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技術 MUC1腫瘍抗原のネイティブ及びアゴニストCTLエピトープ

出願人 アメリカ合衆国
発明者 シュロム、ジェフリーツァン、クォン−ヨク
出願日 2013年1月3日 (6年6ヶ月経過) 出願番号 2014-551304
公開日 2015年2月5日 (4年5ヶ月経過) 公開番号 2015-504071
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学 微生物、その培養処理 医薬品製剤 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 構成物品 日付ファイル 処理済血液 ターゲット候補 合成初期 物理的バリア アルミニウムシリカ 挿入領域
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図面 (5)

課題・解決手段

本発明は、癌のワクチン予防又は治療において利用可能である、ヒト腫瘍関連抗原(TAA)ムチン1(MUC1)由来ヒト細胞溶解性Tリンパ球(CTLエピトープ及びそのアナログを含むペプチドを提供し、並びに、該ペプチドをコードする核酸と、該核酸を含むベクターと、該ペプチド、核酸、又はベクターを含む細胞と、それらの組成物とを提供する。

概要

背景

MUC1(CD227)は、小さなC末端サブユニット(MUC1−C)に共有結合する大きなN末端サブユニット(MUC1−N)のヘテロ二量体から構成されるI型膜糖タンパク質である。MUC1−Nは、完全に細胞外であり、高度にグリコシル化されており、20アミノ酸可変タンデムリピート(VNTR)ドメインからほとんど全てが構成される。MUC1−Cは短い細胞外ドメイン膜貫通ドメイン、及び細胞質テール又はドメイン(MUC1−CD)からなる。

MUC1は、通常、上皮細胞頂端表面上、及び造血細胞活性化T細胞などの非上皮細胞の小さなサブセット中に発現する。健康な上皮におけるその主な機能は、潤滑、並びに化学薬品及び微生物因子に対する物理的バリアを提供することである。他の細胞タイプにおける、その生理役割は明確ではない。

多くのヒト癌腫卵巣膵臓大腸及び前立腺など)及び血液系腫瘍多発性骨髄腫及びいくつかのB細胞非ホジキンリンパ腫など)は、MUC1を異常に過剰発現するということが証明されている。正常な組織におけるそのクラスター化した発現と対照的に、MUC1は腫瘍細胞の全表面に均一に分散する。さらに、MUC1は、一般的に腫瘍においてグリコシル化が不十分であり、タンパク質コア新規かつ潜在的な抗原エピトープ免疫システムにさらしている。MUC1の発現及び分泌は、予後不良及び高転移能とも関連している。

MUC1は腫瘍関連抗原であるため、MUC1を治療用癌ワクチンターゲット候補として利用する多くの計画が、癌ワクチンに対するターゲット候補としてのMUC1の利用に対して最近の20年の間評価されている。臨床試験では、タンパク質ペプチドアジュバント担体、ex vivoで培養された樹状細胞(DCs)、可溶化液、樹状細胞融合、リポソームポックスウイルスアデノウイルス酵母、及び樹状細胞をターゲットとするC型レクチン試験されている。

免疫療法に対するターゲットとしてMUC1を使用するほとんどの臨床試験は、長期完全寛解に達することができなかった、進行した転移性疾患を有する被験者登録する。この結果における1つの要因は、これらの臨床試験の大多数は、MUC1に対する体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を高めるために、VNTRドメインに焦点をあてていることだといえる。腫瘍進行の間に血液中に流される、VNTRドメインを含むN末端サブユニットの相当量は、表面上にMUC1を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答欠如を部分的に説明できる。

MUC1−Cは、MUC1のC末端サブユニットである。MUC1の切断後、大きな細胞外サブユニットにも関わらず、MUC1−Cは、シングルパス(28アミノ酸)膜貫通ドメイン(TD)によって、細胞膜に固定されたままである。MUC1ではなく、MUC1−Cが、おそらくN末端サブユニットの切断により、いくつかの種々の腫瘍細胞株及び癌標本でタンパク質の優勢な形態であることが明らかになっている。さらに、N末端サブユニットが1又は2点でクラスター化され、健康な上皮におけるMUC1の正常な挙動想起させるのに対して、MUC1−Cは、腫瘍細胞の表面全体にわたって均一に分布する。重要なことに、いくつかの組織標本では、MUC1−Cの存在に対してポジティブに染色されるが、N末端サブユニットに対してはネガティブとなり得ることが実証されている。

最近の数年間において、癌遺伝子としてのMUC1−Cの役割に関する証拠が急速に蓄積されている。MUC1−CDの72アミノ酸残基は、いくつかのミトコンドリア細胞質、細胞膜、及び核成分との相互作用を伴う、細胞シグナリング機能の注目に値する範囲と関連する。MUC1−CDは、ζ鎖関連70−kDプロテインキナーゼ(ZAP−70)、プロテインキナーゼCのδアイソフォームPKCδ)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK−3β)、並びにチロシンキナーゼc−Src及びLckなどのいくつかのキナーゼに対するターゲットである。MUC1−CDのリン酸化は、線維芽細胞増殖因子レセプター3、血小板由来増殖因子レセプター、及びErbBファミリーメンバーを含むいくつかの細胞表面増殖因子レセプターの活性化に反応して起こるのかもしれない。リン酸化に加え、MUC1−CDは、β−カテニンエストロゲンレセプター−α、及びヒートショックプロテインなどのいくつかのタンパク質及びレセプターと直接結合できる。MUC1−Cトランスフェクションは、増殖率の増加、足場非依存性細胞増殖、及び化学療法剤に対する耐性など、予め全長のMUC1タンパク質に起因する形質転換誘導及び発癌活性を起こすのに十分である。c−Srcにより活性化されたMUC1−Cシグナリングは、癌細胞運動性浸潤転移刺激するE−カドヘリン接着結合及びインテグリン接着斑の両方の崩壊に関わっており、上皮間葉転移におけるMUC1−Cの潜在的役割を示唆する。特異的細胞内MUC1ペプチドが、癌の進行を抑制できるということも証明されている。最後に、MUC1−Cはヒト多能性幹細胞の増殖を媒介し、その発現は、未分化細胞を同定及び単離するためのマーカーとして利用できるということが示されている。

概要

本発明は、癌のワクチン予防又は治療において利用可能である、ヒト腫瘍関連抗原(TAA)ムチン1(MUC1)由来ヒト細胞溶解性Tリンパ球(CTLエピトープ及びそのアナログを含むペプチドを提供し、並びに、該ペプチドをコードする核酸と、該核酸を含むベクターと、該ペプチド、核酸、又はベクターを含む細胞と、それらの組成物とを提供する。なし

目的

健康な上皮におけるその主な機能は、潤滑、並びに化学薬品及び微生物因子に対する物理的バリアを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号10、配列番号13、配列番号14、配列番号29及び配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたペプチド

請求項2

ペプチドが、20以下のアミノ酸残基を有する、請求項1に記載のペプチド。

請求項3

ペプチドが、配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号10、配列番号13、配列番号14、配列番号29又は配列番号32からなる、請求項1又は2に記載のペプチド。

請求項4

20以下のアミノ酸残基を有し、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号11、配列番号15、配列番号26又は配列番号30を含む、単離されたペプチド。

請求項5

ペプチドが、配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28又は配列番号31を含む、請求項4に記載のペプチド。

請求項6

ペプチドが、配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28又は配列番号31からなる、請求項4に記載のペプチド。

請求項7

請求項1〜6のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、単離された核酸

請求項8

請求項7に記載の核酸を含むベクター

請求項9

請求項10

ベクターが、オルソポックスアビポックス、カプリポクス、及びスイポックスウイルスからなる群より選択されるポックスウイルスである、請求項9に記載のベクター。

請求項11

ポックスウイルスが、ワクシニア鶏痘、及びカナリア痘ウイルスからなる群より選択される、請求項10に記載のベクター。

請求項12

(i)請求項1〜6のいずれか一項に記載の1つ以上のペプチド、(ii)請求項7に記載の1つ以上の核酸、又は(iii)請求項8〜11のいずれか一項に記載の1つ以上のベクターを含む、単離された細胞

請求項13

細胞がヒトである、請求項12に記載の細胞。

請求項14

細胞が、抗原提示細胞又は腫瘍細胞である、請求項12又は13に記載の細胞。

請求項15

(a)(i)請求項1〜6のいずれか一項に記載の1つ以上のペプチド、(ii)請求項7に記載の1つ以上の核酸、(iii)請求項8〜11のいずれか一項に記載の1つ以上のベクター、又は(iv)請求項12〜14のいずれか一項に記載の1つ以上の細胞、及び(b)医薬上許容される担体を含む組成物

請求項16

さらに免疫賦活制御分子を含む、請求項15に記載の組成物。

請求項17

免疫賦活/制御分子が、インターロイキンIL)−2、IL−4、IL−6、IL−12、インターフェロン(IFN)−γ、腫瘍壊死因子(TNF)−α、B7.1、B7.2、ICAM−1、LFA−3、CD70、RANTES、G−CSF、OX−40L、41BBL、抗CTLA−4、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。

請求項18

免疫賦活/制御分子が、(i)キトサン複合化した、IL−12をコードするプラスミド、及び(ii)キトサンと混合した組換えIL−12からなる群より選択される、請求項16に記載の組成物。

請求項19

化学療法剤抗生物質抗ウイルス薬抗真菌薬シクロフォスファミド、又はそれらの組み合わせをさらに含む、請求項15〜18のいずれか一項に記載の組成物。

請求項20

1つ以上のアジュバントをさらに含む、請求項15〜19のいずれか一項に記載の組成物。

請求項21

1つ以上のアジュバントが、ミョウバンアルミニウム塩リン酸アルミニウム水酸化アルミニウムアルミニウムシリカリン酸カルシウム不完全フロイントアジュバント、QS21、MPL−A、RIBIDETOXTM、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項20に記載の組成物。

請求項22

顆粒球単球コロニー刺激因子GM−CSF)をさらに含む、請求項15〜21のいずれか一項に記載の組成物。

請求項23

リポソームをさらに含む、請求項15〜22のいずれか一項に記載の組成物。

請求項24

対象においてMUC1を発現する癌に対する免疫応答を増強する方法であって、請求項15〜23のいずれか一項に記載の組成物の治療上有効量を対象へ投与する工程を含み、該対象の免疫応答が増強される、方法。

請求項25

対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法であって:(a)対象からリンパ球を得る工程、(b)請求項15〜23のいずれか一項に記載の組成物で該リンパ球を刺激して、ex vivoにて細胞傷害性Tリンパ球を産生する工程、及び(c)該細胞傷害性Tリンパ球を対象へ投与する工程、を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される、方法。

請求項26

対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法であって:(a)対象から樹状細胞を得る工程、(b)請求項15〜23のいずれか一項に記載の組成物で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、及び(c)処理した樹状細胞を対象へ投与する工程、を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される、方法。

請求項27

対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法であって:(a)対象から末梢血単核細胞(PBMCs)を得る工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)請求項15〜23のいずれか一項に記載の組成物で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程;及び(e)活性化したPBMCsを対象へ投与する工程、を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される、方法。

請求項28

対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法であって:(a)対象から末梢血単核細胞(PBMCs)を得る工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)請求項15〜23のいずれか一項に記載の組成物で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程;(e)活性化したPBMCsからTリンパ球をex vivoで単離する工程、及び(e)単離したTリンパ球を対象へ投与する工程を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される、方法。

請求項29

対象においてMUC1を発現する癌を抑制するために、請求項15〜23のいずれか一項に記載の組成物でin vitroにて刺激された、養子移入されるT細胞の使用。

技術分野

0001

関連出願の相互参照
本特許出願は、2012年1月3日出願の米国仮特許出願第61/582,723号(参照により組み込まれる)の利益を主張する。

0002

電子出願された物件の参照による組み込み
本願明細書と同時提出され、かつ、以下の通り識別されるコンピューター可読のヌクレオチドアミノ酸配列表が、本明細書中、参照によりその全体が組み込まれる:2013年1月2日付ファイル名「711788_ST25.txt」、7,367バイトのASCIIテキストファイル1件。

背景技術

0003

MUC1(CD227)は、小さなC末端サブユニット(MUC1−C)に共有結合する大きなN末端サブユニット(MUC1−N)のヘテロ二量体から構成されるI型膜糖タンパク質である。MUC1−Nは、完全に細胞外であり、高度にグリコシル化されており、20アミノ酸の可変タンデムリピート(VNTR)ドメインからほとんど全てが構成される。MUC1−Cは短い細胞外ドメイン膜貫通ドメイン、及び細胞質テール又はドメイン(MUC1−CD)からなる。

0004

MUC1は、通常、上皮細胞頂端表面上、及び造血細胞活性化T細胞などの非上皮細胞の小さなサブセット中に発現する。健康な上皮におけるその主な機能は、潤滑、並びに化学薬品及び微生物因子に対する物理的バリアを提供することである。他の細胞タイプにおける、その生理役割は明確ではない。

