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技術 アルコール及びその誘導体のバイオテクノロジーによる生産

出願人 エボニックデグサゲーエムベーハー
発明者 トーマスハースオリヴァートゥムヤンクリストフプフェファーフィリプエンゲルクリスティアンゲーリングマークスペター
出願日 2012年12月14日 (8年5ヶ月経過) 出願番号 2014-547874
公開日 2015年1月22日 (6年4ヶ月経過) 公開番号 2015-502163
状態 特許登録済
技術分野 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理
主要キーワード 炭素移動 pH電極 制限供給 水非混和性溶剤 ベセル 化石炭素 ルブレドキシン 分配平衡
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (5)

課題・解決手段

本発明は、低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼ発現する微生物アルキルと本発明の細胞を含む水溶液とを接触させることを含む、アルキルの酸化方法に関する。

概要

背景

概要

本発明は、低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼ発現する微生物アルキルと本発明の細胞を含む水溶液とを接触させることを含む、アルキルの酸化方法に関する。

目的

本発明の根底にある課題は、水不混和性溶媒水性媒体からの分離が速やかである、水性媒体と水非混和性溶媒を含む二相系において、アルカンを置換アルカンに変換するための生物工学的方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
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請求項1

低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼ発現する微生物

請求項2

発現したアルカンオキシダーゼが、ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ、チトクロームP450酵素キシレンモノオキシゲナーゼメタンモノオキシゲナーゼ及びその変異体を含む群から選択される、請求項1に記載の微生物。

請求項3

脂肪酸分解能が、脂肪酸インポータ、脂肪酸CoAリガーゼアシルCoAデヒドロゲナーゼ、2,4−ジエノイル−CoAレダクターゼエノイル−CoAヒドラターゼ及び3−ケトアシル−CoAチオラーゼを含む群から選択される酵素をコードする遺伝子の欠失によって低下する、請求項1又は2に記載の微生物。

請求項4

微生物が、原核又は下等真核細胞、好ましくは細菌細胞、最も好ましくは大腸菌である、請求項1から3までのいずれか1項に記載の微生物。

請求項5

微生物が組換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現する、請求項1から4までのいずれか1項に記載の微生物。

請求項6

微生物が組換えトランスアミナーゼを発現する、請求項1から5までのいずれか1項に記載の微生物。

請求項7

微生物が、組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはアラニンデヒドロゲナーゼを発現する、請求項6に記載の微生物。

請求項8

アルキル酸化方法であって、a)アルキルと請求項1から7までのいずれか1項に記載の細胞を含む水溶液とを接触させることを含む、前記方法。

請求項9

請求項8に記載の方法であって、b)工程a)からの水溶液と水非混和性有機溶媒とを接触させることを更に含む、前記方法。

請求項10

請求項9に記載の方法であって、アルキル酸化、好ましくは水溶液からの本発明の細胞の除去を完了させた後に、工程b)を実施する、前記方法。

請求項11

請求項1から6までのいずれか1項に記載の微生物をアルキルの酸化に用いる使用。

請求項12

アルキルが式H−(CH2)x−R(式中、xは1〜30であり、且つRは任意の化学基、好ましくは−OH、−COH、−COOH、−COOR1、−NH2、−NO2、−CN、−OPO3H、−SO3H及び−Hを含む群から選択されるものであり、好ましくはHであり、ここでR1は非置換の直鎖状アルキル、好ましくはメチル及びエチルである)によって表される化合物である、請求項6から10までのいずれか1項に記載の方法又は使用。

請求項13

アルキルが直鎖状アルカン、好ましくは室温でガス状である直鎖状アルカンである、請求項7から11までのいずれか1項に記載の方法又は使用。

請求項14

水非混和性有機溶媒が水非混和性脂肪酸又は脂肪酸エステルである、請求項8から13までのいずれか1項に記載の方法又は使用。

技術分野

0001

本発明は、低減された脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼ発現する微生物、本発明の細胞を含む水溶液アルキルとを接触させることを含む、アルキルの酸化方法に関する。

0002

バイオマスなどの再生可能資源に基づくバルク及びファインケミカルの工業生産は様々な欠点を有する。そのうちの1つは、大容量の水性媒体から当該生成物を抽出する必要性であり、更なる下流処理のために生成物を濃縮するだけでなく、典型的には生細胞を含む水性媒体におけるその濃度を制限することも必要とされる手順である。かかる細胞は、非常に強力であるが、過酷な条件、例えば、高温極端pH値、有害な溶媒、生成物等の存在に曝すことができない敏感な触媒であり、あるいはそれらが溶解して、それらの触媒活性が失われ、細胞破片代謝物質及び高分子が放出されて、これが求められている生成物を汚染するか、更には劣化させる作用をし得る可能性がある。

0003

当該生成物の抽出のために、水性媒体を、典型的には、比較的少量の水非混和性有機溶媒と接触させる。その結果、十分に高い程度の疎水性を有する生成物が水性培養液から放出されて、水非混和性溶媒中に蓄積する。生成物は、その後、水非混和性溶媒と適合する更なる合成工程に供されるか、又は例えば、蒸留又は結晶化によって精製され得る。

0004

化合物が水非混和性有機溶媒を用いて水相から抽出され得るかどうかは、その物理化学特性に依存する。無置換炭素鎖富む又は全て該炭素鎖からなる化合物は溶媒中に入りやすいが、ヘテロ原子又は更には電荷を含む官能基を有する化合物は水相中に広がることが予想されるべきである。

0005

平衡状態に到達した液体二相系における化合物の相対的な分布は、ネルンスト分配法則を用いて記述され得る:
α=cphase1/cphase2
(式中、c1及びc2は、それぞれ、第1及び第2の相における化合物のモル平衡濃度であり、定数kは温度依存性分配係数である)。二相系が水相とオクタノールを含む相を含む場合、化合物の分布特性はKow又はP値を用いて記載されてもよい:
Kow=P=cOctanol/cWater

0006

これらの式は、所定の液体二相系中の化合物の分布を記載しているが、これらは分配平衡に達した場合にのみ適用される。純水及び純粋な水非混和性有機溶媒、例えば、水及びヘキサンが混合される場合、2つの異なる相がほぼ瞬時に現れる。しかしながら、生細胞と水非混和性溶媒を含む水性培地を接触させる場合、この状況は非常に異なる。多数の可能な分子間相互作用のために、水非混和性溶剤の分離は、数日間でなければ数時間行われ、その間に、細胞は潜在的に有毒な溶媒との接触に曝される。従って、到達すべき二相状態に要する時間は、化学物質生物工学的生産の効率的なプロセスを考案すべき場合に最適化されるべきパラメータである。

