばIFN−α、IFN−β、IFN−γ)およびインターロイキン(例えばIL−2、IL−11、IL−1Ra)のようなサイトカイン(例えばTNF、TRAIL、TGF−β);凝固因子(例えば第VIII因子、第IX因子、第VIIa因子、トロンビン);血栓溶解剤および抗凝固剤(例えばt−PA、ヒルジン、活性化プロテインC);酵素(例えばα−グルコシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、イズロン酸−2−スルファターゼ、ガラクトシダーゼ、尿酸オキシダーゼ、DNase);抗体および抗体フラグメント(例えばIgG、Fab、Fc)のような抗原結合分子;およびその融合タンパク質(例えばTNFR2−Fc、TMP−Fc、CTLA−4−Fc、IL−1R−Fc、LFA−3−Fc、IL−2−DT)から成る群から選択される。

0124

さらに好ましい態様において、少なくとも1個の薬学的活性部分はリガンド、エフェクター分子、半減期延長モジュールおよび造影分子から成る群から選択される。好ましくは、リガンドは、基質、阻害剤およびアクティベーターのような特異的生物学的機能を発揮するために他の分子と複合体を形成する任意の化学的または生物学的物質である。より好ましくは、リガンドは抗原結合分子、足場タンパク質(Scaffold proteins)、天然リガンド(例えばEGF、VEGF、PDGF、FGF、EPO、TPO、TGF−β、TNF、TRAIL)、リガンド結合受容体フラグメント(例えばTNFR1、TNFR2、VEGFR、CTLA−4、LFA−3、BR3、CD95R、IL−1R、FGFR1)およびアプタマー(例えば抗トロンビン、抗FIXa、抗C3b、抗VEGF、抗CD40L)を含むが、これらに限定されない。

0125

好ましくは、足場タンパク質は、KSR、MEKK1、BCL−10、MAPK、AHNAK−1、HOMER、Pellino、NLRP、DLG1、スピフィリン、植物FLU調節タンパク質を含むが、これらに限定されない重要なシグナル伝達経路制御因子である。

0126

好ましくは、抗原結合分子は、抗体フラグメント、Fabフラグメント(IgMまたはIgEのものを除く)、Fab’フラグメント(IgMまたはIgEのものを除く)、重鎖抗体シングルドメイン抗体(sdAb)、重鎖抗体の可変ドメイン、VHH、ナノボディ、単一鎖可変フラグメント(scFv)、直列型scFv、二重特異性T細胞エンゲージャー(BITE)、二重特異性抗体、単一鎖二重特異性抗体、DART分子、トリプルボディ、ナノ抗体、代替足場タンパク質(例えばダルピンアンチカリンアフィボディ分子、ミクロボディモノボディ、フィノマー、アドネクチン(Adnetins)、テトラネクチンクニッツドメイン、アフィリン、アビマー)およびその融合タンパク質から成る群から選択される。抗原結合分子が薬学的に関連する、すなわち疾患または疾患または障害の症状の予防、診断および/または処置に適切である抗原に結合するのが好ましい。好ましい態様において、疾患は癌タイプ疾患である。好ましくは、抗原結合分子は、EGFR、HER2、HER3、HER4、癌胎児性抗原(CEA)、アルファフェトプロテイン(AFP)、CA−125、上皮性腫瘍抗原(ETA)、about:blank、黒色腫関連抗原(MAGE)およびrasおよびp53の異常産物、エストロゲン受容体、5−アルファ−レダクターゼプロスタグランジンエンドペルオキシドシンターゼ2、VEGFRs、インテグリン受容体ファミリー線維芽細胞活性化タンパク質ガレクチン、EpCAM、CEA、CD44、CD44v、CD2、CD5、CD7、CD19、CD20、CD21、CD22、CD24、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD52、CD56、CD71、CD72、CD73、CD105、CD117、CD123、claudins、c−Met、PDGFR、IGF1−R、HMW−MAA、TAG−72、GD2、GD3、GM2、葉酸受容体、Ley、MUC−1、MUC−2、PSMA、PSCAおよびuPARのような、しかしこれらに限定されない腫瘍関連抗原を認識する。好ましい態様において、抗原結合分子は、IgMまたはIgEからのFabまたはFcフラグメントではないことが想定される。

0127

特に好ましい態様において、抗原結合分子はscFv、好ましくは抗HER2 scFvまたは抗EGFRscFv、より好ましくは配列番号3または4に従うものまたはその変異体である。

0128

好ましい態様において、タンパク質と結合し、それによりそのタンパク質の活性を変えるエフェクター分子、すなわち小分子、ペプチドまたはポリペプチドは、サイトカイン、ケモカイン、免疫(共)刺激性分子、免疫抑制性分子、デスリガンド、アポトーシス誘発タンパク質、酵素(例えばキナーゼ)プロドラッグ変換酵素、RNase、アゴニスト抗体または抗体フラグメント、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメント、毒素、増殖因子、ホルモン、凝固因子、線維素溶解性タンパク質、これらを模倣するペプチドおよびそのフラグメント、融合タンパク質または誘導体を含むが、これらに限定されない。

