図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2015年1月29日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (8)

課題・解決手段

親株ハマ由来する組換えボルデテラパータシス株を提供する。この新しい株は、対立遺伝子交換ベクターSS4245、即ち、如何なる副変異をも残さずに細菌染色体の一部の置換を行うことができるベクターを用いた相同組換えによって得られる。PTサブユニットS1をコードするセグメントを置換し、PTの毒性活性不活性化を引き起こす2種の変異を導入する。この株を更に改変してrPT及び/又はPRNの発現量を増加させることができる。プロモーターとptlターミネーターを有し、上述の変異を含むptx−ptlオペロンの5種のPT構造遺伝子のptxクラスターの第2のコピー染色体の他の位置に挿入することができる。更に、PRN遺伝子の第2のコピーを染色体に挿入することができる。いずれの場合においても、放棄された遺伝子座挿入部位として選択して不要な遺伝子変異の導入を回避する。

概要

背景

パータシス、即ち百日咳は、上気道ボルデテラ・パータシス感染に起因する重篤小児疾患である[1]。B.パータシスの死滅細胞で構成されたワクチンは数十年に亘って使用されている。該ワクチンは、ジフテリア破傷風・百日咳の三種混合ワクチンとして、或はB型肝炎ヘモフィルスインフルエンザ(Haemophilus influenzae)b菌侵襲性疾患に対する免疫をももたらす新たな混合ワクチンとして投与される[2]。該死滅全細胞に関連するエンドトキシンや他の菌体内毒素のレベルが高く、その安全性プロファイルに問題があるため、数か国では、全細胞ワクチンの使用が減少、抑制、更には禁止されている[3、4]。

無細胞ワクチン(全細胞を含まず、ごく一部又は十分に精製された細菌抗原を含んでいる事実にちなんで命名)は、1981年に日本に導入された[5]。無細胞ワクチン中の抗原成分純度が高いことは、臨床安全性プロファイルが改善されていると解釈された。このようなワクチンは、その安全性や有効性が広範な実地試験立証された後、90年代半ばに先進工業国に導入された[6]。しかし、無細胞ワクチンのコストが著しく高いため、WHOによる予防接種拡大普及計画への広範な導入は妨げられた。

B.パータシスの主な病原性因子百日咳毒素(PT)であり[7、8]、百日咳トキソイド(PTd)は無細胞ワクチン中の主な抗原である[8]。ホルムアルデヒドによる簡単な処理で不活性化することができるジフテリア毒素破傷風毒素とは異なり、PTは、化学的手段で不活性化することが困難であることが分かっている[9]。現在、商業生産には様々な不活性化プロセスが用いられている。全てのプロセスにおいては、化学処理に起因するPTの広範な変性が共通している。遺伝的に不活性化された毒素(rPT)を用いて2種の候補ワクチンが調査され[10〜12]、これらの候補の内の1種は実地での有効性試験に採り入れられている[11〜12]。

概要

親株ハマ由来する組換えボルデテラ・パータシス株を提供する。この新しい株は、対立遺伝子交換ベクターSS4245、即ち、如何なる副変異をも残さずに細菌染色体の一部の置換を行うことができるベクターを用いた相同組換えによって得られる。PTサブユニットS1をコードするセグメントを置換し、PTの毒性活性の不活性化を引き起こす2種の変異を導入する。この株を更に改変してrPT及び/又はPRNの発現量を増加させることができる。プロモーターとptlターミネーターを有し、上述の変異を含むptx−ptlオペロンの5種のPT構造遺伝子のptxクラスターの第2のコピー染色体の他の位置に挿入することができる。更に、PRN遺伝子の第2のコピーを染色体に挿入することができる。いずれの場合においても、放棄された遺伝子座挿入部位として選択して不要な遺伝子変異の導入を回避する。

目的

本発明の第1の実施形態においては、遺伝子改変ボルデテラ・パータシス・トハマ株であって、ATCC寄託番号BAA−589を有するトハマ株の百日咳毒素S1遺伝子はArg9→Lys9及びGlu129→Gly129変異を有するが、該変異に起因する抗生物質耐性遺伝子は組み込まれていない改変トハマ株において、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる改変トハマ株を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

遺伝子改変ボルデテラパータシス・トハマ株であって、ATCC寄託番号BAA−589を有するトハマ株の百日咳毒素S1遺伝子はArg9→Lys9及びGlu129→Gly129変異を有するが、該変異に起因する抗生物質耐性遺伝子は組み込まれていない改変トハマ株において、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる改変トハマ株。

請求項2

ベクターSS4245を用い、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずにS1変異を導入した、請求項1に記載の改変トハマ株。

請求項3

Bp−WWCと命名され、寄託番号を有する、請求項1又は2に記載の改変トハマ株。

請求項4

ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体非機能性領域にptxオペロンコピーを組み込むことによって更に改変されており、組み込まれたptxオペロンは、変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むように改変されたS1遺伝子とS2〜S5遺伝子のセットを含んでおり、こうして改変された株は、トハマ染色体内に離れて位置する2種のptxオペロンを有するが、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおらず、1種のptxオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができる、請求項1〜3のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項5

ptxオペロンのコピーは、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込まれている、請求項4に記載の改変トハマ株。

請求項6

ptxオペロンのコピーは、推定アンモニウムトランスポーター偽遺伝子amtBと推定自己トランスポーター偽遺伝子との間に組み込まれている、請求項4又は5に記載の改変トハマ株。

請求項7

組み込まれたptxオペロンのコピーは、ptx−ptlオペロンプロモーターの制御下にある、請求項4〜6のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項8

ptlオペロンの更なるコピーを含まない、請求項4〜7のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項9

改変ptxオペロンの一を超えるコピーが挿入された、請求項4〜8のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項10

ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするprn遺伝子のコピーを組み込むことによって更に改変されており、こうして改変されたトハマ株は、トハマ染色体内に離れて位置する2種のprn遺伝子を有するが、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおらず、1種のprn遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項11

挿入されたprn遺伝子は、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に配置されている、請求項10に記載の改変トハマ株。

請求項12

prn遺伝子のコピーは、疑似推定グルタチオンS−トランスフェラーゼ遺伝子と疑似推定アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子との間に組み込まれている、請求項10又は11に記載の改変トハマ株。

請求項13

prn遺伝子のコピーは、prnプロモーターの制御下にある、請求項10〜12のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項14

prn遺伝子の一を超えるコピーが挿入された、請求項10〜13のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項15

少なくとも2種の改変ptxオペロンと少なくとも2種のprn遺伝子を含む、請求項10〜14のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項16

野生型トハマ株の機能性遺伝子は、除去、置換又は不活性化されていない、請求項1〜15のいずれか1項に記載の改変トハマ株。

請求項17

改変ボルデテラ・パータシス株を製造する方法であって、トハマと命名され、ATCC寄託番号BAA−589を有するB.パータシス株内の触媒サブユニットS1遺伝子を変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むS1遺伝子で置換する段階を含む方法において、ベクターpSS4245を用いて未改変S1遺伝子を改変S1遺伝子で置換することによって、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずに改変遺伝子を組み込み、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる株を得る方法。

請求項18

ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にptxオペロンのコピーを組み込む段階を更に含み、組み込まれたptxオペロンは、変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むように改変されたS1遺伝子とS2〜S5遺伝子のセットを含んでおり、これによって、トハマ染色体内に離れて位置する2種のptxオペロンを有し、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない改変トハマ株を製造し、該改変トハマ株は、1種のptxオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができる、請求項17に記載の方法。

請求項19

ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするprn遺伝子のコピーを組み込む段階を更に含み、これによって、トハマ染色体内に離れて位置する2種のprn遺伝子を有し、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない改変トハマ株を製造し、該改変トハマ株は、1種のprn遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる、請求項17又は18に記載の方法。

請求項20

改変トハマ株の染色体にptlオペロンのコピーを組み込む段階を含まず、改変トハマ株は単一ptlオペロンのみを含む、請求項17〜19のいずれか1項に記載の方法。

請求項21

野生型トハマ株の機能性遺伝子を除去、置換又は不活性化しない、請求項17〜20のいずれか1項に記載の方法。

請求項22

ptxオペロン及び/又はprn遺伝子を非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込む、請求項18〜21のいずれか1項に記載の方法。

請求項23

ptxオペロンのコピーを、推定アンモニウムトランスポーター偽遺伝子amtBと推定自己トランスポーター偽遺伝子との間に組み込む、請求項18〜22のいずれか1項に記載の方法。

請求項24

組み込まれたptxオペロンのコピーは、ptx−ptlオペロンプロモーターの制御下にある、請求項18〜23のいずれか1項に記載の方法。

請求項25

prn遺伝子のコピーを、疑似推定グルタチオンS−トランスフェラーゼ遺伝子と疑似推定アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子との間に組み込む、請求項19〜24のいずれか1項に記載の方法。

