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課題・解決手段

本発明は、アルカンをAlkB型酸化還元酵素と接触させるアルカンの酸化法、またアルカンの酸化生成物混合体を製造するためのAlkB型の酸化還元酵素の使用に関し、ここで酸化生成物におけるカルボン酸アルコールの比は、1超:1である。

概要

背景

概要

本発明は、アルカンをAlkB型酸化還元酵素と接触させるアルカンの酸化法、またアルカンの酸化生成物混合体を製造するためのAlkB型の酸化還元酵素の使用に関し、ここで酸化生成物におけるカルボン酸アルコールの比は、1超:1である。

目的

このような目的のためにアルカンを使用する基本条件は、ヘテロ原子含有官能基(例えばヒドロキシ官能基ケト官能基、及びカルボキシ官能基)を酸化によってアルカン炭化水素鎖に導入することである

効果

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請求項1

酸素の存在下、アルカン酸化生成物混合体を製造するための、AlkB型酸化還元酵素の使用であって、前記酸化生成物におけるカルボン酸アルコールの比が、1超:1である、前記使用。

請求項2

前記アルカンが、炭素数1〜5のアルカンである、請求項1に記載の使用。

請求項3

前記アルカンが、炭素数1〜4のアルカン、好ましくはブタンである、請求項2に記載の使用。

請求項4

前記アルカンが、分枝鎖状アルカン、好ましくは炭素数が4又は5の分枝鎖状アルカン、さらに好ましくはイソブタンである、請求項1から3までのいずれか1項に記載の使用。

請求項5

前記AlkB型酸化還元酵素が、プセウドモナスプチダ(Pseudmonas putida)GPo1、又はその変異体である、請求項1から4までのいずれか1項に記載の使用。

請求項6

前記AlkB型酸化還元酵素が、全細胞触媒の形で用意される、請求項1から5までのいずれか1項に記載の使用。

請求項7

前記AlkB型酸化還元酵素が、精製されたポリペプチドの形で用意される、請求項1から5までのいずれか1項に記載の使用。

請求項8

前記酸化生成物におけるカルボン酸対アルコールの比が、5超:1、好ましくは12超:1、さらに好ましくは20超:1、最も好ましくは40超:1である、請求項1から7までのいずれか1項に記載の使用。

技術分野

0001

本発明は、アルカンと、AlkB型酸化還元酵素とを接触させる工程を含むアルカンの酸化法、並びに、アルカンの酸化生成物混合体を製造するための、AlkB型酸化還元酵素の使用に関し、ここで酸化生成物におけるカルボン酸アルコールの比は、好ましくは1超:1である。

0002

アルカンは、化学工業における最も重要な原料の1つである。アルカンを得るためには通常、化石原料から出発するのだが、一方でまた、再生原料からアルカンを得る方法も公知である。アルカンは特に、エネルギー担体としての使用により(例えば短鎖アルカン気体の形で、長鎖アルカンは液状の形で)知られている一方、工業では特に原料としての役割、又は日常生活の重要な製品(例えばプラスチック若しくは医薬品)につながる多くの合成のための溶剤としての役割が不可欠である。

0003

このような目的のためにアルカンを使用する基本条件は、ヘテロ原子含有官能基(例えばヒドロキシ官能基ケト官能基、及びカルボキシ官能基)を酸化によってアルカン炭化水素鎖に導入することである。というのもアルカン自体は、自身が飽和しているため、化学的には相対的に反応が不活性だからである。しかしながらこの際、アルカンを加熱剤として使用する場合とは異なり、アルカンが完全に酸化されて二酸化炭素にはならず、ヘテロ原子含有官能基は、選択的に、かつ制御して導入しなければならない。

0004

ヘテロ原子含有官能基で置換されたアルカンの合成を説明するためには、多数の反応が公知であり、それは例えば紫外光の作用下でのアルカンのハロゲン化であり、その生成物は、多くの化合物を合成するための原料として用いることができる。よってアルコールは、ハロゲン置換されたアルカンの求核置換によって得ることができる。しかしながらこのような反応には、毒性のある、及び/又は環境に悪影響を与える物質(例えば塩素ガス)を用いなければならず、この塩素ガスは安価なため、ハロゲン化のために工業的にしばしば使用される。

0005

ヘテロ原子(特に酸素原子含有官能基をアルカンに導入する生物工学的な方法もまた、公知である。そこでExxon (EP 98137)の特許では、アルトロバクター・ペトロレオファガス(Arthrobacter petroleophagus)及びその他の野生株によって、プロパンアセトンに変換する方法が記載されている。Grant et at. (2011)は、長鎖アルカンを酸化するために、組み換え型大腸菌細胞を使用している。

0006

こうした背景から本発明の課題は、アルカンの末端炭素原子を選択的に酸化してカルボン酸にするために適した、アルカンを酸化するための生物工学的な方法を開発することである。

0007

本発明の課題はさらに、末端位炭素原子が選択的に酸化された、アルカンの様々な酸化生成物を製造するために適した方法を開発することであり、ここで生成物の量又は比率は影響を受けることがある。

0008

さらに本発明の課題は、末端の炭素原子の酸化を触媒して、アルコール、アルデヒド、及びカルボン酸を含む群からの全ての酸化段階にすることができる酸化還元酵素系を提供することであり、ここで触媒活性を有する唯一ポリペプチドを、基質のアルカン、又はその中間生成物と接触させる。

0009

本発明の課題はさらに、脂肪酸物質代謝とは別個に、各酸化系過剰発現により特徴付けられる系であって、アルカンの末端を選択的に酸化するためのものを提供することである。

0010

本発明のさらなる課題は、アルカンを主に、又は、主にアルコールに酸化するだけではなく、改善された収率でカルボン酸にするために適した、アルカンの酸化法、好ましくは気体状アルカンの酸化法を提供することである。