0129

好ましい態様において、サイトカインはインターロイキンおよび/またはインターフェロンである。インターロイキン(IL)は、インターロイキン−1、インターロイキン−2、インターロイキン−3、インターロイキン−4、インターロイキン−5、インターロイキン−6、インターロイキン−7、インターロイキン−8、インターロイキン−9、インターロイキン−10、インターロイキン−11、インターロイキン12、インターロイキン−13、インターロイキン−14、インターロイキン−15、インターロイキン−16、インターロイキン−17、インターロイキン−18、インターロイキン−19、インターロイキン−20、インターロイキン−21、インターロイキン−22、インターロイキン−23、インターロイキン−24、インターロイキン−25、インターロイキン−26インターロイキン−27、インターロイキン−28、インターロイキン−29、インターロイキン−30、インターロイキン−31、インターロイキン−32、インターロイキン−33、インターロイキン−34およびインターロイキン−35を含むが、これらに限定されない。インターフェロン(IFN)は、インターフェロンI型(例えばIFN−α、IFN−βおよびIFN−ω)、インターフェロンII型(例えばIFN−γ)およびインターフェロンIII型を含むが、これらに限定されない。特に包含されるのは、インターフェロンA1、インターフェロンA2、インターフェロンA4、インターフェロンA5、インターフェロンA6、インターフェロンA7、インターフェロンA8、インターフェロンA10、インターフェロンA13、インターフェロンA14、インターフェロンA16、インターフェロンA17、インターフェロンA21、インターフェロンB1、TNF、TRAILおよびFasLである。

0130

好ましい態様において、ケモカインは、CCケモカインCXCケモカイン、CケモカインおよびCX3Cケモカインを含むが、これらに限定されない。特にケモカインは、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2およびCX3CL1を含むが、これらに限定されない。

0131

好ましい態様において、免疫(共)刺激性タンパク質は、B7.1、B7.2、4−1BBL、LIGHT、ICOSL、GITRL、CD40L、OX40LおよびCD70を含むが、これらに限定されない。

0132

免疫抑制性タンパク質は、好ましくはIL1−Ra、IL−10、CTLA−4、PD−L1およびPD−L2および、好ましくはシュードモナス外毒素A、ジフテリア毒素およびリシンを含むが、これらに限定されない毒素を含むが、これらに限定されない。

0133

好ましい態様において、アポトーシス誘発タンパク質は、Bid、Bik、PumaおよびBimならびにTNF、scTNF、TRAIL、scTRAILおよびFasLのようなしかしこれらに限定されないアポトーシス促進性サイトカイン(デスリガンド)を含むが、これらに限定されない。

0134

好ましい態様において、酵素は、オキシドレダクターゼトランスフェラーゼヒドロラーゼリアーゼイソメラーゼリガーゼを含むが、これらに限定されない。キナーゼは、PKA、PKCおよびPKGのようなAGCキナーゼ、カルシウム/カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼおよびセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ(例えばDAPK2)のようなCaMキナーゼ、カゼインキナーゼ1群のようなCK1、CDK、MAPK、GSK3およびCLKキナーゼのようなCMGC、酵母ステリル(Sterile)7、ステリル11およびステリル20キナーゼのホモログのようなSTE、チロシンキナーゼ(TK)、チロシン−キナーゼ様群のキナーゼ(TKL)、受容体関連チロシンキナーゼ、MAPキナーゼおよびヒスチジンキナーゼを含むが、これらに限定されない。

0135

プロドラッグ変換酵素は、アセチルエステラーゼチオールエステルヒドロラーゼ、リン酸モノエステルヒドロラーゼ、一リン酸ジエステルヒドロラーゼ、三リン酸モノエステルヒドロラーゼ、硫酸エステルヒドロラーゼ(スルファターゼ)、二リン酸モノエステルヒドロラーゼおよびリン酸トリエステルヒドロラーゼのような、しかしこれらに限定されないエステラーゼ;チロシン特異的ホスファターゼ、セリン/スレオニン特異的ホスファターゼ、二重特異性ホスファターゼ、ヒスチジンホスファターゼおよび脂質ホスファターゼのような、しかしこれらに限定されないホスファターゼ;および5−アルファレダクターゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、HMG−CoAレダクターゼメトヘモグロビンレダクターゼリボヌクレオチドレダクターゼ、チオレドキシンレダクターゼ大腸菌ニトロレダクターゼメチレンテトラヒドロ葉酸レダクターゼおよびカルボキシペプチダーゼG2、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、チミジンキナーゼのような、しかしこれらに限定されないレダクターゼを含むが、これらに限定されない。

0136

RNaseは、RNase A、RNase H、RNase I、RNase III、RNase L、RNase P、RNase PhyM、RNase T1、RNase T2、RNase U2、RNase V1およびRNase Vのような、しかしこれらに限定されないエンドリボヌクレアーゼならびにポリヌクレオチドホスホリラーゼ(PNPase)、RNase PH、RNase II、RNase R、RNase D、RNase T、オリゴリボヌクレアーゼエキソリボヌクレアーゼIおよびエキソリボヌクレアーゼIIのような、しかしこれらに限定されないエキソリボヌクレアーゼを含む。