請求項26

組み込まれたprn遺伝子のコピーは、prnプロモーターの制御下にある、請求項19〜25のいずれか1項に記載の方法。

請求項27

改変ptxオペロンのコピーとprn遺伝子のコピーをトハマ株の染色体に挿入する、請求項19〜26のいずれか1項に記載の方法。

請求項28

改変ptxオペロンの一を超えるコピーをトハマ株の染色体に挿入する、請求項18〜27のいずれか1項に記載の方法。

請求項29

prn遺伝子の一を超えるコピーをトハマ株の染色体に挿入する、請求項19〜28のいずれか1項に記載の方法。

請求項30

ボルデテラ・パータシス抗原を製造する方法であって、次の各段階:(i)請求項1〜16のいずれか1項に記載の遺伝子改変B.パータシス・トハマ株、又は請求項17〜29のいずれか1項に記載の方法に従って製造した遺伝子改変B.パータシス・トハマ株を培地内で培養し、該株内に存在する遺伝子によってコードされた無毒化百日咳毒素(rPT)、パータクチン及び繊維状ヘマグルチニン(FHA)を含む抗原を発現させる段階と、(ii)該抗原を回収する段階とを含む方法。

請求項31

抗原の少なくとも一部を培地から回収する、請求項30に記載の方法。

請求項32

凝集原2及び/又は3も発現させて回収する、請求項30又は31に記載の方法。

請求項33

請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法によって製造した抗原。

請求項34

対象において百日咳感染を予防するのに用いる、請求項33に記載の抗原。

請求項35

対象において百日咳感染を予防するための無細胞ワクチンを製造する方法における、請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法によって製造した抗原の使用。

請求項36

請求項30〜32のいずれか1項に記載の方法に従って製造した抗原を含む無細胞ワクチン。

請求項37

該抗原は、無毒化百日咳毒素及び/又はパータクチンである、請求項36に記載のワクチン。

請求項38

FHA、凝集原2及び/又は凝集原3を更に含む、請求項37に記載のワクチン。

請求項39

他の疾患、例えば、ジフテリア破傷風B型肝炎ポリオ及びヘモフィルスインフルエンザb菌の内の一以上の疾患を予防又は治療するための抗原を更に含む、請求項36〜38のいずれか1項に記載のワクチン。

技術分野

0001

本発明は、変異や更なる遺伝子のコピーを組込みむためにベクターSS4245を用い、トハマ(Tohama)と命名された親株由来する組換えボルデテラパータシス(Bordetella pertussis)株の構築に関する。

背景技術

0002

パータシス、即ち百日咳は、上気道のボルデテラ・パータシス感染に起因する重篤小児疾患である[1]。B.パータシスの死滅細胞で構成されたワクチンは数十年に亘って使用されている。該ワクチンは、ジフテリア破傷風・百日咳の三種混合ワクチンとして、或はB型肝炎ヘモフィルスインフルエンザ(Haemophilus influenzae)b菌侵襲性疾患に対する免疫をももたらす新たな混合ワクチンとして投与される[2]。該死滅全細胞に関連するエンドトキシンや他の菌体内毒素のレベルが高く、その安全性プロファイルに問題があるため、数か国では、全細胞ワクチンの使用が減少、抑制、更には禁止されている[3、4]。

0003

無細胞ワクチン(全細胞を含まず、ごく一部又は十分に精製された細菌抗原を含んでいる事実にちなんで命名)は、1981年に日本に導入された[5]。無細胞ワクチン中の抗原成分純度が高いことは、臨床安全性プロファイルが改善されていると解釈された。このようなワクチンは、その安全性や有効性が広範な実地試験立証された後、90年代半ばに先進工業国に導入された[6]。しかし、無細胞ワクチンのコストが著しく高いため、WHOによる予防接種拡大普及計画への広範な導入は妨げられた。

0004

B.パータシスの主な病原性因子百日咳毒素(PT)であり[7、8]、百日咳トキソイド(PTd)は無細胞ワクチン中の主な抗原である[8]。ホルムアルデヒドによる簡単な処理で不活性化することができるジフテリア毒素破傷風毒素とは異なり、PTは、化学的手段で不活性化することが困難であることが分かっている[9]。現在、商業生産には様々な不活性化プロセスが用いられている。全てのプロセスにおいては、化学処理に起因するPTの広範な変性が共通している。遺伝的に不活性化された毒素(rPT)を用いて2種の候補ワクチンが調査され[10〜12]、これらの候補の内の1種は実地での有効性試験に採り入れられている[11〜12]。

発明が解決しようとする課題

0005

しかし、rPTを含むワクチンはまだ使用されていない。

課題を解決するための手段

0006

本発明の第1の実施形態においては、遺伝子改変ボルデテラ・パータシス・トハマ株であって、ATCC寄託番号BAA−589を有するトハマ株の百日咳毒素S1遺伝子はArg9→Lys9及びGlu129→Gly129変異を有するが、該変異に起因する抗生物質耐性遺伝子は組み込まれていない改変トハマ株において、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる改変トハマ株を提供する。

0007

ベクターpSS4245を用いれば、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずにS1変異を導入することができる。

0008

改変株は、ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体非機能性領域にptxオペロンのコピーを組み込むことによって更に改変することができ、組み込まれたptxオペロンは、変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むように改変されたS1遺伝子とS2〜S5遺伝子のセットを含んでおり、こうして改変された株は、トハマ染色体内に離れて位置する2種のptxオペロンを有するが、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおらず、1種のptxオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができる。

0009

ptxオペロンのコピーは、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に組み込むことができる。

0010

ptxオペロンのコピーは、推定アンモニウムトランスポーター偽遺伝子amtBと推定自己トランスポーター偽遺伝子との間に組み込むことができる。

0011

組み込まれたptxオペロンのコピーは、ptx−ptlオペロンプロモーターの制御下とすることができる。

0012

該改変株にはptlオペロンの更なるコピーを組み込まないようにすることができる。

0013

該改変株には改変ptxオペロンの一を超えるコピーを挿入することができる。

0014

該改変株は、ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするprn遺伝子のコピーを組み込むことによって更に改変することができ、こうして改変されたトハマ株は、トハマ染色体内に離れて位置する2種のprn遺伝子を有するが、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでおらず、1種のprn遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる。

0015

挿入されたprn遺伝子は、非機能性偽遺伝子内又は非機能性偽遺伝子間に配置することができる。

0016

prn遺伝子のコピーは、疑似推定グルタチオンS−トランスフェラーゼ遺伝子と疑似推定アスパラギン酸ラセマーゼ遺伝子との間に組み込むことができる。

0017

prn遺伝子のコピーは、prnプロモーターの制御下とすることができる。

0018

該改変株にはprn遺伝子の一を超えるコピーを挿入することができ、少なくとも2種の改変ptxオペロンと少なくとも2種のprn遺伝子を含むことができる。

0019

野生型トハマ株の機能性遺伝子は、除去、置換又は不活性化されていないことが好ましい。

0020

本発明の第2の実施形態においては、改変B.パータシス株を製造する方法であって、トハマと命名され、ATCC寄託番号BAA−589を有するB.パータシス株内の触媒サブユニットS1遺伝子を変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むS1遺伝子で置換する段階を含む方法において、ベクターpSS4245を用いて未改変S1遺伝子を改変S1遺伝子で置換することによって、抗生物質耐性遺伝子を組み込まずに改変遺伝子を組み込み、無毒化百日咳毒素(rPT)を発現することができる株を得る方法を提供する。

0021

該方法は、ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にptxオペロンのコピーを組み込む段階を更に含むことができ、組み込まれたptxオペロンは、変異Arg9→Lys9及びGlu129→Gly129を含むように改変されたS1遺伝子とS2〜S5遺伝子のセットを含んでおり、これによって、トハマ染色体内に離れて位置する2種のptxオペロンを有し、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない改変トハマ株を製造し、該改変トハマ株は、1種のptxオペロンのみを有する株と比較して高いレベルの無毒化百日咳毒素を発現することができる。

0022

該方法は、ベクターpSS4245を用いて改変トハマ株の染色体の非機能性領域にパータクチンをコードするprn遺伝子のコピーを組み込む段階を更に含み、これによって、トハマ染色体内に離れて位置する2種のprn遺伝子を有し、抗生物質耐性遺伝子を組み込んでいない改変トハマ株を製造し、該改変トハマ株は、1種のprn遺伝子のみを有する株と比較して高いレベルのパータクチンを発現することができる。

0023

改変ptxオペロン及び/又はprn遺伝子の一を超えるコピーをトハマ株の染色体に挿入することができる。

0024

本発明の第3の実施形態においては、ボルデテラ・パータシス抗原を製造する方法であって、次の各段階:
上述の遺伝子改変B.パータシス・トハマ株を培地内で培養し、該株内に存在する遺伝子によってコードされた無毒化百日咳毒素(rPT)、パータクチン及び繊維状ヘマグルチニン(FHA)を含む抗原を発現させる段階と、該抗原を回収する段階とを含む方法を提供する。

0025

PT抗原及びFHA抗原は培地から回収することができるが、PRN抗原は、高温処理等の抽出手続きによって培地から一部、細胞から一部回収することができる。

0026

凝集原2及び/又は3も発現させて回収することができる。

0027

本発明の第4の実施形態においては、上述の方法によって製造した抗原を提供する。

0028

対象における百日咳感染の予防、特に、百日咳感染を予防するための無細胞ワクチンの製造に該抗原を用いることができる。

0029

本発明の第4の実施形態においては、上述のように製造された抗原を含む無細胞ワクチンを提供する。該抗原は、無毒化百日咳毒素及び/又はパータクチンとすることができる。該ワクチンは、FHA、凝集原2及び/又は凝集原3、及び/又は他の疾患、例えば、ジフテリア、破傷風、B型肝炎、ポリオ及びヘモフィルス・インフルエンザb菌の内の一以上の疾患を予防又は治療するための抗原を更に含むことができる。

