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技術 突然変異アセトヒドロキシ酸合成酵素タンパク質のラージサブユニットをコードする突然変異ポリヌクレオチドを有し、除草剤耐性が増大したソルガム植物

出願人 アドヴァンタ・ホールディングス・ベスローテン・フェンノートシャップ
発明者 トゥルシージョ・ウリアルテ,ビセンテザンベッリ,アンドレス・ダニエルカスパル,マルコスパルド,アレハンドロ・ペドロ
出願日 2012年4月5日 (8年10ヶ月経過) 出願番号 2015-503768
公開日 2015年4月30日 (5年9ヶ月経過) 公開番号 2015-512640
状態 拒絶査定
技術分野 植物の育種及び培養による繁殖 微生物、その培養処理 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験
主要キーワード 加速技術 植物学者 農業用植物 見積もり値 ストレス状況 ミダス 土壌温度 干ばつ
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図面 (9)

課題・解決手段

ソルガムAHSタンパク質ラージサブユニットの位置93にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドゲノム中に含むソルガム種子。この植物は、野生型ソルガム植物と比較して、例えば、イミダゾリノン群に由来する1つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性を有する。ソルガム植物は、そのゲノム中に、本発明のソルガムAHASの突然変異ラージサブユニットまたはソルガムAHASポリペプチドをコードする1、2、3コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソルガム植物は、AHAS酵素活性阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性であってもよい。例えば、ソルガム植物は、イマゼタピルイマザピル、およびイマザピックなどのイミダゾリノン型の除草剤またはスルホニルウレア群の除草剤に対して寛容性であってもよい。

概要

背景

ソルガム(ソルガム種)は、約20種の草を含む植物の属である。それは東アフリカの熱帯および亜熱帯地域を原産とし、ヒトおよび動物による消費のための穀物用に、大陸のどこででも育てられており、飼料として、およびアルコール飲料の製造のためにも用いられている。それはグルテンを含まないため、ソルガムはセリアック病罹患する個体にとって好適である。

ソルガムは、多くの穀類よりも干ばつおよび過剰の土壌水分含量に対して寛容性である。それは様々な土壌および気象条件下で適切に生長することができる。同様に、それは灌漑に対して好ましく応答し、その生活環の間に必要とするのは最小で250mmであり、最適な灌漑範囲は400〜550mmである。

迅速で均一な発およびそれにより良好な作物移植を達成するためには、土壌は植付けの時点で適切な水分含量を有さなければならない。水の最大の要求は発芽後30日で開始し、穀物が満たされるまで続き、最も重要な段階は円錐花序形成および開花のものであり、それはこの時点での水の欠乏は収量の低下をもたらすからである。

さらに、ソルガムは、干ばつ期には休眠したままになる能力を有し、好ましい期間の下で生長を再開するが、これらのストレス状況は性能に影響し得る。

ソルガムは、正常な発達のために高い温度を必要とし、結果として、他の作物よりも低温に対する感受性が高い。発芽には少なくとも18℃の土壌温度が必要である;植物の実際の活発な生長は、15℃の温度に達するまで達成されず、最適温度は約32℃である。

アセトヒドロキシ酸合成酵素AHAS)は、分枝アミノ酸であるバリンロイシンおよびイソロイシンの合成を触媒する第1の酵素である。AHASは、スルホニルウレアイミダゾリノン、トリアゾロピリミジンおよびピリミジルオキシ安息香酸などのいくつかの除草剤の標的である。前者2つの除草剤ファミリーは、その低い毒性および雑草に対する高い有効性のため現代農業において広く用いられている。

イミダゾリノンファミリーの除草剤は、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピルを含む。

市場に存在するいくつかのスルホニルウレアは、メツルフロンメチルクロスルフロン、ニコスルフロンシノスルフロン、イミダスルフロン、ハロスルフロン、リムスルフロン、トリスルフロン−メチル、およびトリベロン−メチルである。

しかしながら、イミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレアファミリーの除草剤に耐性である植物;例えば、Zea mays、Arabidopsis thaliana、Brassica napus、Glycine max、Nicotiana tabacum、およびOryza sativaなどの種がある(Sebastianら(1989)Crop Sci.,29:1403〜1408頁;Swansonら、1989 Theor.Appl.Genet.78:525〜530頁;Newhouseら(1991)Theor.Appl.Genet.,83:65〜70頁;Sathasivanら(1991)Plant Physiol.,97:1044〜1050頁;Mourandら(1993)J.Heredity 84:91〜96頁;米国特許第5,545,822号)。イミダゾリノン型の除草剤に対する耐性を付与するAHASのラージサブユニットにおける点突然変異ヒマワリにおいて記載されている(WO2007/0118920)。

イミダゾリノンまたはスルホニルウレア型の除草剤に対して耐性である植物も検出されている。これらの植物は、自然に耐性を獲得し、作物育種のために用いられており、除草剤耐性品種をもたらしている。耐性植物の分析から、アミノ酸AlaのValによる置換をもたらすヒマワリのAHASタンパク質において点突然変異が決定された(Whiteら(2003)Weed Sci.,51:845〜853頁)。

さらに、米国特許第4,761,373号;第5,331,107号;第5,304,732号;第6,211,438号;第6,211,439号;および第6,222,100号は、イミダゾリノン除草剤に対して耐性である植物を開示している。これらの植物は全て、一般に、植物における除草剤耐性を惹起するための変化したAHAS遺伝子の使用を記載し、ある特定のイミダゾリノン耐性トウモロコシ系を特に開示している。米国特許第5,731,180号および米国特許第5,767,361号は、イミダゾリノン特異的耐性をもたらす野生型単子葉植物AHASアミノ酸配列における単一のアミノ酸置換を有する単離された遺伝子を考察している。

特許文献WO2006/007373およびWO2006/060634は、コムギ植物においてイミダゾリノン型の除草剤に対して耐性を付与する突然変異を開示している。

刊行物タバコアセトヒドロキシ酸合成酵素における除草剤耐性を付与するアミノ酸」は、除草剤耐性を付与するAHASにおける様々な点突然変異を記載している(GMCrops 1:2、62〜67頁;2010年2月16日)。

特許文献US20100115663は、アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子を変化させることにより達成される除草剤耐性ソルガム植物に関する。また、除草剤ジニトロアニリンに対して耐性であるソルガム植物(US20100205686)および除草剤アセト乳酸合成酵素に対して耐性であるソルガム植物(WO2008/073800)も開示されている。

概要

ソルガムAHASタンパク質ラージサブユニットの位置93にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドゲノム中に含むソルガム種子。この植物は、野生型ソルガム植物と比較して、例えば、イミダゾリノン群に由来する1つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性を有する。ソルガム植物は、そのゲノム中に、本発明のソルガムAHASの突然変異ラージサブユニットまたはソルガムAHASポリペプチドをコードする1、2、3コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソルガム植物は、AHAS酵素活性阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性であってもよい。例えば、ソルガム植物は、イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックなどのイミダゾリノン型の除草剤またはスルホニルウレア群の除草剤に対して寛容性であってもよい。

目的

本発明は、農業用植物、例えば、ソルガム植物の近くにある雑草を防除するための方法であって、前記ソルガム植物がイミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレアの群中の由来する除草剤などの除草剤に対して耐性である、前記方法を提供する

効果

実績

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請求項1

ソルガムAHSタンパク質ラージサブユニットの位置93にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする、少なくとも1つのポリヌクレオチドゲノム中に含むソルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較して1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した上記植物。

請求項2

前記除草剤が、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項3

前記イミダゾリノン除草剤が、イマゼタピルイマザピル、およびイマザピックからなる群から選択される、請求項2に記載のソルガム植物。

請求項4

少なくとも1つのポリヌクレオチドが、配列番号1を含む、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項5

コードされる前記ポリペプチドが配列番号2を含む、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項6

NCIMB41870に記載のAHAS遺伝子中に突然変異を含む、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項7

前記ソルガム植物が、NCIMB41870について記載された耐性と同様なイミダゾリノン群の1つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性形質を含む、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項8

1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した前記ソルガム植物が、別のソルガム植物への遺伝子移入により耐性形質を導入するのに有用である、請求項6または7に記載のソルガム植物。

