図面 (/)

技術 二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体

出願人 ロシュグリクアートアーゲー
発明者 ホッセ,ラルフクライン,クリスティアンメスナー,エッケハルトシャンツァー,ユルゲンミヒャエルシャオ,ツイインシー,レイウマーニャ,パブロワン,ポンヴァルタ,カタリーナ
出願日 2012年9月14日 (8年3ヶ月経過) 出願番号 2014-531183
公開日 2015年1月29日 (5年10ヶ月経過) 公開番号 2015-502739
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 突然変異または遺伝子工学 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード 水平チャネル 色素前駆物 垂直チャネル 固定バッファ LSデータ 異なるサイクル 治療薬品 バルク効果
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年1月29日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (3)

課題・解決手段

本発明は、二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体、その産生方法、前記抗体を含有する薬学的組成物及びこれらの使用に関する。

概要

背景

Lu,D.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications 318(2004)507〜513;J.Biol.Chem.、279(2004)2856〜2865;及びJ.Biol Chem.280(2005)19665〜19672は、ヒトEGFR及びヒトIGF−1Rに対する二重特異性抗体に関する。

国際公開第2010/034441号は、<IGF−1R>HUMABクローン及びヒト化<EGFR>ICR62(配列番号1〜16(下に収載))の配列に基づく、ヒトEGFR及びヒトIGF−1Rに対する二重特異性抗体に関する。

概要

本発明は、二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体、その産生方法、前記抗体を含有する薬学的組成物及びこれらの使用に関する。

目的

本明細書における用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列由来する可変及び定常領域を有する抗体を包含することを目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
2件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位と、ヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメインと、配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインとに基づく改変された抗原結合部位であり、改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、二重特異性抗体。

請求項2

ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位と、ヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体において、i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、ii)a)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号17のCDR1、配列番号18のCDR2及び配列番号19のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号20のCDR1、配列番号21のCDR2及び配列番号22のCDR3を含む、b)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号25のCDR1、配列番号26のCDR2及び配列番号27のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号28のCDR1、配列番号29のCDR2及び配列番号30のCDR3を含む、c)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号36のCDR1、配列番号37のCDR2及び配列番号38のCDR3を含む、d)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号41のCDR1、配列番号42のCDR2及び配列番号43のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号44のCDR1、配列番号45のCDR2及び配列番号46のCDR3を含む、又はe)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号49のCDR1、配列番号50のCDR2及び配列番号51のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号52のCDR1、配列番号53のCDR2及び配列番号54のCDR3を含む、ことを特徴とする二重特異性抗体。

請求項3

i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、ii)a)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む、b)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む、c)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む、d)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む、又はe)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む、ことを特徴とする、請求項1又は2に記載の二重特異性抗体。

請求項4

前記抗体が、二価三価又は四価であることを特徴とする、請求項1から3の何れか一項に記載の二重特異性抗体。

請求項5

前記抗体が、Asn297において糖鎖を付加され、前記糖鎖内のフコースの量が、65%以下であることを特徴とする、請求項1から4の何れか一項に記載の二重特異性抗体。

請求項6

請求項1から5に記載の二重特異性抗体を含む薬学的製剤

請求項7

癌の治療において使用するための請求項1から5の何れか一項に記載の二重特異性抗体。

請求項8

癌の治療のための医薬の製造のための、請求項1から5に記載の二重特異性抗体の使用。

請求項9

請求項1から5に記載の二重特異性抗体を、そのような治療を必要とする患者投与することによる、癌を患う患者の治療方法

請求項10

請求項1から5に記載の二重特異性抗体をコードする核酸

請求項11

請求項1から5に記載の二重特異性抗体の宿主細胞中での発現のための、請求項10に記載の核酸を含むことを特徴とする発現ベクター

請求項12

請求項11に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。

請求項13

請求項1から5に記載の二重特異性抗体を産生するための方法において、請求項10に記載の核酸を宿主細胞中で発現させることと、前記細胞又は細胞培養物上清から前記二重特異性抗体を回収することを特徴とする方法。

技術分野

0001

本発明は、二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体、その産生方法、前記抗体を含む薬学的組成物及びそれらの使用に関する。

背景技術

0002

Lu,D.ら、Biochemical and Biophysical Research Communications 318(2004)507〜513;J.Biol.Chem.、279(2004)2856〜2865;及びJ.Biol Chem.280(2005)19665〜19672は、ヒトEGFR及びヒトIGF−1Rに対する二重特異性抗体に関する。

0003

国際公開第2010/034441号は、<IGF−1R>HUMABクローン及びヒト化<EGFR>ICR62(配列番号1〜16(下に収載))の配列に基づく、ヒトEGFR及びヒトIGF−1Rに対する二重特異性抗体に関する。

0004

本発明の一態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメインと、配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインとに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。

0005

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号17のCDR1、配列番号18のCDR2及び配列番号19のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号20のCDR1、配列番号21のCDR2及び配列番号22のCDR3を含む、
b)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号25のCDR1、配列番号26のCDR2及び配列番号27のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号28のCDR1、配列番号29のCDR2及び配列番号30のCDR3を含む、
c)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号36のCDR1、配列番号37のCDR2及び配列番号38のCDR3を含む、
d)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号41のCDR1、配列番号42のCDR2及び配列番号43のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号44のCDR1、配列番号45のCDR2及び配列番号46のCDR3を含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号49のCDR1、配列番号50のCDR2及び配列番号51のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号52のCDR1、配列番号53のCDR2及び配列番号54のCDR3を含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0006

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位と、ヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体において、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
b)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
c)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
d)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0007

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、前記抗体が、二価三価又は四価であることを特徴とする。

0008

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、前記抗体が、Asn297において糖鎖を付加され、前記糖鎖内のフコースの量が、65%以下であることを特徴とする。

0009

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を含む薬学的製剤である。

0010

本発明の一実施態様は、癌の治療において使用するための本発明に係る二重特異性抗体である。

0011

本発明の一実施態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る二重特異性抗体の使用である。

0012

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を、このような治療を必要とする患者投与することによる、癌を患う患者の治療方法である。

0013

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体をコードする核酸である。本発明の一実施態様は、宿主細胞における本発明に係る二重特異性抗体の発現のための、前記核酸を含むことを特徴とする発現ベクターである。本発明の一実施態様は、前記発現ベクターを含む宿主細胞である。本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を産生するための方法において、宿主細胞中で前記核酸を発現させることと、前記細胞又は細胞培養物上清から前記二重特異性抗体を回収することを特徴とする方法である。

0014

このような二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体は、非常に有効な腫瘍細胞生存阻害及び腫瘍増殖阻害、IGF−1RとIGF−1R双方のシグナル伝達(例えば、リン酸化)阻害のような、非常に役立つ特性を有する。それらは、高い結合親和性やまた効率的な細胞結合のような、役立つ結合特性を有する。それらは、特に、糖鎖工学的に操作された場合に、高いADCC活性を示す。本発明に係る二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体は更にストレス下において高度に安定的であり、この特性は、生産及びその薬物動態特性に重要である。

図面の簡単な説明

0015

<EGFR−IGF1R>抗体OA−Ak18−scFab−GA201と比較した、改変された二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体OA−F13B5−scFab−GA201及びOA−L31D11−scFab−GA201による、A549癌細胞図1a)及びRD−ES癌細胞(図1b)の癌細胞増殖の阻害を示す図である。本発明に係る親和性成熟化された二重特異性抗体OA−F13B5−scFab−GA201及びOA−L31D11−scFab−GA201に関して、効力は顕著に増加する。
2種の異なる癌細胞株H460M2(図2a)及びH322M(図2b)による、ADCCインビトロアッセイを示す図である。親和性成熟、二重特異性の糖鎖工学的に操作された<EGFR−IGF1R>抗体OA−F13B5−scFab−GA201−GE及びOA−L31D11−scFab−GA201−GEは両者共に、未改変の糖鎖工学的に操作された二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体OA−Ak18−scFab−GA201−GEと比較して、ADCCの明らかな増加を示した。

0016

本明細書において、「抗体」は、抗原結合部位を含む結合タンパク質を指す。本明細書における用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、リガンドが実際に結合する抗体分子の領域(複数可)を示す。本発明に係る二重特異性抗体における結合部位は、それぞれ一対の2個の可変ドメイン、即ち、1個の重鎖可変ドメイン及び1個の軽鎖可変ドメインにより形成され得る。抗体における最小の結合部位決定基は、重鎖CDR3である。本発明の一実施態様では、結合部位のそれぞれは、抗体重鎖可変ドメイン(VH)及び/又は抗体軽鎖可変ドメイン(VL)を含み、好ましくは、抗体軽鎖可変ドメイン(VL)及び抗体重鎖可変ドメイン(VH)からなる一対により形成される。

0017

「抗体特異性」は、抗原の特定のエピトープに対する抗体の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。本発明に係る「二重特異性抗体」は、2種の異なる抗原結合特異性を有する抗体である。抗体が、一を越える特異性を有する場合、認識されるエピトープは、単一の抗原又は一を越える抗原と結合され得る。本発明の抗体は、2種の異なる抗原、即ち、第1の抗原としてのEGFRと第2の抗原としてのIGF−1Rに対して特異的である。

0018

本明細書における用語「単一特異性」抗体は、そのそれぞれが同一抗原の同一エピトープと結合する、一又は複数の結合部位を有する抗体を示す。

0019

本出願内で用いられる用語「結合価」は、抗体分子における特定された数の結合部位の存在を示す。よって、用語「二価」、「四価」及び「六価」は、抗体分子におけるそれぞれ2個の結合部位、4個の結合部位及び6個の結合部位の存在を示している。本発明に係る二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」又は「多価」(例えば、(「四価」又は「六価」)であり得る。好ましくは、本発明に係る二重特異性抗体は、二価、三価又は四価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は二価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は三価である。一実施態様では、前記二重特異性抗体は四価である。

0020

本発明の抗体は、2つより多い結合部位を有しかつ二重特異性である。即ち、抗体は、2つより多い結合部位が存在する(即ち、抗体が三価又は多価である)場合であっても、二重特異性であり得る。本発明の二重特異性抗体は、例えば、多価単鎖抗体ダイアボディ及びトリアディ、並びに一又は複数のペプチドリンカーを介して更なる抗原結合部位(例えば、単鎖Fv、VHドメイン及び/又はVLドメイン、Fab又は(Fab)2)が連結された全長抗体定常ドメイン構造を有する抗体を包含する。抗体は、単一種由来全長であっても、あるいはキメラ化又はヒト化されていてもよい。2つより多い抗原結合部位を有する抗体では、タンパク質が2種の異なる抗原に対して結合部位を有する限り、幾つかの結合部位は同一であってよい。即ち、第1の結合部位が、ヒトEGFRに特異的である一方、第2の結合部位は、ヒトIGF−1Rに特異的である。

0021

天然抗体と同様に、本発明の抗体の抗原結合部位は、典型的には、変動的度合いで抗原に対する結合部位の親和性に寄与する6個の相補性決定領域(CDR)を含む。3個の重鎖可変ドメインCDR(CDRH1、CDRH2及びCDRH3)並びに3個の軽鎖可変ドメインCDR(CDRL1、CDRL2及びCDRL3)が存在する。CDR及びフレームワーク領域(FR)の規模は、アミノ酸配列コンパイルされたデータベースとの比較により決定され、そこでは、これらの領域は配列間の可変性に従って定義されている。より少数のCDRで構成された機能的抗原結合部位(即ち、結合特異性が、3、4又は5個のCDRにより決定される場合)もまた本発明の範囲内に包含される。例えば、完全セットの6個に満たないCDRであっても、結合に十分となり得る。一部の事例において、VH又はVLドメインで十分となるであろう。

0022

所定の実施態様では、本発明の抗体は、一又は複数の免疫グロブリンクラス免疫グロブリン定常領域を更に含む。免疫グロブリンクラスは、IgGIgMIgAIgD及びIgEアイソタイプを包含し、IgG及びIgAの場合、これらのサブタイプを包含する。一実施態様では、本発明の抗体は、IgG型抗体の定常ドメイン構造を有する。

0023

本明細書における用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、単一アミノ酸組成の抗体分子の調製物を指す。

0024

用語「キメラ抗体」は、組換えDNA技法により通常調製される、可変ドメイン、即ち、ある供給源又は種由来の結合領域と、異なる供給源又は種に由来する定常領域の少なくとも一部とを含む抗体を指す。マウス可変ドメイン及びヒト定常領域を含むキメラ抗体が好ましい。本発明により網羅される「キメラ抗体」の他の好ましい形態は、本来の抗体から定常領域が改変又は変化されて、特に、C1q結合及び/又はFc受容体(FcR)結合に関する、本発明に係る特性を生じたキメラ抗体である。このようなキメラ抗体は、「クラススイッチ抗体」とも称される。キメラ抗体は、免疫グロブリン可変ドメインをコードするDNAセグメントと、免疫グロブリン定常領域をコードするDNAセグメントとを含む免疫グロブリン遺伝子の、発現された産物である。キメラ抗体を産生するための方法は、従来の組換えDNA及び遺伝子トランスフェクション技法に関与し、本技術分野において周知のものである。例えば、Morrison,S.L.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(1984)6851〜6855;米国特許第5202238号明細書及び米国特許第5204244号明細書を参照されたい。