図面の簡単な説明

0030

図1対立遺伝子交換ベクターpSS4245の概略構造
図2:対立遺伝子交換ベクターpSS4245に改変S1遺伝子を構築するためのベクター。A:S1フランキング領域間に挿入されたクロラムフェニコール耐性カセットでS1遺伝子を置換するための対立遺伝子交換要素。B:改変S1遺伝子をptx−ptlオペロン内の正確な位置に戻すための対立遺伝子交換要素。対立遺伝子交換を行うため、これらのベクターを直線化し、pSS4245に挿入した後、大腸菌SM10からの接合伝達によってB.パータシスに導入する。
図3:対立遺伝子交換手続き。A:クロラムフェニコール耐性マーカーによるS1遺伝子の置換につながる二重組換え事象。B:改変S1遺伝子の元の位置への再挿入につながる二重組換え事象。
図4:ptxオペロンの第2のコピーをB.パータシス染色体に挿入するためのベクター。A:ptxオペロンの第2のコピーの挿入部位は、各々が2種のフレームシフト変異を有する2種の放棄された遺伝子の間で選択した。B:クロラムフェニコールマーカー選択部位に挿入するのに用いた対立遺伝子交換要素。C:元のプロモーターを有するptxオペロンの概略構造。ptx−ptlターミネータークローン化し、S3遺伝子を超えた位置に挿入した。最終的にはこのクラスターをSS4245誘導体に組み込んでクロラムフェニコールマーカーを置換し、第2の対立遺伝子交換事象をもたらしてPT構造遺伝子の第2のコピーを挿入した。
図5:Bp−WWC及びBp−WWDにおけるR9K及びE129G変異の確認。PT構造クラスターの2種のコピーを有する株Bp−WWDに関する変異付近の生の配列データを示す。B.パータシス・トハマ(コンセンサス配列)と誘導体Bp−WWC及びBp−WWDに関する対応配列アラインメントを示す。
図6:prn遺伝子の第2のコピーをB.パータシス染色体に挿入するためのベクター。A:prn遺伝子の第2のコピーの挿入部位は、フレームシフト変異と欠失を有する2種の放棄された遺伝子の間で選択した。B:標的組み込み部位に隣接し、fhaプロモーターの制御下にあるprn遺伝子の概略構造。C:標的組み込み部位に隣接し、自身のプロモーターの制御下にあるprn遺伝子の概略構造。
図7CHO細胞クラスタリング試験。細胞をコンフルエント近くまで増殖した後、PTの希釈物を添加し、2日後にクラスタリングをスコア化した。A:800ngのPT(Bp−WWC株)。B:対照、PTの添加なし。C:検出閾値に相当する2.6pgの野生型PT(トハマ株)。D:43pgの野生型PT(トハマ株)。

実施例

0031

本明細書では、トハマと命名された親株に由来する組換えボルデテラ・パータシス株について記載する。この新しい株は、対立遺伝子交換ベクターpSS4245を用いた相同組換えによって得られる[41]。このベクターによって、如何なる副変異をも残さずに細菌染色体の一部の置換を行うことができる。

0032

PT、FHA及びパータクチン(PRN)の遺伝子はクローン化され、配列決定されている[35〜39]。百日咳毒素は、単一プロモーターから発現される5種の異なる構造遺伝子によってコードされる6種のポリペプチドサブユニットで構成された複合タンパク質である。百日咳毒素の酵素活性毒性活性の大部分は、サブユニットS1によって媒介されるが、その細胞結合特性分裂促進特性は、B−サブユニットを構成する他のサブユニットに起因する。

0033

第1の実施形態においては、PTサブユニットS1をコードするセグメントを置換し、毒性活性の不活性化を引き起こす2種の変異を導入した。第2の実施形態においては、プロモーターとptlターミネーターを有し、上述の変異を含むptx−ptlオペロンの5種のPT構造遺伝子のptxクラスターの第2のコピーを染色体の他の位置に挿入した。ptx−ptlオペロンに存在するptl補助遺伝子組織は改変しなかった。この株から産生するrPTの量は増加した。第3の実施形態においては、prn遺伝子の第2のコピーを染色体に挿入した。いずれの場合においても、放棄された遺伝子座を挿入部位として選択して不要な遺伝子変異の導入を回避し、抗原発現を自己プロモーターで駆動することによって、親トハマ株と同様の調節に付した。

0034

PT、ましてやPRNは高密度培養における制限抗原であるが、FHAは、このような条件下でB.パータシスによって天然過剰産生する。PRNは組換え大腸菌又はピキアパストリス(Pichia pastoris)から高収率で得ることができた[14、15]が、PTサブユニットのみは大腸菌で発現させることはできたものの、成熟毒素に会合させることができず、有望なワクチン候補として考えるには免疫原性が不十分であった[16]。成熟毒素の会合及び分泌には、後の段階で発見される、ptx−ptlオペロンのptlセクションの一部である数種の補助遺伝子が必要であることが現在では分かっている[17]。

0035

遺伝子コピー数の操作による産生増強によって細菌性毒素の産生が増強されることが報告されている[18、19](特にPTの場合[20])が、この場合、タンデムに反復されたマルチコピープラスミドベクター又は遺伝子を主に用いる。この結果、特に産生設定において、株の遺伝的安定性がもたらされることがある。例えば、マルチコピープラスミドベクターを用いてリー(Lee)ら[40]によって得られたB.パータシス株の場合、PT産生の増加は示されず、プラスミド再編成されたか、PTオペロンが欠失したか、又は接合完了体無毒相への変換を経た。

0036

B.パータシスで以前に用いられた対立遺伝子交換ベクターに反し、pSS4245の場合、染色体上では補助的変異(特に、以前の対立遺伝子交換手続きで必要とした自発性ストレプトマイシン耐性変異体の選択に起因するrpsLに影響を及ぼす変異)を必要としないか、或はそのような変異を残さない[22]。このようなハウスキーピング遺伝子に影響を及ぼす変異は、病原性を弱める、即ち、PTやFHA、PRN等の病原性因子の発現を弱めることがある。本発明の株は、他の抗原(特にFHA)のレベルを変えることなく、手な価格の無細胞百日咳ワクチンの製造に用いることができる。

0037

結果
B.パータシス染色体におけるS1遺伝子の変異
2種の変異R9K及びE129GをサブユニットS1に導入するため、2段階アプローチを利用し、これらの変異の1種の損失を引き起こし得る、2種の変異間領域における組換えの可能性を回避した。このアプローチにより、選択培地での簡易レプリカ平板法によって所望のコロニーを選択することができる。先ず、野生型S1遺伝子がクロラムフェニコール耐性遺伝子(CmR)(図2A)又は所望の変異を含む改変S1遺伝子(図2B)(いずれもS1上流域及び下流域の1.2〜1.5kBに隣接)で置換されたpBluescript IISK+中で2種の大腸菌ベクターを構築した。次に、これらのベクターを処理し、そのインサートをpSS4245に導入した。これらの誘導体を大腸菌SM10に導入し、B.パータシス株トハマへの接合伝達及び対立遺伝子交換を行った。プラスミドpSS5Cm3によって、S1遺伝子がCmRマーカーで置換された(図3A)。プラスミドpSS5S13−9K−129Gによって、S1遺伝子がその元の位置(この段階では2種の所望の変異を有する)に回復された(図3B)。選択培地で分離菌を選択した後、予想される位置でのCmR遺伝子と改変S1遺伝子の統合PCR増幅によって確認した(データは示さず)。予想される位置での変異S1遺伝子の組み込みは、S1遺伝子内部で上流5’及び3’下流フランキング領域に結合することが可能な所定のプライマーを用いたPCRで確認されたように明らかであった(データは示さず)。更なる同化のために選択されたクローンのS1遺伝子における変異は、DNA配列決定によって確認した。新しい株をBp−WWCと命名した。

0038

PT構造遺伝子の第2のセットのための第2の組み込み部位の挿入
B.パータシスに適合し得るマルチコピープラスミドに全ptx−ptlオペロンを挿入してPT発現を増加させる最初の試みにおいては、有用な株を送達することができなかったが、これは、PTの過剰発現が潜在的に有毒であり、生存可能な株を得るにはPT発現をある限界内にとどめる必要があることを示唆している。PT毒素の収率を高めるため、PT構造遺伝子の第2のセットをBp−WWC染色体に導入した。挿入標的部位を特定するため、B.パータシス・トハマゲノムの配列をスキャンし、多くの偽遺伝子を同定した。推定アンモニウムトランスポーター遺伝子と推定自己トランスポーター遺伝子との間のDNA配列を挿入用に選択した(posn.2,903,988〜2,905,228及び2,905,291〜2,908,277)。これらの遺伝子は各々、その機能性を損ねるフレームシフト変異を有する(図4A)。先のセクションで概説した一般的な戦略に従った。先ず、選択組み込み部位に隣接する領域内にCmR遺伝子を挿入して大腸菌ベクターpSKPD5Cm3を構築した(図4B)。対象となる配列をpSS4245に挿入した後、CmRマーカーによって対立遺伝子交換を選択した。設計位置でのCmR遺伝子の組み込みをPCRによって確認した(データは示さず)。第2のベクターにおいては、S3遺伝子を同一のフランキング領域内に挿入した後、5種のPT構造遺伝子S1〜S3をptxプロモーター及びptlターミネーターと共に挿入し、S1内に2種の変異を含むベクターpSKptxterを得た(図4C)。標的組み込み部位への対立遺伝子交換によって、PT構造遺伝子の機能性クラスターの第2のコピーがBp−WWC株に挿入された。新しい株をBp−WWDと命名した。組み込みの結果は、ptxオペロン内部で上流域又は下流域に結合しているプライマーを用いた増幅によって確認したが、これによって、組換えが生じた領域は破壊されずに、予想された組み込みが行われたことが分かった。