0011

これらの課題、及びさらなる課題は、本願の対象によって、特にまた添付した従属請求項の対象によって解決され、ここでこれらの実施態様は、従属請求項に記載されている。

0012

第一の態様において本発明の基礎となる問題は、酸素の存在下で、アルカンとAlkB型酸化還元酵素とを接触させる工程を有する、アルカンの酸化法によって解決される。

0013

第一の態様の第一の実施形態では、アルカンが炭素数1〜5のアルカンである。

0014

第一の態様の第二の実施形態では(第一の態様の第一の実施形態の1実施形態でもある)、アルカンが、炭素数1〜4のアルカン(好ましくはブタン)である。

0015

第一の態様の第三の実施形では(第一の態様の第二の実施形態の1実施形態でもある)、アルカンが、分枝鎖状のアルカン(好ましくは炭素数が4又は5であり、さらに好ましくはイソブタン)である。

0016

第一の態様の第四の実施形態では(第一の態様の第三の実施形態の1実施形態でもある)、AlkB型の酸化還元酵素が、プセウドモナスプチダ(Pseudomonas putida)GPo1、又はその変異体である。

0017

第一の態様の第五の実施形態では(第一の態様の第四の実施形態の1実施形態でもある)、AlkB型の酸化還元酵素が、全細胞触媒の形で提供される。

0018

第一の態様の第六の実施形態では(第一の態様の第五の実施形態の1実施形態でもある)、AlkB型の酸化還元酵素が、精製されたポリペプチドの形で提供される。

0019

第二の態様において本発明の基礎となる問題は、酸素の存在下で、アルカンの酸化生成物混合体を製造するために、AlkB型酸化還元酵素を用いることによって解決され、ここで酸化生成物におけるカルボン酸対アルコールの比は、好ましくは1超:1である。

0020

第二の態様の第一の実施形態では、アルカンが、炭素数1〜5のアルカンである。

0021

第二の態様の第二の実施形態では(第二の態様の第一の実施態様の1実施形態でもある)、アルカンが、炭素数1〜4のアルカン(好ましくはブタン)である。

0022

第二の態様の第三の実施形態では(第二の態様の第一及び第二の実施態様の1実施形態でもある)、アルカンが、分枝鎖状アルカン、好ましくは炭素数が4又は5の分枝鎖状アルカンであり、さらに好ましくはイソブタンである。

0023

第二の態様の第四の実施形態では(第二の態様の第一〜第三の実施形態の1実施形態でもある)、AlkB型の酸化還元酵素が、プセウドモナス・プチダ(Pseudomonas putida)GPo1、又はその変異体である。

0024

第二の態様の第五の実施形態では(第二の態様の第一〜第四の実施形態の1実施形態でもある)、AlkB型の酸化還元酵素が、全細胞触媒の形で提供される。

0025

第二の態様の第六の実施形態では(第二の態様の第一〜第四の実施形態の1実施形態でもある)、AlkB型の酸化還元酵素が、精製されたポリペプチドの形で提供される。

0026

第二の態様の第七の実施形態では(第二の態様の第一〜第六の実施形態の1実施形態でもある)、酸化生成物におけるカルボン酸対アルコールの比が、5超:1、好ましくは12超:1であり、さらに好ましくは20超:1、最も好ましくは、40超:1である。

0027

本発明の発明者らは、文献では主にあまり酸化されていない生成物を製造するための触媒として知られるAlkB型の酸化還元酵素が、意外なことに、アルカン(特に気体状のアルカン)から、酸化状態がより高い生成物(特にカルボン酸)を主に製造するために、使用可能なことを確認した。特に、製造されたカルボン酸対、製造されたアルコールの比率は、意外なことに高い。さらに、発明者らは意外なことに、このような酸化還元酵素がアルカンを選択的に酸化できることを発見し、この際に予測される副生成物(特に末端ではない炭素原子が酸化されたアルカン)は、予測に反して非常に僅かしか、又は検出可能な量ではそもそも全く製造されないのである。

0028

本発明によればアルカン、好ましくは気体状のアルカンは、AlkB型の酸化還元酵素を用いて、酸素の存在下で酸化される。AlkBとは、最初はプセウドモナス・プチダGpo1(Pseudomonas putida Gpo1)のAlkBGT系から知られるようになった酸化還元酵素であり、これは第二のさらなるポリペプチドであるAlkG、及びAlkTに依存している。AlkTは、FAD依存性ルブレドキシン還元酵素として同定され、この酵素は、NADHからAlkGへと電子を渡すものである。AlkGとは、ルブレドキシン、すなわち鉄含有レドックス系タンパク質であって、AlkBに対して直接の電子供与体として作用するものである。好ましい実施形態では、「AlkB型酸化還元酵素」という用語自体が、プセウドモナス・プチダGpo1(データバンクコード:CAB54050.1、このデータバンクコードは、本願で使用される他の全ての従来技術と同様に、従来技術のNCBIデータバンクから得られるものであり、詳細には、2011年11月15日付けオンラインリリース版である)のAlkB配列に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、又は99%の配列相同性を有するポリペプチドであり、これはアルカンを酸化する能力を有する。特に好ましい実施形態では、AlkB型の酸化還元酵素は、プセウドモナス・プチダGpo1から得られるAlkG(CAB54052.1)のポリペプチド、及びAlkT(CAB54063.1)のポリペプチドと官能的相互作用を有するアルカン酸化性の酸化還元酵素である。好ましい実施形態では、AlkB型の酸化還元酵素は、AlkBが、プセウドモナス・プチダGpo1から得られるAlkBGT系からのAlkBであるか、又はその変異体である。