0025

用語「ヒト化抗体」は、フレームワーク又は「相補性決定領域」(CDR)が、親免疫グロブリンと比較して異なる特異性の免疫グロブリンのCDRを含むよう改変された抗体を指す。好ましい一実施態様では、マウスCDRは、ヒト抗体のフレームワーク領域へと接ぎ合わされて(graft)、「ヒト化抗体」を調製する。例えば、Riechmann,L.ら、Nature 332(1988)323〜327;及びNeuberger,M.S.ら、Nature 314(1985)268〜270を参照されたい。特に好ましいCDRは、キメラ抗体に関する上述の抗原を認識する配列を表すCDRに相当する。本発明に網羅される「ヒト化抗体」の他の形態は、本来の抗体から定常領域が更に改変又は変化されて、特に、C1q結合及び/又はFc受容体(FcR)結合に関する本発明に係る特性を生じたヒト化抗体である。

0026

本明細書における用語「ヒト抗体」は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変及び定常領域を有する抗体を包含することを目的とする。ヒト抗体は、本技術水準において周知のものである(van Dijk,M.A.及びvan de Winkel,J.G.、Curr.Opin.Chem.Biol.5(2001)368〜374)。ヒト抗体は、免疫化により、内在性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全レパートリー又は選択を産生することのできる、トランスジェニック動物(例えば、マウス)において産生することもできる。このような生殖系列変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイ移植は、抗原曝露によりヒト抗体の産生をもたらすであろう(例えば、Jakobovits,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)2551〜2555;Jakobovits,A.ら、Nature 362(1993)255〜258;Bruggemann,M.ら、Year Immunol.7(1993)33〜40を参照)。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにおいて産生することもできる(Hoogenboom,H.R.及びWinter,G.J.Mol.Biol.227(1992)381〜388;Marks,J.D.ら、J.Mol.Biol.222(1991)581〜597)。Coleら及びBoernerらの技法をヒトモノクローナル抗体の調製に利用することもできる(Cole,S.P.C.ら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R.Liss(1985)77〜96;及びBoerner,P.ら、J.Immunol.147(1991)86〜95)。本発明に係るキメラ及びヒト化抗体に関して既に言及されている通り、本明細書における用語「ヒト抗体」は、例えば、「クラススイッチ」、即ち、Fc部分の変化又は変異(例えば、IgG1からIgG4及び/又はIgG1/IgG4変異)により、定常領域において改変されて、特に、C1q結合及び/又はFcR結合に関する本発明に係る特性を生じたこのような抗体も含む。

0027

用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重又は軽鎖のドメインを指す。自然(native)抗体の重鎖及び軽鎖(それぞれVH及びVL)の可変ドメインは一般に、同様の構造を有し、各ドメインは、3個の「高頻度可変領域」(又は相補性決定領域、CDR)により接続された、その配列が広く保存された4個のフレームワーク(FR)領域を含む。フレームワーク領域は、ベータシート高次構造の形をとり、CDRは、該ベータ−シート構造を接続するループを形成することができる。各鎖におけるCDRは、フレームワーク領域によりその三次元構造に保持され、他の鎖由来のCDRと共に、抗原結合部位を形成する。抗体重及び軽鎖CDR3領域は、本発明に係る抗体の結合特異性/親和性において特に重要な役割を果たし、従って、本発明の更に別の目的を提供する(例えば、Kindt,T.J.ら、Kuby Immunology、第6版、W.H.Freeman and Co.、N.Y.(2007)、91頁を参照)。単一のVH又はVLドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分となり得る。更に、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体由来のVH又はVLドメインを用いて、それぞれ相補的VL又はVHドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより単離することができる。例えば、Portolano,S.ら、J.Immunol.150(1993)880〜887;Clackson,T.ら、Nature 352(1991)624〜628)を参照されたい。

0028

用語「相補性決定領域」又は「高頻度可変領域」は、本明細書において用いられる場合、抗原結合の原因となる抗体のアミノ酸残基を指す。高頻度可変領域は、「相補性決定領域」又は「CDR」由来のアミノ酸残基を含む。「フレームワーク」又は「FR」領域は、本明細書において定義されている「相補性決定領域」残基以外の該可変ドメイン領域である。従って、抗体の軽及び重鎖は、NからC末端にかけて、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。各鎖におけるCDRは、このようにフレームワークアミノ酸に隔てられている。特に、重鎖のCDR3は、抗原結合に最も寄与する領域である。CDR及びFR領域は、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局(Public Health Service)、国立衛生研究所(National Institutes of Health)、メリーランド州ベセスダ(1991)NIH Publication No.91−3242の標準的定義に従って決定される。

0029

本発明に係る二重特異性抗体は、<IGF−1R>結合親和性の増加をもたらす<IGF−1R>抗原結合部位のCDRの親和性成熟化に加えて、「保存的配列改変」を有する抗体を包含する。これは、本発明に係る二重特異性抗体の本明細書において言及されている特徴に影響しない又はこれを変更しないヌクレオチド及びアミノ酸配列改変を意味する。改変は、部位特異的変異誘発及びPCRによる変異誘発等、本技術分野において公知の標準技法により導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられる置換を包含する。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、本技術分野において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖(例えば、リジンアルギニンヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸グルタミン酸)、無電荷極性側鎖(例えば、グリシンアスパラギングルタミンセリンスレオニンチロシンシステイントリプトファン)、非極性側鎖(例えば、アラニンバリンロイシンイソロイシンプロリンフェニルアラニンメチオニン)、ベータ−分枝側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ酸を包含する。よって、二重特異性<EGFR−IGF1R>抗体における予測される非必須のアミノ酸残基は、好ましくは、同一側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基に置き換えることができる。アミノ酸置換は、Riechmann,L.ら、Nature 332(1988)323〜327及びQueen,C.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)10029〜10033により記載されている分子モデリングに基づく変異誘発により行うことができる。

0030

本明細書において、用語「に結合している」、「に特異的に結合している」、「に結合する」又は「に特異的に結合する」は、互換的に用いられ、インビトロアッセイ、好ましくは、表面プラズモン共鳴(SPR)アッセイにおける抗原のエピトープと抗体との結合を指す。「に結合している」、「に特異的に結合している」、「に結合する」又は「に特異的に結合する」は、抗体/抗原結合部位が、1.0×10−8M以下の結合親和性(KD)のKD値で、一実施態様においては、5.0×10−9M以下のKDで、一実施態様においては、2.0×10−9M〜1.0×10−13Mの間のKDで、それぞれの抗原に結合することを意味する。結合の親和性は、用語ka(抗体/抗原複合体への抗体の結合の速度定数)、kd(解離定数)及びKD(kd/ka)により定義される。結合親和性は、表面プラズモン共鳴技法(例えば、BIAcore(登録商標)、GE−Healthcare、スウェーデン、ウプサラ)により決定される。

0031

用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することのできるいずれかのポリペプチド決定基を包含する。所定の実施態様では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル等、分子の化学活性を有する表面のグループ分けを包含し、所定の実施態様では、特異的な三次元構造の特徴及び/又は特異的な電荷特徴を有し得る。エピトープは、抗体により結合される抗原の領域である。所定の実施態様では、抗体は、タンパク質及び/又は巨大分子複合体混合物においてその標的抗原優先的に認識する場合、抗原に特異的に結合すると考えられる。

0032

ヒト上皮増殖因子受容体HER−1又はErb−B1としても公知、本明細書において、「EGFR」と称される)は、c−erbB癌原遺伝子にコードされる170kDaの膜貫通型受容体であり、内因性チロシンキナーゼ活性提示する(Modjtahedi,H.ら、Br.J.Cancer 73(1996)228〜235;Herbst,R.S.及びShin,D.M.、Cancer 94(2002)1593〜1611)。SwissProtデータベースエントリーP00533は、EGFR(配列番号75)の配列を提供する。EGFRのアイソフォーム及びバリアントも存在し(例えば、オルタナティブRNA転写産物、切断型バージョン多型等)、その例としてSwissprotデータベースエントリー番号P00533−1、P00533−2、P00533−3及びP00533−4により同定されるアイソフォーム及びバリアント等が挙げられるがこれらに限定されない。EGFRは、上皮増殖因子(EGF)、トランスフォーミング増殖因子−α(TGF−α)アンフィレギュリンヘパリン結合型EGF(hb−EGF)、ベータセルリン及びエピレギュリンを包含するリガンドに結合することが知られている(Herbst,R.S.及びShin,D.M.、Cancer 94(2002)1593〜1611;Mendelsohn,J.及びBaselga,J.、Oncogene 19(2000)6550〜6565)。EGFRは、チロシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路を介して多数の細胞過程を調節し、その例として、細胞増殖分化、細胞生存、アポトーシス血管新生有糸分裂誘発及び転移を制御するシグナル伝達経路の活性化等が挙げられるがこれらに限定されない(Atalay,G.ら、Ann.Oncology 14(2003)1346〜1363;Tsao,A.S.及びHerbst,R.S.、Signal 4(2003)4〜9;Herbst,R.S.及びShin,D.M.、Cancer 94(2002)1593〜1611;Modjtahedi,H.ら、Br.J.Cancer 73(1996)228〜235)。

0033

ヒトインスリン増殖因子受容体(ヒトIGF−IR;異名、IGF−1R、CD221抗原)は、膜貫通型タンパク質チロシンキナーゼのファミリーに属する(LeRoith,D.ら、Endocrin.Rev.16(1995)143〜163;及びAdams,T.E.ら、Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050〜1063)。SwissProtデータベースエントリーP08069は、IGF−1R(配列番号76)の配列を提供する。IGF−IRは、高い親和性でIGF Iに結合し、インビボにおいて該リガンドに対する生理応答惹起する。IGF IRは、IGF IIにも結合するが、これは、僅かにより低い親和性で行われる。IGF IR過剰発現は、細胞の腫瘍性形質転換を促進し、IGF IRは、細胞の悪性形質転換に関与することの証拠が存在し、従って、癌の治療のための治療剤開発の有用な標的である(Adams,T.E.ら、Cell.Mol.Life Sci.57(2000)1050〜1063)。

0034

組成物及び方法
一態様では、本発明は、一部には、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、二重特異性抗体に基づく。

0035

「未改変の第2の抗原結合部位」は、重鎖可変ドメイン中に、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む。

0036

これらの二重特異性抗体は、<IGF−1R>HUMABクローン18(配列番号9〜16)及びヒト化<EGFR>ICR62(配列番号1〜8)に基づく、国際公開第2010/034441号に記載されている抗EGFR/抗IGF−1Rの<IGF−1R>抗原結合部位の親和性成熟化を経て派生し、結合親和性が増加した、新たな改変された二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体である。

0037

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。

0038

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号9のCDR1、配列番号10のCDR2及び配列番号11のCDR3を含む重鎖可変ドメイン並びに配列番号12のCDR1、配列番号13のCDR2及び配列番号14のCDR3を含む軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。

0039

本明細書における用語「CDRの一又は複数における一又は複数の改変」は、アミノ酸置換、欠失、及び/又は挿入等、1個から最大5個(一実施態様においては、1個から最大3個、一実施態様においては、2個から最大5個、実施形態において、2個又は3個)の改変(総計)を指し、各CDRは、互いに独立的に、0個〜3個の間の改変を含む。一実施態様では、改変は、アミノ酸置換である。

0040

本明細書における用語「未改変の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、結合親和性のKD値」は、<IGF−1R>HUMABクローン18(配列番号9〜16)の未改変の(=親の)抗原結合部位と比較した、改変された親和性成熟化<IGF−1R>抗原結合部位の、ヒトIGF−1Rに対する結合親和性のKD値の10倍以上の増加を言う。結合親和性の増加を決定するため、改変された親和性成熟化された<IGF−1R>抗原結合部位及び未改変の親<IGF−1R>HUMABクローン18(配列番号9〜16)のKD値は、それらのFab断片により、実施例1に詳細に記載する25℃における表面プラズモン共鳴アッセイにおいて決定される。KD値の増加は、KD(未改変)/KD(改変)の比として計算される。

0041

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメイン及び配列番号8の軽鎖可変ドメインを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号15の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、CDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。

0042

「未改変の抗原結合部位」は、配列番号15の重鎖可変ドメインVH及び配列番号16の軽鎖可変ドメインVLを含む。

0043

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメイン及び配列番号8の軽鎖可変ドメインを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号15の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン及び/又は軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。