請求項9

前記植物がトランスジェニックである、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項10

前記植物が非トランスジェニックである、請求項1に記載のソルガム植物。

請求項11

前記ソルガム植物が、NCIMB41870などの植物、NCIMB41870植物の子孫、NCIMB41870突然変異植物およびNCIMB41870突然変異体の子孫からなる群から選択される、NCIMB41870の耐性形質を含む除草剤耐性ソルガム植物。

請求項12

前記除草剤がイミダゾリノン群に属する、請求項11に記載のソルガム植物。

請求項13

前記植物がトランスジェニックである、請求項11に記載のソルガム植物。

請求項14

前記植物が非トランスジェニックである、請求項11に記載のソルガム植物。

請求項15

ソルガムAHASタンパク質のラージサブユニットの位置93にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをゲノム中に含むソルガム種子。

請求項16

前記種子が野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノン群中の1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した植物を生成する、請求項15に記載の種子。

請求項17

前記種子が寄託された種子NCIMB41870に示されるAHAS遺伝子中に突然変異を含む、請求項15に記載の種子。

請求項18

請求項1から10のいずれか1項に記載の植物の種子。

請求項19

請求項11から14のいずれか1項に記載の植物の種子。

請求項20

a)ソルガム植物に由来する核酸試料を準備するステップと、b)ソルガム植物に由来する前記核酸試料中に存在するAHAS遺伝子に対応する領域を増幅する工程と、c)イミダゾリノン群に由来する除草剤に対する耐性を付与する突然変異である、増幅された核酸試料中の少なくとも1個の前記突然変異の存在に基づいて除草剤耐性植物を同定するステップとを含む、除草剤耐性植物を同定するための方法。

請求項21

前記核酸試料がMCIMB41870に存在する突然変異などの少なくとも1個の突然変異を含む、請求項20に記載の方法。

請求項22

前記少なくとも1個の突然変異がコードされたポリペプチド中にAla93Thr置換を含み、前記ポリペプチドがアセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有する、請求項20に記載の方法。

請求項23

前記核酸試料が配列番号1を含む、請求項20に記載の方法。

請求項24

前記ポリペプチドが配列番号2を含む、請求項22に記載の方法。

請求項25

前記植物が単子葉植物である、請求項20に記載の方法。

請求項26

前記植物が双子葉植物である、請求項20に記載の方法。

請求項27

前記植物がトランスジェニック植物である、請求項20に記載の方法。

請求項28

前記植物が非トランスジェニック植物である、請求項20に記載の方法。

請求項29

前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアの群から選択される、請求項20に記載の方法。

請求項30

イミダゾリノン群またはスルホニルウレア群中の、有効量の除草剤を雑草および作物植物施用するステップを含む、作物植物のごく近くにある雑草を防除する方法。

請求項31

前記イミダゾリノン除草剤が、イマゼタピル、イマザピック、およびイマザピルからなる群から選択される、請求項30に記載の方法。

請求項32

前記作物植物が、a)ソルガムAHASタンパク質の位置93にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に含むソルガム植物であって、野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した前記植物、b)NCIMB41870中などのAHAS遺伝子中に突然変異を含むソルガム植物、c)NCIMB41870により示される耐性などの、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の1つまたは複数の除草剤に対する増大した耐性形質を含むソルガム植物、d)ソルガム植物a)〜c)の植物、子孫、誘導体または突然変異体からなる群から選択される、請求項30に記載の方法。

請求項33

a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有し、除草剤耐性AHAS活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有し、AHASのラージサブユニットを含み、除草剤耐性AHAS活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、e)ヌクレオチド配列a)〜(d)の1つと完全に相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド。

請求項34

前記ポリヌクレオチドがAHASのラージサブユニット中にAla93Thr置換を含むポリペプチドをコードする、請求項33に記載のポリヌクレオチド。

請求項35

発現カセット作動可能に連結された請求項33に記載のヌクレオチド配列を含む、発現カセット。

請求項36

前記ポリヌクレオチドの発現誘導する少なくとも1個のプロモーターをさらに含む、請求項35に記載の発現カセット。

請求項37

前記プロモーターが植物、細菌、真菌動物細胞および原生動物中での発現のためのプロモーターを含む群から選択される、請求項36に記載の発現カセット。

請求項38

請求項35に記載の発現カセットで形質転換された細胞

請求項39

前記細胞が細菌、真菌、酵母植物細胞、および動物細胞からなる群から選択される、請求項38に記載の細胞。

請求項40

a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有し、除草剤耐性AHAS活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有し、AHASのラージサブユニットを含み、除草剤耐性AHAS活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、e)ヌクレオチド配列a)〜(d)の1つと完全に相補的なヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを有し、選択可能な遺伝子、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができるヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも1個のプロモーターをさらに含む、形質転換ベクター

請求項41

細菌、真菌、酵母、植物細胞および動物細胞を含む群から選択される細胞を形質転換するための、請求項40に記載のベクターの使用。

請求項42

a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有し、除草剤耐性AHAS活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有し、AHASのラージサブユニットを含み、除草剤耐性AHAS活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、e)ヌクレオチド配列a)〜(d)の1つと完全に相補的なヌクレオチド配列を含む群から選択されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された、植物のゲノム中に組込まれた少なくとも1個のプロモーターを含み、ベクターが選択可能な遺伝子、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導することができるヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも1個のプロモーターをさらに含む、形質転換された植物。

請求項43

前記プロモーターが組織特異的プロモーターおよび葉緑体特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項42に記載の植物。

請求項44

前記植物が単子葉植物である、請求項42に記載の植物。

請求項45

前記植物が双子葉植物である、請求項42に記載の植物。

請求項46

前記植物がソルガム、トウモロコシ、コメ、およびコムギからなる群から選択される、請求項44に記載の植物。

請求項47

前記植物がダイズおよびアブラナからなる群から選択される、請求項45に記載の植物。

請求項48

前記植物が非形質転換植物と比較して増大した除草剤耐性を含む、請求項42に記載の植物。

請求項49

前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求項42に記載の植物。

請求項50

i)a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有し、除草剤耐性AHAS活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有し、AHASのラージサブユニットを含み、除草剤耐性AHAS活性を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、およびe)ヌクレオチド配列a)〜d)の1つと完全に相補的なヌクレオチド配列の群から選択されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む発現カセットまたはベクターであって、前記発現カセットが前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも1個のプロモーターをさらに含み、前記プロモーターが前記ポリヌクレオチドの発現を誘導する、上記発現カセットまたはベクターを用いて植物細胞を形質転換するステップと、ii)前記植物細胞を再生して、除草剤耐性植物を取得するステップとを含む、除草剤耐性植物または除草剤耐性が増大した植物を取得するための方法。

請求項51

前記プロモーターが植物組織特異的プロモーターを含む、請求項50に記載の方法。

請求項52

前記プロモーターが葉緑体特異的プロモーターを含む、請求項50に記載の方法。

請求項53

前記除草剤がイミダゾリノンおよびスルホニルウレアからなる群から選択される、請求項50に記載の方法。

請求項54

前記イミダゾリノン除草剤がイマゼタピル、イマザピック、およびイマザピルを含む群から選択される、請求項53に記載の方法。

請求項55

前記植物が単子葉植物である、請求項50に記載の方法。

請求項56

前記植物が双子葉植物である、請求項50に記載の方法。

請求項57

前記植物がソルガム、トウモロコシ、コメおよびコムギからなる群から選択される、請求項55に記載の方法。

請求項58

前記植物がダイズおよびアブラナからなる群から選択される、請求項56に記載の方法。

請求項59

前記植物が非形質転換植物と比較して増大した除草剤耐性を含む、請求項50に記載の方法。

請求項60

前記植物がAHASのラージサブユニットを含み、除草剤耐性AHAS活性を示す、請求項50に記載の方法。

背景技術

0001

ソルガム(ソルガム種)は、約20種の草を含む植物の属である。それは東アフリカの熱帯および亜熱帯地域を原産とし、ヒトおよび動物による消費のための穀物用に、大陸のどこででも育てられており、飼料として、およびアルコール飲料の製造のためにも用いられている。それはグルテンを含まないため、ソルガムはセリアック病罹患する個体にとって好適である。

0002

ソルガムは、多くの穀類よりも干ばつおよび過剰の土壌水分含量に対して寛容性である。それは様々な土壌および気象条件下で適切に生長することができる。同様に、それは灌漑に対して好ましく応答し、その生活環の間に必要とするのは最小で250mmであり、最適な灌漑範囲は400〜550mmである。