0039

S1遺伝子の配列決定とR9K及びE129G変異の確認
自動化配列決定を用いて所望の変異の存在を確認した。S1遺伝子の2種のコピーが組み込まれた株Bp−WWDの場合、PCR増幅によって、原理的には2種の遺伝子のコピーの混合物が得られる。インサートの内の1種における予期しない点変異が、対応する位置における二重ヌクレオチド割り当てとして出現し得る。R9K及びE129G位置における蛍光シグナル単一ピークはBp−WWC上の正しい配列を示しており、該ピークから、Bp−WWD内のS1の2種のコピーが同一の変異を有していることが分かった。2種の所望な変異付近の配列を図5に示す。図5には、株Bp−WWDの配列決定記録と野生型トハマ、Bp−WWC及びBp−WWDの配列アラインメントが示されている。

0040

PRN遺伝子の第2のコピーのBp−WWD株への挿入
PRN産生が制限されているため、fhaプロモーターと自身のターミネーターの制御下にあるprn構造遺伝子の第2のコピーをBp−WWD染色体内の2種の偽遺伝子間、即ち、推定グルタチオンS−トランスフェラーゼ偽遺伝子と推定アスパラギン酸ラセマーゼ偽遺伝子との間に挿入した(図6A)。CmR遺伝子が選択挿入部位に隣接する上流域と下流域との間に挿入されたpSKPD2Cm3大腸菌ベクターを構築した。FHAプロモーターの制御下で同様のフランキング領域とprn遺伝子を用いて他のベクターを構築した(図6B)。所望の位置にCmRマーカーを挿入した後、通常の対立遺伝子交換選択及びスクリーニング手続きを用いてCmR遺伝子をprn機能性ブロックで置換した。

0041

この構築物から単離されたB.パータシス株はPRNを発現せず、他の抗原のレベルは最終的には検出不可能であった。強いFHAプロモーターの制御下で過剰産生し、PRN産生能力を失ったエスケープ変異体のみ又は全ての病原性因子が生存可能である場合にはPRN産物が有毒であることが暫定的に結論付けられた。従って、fhaプロモーターの代わりに天然prnプロモーターを導入することが決定された。pSKPD25FpPRN3を用いてFHAプロモーターを元のPRNプロモーターで置換し、自身の天然プロモーターとターミネーターを有する機能性ブロックを得た(図6C)。通常の対立遺伝子交換手続きによってこの機能性ブロックを選択部位で挿入し、自身のプロモーターの制御下にあるprn遺伝子の第2の非タンデム反復コピーを有する株を得た。予想される挿入の確認は、prn遺伝子内部でフランキング領域に結合しているプライマーを用いたPCR増幅によって行った。この株は通常は生存可能であり、Bp−WWEと命名した。

0042

PT及びPRN構築物の遺伝的安定性
株Bp−WWEを培養し、MSS培地で連続的に継代培養して計50世代程度とした。最終培養物希釈し、MSS−寒天播種した。30個の単離コロニーランダム採取した。PCRによって30個のコロニーのS1遺伝子及びprn遺伝子について解析した(データは示さず)。その結果、全てのコロニーは、予想された位置にS1遺伝子とprn遺伝子の2種のコピーを含んでいることが分かった。

0043

振盪フラスコ内でのPT及びFHAの発現
振盪フラスコ培養におけるPT及びFHAの産生をELISAによって解析した。振盪フラスコ培養は全て、ヘプタキス(2,6−O−ジメチル)−β−シクロデキストリンを含む変法スタイナー−ショルテ培地(MSS)で行った[23、24]。株Bp−WWC及びBp−WWDの結果を表1及び表2に示す。Bp−WWCや野生株トハマと比べて株Bp−WWDにおけるPTの産生は約2倍であったが、これは、構造遺伝子クラスターのコピー数発現レベルとの予想された相関性を示している。

0044

表1:トハマ株、Bp−WWC株及びBp−WWD株によるPT産生。細胞の増殖は、振盪フラスコを用い、MSS培地中で48時間(実験番号1)又は20〜24時間(実験番号2)行った。2個の別々のフラスコにおける結果を実験番号2に示す。遠心分離によって回収した後、上清アッセイは、ウサギポリクローナル抗体を用いた直接ELISA(実験番号1)、又はウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬として用い、S2特異的モノクローナル抗体アブカム)を検出に用いたサンドイッチELISAによって行った。

0045

0046

表2:Bp−WWC株、Bp−WWD株及びBp−WWE株によるPT及びFHA産生。細胞の増殖は、振盪フラスコを用い、MSS培地中で24時間又は36時間行った。遠心分離によって回収した後、PT及びFHAに関する上清のアッセイは、ウサギポリクローナル抗体を捕捉試薬として用い、S2特異的モノクローナル抗体(アブカム)又はFHAモノクローナル試薬(NIBSC)を検出に用いたサンドイッチELISAによって行った。

0047

0048

振盪フラスコ内でのPRNの発現
MSS培地中で増殖したBp−WWC、Bp−WWD及びBp−WWEの振盪フラスコ培養におけるPRNの産生。PRNのその膜結合型前駆体からの遊離は、未確認プロテアーゼによる不正確な切断の結果である[25]ため、PRN発現をウェスタンブロット濃度測定解析によって確認し、抗原の完全性についても評価した。高密度発酵槽培養においては、PRNの大部分が膜結合型前駆体から培養上清自発的に遊離される(未発表所見)ことも分かった。従って、導入された遺伝子改変によってこの特性が改変されるかどうか調べた。PRNのアッセイは、清澄化した培養上清及び分離細胞の60℃抽出物に対して行った。結果を表3に示す。Bp−WWC及びBp−WWDにおけるPRN毒素の量は同等であった。Bp−WWEにおいては2倍に増加したことが分かったが、これも、遺伝子コピー数と発現レベルとの良好な相関性を示している。これらのフラスコ培養においては、培養上清中に存在するPRNの割合は小さいままか又は無視できるレベルであったが、Bp−WWEの場合には上清中のPRNの割合も増加した。

0049

表3:Bp−WWC株、Bp−WWD株及びBp−WWE株によるPRN産生。細胞の増殖は、振盪フラスコ中で48時間行った。遠心分離によって上清と細胞を分離した。細胞を元の培養体積の抽出バッファーに懸濁させ、30分間で60℃まで加熱した後、再度遠心分離を行って抽出物を採取した。PRNのアッセイはウェスタンブロットによって両方の画分で行った。

0050

0051

これら全てのフラスコ培養におけるPRNのレベルは、同様の条件下でのPTやFHAの濃度よりも十分に低かった。PRNはPTに比べて効率良く産生しないが、この結果は、高密度発酵槽培養で一般に得られている知見を反映していない。この相違は、次の事実、即ち、PRNが細胞表面タンパク質である一方、PTやFHAは振盪フラスコ内で必然的に分泌され、増殖時間は細胞溶解や抗原分解を回避するために制限されるため、バイオマス増殖時間は24〜36時間に制限され、培養物は最大OD650が1〜1.5に達することがあり、これによってPRNの主要源が制限されるという事実によって説明される。

0052

PT不活性化の評価
培養上清からのPTの精製は、オッセンギス(Ozcengiz)のプロセス[26]の変法、即ち、最初の硫酸アンモニウム沈殿リガンド交換クロマトグラフィー代用する[27、28]方法で行った。野生型B.パータシス及びBp−WWC(遺伝的に不活性化したPT)由来のPT毒素の毒性を解析し、CHO細胞クラスタリング試験[29]によって比較した。この試験は、PTに関して報告された他の機能的アッセイに比べて感度が遥かに高い。B.パータシス・トハマ株から精製された天然毒素は、クラスタリング終点が2.6pg/ウェルであることが示された。遺伝的に不活性化されたPTは、この試験で得られた最高濃度(即ち、0.8〜1.6μg/サンプル)でもクラスタリングを促進しなかった(図7)。従って、PTの低溶解度による制限を考慮すると、この試験から、毒性が5×105〜106倍低下することが分かる。この結果から、PTサブユニットS1における2種のアミノ酸置換をもたらす5種のヌクレオチド置換によって、Bp−WWC由来のPT毒素がうまく不活性化されたことが分かる。

