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図面 (6)

課題

健康増進、とりわけ、口腔内疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の提供を課題とする。

解決手段

本願発明者らは健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の探索を行い、Weissella(ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌W3(寄託番号 NITEBP−01789)が口腔内の疾病の予防または治療する効果を有することを見出した。

概要

背景

宿主に有益な作用をもたらす微生物として、腸内フローラバランスを改善する乳酸菌(例えばLactobacillus、やBifidobacterium)が知られ、これらの微生物を食品等により取り込むことがなされていた。
一方、近年では、腸内に留まらず、口腔内の健康増進のための、微生物の利用が注目されている。例えば、国内では乳酸菌であるLactobacillus reuteriを含むヨーグルトが、むし歯菌であるミュータンス連鎖球菌の増殖を阻害するとし、実際、ヒト試験において唾液中のミュータンス連鎖球菌の数を減少させた例が報告されている(非特許文献1)。

概要

健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の提供を課題とする。本願発明者らは健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の探索を行い、Weissella(ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌W3(寄託番号 NITEBP−01789)が口腔内の疾病の予防または治療する効果を有することを見出した。なし

目的

本発明は、健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の提供を課題とする

効果

実績

技術文献被引用数
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請求項1

ワイセラ属乳酸菌W3乳酸菌(Weissellasp.(W3):受託番号NITEBP−01789)もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体

請求項2

ワイセラ属乳酸菌とキシロースからなる口腔内疾病の予防または治療のための口腔組成物

請求項3

ワイセラ属乳酸菌がワイセラ属乳酸菌W3乳酸菌(Weissellasp.(W3):受託番号NITEBP−01789)もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体である請求項2の口腔組成物。

請求項4

ワイセラ属乳酸菌W3(Weissellasp.(W3):受託番号NITEBP−01789)もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体を含むことを特徴とする飲食品

請求項5

請求項2または3の口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品。

技術分野

0001

健康増進のための微生物の利用に関する。

背景技術

0002

宿主に有益な作用をもたらす微生物として、腸内フローラバランスを改善する乳酸菌(例えばLactobacillus、やBifidobacterium)が知られ、これらの微生物を食品等により取り込むことがなされていた。
一方、近年では、腸内に留まらず、口腔内の健康増進のための、微生物の利用が注目されている。例えば、国内では乳酸菌であるLactobacillus reuteriを含むヨーグルトが、むし歯菌であるミュータンス連鎖球菌の増殖を阻害するとし、実際、ヒト試験において唾液中のミュータンス連鎖球菌の数を減少させた例が報告されている(非特許文献1)。

0003

韓国登録特許第10−0995357号公報

先行技術

0004

Int.J.Food Microbiol.95,pp.219−23(2004)
腸内細菌雑誌21,pp.129−142(2007))
Caries Res.40,pp.418−25(2006)
Int.J.Syst.Evol.Microbiol.,52,pp.141−8(2002)

発明が解決しようとする課題

0005

本発明は、健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の提供を課題とする。

課題を解決するための手段

0006

本願発明者らは健康増進、とりわけ、口腔内の疾病の予防または治療に有効な乳酸菌の探索を行い、Weissella(ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌W3(Weissella sp.(w3):寄託番号 NITEBP−01789)が口腔内の疾病の予防または治療する効果を有することを見出した。

発明の効果

0007

ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌W3はS.ミュータンスバイオフィルム形成を抑制し、口腔内の疾病の予防または治療に有効である。また、ワイセラ属乳酸菌はキシロースと組み合わせると口腔内の疾病の予防または治療に有効である。キシロースはS.ミュータンスに代謝されにくいことから、ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌W3と組み合わせて、口腔内の疾病の予防または治療に有効である。

図面の簡単な説明

0008

W1〜W20株、及び、対象のS.ミュータンスバイオフィルム形成抑制効果を確認した実験の結果を示す。図1(a)は実験で観察された染色されたバイオフィルムの色の度合いを示す。図1(b)は(a)を数値化した吸光度指標として示す。本図に示される実験はn=8で行った結果である。
S.ミュータンスによる様々な糖の代謝の際のpHを示す。
ワイセラ属乳酸菌W3の増殖曲線を示す。
ワイセラ属乳酸菌W3のS.ミュータンスバイオフィルム形成抑制効果におけるスクロース濃度の影響およびキシロースの影響を示す。図4(a)は実験で観察された染色されたバイオフィルムの色の度合いを示す。図4(b)は(a)を数値化した吸光度を指標として示す。
ワイセラ属乳酸菌W3のS.ミュータンスバイオフィルム形成抑制効果のキシロース濃度依存性を示す。図5(a)は実験で観察された染色されたバイオフィルムの色の度合いを示す。図5(b)は(a)を数値化した吸光度を指標として示す。本図に示される実験はn=8で行った結果である。
ワイセラ属乳酸菌W3をグラム染色した顕微鏡観察写真である。