0005

多くのヒト癌腫卵巣膵臓大腸及び前立腺など)及び血液系腫瘍多発性骨髄腫及びいくつかのB細胞非ホジキンリンパ腫など)は、MUC1を異常に過剰発現するということが証明されている。正常な組織におけるそのクラスター化した発現と対照的に、MUC1は腫瘍細胞の全表面に均一に分散する。さらに、MUC1は、一般的に腫瘍においてグリコシル化が不十分であり、タンパク質コア新規かつ潜在的な抗原エピトープ免疫システムにさらしている。MUC1の発現及び分泌は、予後不良及び高転移能とも関連している。

0006

MUC1は腫瘍関連抗原であるため、MUC1を治療用癌ワクチンターゲット候補として利用する多くの計画が、癌ワクチンに対するターゲット候補としてのMUC1の利用に対して最近の20年の間評価されている。臨床試験では、タンパク質ペプチドアジュバント担体、ex vivoで培養された樹状細胞(DCs)、可溶化液、樹状細胞融合、リポソームポックスウイルスアデノウイルス酵母、及び樹状細胞をターゲットとするC型レクチン試験されている。

0007

免疫療法に対するターゲットとしてMUC1を使用するほとんどの臨床試験は、長期完全寛解に達することができなかった、進行した転移性疾患を有する被験者登録する。この結果における1つの要因は、これらの臨床試験の大多数は、MUC1に対する体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を高めるために、VNTRドメインに焦点をあてていることだといえる。腫瘍進行の間に血液中に流される、VNTRドメインを含むN末端サブユニットの相当量は、表面上にMUC1を発現する腫瘍細胞に対する免疫応答欠如を部分的に説明できる。

0008

MUC1−Cは、MUC1のC末端サブユニットである。MUC1の切断後、大きな細胞外サブユニットにも関わらず、MUC1−Cは、シングルパス(28アミノ酸)膜貫通ドメイン(TD)によって、細胞膜に固定されたままである。MUC1ではなく、MUC1−Cが、おそらくN末端サブユニットの切断により、いくつかの種々の腫瘍細胞株及び癌標本でタンパク質の優勢な形態であることが明らかになっている。さらに、N末端サブユニットが1又は2点でクラスター化され、健康な上皮におけるMUC1の正常な挙動想起させるのに対して、MUC1−Cは、腫瘍細胞の表面全体にわたって均一に分布する。重要なことに、いくつかの組織標本では、MUC1−Cの存在に対してポジティブに染色されるが、N末端サブユニットに対してはネガティブとなり得ることが実証されている。

0009

最近の数年間において、癌遺伝子としてのMUC1−Cの役割に関する証拠が急速に蓄積されている。MUC1−CDの72アミノ酸残基は、いくつかのミトコンドリア細胞質、細胞膜、及び核成分との相互作用を伴う、細胞シグナリング機能の注目に値する範囲と関連する。MUC1−CDは、ζ鎖関連70−kDプロテインキナーゼ(ZAP−70)、プロテインキナーゼCのδアイソフォームPKCδ)、グリコーゲン合成酵素キナーゼ3β(GSK−3β)、並びにチロシンキナーゼc−Src及びLckなどのいくつかのキナーゼに対するターゲットである。MUC1−CDのリン酸化は、線維芽細胞増殖因子レセプター3、血小板由来増殖因子レセプター、及びErbBファミリーメンバーを含むいくつかの細胞表面増殖因子レセプターの活性化に反応して起こるのかもしれない。リン酸化に加え、MUC1−CDは、β−カテニンエストロゲンレセプター−α、及びヒートショックプロテインなどのいくつかのタンパク質及びレセプターと直接結合できる。MUC1−Cトランスフェクションは、増殖率の増加、足場非依存性細胞増殖、及び化学療法剤に対する耐性など、予め全長のMUC1タンパク質に起因する形質転換誘導及び発癌活性を起こすのに十分である。c−Srcにより活性化されたMUC1−Cシグナリングは、癌細胞運動性浸潤転移刺激するE−カドヘリン接着結合及びインテグリン接着斑の両方の崩壊に関わっており、上皮間葉転移におけるMUC1−Cの潜在的役割を示唆する。特異的細胞内MUC1ペプチドが、癌の進行を抑制できるということも証明されている。最後に、MUC1−Cはヒト多能性幹細胞の増殖を媒介し、その発現は、未分化細胞を同定及び単離するためのマーカーとして利用できるということが示されている。

発明が解決しようとする課題

0010

MUC1−Cの新たな特異的細胞傷害性Tリンパ球(CTLエピトープ及びエンハンサーアゴニストペプチドの同定が望まれている。

課題を解決するための手段

0011

本発明は、配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号10、配列番号13、配列番号14、配列番号29、及び配列番号32からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたペプチドを提供する。本発明は、20以下のアミノ酸残基を有し、配列番号3、配列番号6、配列番号9、配列番号11、配列番号15、配列番号26、又は配列番号30を含む、単離されたペプチドも提供する。

0012

他の側面において、本発明は、ペプチドをコードする核酸と、核酸を含むベクターと、ペプチド、核酸又はベクターを含む細胞と、それらの組成物とを提供する。

0013

本発明は、宿主においてMUC1を発現する癌に対する免疫応答の増強方法であって、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物の治療上有効量を宿主に投与する工程を含み、該宿主の免疫応答が増強される方法も提供する。

0014

本発明はさらに、対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法であって、(a)対象からリンパ球を得る(単離する)工程、(b)宿主に対し、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該リンパ球を刺激して、ex vivoにて細胞傷害性Tリンパ球を産生する工程、及び(c)該細胞傷害性Tリンパ球を対象へ投与する工程を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される方法を提供する。

0015

本発明は、対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法であって、(a)対象から樹状細胞を得る(単離する)工程、(b)ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、及び(c)処理した樹状細胞を対象へ投与する工程を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される方法を提供する。

0016

さらに、本発明は、対象においてMUC1を発現する癌の抑制であって、(a)癌に罹患した対象から末梢血単核細胞(PBMCs)を得る工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程、及び(e)活性化したPBMCsを対象へ投与する工程を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される、癌の抑制を提供する。

0017

本発明はさらに、対象においてMUC1を発現する癌の抑制であって、(a)癌に罹患した対象から末梢血単核細胞(PBMCs)を得る工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程、(e)活性化したPBMCsからTリンパ球をex vivoで単離する工程、及び(e)単離したTリンパ球を対象へ投与する工程を含み、該対象においてMUC1を発現する癌が抑制される、癌の抑制を提供する。

0018

本発明は、対象においてMUC1を発現する癌を抑制するために、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞を含む組成物でin vitroにて刺激された、養子移入されるT細胞の使用を提供する。

図面の簡単な説明

0019

図1A〜Cは、ネイティブペプチド及びアゴニストペプチドに特異的なT細胞株によるIFN−γの産生を示すグラフである。IFN−γ(pg/mL)はY軸に示され、(A)P1172又はP1172(1Y);(B)P1177又はP1177(10V);並びに(C)P1240及びP1240(1Y)のそれぞれのペプチド濃度(pg/mL)はX軸に示されている。
図1A〜Cは、ネイティブペプチド及びアゴニストペプチドに特異的なT細胞株によるIFN−γの産生を示すグラフである。IFN−γ(pg/mL)はY軸に示され、(A)P1172又はP1172(1Y);(B)P1177又はP1177(10V);並びに(C)P1240及びP1240(1Y)のそれぞれのペプチド濃度(pg/mL)はX軸に示されている。
図1A〜Cは、ネイティブペプチド及びアゴニストペプチドに特異的なT細胞株によるIFN−γの産生を示すグラフである。IFN−γ(pg/mL)はY軸に示され、(A)P1172又はP1172(1Y);(B)P1177又はP1177(10V);並びに(C)P1240及びP1240(1Y)のそれぞれのペプチド濃度(pg/mL)はX軸に示されている。
図2A〜Bは、T細胞株T−P432−3F10K(A)及びT−P483−2L3F(B)を用いた、HLA−A3+,MUC1+ターゲット細胞のペプチド特異的なT細胞株溶解を示すグラフである。それぞれの図において、溶解(%)はY軸上、及びX軸上には(a)T細胞株のみ、(b)T細胞株+K562−A3、及び(c)T細胞株+K562−A3+対応するA3ペプチドである。
図3は、ペプチド/HLA−A2複合体(それぞれVNTR−1、VNTR−2、VNTR−3、VNTR−4及びVNTR−5ペプチド)の安定性を示すグラフである。残存する複合体の割合はY軸上、及び時間は時(hours)としてX軸上に示す。

0020

本発明は、癌のワクチン予防又は治療において利用可能である、ヒト腫瘍関連抗原(TAA)ムチン1(MUC1)由来ヒト細胞溶解性Tリンパ球(CTL)エピトープ及びそのアナログを含むペプチドを提供する。特に、本発明は、MUC1−C由来ヒトCTLエピトープ及びそのアナログを含むペプチドを提供する。

0021

第一の実施形態において、本発明のペプチドは、XLAIVYLIAL(配列番号3)のアミノ酸配列(式中、Xは、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはアラニン又はチロシンである)を含むか、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる。配列番号3のXがアラニンの場合、該ペプチドは、MUC1の1172〜1181位のCTLエピトープ(配列番号1)に一致する。配列番号3のXがチロシンの場合、該ペプチドは、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号2)に一致する。

0022

第二の実施形態において、本発明のペプチドは、YLIALAVCQX(配列番号6)のアミノ酸配列(式中、Xは、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはシステイン又はバリンである)を含むか、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる。配列番号6のXがシステインの場合、該ペプチドは、MUC1の1177〜1186位のCTLエピトープ(配列番号4)に一致する。配列番号6のXがバリンの場合、該ペプチドは、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号5)に一致する。

0023

第三の実施形態において、本発明のペプチドは、XLSYTNPAV(配列番号9)のアミノ酸配列(式中、Xは、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはセリン又はチロシンである)を含むか、本質的に該アミノ酸配列からなるか、又は該アミノ酸配列からなる。配列番号9のXがセリンの場合、該ペプチドは、MUC1の1240〜1248位のCTLエピトープ(配列番号7)に一致する。配列番号9のXがチロシンの場合、該ペプチドは、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号8)に一致する。

0024

第四の実施形態において、本発明のペプチドは、ALX1IVYLIAX2(配列番号11)(式中、X1及びX2は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、X1はアラニン又はフェニルアラニンであり、X2はロイシン又はリシンである)を含む。配列番号11のX1がアラニンであり、かつ配列番号11のX2がロイシンの場合、該ペプチドは、MUC1の1172〜1181位のCTLエピトープ(配列番号1)に一致する。配列番号11のX1がフェニルアラニンであり、かつ配列番号11のX2がリシンの場合、該ペプチドは、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号10)に一致する。

0025

第五の実施形態において、本発明のペプチドは、SX1X2RSPYEK(配列番号15)(式中、X1及びX2は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、X1はトレオニン又はロイシンであり、X2はアスパラギン酸、チロシン又はフェニルアラニンである)を含む。配列番号15のX1がトレオニンであり、かつ配列番号15のX2がアスパラギン酸の場合、該ペプチドは、MUC1の1223〜1231位のCTLエピトープ(配列番号12)に一致する。配列番号15のX1がロイシンであり、かつ配列番号15のX2がチロシンの場合、該ペプチドは、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号13)に一致する。配列番号15のX1がロイシンであり、かつ配列番号15のX2がフェニルアラニンの場合、該ペプチドは、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号14)に一致する。

0026

第六の実施形態において、本発明のペプチドは、X1X2APPAHX3V(配列番号26)(式中、X1及びX2は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、X1はセリン又はチロシンであり、X2はトレオニン又はリシンであり、かつX3はアスパラギン又はグリシンである)を含む。配列番号26のX1、X2及びX3が、それぞれセリン、トレオニン及びアスパラギンの場合、該ペプチドは、MUC1の可変数タンデムリピート(VNTR)領域のCTLエピトープ(配列番号27)に一致する。配列番号26のX1、X2及びX3が、それぞれセリン、トレオニン及びグリシンの場合、該ペプチドは、MUC1のVNTR領域のCTLエピトープ(配列番号28)に一致する。配列番号26のX1、X2及びX3が、それぞれチロシン、リシン及びグリシンの場合、該ペプチドは、MUC1のVNTR領域のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号29)に一致する。

0027

第七の実施形態において、本発明のペプチドは、X1X2DTRPAPX3(配列番号30)(式中、X1及びX2は、任意のアミノ酸であり得るが、好ましくは、X1はアラニン又はチロシンであり、X2はプロリン又はロイシンであり、かつX3はグリシン又はバリンである)を含む。配列番号30のX1、X2及びX3が、それぞれアラニン、プロリン及びグリシンの場合、該ペプチドは、MUC1のVNTR領域のCTLエピトープ(配列番号31)に一致する。配列番号30のX1、X2及びX3が、それぞれチロシン、ロイシン及びバリンの場合、該ペプチドは、MUC1のVNTR領域のエンハンサーアゴニストエピトープ(配列番号32)に一致する。