0053

考察
これらの実験における無標識遺伝子挿入及び置換は、B.パータシスにおいてベクターとしてpSS4245を用いることによって成功した。プラスミドの切除を引き起こす第2の相同組換えを行った後、cre−loxシステム[30]やボルデテラで用いる初期の対立遺伝子交換手続き[22]に対し、染色体内には抗菌性遺伝子マーカー瘢痕は残されていなかった。遺伝的に不活性化されたPT毒素の過剰産生は、ptx遺伝子のタンデム反復又はfha遺伝子へ挿入された他のコピーを用いて1992年に報告された[20]。得られた株によってPTが最大80mg/Lまで過剰産生した。タンデム反復遺伝子は、遺伝的不安定性の原因となり得ることが知られている。こうした理由で、B.パータシスのゲノム配列をスキャンして適切な組み込み部位を見出した。2種の偽遺伝子のターミネーター間のDNA位置をptxクラスターの組み込み部位として選択した。事前の試みによって示唆されているように、このような病原性因子の過剰産生は細胞代謝に負荷をかけ、その結果、増殖速度が低下し、最終的には遺伝的不安定性を招く場合があるため、PT構造クラスターのコピー数を2に制限した。

0054

本発明者らは、より高い発現を駆動するfhaプロモーターによるprn遺伝子の過剰発現がB.パータシス細胞に対して明らかに有害であり、より高いPT発現に関連する可能性があることを報告した。本発明者らの知見からは、PRNプロモーターをより強いプロモーターで置換することによるPRN発現の増加は確認されていなかった[21]。従って、天然PRNプロモーターの制御下で遺伝子コピー数を増加させるアプローチを選択した。第2の遺伝子コピーのfhaプロモーターを天然prnプロモーターで置換して、PRN遺伝子の第2のコピーを有し、その天然プロモーターが染色体上の他の位置に挿入された株を作出した。宿主細胞に対するPRNの毒性は大腸菌でも報告された[31]。次に、fhaプロモーターを天然prnプロモーターで置換して、得られた株は振盪フラスコ内で正常な増殖を示し、それに応じて2倍量のPRNが産生した。培養上清と細胞抽出物との間のPRNの分配は多少変化し、上清中の全PRNの割合は大きくなったが、振盪フラスコ内で上清中に自発的に遊離した量は最小限であった。

0055

グルタミン酸炭素源の代謝によるアンモニアの遊離に起因する急激なpH上昇や中毒のため、振盪フラスコ内での増殖は制限される[32]が、これによって、最適な発酵槽条件下で可能性のある株に関する有益な指標が得られる。PTの発現が増加する安定株(Bp−WWD)の構築、又は2種の制限抗原PT及びPRNの発現が増加する安定株(Bp−WWE)の構築が示された。Bp−WWDの場合、PTのみの産生が増強され、産生するPRNの量は不十分となり得るため、この場合には、組換え大腸菌又はピキア・パストリスでPRNを単独供給することが示されるであろう。Bp−WWEの場合、2種の抗原PTとPRNのレベルが同等に増加するため、これら2種の抗原のマッチング量は高密度培養においても得られることが予想され、これによって製造操作が簡略化される。

0056

結論
遺伝的に不活性化されたPTのS1::R9K−E129Gサブユニットを含むB.パータシス株を、如何なるマーカーや瘢痕も染色体内に残さずに構築した。染色体上の2種の偽遺伝子間にptx−ptlオペロンプロモーター及びptlターミネーターの制御下で5種の構造遺伝子(S1変異のptx)を組み込むことによって、振盪フラスコ内でPT毒素が2倍に増加したことが分かった。PTの不活性化はCHO細胞クラスタリングアッセイによって確認した。更に、染色体上の別の位置で他の偽遺伝子間にprn遺伝子の第2のコピーを組み込むことによってPRN産生が増加した。この株は振盪フラスコ継代培養において遺伝的に安定であることが見出され、大規模な(>1000L)発酵に必要とされるよりも多い世代数再現された。これらの株(特に、PT及びPRN抗原の相対量がワクチンの組成マッチするBp−WWE)は、手頃な価格の無細胞百日咳ワクチンの製造を可能にする上で有用であることが示されたが、これは、十分な免疫原性のために天然抗原が必要とする用量が低下し、2種の制限抗原PT及びPRNに対する株の生産性が向上することによるコスト削減に寄与する。

0057

方法
細菌株、プラスミド及び培養条件
本研究に用いた化学物質及び試薬は全て、分子生物学グレード又は分析グレードであった。化学物質はメルク及びシグマから購入した。細菌培養培地はディフコ(米国)及びメルク(ドイツ)から入手した。制限酵素及び修飾酵素ニューイングランドバイオラボ(米国)から購入した。

0058

大腸菌DH5α(インビトロジェン、米国)をクローニング宿主として用いた。この株の増殖は、ルリア・ベルターニ培地(LB)中、37℃で行った。大腸菌DH5α形質転換体の増殖は、適切な抗生物質アンピシリン(50μg/mL)又はクロラムフェニコール(15μg/mL))を添加したLB中で行った。大腸菌SM10は、アール・S.スティビッツ(Earle S. Stibitz)博士(米国食品医薬品局生物製品評価研究センター、細菌、寄生虫及びアレルゲン製品部)から入手し、接合ドナー株として用いた。この株の増殖は、カナマイシン(50μg/mL)を添加したLB中、37℃で行った。大腸菌SM10形質転換体の増殖は、カナマイシン(50μg/mL)、アンピシリン(50μg/mL)及びネオマイシン(10μg/mL)を添加したLB中で行った。B.パータシス・トハマはATCCから入手し、ATCC寄託番号BAA−589を有する(ボルデテラ・パータシス・トハマPh.I染色体寄託番号NC_002929、EMBLジェンバンク寄託番号BX470248、ウェルカム・トラストサンガー研究所から入手可能な配列(http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/bordetella.html)[42])。

0059

B.パータシス株の増殖は、ボルデー−ジャング(BG)寒天培地又は変法スタイナー−ショルテ培地(MSS)にて35℃で行った。プラスミドpBluescript IISK+はストラタジーン(米国)から入手し、pSS4245はアール・S.スティビッツ博士から入手し、pACYC184はニュー・イングランド・バイオラボ(米国)から入手した。

0060

0061

S1フランキング領域のクローニング及びクロラムフェニコール遺伝子の挿入
B.パータシス株トハマの染色体DNAを原料として用いた。5’F−PT−SalI及び5’R−PT−MCSプライマーを用いたPCRによってS1遺伝子の上流域を増幅した。後者のプライマーは、KpnI、XbaI、BglII及びNotI部位を含む。増幅産物アガロースゲルから回収し、QIAEX II抽出キットキアゲン)によって精製した。1287bpの増幅産物をSalI及びNotIで消化し、同じ酵素で消化した大腸菌ベクターpSKΔKpnIにクローン化した。pSKΔKpnIは、KpnI部位が消化によって除去され、クレノウ酵素で埋められ、再環状化されたpBluescript II SK+の誘導体である。得られた構築物を熱ショックによって大腸菌DH5αのコンピテント細胞形質転換し、pSK5’と命名した。同様に、3’F−PTXbaI及び3’R−PT−BglIIプライマーを用いた増幅によって下流域を得た。1531bpの産物をXbaI及びBglIIで消化し、回収した断片を同じ酵素で消化したpSK5’に挿入し、pSK53を得た。

0062

プラスミドpACYC184からCmR遺伝子を得た。プライマーCmF−KpnI及びCmR−XbaIを用いて該遺伝子を増幅した。1295bpのPCR産物を精製し、KpnI及びXbaIで消化し、同じ酵素で切断したpSK53に挿入した。得られたプラスミドをpSK5Cm3と命名した。このプラスミドは、SI遺伝子の5’−上流域及び3’−下流域に隣接するクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む(図2A)。

0063

相同組換えによるSI遺伝子の交換
B.パータシスへの対立遺伝子交換を行うため、新しく開発したベクターpSS4245(図1)を用いた。このベクターに関する完全な記載はまだ公表されていないため、その構造の概略を本明細書にて報告する。このベクターは、ボルデテラ種における対立遺伝子交換のために特異的に設計された。対象となる遺伝子やその染色体上のフランキング配列を挿入することができるマルチリンカークローニング部位を含み、大腸菌内でベクターやその誘導体を選択するのに用いる数種の抗生物質(アンピシリン等)耐性遺伝子を含む。複製開始点pBR322に由来するが、これは、該ベクターが大腸菌内では複製可能であるが、B.パータシス内では自殺することを意味する。Tn5に由来するストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子も存在し、この遺伝子は、B.パータシスに対してはストレプトマイシン耐性をもたらすが、大腸菌にはもたらさない[33]。大腸菌ドナーとB.パータシスレピエントとの間の接合伝達は、プラスミドRP4由来の伝達起点の存在によって生じ得る。これには、ドナー株として大腸菌SM10を用いることが必要であり、RP4由来の必要な接合機能トランスに(in trans)もたらす[22]。接合は、レシピエントであるB.パータシスとドナーである大腸菌を、これら2種の細菌の増殖をサポートする寒天プレート上で一緒画線することによってのみ生じる。ベクターはB.パータシス内では自殺するため、対象となる遺伝子に隣接する一領域における相同組換えによって全ベクターとそのStrRマーカーを組み込んだB.パータシス細胞に対してストレプトマイシンを選択し、それと同時に大腸菌ドナーを排除する。この共組み込みと排除を解決するため、ベクターの大部分は対象となる遺伝子を保存し、pSS4245はI−SceIメガヌクレアーゼ遺伝子と共に対応する切断部位を取り込む(図1)[34]。ヌクレアーゼをptx−ptlオペロンプロモーターの制御下に置く。B.パータシス染色体上には対応する切断部位が存在しない。融合体の選択は調節条件下で行う必要があるが、この場合、PTを含むB.パータシスの全ての病原性因子が抑制される。この条件は、接合プロセスで用いるMSS−寒天プレートに20mMのニコチン酸を添加することによって得られた。ニコチン酸を添加せずにMSS−寒天に接合完了体混合物を移すとptxプロモーター抑制が緩和されるため、I−SceIヌクレアーゼが発現する。これによって、組み込まれたベクターのヌクレアーゼ部位のレベルで細菌染色体内で二重鎖切断が生じる。この事象は修復されなければ致死的である。DNA損傷も修復に向けたSOS応答活性化し、組換え頻度は2〜3ログで増加し、損傷は第2の相同組換えによって最終的には排除される[34]。いずれの場合においても、ベクターの大部分を損失する。第2の組換えが同じフランキング領域内で生じた場合には元の株が再生し、他のフランキング領域内で生じた場合には所望の株が得られる。略同じサイズのフランキング領域と同様に、クロラムフェニコール耐性状態についてスクリーニングする必要のあるコロニーは少数であり、得られる2種類の株、即ち、親株と組換え株は略同等に分布する。