0029

本発明の教示は、ここに記載した生物学的マクロ分子の正確なアミノ酸配列又は核酸配列を用いてのみ説明できるのみならず、欠失、付加、又は置換により1つ以上のアミノ酸又は核酸として得られるこのようなマクロ分子の変異体を用いても、説明できる。好ましい実施形態において、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」とは、以下では「同族体」という用語と同義、かつ交換可能に使用され、他の核酸配列又はアミノ酸配列(これらも同じ意味で使用する)は、70%、75%、80%、85%、90%、92%、94%、96%、98%、又は99%又はそれ以上のパーセンテージを有し、ここで好ましくは、触媒活性中心を形成するアミノ酸、又は構造若しくは折りたたみに不可欠なアミノ酸以外は、欠失若しくは置換されているか、又は単純に保存的に置換されている(例えば、アスパルタートの代わりにグルタマート、又はバリンの代わりにロイシン)。配列がその長さ全体にわたって、相応する高度な相同性を有している必要はなく、本発明によればまた、融合タンパク質、又は相応する相同性及び/又は活性を有する部位を有するコード核酸も使用できる。従来技術は、2つの配列の相同性の程度を計算するために使用可能なアルゴリズムを記載している(例えばArthur Lesk (2008), Introduction to bioinformatics, 3rd edition.)。本発明のさらに好ましい実施形態では、アミノ酸配列又は核酸配列の変異体は、好ましくは上記配列同一性に加えて、実質的に野生型分子又はプロトタイプ分子の酵素活性が同じである。例えば、タンパク質分解酵素として酵素活性を有するポリペプチドの変異体は、ポリペプチド酵素と実質的に同じタンパク質分解活性を有する(すなわち、ペプチド結合加水分解を触媒可能)。特に好ましい実施形態では、「実質的に同じ酵素活性を有する」との記載は、野生型ポリペプチドの基質に関して活性を有することを意味する。この基質は明らかにバックグラウンド活性を超え、かつ/又は3桁未満、好ましくは2桁未満、さらに好ましくは1桁のオーダーでKM値及び/又はkcat値が異なり、同一の基質に関して野生型ポリペプチドを有する。さらなる好ましい実施形態において、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」という用語は、核酸配列又はアミノ酸配列の活性部位又はフラグメントを少なくとも1つ有することを含む。さらなる好ましい実施形態において、「活性部位」という用語はここでさらに、アミノ酸配列の完全な長さより短い、又はアミノ酸配列の完全な長さよりも短くコードするアミノ酸配列又は核酸配列を意味し、ここで、野生型のアミノ酸配列よりも長さが短いアミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列は、野生型ポリペプチド若しくはその変異体と実質的に同じ酵素活性を有する(例えばアルコール脱水素酵素モノオキシゲナーゼ、又はトランスアミラーゼ)。特別な実施形態では、核酸の「変異体」という用語は、核酸、その相補鎖を、好ましくは非常にストリンジェントな条件下で野生型の核酸に結合することを包含する。ハイブリダイゼーション反応ストリンジェンシーは、当業者であれば容易に測定可能であり、一般的にはプローブの長さ、洗浄時の温度、及び塩の濃度に依存する。一般的に長いプローブは、ハイブリダイゼーションのためにより高温を必要とし、これに対して短い試料は、低温で済む。ハイブリダイゼーションが起こるかどうかは一般的に、変性されたDNAの性質に依存し、(特に溶融温度未満で)その周囲に存在する相補鎖とアニーリングする。ハイブリダイゼーション反応のストリジャンシー、及び相応する条件は、Ausubel et al. (1995)に詳細に記載されている。好ましい実施形態において核酸の「変異体」という用語は、ここで使用するように、本来の核酸と同じアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列の変異体を、遺伝子コード縮重の範囲でコードする任意の核酸配列を含む。

0030

多くの適用のために、AlkB型の酸化還元酵素は、全細胞触媒の一部として、選択的な実施形態である。と言うのもこの酵素は、酸化還元酵素又はその活性の少なくとも完全な精製を必要としないか、又は精製を全く必要としないからである。好ましい実施形態において「全細胞触媒」という用語は、ここで使用するように、物質代謝活性細胞であると理解され、これは酵素活性が重要であり、好ましくはAlkB型の酸化還元酵素を有し、好ましくは野生型よりも相対的に高く、有利にはAlkB型の組み換え酸化還元酵素をプラスミド上で過剰発現させることによって、又は遺伝子内統合できる。当業者には、全細胞触媒を製造するためのシステムが多数、例えばDE 60216245から知られている。好ましい実施形態では、全細胞触媒として、又は発現系として使用される細胞が、原核生物細胞、好ましくはバクテリア細胞である。さらなる好ましい実施態様において、これは哺乳動物細胞である。さらなる好ましい実施形態において、これは低級真核細胞、好ましくは酵母細胞である。原核細胞に含まれるのは例えば、エシェリキア(Escherichia)、特に大腸菌、及びプセウドモナス属、及びジフテリア菌である。低級真核細胞に含まれるのは例えば、サッカロミセス属(Saccharomyces)、カンジダピチアヤロウィア(Yarrowia)、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)、特に好ましくはカンジダ・トロピカリス、シゾサッカロミセス・ポンベ、ピチア・パストリス、ヤロウィア・リポリティカ、及びサッカロミセス・セリシアエである。細胞は、本発明により使用される酵素のためにコードする1つ以上の核酸配列を、プラスミド上に、又はその遺伝子内に統合して含有する。このようなプラスミド又は細胞の製造方法は、当業者が日常的に実施できる。こうした製造方法は、分子生物学生化学、遺伝子学、及びミクロ生物学の教科書試験実施要項に記載されている(例えばSambrook et al. (1989))。