0028

本発明のペプチドは、配列番号1〜15及び26〜32のアミノ酸配列の1つ、並びに1つ以上の隣接残基を含むことができる。隣接残基は、ペプチドの免疫応答(例、CTL活性)を誘導する能力阻害しないように選択されるべきである。そのような残基の選択のための指針は、MUC1自身と関連する配列によって提供される。例えば、ペプチドを使用するために、MUC1タンパク質(好ましくはヒトMUC1)の対応する位置の残基と同一である、又は類似する特性を持つ残基を選択できる。

0029

ペプチドがネイティブMUC1配列に存在するCTLエピトープ(例、配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28及び配列番号31)を含む場合、ペプチドは望ましくは、20以下(例、19以下、18以下、17以下、16以下、15以下、14以下、13以下、12以下、11以下又は10以下)のアミノ酸残基を有する。一実施形態において、追加のアミノ酸残基は、存在する場合には、MUC1(例、MUC1−N、MUC1−C又はVNTR領域)由来である。この点において、本発明のペプチドは、MUC1(例、MUC1−N、MUC1−C又はVNTR領域)タンパク質の20以下の連続するアミノ酸を含む、MUC1(例、MUC1−N、MUC1−C又はVNTR領域)タンパク質のフラグメントであり得、ここで、該ペプチドは配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28、及び配列番号31のアミノ酸配列を含む。MUC1タンパク質の追加のアミノ酸残基は、配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28、及び配列番号31のアミノ酸配列のいずれかの末端又は両端に位置し得る。

0030

特に、本発明のペプチドは、配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28、及び配列番号31のアミノ酸配列のC末端に、11以下(例、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、又は0)のアミノ酸残基を含み得、かつ/又は配列番号1、配列番号4、配列番号7、配列番号12、配列番号27、配列番号28、及び配列番号31のアミノ酸配列のN末端に、11以下(例、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下、1以下、又は0)のアミノ酸残基を含み得、ここで、本発明のペプチドは合計で20以下のアミノ酸残基を有する。

0031

ペプチドが、MUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(例、配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号10、配列番号13、配列番号14、配列番号29又は配列番号32)を含む場合、ペプチドは任意の適切な長さであり得る。一実施形態において、ペプチドは20以下(例、19以下、18以下、17以下、16以下、15以下、14以下、13以下、12以下、11以下又は10以下)のアミノ酸残基を有する。追加のアミノ酸残基は、存在する場合には、好ましくはMUC1(例、MUC1−C)タンパク質由来、又は本明細書に記載のMUC1の配列に基づく。追加のアミノ酸残基は、配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号10、配列番号13、配列番号14、配列番号29又は配列番号32のアミノ酸配列のいずれかの末端又は両端に位置し得る。

0032

他の実施形態において、本発明は、1つ以上の対応するアミノ酸残基が、1つ以上のMUC1のエンハンサーアゴニストエピトープ(例、配列番号2、配列番号5、配列番号8、配列番号10、配列番号13、配列番号14、配列番号29又は配列番号32)で置き換えられている、MUC1アミノ酸配列又はそのフラグメントを含むポリペプチドを提供する。例えば、ポリペプチドは、1172位のアラニンがチロシンで置き換えられている(配列番号2のエンハンサーアゴニストエピトープに相当)、完全長のMUC1アミノ酸配列又はそのフラグメントを含み得る。

0033

ペプチドは、任意の方法、例えば、ペプチドを合成することにより、又は細胞内で適切なアミノ酸配列をコードする核酸を発現させ、細胞よりペプチドを回収することなどによって、調製され得る。そのような方法の組み合わせも利用できる。ペプチドのde novo合成方法及び組み換え的にペプチドを製造する方法は当分野で公知である(例、Chan et al.,Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2005;Peptide and Protein Drug Analysis,ed.Reid,R.,Marcel Dekker,Inc.,2000;Epitope Mapping,ed.Westwood et al.,Oxford University Press,Oxford,United Kingdom,2000;Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY 2001;and Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994参照)。

0034

本発明は、ペプチドをコードする核酸も提供する。核酸はDNA又はRNAを含むことができ、一本鎖又は二本鎖であり得る。さらに、核酸は、ヌクレオチドアナログ又は誘導体(例、イノシン又はホスホロチオエートヌクレオチドなど)を含むことができる。核酸はペプチドを単独で、又は融合タンパク質の一部としてコードできる。ペプチドをコードする核酸は、核酸と、細胞への核酸のデリバリー及び/又は細胞での核酸の発現を可能にする要素とを含む構築物の一部として提供され得る。そのような要素としては、例えば、発現ベクタープロモーター、並びに転写及び/又は翻訳配列が挙げられる。適したベクター、プロモーター、転写/翻訳配列、及び他の要素、並びにかかる核酸及び構築物の調製方法は、当分野で公知である(例、Sambrook et al.,上記参照;Ausubel et al.,上記参照)。

0035

本発明はさらに、核酸を含むベクターを提供する。適したベクターの例として、プラスミド(例、DNAプラスミド)、酵母(例、サッカロマイセス)、及びウイルスベクター、例えば、ポックスウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスヘルペスウイルスポリオウイルスアルファウイルスバキュロウイルス(baculorvirus)、及びシンドビスウイルスなどが挙げられる。ベクターがプラスミド(例、DNAプラスミド)の場合、該プラスミドはキトサン複合化され得る。好ましくは、ベクターは、オルソポックスアビポックス鶏痘、ラクーンポックス、家兎痘、カプリポクス(例、羊痘)、レポリポックス、及びスイポックス(例、豚痘)からなる群から選択されるポックスウイルスである。アビポックスウイルスの好ましい例として、鶏痘、鳩、及びカナリア痘、例えばALVACが挙げられる。オルソポックスウイルスの好ましい例として、ワクシニア改変ワクシニアアンカラ(MVA)、Wyeth、NYVAC、TROYVAC、Dry−Vax、POXVAC−TC(Schering−Plough Corporation)、及びそれらの誘導体が挙げられる。例えば、Wyeth株の誘導体はこれに限定されないが、機能的K1L遺伝子を欠いた誘導体を含む。

0036

ベクターが宿主(例、ヒト)への投与のためである場合、ベクター(例、ポックスウイルス)は好ましくはターゲット細胞において低い複製効率を有する(例、細胞あたり約1子孫以下、又は、より好ましくは、細胞あたり0.1子孫以下)。複製効率は、ターゲット細胞の感染後のウイルス力価の決定によって、容易に経験的に決定され得る。

0037

ペプチドをコードする核酸に加えて、ベクターは、1つ以上の免疫賦活制御分子顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GMCSF)、サイトカイン、又は免疫応答を増強し得る他の分子(例、前立腺特異抗原(PSA)及び癌胎児性抗原CEA)などの追加の腫瘍関連抗原、又はCEA−6Dなどのそれらの改変体)をコードする遺伝子も含むことができる。ペプチドをコードする核酸及び任意の他の外来性遺伝子は、好ましくは、結果として生じる組換えウイルスウイルス生存率に影響を及ぼさない、ベクター(例、ポックスウイルス)の部位又は領域(挿入領域)に挿入される。そのような領域は、組換えウイルスのウイルス生存率に重大な影響を及ぼすことなく、組換えの構成を許容する領域に対して、ウイルスDNAのセグメントを試験することにより、容易に同定され得る。

0038

チミジンキナーゼ(TK)遺伝子は、容易に利用でき、多くのウイルスに存在する挿入領域である。特に、TK遺伝子は、全ての検査されたポックスウイルスゲノムにおいて見つけられている。さらなる適した挿入部位は、国際特許出願公開公報WO 2005/048957に記載されている。例えば、鶏痘において、挿入領域はBamHI Jフラグメント、EcoRI−HindIIIフラグメント、BamHIフラグメント、EcoRV−HindIIIフラグメント、長い特有な配列(LUS)挿入部位(例、FPV006/FPV007及びFPV254/FPV255)、FP14挿入部位(FPV060/FPV061)、及び43K挿入部位(FPV107/FPV108)を含むが、これに限定されない。ワクシニアにおいて、挿入部位は44/45、49/50、及び124/125を含むが、これに限定されない。

0039

ベクターが、ペプチドをコードする核酸、及び/又は他の外来性遺伝子(例、1つ以上の免疫賦活/制御分子をコードするもの)を含む組換え鶏痘ウイルスの場合、ペプチドをコードする核酸は、1つの領域(例、FP14領域)に挿入されることができ、外来性遺伝子は他の領域(例、BamHIJ 領域)に挿入され得る。

0040

本発明のベクターは、適したプロモーター及び制御エレメント、例えば転写制御エレメント又はエンハンサーなどを含み得る。ベクターがポックスウイルスベクターの場合、ポックスウイルスプロモーターを利用でき、これにはワクシニア7.5Kプロモーター、ワクシニア30Kプロモーター、ワクシニア40Kプロモーター、ワクシニアI3プロモーター、合成初期後期(sE/L)プロモーター、7.5プロモーター、HHプロモーター、11Kプロモーター、及びPiプロモーターが含まれるが、これに限定されない。プロモーターは、典型的には構成的プロモーターであるものの、誘導性プロモーターも本発明のベクターにおいて利用され得る。そのような誘導可能なシステムは、遺伝子発現の制御を可能にする。

0041

ペプチド、ペプチドをコードする核酸、又はベクターを含む細胞も、本明細書において提供される。適した細胞は、原核細胞並びに真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、酵母、真菌、及びバクテリア大腸菌など)を含む。細胞は、研究又はペプチドの産生のために役立つようにin vitroでもよく、又はin vivoでも可能である。細胞は、ペプチドパルスされた抗原提示細胞でもあり得る。適した抗原提示細胞は、樹状細胞、Bリンパ球単球マクロファージなどを含むが、これに限定されない。

0042

一実施形態において、細胞は樹状細胞である。異なる成熟段階の樹状細胞は、細胞表面の発現マーカーに基づいて単離され得る。例えば、成熟樹状細胞は、提示のために新しいタンパク質を捉えることはほとんどできないが、増殖及び分化のために休止T細胞を刺激することはより上手くできる。従って、成熟樹状細胞は重要となり得る。成熟樹状細胞は、形態学におけるそれらの変化及び種々のマーカーの存在によって、同定され得る。そのようなマーカーは、B7.2、CD40、CD11及びMHCクラスIIなどの細胞表面マーカーを含むが、これに限定されない。あるいは、成熟炎症性サイトカインの産生の観察又は測定によって、同定され得る。

0043

樹状細胞は、典型的な細胞蛍光法、並びに細胞選別技術及び装置、例えば蛍光活性化セルソーター(FACS)などを使用して、集められ、解析され得る。成熟段階が異なる樹状細胞の細胞表面抗原に特異的な抗体は、商業的に利用可能である。

0044

ペプチド、核酸、ベクター又は細胞は単離され得る。用語「単離された」は、本明細書において使用される場合、生物学的環境(例、細胞、組織、培養培地体液など)から取り除かれた又は任意の程度に純度を上げられた(例、合成培地から単離された)、組成物若しくは化合物包含する。単離された組成物及び化合物は、従って、合成され又は天然で産生され得る。

0045

ペプチド、核酸、ベクター又は細胞は、ペプチド、核酸、ベクター又は細胞と、担体(例、医薬上又は生理学的に許容される担体)とを含む組成物(例、医薬組成物)として製剤化され得る。さらに、ペプチド、核酸、ベクター、細胞又は本発明の組成物は、本明細書に記載の方法において、単独で又は医薬製剤の一部として利用され得る。

0046

組成物(例、医薬組成物)は、2以上のペプチド、核酸、ベクター、若しくは細胞又は本発明の組成物を含むことができる。あるいは、又はさらに、組成物は1つ以上の他の医薬活性剤又は薬品を含むことができる。医薬組成物の利用に適してよい、そのような他の医薬活性剤又は薬品の例として、抗癌剤(例、化学療法剤)、抗生物質抗ウイルス薬抗真菌薬シクロフォスファミド、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適した抗癌剤は、限定されないが、アルキル化剤ナイトロジェンマスタード葉酸拮抗薬プリン拮抗薬ピリミジン代謝拮抗物質紡錘体阻害剤トポイソメラーゼ阻害剤アポトーシス誘導剤血管新生抑制剤ポドフィロトキシンニトロソウレアシスプラチンカルボプラチンインターフェロンアスパラギナーゼタモキシフェンロイプロリドフルタミドメゲストロールマイトマイシンブレオマイシンドキソルビシンイリノテカンタキソールゲルダナマイシン(例、17−AAG)、及び当分野で公知の種々の抗癌ペプチド並びに抗体を含む。