0007

置換アルカン、例えば、アルコールアルデヒドケトンカルボン酸及びアミンは、化石炭素源から作られた化合物の転換によって従来から製造されている工業クラスの需要のある典型的な化合物である。再生不可能な化石燃料がますます制限供給される時代に、再生可能な資源、即ち、地質学時間スケールの点で容易で、速やかに補給可能な材料を用いて出発する、アルカン及びその誘導体を製造するための生物工学的方法にかなりの関心が寄せられている。

0008

アルカンを対応する置換アルカン、特に酸化されたアルカンに転換するための多数の方法が従来技術において報告されている。メタンモノオキシゲナーゼは、第1段階で、メチロサイナストリコスポリウム及びメチロコッカスカプスラタスなどのメタン資化細菌(Methanotroph)によるメタンの分解において、メタンのCH結合への1つの酸素原子NAD依存性の挿入を触媒してメタノールを形成する。可溶性メタンモノオキシゲナーゼは、典型的には、飽和及び不飽和の直鎖状分枝鎖状、及び環状の約C8までの環状炭化水素、並びに芳香族複素環式、及び塩素化化合物(Merkx M、Kopp DA、SazinskyMH、Blazyk JL、Mueller J、Lippard SJ (2001)、Angew Chem Int Ed Engl 40:2782-2807; Higgins IJ、Best DJ、Hammond RC. 1980年。メタン資化細菌に関する新たな知見は、生物圏におけるその重要性とその商業的可能性を強調している。Nature 286:561-564)を含む広い基質スペクトルを有する。ヘム含有オキシゲナーゼバチルスメガテリウム由来チトクロームP450 BM−3を含むチトクロームP450システムのクラスからの最も顕著なものも、様々な炭素鎖長のアルカンをヒドロキシル化するために分子状酸素を使用し、タンパク質進化に近づいてきた(Koch DJ, Chen, MM, van Beilen, J.B.及びArnold F.H. (2009, Appl. And Environm. Microbiol. 75(2), 337-344)。シュードモナスプチダGPo1からのアルカンモノオキシゲナーゼなどのルブレドキシン依存性アルカンモノオキシゲナーゼが、中鎖長のアルカンの酸化を触媒すると、アルコールとカルボン酸との混合物が得られる(Grant C、Woodley, J. M、及びBaganz, F (2011年) Enzyme and Microbial Technology 48、480〜486頁)。キシレンモノオキシゲナーゼは、バイオテクノロジー又は合成の手法を用いて、その後に様々な他の置換アルカン、例えば、アミン、カルボン酸、アミドアルキルハライドエステルアルケンに転換され得るアルカンをヒドロキシル化する(Bruce, P. Y. (1998), Organic Chemistry, Sec. Ed., Prentic Hall Inc.)。

0009

アルカンは、単結合によって結合された水素原子及び炭素原子のみからなり、それ自体はヘテロ原子を含む官能基がない。その結果、長い非置換の炭素鎖はもちろん、極性官能基で置換された短いアルカンでも、水非混和性有機溶媒に可溶である。最後に、それらアルカン、例えば、メタノール及びエタノールの多くは、反応性であり且つ生物工学的に関連する微生物の増殖、生存率及び代謝に悪影響を及ぼすことが知られている。従って、このような化合物の製造のための多くの生物工学的方法は、水非混和性溶媒を用いる抽出工程を含む。

0010

従って、本発明の根底にある課題は、水不混和性溶媒の水性媒体からの分離が速やかである、水性媒体と水非混和性溶媒を含む二相系において、アルカンを置換アルカンに変換するための生物工学的方法を提供することである。更に詳細には、本発明の根底にある課題は、2相に分離するのに要する時間に関してその中に溶解した置換アルカンと水非混和性溶媒との分離、所定の時間内の溶媒の分離度、その中に溶解した又はその後の更なるプロセスで得られた生成物の収率及び純度並びに水非混和性溶媒と接触した細胞の生存率及び/又は循環使用可能性を改善することである。

0011

本発明の根底にある別の課題は、かかるプロセスに使用され得る細胞を提供することであり、好ましくは、例えば、一般に酸素消費、生産量当たりの酸素消費量、成長率代謝活性及び生存率に関して、水非混和性有機溶媒の存在によって引き起こされるストレスに対してより耐性のある細胞を提供することである。

0012

本発明の根底にある別の課題は、ベースとなるアルカン及びその誘導体及び持続可能な資源の酸化生成物の製造方法を提供することである。

0013

本発明の根底にある別の課題は、酸素の消費が低減される、アルカンを酸化するための生物工学的方法を提供することである。

0014

本発明の根底にある課題は、添付の請求項の主題によって解決される。

0015

本発明の根底にある課題は、第1の態様において、低減された脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物によって解決される。

0016

第1の態様の第1の実施態様では、アルカンオキシダーゼは、ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ、チトクロームP450アルカンオキシダーゼ、キシレンモノオキシゲナーゼ、メタンモノオキシゲナーゼ及びその変異体を含む群から選択される。

0017

同様に本発明の第1の態様の第1の実施態様である、第2の実施態様では、脂肪酸分解能は、脂肪酸インポータ、脂肪酸CoAリガーゼアシルCoAデヒドロゲナーゼ、2,4−ジエノイル−CoAレダクターゼエノイル−CoAヒドラターゼ及び3−ケトアシル−CoAチオラーゼを含む群からの酵素をコードする遺伝子の欠失によって低下する。

0018

同様に本発明の第1の態様の第1及び第2の実施態様である、第3の実施態様では、微生物は、原核細胞又は下等真核細胞、好ましくは細菌細胞、最も好ましくは大腸菌(E. coli)である。

0019

同様に本発明の第1の態様の第1〜第3の実施態様の実施態様である、第4の実施態様では、微生物は更に組み換えアルコールデヒドロゲナーゼを発現する。

0020

同様に本発明の第1の態様の第1〜第4の実施態様の実施態様である、第5の実施態様では、微生物は更に組換えトランスアミナーゼを発現する。

0021

同様に本発明の第1の態様の第1〜第5の実施態様の実施態様である、第6の実施態様では、微生物は、組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくはアラニンデヒドロゲナーゼを発現する。

0022

本発明の根底にある課題は、第2の態様において、a)本発明の第1の態様及びそれらの実施態様のいずれかによる細胞を含む水溶液とアルキルとを接触させることを含む、アルキルの酸化方法によって解決される。

0023

本発明の第2の態様の第1の実施態様では、この課題は、b)工程a)からの水溶液と水非混和性有機溶媒とを接触させることを更に含む方法によって解決される。

0024

同様に第1の実施態様の実施態様である本発明の第2の態様の第2の実施態様では、アルキル酸化、及び好ましくは水溶液からの本発明の細胞の除去が完了した後に抽出が行われる。