0031

さらなる好ましい実施形態において、これはAlkB型の酸化還元酵素であるが、精製された酵素である。これは、本発明により使用される全ての酵素活性ポリペプチドの場合と同様に、酵素活性なポリペプチド又はその溶解産物、又はポリペプチドの試料を精製段階全体で(未精製の溶解産物から純粋なポリペプチドまで)含有する細胞であり得る。好ましい実施形態では、「精製された」酵素とは、ここで用いるように、好ましい実施形態において、完全な細胞、又は加工されていない細胞抽出物触媒作用のために使用せず、酵素を一部、又は完全に精製することである。特に好ましい実施態様において、「精製された」酵素とは、ここで用いるように、試料のSDSゲル上で好ましくは、目に見えるタンパク質の少なくとも約80%、85%、95%、98%、又は好ましくは99%まで、酵素を精製することである。さらに好ましい実施形態では、認識可能な唯一のポリペプチドを、相応する試料のSDSゲル上で精製する。この分野の当業者には、酵素活性を有するポリペプチドを適切な細胞で過剰発現させ、精製若しくは単離可能な多数の方法が公知である。そこで、ポリペプチドを発現するために、全体的に、当業者に手に入る発現系が使用でき、それは例えばpET又はpGEXのベクターである。精製するためには、クロマトグラフ法が考慮され、例えば、タグを有する組み換えタンパク質アフィニティークロマトグラフ精製法は、ヒスチジンタグの場合には固定された配位子(例えばニッケルイオン)を用いて、目的とするタンパク質に融合されたグルタチオン−S−トランスフェラーゼの場合には固定化されたグルタチオンを用いて、又はマルトース結合性タンパク質を含有するタグの場合には、固定されたマルトースを用いて行われる。

0032

精製された酵素活性を有するポリペプチドは、溶解型で、又は固定化して使用できる。当業者には、ポリペプチドによって、有機若しくは無機固相共有結合又は非共有結合で固定するための適切な方法は知られている(例えば、スルホドリルカップリング化学によって、Pierce社のキット等)。

0033

本発明による教示は、多数のアルカンに適用できる。好ましい実施形態において、「アルカン」とは、ここで用いるように、直鎖状、及び分枝鎖状の式CnH2n+2の炭化水素、並びに式CnH2nの環状炭化水素を含む群から選択される飽和炭化水素であり得、ここでnは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、及びそれ以上であり、好ましくは1〜5であり、さらに好ましくは1〜4である。炭素数が1〜4のアルカンには例えば、メタンエタン、プロパン、ブタン、及びイソブタンという化合物が含まれる。これらのアルカンには、直鎖状アルカン、例えばメタン、エタン、プロパン、及びブタンを含む群が含まれる。特に好ましい実施形態では、アルカンが分枝鎖状アルカンであり、好ましくは、イソブタン、2−メチルブタン、及びネオペンタンを含む群から選択されるアルカンである。さらに好ましい実施態様では、アルカンがブタン及びイソブタンを含む群から選択されるアルカンである。特に好ましい実施形態において、これはメチルシクロブタンである。

0034

本発明による方法を実施するためには、様々な条件が考慮される。重要なのは、酸化剤として分子状酸素が存在することである。酸素は酸素源の形で(例えば過酸化水素又は過マンガン酸カリウム)、存在することができ、またこれらからその場で形成することもできるが、特に好ましいのは酸素ガスの導入であり、さらに好ましくは空気の形で、酸化還元酵素を含有する液状反応培地に導入する。ただし、この際に温度は、生きている細胞又は適切な酵素の試料を用いる場合には、選択した細胞又は選択した酵素が生きられる、又は活性を示す温度でなければならず、これは20℃超、30℃超、40℃超、50℃超、60℃超、70℃超、又は80℃超であり、好ましくは最大100℃であり得る。当業者には、どの有機体がどの温度で生存可能かどうか知られており、例えばFuchs/Schlegel, 2007のような教科書に記載されている。生きている酵母細胞の場合、この温度は5〜45℃、好ましくは15〜42℃、さらに好ましくは20〜30℃であり得る。グラム陰性菌、好ましくは腸内細菌科(最も好ましいのは大腸菌)の場合、この温度は5〜45℃、好ましくは15〜42℃、さらに好ましくは20〜30℃、最も好ましくは35〜40℃であり得る。pH値は、AlkB型酸化還元酵素の活性が、少なくとも充分に長く得られる程度でなければならない。全細胞触媒を用いる場合、細胞は、充分に長く損なわれないままでなければならない。pH値は例えば、3〜12、好ましくは5〜9、さらに好ましくは6〜8であり得る。

0035

アルカンとAlkB型の酸化還元酵素との接触は好ましくは、固体若しくは液状のアルカンである場合には、精製された、又は全細胞触媒の形で存在するAlkB型の酸化還元酵素を、水溶液中で充分に安定的な形で存在させ、アルカンを穏やかに撹拌しながら、酸素と一緒溶液に添加し、或いは気体の形態では、気体状アルカンである限り、水溶液中に導入する。当業者であれば、酵素又は全細胞触媒を、日常的な実験で安定化された形態で用意できる。適切な緩衝系の使用、適切な温度の調節、pH濃度及び塩濃度の値などの注意すべきヨウ素は、例えばCornish-Bowden, 1995のような文献に記載されている。

0036

本発明による細胞を培養するためには、多くの培養培地が考慮され、酵母細胞を用いる場合には、例えばYPD、YPN、及びYNBに、アミノ酸、例えば1Lあたり0.01gのトリプトファン、又はグルコースが、例えば1%(w/v)の濃度で補われていてよい。腸内細菌系の菌(好ましくは大腸菌)を用いる場合、培養のために考慮されるのは完全培地(例えばLB培地)、又は高密度細胞培地(HZD培地)であって、1Lあたり、NH4SO4 1.76g、K2HPO4 19.08g、KH2PO4 12.5g、酵母抽出物6.66g、クエン酸三ナトリウム1.96g、クエン酸鉄アンモニウム(1%) 17ml、微量元素溶液US3 5ml、原料溶液(グルコース50%w/v、MgSO4[×7H2O 0.5%w/v、30mlのNH4Cl 2.2%w/v])から成るものである。