0047

担体は、慣習的に使用されるもののいずれでもあり得、溶解度、及び活性化合物との反応性の欠如など、生理化学的な考慮点によって、及び投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載の医薬上許容される担体、例えば、賦形剤、アジュバント、医薬品添加物、及び希釈剤は、当業者に周知であり、容易に公衆に利用可能である。医薬上許容される担体は、活性剤に対し化学的に不活性であるもの、及び使用条件下、有害な副作用又は毒性を有さないものであることが好ましい。

0048

担体の選択は、特定のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又は本発明のそれらの組成物、及び使用される他の活性剤又は医薬品、並びにペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部は決定されるだろう。

0049

組成物は、さらに又は代わりに、1つ以上の免疫賦活/制御分子を含むことができる。任意の適した免疫賦活/制御分子を使用でき、例えば、インターロイキンIL)−2、IL−4、IL−6、IL−12、インターフェロン(IFN)−γ、腫瘍壊死因子(TNF)−α、B7.1、B7.2、ICAM−1、LFA−3、CD70、RANTES、G−CSF、OX−40L、41BBL、抗CTLA−4、及びそれらの組み合わせなどが使用できる。好ましくは、組成物は、B7.1、ICAM−1、及びLFA−3(TRICOMともいう)の組み合わせを含む。1つ以上の免疫賦活/制御分子は、1つ以上の免疫賦活/制御分子をコードする核酸を含むベクター(例、ポックスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクター)の形で投与され得る。例えば、1つ以上の免疫賦活/制御分子(例、IL−12)は、キトサンあり又はなしでDNAプラスミドの形で投与され得る。あるいは、1つ以上の免疫賦活/制御分子は、キトサンと混合したタンパク質(例、組換えIL−12)など、タンパク質(例、組換えタンパク質)として投与され得る。

0050

本発明の一実施形態において、組成物は、本発明のペプチドをコードする核酸を含む第一の組換えベクター、並びにB7.1、ICAM−1及びLFA−3をコードする核酸を含む第二の組換えベクターを含む。他の実施形態において、本発明のペプチドをコードする核酸、並びにB7.1、ICAM−1、及びLFA−3をコードする核酸は、同じ組換えベクターにある。第一及び/又は第二のベクターは、他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体(例、CEA−6D)、又はそれらのエピトープをさらに含むことができる。

0051

本発明は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物、及び任意で、免疫賦活/制御分子、例えばB7−1、ICAM−1及びLFA−3などで樹状細胞を形質導入する方法を提供する。本発明の一局面において、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物で宿主に形質導入された樹状細胞は、細胞傷害性T細胞応答の活性化などの免疫応答を起こす。

0052

本発明は、MUC1腫瘍にかかった又はかかりやすい患者治療方法、及び/又は、MUC1を発現する癌に対する免疫応答の増強方法、及び/又は、MUC1を発現する癌の抑制方法を提供する。第一の実施形態において、本発明の方法は、1つ以上のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の治療上有効量を対象へ投与する工程を含む。本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、MUC1を発現する癌の進行を妨げるために、特に他の個体よりもそのような癌になるリスクの高い個体において、又はMUC1を発現する癌に苦しめられている患者を治療するために使用され得る。本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意のステージにあるMUC1を発現する癌の対象を治療するために使用され得る。

0053

第二の実施形態において、本発明の方法は、対象から樹状細胞を得る(単離により)工程、治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の1つ以上で該樹状細胞を処理する工程、及び処理した樹状細胞を対象へ投与する工程を含む。

0054

第三の実施形態において、本発明の方法は、(a)対象から抹消血単核細胞(PBMCs)を得る(単離する)工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の1つ以上で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程、及び(e)活性化したPBMCsを対象へ投与する工程を含む。

0055

第四の実施形態において、本発明の方法は、(a)対象からPBMCsを得る(単離する)工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の1つ以上で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程、及び(e)活性化したPBMCsを対象へ投与する工程を含む。

0056

第五の実施形態において、本発明の方法は、(a)対象からPBMCsを得る(単離する)工程、(b)該PBMCsから樹状細胞を単離する工程、(c)治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の1つ以上で該樹状細胞をex vivoにて処理する工程、(d)処理した樹状細胞で該PBMCsをex vivoにて活性化する工程、(e)活性化したPBMCsからTリンパ球をex vivoで単離する工程、及び(e)単離したTリンパ球を対象へ投与する工程を含む、該対象においてMUC1を発現する癌を抑制する方法を含む。

0057

本発明は、対象においてMUC1を発現する癌を抑制するために、治療上有効量のペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の1つ以上でin vitroにて刺激された、養子移入されるT細胞の使用も提供する。

0058

MUC1を発現する癌は、MUC1を発現する任意の癌であり得、これにはヒト癌腫(例えば卵巣、胸、膵臓、結腸直腸甲状腺、頭頸部及び前立腺)並びに血液系腫瘍(多発性骨髄腫及びいくつかのB細胞非ホジキンリンパ腫)が含まれるが、これに限定されない。

0059

ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、任意の方法によって宿主へ投与され得る。例えば、ペプチド、核酸、又は本明細書に記載の、核酸のデリバリー及び発現を可能にする構築物の一部としての核酸を含む組成物と細胞を接触させることによってなど、種々の技術のいずれかによって、ペプチド又はペプチドをコードする核酸(例、ベクターとして)は細胞(例、宿主における)内に導入され得る。細胞内で核酸を導入及び発現するための具体的なプロトコルは、当分野で公知である(参照、例、Sambrook et al.(eds.),上記参照;Ausubel et al.,上記参照)。

0060

ペプチド、核酸、ベクター、細胞、及び組成物を宿主(対象)に投与するのに適した方法は、当分野で公知である。宿主(対象)は、哺乳動物(例、マウスラットハムスター又はモルモットなどの齧歯動物ウサギネコイヌブタヤギウシウマ霊長類又はヒト)などの任意の適した宿主であり得る。

0061

例えば、ペプチド、核酸又はベクター(例、組換えポックスウイルス)は、ex vivoで腫瘍細胞をペプチド、核酸、若しくはベクターにさらすことにより、又はペプチド、核酸、若しくはベクターを宿主へ注入することにより、宿主へ投与され得る。ペプチド、核酸、ベクター(例、組換えポックスウイルス)又はベクターの組み合わせ、細胞、及び組成物は、癌病変又は腫瘍への直接注入により、又は局所適用(例、医薬上許容される担体とともに)により、直接投与(例、局所投与)され得る。

0062

ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、単独で、又はアジュバントと組み合わせて、リポソーム内への取り込み(例、米国特許第5,643,599号、5,464,630号、5,059,421号、及び4,885,172号に記載)、サイトカインとともに、生物学的応答修飾物質(例、インターフェロン、インターロイキン−2(IL−2)、及びコロニー刺激因子(CSF、GM−CSF、及びG−CSF)とともに、又は免疫応答を増強することが公知の、当分野の他の試薬とともに投与され得る。

0063

適したアジュバントの例として、ミョウバンアルミニウム塩リン酸アルミニウム水酸化アルミニウムアルミニウムシリカ(aluminum silica)、リン酸カルシウム不完全フロイントアジュバント、QS21、MLP−A、及びRIBI DETOXTMが挙げられる。

0064

本発明での使用に対して特に好ましいアジュバントは、サイトカインGM−CSFである。GM−CSFは、樹状細胞による抗原プロセシング及び提示を増強するため、効果的なワクチンアジュバントとして示されている。実験研究及び臨床試験によって、組換えGM−CSFは、種々の免疫原を対象とした宿主免疫を増強できるということが示唆されている。

0065

GM−CSFは、ウイルスベクター(例、ポックスウイルスベクター)を用いて、又は医薬製剤において単離されたタンパク質として、投与され得る。GM−CSFはペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の最初の投与前、投与中又は投与後に、宿主へ投与され、宿主の抗原特異的免疫応答を増強できる。例えば、組換えGM−CSFタンパク質は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物でのワクチン接種の各日に宿主へ投与され、次の各3日間(すなわち合計4日間)投与され得る。任意の適した用量のGM−CSFも使用できる。例えば、1日当たり50〜500μg(例、100μg、200μg、300μg、400μg、及びそれらの範囲)の組換えGM−CSFを投与できる。GM−CSFは、任意の適切な方法(例、皮下投与)により投与でき、好ましくは、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物での宿主のワクチン接種部位又はその近くに投与される。

0066

一実施形態において、本発明のペプチドは、ヘルパーペプチド又は大きな担体分子に結合させて、ペプチドの免疫原性を増強できる。これらの分子は、インフルエンザペプチド、破傷風トキソイド、破傷風トキソイドCD4エピトープ、シュードモナス外毒素A、ポリLリジン、脂質尾部小胞体ERシグナル配列などを含むが、これに限定されない。

0067

本発明のペプチドは、当分野で認められた方法を用いて、免疫グロブリン分子と結合され得る。該免疫グロブリン分子は、腫瘍細胞に存在するが通常の細胞には存在しない又はごく少量しか存在しない表面レセプターに特異的であり得る。該免疫グロブリンは、特定の組織(例、胸、卵巣、結腸又は前立腺組織)に特異的であり得る。そのようなペプチド−免疫グロブリン結合体は、特定の組織及び/又は細胞へのペプチドのターゲッティングを許容する。

0068

ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、MUC1特異的免疫応答、好ましくは細胞性免疫応答を生じるのに効果的な量で、宿主(例、ヒトなどの哺乳動物)へ投与される。免疫原としてのペプチド、核酸、ベクター又は細胞の有効性は、当分野で公知のin vivo又はin vitroパラメーターによって決定されてもよい。これらのパラメーターは、抗原特異的な細胞毒性試験、MUC1又はMUC1エピトープを発現する腫瘍の退縮、MUC1又はMUC1エピトープを発現する癌細胞の抑制、サイトカインの産生などを含むが、これに限定されない。

0069

任意の適した用量のペプチド、核酸、ベクター、細胞又はそれらの組成物は、宿主に投与され得る。適切な用量は、宿主の年齢、体重、身長性別全身状態既往歴疾患進行、及び全身腫瘍組織量などの因子に応じて変化し、臨床医によって決定され得る。例えば、ペプチドは、ワクチン接種あたり約0.05mgから約10mgまで(例、0.1mg、0.5mg、1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、及びそれらの範囲)の用量で宿主(例、ヒトなどの哺乳動物)に投与されることが可能であり、好ましくはワクチン接種あたり約0.1mgから約5mgである。種々の用量(例、1、2、3、4、5、6又はそれ以上)が、提供(例、数週間又は数か月にわたって)され得る。一実施形態において、用量は3か月の間毎月提供される。

0070

ベクターがウイルスベクターの場合、適した用量は、約1×105から約1×1012(例、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、及びそれらの範囲)プラーク形成単位(pfus)を含むことができるものの、より低用量又はより高用量を宿主に投与できる。例えば、約2×108pfusを投与(例、約0.5mL量で投与)できる。

0071

本発明の細胞(例、細胞傷害性T細胞)は、注入あたり、約1×105細胞と2×1011細胞との間(例、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、及びそれらの範囲)の用量で宿主に投与され得る。細胞は、例えば、1〜3(例、2)回の注入により投与され得る。細胞の投与に加え、宿主は、インターロイキン2(IL−2)などの生物学的応答修飾物質を投与され得る。投与される細胞が細胞傷害性T細胞の場合、in vivoのT細胞の数をさらに増やすように細胞傷害性T細胞に刺激を与えるために、細胞傷害性T細胞の投与後、ペプチド、核酸、ベクター、又はそれらの組成物が投与され得る。

0072

投与される細胞が樹状細胞の場合、対象に投与される樹状細胞の量は、対象の状態によって変化し、実務者により全ての適切な要因を考慮して決められるべきである。好ましくは、約1×106から約1×1012(例、約1×107、約1×108、約1×109、約1×1010、又は約1×1011であって、本明細書に記載の細胞数の、いずれかの範囲を含む)の樹状細胞がヒト成人に利用される。これらの量は、対象の年齢、体重、大きさ、体調、性別、治療されるべき腫瘍の種類、投与経路、治療は局所又は全身かどうか、及び他の要因によって変わる。当業者は、対象の特殊な状況及びニーズに合わせるために、適した投与量及び投与スケジュールを容易に導き出せるべきである。

0073

本発明は、有効量の本発明のペプチド、核酸、ベクター又は細胞を単独で、又は1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又はアジュバントと組み合わせて、又はリポソーム製剤で、リンパ球を刺激することにより、in vivo、ex vivo又はin vitroで、ペプチド特異的な細胞傷害性Tリンパ球を産生する方法を提供する。リンパ球は、例えば、末梢血腫瘍組織リンパ節、及び胸膜液又は腹水液のような滲出液など、任意の適したソース由来のリンパ球であり得る。