0044

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメイン及び配列番号8の軽鎖可変ドメインを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号15の重鎖可変ドメイン及び配列番号16の軽鎖可変ドメインに基づく改変された抗原結合部位であり、
改変された第2の抗原結合部位が、軽鎖可変ドメインのCDRの一又は複数中に一又は複数の改変を含み、
改変された第2の抗原結合部位が、未改変の第2の抗原結合部位と比較して少なくとも10倍増加した、ヒトIGF−1Rとの結合に対する結合親和性のKD値を有する、
二重特異性抗体である。

0045

従って、本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号1のCDR1、配列番号2のCDR2及び配列番号3のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号4のCDR1、配列番号5のCDR2及び配列番号6のCDR3を含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号17のCDR1、配列番号18のCDR2及び配列番号19のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号20のCDR1、配列番号21のCDR2及び配列番号22のCDR3を含む、
b)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号25のCDR1、配列番号26のCDR2及び配列番号27のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号28のCDR1、配列番号29のCDR2及び配列番号30のCDR3を含む、
c)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号33のCDR1、配列番号34のCDR2及び配列番号35のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号36のCDR1、配列番号37のCDR2及び配列番号38のCDR3を含む、
d)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号41のCDR1、配列番号42のCDR2及び配列番号43のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号44のCDR1、配列番号45のCDR2及び配列番号46のCDR3を含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、重鎖可変ドメイン中に、配列番号49のCDR1、配列番号50のCDR2及び配列番号51のCDR3を含み、軽鎖可変ドメイン中に、配列番号52のCDR1、配列番号53のCDR2及び配列番号54のCDR3を含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0046

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)a)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
b)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
c)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む、
d)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む、又は
e)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0047

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号23の重鎖可変ドメインVHと、配列番号24の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0048

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号31の重鎖可変ドメインVHと、配列番号32の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0049

本発明の一実施態様は、EGFRに結合する第1の抗原結合部位と、IGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号39の重鎖可変ドメインVHと、配列番号40の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0050

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号47の重鎖可変ドメインVHと、配列番号48の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0051

本発明の一実施態様は、ヒトEGFRに結合する第1の抗原結合部位とヒトIGF−1Rに結合する第2の抗原結合部位とを含む、ヒトEGFRとヒトIGF−1Rとに結合する二重特異性抗体であって、
i)第1の抗原結合部位が、配列番号7の重鎖可変ドメインVHと、配列番号8の軽鎖可変ドメインVLとを含み、
ii)第2の抗原結合部位が、配列番号55の重鎖可変ドメインVHと、配列番号56の軽鎖可変ドメインVLとを含む
ことを特徴とする二重特異性抗体である。

0052

このような二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体は、非常に有効な腫瘍細胞生存阻害及び腫瘍増殖阻害、IGF−1RとIGF−1Rの双方のシグナル伝達(例えば、リン酸化)阻害のような、非常に役立つ特性を有する。それらは、高い結合親和性やまた効率的な細胞結合のような、役立つ結合特性を有する。それらは、特に、糖鎖工学的に操作された(GE)場合に、高いADCC活性を示す。

0053

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、IGF−1Rリン酸化とEGFRリン酸化を阻害する(実施例4を参照)。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で、A549癌細胞におけるIGF−1Rリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で、BxPC3癌細胞におけるIGF−1Rリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で、TC−71癌細胞におけるIGF−1Rリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.23nM以下のIC50で、A549癌細胞におけるEGFRリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.90nM以下のIC50で、BxPC3癌細胞におけるEGFRリン酸化を阻害する。

0054

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、癌細胞増殖又は腫瘍細胞増殖を阻害する(実施例5を参照)。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.20nM以下のIC50で(好ましくは、0.15nM以下のIC50で)、A549癌細胞の増殖を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で(好ましくは、0.05nM以下のIC50で)、RD−ES癌細胞の増殖を阻害する。

0055

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、65%以下(好ましくは、50〜5%の間)の量のフコースとなるように糖鎖工学的に操作され、癌細胞においてADCCを誘導する(実施例7を参照)。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、65%以下(好ましくは、50〜5%の間)の量のフコースとなるように糖鎖工学的に操作され、0.10nM以下のEC50でH460M2癌細胞におけるADCCを誘導する。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、65%以下(好ましくは、50〜5%の間)の量のフコースとなるように糖鎖工学的に操作され、0.15nM以下のEC50でH322M癌細胞におけるADCCを誘導する。よって、本発明の二重特異性抗体は、例えば、癌の診断又は治療に有用である。

0056

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、例えば、a)国際公開第2009/080251号、国際公開第2009/080252号、国際公開第2009/080253号もしくはSchaeferら、PNAS 108(2011)11187〜11192(ドメイン交換抗体 − 実施例2を参照 − 配列番号63〜66もしくは配列番号67〜70のCrossMab(CM))又は例えば、b)欧州特許出願公開第10003270.5号明細書(実施例2を参照、配列番号57〜59もしくは配列番号60〜62のOA−scFabを参照)又は例えば、c)Ridgway,J.B.、Protein Eng.9(1996)617〜621;国際公開第96/027011号;Merchant,A.Mら、Nature Biotech 16(1998)677〜681;Atwell,S.ら、J.Mol.Biol.270(1997)26〜35及び欧州特許第1870459(A1)号明細書に記載されているフォーマットを用いた二価である。

0057

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号57、配列番号58及び配列番号59のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号60、配列番号61及び配列番号62のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号63、配列番号64、配列番号65及び配列番号66のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、その配列番号67、配列番号68、配列番号69及び配列番号70のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列は、a)<IGF−1R>F13B5(配列番号17〜24)又は<IGF−1R>L31D11(配列番号41〜48)(両者共に、親和性成熟されたHUMAB<IGF−1R>クローン18抗体)及びb)ヒト化<EGFR>ICR62(配列番号1〜8;国際公開第2006/082515号も参照、<EGFR>ICR62として省略)の抗原結合部位に基づく。

0058

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、三価であり、これは例えば、2種の受容体EGFR又はIGF−1Rのうち一方に特異的に結合する全長抗体であって、その一方の重鎖のC末端/又はN末端の一方のみにおいて、2種の受容体EGFR又はIGF−1Rの他方に特異的に結合するscFab断片が融合した全長抗体に基づくフォーマット(例えば、国際公開第2010/112193号に記載されているノブイントゥホール(knobs−into holes)技術等)、あるいは、例えば、2種の受容体EGFR又はIGF−1Rの一方に特異的に結合する全長抗体であって、その一方の重鎖の一方のC末端において、2種の受容体EGFR又はIGF−1Rの他方に特異的に結合するVH又はVH−CH1断片が融合し、その第2の重鎖の他方のC末端において、VL又はVL−CL断片が融合した全長抗体に基づくフォーマット(例えば、国際公開第2010/115589号に記載されているノブ・イントゥ・ホール技術等)を用いる。他の三価フォーマットは、例えば、欧州特許出願公開第10173914.2号明細書に記載されている。ノブ・イントゥ・ホール技術及びその変種に関して、Ridgway,J.B.、Protein Eng.9(1996)617〜621;国際公開第96/027011号、Merchant,A.Mら、Nature Biotech 16(1998)677〜681;Atwell,S.ら、J.Mol.Biol.270(1997)26〜35;及び欧州特許第1870459(A1)号明細書も参照されたい。

0059

一実施態様では、前記二重特異性抗体は、例えば、国際公開第2007/024715号、国際公開第2007/109254号、国際公開第2010/112193号、国際公開第2010/145792号又は国際公開第2010/145793号に記載されているフォーマットを用いた四価である(例えば、実施例2、Tv−L31D11−GA201及びTv−F13B5−GA201を参照)。

0060

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号71及び配列番号72のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、配列番号73及び配列番号74のアミノ酸配列を含むことを特徴とする。これらのアミノ酸配列は、a)<IGF−1R>F13B5(配列番号17〜24)又は<IGF−1R>L31D11(配列番号41〜48)(両者共に親和性成熟されたHUMAB<IGF−1R>クローン18抗体)及びb)ヒト化<EGFR>ICR62(配列番号1〜8;国際公開第2006/082515号も参照、<EGFR>ICR62と省略)の抗原結合部位に基づく。

0061

更に別の一実施態様では、前記二重特異性抗体は、定常領域がヒト起源に由来することを特徴とする。

0062

本願内で用いられる用語「定常領域」は、可変領域以外の抗体のドメインの総体を表示する。定常領域は、抗原の結合に直接的に関与しないが、様々なエフェクター機能を提示する。その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体は、次のクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM分けられ、これらのいくつかは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA1及びIgA2等のサブクラスへと更に分けることができる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。全5種の抗体クラスに存在し得る軽鎖定常領域は、κカッパー)及びλ(ラムダ)と呼ばれる。本明細書において他に特段の定めがなければ、Fc領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991)、NIH Publication 91−3242に記載されている、EU指数とも呼ばれるEU番号付け方式に従う。

0063

本願において用いられる用語「ヒト起源に由来する定常領域」は、サブクラスIgG1、IgG2、IgG3もしくはIgG4のヒト抗体の定常重鎖領域及び/又は定常軽鎖カッパーもしくはラムダ領域を表示する。このような定常領域は、本技術水準において周知のものであり、例えば、Kabat,E.A.(Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991)、NIH Publication 91−3242;例えば、Johnson,G.及びWu,T.T.、Nucleic AcidsRes.28(2000)214〜218;Kabat,E.A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 72(1975)2785〜2788を参照)により記載されている。IgG4サブクラスの抗体は、Fc受容体(FcガンマRIIIa)結合の低下を示すが、他のIgGサブクラスの抗体は、強い結合を示す。しかし、Pro238、Asp265、Asp270、Asn297(Fc糖質損失)、Pro329、Leu234、Leu235、Gly236、Gly237、Ile253、Ser254、Lys288、Thr307、Gln311、Asn434及びHis435は、変更されると、同様にFc受容体結合の低下をもたらす残基である(Shields,R.L.ら、J.Biol.Chem.276(2001)6591〜6604;Lund,J.ら、FASEB J.9(1995)115〜119;Morgan,A.ら、Immunology 86(1995)319〜324;欧州特許第0307434号明細書)。

0064

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトIgGサブクラスのものであることを特徴とする。

0065

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトIgG1サブクラスのものであることを特徴とする。

0066

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトIgG2サブクラスのものであることを特徴とする。

0067

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトIgG3サブクラスのものであることを特徴とする。

0068

一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、ヒト起源に由来する定常領域を含み、定常領域がヒトIgG4サブクラスのものであることを特徴とする。

0069

典型的なヒト定常領域を配列番号77〜81に示す。

0070

抗体の定常領域は、ADCC(抗体依存性細胞傷害作用)及びCDC(補体依存性細胞傷害作用)に直接的に関与する。補体活性化(CDC)は、多くのIgG抗体サブクラスの定常領域への補体因子C1qの結合により惹起される。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位における定義されたタンパク質−タンパク質相互作用に起因する。このような定常領域結合部位は、本技術水準において公知のものであり、例えば、Lukas,T.J.ら、J.Immunol.127(1981)2555〜2560;Brunhouse,R.及びCebra,J.J.、Mol.Immunol.16(1979)907〜917;Burton,D.R.ら Nature 288(1980)338〜344;Thommesen,J.E.ら、Mol.Immunol.37(2000)995〜1004;Idusogie,E.E.ら、J.Immunol.164(2000)4178〜4184;Hezareh,M.ら、J.Virol.75(2001)12161〜12168;Morgan,A.ら、Immunology 86(1995)319〜324;及び欧州特許第0307434号明細書により記載されている。このような定常領域結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及びP329(KabatのEU指数に従った番号付け、上記参照)により特徴づけられる。

0071

用語「抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)」は、エフェクター細胞の存在下における、本発明に係る抗体によるヒト標的細胞の溶解を指す。ADCCは、好ましくは、新鮮に単離されたPBMC又は単球もしくはナチュラルキラー(NK)細胞のようにバフィーコートから精製されたエフェクター細胞又は永続的に増殖するNK細胞株等、エフェクター細胞の存在下における、本発明に係る抗体によるIGF−1R及びEGFR発現細胞の調製物の処理により測定される。

0072

用語「補体依存性細胞傷害作用(CDC)」は、大部分のIgG抗体サブクラスのFc部分への補体因子C1qの結合により惹起される過程を表示する。抗体へのC1qの結合は、いわゆる結合部位における定義されたタンパク質−タンパク質相互作用に起因する。このようなFc部分結合部位は、本技術水準において公知のものである(上述を参照)。このようなFc部分結合部位は、例えば、アミノ酸L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331及びP329(KabatのEU指数に従った番号付け)により特徴づけられる。サブクラスIgG1、IgG2及びIgG3の抗体は通常、C1q及びC3結合を包含する補体活性化を示し、一方、IgG4は、補体系を活性化せず、C1q及び/又はC3と結合しない。