0009

本発明は、ワイセラ属乳酸菌W3(Weissella sp.(w3):受託番号NITEBP−01789)もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体を提供する。なお、本明細書中、ワイセラ属乳酸菌W3を、ワイセラ乳酸菌W3,ワイセラW3あるいは、単にW3等と表記する場合がある。
なお、変異体とは、培養を続けるうちに、性質あるいは表現型遺伝子配列等に若干の変化が及んだものであるが、本発明の課題である、口腔内の疾病の予防または治療に効果を有する限り、変異したワイセラ属乳酸菌W3は本発明に含まれる。また、形質転換体とは、本発明の乳酸菌を、工業的、あるいは、医療を目的として、プラスミド、あるいはウィルス、その他の遺伝子工学の手法によって、人為的に遺伝子に改変を加えたものをいうが、本発明の課題である、口腔内の疾病の予防または治療に効果を有する限り、形質転換したワイセラ属乳酸菌W3は本発明に含まれる。

0010

また、本発明はワイセラ属乳酸菌とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。この口腔組成物において、ワイセラ属乳酸菌として、特に好ましくはワイセラ属乳酸菌W3である。
又、本発明は、ワイセラ属W3乳酸菌株もしくはその変異体、又はそれらの形質転換体あるいは、上記口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品を提供する。

0011

また、本発明は、ワイセラ属乳酸菌とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。
口腔内の疾病とは、齲蝕歯周病などを指す。
さらには、本発明は、ワイセラ属乳酸菌W3とキシロースからなる口腔内の疾病の予防または治療のための口腔組成物を提供する。
また、さらには、本発明は、ワイセラ属乳酸菌W3、あるいは上記口腔組成物を含むことを特徴とする飲食品を提供する。飲食品は特に限定されることなく、例としては、菓子冷菓乳製品肉類魚類野菜類、それらの加工食品清涼飲料酒類、水、さらには家畜ペット飼料などを挙げることができる。
以下に、本発明の一例を実施例により示すが、本願発明は実施例に限定されるものではない。

0012

培養方法及び試験方法
はじめに、実施例で用いた培養方法や試験方法などの方法の詳細を説明する。

0013

1.Streptococcu mutansUA159および乳酸菌の培養
Streptococcu mutans(本明細書中でS.mutans、S.ミュータンスあるいはS.mと記載する場合がある)としてStreptococcus mutans UA159を用い、BHI(Brain Heart Infusion,日本BD)培地にて37℃で嫌気培養した。乳酸菌はMRS(日本BD)液体培地、またはこれに1.5%寒天を加えた平板培地にて37℃で嫌気的に培養した。

0014

2.16SrRNA遺伝子配列解析による菌種同定方法
16S rRNA遺伝子の上流約500bp領域のDNA断片増幅するため、8UAフォワードプライマ(3’−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−5’(配列番号1))および519Bリバースプライマー(3’−ATTACCGC(C/G)GCTGCTG−5’(配列番号2))(非特許文献2)を用いて、乳酸菌から調製したゲノムDNAを鋳型にしてPCRした。反応の温度条件は、95℃で5分間インキュベートした後、95℃で30秒、55℃で30秒、72℃Cで30秒のインキュベートを25サイクル繰り返した。最後に72℃で7分間インキュベートした。PCR産物を8UAフォワードプライマにてダイレクトシーケンスした。得られたDNAの塩基配列遺伝子データベースDDBJ日本DNAデータバンク)にて塩基配列の相同性検索し、菌種推定した。

0015

3.S.ミュータンス.バイオフィルムの形成および、S.ミュータンス.バイオフィルム形成抑制活性評価
96ウェルマイクロプレートに0.25%〜2%スクローを含むTSB(Tripticase soy broth,日本BD)を加え、さらに予めBHI培地にて培養したS.ミュータンスの培養液OD660が約0.3に希釈して20μl接種した(培養液の全量は300μl)。培養は嫌気的に37℃で16時間行い、その後培養上清を捨てマイクロプレートの底に形成されたバイオフィルムを生理食塩水で2回緩やかに洗浄した。次に、0.3%クリスタルバイオレット溶液でバイオフィルムを10分間染色した後、生理食塩水で2回緩やかに洗浄した。静置し、乾燥させた後マイクロプレートリーダー(SH−1000 Lab、コロナ電気(株))にてOD570を測定し、これをバイオフィルム量とした。
乳酸菌のS.ミュータンスバイオフィルム形成抑制を評価する際は、乳酸菌を107〜108個/mlになるよう培養液に加えた。また、キシロースの効果を確認するために、一部の測定では、培養液に適宜キシロースを加えた。