0137

アゴニスト抗体または抗体フラグメントは、受容体シグナル伝達遺伝子発現タンパク質合成およびタンパク質分解、例えばTRAIL受容体、抗グルココルチコイド誘発腫瘍壊死因子ファミリー受容体(GITR)およびCD40に対するような、しかしこれらに限定されない組織、臓器または個体で作用を起こすものを含む。典型的に、アゴニスト抗体または抗体フラグメントは、受容体分子活性部位またはアロステリック部位と結合し、それにより特異的反応を誘発する。

0138

アンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、アゴニストの作用を遮断するものを含む。典型的に、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、受容体分子の活性部位またはアロステリック部位と結合することによりまたは受容体活性制御に通常関与しない独特結合部位と結合することにより作用し、例えば抗CTLA−4、抗TNFR1、抗VEGFR、抗PDGFR、抗EGFR、抗Her2である。典型的に、アンタゴニスト抗体または抗体フラグメントは、構造的に明確な結合部位でアゴニストと競合するかまたはアゴニストがその結合による通常発揮する作用を起こすことができないような方法でアゴニストの結合部位を変える。

0139

好ましい態様において、増殖因子は、アドレノメデュリン(AM)、アンギオポエチン(Ang)、自己分泌運動性因子骨形成タンパク質(BMPs)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、上皮細胞増殖因子(EGF)、エリスロポエチン(EPO)、線維芽細胞増殖因子(FGF)、グリア細胞株由来神経栄養因子(GDNF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、増殖分化因子−9(GDF9)、肝細胞増殖因子(HGF)、Hep原子a由来増殖因子(HDGF)、インシュリン様増殖因子(IGF)、遊走刺激因子ミオスタチン(GDF−8)、神経増殖因子(NGF)および他のニューロトロフィン血小板由来増殖因子(PDGF)、トロンボポエチン(TPO)、トランスフォーミング増殖因子アルファ(TGF−α)、トランスフォーミング増殖因子ベータ(TGF−β)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、Wntシグナル伝達経路および胎盤増殖因子(PlGF)を含むが、これらに限定されない。

0140

好ましい態様において、凝固因子は、トロンビン、第V因子、第VII因子、第VIII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子および第XIII因子およびその活性フラグメントを含むが、これらに限定されない。

0141

好ましい態様において、線維素溶解性タンパク質は、プラスミンウロキナーゼプラスミノーゲン、α2−抗プラスミン、組織−プラスミノーゲンアクティベーター(t−PA)およびプラスミノーゲン活性化因子インヒビター−1(PAI−1)を含むが、これらに限定されない。

0142

特に好ましい態様において、サイトカインは腫瘍壊死因子(TNF)、より好ましくは配列番号5に従うものまたはその変異体である。さらに好ましい態様において、サイトカインはTNF関連アポトーシス誘発因子(TRAIL)、より好ましくは配列番号6に従うものまたはその変異体である。

0143

模倣ペプチドおよびタンパク質は、トロンボポエチン模倣ペプチド、エリスロポエチン模倣ペプチドのような、しかしこれらに限定されない、他のペプチドまたはタンパク質、特に上記または下記のペプチドまたはタンパク質の活性を模倣するペプチドおよびタンパク質を含む。

0144

さらなる態様において、半減期延長モジュールは、本発明のポリペプチドの半減期、例えば“血漿半減期”または“血清半減期”を変える化学的または生物学的物質である。好ましくは、半減期延長モジュールは、免疫グロブリン結合ドメイン(IgBD)、アルブミン、アルブミン結合ドメイン(ABD)、ペプチド、小分子、脂肪酸、抗体フラグメント、シングルドメイン抗体、VHH、足場タンパク質および長期循環血漿タンパク質に対する親和性を示す天然リガンドからなる群から選択され、このいずれも所望によりペグ化、ヘシル化、ポリシアル化、N−グリコシル化、O−グリコシル化されたまたはPEG模倣ポリペプチドであってよい。好ましくは、IgBDはIg分子のドメインのいずれか、すなわちIg分子の可変ドメインVHまたはVLおよび/または定常ドメインCH1、CH2、CH3 CH4および/またはCLに結合し得る。IGBDは、黄色ブドウ球菌プロテインA(SpA)、連鎖球菌プロテインG(SpG)、ペプトストレプトコッカスマグヌスのプロテインL(PpL)、大腸菌のプロテインEib、ブドウ球菌のプロテインSbiおよび連鎖球菌プロテインMAG、MIG、H、MおよびZAG由来のドメインを含むが、これらに限定されない。

0145

さらなる態様において、造影分子は、特異的標的分子と結合し、それにより、その分子の位置を可視化するものである。好ましくは、造影分子は、生物発光試薬化学発光試薬蛍光造影剤光増感剤キレート試薬および放射性部分から成る群から選択される。

0146

造影分子は、レニラレニフォルミスおよび/またはメトリディア・ロンガからのルシフェラーゼ、過シュウ酸、ポリメチン(例えばCy3、Cy5、Cy5.5、Cy7のようなシアニン色素)、スクアライン誘導体、フタロシアニンポルフィリン誘導体およびBODIPYアナログ(BODIPYFL、BODIPY R6G、BODIPY TR、BODIPYTMR、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)ならびにGFP、EGPF、CFP、BFP、YFP、DsREDのような、しかしこれらに限定されない蛍光タンパク質のような、しかしこれらに限定されない生物発光化学発光および蛍光造影剤を含む(Chudakov et al. (2010) Physiol. Rev. 90:1103-1163)。