0025

本発明の根底にある課題は、第3の態様において、第1の態様及びアルキルを酸化するためのその実施態様のいずれかによる微生物の使用によって解決される。

0026

第2又は第3の態様の更なる実施態様又はそれらの実施態様のいずれかにおいて、アルキルは式H−(CH2)x−R(式中、xは1〜30であり、且つRは任意の化学基、好ましくは−OH、−COH、−COOH、−COOR1、−NH2、−NO2、−CN、−OPO3H、−SO3H及び−Hを含む群から選択されるものであり、好ましくはHであり、ここでR1は非置換の直鎖状アルキル、好ましくはメチル及びエチルである)によって表される化合物である。

0027

第2又は第3の態様の更なる実施態様又はそれらの実施態様のいずれかにおいて、アルキルは直鎖状アルカン、好ましくは室温で気体であるものである。

0028

本発明の第2又は第3の態様の更なる実施態様及びそれらの実施態様のいずれかにおいて、水非混和性有機溶媒は水非混和性脂肪酸又は脂肪酸エステルである。

0029

本発明の発明者らは、驚くことに、アルカン又はアルキル酸化を触媒することが可能な微生物を含む水性培地からの水非混和性有機溶媒の分離が、対応する野生型の微生物ではなく、低下した脂肪酸分解能を有する微生物を使用する場合に、より迅速で且つ完全であることを発見した。

0030

更に、本発明者らは、低下した脂肪酸分解能を有する微生物は、それぞれの野生型微生物よりも少ない酸素を消費するが、生成物の収率は同等か又はより改善されることを発見した。

0031

いかなる理論にも縛られるわけではないが、本発明者らは、細胞の脂肪酸分解能の低下が、洗浄剤として作用し且つ水非混和性有機溶媒の分離を妨げる、当該細胞の細胞内に又はその表面のいずれかに配置された、まだ同定されていない少なくとも1種の代謝物の濃度の低下につながることを理論づけた。

0032

本発明はアルキルの酸化方法を検討する。アルキルは、アルコール、アルデヒド、ケトン、及びカルボン酸を含む群から選択される1種以上の化合物に酸化され得る。かかる化合物は、本発明の方法の主要な生成物であり得るが、これは更に処理されてもよい。例えば、本方法は、アルキルのカルボン酸への酸化だけでなく、かかるカルボン酸のアミドへの転換も含み得る。

0033

本発明は、好ましくはアルコールなどの酸化アルキルへのアルキルの転換のために、低下した脂肪酸分解能を有し且つ組換えアルカンオキシダーゼを発現する微生物を中心としている。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「アルカンオキシダーゼ」との用語は、アルカン及び/又はアルキルを酸化することが可能な酵素を意味する。様々なアルカンオキシダーゼが、文献、例えば、basidiomycete heme-thiolate peroxidases (Gutierrez, A., Babot, E. D., Ullrich, R., Hofrichter, M., Martinez, A. T., del Rio, J. C. (2011年)、ArcH. Biochem. Biophys. 514 (1-2), 33-43頁)、the alkane hydroxylase system of Gardonia sp. strain SoCg (Lo Piccolo, L, De Pasquale, C, Fodale, R., Puglia, A. M., Quatrini, P. (2011年)、Appl. Environm. Microbiol. 77 (4), 1204-12013; Alkane oxidases from Alcanivorax (Grant, C, Woodley, J. M., Baganz, F. (2011年) Enzyme and Microbial Technology, 480-486頁)及びCytochrom P450 systems (Koch, D. J., Chen, M. M., van Beilen, J. B., 及びArnold F. H. (2009年) Appl. and Env. Microbiology, 337-344頁)に記載されている。特に好ましい実施態様では、アルカンオキシダーゼはalkB型のアルカンオキシダーゼである。AlkBは、2つの補助ポリペプチド、AlkG及びAlkTに依存する、シュードモナスプチダAlkBGT系からの酸化還元酵素である。AlkTは、NADHからAlkGに電子を移動させるFAD依存性ルブレドキシン還元酵素である。AlkGは、AlkBへの直接的な電子供与体として機能する鉄含有酸化還元タンパク質である、ルブレドキシンである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「alkB型アルカンオキシダーゼ」との用語は、シュードモナスプチダGpo1からのAlkB(アクセスコード:CAB54050.1、アプリケーションで使用される任意のアクセスコードは、NCBIによって管理されるGenbankデータベースからの各配列を意味し、その際、言及されたリリースは、2011年12月15日に1つのオンラインにある)又はその変異体を意味する。好ましい実施態様において、「アルキル」との用語は、Rが任意の化学基であり、xが1、2、3、好ましくは8以上、更に好ましくは11以上である、式H−(CH2)x−Rによって表される置換基、又はかかる置換基を有する化合物を意味する。

0034

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「ルブレドキシン依存性アルカンオキシダーゼ」との用語は、ルブレドキシンを介して電子を受けるアルカンをその基質として認識するオキシドレダクターゼを意味し、更に好ましい実施態様では、これは、電子をアルカンオキシダーゼに移動させる2つのαらせんと2〜3つのβ鎖で折りたたまれたα+βクラスを有する鉄−硫黄タンパク質であり、最も好ましい実施態様では、シュードモナスプチダ又はそれらの変異体からのAlkGである。例としてはシュードモナスプチダからのAlkGが挙げられる。

0035

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「シトクロムP450酵素」との用語は、そのCO結合形で450nmで吸収帯を有し且つ好ましくはアルカンを酸化することが可能なP450型シトクロムを有する酸化還元酵素を意味する。例としては、Bacillus megaterium (Koch, D. J., Chen, M. M., van Beilen, J. B., 及びArnold, F. H. (2009年) Appl. And Environm. Microbiol. 75(2), 337〜344頁)からのシトクロムP450 BM−3が挙げられる。

0036

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「キシレンモノオキシゲナーゼ」との用語はヒスチジンに富む活性部分を有し且つ好ましくはアルカンを酸化することが可能な、膜スパニング、非ヘム二鉄酵素酸化還元酵素を意味する。例としては、シュードモナスプチダからのXylMが挙げられる(Austin, R. N., Buzzi, K., Kim, E., Zylstra, G. J., 及びGroves, J. T. (2003年) J. Biol. Inorg. Chem. 8, 733〜740頁)。

0037

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「メタンモノオキシゲナーゼ」との用語は、酸素原子によって架橋した二鉄中心(Fe−O−Fe)を含み且つ3つのタンパク質成分ヒドロキシラーゼ、βユニット、及びメタン資化性細菌からのレダクターゼを含む可溶性メタンモノオキシゲナーゼであるか又は粒状のメタンモノオキシゲナーゼのいずれかである酸化還元酵素、銅含有活性部分を有する、メタン細菌における膜タンパク質を意味する。可溶性及び粒子状のメタンモノオキシゲナーゼの例としては、それぞれ、メチロサイナストリコスポリウムOB3bからの溶解性メタンモノオキシゲナーゼ(A C Rosenzweig, Frederick, C. A., Lippard, S. J., Nordlung, P. (1993年) Nature, 366, 537〜543頁)及びメチロコッカスカプスラツスからの粒子状メタンモノオキシゲナーゼ(Bath)(Nguyen, H. H. T., Elliot, S. J., Yip, J. H. K, 及びChan, S. I. (1998年)、J. Biol. Chem. 273, 7957〜7966頁)が挙げられる。