0003

迅速で均一な発およびそれにより良好な作物移植を達成するためには、土壌は植付けの時点で適切な水分含量を有さなければならない。水の最大の要求は発芽後30日で開始し、穀物が満たされるまで続き、最も重要な段階は円錐花序形成および開花のものであり、それはこの時点での水の欠乏は収量の低下をもたらすからである。

0004

さらに、ソルガムは、干ばつ期には休眠したままになる能力を有し、好ましい期間の下で生長を再開するが、これらのストレス状況は性能に影響し得る。

0005

ソルガムは、正常な発達のために高い温度を必要とし、結果として、他の作物よりも低温に対する感受性が高い。発芽には少なくとも18℃の土壌温度が必要である;植物の実際の活発な生長は、15℃の温度に達するまで達成されず、最適温度は約32℃である。

0006

アセトヒドロキシ酸合成酵素AHAS)は、分枝アミノ酸であるバリンロイシンおよびイソロイシンの合成を触媒する第1の酵素である。AHASは、スルホニルウレアイミダゾリノン、トリアゾロピリミジンおよびピリミジルオキシ安息香酸などのいくつかの除草剤の標的である。前者2つの除草剤ファミリーは、その低い毒性および雑草に対する高い有効性のため現代農業において広く用いられている。

0007

イミダゾリノンファミリーの除草剤は、イマゼタピル、イマザキン、およびイマザピルを含む。

0008

市場に存在するいくつかのスルホニルウレアは、メツルフロンメチルクロスルフロン、ニコスルフロンシノスルフロン、イミダスルフロン、ハロスルフロン、リムスルフロン、トリスルフロン−メチル、およびトリベロン−メチルである。

0009

しかしながら、イミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレアファミリーの除草剤に耐性である植物;例えば、Zea mays、Arabidopsis thaliana、Brassica napus、Glycine max、Nicotiana tabacum、およびOryza sativaなどの種がある(Sebastianら(1989)Crop Sci.,29:1403〜1408頁;Swansonら、1989 Theor.Appl.Genet.78:525〜530頁;Newhouseら(1991)Theor.Appl.Genet.,83:65〜70頁;Sathasivanら(1991)Plant Physiol.,97:1044〜1050頁;Mourandら(1993)J.Heredity 84:91〜96頁;米国特許第5,545,822号)。イミダゾリノン型の除草剤に対する耐性を付与するAHASのラージサブユニットにおける点突然変異ヒマワリにおいて記載されている(WO2007/0118920)。

0010

イミダゾリノンまたはスルホニルウレア型の除草剤に対して耐性である植物も検出されている。これらの植物は、自然に耐性を獲得し、作物育種のために用いられており、除草剤耐性品種をもたらしている。耐性植物の分析から、アミノ酸AlaのValによる置換をもたらすヒマワリのAHASタンパク質において点突然変異が決定された(Whiteら(2003)Weed Sci.,51:845〜853頁)。

0011

さらに、米国特許第4,761,373号;第5,331,107号;第5,304,732号;第6,211,438号;第6,211,439号;および第6,222,100号は、イミダゾリノン除草剤に対して耐性である植物を開示している。これらの植物は全て、一般に、植物における除草剤耐性を惹起するための変化したAHAS遺伝子の使用を記載し、ある特定のイミダゾリノン耐性トウモロコシ系を特に開示している。米国特許第5,731,180号および米国特許第5,767,361号は、イミダゾリノン特異的耐性をもたらす野生型単子葉植物AHASアミノ酸配列における単一のアミノ酸置換を有する単離された遺伝子を考察している。

0012

特許文献WO2006/007373およびWO2006/060634は、コムギ植物においてイミダゾリノン型の除草剤に対して耐性を付与する突然変異を開示している。

0013

刊行物タバコアセトヒドロキシ酸合成酵素における除草剤耐性を付与するアミノ酸」は、除草剤耐性を付与するAHASにおける様々な点突然変異を記載している(GMCrops 1:2、62〜67頁;2010年2月16日)。

0014

特許文献US20100115663は、アセチルCoAカルボキシラーゼ遺伝子を変化させることにより達成される除草剤耐性ソルガム植物に関する。また、除草剤ジニトロアニリンに対して耐性であるソルガム植物(US20100205686)および除草剤アセト乳酸合成酵素に対して耐性であるソルガム植物(WO2008/073800)も開示されている。

0015

本発明のソルガム植物は、野生型ソルガム植物と比較して、除草剤、例えば、AHAS酵素を標的とする除草剤、特に、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアに対する改善された耐性を示す。特に、本発明のソルガム植物(Sorghum bicolor)は、そのゲノム中に、少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む。前記ポリヌクレオチドは、ソルガムAHASのラージサブユニットの位置93または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するAHASのラージサブユニットをコードし、前記植物は野生型ソルガム植物と比較して、イミダゾリノン群から選択される除草剤などの1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大している。ソルガム植物は、そのゲノム中に、ソルガムAHASの突然変異ラージサブユニットまたは本発明のソルガムAHASポリペプチドをコードする、1、2、3コピー以上のポリヌクレオチドを含んでもよい。この文脈において、ソルガム植物は、AHAS酵素活性阻害することができる任意の除草剤に対して寛容性であってもよい、すなわち、ソルガム植物は、限定されるものではないが、イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックなどのイミダゾリノン型の除草剤または限定されるものではないが、クロロスルフロン、メツルフロンメチル、スルホメツロンメチル、クロリムロンエチルチオフェンスルフロンメチル、トリベヌロンメチル、ベンスルフロンメチル、ニコスルフロン、エタメツルフロンメチル、リムスルフロン、トリフルスルフロンメチル、トリアスルフロン、プリミスルフロンメチル、シノスルフロン、アミドスルフロン、フルザスルフロン、イマゾスルフロンピラゾスルフロンエチル、およびハロスルフロンなどのスルホニルウレア群の除草剤に対して寛容性であってもよい。

0016

好ましい実施形態においては、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤に対して耐性である本発明のソルガム植物は、VT11−11331−BKと命名されたソルガム系であり、その種子はブダペスト条約の下で2011年10月12日に受託番号NCIMB41870の下でNCIMBコレクション寄託されたものである。突然変異VT11−11331−BK植物、その部分およびその種子は、そのゲノム中に、配列番号2に記載の配列を有するAHASラージサブユニットのポリペプチドをコードする配列番号1に記載のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む突然変異AHAS遺伝子を含む。AHASのラージサブユニットに対応する配列番号2のアミノ酸配列は、ソルガムAHASのラージサブユニットの野生型アミノ酸配列(配列番号3)と1個のアミノ酸が異なり、前記相違はソルガムAHASのラージサブユニットの位置93、または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を含む。

0017

本発明の除草剤寛容性ソルガム植物遺伝資源は、他のソルガム品種への遺伝子移入による寛容性形質の導入にとって有用である。本発明のソルガム植物は、AHASラージサブユニットをコードし、ソルガムAHASの前記ラージサブユニットの位置93または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリヌクレオチドを含む植物の子孫および種子を含み、前記植物は野生型ソルガム植物と比較して、1つまたは複数のイミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレア除草剤に対する耐性の増大を示す。

0018

好ましい実施形態においては、除草剤耐性ソルガム植物は、NCIMB41870の耐性形質を含み、NCIMB41870に記載の植物、NCIMB41870植物の子孫、NCIMB41870植物の突然変異体、およびNCIMB41870突然変異体の子孫であってもよい。前記植物は、トランスジェニックまたは非トランスジェニックであってもよく、農業使用、または観葉植物などの他の使用にとって好適な任意の植物種に属してもよい。

0019

ソルガムAHASタンパク質ラージサブユニットの位置93にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドをそのゲノム中に含むソルガム種子がさらに提供される。この種子は、野生型ソルガム植物と比較して、イミダゾリノン群の1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した植物を発芽、生成する。好ましい実施形態においては、前記種子は、NCIMB41870として寄託された種子である。