0073

モノクローナル抗体の細胞介在性エフェクター機能は、Umana,P.ら、Nature Biotechnol.17(1999)176〜180及び米国特許第6,602,684号明細書に記載されている通り、そのオリゴ糖構成成分を操作することにより増強され得る。最も一般的に用いられる治療抗体であるIgG1型抗体は、各CH2ドメインにおけるAsn297に保存されたN結合型糖鎖付加部位を有する糖タンパク質である。Asn297に付着した2種の複合体二分岐オリゴ糖は、CH2ドメイン間に埋め込まれてポリペプチド主鎖と広範な接触を形成し、その存在は、抗体が、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)等のエフェクター機能を媒介するために必須である(Lifely,M.R.ら、Glycobiology 5(1995)813〜822;Jefferis,R.ら、Immunol.Rev.163(1998)59〜76;Wright,A.及びMorrison,S.L.、TrendsBiotechnol.15(1997)26〜32)。Umana,P.ら、Nature Biotechnol.17(1999)176〜180及び国際公開第99/54342号は、二分されたオリゴ糖の生成を触媒する糖転移酵素であるβ(1,4)−N−アセチルグルコサミン転移酵素III(「GnTIII」)のチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞における過剰発現が、抗体のインビトロADCC活性を有意に増加させることを示した。Asn297糖質組成の変更又はその排除は、FcγR及びC1qへの結合にも影響する(Umana,P.ら、Nature Biotechnol.17(1999)176〜180;Davies,J.ら、Biotechnol.Bioeng.74(2001)288〜294;Mimura,Y.ら、J.Biol.Chem.276(2001)45539〜45547;Radaev,S.ら、J.Biol.Chem.276(2001)16478〜16483;Shields,R.L.ら、J.Biol.Chem.276(2001)6591〜6604;Shields,R.L.ら、J.Biol.Chem.277(2002)26733〜26740;Simmons,L.C.ら、J.Immunol.Methods 263(2002)133〜147)。

0074

モノクローナル抗体の細胞介在性エフェクター機能を増強するための方法は、例えば、国際公開第2005/044859号、国際公開第2004/065540号、国際公開第2007/031875号、Umana,P.ら、Nature Biotechnol.17(1999)176〜180、国際公開第99/54342号、国際公開第2005/018572号、国際公開第2006/116260号、国際公開第2006/114700号、国際公開第2004/065540号、国際公開第2005/011735号、国際公開第2005/027966号、国際公開第1997/028267号、米国特許出願公開第2006/0134709号明細書、米国特許出願公開第2005/0054048号明細書、米国特許出願公開第2005/0152894号明細書、国際公開第2003/035835号及び国際公開第2000/061739号において、あるいは例えば、Niwa,R.ら、J.Immunol.Methods306(2005)151〜160;Shinkawa,T.ら、J.Biol.Chem.278(2003)3466〜3473;国際公開第03/055993号及び米国特許出願公開第2005/0249722号明細書において報告されている。

0075

従って、本発明の一実施態様では、二重特異性抗体は、Asn297(Kabatに従った番号付け)において糖鎖を付加され(IgG1又はIgG3のFc部分を含む場合)、前記糖鎖内のフコースの量は、65%以下となる。別の一実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は、5%〜65%の間であり、一実施態様においては、20%〜50%の間である。別の一実施態様では、前記糖鎖内のフコースの量は、0%〜5%の間である。本発明に係る「Asn297」は、Fc領域における297位前後に位置するアミノ酸アスパラギン(Kabatに従った番号付け)を意味する。抗体の軽微配列変種に基づき、Asn297は、297位の数アミノ酸(通常+3アミノ酸を越えない)上流又は下流に、即ち、294〜300位の間に位置してもよい。

0076

本発明に係る糖鎖付加された抗体の一実施態様では、IgGサブクラスは、ヒトIgG1サブクラス又はIgG3サブクラスのものである。更に別の一実施態様では、N−グリコリルノイラミン酸(NGNA)の量は、1%以下である、及び/又はN末端アルファ−1,3−ガラクトースの量は、前記糖鎖内の1%以下である。糖鎖は、好ましくは、CHO細胞において組換えにより発現される抗体のAsn297に付着したN結合型グリカンの特徴を示す。

0077

用語「糖鎖は、CHO細胞において組換えにより発現される抗体のAsn297に付着したN結合型グリカンの特徴を示す」は、本発明に係る二重特異性抗体の定常領域のAsn297における糖鎖が、例えば、国際公開第2006/103100号において報告されるような、未改変のCHO細胞において発現される同一抗体のものと同一の構造及びフコース残基を除く糖残基配列を有することを表示する。

0078

本願内で用いられる用語「NGNA」は、糖残基N−グリコリルノイラミン酸を表示する。

0079

ヒトIgG1又はIgG3の糖鎖付加は、最大2個のGal残基で終止するコアフコシル化した二分岐複合体オリゴ糖の糖鎖付加として、Asn297において起こる。IgG1又はIgG3サブクラスのヒト定常重鎖領域は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局、国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ(1991)NIH Publication No 91−3242及びBruggemann,M.ら、J.Exp.Med.166(1987)1351〜1361;Love,T.W.ら、MethodsEnzymol.178(1989)515〜527により詳細に報告されている。これらの構造は、末端Gal残基の量に応じて、G0、G1(α−1,6−又はα−1,3−)又はG2グリカン残基と命名される(Raju,T.S.、Bioprocess Int.1(2003)44〜53)。抗体Fc部分のCHO型糖鎖付加は、例えば、Routier,F.H.、Glycoconjugate J.14(1997)201〜207により記載されている。糖改変(glycomodify)されていないCHO宿主細胞において組換えにより発現される抗体は通常、少なくとも85%の量でAsn297においてフコシル化されている。本発明に係る二重特異性抗体の定常領域の改変されたオリゴ糖は、ハイブリッド又は複合体となり得る。好ましくは、二分された低下された/非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッドである。別の一実施態様では、二分された低下された/非フコシル化オリゴ糖は、複合体である。

0080

本発明において、「フコースの量」は、逆相PLC(RP−UPLC)により測定され、実施例9に記載されている平均値として計算される、Asn297に付着した全糖構造(例えば、複合体、ハイブリッド及び高マンノース構造)の合計に関係する、Asn297における糖鎖内の前記糖の量を意味する。試料のnonFuc含量の相対レベル定量化のため、フコースを除くオリゴ糖を表す全ピーク面積がまとめられ、全オリゴ糖ピークの総ピーク面積に関連付けられる。

0081

本発明に係るあらゆる二重特異性抗体に関して、「GE」は、糖鎖工学的に操作されていることを意味し、「WT」(野生型)は、糖鎖工学的に操作されていないことを意味する。

0082

本発明の更に別の一態様において、本発明に係る二重特異性抗体は、ADCC及び/又はCDCを有する抗体であり、Fc−ガンマ受容体及び/又は補体因子C1qと結合する、ヒト起源のIgG1又はIgG3(好ましくは、IgG1)サブクラスの定常領域を有する。Fc受容体及び/又は補体因子C1qと結合するこのような抗体は、抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)及び/又は補体依存性細胞傷害作用(CDC)を誘発する。

0083

組換え方法及び組成物
抗体は、例えば、米国特許第4,816,567号明細書に記載されている組換え方法及び組成物を用いて産生することができる。一実施態様では、本明細書に記載されている二重特異性抗体をコードする単離された核酸が提供される。このような核酸は、抗体のVLを含むアミノ酸配列及び/又はVHを含むアミノ酸配列(例えば、抗体の軽及び/又は重鎖)をコードすることができる。更に別の一実施態様では、このような核酸を含む一又は複数のベクター(例えば、発現ベクター)が提供される。更に別の一実施態様では、このような核酸を含む宿主細胞が提供される。このような一実施態様では、宿主細胞は、(1)抗体のVLを含むアミノ酸配列及び抗体のVHを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター又は(2)抗体のVLを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第1のベクター及び抗体のVHを含むアミノ酸配列コードする核酸を含む第2のベクターを含む(例えば、これで形質転換されている)。一実施態様では、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞又はリンパ系細胞(例えば、Y0、NS0、Sp20細胞)である。一実施態様では、抗EGFR/抗IGF−1Rの方法であって、上述の抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に適した条件下で培養することと、宿主細胞(又は宿主細胞培養培地)から抗体を必要に応じて回収することを含む方法が提供される。

0084

抗EGFR/抗IGF−1Rの組換え産生のため、例えば上述の抗体をコードする核酸が単離され、宿主細胞において更にクローニング及び/又は発現するために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、従来の手順を用いて(例えば、抗体の重及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)容易に単離及び配列決定することができる。

0085

抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載されている原核生物又は真核生物の細胞を包含する。例えば、抗体は、特に、糖鎖付加及びFcエフェクター機能が必要とされない場合、細菌において産生することができる。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現に関して、例えば、米国特許第5,648,237号明細書、米国特許第5,789,199号明細書及び米国特許第5,840,523号明細書を参照されたい(大腸菌(E. coli)における抗体断片の発現について記載する、Charlton,K.A.、In:Methodsin Molecular Biology、248巻、Lo,B.K.C.(編)、Humana Press、ニュージャージー州トトワ(2003)、245〜254頁も参照されたい)。発現後に、抗体は、可溶性画分において細菌細胞ペーストから単離し、更に精製することができる。

0086

原核生物に加えて、糸状菌類又は酵母等、真核生物微生物は、抗体をコードするベクターのクローニング又は発現宿主に適しており、これは、その糖鎖付加経路が「ヒト化」されて、部分的に又は完全にヒトの糖鎖付加パターンを有する抗体の産生をもたらす真菌及び酵母株を包含する。Gerngross,T.U.、Nat.Biotech.22(2004)1409〜1414;及びLi,H.ら、Nat.Biotech.24(2006)210〜215を参照されたい。

0087

糖鎖付加された抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物(非脊椎動物(invertebrate)及び脊椎動物)に由来する。非脊椎動物細胞の例として、植物及び昆虫細胞が挙げられる。特に、ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて用いることのできる、多数のバキュロウイルス株が同定された。

0088

植物細胞培養物宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第5,959,177号、同第6,040,498号、同第6,420,548号、同第7,125,978号及び同第6,417,429号明細書(トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTBODIESTM技術について記載)を参照されたい。

0089

脊椎動物細胞を宿主として用いることもできる。例えば、浮遊状態での育成順応された哺乳類細胞株が有用となり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、SV40(COS−7)により形質転換されたサル腎臓CV系統;ヒト胚性腎臓系統(例えば、Graham,F.L.ら、J.Gen Virol.36(1977)59〜74に記載されている293又は293細胞);ベビーハムスター腎臓細胞(BHK);マウスセルトリ細胞(例えば、Mather,J.P.、Biol.Reprod.23(1980)243〜252に記載されているTM4細胞);サル腎臓細胞(CV1);アフリカミドリザル腎臓細胞(VERO−76);ヒト子宮頸がん細胞(HELA);イヌ腎臓細胞(MDCKバッファローラット(buffalo rat)肝臓細胞BRL3A);ヒト肺細胞(W138);ヒト肝臓細胞(Hep G2);マウス乳房腫瘍(MMT060562);例えば、Mather,J.P.ら、Annals N.Y.Acad.Sci.383(1982)44〜68に記載されているTRI細胞;MRC5細胞;及びFS4細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株は、DHFR−CHO細胞(Urlaub,G.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77(1980)4216〜4220)を包含するチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞;並びにY0、NS0及びSp2/0等、骨髄腫細胞株を包含する。抗体産生に適した特定の哺乳類宿主細胞株の総説に関して、例えば、Yazaki,P.及びWu,A.M.、Methodsin Molecular Biology、248巻、Lo,B.K.C.(編)、Humana Press、ニュージャージー州トトワ(2004)、255〜268頁を参照されたい。

0090

本発明に係る二重特異性抗体は、組換え手段により産生される。よって、本発明の一態様は、本発明に係る抗体をコードする核酸であり、更に別の一態様は、本発明に係る抗体をコードする前記核酸を含む宿主細胞である。組換え産生のための方法は、本技術水準において広く知られており、原核生物及び真核生物の細胞におけるタンパク質発現と、続く抗体の単離及び通常、薬学的に許容される純度への精製を含む。宿主細胞における上述の抗体の発現のため、それぞれ改変された軽及び重鎖をコードする核酸は、標準方法により発現ベクターに挿入される。CHO細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、HEK293細胞、COS細胞、PER.C6細胞、酵母又は大腸菌細胞のような、適切な原核生物又は真核生物の宿主細胞において発現が行われ、細胞(上清又は溶解後の細胞)から抗体が回収される。抗体の組換え産生のための一般方法は、本技術水準において周知のものであり、例えば、Makrides,S.C.、Protein Expr.Purif.17(1999)183〜202;Geisse,S.ら、Protein Expr.Purif.8(1996)271〜282;Kaufman,R.J.、Mol.Biotechnol.16(2000)151〜160;Werner,R.G.、Drug Res.48(1998)870〜880の総説論文に記載されている。