0064

プラスミドpSK5Cm3をSacI及びBglIIで消化し、回収した断片をSacI及びBamHIで切断したpSS4245に連結させた。大腸菌SM10に形質転換した後、得られたプラスミドをpSS5Cm3と命名した。B.パータシス株トハマの新鮮な培養物(ニコチン酸(20mM)を添加したMSS−寒天にて4日間)とベクター含有大腸菌SM10の新鮮な培養物(アンピシリン、カナマイシン及びクロラムフェニコールを添加したLB−寒天にて一晩)を擦り取り、ニコチン酸(20mM)及びMgCl2(10mM)を添加したLB:MSS(1:1)を含む寒天プレート上で混合した。35℃で3時間経過させた後、ニコチン酸(20mM)、ストレプトマイシン(50μg/mL)及びクロラムフェニコール(5μg/mL)を添加したMSSに混合物を塗布した。クロラムフェニコール(5μg/mL)を添加したMSS−寒天上にスワブ増殖物を画線し、第2の組換え事象に備えた。得られた単一コロニーをレプリカ平板法で試験し、SmS及びCmR表現型を有する少数のコロニーを保持して更なる試験に備えた(図3A)。B.パータシス特異的プライマーを用いたPCR増幅によって、コロニーがB.パータシスであることを確認した。CmR遺伝子が設計位置で組み込まれたことの確認は、CmR遺伝子の内部で上流5’フランキング領域に特異的に結合するプライマー(5’F−int及び5’RCM−intプライマー)及び3’下流フランキング領域に特異的に結合するプライマー(3’FCM−int及び3’R−intプライマー)を用いたPCRによって行った。PCR解析から、5’及び3’フランキング領域が存在し、CmR遺伝子がS1遺伝子の代わりに予想された位置で挿入されたことが確認された。また、これらの確認によって、対立遺伝子交換プロセスは、組換えが生じたS1フランキング領域内で如何なる変化も引き起こさなかったことも分かった。

0065

改変S1遺伝子の構築
S1遺伝子をPCR増幅によってクローン化し、部位特異的PCR変異誘発によって変異させた。プライマーS1F−PT−KpnI及びS1R−PTXbaIを用いて染色体DNA由来の遺伝子を増幅した。精製したPCR産物をXbaI及びKpnIで消化し、回収した908bpの断片を同じ酵素で切断したpSK53に連結させた。形質転換及びコロニー選択後、得られたプラスミドをpSK5S13と命名した。

0066

部位特異的PCR変異誘発には、配列ミスマッチCGC→AAGを有する内部F−R9K及びR−R9Kプライマーを用い、R9K置換を引き起こした。これらのプライマーは別々の反応サイクルで用いた。次に、増幅産物を混合し、アニーリング後に増幅を4〜5サイクル継続させた。次に、外側プライマーを反応に添加して所望の変異を含む全S1断片を得た。同様の手続きを行い、内部ミスマッチプライマーF−E129G及びR−E129Gを用いて第2の変異をもたらし、配列GAA→GGGを得て、E129G置換を引き起こした。

0067

得られた断片をXbaI及びKpnIで消化し、同じ酵素で切断したpSK53に挿入し、プラスミドpSK5S13−9K−129Gを得た(図2B)。これをSacI及びBglIIで消化し、回収した断片をSacI及びBamHIで切断したpSS4245に連結させた。大腸菌SM10に形質転換した後、得られたプラスミドをpSS5S13−9K−129Gと命名した。

0068

改変S1遺伝子をB.パータシス染色体内の元の位置に戻すための対立遺伝子交換を上述のように行ったが、クロラムフェニコールによる接合完了体の選択は行わなかった。この場合、所望の株は該マーカーを損失したため、所望の表現型CmS及びSmSを有するコロニーを特定するのにレプリカ平板法によるスクリーニングが必要であった。得られたトハマ誘導体をBp−WWCと命名した(図3B)。設計位置でのS1変異遺伝子の組み込みは、所定のプライマーを用いたPCRによって確認した。該プライマーは、S1遺伝子内部で上流5’フランキング領域に結合することができ(5’F−int及びR−R9Kプライマー)、3’下流フランキング領域を結合することができた(F−E129G及び3’R−intプライマー)。

0069

5種のPT構造遺伝子の第2のセットの挿入
先ず、標的挿入部位に隣接する配列(図4A)をクローン化してpSKPD5Cm3を得た。上流の1688bpの断片をプライマー5’F−PD−ApaI及び5’R−PD−MCSで増幅し、ApaI及びKpnIで消化し、同じ酵素で切断したpSK5Cm3に連結させてpSKPD5’−Cmを得た。下流の2980bpの断片をプライマー3’F−PD−MCS及び3’R−PD−BglIIで増幅し、XbaI及びBglIIで消化し、同じ酵素で切断したpSKPD5’−Cmに連結させた。得られたプラスミドをpSKPD5Cm3と命名した(図4B)。

0070

このプラスミドをNotI及びBglIIで消化し、NotI及びBamHIで消化したpSS4245に連結させて接合構築物を得た。得られたプラスミドをpSSPD53−Cmと命名した。SmS及びCmRについての接合伝達及び選択によって所望のB.パータシス誘導体Bp−PD53−Cmが得られたが、無傷の上流、下流及びCmRインサートの存在をPCR増幅によって確認した。該プライマーは、CmR遺伝子内部で上流5’フランキング領域に結合することができ(5’FPD−int及び5’RCM−intプライマー)、3’下流フランキング領域に結合することができた(3’FCM−int及び3’RPD−intプライマー)。

0071

S3遺伝子に隣接するptx−ptlターミネーターを挿入して、プロモーターを有するptxオペロンの機能性コピーを得た。プライマーPtxF−BamHI及びPtxR−MCSを用いて、オペロンプロモーターを有するPTの5種の構造遺伝子(改変S1、S2、S4、S5及びS3)をBp−WWCDNAから増幅した。3469bpの増幅産物をBamHI及びSpeIで消化し、回収した断片を同じ酵素で切断したpSKΔRIに連結させてpSKptxを得た。pSKΔRIは、EcoRI部位が消化によって除去され、クレノウ酵素で埋められ、再環状化されたpBluescript II SK+のバリアントである。

0072

次に、ptx−ptlオペロンターミネーターをTerF−EcoRI及びTerR−SpeIプライマーで増幅した。223bpの産物をEcoRI及びSpeIで二重消化し、同じ酵素で切断したpSKptxに連結させた。形質転換及びコロニー選択後、得られたプラスミドをpSKptxterと命名した(図4C)。次に、このプラスミドをBamHI及びSpeIで二重消化し、同じ酵素で切断したpSSPD5Cm3に連結させて接合ベクターpSSPDptxterを得た。SmS及びCmSコロニーに対するレプリカスクリーニングを用い、Bp−PD53Cmへの対立遺伝子交換を上述のように行ってBp−WWDと命名された株を得た。設計位置でのS1変異遺伝子の組み込みは、所定のプライマーを用いたPCRによって確認した。該プライマーは、S1遺伝子内部で上流5’フランキング領域に結合することができ(5’FPD−int及びR−R9Kプライマー)、3’下流フランキング領域を結合することができた(F−E129G及び3’RPD−intプライマー)。

0073

PRN構造遺伝子の第2のコピーの挿入
PRN構造遺伝子の第2のコピーを組み込むために選択した標的部位へのクロラムフェニコール耐性遺伝子の組み込み。
BamHI部位が欠如したpBluescriptSK+の誘導体の構築を、酵素による消化、クレノウ酵素による埋め込み及び連結によって行った。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、pSKΔH1と命名した。

0074

B.パータシス・トハマ株の配列をスキャンし、偽遺伝子を特定した。推定グルタチオンS−トランスフェラーゼ偽遺伝子と推定アスパラギン酸ラセマーゼ偽遺伝子との間のDNA配列を挿入部位として選択した(posn.1,344,710〜1,345,685及び1,345,693〜1,346,049)。これらの遺伝子はフレームシフト変異を有しており、機能的ではない(図6A)。