0037

好ましい実施形態において、本発明による方法で使用される細胞は、アルカンの酸化に用いられるのとは異なる培地でも育成できる。特に好ましい実施形態において、培養のために使用される培地は完全培地であり、アルカン酸化のために使用される培地は、最少培地である。本発明による方法は、生存可能な細胞を用いて行われる限り、細胞の培養の後に、好ましくは反応緩衝液で行い、この緩衝液1Lは(NH4)H2PO4 8g、NaCl 0.5g、MgSO4×7H2O 0.48g、微量元素溶液US3 15mlから成る。微量元素溶液US3 1Lは、37%のHCl 36.5g、MnCl2×4H2O 1.91g、ZnSO4×7H2O 1.87g、Na−EDTA×2H2O 0.8g、H3BO3 0.3g、Na2MoO4×2H2O 0.25g、CaCl2×2H2O 4.7g、FeSO4×7H2O 17.8g、CuCl2×2H2O 0.15gから構成され、そのpHは5.4に調製される。さらなる実施形態において、アルカンの酸化は、M9培地で行う(グルコース15g、Na2PO4 6.79g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 2g、酵母抽出物15g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 1ml、及びカナマイシン50μgを、1000mlのフラスコ播種し、ここで、微量元素溶液(TE)1Lあたり、以下のように設定する:37%のHCl 36.5g、MnCl2×4H2O 1.91g、ZnSO4×7H2O 1.87g、Na−EDTA×2H2O 0.84g、H3BO3 0.3g、Na2MoO4×2H2O 0.25g、CaCl2×2H2O 4.7g、FeSO4×7H2O 17.3g、及びCuCl2×2H2O 0.15g。

0038

本発明による方法は、大気圧下で行うことができる。しかしながら気体状のアルカン原料を用いる場合、AlkB型の酸化還元酵素は高圧下での反応を、気体混合物の存在下で触媒することができ、これは主にアルカンと酸素との混合物を含有し、その割合は好ましくは50体積%超、60体積%超、70体積%超、又は80体積%超である。好ましい実施形態では、圧力は1.5bar超、2bar超、3bar超、又は4bar超である。さらなる好ましい実施形態では、圧力は0.5〜4bar、好ましくは1〜3bar、最も好ましくは1〜1.5barである。

0039

本発明による方法の特別な利点は、原料として使用するアルカンの酸化還元酵素の特定の比が得られることにある。アルカンは、AlkB型の酸化還元酵素によって、末端位の炭素原子(共有結合によって、最大1個のさらなる炭素原子とのみ、直接結合されている炭素原子)を基本的に3つの酸化段階に酸化することができる(すなわち、アルコール、アルデヒド、及びカルボン酸に酸化)。好ましい実施形態において、「酸化生成物のもとでカルボン酸対アルコールの比が1超:1である」という記載は、カルボン酸対アルコールの物質量の比が、好ましくは末端位の炭素原子の酸化により生じる物質量対、末端位の炭素原子の酸化により生じるアルコールの比が、1超:1であるということを意味する。すなわち、生成物混合体中で、末端位の炭素原子の酸化により生じるカルボン酸の分子が、末端位の炭素原子の酸化により生じるアルコールの分子よりも多く存在するということである。

0040

好ましい実施形態においては、アルカン、好ましくは炭素数1〜5のアルカン、さらに好ましくは炭素数1〜4のアルカン、最も好ましくは炭素数が4のアルカンから、酸素の存在下、酸化生成物を製造するために、AlkB型の酸化還元酵素、好ましくはAlkB型のプセウドモナス・プチダGpo1を使用することができ、ここでカルボン酸対アルコールの比が、1超:1、好ましくは1.5:1、2:1、5:1、10:1、15:1、又は20:1である。

0041

本発明はさらに好ましい実施形態において、非環状アルカンの末端位の炭素原子を相応するアルデヒド及び/又は相応する末端位のモノカルボン酸にする方法を包含し、当該方法は、酸化剤の存在下で、アルカンと生物学的試薬(触媒活性を有する酸化還元酵素)とを接触させる工程を有し、ここで前記アルカンが、ブタン又はイソブタンであり、前記酸化還元酵素が、AlkB型の酸化還元酵素であり、さらに好ましくはモノオキシゲナーゼAlkBが、プセウドモナス・プチダGPo1からのものであるか、又はその同族体であり、前記酸化剤が酸素であり、また本発明は、AlkB型の酸化還元酵素、好ましくはプセウドモナス・プチダ GPo1又はその同族体から得られるモノオキシゲナーゼを、非環状アルカンの末端位炭素原子の酸化によって、相応するアルデヒド、及び/又は相応する末端位のモノカルボン酸にするために用いる使用であって、前記アルカンがブタン又はイソブタンである使用を包含する。