0038

本発明の教示は、本出願において、例えば、名称又は受託番号によって明確に、又は暗示的に示される正確なアミノ酸又は核酸配列を有する生物学的高分子を用いて実施されるだけでなく、かかる配列の変異体を用いて実施されてもよい。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「変異体」との用語は、アミノ酸又は核酸配列を含み、これらはそれぞれ、参照のアミノ酸又は核酸配列と70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、95%、96%、97、98%、又は99%同一であり、その際、好ましくは、機能、例えば、タンパク質の触媒作用にとって不可欠なもの以外のアミノ酸、又は分子の折りたたみ又は構造が挿入によって欠失され、置換され又は置き換えられるか、又は必須のアミノ酸は保守的な方法で置き換えられる。最新技術は、2つの所与核酸又はアミノ酸配列整列させ且つ同一性の程度を計算するために使用され得るアルゴリズムを含む。Arthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 第3版、Thompsonら、Nucleic AcidsResearch 22, 4637〜4680頁、1994年、及びKatohら、Genome Information, 16(1), 22-33, 2005年を参照されたい。「変異体」との用語は、「相同体」との用語に同義的に且つ交換可能に使用される。かかる変異体は、かかる巨大分子又はそれらの変異体を含むアミノ酸又は核酸配列並びに融合において欠失、挿入又は置換を導入することによって調製され得る。好ましい実施態様では、アミノ酸配列に関する、「変異体」との用語は、好ましくは、上記の配列の同一性に加えて、それぞれの基準に対して1つ以上の保存的なアミノ酸の変更を含むアミノ酸配列又は野生型配列を含むか又は1つ以上の保存的なアミノ酸の変更を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。好ましい実施態様では、アミノ酸配列又は核酸配列の「変異体」との用語は、好ましくは上記の配列の同一性に加えて、それぞれ、アミノ酸配列又は核酸配列の任意の活性部分及び/又はフラグメント、又はアミノ酸配列の活性部分及び/又はフラグメントをコードする任意の核酸配列を含む。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「活性部分」との用語は、アミノ酸配列又は核酸配列を意味し、これらは、それぞれ、完全長のアミノ酸配列よりも短いか又は完全長のアミノ酸配列よりも短くコードし、その際、アミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、それぞれ、それらの必須の生物学的活性の少なくとも一部を保持する。例えば、プロテアーゼの活性部分及び/又はフラグメントは、ポリペプチドにおけるペプチド結合加水分解することが可能である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「それらの必須の生物学的活性の少なくとも一部を保持する」との用語は、当該アミノ酸配列が、背景の活性を超える及びそれとは異なる生物学的活性及び前記活性を特徴とする速度パラメータ、更に詳細にはkcat及びKMを有し、特定の基質に関する基準分子によって示される値の、好ましくは3桁以内の、更に好ましくは2桁以内、最も好ましくは1桁以内であることを意味する。好ましい実施態様では、核酸の「変異体」との用語は、その相補鎖が好ましくは基準又は野生型の核酸に対して、厳格な条件下でハイブリダイズする核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応の厳格さは、当業者によって容易に決定され、これは一般にプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に依存する経験的な計算である。一般に、より長いプローブは適切なアニーリングのためにより高い温度を必要とするが、より短いプローブはより低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは、一般に、相補鎖に再アニールするする変性DNAの能力に依存し、これはその融点よりも低い環境に存在する。プローブとハイブリダイズ可能な配列との間の所望の相同性の程度が高い程、使用され得る相対温度が高くなる。その結果、より高い相対温度は反応条件をより厳しくし、より低い温度はそれほど厳しくしない傾向があるということになる。ハイブリダイゼーション反応の厳格さの更なる詳細及び説明については、F. M. Ausubel (1995年), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Inc.を参照されたい。更には、当業者は、ハイブリダイゼーションによってDNA配列をどのように同定するかについて、マニュアル「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」、Boehringer Mannheim GmbH、マンハイム、ドイツ、1993年及びLieblら(International Journal of Systematic Bacteriology 41 : 255〜260頁(1991年)に示された指示に従ってよい。好ましい実施態様では、厳格な条件は、任意のハイブリダイゼーションに適用される、即ち、ハイブリダイゼーションは、プローブが標的配列に70%以上同一である場合のみ起こる。標的配列よりも低い程度の同一性を有するプローブは、ハイブリダイズされ得るが、かかるハイブリッドは不安定であり、且つ選好性を高めるために、温度が約50℃〜68℃、約52℃〜68℃、約54℃〜68℃、約56℃〜68℃、約58℃〜68℃、約60℃〜68℃、約62℃〜68℃、約64℃〜68℃、約66℃〜68℃であると同時に、塩の濃度を2×SSCまで低下させるか、又は任意にその後0.5×SSCまで低下させる、厳格な条件下にて洗浄工程で除去される。特に好ましい実施態様では、温度は約64℃〜68℃又は約66℃〜68℃である。塩の濃度を0.2×SSC又は更に0.1×SSCに調整することが可能である。参照又は野生型配列の少なくとも70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%に対してある程度の同一性を有するポリヌクレオチド断片が単離され得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、核酸配列の「相同体」との用語は、遺伝子コード縮重に従って、参照核酸配列と同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を意味する。

0039

本発明の教示は、広範囲の微生物を用いて行われ得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「微生物」との用語は、細菌、古細菌真菌藻類等を含む任意の恒久的単細胞微生物を指す。好ましい実施態様では、微生物は、細菌微生物、更に好ましくはシュードモナス、コリネバクテリウム及び大腸菌(Escherichia coli)を含む群からのもの、最も好ましくは大腸菌である。別の好ましい実施態様では、微生物は、下等真核生物、更に好ましくはサッカロミセスカンジダピキア、シゾサッカロミセス及びヤロウイアを含む群からの真菌、最も好ましくはサッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerivisiae)である。本出願を通して、「微生物」との用語は、「細胞」との用語の同意語として及び同義的使用されている。微生物は、単離された微生物、換言すれば、微生物の単一菌株の純粋な培養物であってよいか、又は少なくとも2種の菌株の混合物を含み得る。バイオテクノロジー関連の微生物は、例えば、アメリカ培養コレクション(ATCC)又はドイツ微生物細胞培養コレクション(DSMZ)から市販されている。微生物を維持し且つ修正するための粒子は、先行技術、例えば、Sambroke/Fridge/Maniadis (1989年): Molecular cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Press, 第2版, Fuchs/Schlegel (2007年), Allgemeine Mikrobiologie, 2008年, Georg Thieme Verlagから入手可能である。