0091

二重特異性抗体は、適宜、例えば、プロテインAセファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーゲル電気泳動透析又はアフィニティークロマトグラフィー等、従来の免疫グロブリン精製手順により培養培地から分離される。モノクローナル抗体をコードするDNA及びRNAは、従来の手順を用いて容易に単離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなDNA及びRNAの供給源として役立つことができる。DNAを単離したら、発現ベクターに挿入し、次に、そのままでは免疫グロブリンタンパク質を産生することのないHEK293細胞、CHO細胞又は骨髄腫細胞等、宿主細胞にトランスフェクトして、宿主細胞における組換えモノクローナル抗体の合成を得ることができる。

0092

本願において用いられる用語「宿主細胞」は、本発明に係る抗体を作製するために操作することのできるいずれかの種類の細胞系を表示する。一実施態様では、HEK293細胞及びCHO細胞が、宿主細胞として用いられる。本明細書において、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に用いられ、このような命名は全て、後代を包含する。よって、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、初代対象(primary subject)細胞及び継代(transfer)の数を問わずそれから派生する培養物を包含する。あらゆる後代が、計画的又は偶発性の変異により、DNA含量が正確に同一であるとは限らないことも理解される。本来の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同一機能又は生物活性を有するバリアント後代が包含される。

0093

NS0細胞における発現は、例えば、Barnes,L.M.ら、Cytotechnology 32(2000)109〜123;Barnes,L.M.ら、Biotech.Bioeng.73(2001)261〜270により記載されている。一過性発現は、例えば、Durocher,Y.ら、Nucl.Acids.Res.30 E9(2002)により記載されている。可変ドメインのクローニングは、Orlandi,R.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(1989)3833〜3837;Carter,P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)4285〜4289;及びNorderhaug,L.ら、J.Immunol.Methods 204(1997)77〜87により記載されている。好ましい一過性発現系(HEK293)は、Schlaeger,E.−J.and Christensen,K.、Cytotechnology 30(1999)71〜83及びSchlaeger,E.−J.、J.Immunol.Methods 194(1996)191〜199により記載されている。

0094

原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーター、必要に応じてオペレーター配列及びリボソーム結合部位を包含する。真核生物の細胞は、プロモーター、エンハンサー及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。

0095

核酸は、別の核酸配列と機能的な関係性に置かれている場合、「作動可能に連結」されている。例えば、プレ配列又は分泌型リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に関与するタンパク質前駆体として発現される場合、該ポリペプチドのDNAに作動可能に連結されている。プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、該コード配列に作動可能に連結されている。あるいは、リボソーム結合部位は、翻訳を容易にするよう配置されている場合、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、「作動可能に連結」は、連結されているDNA配列が、近接していることを意味し、分泌型リーダーの場合、近接し、読み枠内にあることを意味する。しかし、エンハンサーは、近接していなくてもよい。連結は、簡便な制限部位におけるライゲーションにより達成される。このような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーは、従来の慣例を踏まえて用いられる。

0096

フコースの量が低下した本発明に係る抗体は、GnTIII活性を有するポリペプチド及びManII活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1種の核酸を、Fc領域におけるオリゴ糖を本発明に従ってフコシル化できる量で発現するよう操作された、糖改変された宿主細胞において発現させることができる。一実施態様では、GnTIII活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドである。あるいは、米国特許第6,946,292号明細書に従って宿主細胞のα1,6−フコシル基転移酵素活性を減少又は排除させて、糖改変された宿主細胞を作製することができる。抗体フコシル化の量は、例えば、発酵条件又は異なるフコシル化量を有する少なくとも2種の抗体の組み合わせのいずれかにより予め定めることができる。

0097

フコースの量が低下した本発明に係る抗体は、(a)前記抗体の産生を可能にする条件かつ本発明に係る量で前記抗体のFc領域に存在するオリゴ糖のフコシル化を可能にする条件下で、GnTIII活性及び/又はManII活性を有する融合ポリペプチドをコードする少なくとも1種のポリヌクレオチドを発現するよう操作された宿主細胞を培養することと、(b)前記抗体を単離することとを含む方法により、宿主細胞において産生することができる。一実施態様では、GnTIII活性を有するポリペプチドは、融合ポリペプチドであり、好ましくは、GnTIIIの触媒ドメインと、マンノシダーゼIIの局在化ドメイン、β(1,2)−N−アセチルグルコサミン転移酵素I(「GnTI」)の局在化ドメイン、マンノシダーゼ(marmosidase)Iの局在化ドメイン、β(1,2)−N−アセチルグルコサミン転移酵素II(「GnTII」)の局在化ドメイン及びα−1,6コアフコシル基転移酵素の局在化ドメインからなる群から選択される異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在化ドメインとを含む。好ましくは、ゴルジ局在化ドメインは、マンノシダーゼII又はGnTI由来である。

0098

本明細書において、「GnTIII活性を有するポリペプチド」は、N結合型オリゴ糖トリマンノシルコアのβ−結合型マンノシドへのβ−1,4結合におけるN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基の付加を触媒することができるポリペプチドを指す。これは、用量依存性あり又はなしで特定の生物学的アッセイにおいて測定した際に、国際生化学分子生物学連合命名法委員会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)(NC−IUBMB)に従ったβ−1,4−マンノシル−糖タンパク質4−ベータ−N−アセチルグルコサミン転移酵素(EC2.4.1.144)としても知られるβ−1,4−N−アセチルグルコサミン転移酵素IIIの活性と同様の、但し必ずしも同一でなくてもよい酵素活性を提示する融合ポリペプチドを包含する。用量依存性が存在する場合、これは、GnTIIIと同一である必要はないが、寧ろGnTIIIと比較して所定の活性における用量依存と実質的に同様である(即ち、候補ポリペプチドは、GnTIIIと比べてより大きい活性、あるいはせいぜい約25倍低い、好ましくは、せいぜい約10倍低い活性、最も好ましくは、せいぜい約3倍低い活性を提示するであろう)。本明細書において、用語「ゴルジ局在化ドメイン」は、ゴルジ複合体内の位置におけるポリペプチド繋留の原因となるゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般に、局在化ドメインは、酵素アミノ末端テール」を含む。

0099

フコースの量が低下した本発明に係る抗体の産生のため、同様に、改変されたグリコフォームを有する抗体を産生することができ、それが可能になるよう操作された宿主細胞を用いることができる。このような宿主細胞は、GnTIII活性を有する一又は複数のポリペプチドを増加レベルで発現するよう更に操作されている。CHO細胞は、このような宿主細胞として好ましい。同様に、ADCCが増加した抗体組成物を産生する細胞が、米国特許第6,946,292号明細書において報告されている。

0100

抗体の精製は、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成(banding)、カラムクロマトグラフィーアガロースゲル電気泳動及び本技術分野において周知のその他を包含する標準技法により、細胞構成成分又は他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸又はタンパク質を排除するために行われる。Ausubel,F.ら(編)Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing and Wiley Interscience、New York(1987)を参照されたい。微生物タンパク質によるアフィニティークロマトグラフィー(例えば、プロテインA又はプロテインGアフィニティークロマトグラフィー)、イオン交換クロマトグラフィー(例えば、陽イオン交換カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換アミノエチル樹脂)及び混合モード(mixed−mode)の交換)、チオフィリック(thiophilic)吸着(例えば、ベータ−メルカプトエタノール及び他のSHリガンドによる)、疎水性相互作用又は芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック(arenophilic)樹脂又はm−アミノフェニルボロン酸による)、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Ni(II)及びCu(II)親和性材料による)、分子ふるいクロマトグラフィー並びに電気泳動的方法(ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等)等、タンパク質精製のために、様々に異なる方法が十分に確立され、広く用いられている(Vijayalakshmi,M.、A.、Appl.Biochem.Biotech.75(1998)93〜102)。

0101

本明細書において、表現「細胞」、「細胞株」及び「細胞培養物」は、互換的に用いられ、このような命名は全て、後代を包含する。よって、単語「形質転換体」及び「形質転換された細胞」は、初代対象細胞及び継代の数を問わずそれから派生する培養物を包含する。あらゆる後代は、計画的又は偶発性の変異により、DNA含量が正確に同一であるとは限らないことも理解される。本来の形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同一機能又は生物活性を有するバリアント後代が包含される。別個の命名が企図されている場合、文脈から明らかになるであろう。

0102

本明細書における用語「形質転換」は、宿主細胞にベクター/核酸を移入させる過程を指す。手強い細胞壁障壁を持たない細胞が宿主細胞として用いられる場合、例えば、Graham,F.L.及びVan der Eb,A.J.、Virology 52(1973)456〜467により記載されているリン酸カルシウム沈殿方法によりトランスフェクションが行われる。しかし、核インジェクション又はプロトプラスト融合による等、DNAを細胞に導入するための他の方法を用いることもできる。原核生物の細胞又は実質的な細胞壁構築物を含有する細胞が用いられる場合、例えば、トランスフェクションの一方法は、Cohen,S.N.ら、PNAS.69(1972)2110〜2114により記載されている、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理である。

0103

本明細書において、「発現」は、核酸がmRNAに転写される過程及び/又は転写されたmRNA(転写産物とも称される)が、続いてペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質に翻訳される過程を指す。転写産物及びコードされたポリペプチドは、遺伝子産物と総称される。ポリヌクレオチドが、ゲノムDNAに由来する場合、真核生物の細胞における発現は、mRNAのスプライシングを包含し得る。

0104

「ベクター」は、挿入された核酸分子を宿主細胞の内部及び/又はその間に移入する、特に自己複製する核酸分子である。この用語は、DNA又はRNAを細胞に挿入するために主として機能するベクター(例えば、染色体組み込み)、DNA又はRNAを複製するために主として機能する複製ベクター、及びDNA又はRNAを転写及び/又は翻訳させるために機能する発現ベクターを包含する。記載されている機能のうち2種以上を提供するベクターも包含される。

0105

「発現ベクター」は、適切な宿主細胞に導入されると、転写され、ポリペプチドに翻訳されることのできるポリヌクレオチドである。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるよう機能できる発現ベクターで構成された、適した宿主細胞を指す。

0106

「単離された」抗体は、その天然の環境の構成成分から分離された抗体である。一部の実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動(例えば、SDS−PAGE、等電点電気泳動(IEF)、キャピラリー電気泳動)又はクロマトグラフィー(例えば、イオン交換又は逆相HPLC)により決定される、95%又は99%を超える純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説に関して、例えば、Flatman,S.ら、J.Chromatogr.B 848(2007)79〜87を参照されたい。

0107

イムノコンジュゲート
本発明は、また、化学療法薬剤もしくは薬物、成長阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物もしくは動物起源タンパク質毒素、酵素活性毒素もしくはこれらの断片)又は放射性同位元素等、一又は複数の細胞傷害性薬物コンジュゲートされた本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体を含むイムノコンジュゲートを提供する。

0108

「イムノコンジュゲート」は、細胞傷害性薬物等が挙げられるがこれらに限定されない一又は複数の異種分子にコンジュゲートされた抗体である。

0109

本明細書における用語「細胞傷害性薬物」は、細胞機能を阻害もしくは防止する、及び/又は細胞死もしくは破壊を引き起こす物質を指す。細胞傷害性薬物として、放射性同位元素(例えば、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素);化学療法の薬剤又は薬物(例えば、メトトレキサートアドリアマイシン(adriamicin)、ビンカアルカロイドビンクリスチンビンブラスチンエトポシド)、ドキソルビシンメルファランマイトマイシンCクロラムブシルダウノルビシン又は他の挿入剤);成長阻害剤;核酸分解酵素等、酵素及びその断片;抗生物質;細菌、真菌、植物又は動物起源の小分子毒素又は酵素活性毒素等、毒素(これらの断片及び/又はバリアントを包含);並びに下に開示する様々な抗腫瘍又は抗癌剤が挙げられるがこれらに限定されない。

0110

一実施態様では、イムノコンジュゲートは、抗体が、一又は複数の医薬にコンジュゲートされた抗体−薬物コンジュゲートADC)であり、薬物の例として、マイタンシノイド(米国特許第5,208,020号明細書、米国特許第5,416,064号明細書及び欧州特許第0425235(B1)号明細書を参照);モノメチルオーリスタチン薬物部分DE及びDF(MMAE及びMMAF)等、オーリスタチン(auristatin)(米国特許第5,635,483号明細書、米国特許第5,780,588号明細書及び米国特許第7,498,298号明細書を参照);ドラスタチンカリチアマイシン又はその誘導体(米国特許第5,712,374号明細書、米国特許第5,714,586号明細書、米国特許第5,739,116号明細書、米国特許第5,767,285号明細書、米国特許第5,770,701号明細書、米国特許第5,770,710号明細書、米国特許第5,773,001号明細書及び米国特許第5,877,296号明細書;Hinman,L.M.ら、Cancer Res.53(1993)3336〜3342;及びLode,H.N.ら、Cancer Res.58(1998)2925〜2928を参照);ダウノマイシン又はドキソルビシン等、アントラサイクリン(Kratz,F.ら、Curr.Med.Chem.13(2006)477〜523;Jeffrey,S.C.ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.16(2006)358〜362;Torgov,M.Y.ら、Bioconjug.Chem.16(2005)717〜721;Nagy,A.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)829〜834;Dubowchik,G.M.ら、Bioorg.&Med.Chem.Letters 12(2002)1529〜1532;King,H.D.ら、J.Med.Chem.45(2002)4336〜4343;及び米国特許第6,630,579号明細書を参照);メトトレキサート;ビンデシンドセタキセルパクリタキセル、ラロタキセル(larotaxel)、テセタキセル(tesetaxel)及びオルタタキセル(ortataxel)等、タキサントリコテシン;並びにCC1065等が挙げられるがこれらに限定されない。