0042

本発明をさらに、以下の図面と、非制限的な実施例を用いて説明するが、ここからさらなる特徴、実施形態、態様、及び利点を読み取ることができる。

図面の簡単な説明

0043

1−ブタノールの濃度(a)、2−ブタノールの濃度(b)、ブチルアルデヒドの濃度(c)、又は酪酸の濃度(d)を、プセウドモナス・プチダGPo1から撹拌回転数500〜800回転/分で得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系により、ブタンと酸素との反応における時系列で示したものである。発酵槽(F)、及び洗浄瓶(WF)における濃度が示されている。
a)及びb)は、プセウドモナス・プチダGPo1から得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系による大腸菌による酸化に対するバイオマス濃度の影響を示し、(a)は1−ブタノールの濃度を、(b)は酪酸の濃度を時系列で示したものである。
a)、b)、c)、及びd)は、プセウドモナス・プチダGPo1から得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系による大腸菌によるブタンの酸化に対する微量元素(TE)の濃度の影響を示し、(a)は1−ブタノールの濃度、(b)は2−ブタノールの濃度、(c)はブチルアルデヒドの濃度、そして(d)酪酸の濃度を時系列で示したものである。
a)、b)、c)、及びd)は、プセウドモナス・プチダGPo1から得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系による、大腸菌BL21と、大腸菌3110との比較、並びにプセウドモナス・プチダGPo1から得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系による大腸菌によるブタンの酸化に対する影響を示し、(a)は1−ブタノールの濃度、(b)は2−ブタノールの濃度、(c)はブチルアルデヒドの濃度、そして(d)は酪酸の濃度を時系列で示したものである。
a)、b)、及びc)は、プセウドモナス・プチダGPo1から得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系による大腸菌によるイソブタンの酸化を示し、(a)は2−メチル−1−プロパノールの濃度、(b)はイソブチルアルデヒドの濃度、そして(c)はイソ酪酸の濃度を時系列で示したものである。
例7についてクローニングしたベクターp−LL−30を図式的に示す。
アルカニボラックス・ボルクメンシス(Alcanivorax borkumensis)から得られるモノオキシゲナーゼ系を用いた大腸菌によるブタンの酸化を示す(実施例7と同様に実施)。

0044

例1:プセウドモナス・プチダGPo1から得られるAlkBGTモノオキシゲナーゼ系による、大腸菌によるブタンの酸化
大腸菌BL21 pCOM 10のグリセリン低温培養(対照プラスミド)、及び大腸菌BL21 pBT10(WO 2009/077461)を100μlを、LBアガープレート上でカナマイシン50μlとともに置き、24時間、37℃でインキュベートする。LBプレートを酵母抽出物5g、ペプトン10g、NaCl 0.5g、アガーアガー15g、及びカナマイシン50μgの溶液1リットルから作製する。pHは、オートクレーブの前に5%のNH4OHで7.4に調整する。

0045

これらのプレートから(反応用バッチのために)、2×25mlLBブロス(アガーアガーの無い上澄み溶液)を、カナマイシン50μlと一緒に、播種物を完全循環させる(容量10μl)じゃま板付きの三角フラスコ(100ml)に、播種した。培養は24時間、37℃で、200回転/分(振幅2.5cm)でインキュベートする。

0046

その後、変性M9培地75ml内にある培養液体25mlごとに、1000mLの三角フラスコに1Lあたり以下の組成で播種する:グルコース15g、Na2PO4 6.79g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 2g、酵母抽出物15g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 1ml、及びカナマイシン50μg。微量元素溶液(TE)は、1Lあたり以下のように作製する:37%のHCl 36.5g、MnCl2×4H2O 1.91g、ZnSO4×7H2O 1.87g、Na−EDTA×2H2O 0.84g、H3BO3 0.3g、Na2MoO4×2H2O 0.25g、CaCl2×2H2O 4.7g、FeSO4×7H2O 17.3g、及びCuCl2×2H2O 0.15g。pHは、5%のNH4OHで7.4に調整する。さらに、フラスコ1つあたりオートクレーブされた消泡剤(Delamex)3滴を添加する。

0047

フラスコは、2時間、37℃で、180回転/分(振幅2.5cm)でインキュベートする。この後、温度を25℃に減少させる。25℃で0.5時間後に、DCPK0.4mMを導入した。培地はさらに16時間、25℃、180回転/分で振った。その後、Monosepsisで顕微鏡試験を行った。

0048

これらの培地を1まとめにし、50mlのファルコンチューブに満たし、10000gの場合、25℃で10分間、遠心分離した。残渣は廃棄する。培地200mlからのペレットを、反応緩衝液10mlに再懸濁させる。この反応緩衝液は、Na+/K+のリン酸緩衝液70mMから成り、pHは1MのNaOHにより7に調整され、Na2PO4 6.79g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 1ml、及びカナマイシン50μgを有するか、又は(NH4)H2PO4緩衝液 70mMから成り、pHは(NH4)H2PO4 8gにより7に調整され、NaCl 0.5g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 1ml、及びカナマイシン 50μgから成る(1L当たり)。ここでpHの調整は、5%のNH4OHにより行う。

0049

オートクレーブされた消泡剤(Delamex)約3滴を入れた緩衝液170mlを、300mlの発酵槽に装入する。この発光槽に、ガス瓶からブタン25%、合成空気75%の気体混合物を初期圧力5barで、孔径0.2μmの焼結ガラスperlatorを通じ、流速25l/hでガスを送る。この発酵槽は、水浴中で25℃に温度調整し、マグネチックスターラを用いて500回転/分で2時間、それから800回転/分で撹拌した。排気は、水150mlが充填された洗浄瓶を通じて排出する。

0050

この発酵槽に、再懸濁されたペレット10mlを播種する。これら2つの培地のODは、約10である。反応は、グルコースを1体積%添加することにより開始する。pHは選択的に、試験時間の間、制御しても、制御しなくてもよい。10分後、45分後、135分後、及び240分後に、発酵槽と洗浄瓶からそれぞれ試料を10ml取り出す。発酵槽からの試料中に、HClを2ml入れて、反応を停止させる。発酵試料は、10000gで10分、反応温度で遠心分離し、その残渣は0.2μmの装入型フィルター濾過する。これらの試料はHPLCバイアルでの分析のために充填する。クロマトグラフ分析のために、Agilent Technologies社の1200型装置のHPLC−RIDを用いた。Aminex社の HPX-87H型カラム(30mm×7.8mm)を用いた。この装置は、H2SO4 10mMを溶離剤として、流速0.6ml/分、及びカラム温度40℃で稼働させた。分析すべき全ての物質の標準は、純水中で前処理し、同一の条件で測定した。評価は、保持時間の比較によって行った。さらに、それぞれの試料採取時点について、pH、OD、及びグルコース濃度を測定するために、発酵槽から試料を2ml採取する。pHは、外部のpH測定器で測定し、OD分光分析は600nmで測定し、グルコース含分は生化学的な分析機(Kreienbaum社のYSI Select 2700)により測定する。