0020

イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群中の除草剤に対して耐性である植物を同定するための方法であって、
a)ソルガム植物に由来する核酸試料を供給するステップと、
b)前記核酸試料中に存在するソルガム植物からAHAS遺伝子に対応する領域を増幅するステップと、
c)イミダゾリノン除草剤に対する耐性を付与する前記増幅された核酸試料中の少なくとも1つの突然変異の存在に基づいて、イミダゾリノン群の除草剤に対して耐性であるソルガム植物を同定するステップと
を含む、上記方法がさらに提供される。好ましい実施形態においては、NCIMB41870中の突然変異などのAHAS中に少なくとも1つの突然変異を含む植物が選択され、AHAS遺伝子中の前記少なくとも1つの突然変異は野生型ソルガムAHASアミノ酸配列と比較して、Ala93Thr置換を含むAHASのポリペプチドまたはラージサブユニットをコードする。前記植物は単子葉植物または双子葉植物であってもよい。好ましくは、前記植物は、ソルガム、コメ、トウモロコシ、ダイズコムギオートムギオオムギライムギ、アマ、ワタサトウキビ、ヒマワリなどの農業の対象となる植物である。同定の方法は、特異的点突然変異SNPマーカーを用いてもよい。

0021

本発明は、農業用植物、例えば、ソルガム植物の近くにある雑草を防除するための方法であって、前記ソルガム植物がイミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレアの群中の由来する除草剤などの除草剤に対して耐性である、前記方法を提供する。好ましい実施形態においては、除草剤はイミダゾリノンである。イミダゾリノン除草剤は、イマゼタピル、イマザピック、またはイマザピルであってもよい。前記植物は、NCIMB41870などの耐性形質を示してもよく、その誘導体、突然変異体、または子孫植物であってもよい。

0022

本発明は、限定されるものではないが、以下のヌクレオチド配列:
配列番号1に記載の配列、
配列番号2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
−配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、AHASのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ヌクレオチド配列、
またはその相補配列
のうちの1つまたは複数を含むポリペプチドを提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、Ala93Thr置換を含むAHASのラージユニットのポリペプチドをコードする。

0023

本発明はまた、以下のヌクレオチド配列:配列番号1、配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、AHASのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ヌクレオチド配列、またはその相補配列を有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む発現カセットも提供する。好ましくは、前記ポリヌクレオチドは、Ala93Thr置換を含むAHASのラージユニットのポリペプチドをコードし;前記配列は発現を行うためのヌクレオチド配列、例えば、1つまたは複数のプロモーターエンハンサーまたは他の公知の調節配列作動可能に連結される。プロモーターは、植物、植物組織葉緑体、動物、細菌、真菌または酵母細胞中での発現のためのプロモーターであってもよい。

0024

本発明は、以下のヌクレオチド配列:a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、AHASのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ヌクレオチド配列のうちの1つを有する少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導する作動可能に連結された配列および選択マーカーをさらに含む形質転換ベクターを提供する。ベクターを、それぞれ特定の場合のために適合化される、細菌、真菌、酵母植物細胞または動物細胞形質転換するために用いることができる。

0025

本発明は、そのゲノム中に組込まれた、a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列;b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、AHASのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ヌクレオチド配列;e)a)から(d)のヌクレオチド配列の1つと完全に相補的なヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチドに作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターを含み、ベクターが選択可能な遺伝子と、前記ヌクレオチド配列の発現を誘導するヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも1つのプロモーターとをさらに含む、形質転換された植物を提供する。プロモーターは、植物、例えば、植物組織または葉緑体においてポリペプチド発現を誘導するプロモーターである。形質転換植物は、単子葉植物、例えば、ソルガム、トウモロコシ、コメ、もしくはコムギ;または双子葉植物、例えば、ヒマワリ、Arabidopsis、タバコもしくはアブラナであってもよい。形質転換植物は、等量の前記除草剤が両方に対して施用された場合に同じ野生型植物と比較して除草剤(イミダゾリノンおよびスルホニルウレア)に対して耐性である。

0026

本発明はまた、除草剤耐性植物または除草剤に対する耐性が増大した植物を取得するための方法であって、i)植物細胞を、ポリヌクレオチドを含む発現カセットで形質転換するステップ、ii)植物細胞を再生させて、除草剤耐性植物を取得するステップを含み、前記ポリヌクレオチドが、以下のヌクレオチド配列:a)配列番号1に記載のヌクレオチド配列、b)配列番号2に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、c)配列番号2のアミノ酸配列に対する少なくとも95%の配列同一性を有するポリペプチドであって、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、d)配列番号1に記載のヌクレオチド配列に対する少なくとも85%の同一性を有するヌクレオチド配列であって、AHASのラージサブユニットを含むポリペプチドをコードし、除草剤耐性AHAS活性を示す前記ヌクレオチド配列およびe)a)から(d)のヌクレオチド配列の1つと完全に相補的なヌクレオチド配列のうちの少なくとも1つを有する、前記方法も提供する。DNA発現カセットは、植物、例えば、植物組織または葉緑体における前記ポリペプチドの発現を誘導するための少なくとも1つのプロモーターを含む。形質転換植物は、単子葉植物、例えば、ソルガム、トウモロコシ、コメ、もしくはコムギ;または双子葉植物、例えば、ヒマワリ、Arabidopsis、タバコ、ダイズもしくはアブラナであってもよい。形質転換植物は、等量の前記除草剤が両方に対して施用された場合に野生型植物と比較して除草剤(イミダゾリノンおよびスルホニルウレア)に対して耐性である。前記植物は、除草剤に対して耐性であるAHASのラージサブユニットを含む。

図面の簡単な説明

0027

イミダゾリノン耐性突然変異ソルガム系(ADV−IMI−R)および元の自家受粉ソルガム系80237または野生型系の用量応答曲線を示す図である。アッセイされた除草剤は、0(対照)、1X、2X、3Xおよび4Xの施用率のイマゼタピル、イマザピルおよびイマザピックであった。除草効果を、未処理の対照と比較した空中組織乾燥物量(Dry matterDM)のパーセンテージとして測定した;それぞれの値は3回のアッセイの平均である。
突然変異ADV−IMI−RAHASヌクレオチド配列と、元のエンドガミックソルガム系80237または野生型系のものとのアラインメントを示す図である。ヌクレオチドのGからAの置換は、両配列を識別する位置+277に示される。重複するアンプリコン配列を増幅するのに用いられる異なるプライマー下線を付ける。
ソルガムAHAS遺伝子のコドン93のSNP G/Aに関する遺伝子型決定アッセイを示す図である。特異的SNP−SbAHASマーカーを、ADV−IMI−RxF2 90523に由来する177個のF2子孫植物の遺伝子型において分析した。3つのクラスターが明確に定義され、対立遺伝子突然変異体(A/A)のホモ接合植物に対応するドット(黒い丸)、ヘテロ接合植物(A/G)に対応する三角(黒い三角形)および野生型対立遺伝子(G/G)のホモ接合植物の菱形(黒い菱形)として同定された。
ソルガムAHAS遺伝子(受託番号GM663363.1)のヌクレオチド配列と、Phytozomeヌクレオチド配列データベース(http://www.phytozome.net/search.php)に寄託されたソルガムゲノム配列(Sorghum bicolor)とをマッチングさせることにより得られた結果を示す図である。このマッチングは、AHAS GM663363.1配列が、ソルガムゲノムの染色体4に位置するAHAS配列に対する高度に有意な相同性(値e=0)を示すことを示しており、これは対象の遺伝子がこの連結基に存在することを示す。
S.bicolor染色体4の連結マップを示す図である。隣接するマーカー間の距離はセンチモルガン(cM)で与えられる。SNP−SbAHASおよび177個のF2植物の遺伝子型の染色体4中の7つのSSRを参照するイマゼタピルに対する耐性の染色体位置が示される。このマップは、LOD=3のデフォルトパラメータおよび50cMの最大Kosambi距離を用いる、JoinMapソフトウェアを用いて構築されたものである。

0028

除草剤寛容性植物を得るために、エンドガミックソルガム(Sorghum bicolor)系80237植物を、エチルメタンスルホン酸EMS)の水性溶液で処理した。処理した種子を植え、開放授粉のために放置した。273個のM1植物を選択し、それぞれの植物の2個の種子を苗床に植えることによって、合計546個のM2植物を得た。それぞれの対の1個の植物に由来する花粉採取し、その対の他の植物を授粉させるために用いた。273個の授粉したM2植物のそれぞれから得られたM3種子を収穫した。合計273個の畝間にM3子孫を植えた。それぞれのM3畝間からの50個の植物に、100ml L a.i./haのイマゼタピルを噴霧した。畝間からの68個の植物は、除草剤による処理後に正常な生長および症状の非存在を示し、除草剤に対して耐性であると考えられ、VT09−9754と同定された。畝間からの耐性植物の系譜を同定し、それらを80237EMS2−192と命名した(以後、ADV−IMI−Rと呼ぶ)。元のADV−IMI−R突然変異体から選択された除草剤寛容性M7突然変異体植物および種子(VT11−11331−BKと命名)を取得し、ブダペスト条約の条項の下で、2011年10月12日に受託番号NCIMB41870としてNCIMBコレクションに寄託した。