0040

本発明の微生物は、低減された脂肪酸分解能を有している。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「低下した脂肪酸分解能を有する」との用語は、それぞれの微生物が、通常の脂肪酸分解能を有する同等の微生物よりも遅い速度で、脂肪酸、好ましくは環境から取り込まれるものを分解することを意味する。好ましい実施態様では、かかる微生物の脂肪酸分解は、β−酸化経路関与する酵素をコードする少なくとも1つの遺伝子の欠失、阻害又は不活性化のために低くなる。本発明の好ましい実施態様では、β−酸化経路に関与する少なくとも1種の酵素は、選好性の増大のために、それぞれの野生型微生物における同等の条件下で同じ酵素の活性に対して、5%、10%、20%、40、50%、75%、90%又は99%の活性が失われる。当業者は、Sambrook/Fritsch/Maniatis (1989年)に記載されるように、例えば、放射能に細胞を曝した後に得られた突然変異体の蓄積又はスクリーニング点突然変異の部位特異的導入又は活性酵素のためにコードする染色体中組込み遺伝子のノックアウトによって、酵素をコードする遺伝子を削除するか又は微生物中のかかる酵素の活性を低下させるために使用され得る様々な技術に精通している。また、転写抑制因子FadRは、β−酸化経路に関与する酵素の発現が抑制されるまで過剰に発現され得る(Y Fujita、H Matsuoka、及びK Hirooka (2007年) Mol. Microbiology 66(4), 829〜839頁)。好ましい実施態様において、本願明細書で使用される「遺伝子の削除」との用語は、前記遺伝子をコードする核酸配列が、前記遺伝子によってコードされた活性ポリペプチドの発現が低減されるように修飾されることを意味する。例えば、遺伝子は、ポリペプチドの触媒活性中心をコードする配列を含む配列の一部をインフレーム除去することにより削除され得る。あるいは、リボソーム結合部位は、リボソームがもはや対応するRNAを翻訳しないように変更され得る。更に、当業者は、酵素学教科書、例えば、A Cornish-Bowden (1995年), Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited, 1995に記載されるような標準的な試験を用いて生存細胞によって発現される酵素の活性を日常的に測定することが可能である。技術水準は、β−酸化経路に関与する酵素の活性を測定するために特別に設計された様々な試験、例えば、K Kameda & W D Nunn (1981年) J. Biol. Chem. 256, 5702-5707頁、H Marrakchi, W E DeWolf, C Quinn, J West, B J Polizzi, C Y Soら(2003年) Biochem. J. 370, 1055-1062頁、S Lobo, G Florova、及びK A Reynolds(2001年) Biochemistry 40 (39), 11955-64頁、X Yu, T Liu, F Zhu, 及びC Khosla (2011年) PNAS、オンラインに発表)を開示している。

0041

微生物中の脂肪酸の分解は、酵素的に触媒される一連の反応により達成される。まず第一に、脂肪酸が取り込まれ、大腸菌の場合、それぞれFadL及びFadDと呼ばれる、脂肪酸CoAリガーゼ活性を有する少なくとも1つの外膜タンパク質及び1つの内膜関連タンパク質を含むトランスポートアシル活性化機構を介して細胞膜にわたり転位する。細胞の内部では、分解されるべき脂肪酸は、β−酸化経路の他の反応を触媒する酵素に供される。最初の細胞内の工程は、アシル−CoAのエノイルCoAへのアシル−CoA脱水素酵素を介した変換を含み、これは大腸菌の場合、FadEと呼ばれる。得られたエノイル−CoAは、3−ヒドロキシアシル−CoAを介して、水素化及び酸化を通して、3−ケトアシル−CoAに転換され、触媒されてエノイル−CoAヒドラターゼ/3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼになり、これは大腸菌においてFadBと呼ばれる。最後に、3−ケトアシルCoAチオラーゼ、大腸菌におけるFadAが、3−ケトアシル−CoAの切断を触媒すると、アセチル−CoA及び2つの炭素原子によって短縮された導入アシル−CoAが得られる。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「低下した脂肪酸分解能を有する微生物」との用語は、脂肪酸を取り込む及び/又は分解する能力が低下した微生物、好ましくは少なくとも8個の炭素鎖を有するものを意味する。微生物の脂肪酸分解能は、様々な方法で低下され得る。好ましい実施態様では、微生物は、その野生型と比較して、低下したβ−酸化経路に関与する酵素の活性を有する。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「β−酸化経路に関与する酵素」との用語は、β−酸化経路を介して、前記脂肪酸の分解の一部として形成された脂肪酸又はその誘導体と直接相互作用する酵素を意味し、一連の反応は、好ましくは脂肪酸又はその誘導体を基質と見なすことによって、脂肪酸のアセチル−CoA及び短縮された脂肪酸のCoAエステルへの変換を行い、そしてこれをβ−酸化経路の一部として形成された代謝物に変換する。特に好ましい実施態様では、「β−酸化経路に関与する酵素」との用語は、脂肪酸トランスポーター、更に具体的には脂肪酸導入機構の要素、例えば、FadL又はその変型及び膜結合脂肪酸CoA−リガーゼの成分を含む。例えば、アシル−CoAデヒドロゲナーゼは、脂肪酸−CoAと相互作用し且つ脂肪酸−CoAエステルをエノイル−CoAに変換し、これはβ−酸化の一部として形成される代謝物質であるため、β−酸化経路に関与する酵素である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「脂肪導入酸化経路に関与する酵素」との用語は、導入された脂肪酸及びその成分、脂肪酸CoA−リガーゼ、アシル−CoAデヒドロゲナーゼ、エノイル−CoAヒドラターゼ、3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼ及び3−ケト−アシル−CoAチオラーゼを含む群からの任意のポリペプチドを含む。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「脂肪酸トランスポーター」との用語は、膜の外側から又は外側、即ち、媒体露出した膜、微生物の膜の外側から脂肪酸を、場合により複数の活性ポリペプチドを含む機構の一部として、細胞の内部に転位することが可能なポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドFadL(アクセスコード:BAA16205.1)は脂肪酸トランスポーターである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「脂肪酸−CoAリガーゼ」との用語は、脂肪酸のCoAエステルへの脂肪酸の変換を触媒することが可能なポリペプチド、即ち、好ましくは前記脂肪酸をβ−酸化経路に導入するために、カルボキシ基の官能基−OHが−S−CoAに置き換えられた分子を意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドFadD(アクセスコード:BAA15609.1)はアシル−CoAデヒドロゲナーゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「アシル−CoAデヒドロゲナーゼ」との用語は、好ましくはβ−酸化経路の一部として、アシル−CoAのエノイル−CoAへの変換を触媒することが可能なポリペプチドである。例えば、大腸菌中のポリペプチドFadE(アクセスコード:BAA77891.2)はアシル−CoAデヒドロゲナーゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「2,4−ジエノイル−CoAレダクターゼ」との用語は、好ましくはβ−酸化経路の一部として、2,4−ジエノイルCoAの、不飽和脂肪酸からエノイル−CoAへの変換を触媒することが可能なポリペプチドである。例えば、大腸菌中のポリペプチドFadHは2,4−ジエノイル−CoAレダクターゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「エノイル−CoAヒドラターゼ」との用語は、3−ヒドロキシアシル−CoAデヒドロゲナーゼをも意味し、水素化及び酸素化を通して、好ましくはβ−酸化経路の一部として、エノイル−CoAの3−ケトアシル−CoAへの転換を触媒することが可能なポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドFadB(アクセスコード:BAE77457.1)はエノイル−CoAヒドラターゼである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「ケトアシル−CoAチオラーゼ」との用語は、好ましくはβ−酸化経路の最終段階として、2つの炭素原子及びアセチル−CoAによって短縮されたアシルCoAが得られる、切断3−ケトアシル−CoAの変換を触媒することが可能なポリペプチドを意味する。例えば、大腸菌中のポリペプチドFadA(アクセスコード:AP009048.1)はケトアシル−CoAチオラーゼである。