0147

キレート試薬は、カルシウム、マグネシウム、鉄、アルミニウム亜鉛、銅、ヒ素、鉛、タリウムおよび水銀イオンのような、しかしこれらに限定されない少なくとも1種の金属イオンを、キレート化により結合できる。このようなキレート試薬は、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、エチレンジアミンテトラ酢酸(カルシウム二ナトリウムベルサント)(CaNa2−EDTA)、ジメルカプロール(BAL)、ジメルカプトコハク酸(DMSA)、ジメルカプトプロパンスルホネート(DMPS)、フェリチンデフェロキサミンおよびデフェラシロクスデフェリプロン(1,2−ジメチル−3−ヒドロキシル−4−ピリジノン)、DOTA、DTPA、DADT、DADS、DO3A、N2S2MAMA、トリアミドチオールホスホネート、有機ガドリニウム錯体ペニシラミンおよびテトラサイクリン系抗生物質を含み得る。

0148

好ましい態様において、放射性部分は、放射性核種を含み得る。放射性部分は、F、Br、Mn、Co、Ga、As、Zr、P、C、S、H、I、In、Lu、Cu、Rh、Bi、At、Y、Re、Ac、TcまたはHg原子同位体であり得る。放射性部分は、本発明のポリペプチドを放射性に標識し、例えばヒト体内での、その検出を可能にし、診断的手法(放射免疫検出法:RAID)と有用となるだけでなく、治療適用(放射免疫治療:RAIT)にも適するものとする。

0149

光増感剤は、特異的波長の光で励起後、発光またはフリーラジカルおよび一重項酸素形成が可能な化学化合物である。光増感剤は、例えば光線力学的治療のために使用される。好ましい態様において、光増感剤は、特にHpD、ALA、M−ALA、ベルテポルフィンルテサフィリン(Lutexaphyrin)、テモポルフィンタラポルフィン、HPPH、フタロシアニンおよびナフタロシアニンを含む、ポルフィリンファミリー、テキサフィリンファミリー、クロリンファミリーおよびフタロシアニンファミリーの化合物を含むが、これらに限定されない。

0150

特に好ましい態様において、ポリペプチドは、C末端にscFvEGFRが融合および/またはN末端にscFVHER2が融合したMHD2ドメインを含む。さらに好ましい態様において、scTRAILまたはscTNFは、MHD2ドメインのC末端および/またはN末端に融合している。特に好ましい態様において、scFvEGFRはMHD2のN末端に融合し、scFvHER2はMHD2のC末端に融合している。さらに好ましい態様において、scFvEGFRはMHD2のN末端に融合し、scTNFはMHD2のC末端に融合している。さらに好ましい態様において、scFvEGFRはMHD2のN末端に融合し、scTRAILはMHD2のC末端に融合している。さらに好ましい態様において、scDbEpCAMxEGFRはMHD2のN末端に融合し、scTRAILはMHD2のC末端に融合している。極めて好ましいのは、配列番号7、8、9、10、11、12、13または14に従うポリペプチドである。

0151

特に好ましい態様において、ポリペプチドは、C末端にscFvEGFRが融合および/またはN末端にscFVHER2が融合しているEHD2ドメインである。さらに好ましい態様において、scTRAILまたはscTNFは、EHD2ドメインのC末端および/またはN末端に融合している。特に好ましい態様において、scFvEGFRはEHD2のN末端に融合し、scFvHER2はEHD2のC末端に融合している。さらに好ましい態様において、scFvEGFRはEHD2のN末端に融合し、scTNFはEHD2のC末端に融合している。さらに好ましい態様において、scFvEGFRはEHD2のN末端に融合し、scTRAILはEHD2のC末端に融合している。さらに好ましい態様において、scDbEpCAMxEGFRはEHD2のN末端に融合し、scTRAILはEHD2のC末端に融合している。極めて好ましいのは、配列番号15、16または17に従うポリペプチドである。

0152

第二の面において、本発明は、本発明の第一の面のポリペプチドをコードする配列を含む、核酸分子を提供する。好ましくは、このような核酸分子はDNAおよび/またはRNA分子を含む。

0153

第三の面において、本発明は、本発明の第二の面のポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。適切なベクターは、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスおよび/または人工染色体を含むが、これらに限定されないことが理解される。

0154

第四の面において、本発明は、本発明の第一の面の少なくとも2個のポリペプチドを含む複合体を提供する。好ましい態様において、少なくとも2個のポリペプチドは、HD2ドメインを介して、好ましくは共有結合性または非共有結合性結合を介して連結している。共有結合性結合が、好ましくは各々各ポリペプチドのHD2ドメイン内に存在する2個のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合であるのが特に好ましい。複合体を形成する少なくとも2個のポリペプチドは同一または異なるHD2ドメインを含み得る。複合体を形成する少なくとも2個のポリペプチドが同一HD2を含む、すなわち複合体を形成する少なくとも2個のポリペプチドがMHD2を含むまたは複合体を形成する少なくとも2個のポリペプチドがEHD2を含むのが、特に好ましい。