0016

4.乳酸菌の糖資化性評価
乳酸菌の糖資化性についてはAPI50 CHL kit(bioMerieuxフランス)を用いて評価した。すなわちMRS寒天培地で培養して形成したコロニーをとり、菌液接種用培地種用培地(API 50 CHB/CHEメディウム)に懸濁し、マクファーランド濁度2となるように調製した。その懸濁液を49種類の糖代謝判定のウェルに接種し、ミネラルオイル重層して24時間培養した。指示薬の色の変化によって代謝が陽性陰性かを判定した。

0017

5.S.ミュータンスによる糖質の資化性評価
BHI培地にてOD660が約0.5となるまで培養したS.ミュータンスの培養液をグルコーススクロース、キシロース、キシロオリゴ糖またはフラクトオリゴ糖を5%含むHI培地5mlに50μl接種し、37℃で18時間嫌気培養した。培養液のpHを測定し、歯(エナメル質)からカルシウムおよびリン酸溶出し始めるpHである5.7を上回ったかどうかを評価した。

0018

6.乳酸菌の増殖曲線の評価
乳酸菌をMRS培地にてOD660が約0.5となるまで37℃で嫌気培養し、その培養液を糖を含んでいないHeart Infusion(HI培地,日本BD)培地5mlに50μl接種した。37℃で嫌気的に培養し、1時間おきにOD660を測定した。また、スクロース、キシロース、キシロオリゴ糖またはフラクトオリゴ糖の資化性を評価する場合には、それぞれの糖を1.5%となるようにHI培地に加え、同様の操作を行った。

0019

<実験および結果>
以下に本実施例で行った具体的な実験及び結果を記載する。

0020

1.S.ミュータンスバイオフィルム形成抑制効果を有する乳酸菌の探索
本願発明者らは、はじめに、キムチ由来の乳酸菌を調べ、ワイセラ属の乳酸菌がS.ミュータンスのバイオフィルム形成を強力に抑制することを確認した。この結果はM.S.Kangらの報告(非特許文献3)や特許文献1において既に示されており、それらの結果と一致したといえる。
本発明では、ワイセラ属の乳酸菌の中でも、とりわけバイオフィルム形成抑制効果の高いワイセラ属乳酸菌株を得ることを目標とした。そこで、本願発明者らは、改めて、キムチの一部をMRS培地に塗布して培養し、新たに複数の乳酸菌株を単離した。これらの乳酸菌株をそれぞれグラム染色して形態を観察し、Weissella cibaria JCM12495(基準株)を対照に観察を行い、ワイセラ属と思われる株を選抜した。さらにそれぞれの株の16SrRNA遺伝子の上流領域約500bpのDNA断片の配列解析を行い、遺伝子データベース(DDBJ:日本DNAデータバンク)にて塩基配列の相同性検索を行い、ワイセラ属乳酸菌株と同定されるものを選び、最終的に20種類のワイセラ属乳酸菌株を得た。これらをW1からW20と名づけた。

0021

2.ワイセラ属乳酸菌のバイオフィルム形成抑制活性比較
ワイセラ属乳酸菌W1からW20株とのバイオフィルム形成抑制効果を評価した。比較対象として既知のむし歯予防乳酸菌として知られるLactobacillus reuteriおよびLactobacillus salivariusを用いた。結果を図1に示す。ワイセラ属乳酸菌W3が最もバイオフィルム形成抑制効果があることが分かった。

0022

3.既知ワイセラ属乳酸菌とワイセラ属乳酸菌W3の糖資化性比
ワイセラ属乳酸菌W3の糖資化性を調べた。結果を表1に示す。

0023

0024

ワイセラ属乳酸菌W3の資化性は、W.confusaおよびW.cibariaの基準株の資化性と異なっていた。また、特許文献1で開示されたワイセラ属乳酸菌とも異なる性質を示した。したがって、W3は既知のワイセラ属乳酸菌とは異なる、新しい株と示唆された(表2)。

0025

0026

4.ワイセラ属乳酸菌W3の16sRNA遺伝子の解析
ワイセラ属乳酸菌W3の16sRNA遺伝子の塩基配列(上流領域の約500bp)の解析結果は次のとおりであった。
TTTGTGGTTCAACTGATTTGAAGAGCTTGCTCAGATATACGATGGACATTGCAAAGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGAAACCTACCTCTTAGCAGGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGTATAACAATGACAACCGCATGGTTGTTATTTAAAAGATGGTTCTGCTATCACTAAGAGATGGTCCCGCGGTGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGTGTGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACACTGTTGTAAGAGAAGAATGACATTGAGAGTAACTGTTCAATGTGTGACGGTATCTTACCAGAAAGGAACGGCTAAATACGT(配列番号3)