0111

別の一実施態様では、イムノコンジュゲートは、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートされた本明細書に記載されている抗体を含み、酵素活性毒素又はその断片の例として、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素非結合活性断片外毒素A鎖(緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシン(modeccin)A鎖、アルファ−サルシン(sarcin)、アレウリテス・フォルディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII及びPAP−S)、ニガウリ(momordica charantia)阻害剤、カーシン(curcin)、クロチン(crotin)、サポナリアオフィシナリス(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニンミトゲリン(mitogellin)、レストクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテシン(tricothecene)等が挙げられるがこれらに限定されない。

0112

別の一実施態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートされて放射性コンジュゲートを形成した、本明細書に記載されている抗体を含む。種々の放射性同位元素が、放射性コンジュゲートの産生に利用できる。例として、At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及びLuの放射性同位元素が挙げられる。放射性コンジュゲートが検出に用いられる場合、放射性コンジュゲートは、シンチグラフィー試験のための放射性原子、例えばTC99mもしくはI123、又は再びヨウ素−123、ヨウ素−131、インジウム−111、フッ素−19、炭素−13、窒素−15、酸素−17、ガドリニウムマンガンもしくは鉄等、核磁気共鳴(NMR)画像(磁気共鳴画像MRIとしても知られる)のためのスピン標識を含むことができる。

0113

N−サクシニミジル−3−(2−ピリジルジチオプロピオネート(SPDP)、サクシニミジル−4−(N−マレイミドメチルシクロヘキサン−1−カルボキシレートSMCC)、イミノチオラン(IT)、イミドエステル二官能性誘導体(ジメチルアジイミデート(adipimidate)HCl等)、活性エステルスベリン酸ジサクシニミジル等)、アルデヒドグルタルアルデヒド等)、ビスアジド化合物(ビス(p−アジドベンゾイルヘキサンジアミン等)、ビス−ジアゾニウム誘導体(ビス−(p−ジアゾニウムベンゾイル)−エチレンジアミン等)、ジイソシアネートトルエン2,6−ジイソシアネート等)及びビス−活性フッ素化合物(1,5−ジフルオロ−2,4−ジニトロベンゼン等)等、種々の二官能性タンパク質カップリング剤を用いて、抗体及び細胞傷害性薬物のコンジュゲートを作製することができる。例えば、Vitetta,E.S.ら、Science 238(1987)1098〜1104に記載されている通り、リシン免疫毒素を調製することができる。炭素−14標識された1−イソチオシアネートベンジル(isothiocyanatobenzyl)−3−メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX−DTPA)は、抗体へと放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするための例示的なキレート剤である。国際公開第94/11026号を参照されたい。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を容易にする「開裂可能リンカー」となり得る。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari,R.V.ら、Cancer Res.52(1992)127〜131;米国特許第5,208,020号明細書)を用いることができる。

0114

イムノ(immunuo)コンジュゲート又はADCとして、クロスリンカー試薬により調製されたこのようなコンジュゲートを本明細書において明確に考慮するがこれらに限定されず、クロスリンカー試薬の例として、BMPS、EMCS、GMBSHBVS、LC−SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、スルホ−EMCS、スルホ−GMBS、スルホ−KMUS、スルホ−MBS、スルホ−SIAB、スルホ−SMCC及びスルホ−SMPB並びにSVSB(サクシニミジル−(4−ビニルスルホンベンゾエート)等が挙げられるがこれらに限定されず、これらは(例えば、Pierce Biotechnology,Inc.、米国イリノイロックフォードから)市販されている。

0115

診断及び検出のための方法及び組成物
所定の実施態様では、本明細書において提供される抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体は、生体試料におけるEGFR及び/又はIGF−1Rの存在の検出に有用である。本明細書における用語「検出」は、定量的又は定性的検出を網羅する。所定の実施態様では、生体試料は、腫瘍組織等、細胞又は組織を含む。

0116

一実施態様では、診断又は検出の方法において用いるための本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体が提供される。更に別の一態様において、生体試料におけるEGFR及び/又はIGF−1Rの存在を検出する方法が提供される。所定の実施態様では、方法は、EGFR及び/又はIGF−1Rと本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体との結合に許容的な条件下で、本明細書に記載されている抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体と生体試料を接触させることと、抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体とEGFR及び/又はIGF−1Rとの間で複合体が形成されるか検出することとを含む。このような方法は、インビトロ又はインビボ方法となり得る。一実施態様では、例えば、EGFR及び/又はIGF−1Rが、患者の選択のためのバイオマーカーである場合、本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体は、抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体を用いた治療法適格な対象の選択に用いられる。

0117

本発明の抗体を用いて診断され得る例示的な障害として、癌が挙げられる。

0118

所定の実施態様では、標識された抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体が提供される。標識として、直接的に検出される標識又は部分(蛍光発色団高電子密度化学発光及び放射性標識等)と共に、間接的に、例えば、酵素反応又は分子相互作用により検出される酵素又はリガンド等の部分が挙げられるがこれらに限定されない。例示的な標識として、放射性同位元素32P、14C、125I、3H及び131I、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体等のフルオロフォアダンシルウンベリフェロンルシフェラーゼ(luceriferase)、例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ(米国特許第4,737,456号明細書)、ルシフェリン、2,3−ジヒドロフタラジンジオン西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリホスファターゼβ−ガラクトシダーゼグルコアミラーゼリゾチーム糖類オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−6−リン酸脱水素酵素ウリカーゼ等の複素環オキシダーゼ及びキサンチンオキシダーゼ、HRP等の色素前駆物質を酸化するために過酸化水素を用いる酵素とカップリングしたもの、ラクトペルオキシダーゼ又はミクロペルオキシダーゼ(microperoxidase)、ビオチンアビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定的なフリーラジカルその他が挙げられるがこれらに限定されない。

0119

薬学的製剤
本明細書において提供される二重特異性抗体の薬学的製剤は、一又は複数の必要に応じた薬学的に許容される担体(Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A.(編)(1980))と、所望の程度の純度を有するこのような抗体を混合することにより、凍結乾燥された製剤又は水溶液の形態で調製される。薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる薬用量及び濃度においてレシピエントに対し無毒性であり、その例として:リン酸塩クエン酸塩及び他の有機酸等、バッファーアスコルビン酸及びメチオニンを包含する抗酸化剤保存料塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化ヘキサメトニウム塩化ベンザルコニウム塩化ベンゼトニウムフェノールブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等、アルキルパラベンカテコールレゾルシノールシクロヘキサノール;3−ペンタノール;及びm−クレゾール等);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミンゼラチン又は免疫グロブリン等、タンパク質;ポリビニルピロリドン)等、親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン等、アミノ酸;グルコース、マンノース又はデキストリンを包含する単糖類二糖類及び他の炭水化物EDTA等、キレート剤;スクロースマンニトールトレハロース又はソルビトール等、糖;ナトリウム等、塩形成対イオン金属複合体(例えば、Zn−タンパク質複合体);及び/又はポリエチレングリコール(PEG)等、非イオン性界面活性剤が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質(sHASEGP)、例えば、rhuPH20(HYLENEX(登録商標)、Baxter International,Inc.)等のヒト可溶性PH−20ヒアルロニダーゼ糖タンパク質等、間質性(interstitial)薬物分散剤を更に包含する。rhuPH20を包含する特定の例示的なsHASEGP及び使用方法は、米国特許出願公開第2005/0260186号及び同第2006/0104968号明細書に記載されている。一態様において、sHASEGPは、コンドロイチナーゼ等、一又は複数の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わされる。

0120

例示的な凍結乾燥された抗体製剤は、米国特許第6,267,958号明細書に記載されている。水性抗体製剤は、米国特許第6,171,586号明細書及び国際公開第2006/044908号に記載されている製剤を包含し、後者の製剤は、酢酸ヒスチジンバッファーを包含する。

0121

本明細書における製剤は、処置されている特定の徴候の必要に応じて、2種以上の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えることのない相補的活性を有する有効成分を含有することもできる。このような有効成分は、企図される目的に有効な量で組み合わせて適宜存在する。

0122

有効成分は、例えば、コロイド性薬物送達系(例えば、リポソームアルブミンマイクロスフェアマイクロエマルションナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションにおいて、コアセルベーション技法により又は界面重合により調製されたマイクロカプセルに、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに封入することができる。このような技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第16版、Osol,A.(編)(1980)において開示されている。

0123

徐放調製物を調製することができる。徐放調製物の適した例として、抗体を含有する固体疎水性ポリマー半透性マトリクスであって、成形された物品、例えば、フィルム又はマイクロカプセルの形態のマトリクスが挙げられる。

0124

用語「薬学的製剤」は、そこに含有される有効成分の生物活性が有効となることを可能にするような形態の、製剤が投与される対象が許容できない毒性を有する追加的な構成成分を含有しない調製物を指す。

0125

「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒性の、有効成分以外の薬学的製剤における成分を指す。薬学的に許容される担体として、バッファー、賦形剤、安定剤又は保存料が挙げられるがこれらに限定されない。

0126

インビボ投与に用いられる製剤は一般に、無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成することができる。

0127

本発明の一実施態様は、本発明に係る二重特異性抗体を含む薬学的製剤である。

0128

治療の方法及び組成物
本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかを、治療方法において用いることができる。

0129

一態様において、薬物として用いるための二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体が提供される。更に別の態様において、癌の治療において使用するための二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体が提供される。所定の実施態様では、処置方法において用いるための二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体が提供される。所定の実施態様では、本発明は、有効量の二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体を個体に投与することを含む、癌を有する個体を処置する方法において用いるための二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体を提供する。このような一実施態様では、方法は、有効量の少なくとも1種の追加的な治療剤、例えば、後述する治療剤を個体に投与することを更に含む。更に別の実施形態において、本発明は、細胞増殖、特に、癌細胞増殖の阻害において用いるための二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体を提供する。所定の実施態様では、本発明は、有効量の二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体を個体に投与して、細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害することを含む、個体における細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害する方法において用いるための二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体を提供する。上述の実施形態のいずれかに係る「個体」は、好ましくは、ヒトである。

0130

更に別の一態様において、本発明は、薬物の製造又は調製における、二重特異性抗EGFR/抗IGF−1R抗体の使用を提供する。一実施態様では、薬物は、癌を処置するためのものである。更に別の一実施態様では、薬物は、癌を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、癌を処置する方法において用いるためのものである。このような一実施態様では、方法は、有効量の少なくとも1種の追加的な治療剤、例えば、後述する治療剤を個体に投与することを更に含む。更に別の一実施態様では、薬物は、細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害するためのものである。更に別の一実施態様では、薬物は、有効な量の医薬を個体に投与して、細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害することを含む、個体における細胞増殖、特に、癌細胞増殖を阻害する方法において用いるためのものである。上述の実施形態のいずれかに係る「個体」は、ヒトとなり得る。一実施態様では、「個体」は、ヒトである。

0131

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、IGF−1Rリン酸化及びEGFRリン酸化を阻害する(実施例4を参照)。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で、A549癌細胞におけるIGF−1Rリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で、BxPC3癌細胞におけるIGF−1Rリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で、TC−71癌細胞におけるIGF−1Rリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.23nM以下のIC50で、A549癌細胞におけるEGFRリン酸化を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.90nM以下のIC50で、BxPC3癌細胞におけるEGFRリン酸化を阻害する。

0132

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、癌細胞増殖又は腫瘍細胞増殖を阻害する(実施例5を参照)。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.20nM以下のIC50で(好ましくは、0.15nM以下のIC50で)、A549癌細胞の増殖を阻害する。一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、0.10nM以下のIC50で(好ましくは、0.05nM以下のIC50で)、RD−ES癌細胞の増殖を阻害する。