0155

少なくとも2個のポリペプチドは、HD2のN末端および/またはC末端ドメインに融合するモジュールに関してまたはHD2ドメインと融合モジュールを連結するリンカーペプチドに関して同一でも異なってもよく、すなわちそれらは上に詳述したとおり、HD2ドメインに連結した同一または異なるモジュール、好ましくは薬学的活性部分を含んでよく、異なるモジュールを連結する異なるペプチドリンカーを含んでよい。それゆえに、好ましい態様において、複合体は、次の構造の少なくとも2個のポリペプチドを含み、ここで、少なくとも2個のポリペプチドは同一または異なる:
X1−HD2、HD2−Y1、X1−X2−HD2、X1−[X]m−1−HD2、HD2−Y1−Y2、HD2−Y1−[Y]n−1、X1−HD2−Y1、X1−X2−HD2−Y1−Y2、X1−[X]m−1−HD2−Y1−[Y]n−1、X1−HD2−Y1−Y2、X1−HD2−Y1−Yn、X1−X2−HD2−Y1、X1−[X]m−1−HD2−Y1、X1−L−HD2、X1−X2−L−HD2、X1−L−X2−L−HD2、X1−L−X2−HD2、X1−[X]m−1−L−HD2、X1−L−[X]m−1−L−HD2、X1−L−[X]m−1−HD2、Y1−L−HD2、Y1−Y2−L−HD2、Y1−L−Y2−L−HD2、Y1−L−Y2−HD2、Y1−[Y]n−1−L−HD2、Y1−L−[Y]n−1−L−HD2、Y1−L−[Y]n−1−HD2、X1−L−HD2−L−Y1、X1−HD2−L−Y1、X1−L−HD2−Y1、X1−X2−L−HD2−L−Y1−Y2、X1−X2−HD2−L−Y1−Y2、X1−X2−L−HD2−Y1−Y2、X1−L−X2−L−HD2−L−Y1−L−Y2、X1−X2−L−HD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−HD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−HD2−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−HD2−L−Y1−Y2、X1−L−X2−HD2−Y1−L−Y2、X1−X2−HD2−L−Y1−L−Y2、X1−L−X2−L−HD2−Y1−Y2、X1−[X]m−1−L−HD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−[X]m−1−HD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−[X]m−1−L−HD2−Y1−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−L−HD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−[X]m−1−L−HD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−HD2−L−Y1−L−[Y]n−1、X1−L−X2−L−HD2−Y1−L−[Y]m−1、X1−L−[X]m−1−L−HD2−L−Y1−[Y]n−1、X1−L−[X]m−1−HD2−Y1−L−[Y]n−1、X1−[X]m−1−HD2−L−Y1−L−[Y]n−1またはX1−L−[X]m−1−L−HD2−Y1−[Y]n−1。mおよびnは各場合上記の好ましいおよび特にこのまし意味を有する。

0156

特に好ましい態様において、複合体は、2個のポリペプチド間で形成され、その各々は、C末端にscFvEGFRが融合および/またはN末端にscFVHER2が融合したMHD2ドメイン;C末端および/またはN末端にscTRAILまたはscTNFが融合したMHD2ドメイン;N末端にscFvEGFRが融合し、C末端にcFvHER2が融合したMHD2、N末端にscFvEGFRが融合し、C末端にscTNFが融合したMHD2ドメイン;N末端にscFvEGFRが融合し、C末端にscTRAILが融合したMHD2;およびN末端にscDbEpCAMxEGFRが融合し、C末端にscTRAILが融合したMHD2を含む。極めて好ましいのは、配列番号7、8、9、10、11、12、13または14に従う2個のポリペプチド間で形成された複合体である。

0157

特に好ましい態様において、複合体は2個のポリペプチド間で形成され、その各々は、C末端にscFvEGFRが融合および/またはN末端にscFVHER2が融合したEHD2ドメイン;C末端および/またはN末端にscTRAILまたはscTNFが融合したEHD2ドメイン;N末端にscFvEGFRが融合し、C末端にscFvHER2が融合したEHD2、N末端にscFvEGFRが融合し、C末端にscTNFが融合したEHD2ドメイン;N末端にscFvEGFRが融合し、C末端にscTRAILが融合したEHD2;およびN末端にscDbEpCAMxEGFRが融合し、C末端にscTRAILが融合したEHD2を含む。極めて好ましいのは、配列番号15、16または17に従う2個のポリペプチド間で形成された複合体である。

0158

第五の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクターまたは第四の面の複合体を含む、細胞を提供する。このような細胞は原核細胞(例えば細菌細胞)または真核細胞(例えば真菌、植物または動物細胞)を含むが、これらに限定されないことは理解される。

0159

第六の面において、本発明は、第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞および薬学的に許容される担体および/または添加物を含む、組成物を提供する。好ましくは、このような組成物は医薬組成物である。

0160

好ましい態様において、医薬組成物は、さらに薬学的に許容される担体および/または添加物および所望により1種以上の付加的活性物質を含む。好ましくは、第六の面の組成物は、患者への投与に適する形態を提供するために、治療有効量の化合物を、好ましくは精製形で、適切な量の担体および/または添加物と共に含む。製剤は投与方法に適さなければならない。