0027

データベース検索の結果、上記の配列からは、ワイセラ属乳酸菌W3は、Weissella confusa(ワイセラコンヒューサ)と推定された。しかし、糖資化性においては、ワイセラ属乳酸菌W3はWeissella confusaの基準株と異なる。
非特許文献4において、著者らは、Weissella confusaの16SrRNA遺伝子の塩基配列は、Weissella cibaria(ワイセラチバリア)のそれと89.2%〜99.2%の相同性を示すなど、ワイセラ属の乳酸菌に関しては16SrRNA遺伝情報から種までを特定することは困難であると述べている。これらを総合的に解釈し、ワイセラ属乳酸菌W3は既知の菌株とは異なる新たな株と認定し、Weissella sp.(w3)として、独立行政法人製品評価技術基板機構特許微生物寄託センターに、2014年1月21日に寄託した。受託番号はNITEBP−01789である。

0028

5.口腔内でワイセラ属乳酸菌と組み合わせに適した糖類の検索
乳酸菌を口腔内の疾病予防または治療に使用することを考えると、乳酸菌の栄養源となる糖は、一般的な細菌、特に齲蝕の原因であるS.ミュータンスには代謝され辛く、乳酸菌だけを増殖・活性化する糖が好ましい。上記観点より、キシロースに注目した。
S.ミュータンスによる糖質の資化性評価の結果(図2)、S.ミュータンスは5%のキシロースを含む培地で培養してもpH5.7を上回った。これはキシロースがS.ミュータンスに代謝され辛いこと、また、キシロースがむし歯の原因となり辛いことを示している。
一方、培地に含まれる糖の種類を限定してワイセラ属乳酸菌W3を培養し、増殖曲線を評価した結果、図3に示すように、ワイセラ属乳酸菌W3はキシロース、スクロース、キシロオリゴ糖、フラクトオリゴ糖のいずれの糖でも、HI培地と比べて増殖が促進し、中でもキシロースとキシロオリゴ糖は増殖をより促進した。これらの糖はワイセラ属乳酸菌W3における代謝が早いものと思われる。
上より、キシロースは口腔内の疾病予防または治療に使用するために、ワイセラ属乳酸菌と組み合わせる糖として有効と考えられる。

0029

6.ワイセラ属乳酸菌W3のS.ミュータンスのバイオフィルム形成抑制効果におけるスクロース濃度依存性
S.ミュータンスバイオフィルム形成抑制活性評価の結果、ワイセラ属乳酸菌W3は0.25%〜2%スクロース添加培地のいずれの条件においてもバイオフィルム形成を抑制した(図4(a)及び(b)S.ミュータンス+ワイセラ属乳酸菌W3)。さらにキシロース1.5%存在下で、S.ミュータンスバイオフィルム形成抑制活性評価を行ったところ、1〜2%と高濃度のスクロース存在下においては、ワイセラ属乳酸菌W3とともにキシロース1.5%添加すると、ワイセラ属乳酸菌W3のみ添加した場合と比較してバイオフィルム形成抑制効果を有意に高めた(p<0.05)(図4(a)および(b)S.ミュータンス+ワイセラ属乳酸菌W3+キシロース)。

0030

7.ワイセラ属乳酸菌W3のバイオフィルム形成抑制効果におけるキシロース濃度依存性
1%スクロースを含むTSB培地でS.ミュータンスとともにワイセラ属乳酸菌W3を加えて培養してバイオフィルムを形成させた。培養の際、0.02%から3.0%のキシロースを加えたところ、添加したキシロースの濃度依存的にバイオフィルム形成が抑制された(図5)。ダネット多重比較統計解析したところ、キシロース無添加の場合と比較して、0.19%以上のキシロースを含む培地で有意にバイオフィルムを減少させた(p<0.05)。

0031

8.ワイセラ属乳酸菌W3の顕微鏡観察
グラム染色したワイセラ属乳酸菌W3の形態観察結果を図6に示す。

実施例

0032

以上、本実施例より、ワイセラ属乳酸菌W3はS.ミュータンスのバイオフィルム形成を抑制し、口腔内の疾病の予防または治療に有効であることが分かった。また、ワイセラ属乳酸菌はキシロースと組み合わせるとその抑制活性が高まった。キシロースはS.ミュータンスに代謝されにくいことから、ワイセラ属乳酸菌、とりわけ、ワイセラ属乳酸菌W3と組み合わせて、口腔内の疾病の予防または治療に有効であることが分かった。

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