0042

多くの化合物は、それらがアルキル置換基、例えば、これらに限定されないが、アルカン、アルケン、アルキンアリールヘテロアリール、アルコール、アミン、アルカン酸アルケン酸、脂質、アミノ酸、飽和又は不飽和及び/又は直鎖状又は分岐鎖状脂肪酸を含む限り、本発明の微生物を用いてアルコールに変換され得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「アルキル」との用語は、式H−(CH2)x−R(式中、xは4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28であるか、又は優先度の順に、少なくとも6、8、10又は12であり、且つRは任意の化学基、好ましくは−OH、−COH、−COOH、−COOR1(式中、R1は非置換の直鎖状アルキル、好ましくはメチル及びエチル、−NH2、−NO2、−CN、−OPO3H、−SO3H及び−Hであり、好ましくはHである)によって表される化合物である。好ましい実施態様では、アルキルは脂肪酸又はそのエステルである。他の好ましい実施態様では、アルキルは、式CnH2n+2によって表されるアルカン、例えば、分枝鎖状アルカン、シクロアルカン及び1つ以上の直鎖状アルキル置換基を有するシクロアルカンであり、且つnは1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、好ましくは1〜12、更に好ましくは1〜4である。別の好ましい実施態様では、アルキルは、分枝鎖状アルキルを含む、25℃で且つ大気圧下でガス状のアルキルである。好ましい実施態様では、アルカンはイソブタンである。

0043

組換えアルカンオキシダーゼに加えて、更なる酵素、好ましくは組換え酵素を有する微生物を使用することが有利であり得る。好ましい実施態様では、微生物は、アルカンオキシダーゼに加えて、野生型又は、好ましくは組み換えアルコールデヒドロゲナーゼを有する。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「アルコールデヒドロゲナーゼ」との用語は、アルデヒド又はケトンに対応するアルコールの変換を触媒することが可能な酵素を意味する。例としては、バチルスステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)(アクセスコードP42328)、ロドコッカスベル(Rhodococcus ruber)(アクセスコードAJ491307.1)、ラルストニアユートロファ(Ralstonia eutropha)(アクセスコードACB78191.1)、ラクトバチルスブレビス(Lactobacillus brevis)(アクセスコードYP_795183.1)、ラクトバチルスケフィリ(Lactobacillus kefiri)(アクセスコードACF95832.1)、パラコッカスパントトロフス(Paracoccus pantotrophus)(アクセスコードACB78182.1)及びスフィンゴビウムヤノイクヤエ(Sphingobium yanoikuyae)(アクセスコードEU427523.1)並びにそれらの変異体からのアルコールデヒドロゲナーゼが挙げられるが、これらに限定されない。

0044

本発明の微生物は、アルカンオキシダーゼ及びアルコールデヒドロゲナーゼの他に、トランスアミナーゼ、好ましくは組換えトランスアミナーゼを有してよく、これはアルキルをアミンに変換することが目的である場合に有利である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「トランスアミナーゼ」との用語は、別のアミノ酸を得るために、α−アミノ基、好ましくはアミノ酸を、供与体から受容体分子、好ましくはα−ケト酸転移することが可能な酵素を意味する。特に好ましい実施態様では、トランスアミナーゼはω−トランスアミナーゼである。トランスアミナーゼの例としては、クロモバクテリウムビオラセウム(Chromobacterium violaceum)ATCC12472(アクセスコードNP_901695)からのトランスアミナーゼが挙げられるが、これに限定されない。

0045

本発明の微生物は、アルカンオキシダーゼの他に、アルコールデヒドロゲナーゼ及びトランスアミナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、好ましくは組換えアミノ酸デヒドロゲナーゼを有してよい。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「アラニンデヒドロゲナーゼ」との用語は、アミノ酸、水及びNAD+のケト酸、アンモニア及びNADHへの転換を触媒することが可能な酵素を意味する。アミノ酸デヒドロゲナーゼは、アラニンデヒドロゲナーゼ、即ち、L−アラニン、水及びNAD+のピルビン酸、アンモニア及びNADHへの転換を触媒することが可能な酵素であってよい。好適なアミノ酸デヒドロゲナーゼの例は、枯草菌(アクセスコード:L20916)、リゾビウムレグミノサルム(Rhizobium leguminosarum)(アクセスコード:CP001622)、ビブリオプロテオリチカス(Vibrio proteolytikus)(アクセスコード:AF070716)、結核菌(アクセスコード:X63069)及びエンテロバクターアエロゲネス(アクセスコード:AB013821)からのアラニンデヒドロゲナーゼを含む。

0046

本発明の方法は、本発明の細胞を含む水溶液とアルキルとを接触させることを含む。この工程は、アルキルと溶液とを一時的に接触させることを含むだけでなく、実際に、酸化反応及び可能性のある更なる下流の反応を起こすほど十分に長く、例えば、少なくとも1時間、2時間、4時間、5時間、10時間又は20時間にわたり、本発明の細胞の存在下でアルキルをインキュベートすることを含んでよい。選択された温度は、本発明の細胞が触媒的に有能及び/又は代謝的に活性な、例えば、本発明の細胞が大腸菌細胞である場合、10〜42℃、好ましくは30〜40℃、最も好ましくは32〜38℃のままでなければならない。