0074

MUC1ペプチド特異的細胞傷害性Tリンパ球は、MUC1に対して免疫反応性である。好ましくは、細胞傷害性Tリンパ球は、腫瘍細胞及び癌の発生を抑制し、MUC1又はそのエピトープを発現する腫瘍細胞の増殖を抑制するか、又は該細胞を死滅させる。細胞傷害性Tリンパ球は、抗原特異的であることに加えて、MHCクラスI拘束性であり得る。一実施形態において、細胞傷害性Tリンパ球は、MHCクラスIHLA−A2拘束性である。他の実施形態において、細胞傷害性Tリンパ球は、MHCクラスIHLA−A3拘束性である。細胞傷害性Tリンパ球は、好ましくはCD8+表現型を有する。

0075

一実施形態において、リンパ球は宿主から取り出され、ex vivoでペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物により刺激され、細胞傷害性Tリンパ球を産生する。細胞傷害性Tリンパ球は、癌に対する免疫応答を増強するために宿主に投与でき、それにより癌を抑制する。従って、本発明は、宿主の癌を抑制する方法であって、(a)リンパ球を得る工程(例、宿主より)、(b)ペプチド、核酸、ベクター、細胞又はそれらの組成物で該リンパ球を刺激して、細胞傷害性Tリンパ球を産生する工程、及び(c)該細胞傷害性Tリンパ球を宿主へ投与する工程を含み、癌が抑制される方法を提供する。

0076

他の実施形態において、宿主内のリンパ球は、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物が宿主へ投与されることにより刺激され、細胞傷害性Tリンパ球を産生し、かかる細胞傷害性Tリンパ球は癌への免疫応答を増強し、それによって癌を抑制する。

0077

本発明はプライム及びブーストのプロトコルを含む。特に、プロトコルは、本発明のペプチドと、任意選択で1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする1つ以上の組換ベクターを含む組成物での最初の「プライム」と、それに続いて、本発明のペプチド、又は本発明のペプチドと、任意選択で1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする1つ以上のポックスウイルスベクターを含む組成物での1回、又は好ましくは複数回の「ブースト」を含む。

0078

最初のプライミングワクチン接種は、1つ以上のベクターを含み得る。一実施形態において、単一のベクター(例、ポックスウイルスベクター)は、本発明のペプチド並びに1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープのデリバリーに利用される。他の実施形態において、2つ以上のベクター(例、ポックスウイルスベクター)は、プライミングワクチン接種を含み、これは一回の注射で同時に投与される。

0079

ブースティングワクチン接種も、1つ以上のベクター(例、ポックスウイルスベクター)を含み得る。一実施形態において、単一のベクターは、本発明のペプチド並びに1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープ(ブースティングワクチン接種のため)のデリバリーに利用される。他の実施形態において、2つ以上のベクターは、ブースティングワクチン接種を含み、これは一回の注射で同時に投与され得る。

0080

異なるベクター(例、ポックスウイルスベクター)は、異なる時間間隔での接種のために、異なるセットの治療用分子運ぶベクターを用いた、異種のプライム/ブーストプロトコルを提供するために使用できる。例えば、1つの異種のプライム/ブースト組み合わせにおいて、第一のオルソポックスベクター組成物をプライムに使用し、第二のアビポックスベクター組成物をブーストに使用する。

0081

ベクター(例、ポックスウイルスベクター)の投与スケジュールは典型的に、ブースティングベクターの頻回投与を伴う。ブースティングベクターは、任意の適した期間(例、2〜4週間毎)で1〜3回(例、1、2又は3回)、任意の適した期間の間(例、6〜12週間で合計少なくとも5から15回ブースティングワクチン接種)投与され得る。例えば、プライマリーワクチン接種は、組換えワクシニア又はMVAベクターを含み、それに続いて、複数回のブースターワクチン接種では、アビポックスベクター用いる。特定の実施形態において、宿主は、プライミングベクターで一回ワクチン接種を受けた後、2週間毎に6ブーストのブースティングベクター、その後4週間毎にブースティングベクター、そして疾病進行に応じた期間、ブースティングベクターを続ける。

0082

本発明はさらに、医薬上許容される担体中、少なくとも第一の組換えベクター(例、ポックスウイルスベクター)であって、そのゲノム又はその一部に本発明のペプチドをコードする核酸が組み込まれているものを有するキットを提供する。第一の組換えベクター(例、ポックスウイルスベクター)は、1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする1つ以上の核酸も含むことができる。第一の組換えベクターに加え、キットは、医薬上許容される担体中、1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープをコードする1つ以上の核酸を含む第二の組換えベクターを有し得る。キットはさらに、容器注射針、及びキットの使用方法についての説明書を提供する。他の実施形態において、キットはさらに、GM−CSFなどのアジュバント及び/又はキット構成物品とともに市販されているアジュバントを使用するための説明書を提供する。

0083

ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、及び腫瘍内を含む(これに限定されない)様々なルートによって、宿主に投与され得る。複数回投与される場合、宿主の1つ以上の部位に投与され得る。

0084

ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の投与は、「予防的」又は「治療的」であり得る。予防的に提供される場合、宿主の免疫システムが、宿主が発症しやすい腫瘍と戦うことを可能にするために、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は腫瘍形成に先立って提供される。例えば、遺伝性感受性を有する宿主は、そのような予防免疫接種で治療されることが好ましい患者群である。ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物の予防的な投与は、MUC1を発現する癌を予防し、改善し、又は遅らせる。治療的に提供される場合、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、MUC1を発現する癌の診断時又は診断後に提供される。

0085

宿主がすでにMUC1を発現する癌又は転移性癌と診断されている場合、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、化学療法又は放射線などの他の治療的処置と併せて投与され得る。

0086

好ましい実施形態において、ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物を宿主へ投与すると、結果として、本発明のペプチド並びに任意選択で1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープ(同時投与されたもの)を発現する宿主細胞がもたらされる。本発明のペプチド(すなわち、MUC1抗原)は、感染した宿主細胞の細胞表面に発現し得る。1つ以上の免疫賦活/制御分子及び/又は他の腫瘍関連抗原(例、CEA)、それらの改変体、並びにそれらの免疫原性エピトープは、細胞表面に発現することが可能であり、又は宿主細胞によって活発に分泌されてもよい。MUC1抗原及び免疫賦活/制御分子の両方が発現すると、特定のT細胞に必要なMHC拘束性ペプチドと、該T細胞に適切なシグナルが提供されて、抗原認識、並びに抗原特異的T細胞の増殖又はクローン性増殖に役立つ。総合的な結果は、免疫システムのアップレギュレーションである。好ましくは、免疫反応のアップレギュレーションは、癌(例、乳癌卵巣癌結腸癌肺癌甲状腺癌胃癌頭頸部癌又は前立腺癌)細胞の増殖を抑制する又は死滅させることができる、抗原特異的ヘルパーTリンパ球及び/又は細胞傷害性Tリンパ球の増加である。

0087

本発明の方法について、医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。非経口、皮下、静脈内、筋肉内、及び腹腔内投与のための以下の製剤が代表的であるが、これに制限されない。当業者ならば、本発明のペプチド、核酸、ベクター、細胞又は組成物のこれらの投与ルートが公知であり、2つ以上のルートを用いて特定の合成物を投与することができるものの、特定のルートが他のルートと比べてより即効性があり、より効果的な反応を提供できるということを理解するだろう。

0088

注射製剤は、本発明に基づいて好まれるこれら製剤のうちの1つである。注射用組成物として効果的な医薬担体要件は、当業者に周知である(例、Pharmaceutics and Pharmacy Practice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker and Chalmers,eds.,pages 238−250(1982),and ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,4Th ed.,pages 622−630(1986)参照)。

0089

非経口投与に適した製剤は、酸化防止剤緩衝液静菌剤、及び製剤を、意図されるレシピエントの血液と等張とする溶質を含むことができる水性及び非水性の等張滅菌注射液、並びに懸濁剤可溶化剤増粘剤安定化剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。ペプチド、核酸、ベクター、細胞、又はそれらの組成物は、医薬担体中、生理学的に許容される希釈剤中で投与でき、これは例えば滅菌液体又は液体の混合物などであって、水、生理食塩水デキストロース水溶液及び関連する糖溶液エタノールイソプロパノール、若しくはヘキサデシルアルコールなどのアルコールプロピレングリコール若しくはポリエチレングリコールなどのグリコールジメチルスルホキシド、2,2−ジメチル−1,3−ジオキソラン−4−メタノールなどのグリセロールケタール、ポリ(エチレングリコール)400などのエーテル、油、脂肪酸脂肪酸エステル若しくはグリセリド石鹸若しくは洗剤などの医薬上許容される界面活性化剤の添加を有する若しくは有さないアセチル化脂肪酸グリセリドペクチンカルボマーメチルセルロースヒドロキシプロピルメチルセルロース若しくはカルボキシメチルセルロースなどの懸濁化剤、又は乳化剤及び他の医薬アジュバントを含む。

0090

非経口製剤で利用できる油は、石油系、動物性植物性、及び合成油を含む。油の具体例として、ピーナッツ大豆胡麻綿実トウモロコシオリーブワセリン及び鉱物の油が挙げられる。非経口製剤での利用に適した脂肪酸は、オレイン酸ステアリン酸、及びイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、脂肪酸エステルの適切な例である。

0091

非経口製剤での利用に適した石鹸は、脂肪アルカリ金属(fatty alkali metal)、アンモニウム及びトリエタノールアミン塩を含み、並びに適した洗剤は、(a)例えば、ジメチルジアルキルアンモニウムハライド、及びアルキルピリジニウムハライドなどの陽イオン性洗剤、(b)例えば、アルキルアリル、及びオレフィンスルホネート、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセライドスルフェート、並びにスルホサクシネートなどの陰イオン性洗剤、(c)例えば、脂肪アミンオキシド(fatty amine oxides)、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレンコポリマー(polyoxyethylenepolypropylenecopolymers)などの非イオン性洗剤、(d)例えば、アルキル−b−アミノプロピオネート、及び2−アルキル−イミダゾリン四級アンモニウム塩などの両性洗剤、並びに(e)それらの混合物を含む。

0092

防腐剤及び緩衝液を使用してもよい。注射部位の炎症を最小限にする又は排除するために、そのような組成物は、約12から約17の親水性−親油性バランスHLB)を有する1つ以上の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。そのような製剤における界面活性剤の量は、一般的に約5重量%から約15重量%の範囲である。適した界面活性剤としては、モノオレイン酸ソルビタンなどのポリエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びエチレンオキサイド疎水性塩基との高分子量付加物プロピレンオキサイドのプロピレングリコールとの縮合により形成される)を含む。

0093

非経口製剤は、アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数用量密閉容器に入れて供給することができ、かつ、フリーズドライ凍結乾燥)状態で保存でき、これは、使用直前に、注射のために滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要する。即席注射用液及び懸濁液は、滅菌粉末顆粒及び錠剤から調製できる。

0094

以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然ながら、その範囲を制限するものであると解釈されるべきではない。

0095

実施例1
以下の材料及び方法は、実施例2〜5で議論する実験のために使用した。

0096

細胞培養
MCF−7ヒト乳腺癌細胞株(HLA−A2+/MUC1+)、CF−PAC−1ヒト膵臓腺癌細胞株(HLA−A2+/MUC1+)、SK−Mel−24メラノーマ細胞株(HLA−A2+/MUC1−)、及びASPC−1ヒト膵臓腺癌細胞株(HLA−A2−/MUC1+)をAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入し、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.5μg/mLアムホテリシンB(Mediatech,Inc.)、及び0.01μg/mLヒト組換えインスリン(Invitrogen Life Technologies,Inc.,Carlsbad,CA)を補充したDMEM完全培地(Mediatech,Inc.,Manassas,VA)中で維持した。全ての培養は、マイコプラズマフリーだった。HLA−A*0201(Storkuset al.,J.Immunol.,138:1657−1659(1987))を発現するK562ヒト慢性骨髄性白血病細胞株(K562/A*0201)(Andersonet al.,J.Immunol.,151:3407−3419(1993))は、C.Britten(Johannes Gutenberg University of Mainz,Mainz,Germany)から入手し、10%の熱失活させたウシ胎児血清、2mMグルタミン、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.5μg/mL、0.7mg/mLG418を補充したRPMI−1640完全培地で培養した。174CEM−T2細胞株(T2)トランスポート欠失変異株(Hogan et al.,J.Exp.Med.,168:725−736 (1988))は、Dr.Peter Cresswell(Yale University School of Medicine,New Haven,CT)により提供された。C1R−A2細胞及びT2細胞は、マイコプラズマフリーであり、それぞれ、RPMI−1640完全培地及びイスコフ改変ダルベッコ完全培地(Mediatech,Inc.)で維持した。