0133

本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、65%以下(好ましくは、50〜5%の間)の量のフコースにより糖鎖工学的に操作され、癌細胞においてADCCを誘導する(実施例7を参照)。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、65%以下(好ましくは、50〜5%の間)の量のフコースにより糖鎖工学的に操作され、0.10nM以下のEC50でH460M2癌細胞におけるADCCを誘導する。本発明の一実施態様では、本発明に係る二重特異性抗体は、65%以下(好ましくは、50〜5%の間)の量のフコースにより糖鎖工学的に操作され、0.15nM以下のEC50でH322M癌細胞におけるADCCを誘導する。

0134

本明細書における用語「癌」は、リンパ腫リンパ性白血病肺癌非小細胞(NSCL)癌、細気管支肺胞性(bronchioloalviolar)細胞肺癌骨癌膵臓癌皮膚癌、頭部もしくは頸部の癌、皮膚性もしくは眼内メラノーマ子宮癌卵巣癌直腸癌肛門領域の癌、胃癌の癌、結腸癌乳癌、子宮癌、卵管がん子宮内膜のがん、子宮頸部のがん、のがん、外陰部のがん、ホジキン病食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、軟部組織肉腫尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌膀胱の癌、腎臓もしくは尿管の癌、腎臓細胞がん腎盂のがん、中皮腫肝細胞癌胆道癌中枢神経系(CNS)の新生物脊髄腫瘍脳幹神経膠腫多形神経膠芽腫星状細胞腫シュワン腫(schwanoma)、上衣腫(ependymona)、髄芽腫髄膜腫扁平細胞がん、下垂体腺腫及びユーイング肉腫等、上述の癌のいずれかの不応性バージョン又は上述の癌のうち1種もしくは複数種の組み合わせを包含する、増殖性疾患を指す。

0135

「個体」又は「対象」は、哺乳類である。哺乳類として、飼い慣らされた動物(例えば、ウシヒツジネコ、イヌ及びウマ)、霊長類(例えば、ヒト及びサル等の非ヒト霊長類)、ウサギ及び齧歯類(例えば、マウス及びラット)が挙げられるがこれらに限定されない。所定の実施態様では、個体又は対象は、ヒトである。

0136

「有効量」の薬剤、例えば、薬学的製剤は、所望の治療的又は予防的結果を達成するための、必要な薬用量及び期間における有効な量を指す。

0137

本明細書において、「処置」(及びその文法上の変種、「処置する」又は「処置している」等)は、処置されている個体の自然の経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防法のため、あるいは臨床病理学の経過において行うことができる。処置の望ましい効果として、疾患の発生又は再発の予防、症状の軽減、疾患のいずれかの直接的又は間接的病理学的結果の縮小、転移の予防、疾患進行速度の減少、病状寛解又は緩和及び緩解又は改善された予後が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本発明の抗体は、疾患の発症遅延させるため、あるいは疾患の進行を遅らせるために用いられる。

0138

更に別の一態様において、本発明は、例えば上述の治療方法のいずれかにおける使用のための、本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかを含む薬学的製剤を提供する。一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかと、薬学的に許容される担体とを含む。別の一実施態様では、薬学的製剤は、本明細書に提供される二重特異性抗体のいずれかと、少なくとも1種の追加的な治療剤、例えば、後述する治療剤とを含む。

0139

本発明の抗体は、治療法において単独で、あるいは他の薬剤と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも1種の追加的な治療剤と同時投与することができる。

0140

上記のこのような併用療法は、組み合わせた投与(同一又は別々の製剤に2種以上の治療剤が包含される場合)と、別々の投与とを網羅し、別々の投与の場合、本発明の抗体の投与は、追加的な治療剤及び/又はアジュバントの投与の前に、同時に及び/又は後に行うことができる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて用いることもできる。本発明の抗体(及びいずれかの追加的な治療剤)は、非経口的、肺内及び鼻腔内を包含するいずれかの適した手段により投与することができ、局所的処置に望ましい場合、病巣内投与を包含する。非経口的注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を包含する。投薬は、一部には、投与が短期であるか慢性であるかに応じて、いずれかの適した経路、例えば、静脈内又は皮下注射等、注射により行うことができる。様々な時点に及ぶ単数又は複数回投与ボーラス投与及びパルス注入等が挙げられるがこれらに限定されない様々な投薬スケジュールが、本明細書において考慮される。

0141

本発明の抗体は、優れた医療行為と調和した様式で処方、服用及び投与されるであろう。本文脈における検討のための因子は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジューリング及び医師にとって公知の他の因子を包含する。抗体は、そうである必要はないが、必要に応じて、問題になっている障害の予防又は処置に現在用いられている一又は複数の薬剤と共に処方される。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在する抗体の量、障害又は処置の種類及び上に記す他の因子に依存する。これらは、一般に、同一薬用量で、本明細書に記載されている投与経路により、あるいは本明細書に記載されている薬用量の約1〜99%で、あるいは適切であると経験的に/臨床的に決定されるいずれかの薬用量で、いずれかの経路により用いられる。

0142

疾患の予防又は処置のため、本発明の抗体(単独で、あるいは一又は複数の他の追加的な治療剤と組み合わせて用いられる場合)の適切な薬用量は、処置される疾患の種類、抗体の種類、疾患の重症度及び経過、抗体が予防目的のために投与されるのか治療目的のために投与されるか、以前の治療法、患者の臨床歴及び抗体に対する応答及び通院中の医者の裁量に依存するであろう。抗体は、一度に、あるいは一連の処置にわたり患者に適宜投与される。疾患の種類及び重症度に応じて、約1μg/kg〜15mg/kg(例えば、0.5mg/kg〜10mg/kg)の抗体が、例えば、1回又は複数回の別々の投与によるものであれ、持続的注入によるものであれ、患者への投与のための初回候補薬用量となり得る。ある典型的な一日薬用量は、上述の因子に応じて、約1μg/kg〜100mg/kg以上に及び得る。数日又はそれ以上にわたる反復投与のため、状態に依存して、処置は一般に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されるであろう。抗体のある例示的な薬用量は、約0.05mg/kg〜約10mg/kgの範囲となるであろう。よって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kg(又はそのいずれかの組み合わせ)の1又は複数の用量を、患者に投与することができる。このような用量は、断続的に、例えば、1週間毎又は3週間毎に投与することができる(例えば、患者が、約2〜約20又は例えば、約6用量の抗体を受けるように)。初回により高い負荷用量、続いて1回又は複数回のより低い用量を投与してもよい。例示的な投薬レジメンは、例えば、約4mg/kgの初回負荷用量、続いて約2mg/kgの毎週維持用量の抗体の投与を含む。しかし、他の薬用量レジメンも有用となり得る。この治療法の進行は、従来の技法及びアッセイにより容易にモニターされる。

0143

本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体の代わりに又はそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを用いて、上述の製剤又は治療方法のいずれかを行うことができると理解される。

0144

本発明の別の一態様は、癌の治療において使用するための本発明に係る二重特異性抗体である。

0145

本発明の別の一態様は、癌の治療のための医薬の製造のための、本発明に係る二重特異性抗体の使用である。

0146

本発明の別の一態様は、このような治療を必要とする患者に、本発明に係る二重特異性抗体を投与することによる、癌を患う患者の処置の方法である。

0147

製造品
本発明の別の一態様において、上に記載されている障害の処置、予防及び/又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と、該容器上の又はこれに付随するラベル又は添付文書とを含む。適した容器は、例えば、瓶、バイアルシリンジ、IV溶液バッグ等を包含する。容器は、ガラス又はプラスチック等、種々の材料から形成することができる。容器は、それ自体のみで、あるいは別の組成物と組み合わせて状態の処置、予防及び/又は診断に有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる(例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、あるいは皮下注射針で刺し通すことができる栓を有するバイアルとなり得る)。組成物における少なくとも1種の活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、最適な状態の処置に用いられることを示す。更に、製造品は、(a)本発明の抗体を含む組成物が含有された第1の容器と、(b)更に別の細胞傷害性さもなければ治療剤を含む組成物が含有された第2の容器とを含むことができる。本発明の本実施形態における製造品は、該組成物を特定の状態の処置に用いることができることを示す添付文書を更に含むことができる。あるいは、又は更に、製造品は、注射用静菌水(BWFI)、リン酸緩衝食塩水リンゲル溶液及びデキストロース溶液等、薬学的に許容されるバッファーを含む第2の(又は第3の)容器を更に含むことができる。これは、他のバッファー、希釈剤フィルター、針及びシリンジを包含する、商業上及び利用者の観点から望ましい他の材料を更に包含することができる。

0148

用語「添付文書」は、このような治療薬品の使用に関与する徴候、利用法、薬用量、投与、併用療法、禁忌及び/又は警告に関する情報を含有する、治療用薬品の商用パッケージに通例包含される説明書を指すよう用いられる。

0149

上述の製造品のいずれかが、本発明に係る抗EGFR/抗IGF−1R二重特異性抗体の代わりに、あるいはそれに加えて、本発明のイムノコンジュゲートを包含し得ることが理解される。

0150

配列の説明
a)アミノ酸配列:
配列番号1重鎖CDR1、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号2 重鎖CDR2、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号3 重鎖CDR3、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号4軽鎖CDR1、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号5 軽鎖CDR2、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号6 軽鎖CDR3、ヒト化<EGFR>ICR62
配列番号7重鎖可変ドメイン、ヒト化<EGFR>ICR62−I−HHD
配列番号8軽鎖可変ドメイン、ヒト化<EGFR>ICR62−I−KC
配列番号9 重鎖CDR1、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号10 重鎖CDR2、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号11 重鎖CDR3、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号12 軽鎖CDR1、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号13 軽鎖CDR2、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号14 軽鎖CDR3、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号15 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号16 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>HUMAB−クローン18
配列番号17 重鎖CDR1、<IGF−1R>F13B5(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号18 重鎖CDR2、<IGF−1R>F13B5
配列番号19 重鎖CDR3、<<IGF−1R>F13B5
配列番号20 軽鎖CDR1、<IGF−1R>F13B5
配列番号21 軽鎖CDR2、<IGF−1R>F13B5
配列番号22 軽鎖CDR3、<IGF−1R>F13B5
配列番号23 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>F13B5
配列番号24 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>F13B5
配列番号25 重鎖CDR1、<IGF−1R>L37F7(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号26 重鎖CDR2、<IGF−1R>L37F7
配列番号27 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L37F7
配列番号28 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L37F7
配列番号29 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L37F7
配列番号30 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L37F7
配列番号31 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L37F7
配列番号32 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L37F7
配列番号33 重鎖CDR1、<IGF−1R>L39D7(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号34 重鎖CDR2、<IGF−1R>L39D7
配列番号35 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L39D7
配列番号36 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L39D7
配列番号37 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L39D7
配列番号38 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L39D7
配列番号39 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L39D7
配列番号40 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L39D7
配列番号41 重鎖CDR1、<IGF−1R>L31D11(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号42 重鎖CDR2、<IGF−1R>L31D11
配列番号43 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L31D11
配列番号44 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L31D11
配列番号45 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L31D11
配列番号46 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L31D11
配列番号47 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D11
配列番号48 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D11
配列番号49 重鎖CDR1、<IGF−1R>L31D7(改変された<IGF−1R>HUMAB−クローン18)
配列番号50 重鎖CDR2、<IGF−1R>L31D7
配列番号51 重鎖CDR3、<<IGF−1R>L31D7
配列番号52 軽鎖CDR1、<IGF−1R>L31D7
配列番号53 軽鎖CDR2、<IGF−1R>L31D7
配列番号54 軽鎖CDR3、<IGF−1R>L31D7
配列番号55 重鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D7
配列番号56 軽鎖可変ドメイン、<IGF−1R>L31D7
配列番号57OA−F13B5−scFab−GA201重鎖1
配列番号58 OA−F13B5−scFab−GA201重鎖2
配列番号59 OA−F13B5−scFab−GA201軽鎖
配列番号60 OA−L31D11−scFab−GA201重鎖1
配列番号61 OA−L31D11−scFab−GA201重鎖2
配列番号62 OA−L31D11−scFab−GA201軽鎖
配列番号63 CM−F13B5−GA201重鎖1
配列番号64 CM−F13B5−GA201重鎖2
配列番号65 CM−F13B5−GA201軽鎖1
配列番号66 CM−F13B5−GA201軽鎖2
配列番号67 CM−L31D11−GA201重鎖1
配列番号68 CM−L31D11−GA201重鎖2
配列番号69 CM−L31D11−GA201軽鎖1
配列番号70 CM−L31D11−GA201軽鎖2
配列番号71 Tv−F13B5−GA201鎖1
配列番号72 Tv−F13B5−GA201鎖2
配列番号73 Tv−L31D11−GA201鎖1
配列番号74 Tv−L31D11−GA201鎖2
配列番号75 ヒトEGFR
配列番号76 ヒトIGF−1R
配列番号77 ヒトカッパー定常軽鎖領域
配列番号78 ヒトラムダ定常軽鎖領域
配列番号79 ヒト定常重鎖領域IgG1(コーカサス人種アロタイプ
配列番号80 ヒト定常重鎖領域IgG1(アフリカ系アメリカ人アロタイプ)
配列番号81 ヒト定常重鎖領域IgG4