0047

実施態様では、本発明の方法は、工程a)の後に又は工程a)と同時に、「水非混和性有機溶媒」を用いて工程a)からの生成物を接触させることを考慮する。当業者であれば、本発明によって使用され得る多くの水非混和性有機溶媒を知っている。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「水非混和性有機溶媒」との用語は、少なくとも2個の炭素原子を含み且つ水性液相の存在下で、好ましくは25℃で、明らかに水相から分離された、別の液相を形成しやすい化合物を意味する。分離相は、連続液相又はエマルションであってよい。別の好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「水非混和性」との用語は、水に溶解しない液体化合物の傾向を意味する。最後に、別の好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「水非混和性」との用語は、そのように指定された化合物が、その常用対数が0を超える、好ましくは0.5を超える、更に好ましくは1を超える、最も好ましくは2を超えるpH値(J Sangster, Octanol-Water Partition Coefficients: Fundamentals and Physical Chemistry, Vol. 2 of Wiley Series in Solution Chemistry, John Wiley & Sons, Chichester, 1997年)を有する。好ましい水非混和性有機溶媒は、室温で液体の置換された及び直鎖状のアルカン、シクロアルカン、シクロアルケン、アリール、脂肪酸、脂肪酸エステル、アルコール、ヘテロシクロアルカンヘテロシクロアルケン及びヘテロアリールを含む群からの水非混和性溶媒を含むが、これらに限定されない。水非混和性有機溶媒は、2種以上の有機溶媒を含み得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「水非混和性有機溶媒」を用いて生成物を「抽出する」との用語は、水非混和性有機溶媒を含む相に生成物を入り込ませる程度に十分に長く、本発明の細胞を含む水溶液と水非混和性有機溶媒とを接触させることを意味する。その後、水非混和性有機溶媒を含む相は、例えば、蒸留により又はデカンテーションにより、水溶液から分離され得る。化合物が液体又は気体又はどちらでもないかは、好ましくは大気圧下にて25℃で決定される。

0048

好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒は、脂肪酸又はそのエステルであり、更に好ましい実施態様では、式CH3−(CH2)x−COORs(式中、xは8、9、10、28であり、更に好ましくは12又は12を上回り、RsはH又はアルキル、好ましくはメチル又はエチルである)によって表される脂肪酸である。別の好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒は、不飽和脂肪酸、好ましくは炭素鎖の9位に炭素炭素二重結合を有するもの、更に好ましくは12個以上の炭素原子を有するものである。最も好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒はオレイン酸である。別の好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒はヘキサン酸である。好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒はラウリン酸メチルエステルである。水非混和性有機溶媒は、これを水溶液から分離することが容易な体積である。好ましい実施態様では、水非混和性有機溶媒の体積は、水溶液と水非混和性有機溶媒の合わせた総体積の2〜98パーセント、更に好ましくは5〜95パーセント、更に好ましくは10〜40パーセント、最も好ましくは20〜30パーセントである。

0049

好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「接触させる」との用語は、細胞がアルキルを取り込み且つ代謝することができるように、アルキルと本発明の細胞とを直接接触させることを意味する。例えば、細胞とアルキルは、無機膜などの膜によって分離された異なる区画にあってはならない。アルキルが固体又は可溶性である場合、これは単純に水溶液中で本発明の細胞に添加されてよい。アルキルが気体状である場合、細胞を含む水溶液は前記ガス状アルキルを含むガスによって散布されてよい。

0050

「水溶液」との用語は、代謝活性な及び/又は生存可能な状態で、少なくとも一時的に、本発明の細胞を維持するために使用され得る任意の溶液を含み、必要であれば、任意の追加の基質を含む。当業者であれば、本発明の細胞、例えば、大腸菌の場合、LB培地を維持するために使用され得る、通常、媒体と呼ばれる、多くの水溶液に精通している。好ましい実施態様では、水溶液は、好気性条件下で維持される。水溶液として最小培地、即ち、複合媒体とは対照的に、代謝的に活性な及び/又は生存可能な状態で細胞を維持するために、必須の最小限のセットの塩及び栄養のみを含む適切な単純組成の媒体を使用することが有利である。例えば、M9培地は最小培地として使用され得る。酸化されるべきアルキルが限定された水への溶解性を有する場合、Tween又はTritonなどの洗浄剤が、水溶液に添加されるか又は疎水性の溶媒が酸化されるべきアルキルを溶解するために使用され得る。当業者であれば、種々の水溶液及び有機溶液の調製に精通している。

0051

好ましい実施態様では、工程b)では、アルキル酸化の完了後に、好ましくは本発明の細胞の水溶液からの除去が行われる。好ましい実施態様では、アルキル酸化、即ち、本発明の細胞によって触媒されるアルキルの酸化は、以下の要件の少なくとも1つが満たされる場合、完全であるとみなされ得る:a)本発明の細胞が代謝的に活性でなくなる、b)基質ターンオーバーが検出できない、c)基質がもはや水溶液中に存在しない、d)生成物の正味量がもはや有意に増加しない、例えば、濃度プラトーに到達したか又は生成物の形成を示すグラフの傾きが2時間を超えてゼロ以下である。細胞は、例えば、遠心分離濾過又はデカンテーションによって、当業者に公知の多数の方法で水溶液から除去され得る。

0052

本発明は、本発明の更なる特徴、実施態様、態様及び利点が示される、以下の図面及び非限定的な実施例によって更に例示される。

図面の簡単な説明

0053

図1は、「ΔFadE」とも呼ばれる、ΔFadE突然変異株W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA](左)及び野生型(WT)とも呼ばれる菌株W3110[alkB−alaD−TA](右)(FadEである事実を除いて前者の菌株と同一の後者は削除されていない)がALSMEを生成するために使用される場合の異なる相分離挙動を示す。矢印は、変異体が使用される場合の10分後に見られる有機相と水相との間の中間相を示す。かかる中間相は、野生型株が使用される場合、10分後に検出されない。
図2は、発酵の完了後に培地をファルコンチューブに移したという事実を除いて、図1に関して記載されたのと同じ実験の結果を示す。
図3は、図1に関して記載された実験に使用された両方の菌株の酸素移動速度二酸化炭素移動速度を示す。
図4は、図1に関して記載されたのと同じ実験における経時的なALSME濃度を示す。

0054

実施例1:ω−アミノ酸ラウリン酸メチルエステル(ALSME)の製造のための低下したアシルCoA−デヒドロゲナーゼ活性を有する細胞を用いる水性媒体からの疎水性相の分離の促進
ラウリン酸メチルエステルの、ω−ヒドロキシラリン酸を経由するω−アミノラウリン酸(ALS)メチルエステルへの転換を、菌株W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]及びW3110[alkB−alaD−TA]を用いて、DASGIPからの8つの容器を備える並列発酵システムで行った。