0097

ペプチド
MUC1−Cのアミノ酸配列は、ペプチド/MHC複合体予測される解離半減期により潜在的なMHC結合ペプチド位置づける、アメリカ国立衛生研究所のバイオインフォマティクス及び分子解析部門(BioInformatics and Molecule Analysis Section)(Parker et al.,J.Immunol.,152:163−175(1994))のコンピューターアルゴリズムを使用して、HLA−A2結合についてコンセンサスモチーフ適合スキャンした。American Peptide Company(Sunnyvale,CA)は、7つの9−merペプチド又は10−merペプチド及びそれらのアナログをMUC1−Cから合成した。ペプチドの純度は>90%だった。

0098

フローサイトメトリー解析
単色のフローサイトメトリー解析は、Guadagni et al.,Cancer Res.,50:6248−6255(1990)で以前に述べられている。簡単には、Ca2+及びMg2+フリーの冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を3回洗浄し、その後、抗HLA−A2,28(One Lambda,Inc.,Canoga Park,CA)、抗CD3、抗CD4、及び抗CD8(BD Biosciences,San Jose,CA)FITC結合モノクローナル抗体を用いて4℃で1時間染色した。マウスIgG2a,k FITC(BD Biosciences)をアイソタイプコントロールとして用いた。次いで、細胞をCa2+及びMg2+フリーの冷PBSで3回洗浄後、同じ緩衝液に再懸濁し、FACScan(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)及びCellQuestソフトウェア(BD Biosciences)を用いてすぐに分析した。結果は、10,000個の生細胞から集めたデータから得られ、陽性細胞パーセント及び平均蛍光強度MFI)で表した。MFI値対数スケールで集め、蛍光ドットプロットで全細胞の平均を測定することにより決定された蛍光レベルを表すのに使用した。

0099

2色のフローサイトメトリー解析の手順は、以下を除いて単色の解析と同様である。樹状細胞は、以下の抗体組み合わせ:抗MHCクラスIIFITC/抗CD11cAPC;抗クラスI FITC/抗CD80フィコエリトリン(PE);抗クラスI FITC/抗CD83PE;抗クラスI FITC/抗CD86PE;抗クラスI FITC/抗クラスII PE;抗クラスI FITC/抗CD58PE;抗クラスI FITC/抗CD54PEを用いて分析した。マウスIgG1,k FITC、マウスIgG1,k PE、及びマウスIgG2a,k FITCをアイソタイプコントロールとして用いた。>96%のDCがCD11c+及びMHCクラスII+であった。MHCクラスIIに対する抗体は、Serotec(Oxford,UK)から購入し、他の抗体はBD Biosciencesから購入した。

0100

ペプチドのHLA−A2への結合
P1172、P1177、P1240及びそれらのアナログのHLA−A2分子への結合は、フローサイトメトリーによって実証されるように(Nijman et al., Eur.J.Immunol.,23:1215−1219(1993))、T2A2細胞でのHLA−A2発現のアップレギュレーションによって評価した。

0101

PBMCs由来のDCsの培養
末梢血単核細胞(PBMCs)は、PANVAC−VF臨床試験に登録されたHLA−A2+の患者のヘパリン処理済血液から得た。リンパ球分離媒体グラジエント(MP Biomedicals,Aurora,OH)を用いて、製造者の指示に従ってPBMCsを分離した(Boyum,Scand.J.Clin.Lab.Invest.Suppl.,97:51−76(1968))。DCsは、Sallusto et al.,J.Exp.Med.,179:1109−1118(1994)に記載されるように、PBMCsから調製した。

0102

T細胞株の産生
Tsang et al.,J.Natl.Cancer Inst.,87:982−990(1995)により述べられているプロトコルの修正により、MUC1−C特異的CTLsを産生した。P1172、P1172(1Y)、P1177、及びP1177(10V)特異的T細胞株は、MUC1−CEAベースワクチンを接種した2人の結腸癌患者から産生した。P1240及びP1240(1Y)特異的T細胞株は、MUC1−CEAベースのワクチンを接種した卵巣癌患者及び乳癌患者から産生した。前述のとおり生成したCD40L又は酵母成熟自己DCsを、抗原提示細胞(APCs)として使用した。ワクチン接種後70日目に得たPBMCsをAPCsに添加し、12.5μg/mLの対応するペプチドで、エフェクター:APCが10:1の比率でパルスした。3回のin vitro刺激(IVS)サイクルのために、自己DCsをAPCsとして使用した。3回目のIVSサイクル後、放射線照射(23,000rads)された自己EBV形質転換B細胞を、APCsとして使用した。EBV形質転換B細胞での再刺激のために、12.5μg/mLの濃度でペプチドを用いて、自己EBV形質転換B細胞を、エフェクター:APCが1:3の比率でパルスした。5%CO2を含む加湿大気中で、培養物を3日間、37℃でインキュベートした。その後、培養物に7日間、20U/mLの濃度の組換えヒトIL−2を補充し;IL−2を含む培地を3日毎に補給した。ペプチドとの3日間のインキュベーション及び7日間のIL−2補充は、1回のIVSサイクルを構成した。

0103

テトラマー染色
ストレプトアビジン−PE標識P1172(1Y)/HLA−A*0201テトラマー、PE標識P1177(10V)/HLA−A*0201テトラマー、PE標識P1240/HLA−A*0201テトラマー、及びPE標識P1240(1Y)/HLA−A*0201テトラマーは、Tetramer Core Facility(Atlanta,GA)により調製された。PE標識HIVgag(配列番号25)/HLA−A*0201テトラマーは、Beckman Coulter(Fullerton,CA)から入手し、ネガティブコントロールとして使用した。1μLのテトラマー及び抗CD8−FITC抗体(BD Biosciences)で30分間、室温で暗所にてPBMCs(1×106)を染色し、FACS緩衝液で2回洗浄し、FACScan及びCellQuestソフトウェアを使用して解析した。結果は、100,000個の細胞から集めたデータから得た。

0104

細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞を、50μCiの111Inで標識したオキシキノリン(Medi−Physics Inc.,Arlington,IL)で、室温にて15分間標識した。100μLのRPMI−1640完全培地中のターゲット細胞(3×103)を、平底アッセイプレートの各96ウェルに添加した。10%のプールされたヒトAB血清を補充した100μLのRPMI−1640完全培地にエフェクター細胞を懸濁し、ターゲット細胞に添加した。次いで、プレートを37℃、5%CO2、4又は16時間インキュベートした。ハーベスターフレームズ(harvester frames)(Skatron,Inc.,Sterling,VA)を用いてガンマ線計数するために、上清を回収した。測定を3回行い、標準偏差を算出した。特異的溶解は以下の計算式により算出した(全ての値はcpmで表示)。

0105

0106

100μLのRPMI−1640完全培地を添加したウェルから、自然遊離を決定した。ターゲットを2.5%Triton X−100で処理後、全遊離放射活性を得た。

0107

サイトカインの検出
種々のペプチド濃度のIL−2を含まない培地中、ペプチドパルスした自己DCs又は自己EBV形質転換B細胞により24時間刺激されたT細胞の上清を、ELISAキット(BioSourceInternational,Camarillo,CA)によりIFN−γの分泌についてスクリーニングした。結果はpg/mLで表した。

0108

統計解析
対応のある両側スチューデントt検定及びStatViewソフトウェア(Abacus Concepts,Berkeley,CA)を使用して、統計学有意性を算出した。

0109

実施例2
本実施例は、MUC1−CサブユニットのCTLエピトープ及びそのアナログの決定を実証する。

0110

MUC1−Cサブユニットの第一のアミノ酸配列(MUC1配列の残基1098から1254に対応)を、HLA−A2結合ペプチドのコンセンサスモチーフについて解析した。2つの10−merペプチド(P1172及びP1177と称する)及び1つの9−merペプチド(P1240と称する)を同定し、合成した(表1参照)。ネイティブエピトープP1172、P1177、及びP1240の3つのアナログ(それぞれP1172(1Y)、P1177(10V)、及びP1240(1Y))を、1位及び10位のアミノ酸残基の単一アミノ酸置換により作製した。各アナログは、対応するネイティブエピトープよりもHLA−A2分子に対する高い予測親和性を有した。

0111

HLA−A2分子に対して高い親和性を有するペプチド(NGEPP703)(Cereda et al.,Cancer Immunol.Immunother.,59:63−71(2010))及び特異的なHLA−A3ペプチド(CAP−7)を、それぞれ、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしてアッセイで使用した。

0112

0113

P1177、P1172、及びP1240は、HLA−A2分子に対し、ネガティブコントロールと比較してより高い親和性を示した。アナログペプチドP1177(10V)及びP1240(1Y)は、HLA−A2分子に対し、対応するネイティブペプチドP1177及びP1240と比較してより高い親和性を示した。

0114

アナログ及びネイティブペプチドのペプチド/HLA−A2複合体の安定性は、HLA−A2分子の残存する複合体のパーセンテージを異なる時点(0、2、4、6、8、及び10時間)で決定することにより解析した。アナログペプチドP1177(10V)は、ネイティブペプチドP1177よりも、クラスI分子に対してより結合活性が高いことを各時点で実証した。P1172(1Y)及びP1172、並びにP1240(1Y)及びP1240の間では、解離半減期に関して違いは認められなかった。

0115

実施例3
本実施例は、MUC1−CサブユニットのCTLエピトープ及びそのアナログのさらなる特徴を実証する。

0116

P1172、P1177、P1240、及びそれらの対応するアナログの免疫原性を、in vitroで特異的CTLsを産生する能力を評価することによりさらに調べた。組換えワクシニア−CEA−MUC1−TRICOM及び組換え鶏痘−CEA−MUC1−TRICOMでワクチン接種された、結腸癌患者(患者1)由来及び乳癌患者(患者2)由来のPBMCsを用いて、これらのMUC1−Cネイティブ及びアゴニストペプチドに対して特異的CD8+細胞株を樹立した。P1172、P1172(1Y)、P1177、及びP1177(10V)を用いて患者1から産生されたT細胞株は、それぞれ、T−1−P1172、T−1−1172(1Y)、T−1−P1177、及びT−1−P1177(10V)とした。P1240及びP1240(1Y)を使用して患者2から産生したT細胞株は、それぞれ、T−2−P1240及びT−2−P1240(1Y)とした。

0117

これらのT細胞株の特異性を評価するために、対応するペプチドでパルスされ放射線照射された自己B細胞を用いて、IFN−γリリースアッセイを行った。対応するペプチドでパルスされ放射線照射された自己B細胞を用いて、APC:T細胞が2:1の比率でT細胞を刺激した。T細胞は5×105/mLの濃度で使用した。24時間の培養上清を集め、IFN−γの分泌を調べた。T−1−P1172(1Y)、T−1−P1177(10V)、及びT−2−P1240(1Y)細胞株は、対応するネイティブペプチドを用いて産生されたT細胞株と比較して、より高レベルのIFN−γを産生した(表2)。

0118

0119

次いで、アゴニストペプチド特異的T細胞を活性化するネイティブペプチド及びアゴニストペプチドの能力を比較するために、種々の濃度で試験を行った。各ペプチド濃度において、アゴニストペプチドP1172(1Y)、P1177(10V)、及びP1240(1Y)でAPCsをパルスすると、ネイティブペプチドP1172、P1177、及びP1240と比較して、アゴニストペプチド特異的T細胞株による、最大レベルのIFN−γ産生が導かれた(図1A〜1C参照)。

0120

次いで、上述と同じ臨床試験より他の結腸癌患者(患者3)のPBMCsから、P1177及びP1177(10V)を使用して更なるT細胞株を樹立し、それぞれT−3−P1177及びT−3−P1177(10V)とした。T−3−P1177(10V)はT−3−P1177よりも高レベルのIFN−γを産生した(>1,000pg/mL対456pg/mL)。

0121

実施例4
本実施例は、癌患者のMUC1CTLエピトープ及びエンハンサーアナログペプチドの免疫原性を実証する。

0122

T細胞株T−1−P1172、T−1−1172(1Y)、T−1−P1177、T−1−P1177(10V)、T−2−P1240、及びT−2−P1240(1Y)におけるMUC1−C特異的CD8+T細胞の頻度を、P1172(1Y)/HLA−A*0201テトラマー、P1177(10V)/HLA−A*0201テトラマー、P1240(1Y)/HLA−A*0201テトラマー、及び抗CD8抗体を使用して調べた。アゴニストエピトープ特異的T細胞株T−1−P1172(1Y)、T−3−P1177(10V)、及びT−2−P1240(1Y)では、対応するネイティブペプチドを使用して産生したT細胞株と比較して、高頻度のMUC1−C特異的CD8+T細胞が産生された(それぞれ、6.38%対1.53%、6.18%対3.53%、及び6.6%対1.6%)。