0051

結果
その結果が、図1a)〜d)にまとめてある。大腸菌BL21 p COM10(対照用プラスミド)による試験では、ブタン又は1−ブタノールの酸化は起こらない。これに対して、大腸菌BL21pBT10を使った場合には、n−ブタンの酸化生成物が生じる:1−ブタノール、酪酸、2−ブタノール、ブチルアルデヒド、1,4−ブタンジオール定量化できず)、及びブチロラクトン痕跡量)が検出された。

0052

全ての酸化生成物濃度は、試験時間全体にわたって、上昇する。グルコースが約1g/lh消費され、pH値は7から約5に低下する。

0053

例2:プセウドモナス・プチダGPo1からのモノオキシゲナーゼ(AlkBT)による大腸菌によるn−ブタンの酸化に対する、撹拌回転数の影響
試験は、例1と同様に行う。撹拌回転数は第二のバッチで最初から、900回転/分で一定に調整する。ODは例1に比べて、二倍高い。TE濃度は、15倍である。最後の試料採取は、200分後に行った。

0054

結果
発酵槽(F)における1−ブタノールの形成は、一定の高い回転数でより早く行い、最大回転数に達する。洗浄瓶(WF)では、1−ブタノールの濃度が低い水準で、ほぼ同一である。発酵槽(F)における2−ブタノールの濃度は、それぞれの撹拌数で試験時間全体にわたって上昇するが、その幅は僅かである。洗浄瓶において、2−ブタノールは、試験時間の終わりになって初めて、検出可能となる。ブチルアルデヒドの濃度は、高い撹拌数ではより早く上昇するが、113hPa(20℃)という蒸気圧では、より早く稼働させる。ブチルアルデヒドは、定性的には検出できるが、定量的には検出できない。

0055

n−酪酸は、撹拌数が低い場合には、試験時間の終わりになって初めて形成される。撹拌回転数が高いと、濃度が連続的に上昇する。洗浄瓶では、n−酪酸は検出されない。

0056

例3:プセウドモナス・プチダGPo1からのモノオキシゲナーゼ(AlkBT)による大腸菌によるn−ブタンの酸化に対する、バイオマス濃度の影響
試験は、例1と同様に行う。撹拌回転数は900回転/分と一定に保ち、TE濃度はそれぞれ15倍である。1×とは、約10のODを意味し、2×とは、20に相当する。

0057

結果
その結果が、図2a)とb)にまとめてある。最大濃度は、二倍のODでより早い試験時間の到達につながる。1−ブタノールも、より迅速に変換される。

0058

酪酸は発酵槽(F)でのみ検出され、洗浄瓶では検出できない。二倍のODにより、酪酸形成が開始され、早くも変換の開始につながる。通常量のODでは、これらの条件下では240分後になって初めて、酪酸が検出できる。この濃度は、二倍のODにおける最大濃度の約18%である。

0059

例4:プセウドモナス・プチダGPo1からのモノオキシゲナーゼ(AlkBT)による大腸菌によるn−ブタンの酸化に対する、TE濃度の影響
試験は、例1と同様に行う。撹拌回転数は900回転/分と一定である。使用する大腸菌株はE. coli W31 10 pBT10である。TEの濃度は、緩衝液1Lあたり1ml(1×)又は緩衝液1Lあたり15ml(15×)である。15倍の濃度の試験では、さらに30mg/lのMOPSが添加されている。

0060

結果
これらの結果が図3a)〜d)に示されている。TEの濃度が15倍の場合、全ての酸化生成物はより迅速に、より高い濃度で形成される。

0061

例5:プセウドモナス・プチダGPo1からのモノオキシゲナーゼ(AlkBGT)による大腸菌株BL21と、大腸菌株W3110との比較
試験は例1と同様に、一定の撹拌回転数(900回転/分)で行う。TE濃度は、反応用緩衝溶液1Lあたり15mlである。

0062

結果
その結果が、図4a)〜d)にまとめてある。大腸菌株W3110 pBT10は全ての酸化生成物を、大腸菌株BL21 pΒΤ 10より迅速に、かつ高濃度で形成する。

0063

例6:プセウドモナス・プチダGPo1から得られるモノオキシゲナーゼAlkBGT系による、大腸菌によるイソブタンの酸化
作業の経過は、例1と同様である。使用したのは、大腸菌株W3110 pBT10である。 反応緩衝液は、Na+/K+のリン酸緩衝液70mM、pHは5%のNa4OHにより7に調整され、Na2PO4 6.79g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 15ml、及びカナマイシン50μgから成る(1Lあたり)。

0064

ガスの給送は例1と同様に、i−ブタン25%と、合成空気75%との混合物のみで行う。

0065

結果
その結果が、図5a)〜c)にまとめてある。i−ブタンの酸化生成物について、i−ブタノール、i−酪酸、t−ブタノール、及びi−ブチルアルデヒドが検出される。

0066

例7:アルカニボラックス・ボルクメンシスから得られるAlkBGT型モノオキシゲナーゼ系による、大腸菌によるブタンの酸化
酸化のために使用される株は、アルカニボラックス・ボルクメンシスSK2(データベースコードCAL18155.1、及びCAL 18156.1)からのAlkB型モノオキシゲナーゼのための遺伝子情報を有するプラスミドを含有する。alkST、alkL、並びにalkS、及びAlkBについての遺伝子情報は、プセウドモナス・プチダGPo1に由来する。