0161

医薬組成物は溶液剤、懸濁液剤エマルジョン剤錠剤丸剤カプセル散剤徐放性製剤などの形を取り得る。医薬組成物は、トリグリセリドのような伝統的結合剤および担体と坐剤に製剤できる。

0162

本発明の医薬組成物の製造のために、薬学的に許容される担体は固体または液体であり得る。固形組成物は、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤ロゼンジ剤カシェー剤、坐剤および分散性顆粒剤を含む。固形添加物は1種以上の物質であってよく、これはまた希釈剤、風味剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤または封入材料としても働き得る。散剤において、添加物は、好ましくは微粉砕固体であり、これは、本発明の微粉砕した阻害剤と混合される。錠剤において、活性成分を、適切な比率で必要な結合特性を有する担体と混合し、所望の形およびサイズに圧縮する。適切な添加物は、炭酸マグネシウムステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチンデキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカントメチルセルロースナトリウムカルボキシメチルセルロース低融点カカオバターなどである。坐剤製剤のために、脂肪酸グリセリドまたはカカオバターの混合物のような低融点蝋を最初に融解し、活性成分を撹拌によるようにその中に均一に分配する。その後溶融均質混合物好都合なサイズの鋳型に注加し、冷却し、それにより固化させる。錠剤、散剤、カプセル剤、丸剤、カシェー剤およびロゼンジ剤を、経口投与に適する固体投与形態として使用できる。

0163

液体形態組成物は、溶液、懸濁液およびエマルジョン、例えば、水、塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール溶液または水/プロピレングリコール溶液を含む。非経腸注射(例えば静脈内、動脈内、骨内注入筋肉内、皮下、腹腔内、皮内および髄腔内注射)のために、液体製剤を、例えばポリエチレングリコール水溶液中の、溶液として製剤できる。塩類溶液は、医薬組成物が静脈内されるとき、好ましい担体である。

0164

好ましくは、医薬組成物は単位投与量形態である。このような形態で、組成物は、適当な量の活性成分を含む単位投与量に細分し得る。単位投与量形態は、包装錠剤、バイアルまたはアンプル中のカプセル剤および粉末のような、包装組成物、個別の量の組成物を含む包装物であり得る。また、単位投与量形態はカプセル、注射バイアル、錠剤、カシェー剤またはロゼンジ剤自体であってよくまたは包装された形態のこれらの任意の適当な数であってよい。

0165

組成物は、望むならば、微量の湿潤剤または乳化剤またはpH緩衝剤を含み得る。

0166

さらに、このような医薬組成物は、アジュバントおよび/または付加的活性成分を含むが、これらに限定されない他の薬理学的活性物質も含み得る。アジュバントは、本発明において無機アジュバント、有機アジュバント、油性アジュバント、サイトカイン、粒子アジュバント、ビロソーム、細菌アジュバント、合成アジュバントまたは合成ポリヌクレオチドアジュバントを含むが、これらに限定されない。