0029

本発明は、EMSで突然変異させたソルガム植物に限定されない。他の突然変異方法、例えば、放射線照射および化学的変異原などの方法により得られたソルガム植物も本発明の範囲内にある。除草剤耐性突然変異植物を、除草剤と共に培養された細胞に対する選択圧および除草剤耐性植物を生成するための耐性細胞の選択のプロセスを用いて取得することもできる。突然変異および育種方法の詳細を、「Principles of Cultivar Development」Fehr、1993、Macmillan Publishing Company(引用することにより本明細書の一部をなすものとする)に見出すことができる。

0030

続いて、イミダゾリノン耐性植物突然変異体ADV−IMI−R(元の突然変異)に対する除草剤噴霧の効果を、エンドガミックソルガム系80237(Advanta所有エリート系)の応答と比較した。その目的のために、植物を、上で、イミダゾリノンファミリーに属する3つの除草剤:イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックで処理した。4つの異なる施用率をアッセイした:それぞれの除草剤について1X、2X、3X、および4X。それぞれの除草剤に関する推奨される畑施用率(1X)を、表1に示す。

0031

0032

噴霧の10日後、全ての植物を、空中組織における乾燥物量(DM)についてアッセイした。その結果を図1に示す。

0033

本発明のADV−IMI−R突然変異体の応答を、エンドガミック系80237のものと比較した。表2は、未処理対照と比較した乾燥物量のパーセンテージ(DM%対照)として表した、異なる施用率のイマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックの効果を示す。開示された値は、3回の実験の平均である。

0034

0035

これらの結果は、本発明のADV−IMI−R突然変異体が4Xの施用率でも3つの試験したイミダゾリノン群の除草剤に対して耐性であることを示す。逆に、元のエンドガミック系80237は、推奨される施用率(1X)が適用される場合でも、全ての除草剤に対して明確に感受性である。

0036

見られるように、本発明の除草剤耐性ソルガム植物は、イマゼタピル、イマザピック、またはイマザピルなどのイミダゾリノン群の除草剤に対して耐性である。

0037

イミダゾリノン耐性ソルガム植物に、公知のイミダゾリノン除草剤群のいずれかの使用の推奨量の4倍である量を噴霧することができる。耐性植物は、例えば、NCIMB41870種子に由来する植物において観察されるような耐性形質を有してもよく、またはそれは、それから誘導された植物、子孫、もしくはそのゲノム中に、ソルガムAHASタンパク質の位置93または等価な位置にアラニンからトレオニンへの置換を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含み、野生型ソルガム植物と比較してイミダゾリノン群に由来する1つまたは複数の除草剤に対する耐性が増大した他の植物であってもよい。

0038

さらに、当業者であれば、そのようなアミノ酸位置が、アミノ酸が付加されるか、または例えば、アミノ酸配列のN末端から除去されるかどうかに応じて変化してもよいことを認識するであろう。「等価な位置」とは、例示されたアミノ酸位置と同じ保存領域内にある位置を意味することが意図される。

0039

本発明において、除草剤に対する用語「寛容性」および除草剤に対する「耐性」は、同じ意味およびイミダゾリノンまたはスルホニルウレアなどの除草剤に関連して用いられる場合、等価な範囲を有する。

0040

本発明は、有効量の除草剤に対して耐性を示す植物、植物細胞、植物組織を提供する。「有効量」とは、野生型植物、植物細胞または組織の生長を阻害することができるが、耐性植物、植物細胞または植物組織に対する重篤な効果をもたらさない除草剤の量を意味する。除草剤の有効量は、雑草を排除するための推奨量である。野生型植物、細胞または組織は、例えば、イミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤の除草剤耐性形質を示さないものである。用語「植物」は、任意の段階の植物、または植物部分包含し、前記植物部分は知識を有する植物学者には周知の種子、葉、花、、組織または器官であってもよい。

0041

突然変異を検出するために、前記AHASポリペプチドまたはラージサブユニットが除草剤耐性である、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする本発明の突然変異ソルガムAHAS遺伝子を配列決定した。

0042

突然変異植物に由来するAHAS遺伝子DNA配列と、野生型ソルガム植物に由来するAHAS遺伝子DNA配列との比較により、ヌクレオチド位置+277のGヌクレオチドがAに変化する点突然変異が同定されたが、これは本発明のADV−IMI−R突然変異体から元のソルガム80237系(野生型)を識別するものである。突然変異体および野生型系に由来するAHASアミノ酸配列を推定した場合、ヌクレオチド置換(配列番号1のACGによるGCG)がコドン93で突然変異ポリペプチドをコードし、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を示し、突然変異ADV−IMI−R系のソルガムAHASタンパク質のラージサブユニットに対応するポリペプチド(配列番号2)中のアラニンからトレオニン(Ala93Thr)への置換をもたらすことが観察された。

0043

前記ポリペプチドの位置93または異なる種に属する別のAHAS酵素の等価な位置にアラニンからトレオニン(Ala93Thr)への置換を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む植物、植物部分、種子、その子孫、トランスジェニック植物なども本発明の範囲内にある。

0044

少なくとも85%、95%、または98%の配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドも本発明の範囲内にある。配列同一性パーセントは、2つのアミノ酸配列または2つのヌクレオチド配列のアラインメントにより決定される。2つの配列間のアラインメントのパーセンテージを、例えば、以下の式:
(同一の位置の量/重複する位置の総量)x100
を用いて算出することができる。

0045

2つの配列間のアラインメントのパーセンテージは、様々な数学アルゴリズム、例えば、Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:403頁のNBLASTおよびXBLASTプログラムに含まれるアルゴリズムを用いて決定される。BLAST、Gapped BLAST、およびPSI−Blastプログラムを用いる場合、対応するプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメータを用いることができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。配列の比較のために用いられる数学アルゴリズムの別の好ましい非限定例は、MyersおよびMiller(1988)CABIOS 4:11〜17頁のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組込まれている。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプログラムを用いる場合、PAM120ウェイト残基テーブル(weight residue table)、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを用いることができる。また、アラインメントを手動による検査により実施することもできる。

0046

本発明は、除草剤耐性を付与するポリヌクレオチドおよびタンパク質を含む。除草剤耐性ポリヌクレオチドを参照する場合、それは除草剤耐性AHASタンパク質をコードするポリヌクレオチドを意味すると理解される。除草剤耐性AHASタンパク質は、天然であっても、または突然変異体であってもよく、それらはイミダゾリノンまたはスルホニルウレアの群に属する除草剤に対する耐性を付与する。

0047

イミダゾリノン、例えば、イマゼタピルに対する耐性の継承を、イマゼタピル感受性系とADV−IMI−R突然変異体とを交配することにより生成された分離F2ソルガム集団において評価した。かくして得られたF2植物に、発芽後の段階V6で3X、20日間の施用率でイマゼタピル(Pivot(登録商標)、BASF)を噴霧し、表現型症状を、処理の10日後に評価した。その結果を表3に提供する。

0048

0049

結果は、F2植物集団を、3つの表現型カテゴリー:損傷のない植物、萎黄病植物および枯死した植物に個体をグループ化するのを可能にする表現型スコアリングによる視覚的症状に基づいて分類することができることを示す。

0050

配列決定により、本発明の除草剤寛容性ソルガム突然変異体が、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドまたはAHASタンパク質のラージサブユニット中に点突然変異を有することが示された。配列番号1に記載のヌクレオチド配列は、ヌクレオチドGが、ヌクレオチド位置+277(コドン93に対応する)でAに変化していることを示し、これは本発明の誘導されたADV−IMI−R突然変異体から元のソルガムエンドガミック系80237(除草剤に対して感受性である)を識別するものである。この分子マーカーを、SNP−SbAHASと命名した。