0151

b)核酸配列:
配列番号82 Ak18VL及びVHライブラリーのライブラリー鋳型(pRJH61)
配列番号83 ライブラリープライマー配列AM_VL_AK18_L1_ba
配列番号84 ライブラリープライマー配列AM_VL_AK18_L2_fo
配列番号85 ライブラリープライマー配列AM_VH_AK18_H1_ba
配列番号86 ライブラリープライマー配列AM_VH_AK18_H2_fo

0152

次の実施例、配列表及び図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に表記されている。本発明の精神から逸脱することなく、表記された手順において修正を行ってよいことが理解される。

0153

実験手順
実施例
材料及び方法
組換えDNA技法
Sambrook,J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual;Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨークコールドスプリングハーバー(1989)に記載されている通り、標準方法を用いてDNAを操作した。メーカーの説明書に従って、分子生物学試薬を用いた。

0154

DNA及びタンパク質配列解析及び配列データ管理
ヒト免疫グロブリン軽及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般情報は、Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局(1991)NIH Publication No 91−3242において提示されている。抗体鎖のアミノ酸は、EU番号付け(Edelman,G.M.ら、PNAS 63(1969)78〜85;Kabat,E.A.ら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、米国公衆衛生局(1991)NIH Publication No 91−3242)に従って番号付けされる。GCG(Genetics Computer Group、ウィスコンシン州マディソン)のソフトウェアパッケージバージョン10.2及びInfomaxのVectorNTI Advance suiteバージョン8.0を、配列作成、マッピング、解析、アノテーション及び図解に用いた。

0155

DNA配列決定
DNA配列は、SequiServe(ドイツ、バターステッテン)及びGeneart AG(ドイツ、レーゲンスブルク)において、二本鎖配列決定により決定された。

0156

遺伝子合成
Geneart AG(ドイツ、レーゲンスブルク)によって、合成オリゴヌクレオチド及びPCR産物から自動遺伝子合成により、所望の遺伝子セグメントを調製した。scFv抗体断片のC末端付着を有する重又は軽鎖、S354C及びT366W変異を保有する「ノブ・イントゥ・ホール」抗体重鎖、並びに未改変のVHドメイン、交差性(crossed)Cカッパードメイン又はscFab抗体断片と組み合わせた、CH3ドメインにY349C、T366S、L368A及びY407V変異を保有する「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖と共に、未改変の抗体軽鎖又はCH1ドメイン交換軽鎖をコードする遺伝子セグメントは、唯一制限エンドヌクレアーゼ開裂部位(BamHI−XbaI、BamHI−XmnI又はBamHI−KpnI)に隣接し、これをpGA18(ampR)プラスミドにクローニングした。形質転換細菌からプラスミドDNAを精製し、UV分光測定法により濃度を決定した。DNA配列決定により、サブクローニングした遺伝子断片のDNA配列を確認した。全コンストラクトは、真核生物の細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダーペプチド(MGWSCIILFVATATGVHS)をコードする5’端DNA配列を有するよう設計した。

0157

発現プラスミド構築
抗体軽鎖をコードする発現プラスミドと共に、全「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖の構築のためにRoche発現ベクターを用いた。ベクターは、次のエレメントで構成される:
選択マーカーとしてのハイグロマイシン抵抗性遺伝子
エプスタイン・バーウイルスEBV)の複製起点、oriP、
−大腸菌における本プラスミドの複製を可能にする、ベクターpUC18由来の複製起点、
− 大腸菌におけるアンピシリン抵抗性を与えるベータ−ラクタマーゼ遺伝子
ヒトサイトメガロウイルスHCMV)由来の最初期エンハンサー及びプロモーター、
− ヒト1−免疫グロブリンポリアデニル化(「ポリA」)シグナル配列及び
− 独自のBamHI及びXbaI制限部位。

0158

scFv抗体断片のC末端付着を有する重又は軽鎖、未改変のVHドメイン、交差性Cカッパードメイン又はscFab断片を有する「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖と共に未改変の軽鎖又はCH1ドメイン交換軽鎖を含む免疫グロブリン遺伝子を遺伝子合成により調製し、記載されているpGA18(ampR)プラスミドにクローニングした。合成DNAセグメントを保有するpG18(ampR)プラスミド及びRoche発現ベクターをBamHIとXbaI、BamHIとXmnI又はBamHIとKpnIの制限酵素(Roche Molecular Biochemicals)で消化し、アガロースゲル電気泳動に付した。次に、精製された、scFv抗体断片のC末端付着を有する重又は軽鎖、「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖及び未改変又はドメイン交換軽鎖をコードするDNAセグメントを、単離されたRoche発現ベクターBamHI/XbaI、BamHI/XmnI又はBamHI/KpnI断片にライゲーションして、最終発現ベクターを得た。最終発現ベクターを大腸菌細胞に形質転換し、発現プラスミドDNAを単離し(Miniprep)、制限酵素解析及びDNA配列決定に付した。正しいクローンを150mlのLB−Amp培地において培養し、再度プラスミドDNAを単離し(Maxiprep)、DNA配列決定により配列整合性を確認した。

0159

HEK293細胞における二重特異性抗体の一過性発現
メーカーの説明書(Invitrogen、米国)に従ったFreeStyle(商標)293発現系を用いたヒト胚性腎臓293−F細胞の一過性トランスフェクションにより、組換え二重特異性抗体を発現させた。簡単に説明すると、FreeStyle(商標)293発現培地において37℃/8%CO2で、浮遊FreeStyle(商標)293−F細胞を培養し、この細胞を、トランスフェクションの1日前に新鮮培地において1×106生細胞/mlの密度播種した。トランスフェクションのため、250mlの最終トランスフェクション容量において、162.5μlの293−Free(商標)トランスフェクション試薬(Merck、米国)及び125μgのscFvのC末端付着を有する重又は軽鎖をコードするDNAをプラスミド比1:1で、又は「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖1及び2並びに軽鎖プラスミドDNAを1:2:1もしくは1:3:1モル比で用いて、10mlのダルベッコPBS(PAA、オーストリア)においてDNAを調製した。Cross Mabのトランスフェクションのため、プラスミド比1:1:2:2又は1:1:3:2の「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖1:未改変の軽鎖:Cカッパードメイン交換「ノブ・イントゥ・ホール」重鎖2:CH1ドメイン交換軽鎖を調製した。トランスフェクションの7日後に、抗体を含有する細胞培養物上清を、14000g、30分間の遠心分離により収集し、滅菌フィルター(0.22μm)を通して濾過した。精製まで−20℃で上清を貯蔵した。

0160

二重特異性抗体の精製
MabSelectSure−セファロース(商標)(GE Healthcare、スウェーデン)及びSuperdex 200分子ふるい(GE Healthcare、スウェーデン)クロマトグラフィーを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、細胞培養物上清から二重特異性抗体を精製した。簡単に説明すると、滅菌濾過した細胞培養物上清を、PBSバッファー(10mM Na2HPO4、1mM KH2PO4、137mM NaCl及び2.7mM KCl、pH7.4)で平衡化したMabSelectSuRe樹脂において捕捉し、平衡化バッファー洗浄し、25mMクエン酸ナトリウム、pH3.0で溶出した。溶出されたタンパク質画分プールし、2M Tris、pH9.0で中和し、20mMヒスチジン、140mM NaCl、pH6.0で平衡化したSuperdex 200 26/60GL(GE Healthcare、スウェーデン)カラムを用いた分子ふるいクロマトグラフィーにより更に精製した。CE−SDS(Caliper Life Science、米国)により分子ふるいクロマトグラフィー画分を解析し、二重特異性抗体含有画分をプールし、−80℃で貯蔵した。

0161

精製されたタンパク質の解析
アミノ酸配列に基づいて計算したモル吸光係数を用いて、280nmにおける光学密度OD)を測定することにより、精製されたタンパク質試料タンパク質濃度を決定した。マイクロ流体Labchip技術(Caliper Life Science、米国)を用いたCE−SDSにより、二重特異性及び対照抗体の純度、抗体整合性及び分子量を解析した。メーカーの説明書に従い、HTタンパク質発現試薬キットを用いたCE−SDS解析のため、5μlのタンパク質溶液を調製し、HTタンパク質発現チップを用いたLabChip GXIIシステムにおいて解析した。LabChip GXソフトウェアバージョン3.0.618.0を用いてデータを解析した。200mM KH2PO4、250mM KCl、pH7.0ランニングバッファーにおいて25℃で、Superdex200分析的分子ふるいカラム(GE Healthcare、スウェーデン)を用いた高速SECにより、二重特異性及び対照抗体試料凝集体含量を解析した。25μgのタンパク質をカラムに流速0.5ml/分で注射し、均一濃度で50分間にわたり溶出した。ペプチド−N−グリコシダーゼF(Roche Molecular Biochemicals)を用いた酵素処理によるN−グリカンの除去後に、NanoElectrospray Q−TOF質量分析により、低下した二重特異性抗体軽及び重鎖のアミノ酸主鎖の整合性を検証した。

0162

表面プラズモン共鳴
Biacore評価ソフトウェアにより、会合及び解離相の表面プラズモン共鳴シグナルの観察された時間経過を、二重参照(double referencing)(c=0nM及びFC1=ブランク表面に対する)あり、局所バルク効果(RI=0)なしでラングミュア(Langmuir)1:1結合モデル適合させることにより、標準動態を評価した。

0163

MAbへのヒト及びカニクイザル(cyno)IGF−1Rの結合
チップC1における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング;ランニングバッファーHBS−N、T=25℃、EDC/NHSの混合物による活性化;カップリングバッファー10nM NaAc、pH4.5、c=1μg/mLにおいて抗huFc捕捉抗体希釈し、プログラムされた標的レベル200RU(FC1〜FC4における実際の固定化レベル、ほぼ189〜195RU)によりカップリングした;最後に、残りの活性化カルボキシル基を、1Mエタノールアミンの注射により遮断した。PBST+0.1%BSAにおいて1.3nMになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、10μl/分、30秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。捕捉レベル5.4〜9.2RU。FC2〜4において1ラン当たり3種のMAb、FC1は参照として捕捉抗体のみ。分析物としてヒト及びカニクイザル(cyno)IGF−1R結合の動態を37℃、ランニングバッファーPBSTで測定した。一連の3倍増加濃度(PBST+0.1%BSAにおける1.65〜400nM)において、流速50μl/分、120秒間の会合、600秒間の解離で分析物を注射した。10mMグリシンpH1.75/30μl/分を60秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。

0164

MAbへのヒト及びカニクイザル(cyno)EGFRの結合
チップCM5における、メーカーの説明書に従った標準アミンカップリング;ランニングバッファーHBS−N、T=25℃、EDC/NHSの混合物による活性化;カップリングバッファー10mM NaAc、pH4.5、c=4μg/mLにおいて抗huFc捕捉抗体を希釈し、プログラムされた標的レベル1000RU(FC1〜FC4における実際の固定化レベル、ほぼ1170〜1260RU)によりカップリングした;最後に、残りの活性化カルボキシル基を、1Mエタノールアミンの注射により遮断した。PBS+0.1%BSAにおいて10nMになるよう二重特異性又は親抗体を希釈し、別々のサイクルにおいて、10μl/分、30秒間の注射によりリガンドとして捕捉した。捕捉レベル15〜79RU。FC2〜4において1ラン当たり3種のMAb、FC1は参照として捕捉抗体のみ。分析物として単量体ヒトHER1−ECD及びカニクイザル(cyno)EGFR結合の動態を37℃、ランニングバッファーPBSで測定した。一連の3倍増加濃度(PBS+0.1%BSAにおける4.12〜1000nM)において、流速50μl/分、120秒間の会合、1200秒間の解離で分析物を注射した。10mMグリシンpH1.75/30μl/分を60秒間による各サイクルの後に、捕捉抗体を再生した。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

  • 株式会社堀場製作所の「 エクソソーム表面分子を特定する方法」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】本発明はエクソソーム表面分子に対する結合性分子が固相化された担体をカゼイン溶液またはカゼイン分解物溶液でブロックおよび洗浄すること、ならびに該担体とエクソソームを含む被験試料の接触前... 詳細

  • 株式会社資生堂の「 レチノイドの副作用に対する感受性の決定方法」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】SNP解析により遺伝要素に基づいて対象のレチノイドの副作用に対する感受性を決定する方法、レチノイドの副作用に対する感受性を決定するコンピュータ、及び当該コンピュータを制御するプログラ... 詳細

  • 公立大学法人福島県立医科大学の「 大腸がんの予後バイオマーカー」が 公開されました。( 2020/10/29)

    【課題・解決手段】大腸がん患者の予後を予測するための、及び/又は大腸がん患者に対する抗がん剤の有効性を判定するためのバイオマーカーを提供する。GALNT6タンパク質若しくはそのペプチド断片、又はGAL... 詳細

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