0075

SpeIを有するプライマー(5’F−PD2−SpeI)とBamHI及びNotI制限部位を含むマルチリンカーを有するプライマー(5’R−PD2−MCS)を用いて標的挿入部位に対する5’−上流域を増幅した。増幅産物をゲル電気泳動によって単離し、SpeI及びNotIで二重消化した。得られた断片を同じ酵素で消化したpSKΔH1の断片に連結させた。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、pSKPD25と命名した。XbaI制限部位を有するプライマー(3’F−PD2−XbaI)及びNotI制限部位を有するプライマー(3’R−PD2−NotI)を用いて3’−下流断片を同様に増幅した。同じ酵素で消化した後、得られた断片を同じ酵素で消化したpSKPD25の断片に連結させた。得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、pSKPD253と命名した。

0076

BamHI制限部位を有するプライマー(CmF−BamHI)及びXbaI制限部位を有するプライマー(CmR−XbaI)を用いたプラスミドpACYC184からのPCR増幅によってクロラムフェニコール耐性部位を得た。PCR産物をこれら2種の酵素で消化し、同じ酵素で切断したpSKPD253にクローン化した。連結後、得られたプラスミドを大腸菌に形質転換し、制限酵素解析によって確認し、pSKPD25Cm3と命名した。

0077

制限酵素マッピングによって確認した後、プラスミドをNotI及びSpeIで消化し、得られた断片を同じ酵素で二重消化したpSS4245に連結させた。得られたプラスミドをpSSP2D5Cm3と命名し、大腸菌SM10に形質転換した。

0078

Bp−WWDをレシピエントB.パータシス株として用いて上述のように接合を行い、CmR及びSmS単一コロニーを選択した。設計位置でのCmR遺伝子の組み込みは、CmR遺伝子内部で上流5’フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー(5’FPD2−int及び5’RCM−intプライマー)及び3’下流フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー(3’FCM−int及び3’RPD2−intプライマー)を用いたPCRによって確認した。

0079

fhaプロモーターの制御下でのprn遺伝子の組み込み
ATG開始コドン(F)で開始するプライマーとXbaI(R)制限部位を有するプライマーを用いてB.パータシスDNAからPRNの構造遺伝子を増幅した。コード領域及びターミネーターのみを含む2808bpの増幅産物を「A」テーリングプロトコルプロメガ)によって処理した。得られた断片をpGEM−Tイージーベクターにクローン化した。得られたpGEM−TPRNと命名されたプラスミドを制限酵素解析によって確認した。強いFHAプロモーターによって駆動されるPRN遺伝子の第2のコピーを得るための最初の検査において、FHAプロモーターをPCR増幅によってB.パータシスDNAから単離し、PRN遺伝子の前方に挿入した。BamHIを有するプライマー(FHAproF−BamHI)とNdeI−XbaIを含むポリリンカーを有するプライマー(FHAR−MCS)によってFHAプロモーターを増幅した。精製産物をBamHI及びXbaIで切断した後、回収したDNA断片を同じ酵素で切断したpSKPD253に連結させた。得られたpSKPD253Fpと命名されたプラスミドを制限酵素解析によって確認した。このプラスミドをNdeI及びXbaIで切断した後、PRNF−NdeI及びPRNR−XbaIプライマーによってpGEMTPRNから増幅し、同じ酵素で切断したprn遺伝子のPCR産物と連結させた。得られたプラスミドをpSKPD25FpPRN3と命名した(図6B)。このプラスミドをNotI及びSpeIで消化し、同じ酵素で消化したpSS4245に連結させることによって接合構築物を得た。得られたプラスミドをpSSPD2FpPRNと命名した。この構築物をBp−WWD染色体の選択位置で挿入し、上述の通常の対立遺伝子交換手続きとスクリーニングを用いて導入したクロラムフェニコール耐性マーカーを置換した。

0080

prnプロモーターの制御下でのprn遺伝子の発現
制限部位BamHIを有するプライマー(PrnProF−BamHI)及び制限部位NdeIを有するプライマー(PRNProR−NdeI)を用いたB.パータシスDNAのPCR増幅によってPRNプロモーターをクローン化した。プラスミドpSKPD25FpPRN3をBamHI及びNdeIで切断し、FHAプロモーターを損失した断片を得た。PRNプロモーターをその場所に連結させた。大腸菌に形質転換し、制限酵素解析によって確認した後、得られたプラスミドをpSKPD25PRN3と命名した(図6C)。該プラスミドをNotIで切断し、同じ酵素で切断したpSS4245に挿入した。得られた構築物のpSSPD2prnを大腸菌SM10に導入し、対立遺伝子交換を行った。得られたB.パータシス株をBp−WWEと命名した。設計位置でのprn遺伝子の組み込みの確認は、prn遺伝子内部で上流5’フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー(5’FPD2−int及びPRNProR−NdeIプライマー)及び3’下流フランキング領域のみに特異的に結合するプライマー(PRNF−int及び3’RPD2−intプライマー)を用いたPCRによって行った。

0081

振盪フラスコ培養におけるPT、FHA及びPRNの発現
振盪フラスコ中、メチル化β−シクロデキストリンを添加したMSS培地(100mL)を用い、35℃、200rpmでBp−WWC、Bp−WWD及びBp−WWEを増殖した。増殖を32〜48時間行った後、培養上清を採取し、ELISAによってアッセイしてPT及びFHAの発現レベルを定量化した。PRN発現をウェスタンブロット濃度測定解析によって確認し、抗原の完全性についても評価した。このアッセイは、清澄化した培養上清と等張バッファー中60℃で加熱して得た細胞抽出物との両方について行った。

0082

PT及びFHAに対するELISAアッセイ
PT又はFHAに対する精製ウサギポリクローナル抗体(1:1000、NLAC、タイ)を96ウェルプレート(NUNCマキシソープ)中、炭酸重炭酸バッファー(pH9.6)(100μL/ウェル)でコートし、4℃で一晩インキュベートした。リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4、0.1%ツイーン20含有)(PBST)で3回洗浄した後、3%ウシ血清アルブミン(BSA)含有PBST(100μL/ウェル)を用いてブロッキングを行い、その後、37℃で1時間インキュベートした。ブロッキングバッファー廃棄して洗浄を行った後、標準PT、FHA又はサンプルの希釈物を添加し、37℃で1時間インキュベートした。PBSTで3回洗浄した後、ブロッキングバッファーに溶解した抗PTサブユニットS2マウスモノクローナル抗体(1:30,000、アブカム、米国)又は抗FHAマウスモノクローナル抗体(1:10,000、NIBSC、英国)(100μL)を添加し、同様の条件下でインキュベートした。PBSTでウェルを3回洗浄した後、ウサギ抗マウス(H+L)IgG−HRP接合体(アブカム、米国)のブロッキングバッファー希釈物(1:10,000)(100μL)を二次抗体として用い、再度37℃で1時間インキュベートした。PSTで洗浄した後、3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン(KPL、米国)(100μL)を酵素基質として添加した。1N HCl(100μL/ウェル)によって呈色反応を終了させた。マイクロタイタープレートリーダーを用い、光学濃度を450nmで測定した。

0083

PRNに対するウェスタンブロットアッセイ
標準PRN及びサンプルの希釈物を10%SDS−PAGEゲルに溶解した後、半乾燥ブロッティングシステムを用いてPVDF膜に移した。PBSTに溶解した5%スキムミルクで膜を1時間ブロックした。このブロッキング溶液を廃棄した後、膜をブロッキングバッファーに溶解した抗PRNヒツジ血清(1:10,000、NIBSC、英国)(20mL)と共に1時間インキュベートし、その後、PBSTで3回洗浄した。次に、膜を同様の条件下でウサギ抗ヒツジIgG−HRP接合体(サンクルーズバイオテクノロジー、米国)(20mL)と共にインキュベートし、再度洗浄した。次に、膜を3,3’−ジアミノベンズアミジン色くなるまで浸漬した。脱イオン水で2〜3回すすいで反応を終了させた後、室温で乾燥させた。膜をスキャンし、画像ファイルに変換した。専用のソフトウェアを用いたサンプル及び基準バンドデンシトメトリー解析によってPRN濃度を求めた。

0084

遺伝的安定性
株の培養をMSS培地(100mL)中、35℃、200rpmで48時間行った後、培養物(0.1mL)をMSS(100mL)に導入し、同様の条件下でインキュベートした。この工程を更に4回繰り返した。各導入は10世代に相当する。培養物を希釈し、MSS寒天上に播種した。30個の単離コロニーをランダムに選択した。選択した30個のコロニーの内の2個をPCRによって解析し、予想されるPT及びPRNインサートの存在を検出した。

0085

CHO細胞クラスタリングアッセイ
チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞クラスタリング活性をヒュレット(Hewlett)らの方法[28]によって確認した。即ち、10%ウシ胎仔血清を添加したcRPMI1640培地中でCHO細胞を培養した。5%CO2雰囲気下、37℃で細胞をインキュベートした。培養した細胞をトリプシン処理し、cRPMI1640培地で2×104個/mLに調整し、96ウェルマイクロ培養プレートのウェルに供給した(200μL/ウェル)。試験サンプル及び基準PT毒素をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(pH7.4)にて10倍間隔で連続的に希釈し、希釈物(25μL)をウェルに添加した。同様の条件下で48時間インキュベートしてクラスタリングを最大限にした後、細胞をクリスタルバイオレットで染色し、写真撮影した。