0051

除草剤耐性である可能性のある植物、植物部分または種子を検出するためのSNP−SbAHASマーカーの有用性を決定するために、除草剤耐性ADV−IMI−R突然変異体(VT09−9754−48−6−BK選択)と、除草剤感受性エンドガミック系90523とを交配させることにより生成されたF2集団(本明細書ではADV−IMI−Rx90523 F2集団と命名する)に由来する177個の植物を試験した。図3は、一例として、F2集団からのいくつかの植物の対立遺伝子識別を示す。2つの試験した対照を、予想されるクラスターにグループ化した(それぞれ、ホモ接合耐性およびホモ接合感受性の、ADV−IMI−R突然変異体および野生型90523)。これらのデータにより、分子マーカーSNP−SbAHASが、アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有するポリペプチドまたはソルガムAHASタンパク質のラージサブユニットをコードするポリヌクレオチドのヌクレオチド位置+277の3つの対立遺伝子組合せを識別するのに有用であることが確認される。

0052

当業者であれば、SNP−SbAHASマーカーおよびその使用の開示を考慮して、例えば、イミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレアの群に属する除草剤、例えば、イマゼタピル、イマザピックなどに対する除草剤耐性植物を同定することができる。同定方法は、本明細書に記載の方法に加えて、任意の他の公知の方法であってもよく、例えば、ASA(Soleimaniら(2003)Plant Mol Biol Rep 21:281〜288頁)、PAMSA(Gaudetら(2007)Plant Mol Biol Rep 25:1〜9頁)、SSCP(GermanoおよびKlein(1999)Theor Appl Genet 99:37〜49頁)またはTaqMan(登録商標)(Jonesら(2008)Pest Management Science 64:12〜15頁)を参照されたい。

0053

耐性表現型と突然変異対立遺伝子数との相関を、SNP−SbAHASマーカーを用いて分析した。この目的のために、F2子孫(ADV−IMI−Rx90523)に由来する個々の植物の萎黄病および枯死表現型を、イマゼタピルを噴霧した後に試験した。同時に、SNP−SbAHASマーカーの遺伝子型を試験した。その結果を表4に示す。分子マーカーSNP−SbAHASと、イマゼタピルに対する耐性との相関(表現型の評定として測定)を、カイ二乗独立検定を用いて決定した。この試験により、表現型および遺伝子型共分離に従う、AHAS遺伝子中の誘導された突然変異(特異的SNP−SbAHASマーカーを用いて遺伝子型決定された)と、イマゼタピルに対する耐性との高度に有意な相関を示す確率p=1.948e−46が得られた。

0054

0055

さらに、除草剤耐性および特異的SNP−SbAHASマーカーの遺伝子マッピングを実行した。GenBank(受託番号GM663363.1、配列番号4)に開示されたソルガムAHAS配列に基づいて、BLAST分析を実行して、Sorghum bicolorのDNA配列と、Phytozomeデータベース(http://www.phytozome.net/search.php)とを一致させた。図4に示される結果は、イミダゾリノン群に属する除草剤に対する耐性と関連するAHAS配列がSorghum bicolorゲノムの染色体4中に位置することを示している。この情報に基づくフィンガープリンティング(遺伝子型決定)手順を、様々なSSR型DNA分子マーカーを用いて本発明の突然変異ADV−IMI−R系およびエンドガミック90253系について実行した。染色体4に位置する7個の多型SSRを、遺伝子型決定のために選択した(Mace、ESら、A consensus genetic map of sorghum that integrates multiple component maps and high−throughput Diversity Array Technology(DArT) markers、BMCPlant Biology、2009、9:13頁;Srinivas、Gら、Exploration and mappingof microsatellite markers from subtracted drought stress ESTs in Sorghum bicolor(L.)、Moench.Theor.Appl.Genet.2009、118:703〜717頁;Ramu、Pら、In silico mapping of important genes and markers available in the public domain for efficient sorghum breeding、Mol Breeding 2010、26:409〜418頁;http://www.lbk.ars.usda.gov/psgd/sorghum/2009SorghumSEAMs_LBKARS.xls)。

0056

この手順の結果を用いれば、SNP−SbAHASマーカーと耐性表現型の両方を遺伝子マッピングすることが可能であったが、これはイミダゾリノンに対する耐性および特異的SNP−SbAHASマーカーが、Sorghum bicolorの染色体4中の以前に同定されたSSRにフランキングして染色体4中に位置することを示している(図5)。

0057

本発明のポリヌクレオチド(配列番号1)を、トランスジェニック植物を得るために植物中に導入することができる。ポリヌクレオチドを植物、特に、農業目的の植物、例えば、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、コムギ、サトウキビ、アマ、ヒマワリまたは他の植物;野菜樹木、または観葉植物に導入するための様々な方法がある。トランスジェニック植物を得るためにポリヌクレオチドを導入する方法は当業界で周知であり、組換え方法を用いることもできる。

0058

例えば、ベクターを用いる植物の形質転換のための様々な方法がある(An、G.ら(1986)Plant Pysiol.,81:301〜305頁;Fry、J.ら(1987)Plant Cell Rep.,6:321〜325頁;Block、M.(1988)Theor.Appl Genet.,76:767〜774頁;Hincheeら(1990)Stadler.Genet.Symp.,203212.203〜212頁;Barceloら(1994)Plant J.,5:583〜592頁;Beckerら(1994)Plant J.,5:299〜307頁;Borkowskaら(1994)Acta Physiol Plant.,16:225〜230頁;Christouら(1992)TrendsBiotechnol.,10:239〜246頁;D’Halluinら(1992)Bio/Technol.,10:309〜314頁;Dhirら(1992)Plant Physiol.,99:81〜88頁;Casasら(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA 90:11212〜11216頁;Dong、J.A.およびMchughen、A.(1993)Plant Sci.,91:139〜148頁;Golovkinら(1993)Plant Sci.,90:41〜52頁;Guo Chin Sci.,Bull.,38:2072〜2078頁;Asanoら(1994)Plant Cell Rep.,13;Christou、P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.,5:17〜27頁;Eapenら(1994)Plant Cell Rep.,13:582〜586頁;Hartmanら(1994)Bio−Technology 12:919923頁;Christou、P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.−Plant;29P:119〜124頁;Daviesら(1993)Plant Cell Rep.,12:180〜183頁;Ritalaら(1994)Plant.Mol.Biol.24:317〜325頁;ならびにWan、Y.C.およびLemaux、P.G.(1994)Plant Physiol.,104:3748頁)。

0059

植物を形質転換するためのいくつかの方法および遺伝子操作技術が、Sambrookら(1989)Molecular cloning、 A laboratory manual、Cold Spring Harbor Press、Plainview、N.Y.;AusubelFMら、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、New York、N.Y.に記載されている。

0060

ベクターを、米国特許第4,945,050号およびCasasら、Proc.Natl.Sci.,USA、90:11212頁、1993に記載されたものなどの弾道粒子加速技術を用いて導入することもできる。

0061

例えば、本発明のポリヌクレオチドで形質転換された植物は、除草剤耐性AHASタンパク質を発現し、イミダゾリノンおよび/またはスルホニルウレアなどの除草剤に対する耐性形質を示す。「除草剤耐性AHASタンパク質」とは、除草剤が野生型AHASタンパク質のAHAS活性を阻害する濃度でAHAS活性を阻害する除草剤の存在下にある場合、野生型AHAS活性のものよりも高いAHAS活性を示すタンパク質を意味する。

0062

本発明のポリヌクレオチド配列を、対象、例えば、農業対象の植物において耐性AHASタンパク質を発現させるための発現カセット中に含有させることができる。このカセットは、例えば、少なくとも1つのプロモーターに作動可能に連結された調節配列を含む。プロモーターは当業界で周知であり、例えば、構成的、誘導的、組織特異的、葉緑体特異的プロモーターであってもよく、それらは全て植物中で機能的である。カセットは、当業界で公知の転写終結配列をさらに含む。カセットは、除草剤耐性AHASポリヌクレオチドの発現効率を改善するための様々な調節配列、例えば、イントロンウイルス配列などのエンハンサーを含んでもよく;または前記ポリヌクレオチドに結合した、もしくは結合していない、本発明のポリヌクレオチドとは異なる対象の他のポリヌクレオチド配列;またはリーダー配列を含んでもよい。

0063

プロモーターとしては、限定されるものではないが、構成的、誘導的、組織または器官特異的プロモーター、例えば、35Sプロモーター、創傷もしくは化学誘導性プロモーター熱ショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどが挙げられる(Chaoら、1999、Plant Physiol.,120:979頁;米国特許第5,187,267号、米国特許第5,057,422号)。