0123

次いで、これらのT細胞株を、MUC1+/HLA−A2+乳癌細胞株(MCF−7)及びMUC1+/HLA−A2+膵臓癌細胞株(CF−PAC−1)に対する細胞傷害性活性について試験した。MUC1−/HLA−A2+メラノーマ細胞株(SK−MEL−24)及びMUC1+/HLA−A2−膵臓癌細胞株(ASPC−1)をネガティブコントロールとして使用した。これらの腫瘍細胞株のHLA−A2及びMUC1−Cの発現を、フローサイトメトリーで評価した(表3参照)。

0124

0125

MUC1−Cエピトープ特異的T細胞株を用いて、16時間の111Inリリースアッセイを行った。MCF−7細胞は、アゴニストエピトープ特異的T細胞株により、対応するネイティブエピトープに特異的なT細胞株よりも著しく溶解された。予想通り、SK−MEL−24細胞に対する溶解は観察されなかった(表4参照)。

0126

0127

実施例5
本実施例は、本発明のペプチドを用いて産生したT細胞株のCTL細胞溶解の特異性及びHLA−A2拘束性を実証する。

0128

T−1−P1177(10V)及びT−2−P1240(1Y)細胞は、該細胞株が高レベルのIFN−γ、高パーセンテージのテトラマー+T細胞、及び殺腫瘍細胞の増大を生じたため、選択した。

0129

CTL細胞溶解の特異性及びHLA−A2拘束性を確認するため、T−1−P1177(10V)及びT−2−P1240(1Y)細胞を、ターゲットとしたCF−PAC−1細胞とともにコールドターゲット阻害アッセイで使用した。111Inで標識したCF−PAC−1細胞及び非標識のK562/A2.1細胞を、1:10で使用した。K562/A2.1細胞を、ペプチド(25μg/mL)あり又はなしで2時間インキュベートした。

0130

P1177(10V)及びP1240(1Y)ペプチドパルスされた非標識のK562/A2.1細胞の添加は、エフェクター:ターゲット比が25:1で、T−1−P1177(10V)及びT−2−P1240(1Y)細胞のCF−PAC−1コントロールに対するCTL活性を、それぞれ21.1%から4.0%溶解及び13.5%から1.7%溶解まで減少させた(表5)。

0131

0132

抗体ブロッキング試験を実施して、溶解がHLA−A2拘束性であるかどうかを決定した。16時間の111Inリリースアッセイにおいて、いずれの抗体も含まないか、UPC−10(10μg/mL)を含むか、又は抗HLA−A2(10μg/mL)を含む、培地でCF−PAC−1細胞を1時間インキュベートした。CF−PAC−1細胞に対するT−1−P1177(10V)及びT−2−P1240(1Y)のCTL活性は、抗HLA−A2抗体では溶解が抑制されたがコントロール抗体UPC−10では抑制されなかったことから示されるように、HLA−A2拘束性であることが示された(表6)。

0133

0134

これらの結果は、アゴニストエピトープを用いて産生されたMUC1−C特異的T細胞が、抗原特異的及びHLA−A2拘束性の様式で、ネイティブMUC−1を内在的に発現する腫瘍細胞を溶解することを示した。

0135

実施例6
以下の材料及び方法は、実施例7〜9において議論する実験のために使用した。

0136

患者
前述のCEAベース及びMUC1ベースウイルスワクチン(PANVAC−V/F)(Gulley et al.,Clin.Cancer Res.,14:3060−3069(2008))の臨床試験で登録された卵巣癌患者の抹消血単核細胞(PBMCs)を使用した。PANVACは、CEA、MUC1、及び3つの共刺激分子(B7.1、細胞間接着分子1(ICAM−1)、及びリンパ球機能関連抗原3(LFA−3))を発現する、組換えワクシニア(V)及び鶏痘(F)ベクターからなる。プライムとしてワクシニア、ブースト注射として鶏痘を用いて、最初の月は隔週で、それ以降は月1回与えた。

0137

HLA−A3+の健康なドナー由来のPBMCsを、記載される参照集団として使用した。アメリカ国立衛生研究所臨床センター(National Institutes of Health Clinical Center)の治験審査委員会は手順を承認し、インフォームドコンセントはヘルシンキ宣言に従って得られた。

0138

細胞培養
ヒト卵巣癌細胞株SKOV3(HLA−A3+及びMUC1+)、及び膵臓癌細胞株CFPAC1(HLA−A3+及びMUC1+)並びにASPC−1(HLA−A3+及びMUC1−)はAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)より購入した。全ての細胞培養物は、マイコプラズマフリーであり、完全培地(10%ウシ胎仔血清、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン及び2mML−グルタミンを補充したRPMI1640)(Mediatech,Herndon,VA)中で維持した。C1RA3及びK562−A3細胞:C1R(Dr.WEBiddison(NINDS,NIH,Bethesda,MD)から親切贈与)及びK562(ATCC)は、NCI−Fredrick Eukaryotic Expression Group(Frederick,MD)によって、HLA−A3を発現するためにHLA−A3ベクターでトランスフェクトされた。0.2mg/mlのG−418(Mediatech)を補充したRPMI完全培地で、それらを維持した。

0139

ペプチド
MUC1−Cのアミノ酸配列は、ペプチド/MHC複合体の予測される解離半減期により潜在的なMHC結合ペプチドを位置づけるためにParkerらによって開発されたコンピューターアルゴリズム(Parkeret al.,J.Immunol,152:163−175(1994))を使用して、HLA−A3結合ペプチドについてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。American Peptide Company(Sunnyvale,CA)が、結合親和性を増大させるために、アミノ酸置換したMUC1−C由来の、7つの9−mer又は10−merペプチドアナログを合成した。ペプチドの純度は>90%だった。

0140

PBMCs由来樹状細胞の培養
患者から末梢血を集め、密度勾配遠心法によりPBMCsを単離した(Lymphocyte Separation Medium,ICN Biochemicals,Aurora,VA)。樹状細胞(DCs)は、以前に記載された手順(Yokokawa et al.,Int.J.Cancer,121:595−605(2007))の変更を使用して産生した。100ng/mlGM−CSF及び20ng/mlIL−4(PeproTech,Rocky Hill,NJ)を含むAIM−V培地中で、樹状細胞を増殖させた。5日間培養後、1μg/mlCD40L及び1μg/mlエンハンサー(Enzo Life Sciences,Farmingdale,NY)の24時間添加によりDCsを成熟させた。次いで、それらを、PBMCsの最初のin vitro刺激(IVS1)のためにすぐに使用するか、又は今後の使用のために分割して凍結した。

0141

T細胞株の産生
Tsang et al.,J.Nat.Cancer Inst.,87:982−990(1995)により述べられているプロトコルの改訂版を使用し、MUC1−C特異的細胞傷害性Tリンパ球を産生した。放射線照射された自己DCsを、12.5μg/mlのペプチドで2時間パルスし、次いで、PBMCsを10:1の比率で添加した。3日後、ヒトIL−2(20Cetus units/ml)を加えた。細胞を7日毎に、再刺激した。3回目のin vitro刺激(IVS)後、抗原提示細胞として自己エプスタイン—バーウイルス形質転換B細胞を使用して、3:1の比率で細胞を再刺激した。

0142

フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析(FACS)は、以前に記載されたように(Yokokawa et al.,上記参照)行った。簡単には、ヤギ抗ヒト二次FITC結合抗体とともにGAP−A3抗体をHLA−A3に使用し、DF3抗体を細胞外MUC−1に使用した。CD8−PE、CD45RA−PECy7、CD62L−FITC及びCXCR3−APC(BD Biosciences,San Jose,CA)で40分間、4℃で染色することにより、T細胞株に対して4色FACS解析を実施した。LSRII(BD)により1×105細胞を得て、FlowJo9.0.1ソフトウェア(Tree Star Inc,Ashland,OR)を使用してデータを解析した。適切なアイソタイプコントロールを使用し、死細胞は解析から除いた。

0143

テトラマー染色
NIH Tetramer Core Facility(Atlanta,GA)により、フィコエリトリン(PE)で標識したHLA−A3−P432−3F10K及びHLA−A3−P483−2L3Fテトラマーを調製し、PEで標識したMHCクラスIヒトネガティブテトラマー(KitNo T01044)をBeckman Coulter Inc(Sykesville,MD)から得た。ネガティブテトラマーは、特異性は知られておらず、及びどのHLA対立遺伝子のヒトCD8+T細胞にも結合しない。テトラマーを1:100で希釈して使用し、細胞を45分、4℃で染色した。LSRII(BD)により1×105細胞を得て、FlowJo9.0.1ソフトウェア(Tree Star Inc,Ashland,OR)を使用してデータを解析した。

0144

細胞傷害性アッセイ及びコールドターゲット阻害アッセイ
T細胞により媒介される死滅を決定するために、16時間の111Inリリースアッセイを使用した(Tsanget al.,上記参照)。37℃で20分間、2×106ターゲット細胞を60μCiの111Inオキサイド(GE Health care,Vienna,VA)で標識し、96ウェルの丸底培養プレート中、3000細胞/ウェルで使用した。T細胞を異なる比率で添加した。全てのアッセイは、10%ウシ胎児血清、グルタミン、及び抗生物質(Mediatech,Manassas,VA)で置き換えたRPMI培地中で実施された。培地のみでターゲット細胞をインキュベートすることによって自然遊離を決定し、2.5%TritonX−100でインキュベートすることによって完全溶解を決定した。計算式を用いて溶解を算出した(全ての値はcpmで表示):

0145

0146

コールドターゲット阻害アッセイは、K562−A3細胞又はペプチドパルスされたK562−A3細胞を1:10の比率でウェルに添加することによって実施した(Yokokawa et al.,上記参照)。

0147

サイトカインの検出
2.2×106T細胞、及びペプチドP432−3F10K又はP483−2L3Fでパルスされた5.5×106自己B細胞を24時間、ウェルあたり5mLの培地でインキュベートした。サイトカインの検出のために、上清をMulti−arrayテクノロジー(Meso Scale Diagnostics,Gaitersburg,MD)で解析した。

0148

LISPOTアッセイ
HLA−A3+患者におけるCD8免疫応答の測定は、Arlen et al.,Cancer Immunol.Immunother.,49:517−529(2000)により述べられている手順の変更を用いて、酵素結合免疫吸着スポットアッセイ(ELISPOT)によって行った。APCとしてK562−A3細胞を使用して、アッセイを実施した。ELISPOTは、ペプチドによる刺激に応じてIFNγを放出するT細胞の頻度を測定する。P432−3F10K、P483−2L3F、ペプチドなし、又はHIVgagペプチド(配列番号25:ネガティブコントロール)を使用した。ワクチン接種前又は接種後に各患者のPBMCsを比較した。陽性反応は、IFNγ分泌細胞において≧2倍増加として得点された。スポットは、イムノスポットカウンター(Cellular Technology Ltd,Shaker Heights,OH)を使用して解析した。

0149

統計解析
統計的評価のため、2群間ノンパラメトリックマンホイットニー検定を使用した(GraphPad Software,La Jolla,CA)。<0.05のP値を有意とみなした。

0150

実施例7
本実施例は、MUC1−CサブユニットのCTLエピトープ及びそれらのアナログの決定を実証する。

0151

MUC1−Cアミノ酸配列は、免疫療法に使用できる可能性があるCD8+T細胞エピトープを同定するために、HLA−A3結合ペプチドについてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。ネイティブエピトープの予測される結合は低いので、T細胞レセプターに対するより高い結合が予測される7つの新しいペプチドを調製した(表7参照)。

0152

0153

細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の産生能力について、これらのペプチドを調べた。PBMCsのin vitro刺激によりCTLを産生し、次いで、ターゲットとしてのペプチドパルスされたC1RA3細胞とともに、細胞傷害性アッセイに使用した。T−432−3F10K及びT−483−2L3F(それぞれ、P432−3F10K及びP483−2L3Fに対応)と称する、2つのペプチドで産生された細胞株は、高い細胞傷害性活性を実証し、これらのペプチドを以降の実験に使用した。

0154

ペプチドP432−3F10K及びペプチドP483−2L3Fで産生されたT細胞株におけるMUC1−C特異的CD8+T細胞の頻度を決定するために、HLA−A3−P432−3F10Kテトラマー及びHLA−A3−P483−2L3Fテトラマー解析を使用した。6回のIVSサイクル後、20%及び16%のT細胞が、それぞれP432−3F10Kテトラマー及びP483−2L3Fテトラマーに結合した。0.01%及び0.04%の細胞は、ネガティブテトラマーに結合した。

0155

サイトカイン産生を誘導するMUC1−Cペプチドの能力を試験するために、実施例6に記述したPANVAC卵巣癌臨床試験の2人の患者由来のP432−3F10K及びP483−2L3F特異的T細胞株(1.1×106T細胞/mL)を、P432−3F10K又はP483−2L3Fで24時間パルスした自己B細胞と、24時間インキュベートした。刺激した細胞及び刺激していない細胞の上清のサイトカインレベルを評価した。表8に示すように、刺激後にいくつかのI型サイトカインが増加した。