0167

第七の面において、本発明は、医薬として使用するための、上に詳述した第一の面のポリペプチド、第二の面の核酸分子、第三の面のベクター、第四の面の複合体または第五の面の細胞を提供する。好ましい態様において、複合体は医薬で使用するため、すなわち自己免疫性疾患、アレルギー性疾患、癌タイプ疾患、皮膚状態、内分泌疾患、眼疾患および障害、遺伝性障害、感染症、消化器系疾患、神経障害および精神疾患を含むが、これらに限定されない障害または疾患の予防、処置または診断に使用するためである。自己免疫性疾患の例は、I型糖尿病、リウマチ性関節炎、乾癬、クローン病、自己免疫性心筋症、自己免疫性肝炎、橋本甲状腺炎およびシェーグレン症候群を含むが、これらに限定されない。アレルギー性疾患の例は、アレルギー性鼻炎、喘息、アトピー性湿疹、アナフィラキシー、昆虫毒アレルギー、薬物アレルギーおよび食物アレルギーを含むが、これらに限定されない。癌タイプ疾患の例は、基底細胞癌、膀胱癌、骨の癌、脳腫瘍、乳癌、バーキットリンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、食道癌、網膜芽細胞腫、胃癌、消化器間質腫瘍、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、中咽頭癌、卵巣癌、膵癌、胸膜肺芽腫、前立腺癌、咽頭癌、甲状腺癌および尿道癌を含むが、これらに限定されない。皮膚状態の例は、アクネ、皮膚炎、湿疹、皮膚付属器の状態、皮下脂肪の状態、色素沈着障害、上皮母斑、上皮新生物、上皮嚢腫、紅斑、凍傷、遺伝性皮膚症、ムチン沈着症、神経皮膚状態(例えばウィスコット・アルドリッチ症候群)および乾癬を含むが、これらに限定されない。内分泌疾患の例は、I型およびII型糖尿病、骨粗鬆症およびクッシング病を含むが、これらに限定されない。遺伝性障害の例は、色覚異常、嚢胞性線維症、ダウン症候群、鎌状赤血球疾患およびターナー症候群を含むが、これらに限定されない。感染症の例は、アフリカ睡眠病、AIDS、HIV感染、炭疽、ボレリア症、カリシウイルス感染(ノロウイルスおよびサポウイルス)、水痘、クラミジア感染、コレラ、クロストリジウム感染、コロラドダニ熱(CTF)、感冒、クロイツフェルト・ヤコブ病、デング熱(DEN−1、DEN−2、DEN−3およびDEN−4)、エボラ、エンテロウイルス感染、ヒトヘルペスウイルス6(HHV−6)およびヒトヘルペスウイルス7(HHV−7)の感染、淋病、連鎖球菌感染(A群およびB群)、手足口病(HFMD)、ヘリコバクター・ピロリ感染、肝炎(A型、B型、C型およびD型)、ヘルペス感染、パピローマウイルス感染、パラインフルエンザウイルス感染、インフルエンザ、ラッサ熱、マールブルグ熱、麻疹、髄膜炎、流行性耳下腺炎、パスツレラ症、シラミ属感染、ペスト、肺炎球菌感染、呼吸器多核体ウイルス感染、ロタウイルス感染、風疹ウイルス感染、サルモネラ食中毒および感染、SARS、疥癬感染、住血吸虫症、天然痘、ブドウ球菌食中毒および感染、梅毒、破傷風、白癬菌感染、結核、チフス、ベネズエラウマ脳炎および黄色熱のような、ウイルス、細菌、寄生虫、プリオンまたは他の病原体または寄生生物が原因の感染疾患を含むが、これらに限定されない。消化器系疾患の例は、胃腸炎、イレウス、回腸炎、大腸炎、虫垂炎、セリアック病、過敏性腸症候群、憩室性疾患、下痢、ポリープおよび潰瘍性大腸炎を含むが、これらに限定されない。神経障害の例は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、脳損傷、クロイツフェルト・ヤコブ病、クッシング症候群、失読症、脳炎、癲癇、頭痛、ハンチントン病、片頭痛、多発性硬化症、パーキンソン病、ポリオ、狂犬病、統合失調症および卒中を含むが、これらに限定されない。精神疾患の例は、急性ストレス障害、注意欠損過活動障害(ADHD)、自閉症性障害、境界性人格障害、神経性過食症、燃え尽き症候群、統合失調症、鬱病、認知障害、コミュニケーション障害、摂食障害、窃盗癖、学習障害、男性勃起障害、抑欝、強迫性障害(OCD)、妄想性障害、病的賭博、外傷後ストレス障害(PTSD)、精神病性障害、過眠症、不眠症およびトゥレット症候群を含むが、これらに限定されない。

0168

次の実施例は本発明の単なる説明であり、添付する特許請求の範囲により示される本発明の範囲をいかなる方法でも限定すると解釈してはならない。

0169

実施例1:scFv−MHD2融合タンパク質の産生
ヒト化抗EGFRscFv(hu225)を、CDR移植により抗体C225(Goldstein et al., 1995)から産生した。抗HER2 scFv 4D5を、公開された配列(Carter et al., 1992)から再現した。scFvならびにヒトIgM重鎖ドメイン2(MHD2)の配列のいずれも、ヒト細胞での発現のためにコドン最適化されており、現在Life Technologies子会社(Darmstadt, Germany)であるGeneartにより、適当なクローニング部位を添加されて合成された。2個の二価抗体−MHD2融合タンパク質を、ヒト化抗EGFR scFvをMHD2のN末端に(scFvEGFR−MHD2;scFvA−MHD2)または抗HER2 scFvをMHD2のC末端に(MHD2−scFvHER2;MHD2−scFvB)それぞれ融合させることにより産生した。さらに、四価の二重特異性融合タンパク質を、scFvAをMHD2のN末端およびscFvBをMHD2のC末端に融合して産生した(scFvEGFR−MHD2−scFvHER2;scFvA−MHD2−scFvB)(図3a、b)。全ての構築物真核発現ベクターpSecTagAにクローン化し、安定に遺伝子導入したHEK293細胞で、1.5〜2.5mg/L上清の収量で産生した。SDS−PAGE分析は、MHD2における1個の潜在的N−グリコシル化部位を考慮して、還元条件下で、予想される分子質量の単量体ポリペプチド鎖を明らかにした(単一特異性MHD2融合タンパク質で約50kDaおよび二重特異性MHD2融合タンパク質で75kDa)(図3c参照)。非還元条件下で、全構築物は、二量体分子に対応するバンドを示したが、単量体サイズの第二のバンドが観察された。単一特異性MHD2融合タンパク質について、分子の約80〜90%がジスルフィド結合した二量体として存在したが、二重特異性MHD2融合タンパク質について、約50%がジスルフィド結合していた。