0064

また、植物において有用であり得る好適な転写ターミネーターも当業者には公知であり、例えば、Odellら、1985、Nature 313:810頁;Sanfaconら、Genes Dev.,5:141頁、1990;Munroeら、1990 Gene 91:151頁;Rosenbergら、1987、Gene 56:125頁;Joshiら、Nucleic Acid Res.,15:9627頁、1987を参照されたい。

0065

「作動可能に連結された」とは、プロモーターと第2の配列との機能的連結を指すことが意図される。プロモーター配列は、第2の配列に対応するDNA配列の転写を開始、媒介する。用語「作動可能に連結された」とは、連結される核酸配列が連続的であり、2つのタンパク質コード領域を結合させるのに必要である場合、連続的であり、同じ読み枠中にあることを意味する。カセットは、複数の発現カセットであってもよい。

0066

本発明のポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドの融合物の形態で、または別々に、他のポリヌクレオチドに結合させることができる。他のポリヌクレオチドは、例えば、当業者には周知である除草剤耐性、昆虫耐性または他の植物部分をコードしてもよい。

0067

植物中での発現を改善するために、本発明のポリヌクレオチドを、例えば、植物にとって好ましいコドンを含有させること、イントロンまたは有害な配列などの配列を欠失させることにより改変することができる。また、突然変異され、例えば、欠失もしくは挿入を示す本発明の耐性AHASポリペプチドまたは本明細書に記載のものとは異なる他の突然変異をコードするポリヌクレオチドも本発明の範囲内にある。「突然変異ポリヌクレオチド」とは、そのヌクレオチド配列中永続的な変化を有するポリヌクレオチドを意味する。

0068

本発明のポリヌクレオチドを、置換、欠失、トランケーション、および挿入により変化させることができる。そのような操作のための方法は当業界で一般に公知である。突然変異誘発およびヌクレオチド配列変化のための方法は当業界で周知である(Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:488〜492頁;Kunkelら(1987)Methodsin Enzymol.,154:367〜382頁;WalkerおよびGaastra編(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company、New York)およびそこで引用された参考文献)。対象のタンパク質の生物活性に影響しないアミノ酸置換を、引用することにより本明細書の一部をなすものとする、Dayhoffら(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington、D.C.)に見出すことができる。

0069

本発明のAHASポリヌクレオチドを含むDNAを、ベクターの一部として様々な植物に導入することができる。好適なベクターの選択は、形質転換のために用いられることが意図される方法および形質転換される植物に依存する。当業者であれば、様々なベクター、例えば、Tiおよび/またはRiをよく知っている。T−DNAも、TiまたはRiベクターを組込むためのフランキング領域として用いられる(WO84/02913、Herrera−Estrellaら、1983、Nature 303:209頁;Horschら、1984、Science 223:496頁;Fraleyら、1983、Proc.Natl.Acad.Sci、USA 80:4803頁)。

0070

ベクターは、発現カセットおよび他のヌクレオチド配列、例えば、抗生物質または除草剤に対する耐性を付与するマーカーなどの選択マーカーおよび植物中での対象のポリヌクレオチド、例えば、配列番号2のAHASラージサブユニットポリペプチドの発現を誘導するための配列を含んでもよい。

0071

本発明の耐性AHASポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、イミダゾリノンおよびスルホニルウレアの型の除草剤に対して耐性であるトランスジェニック植物を取得するのに有用であってもよい。形質転換植物は、双子葉植物または単子葉植物などの任意の型の植物であってもよく、特に、限定されるものではないが、ソルガム(Sorghum bicolor、Sorghum vulgare)、トウモロコシ(Zea mays)、Brassica種(例えば、B.napus、B.rapa、B.juncea)、アルファルファ(Medicago sativa)、コメ(Oryza sativa)、ライムギ(Secale cereale)、キビ(Pennisetum glaucum)、(Panicum miliaceum)、(Setaria italica)、(Eleusine coracana)、ヒマワリ(Helianthus annuus)、コムギ(Triticum aestivum、T.Turgidum ssp.durum)、ダイズ(Glycine max)、タバコ(Nicotiana tabacum)、ピーナッツ(Arachis hypogaea)、ワタ(Gossypium barbadense、Gossypium hirsutum)、サツマイモ(Ipomoea batatus)、キャッサバ(Manihot esculenta)、コーヒー(Coffea spp.)、ココナッツ(Cocos nucifera)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、パイナップル(Ananas comosus)、柑橘類の木(Citrus spp.)、ココア(Theobroma cacao)、(Camellia sinensis)、バナナ(Musa spp.)、アボカド(Persea americana)、オリーブ(Olea europaea)、カシュー(Anacardium occidentale)、アーモンド(Prunus amygdalus)、サトウダイコン(Beta vulgaris)、ジャガイモ(Solanum tuberosum)、サトウキビ(Saccharum spp.)、野菜、観葉植物、および樹木などの農業対象の植物が挙げられる。好ましくは、本発明の植物は、ソルガムである。

0072

本発明は、以下の実施例により良好に例示されるが、その範囲を限定すると解釈されるべきではない。逆に、本発明の他の実施形態、改変物および等価物が、本明細書を読んだ後に可能となり、当業者であれば、本発明の精神および/または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく提言することができることが明確に理解されるべきである。

0073

[エンドガミックソルガム系80237の突然変異誘発およびイミダゾリノン耐性突然変異体80237EMS2−192の選択]
エンドガミック系80237に由来する32000個の予め発芽させたソルガム種子を、0.05%v/vのエチルメタンスルホン酸(EMS)の水性溶液中に16時間浸した。処理された種子を2007年12月21日にExperimental Station of Advanta Seedsin Venado Tuerto、Province of Santa Fe、Argentinaのプロット1番(33°41’47’’S;61°58’45’’W)に植え、それらを開放授粉のために放置した。

0074

合計273個のM1植物を選択し、それぞれの植物からの2個の種子を2008年5月23日にExperimental Station of Advanta Seedsin Oran、Province of Salta、Argentina(22°49’37’’S;64°20’14’’W)の苗床に植え、合計546個のM2植物を得た。それぞれの対の一方の植物から花粉を採取し、その対の他方の植物を授粉させるのに用いた。273個の授粉したM2植物のそれぞれから得られたM3種子を収穫した。合計273個の畝間のM3子孫を2008年12月16日にVenado Tuertoに植え、それぞれのM3畝間に由来する50個の植物に2008年12月23日に100ml L a.i./haのイマゼタピルを噴霧した。畝間に由来する68個の植物は除草剤による処理後に正常な生長および症状の非存在を示し、除草剤に耐性であると考えられ、VT09−9754と同定された。畝間に由来する耐性植物の系譜を同定し、それらを80237EMS2−192と命名した(以後、ADV−IMI−Rと呼ぶ)。

0075

世代の歴史を表5に示す。

0076

0077

[元のソルガムエンドガミック系80237と比較した、耐性ADV−IMI−R突然変異体におけるイミダゾリノンによる処理に対する応答率の分析]
ソルガム系80237(Advanta所有のエリート系)および本発明のイミダゾリノン耐性ADV−IMI−R突然変異体(元の突然変異)に、畑上で、イミダゾリノン群中の3つの除草剤:イマゼタピル、イマザピル、およびイマザピックを噴霧した。4つの異なる施用率をそれぞれの除草剤についてアッセイした:1X、2X、3Xおよび4X(1Xが推奨される施用率である)(上記の表1を参照されたい)。

0078

畑実験をVenado Tuertoにおいて実行し、植付けを2010年12月1日に行った。除草剤を発芽の20日後に噴霧した(V6段階)。全ての処理を、その対応する未処理対照と比較した。実験設計は、3つの複製物に分割したプロットからなっていた(主プロット:除草剤による処理;副プロット:系)。

0079

噴霧の10日後、全ての植物を、空中組織における乾燥物量(DM)についてアッセイした。除草剤応答を、対応する未処理対照の空中組織におけるDMパーセンテージとして評価した。

0080

かくして、それぞれの施用率jに関する除草剤iに対して感受性である系を、
DMij%対照=(DMij*100)/DM対照
として表した。DMij%対照は、それぞれの系に由来するそれぞれの処理に関する3回の実験の平均値である。