0156

0157

実施例8
本実施例は、本発明のペプチドの癌細胞を抑制する能力を実証する。

0158

4回又は6回のIVS後、2人の癌患者由来のペプチド特異的T細胞株を、細胞傷害性アッセイに使用した。ヒト卵巣癌細胞株SKOV3、及び膵臓癌細胞株ASPC−1を、FACS解析のために、HLA−A3及びMUC1に対する抗体で染色した。SKOVはHLA−A3(99%)及びMUC1(94%)を発現したのに対し、ASPC−1はMUC1陽性(71%)であったが、HLA−A3を発現しなかった。

0159

癌細胞株放射性インジウム(111In)とインキュベートし、特異的T−432−3F10K及びT−483−2L3FT細胞株とともに細胞傷害性アッセイに使用した。T細胞は、MUC1及びHLA−A3の両方を発現する腫瘍細胞を特異的に殺したが、MUC1を発現するがHLA−A3は発現していない細胞は殺さなかった。

0160

さらに、ターゲットとして膵臓癌細胞株CF−PAC−1(HLA−A3+及びMUC1+)を、コールドターゲットとしてペプチドパルスK562−A3細胞を用いて、コールドターゲット阻害アッセイを実施した。これらの細胞は効率的にペプチドを提示し、1:10の比率で添加された場合に、腫瘍細胞の溶解をブロックするが、ペプチドにさらされていないK562−A3細胞は、同じ濃度で添加された場合、腫瘍溶解に影響を及ぼさなかった(図2A、2B参照)。T細胞:ターゲット細胞の比率は25:1であった。

0161

実施例9
本実施例は、癌患者における本発明のペプチドの免疫原性を実証する。

0162

臨床ワクチン試験の3人の患者のPBMCsを、ペプチドP432−3F10K又はペプチドP483−2L3Fにさらした自己樹状細胞で、2回のIVSサイクルで刺激し、最後の刺激から1週間後、細胞をCD8−FITC(20μL)と、P432−3F10K/P483−2L3F−テトラマーPE(1μL)又はネガティブテトラマーPC(1μL)のいずれかとで45分間染色後、FACS解析に供した。

0163

表9及び表10に示すように、20〜60%の細胞が、2回の刺激後にテトラマーと結合した。表9及び表10の結果は、全てのCD8+T細胞からのテトラマー陽性細胞の頻度で表す。

0164

0165

0166

臨床ワクチン試験に登録した癌患者のPBMCsにおいて、P432−3F10K及びP483−2L3Fペプチドに反応するCD8+T細胞の存在を評価するため、IFNγELISPOTアッセイを実施した。P432−3F10K及びP483−2L3Fペプチドを、25μg/mLの濃度でELISPOTアッセイに使用して、特異的T細胞の前駆体頻度を決定した。ペプチドパルスしたK562−A3細胞をAPCとして、エフェクター:APCを1:2の比率で使用した。HIVペプチド及びペプチドなしをコントロールとして使用した。

0167

表11に示すように、11人の患者のうち5人が、ワクチン接種前及び接種後3か月のPBMCsにおいて、ペプチドP432−3F10Kによる刺激で特異的なIFNγ産生を示した。いずれの患者もP483−2L3Fペプチドに対して特異的な反応を示さず、患者IはPBMCsが少なすぎたため評価できなかった。

0168

0169

実施例10
以下の材料及び方法は、実施例11及び12において議論する実験のために使用した。

0170

ペプチドのHLA−A2への結合
pVNTR1、pVNTR2、pVNTR4及びそれらのアナログ(pVNTR3及びpVNTR5)のHLA−A2分子への結合を、フローサイトメトリーによって実証されるように、T2A2細胞でのHLA−A2発現のアップレギュレーションによって評価した(Nijman et al.,Eur.J.Immunol.,23:1215−1219(1993))。

0171

T細胞株の産生
Tsang et al.,J.Nat.Cancer Inst.,87:982−990(1995)により述べられたプロトコルを修正して、MUC1−C特異的CTLsを産生した。pVNTR3、pVNTR5特異的T細胞株を、PSAベースワクチンでワクチン接種した前立腺患者から産生した。先に記載するように作製したCD40L又は酵母成熟自己DCsを抗原提示細胞(APCs)として使用した。ワクチン接種後94日目に得たPBMCsをAPCsに添加し、エフェクター:APCを10:1の比率で、12.5μg/mLの対応するペプチドでパルスした。自己DCsをAPCsとして、3回のin vitro刺激(IVS)サイクルに使用した。放射線照射(23,000rads)された自己EBV形質転換B細胞をAPCsとして、3回のIVSサイクル後に使用した。EBV形質転換B細胞での再刺激のために、12.5μg/mLの濃度のペプチドを使用して、自己EBV形質転換B細胞をエフェクター:APCが1:3の比率でパルスした。5%CO2を含む加湿大気中で、培養物を3日間、37℃でインキュベートした。次いで、培養物に、20U/mLの濃度で組換えヒトIL−2を7日間補充した;IL−2を含む培地を3日毎に補充した。ペプチドとの3日間のインキュベーション及び7日間のIL−2補充は、1回のIVSサイクルを構成した。

0172

細胞傷害性アッセイ
ターゲット細胞を、50μCiの111Inで標識したオキシキノリン(Medi−Physics Inc.,Arlington,IL)で15分間、室温で標識した。RPMI−1640完全培地100μL中のターゲット細胞(3×103)を、平底アッセイプレートの各96ウェルに添加した。10%のプールされたヒトAB血清を補充したRPMI−1640完全培地100μLにエフェクター細胞を懸濁し、ターゲット細胞に添加した。次いで、5%CO2中、37℃で4又は16時間、プレートをインキュベートした。ガンマ線計数のために、ハーベスターフレームズ(harvester frames)(Skatron,Inc.,Sterling,VA)を使用して上清を回収した。測定は3回行い、標準偏差を算出した。特異的溶解は以下の計算式により算出した(全ての値はcpmで表示)。

0173

0174

100μLのRPMI−1640完全培地を添加したウェルから自然遊離を決定した。ターゲットを2.5%TritonX−100で処理後、全遊離放射活性を得た。

0175

細胞培養
MCF−7ヒト乳腺癌細胞株(HLA−A2+/MUC1+)、CF−PAC−1ヒト膵臓腺癌細胞株(HLA−A2+/MUC1+)、SK−Mel−24メラノーマ細胞株(HLA−A2+/MUC1−)、及びASPC−1ヒト膵臓腺癌細胞株(HLA−A2−/MUC1+)をAmerican Type Culture Collection(Manassas,VA)から購入し、10%ウシ胎児血清、2mMグルタミン、100units/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.5μg/mLアムホテリシンB(Mediatech,Inc.)、及び0.01μg/mLヒト組換えインスリン(Invitrogen Life Technologies,Inc.,Carlsbad,CA)を補充したDMEM完全培地(Mediatech,Inc.,Manassas,VA)中で維持した。全ての培養物はマイコプラズマフリーだった。

0176

実施例11
本実施例は、MUC1 VNTR領域のCTLエピトープ及びそれらのアナログの決定を実証する。

0177

MUC1 VNTRアミノ酸配列は、免疫療法に使用できる可能性があるCD8+T細胞エピトープを同定するために、HLA−A2結合ペプチドについてコンセンサスモチーフの適合をスキャンした。3つの9−merペプチド(VNTR−1、VNTR−2、及びVNTR−4と称する)を同定し、合成した(表12参照)。

0178

ネイティブエピトープVNTR−2及びVNTR−4の2つのアナログ(それぞれVNTR−3及びVNTR−5)は、1、2、及び9位のアミノ酸残基のアミノ酸置換により産生した(表12参照)。各アナログは、対応するネイティブエピトープよりもHLA−A2分子に対する高い予測親和性を有した。

0179

HLA−A2分子に対して高い親和性を有するペプチド(NGEPP703)(Cereda et al.,Cancer Immunol.Immunother.,59:63−71(2010))及び特異的なHLA−A3ペプチド(CAP−7)を、それぞれ、ポジティブコントロール及びネガティブコントロールとしてアッセイで使用した。

0180

0181

VNTR−1、VNTR−2、及びVNTR−4は、HLA−A2分子に対し、ネガティブコントロールと比較してより高い親和性を示した。アナログペプチドVNTR−3及びVNTR−5は、HLA−A2分子に対し、それぞれ対応するネイティブペプチドVNTR−2及びVNTR−4と比較してより高い親和性を示した。

0182

アナログ及びネイティブペプチドのペプチド/HLA−A2複合体の安定性は、HLA−A2分子の残存する複合体のパーセンテージを異なる時点(0、2、4、6、8、及び10時間)で決定することにより解析した。アナログペプチドVNTR−3及びVNTR−5は、それぞれのネイティブペプチドVNTR−2及びVNTR−4よりも、クラスI分子に対してより高い結合活性を各時点で実証した(図3参照)。

0183

実施例12
本実施例は、癌患者におけるMUC1 VNTRエンハンサーアナログペプチドの免疫原性を実証する。

0184

PBMCsのin vitro刺激によるCTLsの産生能力について、VNTR−3及びVNTR−5ペプチドを調べた。次いで、得られたT細胞株(それぞれT−VNTR−3及びT−VNTR−5)を、MUC1+/HLA−A2+乳癌細胞株(MCF−7)及びMUC1+/HLA−A2+/A3+膵臓癌細胞株(CF−PAC−1)に対する細胞傷害性活性について試験した。MUC1−/HLA−A2+メラノーマ細胞株(SK−MEL)及びMUC1+/HLA−A2−膵臓癌細胞株(ASPC−1)をネガティブコントロールとして使用した。

0185

MUC1 VNTRエピトープ特異的T細胞株を使用して、111Inリリースアッセイを行った。予想通り、ASPC−1(HLA−A2−)及びSK−MEL(MUC1−)細胞に対する溶解は観察されなかった(表13参照)。

0186

0187

T−VNTR−3(VNTR−3アゴニストペプチド特異的T細胞株)及びT−VNTR−5(VNTR−5アゴニストペプチド特異的T細胞株)を1×105細胞/mLの濃度で別々に培養した。APC:T細胞の比率は3:1だった。アゴニスト又はネイティブペプチドを種々の濃度で使用した(表14及び15参照)。24時間後に上清を集め、IFN−γの量を決定した。アゴニストペプチドで刺激したVNTR−3及びVNTR−5特異的T細胞株は、ネイティブペプチドでの刺激と比較して高レベルのIFN−γを産生した(表14及び15参照)。

0188

0189

0190

CTL細胞溶解の特異性及びHLA−A2拘束性を確認するため、T−VNTR−3及びT−VNTR−5細胞を、膵臓癌細胞株CF−PAC−1(HLA−A2+/A3+及びMUC1+)とともにコールドターゲット阻害アッセイで使用した。CF−PAC−1細胞、及びVNTRアゴニストペプチドでパルスされた又はパルスされていない自己B細胞を、ターゲットとして使用した。

0191

表16のデータにより実証されるように、対応するVNTRアゴニストペプチドでパルスされた自己B細胞は、腫瘍細胞の溶解をブロックするが、ペプチドにさらされていない自己B細胞は、腫瘍溶解に影響を及ぼさなかった。

0192

0193

刊行物、特許出願及び特許を含む、本明細書中に引用した全ての参考文献は、それぞれの参考文献が参照によって組み込まれることが個々に且つ具体的に示されているのと同程度、及びその全体が本明細書中に記載されているのと同程度まで、参照によって本明細書中に組み込まれる。

0194

本発明の説明に関して(特に以下の特許請求の範囲に関して)、用語「a」及び「an」及び「the」並びに同様の指示対象の使用は、本明細書中に特記しないか文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方をカバーすると解釈すべきである。用語「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」及び「含む(containing)」は、特記しない限り、オープンエンドの用語(即ち、「〜を含むがそれらに限定されない」を意味する)と解釈すべきである。本明細書中の値の範囲の記述は、本明細書中に特記しない限り、その範囲内に入る各個別の値に個々に言及する省略方法として働くことのみを意図しており、各個別の値は、それが本明細書中に記述されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施できる。本明細書中に提供される任意の及び全ての例文又は例示的語句(例えば、「など(such as)」)の使用は、本発明をより明瞭にすることのみを意図しており、特段特許請求されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のどの語句も、特許請求されていない任意の要素を本発明の実施に必須のものとして示していると解釈すべきではない。

実施例

0195

発明者が知る、発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書中に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上述の説明を読めば当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がかかるバリエーションを適宜使用することを予期しており、本発明者らは、本明細書中に具体的に記載されたのとは異なる方法で本発明が実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法によって許容されるとおり、本明細書に添付した特許請求の範囲に記載される主題の全ての変更形態及び同等物を含む。さらに、その全ての可能なバリエーションでの上記要素の任意の組み合わせが、本明細書中に特記しない又は文脈と明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。

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