0170

実施例2:scFv−MHD2融合タンパク質の生理活性
抗体−MHD2融合タンパク質の選択性を、それぞれEGFR、HER2およびHER3の細胞外領域のFc融合タンパク質を使用してELISAにより分析した(図4a)。scFvEGFR−MHD2はEGFRへのおよびMHD2−scFvHER2はHER2への特異的結合を示し、一方scFvEGFR−MHD2−scFvHER2融合タンパク質は両受容体への結合を示した。ネガティブコントロールとして含ませたHER3−Fc融合タンパク質への結合は観察されなかった。さらに、抗体−MHD2融合タンパク質を、種々の量のEGFRおよびHER2を発現する種々の腫瘍細胞株に対する結合について、フローサイトメトリーにより分析した(図4b)。EGFR発現細胞株A431はscFvEGFR−MHD2およびscFvEGFR−MHD2−scFvHER2に強い結合を示し、一方MHD2−scFvHER2では結合は検出されないかまたは検出されても極わずかであった(図4b)。対照的に、HER2陽性細胞株SKBR3はMHD2−scFvHER2およびscFvEGFR−MHD2−scFvHER2に強い結合を示し、scFvEGFR−MHD2には弱い結合のみであった(図4b)。少量のEGFRおよびHER2を発現する肺癌細胞株NCI−H460は、scFvEGFR−MHD2およびMHD2−scFvHER2の弱い結合を示したが、scFvEGFR−MHD2−scFvHER2では結合は増加した(図4b)。同様の結果が結腸癌細胞株Colo205で見られた(図4b)。SKBR3以外、2個の単一特異性MHD2融合タンパク質と比較して、観察された二重特異性MHD2融合タンパク質の結合は増加した。

0171

実施例3:MHD2−scTNF融合タンパク質の産生
抗体−TNFMHD2融合タンパク質を、抗EGFRscFvをMHD2のN末端におよび単一鎖TNF誘導体(scTNF;Krippner-Heidenreich et al., 2008)をMHD2のC末端に融合することにより産生した(scFv−MHD2−scTNF)。さらに、scFvを欠く二価サイトカイン−MHD2分子を産生した(MHD2−scTNF)(図5a、b)。2個の構築物を、HEK293細胞で5〜12mg/L上清の収量で産生した。SDS−PAGEは、還元条件下で、単量体ポリペプチドの予想される分子質量に対応する単一バンドを示した(MHD2−scTNFで70kDaおよびscFv−MHD2−scTNFで100kDa)。二量体アセンブリは、非還元条件下で見られ、MHD2−scTNFの約40%およびscFv−MHD2−scTNFの約95%が二量体として存在した(図5c)。二量体アセンブリを、分子ふるいクロマトグラフィー(SEC)により確認した(図5d−f)。約50kDaのみかけの分子量で主ピーク溶出されるScTNFを、比較のために含ませた。MHD2−scTNF分子は、約200kDaの主ピークを示し、scFv−MHD2−scTNFは約300kDaに対する主ピークを示した。融解温度もscFv−MHD2−scTNFで測定し、約77℃の主要な融解温度を示した(図5g)。

0172

実施例4:MHD2−scTNF融合タンパク質の生理活性
ELISAにおいて、scFv−MHD2−scTNF融合タンパク質はEGFR−Fc融合タンパク質に特異的結合を示し、一方MHD2−scTNFに対する結合は観察されなかった(図6a)。EGFRへの結合を、EGFR発現細胞株A431およびHT1080を用いるフローサイトメトリーでさらに確認した(図6b)。scFv−MHD2−scTNFの両細胞株への結合はセツキシマブとのプレインキュベーションにより遮断できた。トラスツマブ(抗HER2)で観察される効果はないか極わずかであった。

0173

次に、融合タンパク質を、Fasの膜貫通型および細胞質領域に融合したヒトTNFR1(MEF−TNFR1)またはTNFR2(MEF−TNFR2)のいずれかの細胞外領域を発現するように安定に遺伝子導入したマウス胎仔線維芽細胞(MEF)での細胞死誘発について試験した(Krippner-Heidenreich et al., 2002)。これらの細胞株は、可溶性TNFと膜結合TNF(mTNF)の作用の区別が可能であり、mTNFまたは多量体TNFがMEF−TNFR2活性に必要である。scTNF、MHD2−TNFおよびscFv−MHD2の抗体価測定は、MEF−TNFR1に対するscTNFおよびMHD2−scTNFの強細胞傷害性活性を示し、一方MEF−TNFR2細胞に対する死滅は二量体MHD2−scTNF構築物によってのみ誘発された(図6c、d)。ScFv−MHD2は両細胞株に対して不活性であった。

0174

scTNF融合タンパク質の生理活性を、HT1080細胞からのIL−8のTNF介在分泌の測定によりさらい分析した。ScTNFならびにMHD2−scTNF融合タンパク質は、濃度依存的方法でIL−8分泌を誘発し、EC50値は約1〜10nMであった(図6e)。強度に増加した刺激活性がscFv−MHD2−scTNFで見られ、約10pMが最適であった。高濃度で、IL−8遊離は最高値の約25%まで減少した。ネガティブコントロールとして含ませたscTNF部分を欠くscFv−MHD2融合タンパク質は刺激活性を示さなかった。scFv−MHD2−scTNFによるIL−8分泌誘発は、同一エピトープ指向する過剰量のセツキシマブ(660nM)で非標的化MHD2−scTNF融合タンパク質およびscTNFにより誘発されるレベルまで完全に遮断されたが、トラスツマブは効果を有しなかった。両抗体とも、それぞれMHD2−scTNFおよびscTNFにより誘発されるIL−8分泌に影響しなかった(図6f)。

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