0081

[アセトヒドロキシ酸合成酵素活性を有し、イミダゾリノン耐性である本発明の突然変異ポリペプチドをコードするソルガムAHAS遺伝子の配列決定]
ADV−IMI−R突然変異体(VT11−11331−BK選択)および野生型エンドガミック系80237に由来する葉組織に関して配列決定試験を行った。ゲノムDNAを単離し、100ng/μlの最終濃度で水中に再懸濁した。ADV−IMI−R突然変異体およびソルガム系80237に由来するアセトヒドロキシ酸合成酵素(AHAS)遺伝子の配列決定のために、受託番号GM663363.1の下でGenBankに開示されたソルガムAHAS配列に基づいて、ポリメラーゼ連鎖反応PCR)による増幅のための特異的プライマーを設計した。完全なAHASコード配列を表す5つの重複するDNAセグメントアンプリコン)を生成するためにプライマーを設計した。設計されたプライマーの配列は以下の通りである。

0082

0083

PCR混合物は25μlの最終容量および以下の成分:1X反応バッファー(Invitrogen)、0.2mM dNTP(GE Healthcare)、2.5mM MgCl2(Invitrogen)、0.2μMの各プライマー、0.5μl Platinum Taq(5U/μl)(Invitrogen)および100ngのゲノムDNAを有していた。PCR反応を、GeneAmpPCRSystem 9700サーモサイクラー(Perkin−Elmer)中で実施し、増幅条件は以下の通りであった:94℃で1分間の初期変性、次いで、94℃で45秒間、57℃で45秒間、および72℃で70秒間の35サイクルのステップ、ならびに72℃で10分間の最終伸長ステップ

0084

両方ともADV−IMI−R産物ならびに元のソルガム系80237に関するSbAHAS−F1およびSbAHAS−R1OLD1−R2プライマーを用いた場合、増幅産物は得られなかった。

0085

この問題を克服するために、2つの新しいプライマーを設計して、第6のアンプリコンを生成した:

0086

0087

上記のものと同じPCR条件を用いて、第6のアンプリコンを得た。

0088

PCRによる増幅の結果生じる2μlの各DNA産物アガロースゲル電気泳動により検査して、分子量マーカーLow DNA Mass Ladder(Invitrogen)を参照して断片サイズおよびDNA濃度見積もり値を分析した。残りのPCR産物を、Wizard(登録商標)SVゲル(Promega)およびPCR Clean−Up System(Promega)を用いて精製した。精製されたDNAを、BigDye(登録商標)Terminator v3.1 Cycle Sequencing System(Applied Biosystems)を製造業者説明書に従って用いて配列決定した。

0089

各アンプリコンに関して得られたアセトヒドロキシ酸合成酵素の配列決定ファイルを、CAP3 Sequence Assembly Program(http://pbil.univ−lyon1.fr/cap3.php)を用いて整理した。アセトヒドロキシ酸合成酵素遺伝子の得られるDNA配列を、Clustal Wバージョン2.1プログラム(http://www.clustal.org)を用いて整列させた。

0090

[イマゼタピル感受性系と、耐性ADV−IMI−R突然変異体とを交配させることにより生成された分離F2ソルガム集団におけるイマゼタピル耐性の継承]
ソルガム系90523(Advanta所有エリート系、イミダゾリノンに感受性)と、イミダゾリノン耐性ADV−IMI−R突然変異体(VT09−9754−48−6−BK選択)との間で標的化交配を実行した。得られるF1植物を自家授粉させ、F2種子を収穫した。F2種子を、2010年10月にVenado Tuertoの畑に植えた。F2植物(177個の植物)に、3xの施用率で(商業的使用のために製造業者により推奨される施用率は1Xであり、これは100ml a.i./haと等しい)、イマゼタピル(Pivot(登録商標)、BASF)を噴霧した。噴霧の前に、ADV−IMI−R突然変異体(VT09−9754−48−6−BK選択)と野生型系90523の両方に由来する177個のF2植物のそれぞれから葉組織を採取して、ゲノムDNAを単離し、遺伝子型決定分析における使用のために最終濃度100ng/μlで水に再懸濁した。

0091

除草剤を、発芽の20日後に噴霧した(段階V6)。植物を噴霧の10日後に評価し、以下の表現型スコアリングに従って視覚的に評価された症状により除草効果を3つのカテゴリーに分類した:
−1=損傷なし
−2=萎黄病
−3=枯死。

0092

[SNP−SbAHASに特異的なDNAマーカーの開発]
ヌクレオチド位置+277(コドン93)のヌクレオチドGをAにより置きかえるAHAS遺伝子中の単一の点突然変異は、誘導されたADV−IMI−R突然変異体から元のエンドガミックソルガム系80237(除草剤感受性)を識別する。下記群の二重標識されたプライマーおよびプローブを用いて、分子マーカー(本明細書ではSNP−SbAHASと命名される)を設計した:

0093

0094

AB 7500サーモサイクラー(Applied Biosystems、FosterCity、CA、US)を用いるリアルタイムPCR対立遺伝子識別アッセイにより、遺伝子型決定を行った。PCR反応混合物を、12.5μlの2X Perfecta(登録商標)qPCR Supermix(Quanta Biosciences、Gaithersburg、MD、US)、0.08μMのプライマー(フォワードおよびリバース)、0.4μMのプローブ(1および2)、10μlのゲノムDNAならびに最終容量を作るためのDNase非含有水を含む25μlの最終容量で調製した。増幅条件は、95℃で10minの1回の初期変性サイクル、次いで、92℃で15秒間の変性および60℃で1minのハイブリダイゼーション伸長の50サイクルであった。対立遺伝子識別アッセイの結果を、AB Sequence Detection System(SDS)7500 1.4ソフトウェアプログラム(Applied Biosystems、Foster City、CA、US)を用いて増幅後に分析した。

0095

[除草剤耐性とADV−IMI−R突然変異体中のAHAS突然変異との相関]
ADV−IMI−Rx90523交配により得られた個々のF2子孫植物を、イマゼタピルを用いる噴霧(実施例4に記載の方法を用いる)後に表現型分類(損傷なし、萎黄病および枯死)した後、AHAS中の誘導された突然変異に特異的である分子マーカーSNP−SbAHASを用いて(実施例5に記載の方法を用いる)遺伝子型分類した。

0096

[除草剤耐性および特異的SNP−SbAHASマーカーの遺伝子マッピング]
除草剤耐性および特異的SNP−SbAHASマーカーを遺伝子マッピングした。Genbank(受託番号GM663363.1)に開示されたソルガムAHAS配列に基づいて、BLAST分析を実行して、それをPhytozomeデータベース(http://www.phytozome.net/search.php)に寄託されたSorghum bicolorのゲノムDNA配列と一致させた。

0097

突然変異ADV−IMI−R系およびエンドガミック系90253の遺伝子型決定(フィンガープリンティング)を、SSR型分子マーカー群を用いて実行した。Sorghum bicolorゲノムの染色体4に位置する7個の多型SSRを、遺伝子型決定のために選択した(Mace、ESら、A consensus genetic map of sorghum that integrates multiple component maps and high−throughput Diversity Array Technology(DArT) markers、BMCPlant Biology、2009、9:13頁;Srinivas、Gら、Exploration and mappingof microsatellite markers from subtracted drought stress ESTs in Sorghum bicolor(L.)、Moench.Theor.Appl.Genet.2009、118:703〜717頁;Ramu、Pら、In silico mapping of important genes and markers available in the public domain for efficient sorghum breeding、Mol Breeding 2010、26:409〜418頁;http://www.lbk.ars.usda.gov/psgd/sorghum/2009SorghumSEAMs_LBKARS.xls)。

0098

7つの選択された多型SSRは以下の通りであった。

0099

0100

試験したSSRのそれぞれに由来する得られるPCR断片を、自動化配列決定装置ABI3130x1(Applied Biosystems)を用いるキャピラリー電気泳動により分解した。これらの7個のSSRの遺伝子型決定を、ADV−IMI−Rx90523交配から得られるF2子孫の177個の個体において行った。さらに、これらの同じ177個のF2子孫植物を、AHAS遺伝子中の導入された突然変異に特異的なSNP−SbAHASマーカーの存在に関して分析した。結果を、F2子孫植物に関するイマゼタピルの施用時の表現型評定に従って分類し、コンピュータプログラムJoinMap(Van Ooijen、JWおよびVoorips、RE、JoinMap 3.0 Software for the calculation of genetic linkage maps、Plant Research International、2001、Wageningen、The Netherlands)を用いて分析した。

実施例

0101

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