0067

目的ベクターのクローニング
数を増やすために、New England Biolabs社の2×Phusion HF Master Mix (NEB, M0531 S)を使用した(製造元記載による)。ベクターとPCR生成物を、純度に依存して、直接カラム精製し(Hilden在、Qiagen社、QiaQuick PCR Purification Kit)、抽出した。PCR、アガロース−ゲル−電気泳動、DNAの臭化エチジウム着色、及びPCRフラグメントサイズの測定の実施は、当業者に公知の手法で行った。両方の場合において、期待した大きさのPCRフラグメントを用意できた。PCRのためには、配列番号1、2、3、及び4で示される配列を有するプライマーを使用した。

0068

精製したPCR生成物を、EcoRI−HF+Ac/lで切断されたベクターpBT1_alkL中に、ゲル洗浄の後、組み替えによって、インフュージョン−HD−クローニングキット(製造元:米国カリフォルニア州Mountain View在、Clontech Laboratories社)を用いてクローニングした。化学的作用により被感染作用を有する大腸菌DH10(Frankfurt在、New England Biolabs社)の形質転換は、当業者に公知の手法で行った。目的配列の正確な挿入は、制限分析によって確認し、導入された配列の信頼性は、DNA配列によって確認される。生成したベクターは、p−LL−30と呼ぶ(図7)。ベクターの配列は、配列プロトコルに配列番号5で記載されている。

0069

目的ベクターは、当業者に公知の手法で大腸菌W3110内でクローニングした。生成した株を大腸菌W3110AN−S−LL−16と呼ぶ。

0070

細胞の培養、及び生物的転化
大腸菌W3110 EN−S−LL−16のグリセリン低温培養体100μlを、LBアガープレート上でカナマイシン50μlとともに置き、24時間、37℃でインキュベートする。LBプレートを酵母抽出物5g、ペプトン10g、NaCl 0.5g、アガーアガー15g、及びカナマイシン50μgの溶液1リットルから作製する。

0071

これらのプレートから、3×25mlのLBブロス(アガーアガーの無い上澄み溶液)を、カナマイシン50μlと一緒に、100mlのじゃま板付き三角フラスコに、プレートの各コロニーに播種した。培養は24時間、37℃で、200回転/分(振幅2.5cm)でインキュベートする。

0072

その後、変性M9培地175ml内にある培養液体25mlごとに、1000mLの三角フラスコに1Lあたり以下の組成で播種する:グルコース15g、Na2PO4 6.79g、KH2PO4 3g、NaCl 0.5g、NH4Cl 2g、酵母抽出物15g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 1ml、及びカナマイシン50μg。微量元素溶液(TE)は、1Lあたり以下のように作製する:37%のHCl 36.5g、MnCl2×4H2O 1.91g、ZnSO4×7H2O 1.87g、Na−EDTA×2H2O 0.84g、H3BO3 0.3g、Na2MoO4×2H2O 0.25g、CaCl2×2H2O 4.7g、FeSO4×7H2O 17.3g、及びCuCl2×2H2O 0.15g。pHは、5%のNH4OHで7.4に調整する。さらに、フラスコ1つあたりオートクレーブされた消泡剤(Delamex)3滴を添加する。

0073

フラスコは、2時間、37℃で、180回転/分(振幅2.5cm)でインキュベートする。この後、温度を25℃に減少させる。25℃で0.5時間後に、DCPK0.4mMを導入した。培地はさらに16時間、25℃、180回転/分で振った。

0074

これらの培地を1まとめにし、50mlのファルコンチューブに満たし、10000gの場合、25℃で10分間、遠心分離した。残渣は廃棄する。培地600mlからのペレットを、反応用緩衝液30mlに再懸濁させる。反応用緩衝液は、リン酸アンモニウム緩衝液70mM、pHは(NH4)H2PO4 8gにより7に調整され、NaCl 0.5g、MgSO4×7H2O 0.49g、TE 1ml、及びカナマイシン50μgから成る(1Lあたり)。pHの調整は、25%のアンモニア溶液で行った。

0075

オートクレーブされた消泡剤(Delamex)約3滴を入れた緩衝液150mlを、300mlの発光槽に装入する。この発酵槽に、ブタン25%、合成空気75%の気体混合物を、孔径0.2μmの焼結ガラスperlatorを通じ、6.5lN/hでガスを送る。この発酵槽は、水浴中で30℃に温度調整し、マグネチックスターラを用いて900回転/分で撹拌する。排気は、水150mlが充填された洗浄瓶を通じて排出する。

0076

この発酵槽に、再懸濁された予備培養ペレットを播種する。OD600は、約15である。pH値は、5%のアンモニア溶液によって7.0に制御する。グルコース供給速度は、1g/lhである。様々な時点で、発酵槽と洗浄瓶からそれぞれ試料を5ml取り出す。発酵試料は、10000gで10分、反応温度で遠心分離し、その残渣は0.2μmの装入型フィルターで濾過する。これらの試料はHPLCバイアルでの分析のために充填する。クロマトグラフ分析のために、Agilent Technologies社の1200型装置のHPLC−RIDを用いる。Aminex社の HPX-87H型カラム(30mm×7.8mm)を用いる。この装置は、H2SO4 10mMを溶離剤として、流速0.6ml/分、及びカラム温度40℃で稼働させる。分析すべき全ての物質の標準は、純水中で前処理し、同一の条件で測定する。評価は、保持時間の比較によって行う。さらに、それぞれの試料採取時点について、pH、OD、及びグルコース濃度を測定するために、発酵槽から試料を2ml採取する。pHは外部のpH測定器で測定し、OD分光分析は600nmで測定し、グルコース含分は生化学的な分析機(Kreienbaum社のYSI Select 2700)により測定する。その結果が、表7にまとめてある。
・文献一覧

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