0086

0087

参考文献
1. Mattoo S, Cherry JD: Clin Microbiol Rev 2005, 18:326-382.
2. Aristegui J, Usonis V, Coovadia H, Riedemann S, Win KM, Gatchalian S, Bock HL: Facilitating the WHO expanded program of immunization: the clinical profile of a combined diphtheria, tetanus, pertussis, hepatitis B and Haemophilus influenzae type b vaccine. Int J Infect Dis 2003, 7:143-151.
3. Miller DL, RossEM, Alderslade R, BellmanMH, Rawson NS: Pertussis immunisation and serious acute neurological illness in children. Br Med J (Clin Res Ed) 1981, 282:1595-1599.
4. Stuart-Harris C: Benefits and risks of immunization against pertussis. Dev Biol Stand 1979, 43:75-83.
5. Sato Y, Sato H: Development of acellular pertussis vaccines. Biologicals 1999, 27:61-69.
6. Brown B, Greco D, Mastrantonio P, Salmaso S, Wassilak S: Pertussis vaccine trials. Trial synopses. Dev Biol Stand 1997, 89:37-47.
7. Monack D, Munoz JJ, Peacock MG, Black WJ, Falkow S: Expression of pertussis toxin correlates with pathogenesis in Bordetella species. J Infect Dis 1989, 159:205-210.
8. Weiss AA, Hewlett EL: Virulence factors of Bordetella pertussis. Ann Rev Microbiol 1986, 40:661-686.
9. Munoz JJ, Arai H, Cole RL: Mouse-protecting and histamine-sensitizing activities of pertussigen and fimbrial hemagglutinin from Bordetella pertussis. Infect Immun 1981, 32:243-250.
10. LoosmoreSM, Zealey GR, BouxHA, Cockle SA, Radika K, Fahim RE, Zobrist GJ, Yacoob RK, Chong PC, YaoFL, et al.: Engineering of genetically detoxified pertussis toxin analogs for development of a recombinant whoopingcough vaccine. Infect Immun 1990, 58:3653-3662.
11. Nencioni L, Pizza M, Bugnoli M, De Magistris T, Di Tommaso A, Giovannoni F, Manetti R, Marsili I, Matteucci G, Nucci D, et al.: Characterization of genetically inactivated pertussis toxin mutants: candidates for a new vaccine against whooping cough. Infect Immun 1990, 58:1308-1315.
12. Pizza M, Covacci A, Bartoloni A, Perugini M, Nencioni L, De MagistrisMT, Villa L, Nucci D, Manetti R, Bugnoli M, et al.: Mutants of pertussis toxin suitable for vaccine development. Science 1989, 246:497-500.
13. Greco D, Salmaso S, Mastrantonio P, Giuliano M, TozziAE, Anemona A,Ciofi degli Atti ML, Giammanco A, Panei P, Blackwelder WC, et al: A controlled trial of two acellular vaccines and one whole-cell vaccine against pertussis. Progetto Pertosse Working Group. N Engl J Med 1996, 334:341-348.
14. Makoff AJ, Oxer MD, Ballantine SP, Fairweather NF, Charles IG: Protective surface antigen P69 of Bordetella pertussis: its characterization and very high level expression in Escherichia coli. Biotechnology (N Y) 1990, 8:1030-1033.
15. Romanos MA, Clare JJ, Beesley KM, Rayment FB, Ballantine SP, Makoff AJ, Dougan G, Fairweather NF, Charles IG: Recombinant Bordetella pertussis pertactin (P69) from the yeast Pichia pastoris: high-level production and immunological properties. Vaccine 1991, 9:901-906.
16. Nicosia A, Bartoloni A, Perugini M, Rappuoli R: Expression and immunological properties of the five subunits of pertussis toxin. Inf Immu. 1987, 55:963-967.
17. Kotob SI, Hausman SZ, Burns DL: Localization of the promoter of the ptl genes of Bordetella pertussis, which encode proteins essential for secretion of pertussis toxin. Infect Immun 1995, 63:3227-3230.
18. Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, Sreekrishna K, Romanos MA: High-level expression of tetanus toxin fragment C in Pichia pastoris strains containing multiple tandem integrations of the gene. Biotechnology (N Y) 1991, 9:455-460.
19. Rappuoli R: Isolation and characterization of Corynebacterium diphtheriae nontandem double lysogens hyperproducing CRM197. Appl Environ Microbiol 1983, 46:560-564.
20. Zealey GR, Loosmore SM, Yacoob RK, Cockle SA, Herbert AB, Miller LD, Mackay NJ, Klein MH: Construction of Bordetella pertussis strains that overproduce genetically inactivated pertussis toxin. Appl Environ Microbiol 1992, 58:208-214.
21. Loosmore SM, Yaacoob RK, Zealey GR, Jackson GED, Yang Y-P, Chong PS-C, Shortreed JM, Coleman DC, Cunningham JD, Gisonni L, Klein MH: Hybrid genes over-express pertactin from Bordetella pertussis. Vaccine 1995, 13:571-580.
22. Stibitz S: Use of conditionally counterselectable suicide vectors for allelic exchange. MethodsEnzymol 1994, 235:458-465.
23. Imaizumi A, Suzuki Y, Ono S, Sato H, Sato Y: Heptakis(2,6-O-dimethyl)b-cyclodetrin: a novel growth stimulant for Bordetella pertussis phase I. J. Clin. Microbiol. 1983, 17:781-786.
24. Imaizumi A, Suzuki Y, Ono S, Sato H, Sato Y: Effects of heptakis(2,6-O-dimethyl)b-cyclodextrin on the production of pertussis toxin by Bordetella pertussis. Inf. Immun. 1983, 41:1138-1143.
25. Capiau C, Carr SA, Hemling ME, Plainchamp D, Conrath K, Hauser P, Simoen E, Comberbach M, Roelants P, Desmons P, Permanne P, Petre JO: Purification, characterization, and immunological evaluation of the 69-kDa outer membrane protein of Bordetella pertussis. In:Proceedings of the sixth international symposium on pertussis, Manclark CR (ed., 1990. DHHS publication N° (FDA) 90-1164, pp7586.
26. Ozcengiz E, Kilinc K, Buyuktanir O, Gunalp A: Rapid purification of pertussis toxin (PT) and filamentous hemagglutinin (FHA) by cation-exchange chromatography. Vaccine 2004, 22:1570-1575.
27. Chong P, Jackson G,Cwyk W, Klein M: Simultaneous determination of Bordetella pertussis toxin and filamentous haemagglutinin concentrations by hydroxyapatite high-performance liquid chromatography. J Chromatogr 1990, 512:227-236.
28. Capiau C, Desmons P: Method for isolating and purifying Bordetella pertussis antigenic factors. US pat. 5,391,715.
29. Hewlett EL, Sauer KT, Myers GA, Cowell JL, Guerrant RL: Induction of a novel morphological response in Chinese hamster ovary cells by pertussis toxin. Infect Immun 1983, 40:1198-1203.
30. Sauer B: Functional expression of the cre-lox site-specific recombination system in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 1987, 7:2087-2096.
31. Charles I, Fairweather N, Pickard D, Beesley J, Anderson R, Dougan G, Roberts M: Expression of the Bordetella pertussis P.69 pertactin adhesin in Escherichia coli: fate of the carboxy-terminal domain. Microbiology 1994, 140 ( Pt 12):3301-3308.
32. FrohlichBT, De Bernardez CmarkER, Siber GR, Swartz RW: Improved pertussis toxin production by Bordetella pertussis through adjusting the growth medium's ionic composition. J Biotechnol 1995, 39:205-219.
33. O'Neill EA, KielyGM, Bender RA: Transposon Tn5 encodes streptomycin resistance in nonenteric bacteria. J Bacteriol 1984, 159:388-389.
34. Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR: Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Res 1999, 27:4409-4415.
35. Nicosia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 4631 [1986].
36. Loosmore et al., Nucl. Acids Res. 17, 8365 [1989].
37. Relman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2637 [1989].
38. Charles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 3554 [1989].
39. Glaser et al., Molec. Microbiol. 2, 19 [1988].
40. Lee et al., 1989, Infect. Immun. 57: 1413-1418.
41. Inatsuka CS, et al., Pertactin is required for Bordetella to resist neutrophil-mediated clearance Infect. Immun. 2010, doi:10.1128/IAI.00188-10.
42. Parkhill et al., Comparative analysis of the genome sequences of Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis and Bordetella bronchiseptica. Nature Genetics (2003) 35 32-40.

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 国立大学法人北海道大学の「 メラノーマのがん治療耐性を判定する方法」が 公開されました。( 2021/03/18)

    【課題】 本発明は、がん治療耐性を有するメラノーマを判別することにより、効果的なメラノーマの治療を実現することを目的とする。【解決手段】 本発明は、IL-34タンパク質又はこれをコードするmRNA... 詳細

  • 国立大学法人京都大学の「 低抗原性細胞の製造方法」が 公開されました。( 2021/03/18)

    【課題・解決手段】レシピエントに他家移植した場合の拒絶反応が低減された低抗原性細胞を、ドナー細胞から製造する製造方法であって、前記ドナー細胞及び前記レシピエントのHuman Leukocyte A... 詳細

  • 第一三共株式会社の「 KLK5阻害ペプチド」が 公開されました。( 2021/03/18)

    【課題・解決手段】新規ペプチドを提供すること配列番号61で示されるアミノ酸配列を含み、且つ、プロテアーゼを阻害するペプチド。... 詳細

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