0055

N.B.では、これらの2つの菌株は、国際出願WO2009/077461号に一致するオキシドレダクターゼAlkB、アルコールデヒドロゲナーゼ及びトランスアミナーゼを含むpBR322由来のプラスミドを含み、これらは前者がFadEをコードする遺伝子、β−酸化経路の大腸菌アシル−CoAデヒドロゲナーゼの欠損を有することを除いて同一である。

0056

リットル反応容器を発酵のために使用した。pH電極をpH4及びpH7の標準液を用いて2点較正によって較正した。300mlの水道水を含有する反応容器を121℃で20分間加圧滅菌した。その後、pO2−検出器を、DASGIPシステムで一晩(少なくとも6時間)偏光させた。翌、水をクリーンベンチ下で除去し、100mg/Lのアンピシリン補足された高細胞密度培地300mLで置き換えた。その後、pO2検出器を1点較正(撹拌器:400rpm、ガス流:10sL/h空気)にかけて、供給材料補正剤及び誘導に関係する管材料を、70%のエタノール、その後、1MのNaOHを用いて所定の洗浄によって洗浄し、その後、滅菌VE水で濯ぐ。

0057

ALS及びALSMEを産生する大腸菌の菌株を、100mg/Lのアンピシリンで捕捉されたLB培地(バッフルを備えた100mlのフラスコ中で25ml)中で、37℃及び200rpmで約18時間にわたり一晩、それぞれの凍結培養物から接種した。その後、2mLの高細胞密度培地中の培養物(15g/Lのグルコース(30ml/Lの別々に加圧滅菌された、1%のMgSO4*7H2O及び2.2%のNH4Clを含む500g/Lのストック溶液)、1.76g/Lの(NH4)2SO4、19.08g/LのK2HPO4、12.5g/LのKH2PO、6.66g/Lの酵母エキス、2.24g/Lのクエン酸三ナトリウム二水和物クエン酸第三鉄アンモニウム溶液:17ml/Lの別々に加圧滅菌された1%のストック溶液、微量元素溶液:5ml/Lの別々に加圧滅菌されたストック溶液(36.50g/LのHCl(37%)、1.91g/LのMnCl2*4H2O、1.87g/LのZnSO4*7H2O、0.84g/Lのエチレンジアミンテトラ酢酸二水化物、0.30g/LのH3BO3、0.25g/LのNa2MoO4*2H2O、4.70g/LのCaCl2*2H2O、17.80g/LのFeSO4*7H2O、0.15g/LのCuCl2*2H2O))(ベセルを備えた100mlのフラスコ内に菌株当たり20ml)を、100mg/Lのアンピシリンと共に37℃/200rpmで更に5.5時間にわたり接種し且つインキュベートした。

0058

600nmにおける培養物の光学密度を、W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]の場合に6.9として及びW3110[alkB−alaD−TA]の場合に7.4として測定した。反応容器を0.1の最終光学密度に接種するために、4.0mL又は4.4mLを、それぞれ、無菌条件下で5mlのシリンジ中に移して使用し、中空針及び70%のエタノールの層で覆われたセプタムを用いて反応物を接種した。以下の標準プログラムを使用した。

0059

実施した実験は、以下の段階に入る:ある光学密度で細胞を得ることが目的である増殖期、及び基質ラウリン酸メチルエステルをω−アミノラウリン酸メチルエステルに変換することが目的であるその後の生体内変換期。pH値はアンモニア(12.5%)を用いて6.8に維持した。培養及び生体内変換の間、培養液中の溶存酸素を、30%のガス流量撹拌によって維持した。

0060

発酵をフェドバッチとして実施し、その際、供給が開始し、5g/Lhのグルコース供給(1%のMgSO4*7H2O及び2.2%のNH4Clを含む500g/Lのグルコース)がDOピークによって引き起こされた。供給が開始する時に、温度は37℃から30℃に低下した。トランスアミナーゼの発現を、供給開始から2時間後にIPTG(1mM)の自動添加によって誘導し、alk遺伝子を、供給開始から10時間後にDCPK(0.025%v/v)の手動添加によって誘導した。培養ブロスの光学密度を、生体内変換を開始する前に測定した。

0061

生体内変換段階は、ラウリン酸メチルエステル、オレイン酸(工業グレード、90%)を含む混合物をバッチとして発酵ブロスに添加することによって供給開始から14時間後に開始した。トランスアミナーゼにアミノ基供与体を提供するために、生体内変換の開始の30分前に、5mlの3M硫酸アンモニウム溶液を発酵ブロスに添加した。2mlの発酵ブロス試料を容器から取り出し、その一部をアセトン及びHCl(c(HCl)0.1モル/L)を含む混合物中で1:20に希釈して抽出した。試料を、1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、7.5時間、10.5時間、19.5時間及び21時間で取っておき、その後、全ての反応容器から生体内変換を開始する。DASGIPシステムからの排気ガス分析を介して発酵中に酸素移動速度(OTR)及び炭素移動速度(CTR)を測定した。発酵は、生体内変換の開始から21時間後に終了した。撹拌機、ガス流量、温度制御、及びpH制御の電源切り、容器を更に5〜10分間静置する機会を設けた。

0062

結果:
生体内変換が進行すると、酸素と炭素の移動速度は、W3110[alkB−alaD−TA]の場合に大幅に増加する。これとは対照的に、酸素と炭素の移動速度は、欠失変異体W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]の場合には減少し、生体内変換の前に観察されるレベルに近づく(図3)。両方の菌株によって形成された生成物の量は同等であり(図4)、実際に、収率は変異体を用いた場合よりもわずかに良好である。

0063

生体内変換の完了から10分後に、はっきりとした相分離を、菌株W3110ΔFadE[alkB−alaD−TA]を含む反応容器内で視覚的に検出することができ、その際、上相は体積の約40%を占め、下相は約60%を占めた。薄い中間相は、これらの相の間で観察され得る。試料を上相及び下相から取り、15mlのファルコンチューブに移し、そして5500×gで10分間遠沈させた。下相からの試料を含むチューブは、約95%の水相とバイオマスからなっていた。上相からの試料を含むチューブは、約60%の有機溶液からなっていた(図2)。菌株W3110[alkB−alaD−TA]を含む反応容器は、10分後に均質なエマルションを含有し、相分離は更に20分間全く観察できなかった(図1)。

0064

要約すると、FadEをコードする遺伝子、β−酸化経路の大腸菌アシルCoAデヒドロゲナーゼの欠失は、変異体が水溶液中にあり且つ水非混和性有機溶媒と接触する場合に改善された相分離をもたらし、さらには低下した酸素の消費をもたらす。

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