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技術 プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型(PCSK9)に対する抗原結合タンパク質

出願人 アムジエン・インコーポレーテツド
発明者 サイモン・マーク・ジヤクソンナイジエル・ペラム・クリントン・ウオーカーデレク・エバン・パイパーベイ・シヤンウエンヤン・シエンジヨイス・チー・イエー・チヤンチヤドウイツク・テレンス・キングランドル・ロバート・ケツチエムクリストフアー・メーリンテレサ・アラサス・カラベオチオーン・ツアオ
出願日 2015年2月23日 (4年7ヶ月経過) 出願番号 2015-033054
公開日 2015年9月24日 (4年0ヶ月経過) 公開番号 2015-166345
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 非環式または炭素環式化合物含有医薬 微生物による化合物の製造
主要キーワード キャッチオール 生データ点 機能的検査 スペース群 境界相 事前加熱 構造検査 分岐図
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重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年9月24日)のものです。
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図面 (20)

課題

プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンクシン9型(PCSK9)に結合する抗原結合タンパク質並びに該抗原結合タンパク質を使用及び作製する方法の提供。

解決手段

プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型(PCSK9)と相互作用する抗原結合タンパク質。PCSK9に対する抗原結合タンパク質の医薬として有効な量を投与することによって高コレステロール血症及び他の疾患を治療する方法。PCSK9に対する抗原結合タンパク質を用いて、試料中のPCSK9の量を検出する方法。

概要

背景

プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンクシン9型(PCSK9)は、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアーゼである(Horton et al., 2007;Seidah and Prat, 2007)。インビトロ実験は、HepG2細胞へのPCSK9の添加は細胞表面LDLRのレベルを低下させることを示している(Benjannet et al., 2004;Lagace et al., 2006;Maxwell et al., 2005;Park et al., 2004)。マウスを用いた実験は、PCSK9タンパク質レベルを増加させることが肝臓中のLDLRタンパク質のレベルを減少させる(Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004)が、PCSK9ノックアウトマウスは肝臓中のLDLRの増加したレベルを有する(Rashid et al., 2005)ことを示した。さらに、血漿LDLの増加又は減少したレベルの何れかをもたらす様々なヒトPCSK9変異が同定されている (Kotowski et al., 2006;Zhao et al., 2006)。PCSK9は、LDLRタンパク質と直接相互作用し、LDLRとともに細胞内に取り込まれ、エンドソーム経路全体を通じてLDLRと同時に免疫蛍光を発する(Lagace et al., 2006)ことが示されている。PCSK9によるLDLRの分解は観察されておらず、細胞外LDLRタンパク質レベルを低下させる機序は不明である。

PCSK9は、セリンプロテアーゼのスブチリシン(S8)ファミリー中のプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである(Seidah et al., 2003)。ヒトは、S8AとS8Bサブファミリーに分けることができる9つのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼを有する(Rawlings et al, 2006)。フューリン、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6及びPC7/PC8/LPC/SPC7は、サブファミリーS8Bに分類される。マウスフューリン及びPC1由来の異なるドメイン結晶及びNMR構造は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメイン並びに触媒ドメインのすぐC末端Pドメインを明らかにする(Henoch et al, 2003;Tangrea et al, 2002)。このサブファミリー内のアミノ酸配列類似性に基づいて、7つのメンバー全てが類似の構造を有すると予想される(Henrich et al., 2005)。SKI−1/S1P及びPCSK9は、サブファミリーS8Aに分類される。これらのタンパク質との配列比較は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメインの存在も示唆する(Sakai et al., 1998; Seidah et al., 2003; Seidah et al, 1999)。これらのタンパク質では、触媒ドメインに対してC末端のアミノ酸配列は、より可変的であり、Pドメインの存在を示唆しない。

プロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼはチモーゲンとして発現され、多段階工程を経て成熟する。この過程におけるプロドメインの機能は2つある。まず、プロドメインはシャペロンとして作用し、触媒ドメインの適切な折り畳みのために必要とされる(Ikemura et al, 1987)。触媒ドメインが折り畳まれたら、プロドメインと触媒ドメインの間で自己触媒が起こる。この最初の切断反応の後に、プロドメインは触媒ドメインに結合された状態を保ち、次いで、触媒活性阻害剤として作用する(Fu et al, 2000)。状態が正しければ、プロドメイン内の部位において、成熟は、第二の自己触媒現象とともに進行する(Anderson et al, 1997)。この第二の切断現象が起こった後に、プロドメインと触媒ドメインは解離し、活性プロテアーゼを与える。

PCSK9チモーゲンの自己触媒がGln152とSer153の間で起こり(VFAQ/SIP)(Naureckiene et al, 2003)、細胞からのその分泌のために必要とされることが示された(Seidah et al,2003)。PCSK9のプロドメイン内の部位での第二の自己触媒現象は、観察されなかった。精製されたPCSK9は、非還元SDS−PAGEによって分離され得る2つの種(17Kdにプロドメイン及び65Kdに触媒+C末端ドメイン)から構成される。PCSK9は、その阻害的プロドメインなしに単離されておらず、PCSK9の触媒活性の測定は変動する(Naureckiene et al, 2003; Seidah et al, 2003)。

概要

プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型(PCSK9)に結合する抗原結合タンパク質並びに該抗原結合タンパク質を使用及び作製する方法の提供。プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型(PCSK9)と相互作用する抗原結合タンパク質。PCSK9に対する抗原結合タンパク質の医薬として有効な量を投与することによって高コレステロール血症及び他の疾患を治療する方法。PCSK9に対する抗原結合タンパク質を用いて、試料中のPCSK9の量を検出する方法。

目的

抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫学的寛容性の欠如のためにマウスの機構活用することによって、これらのマウス系統中の再生されたヒト抗体レパートリーは、目的とする

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
0件

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請求項1

列番号1のアミノ酸配列を含むPCSK9タンパク質に結合し、LDLRに対するPCSK9のLDLR低下効果を減少させる単離された中和抗原結合タンパク質

請求項2

抗原結合タンパク質がLDLR非競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離された中和抗原結合タンパク質。

請求項3

抗原結合タンパク質がLDLR競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離された中和抗原結合タンパク質。

請求項4

PCSK9に選択的に結合する抗原結合タンパク質であって、前記抗原結合タンパク質は100pM未満であるKdでPCSK9に結合する、抗原結合タンパク質。

請求項5

抗原結合タンパク質が10pM未満であるKdで結合する、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項6

抗原結合タンパク質が5pM未満であるKdで結合する、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項7

配列番号1のPCSK9タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質であって、前記単離された抗原結合タンパク質とバリアントPCSK9タンパク質の間の結合が単離された抗原結合タンパク質と配列番号1のPCSK9タンパク質の間の結合の50%未満である、抗原結合タンパク質。

請求項8

バリアントPCSK9タンパク質が配列番号1に示される207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及び554からなる群から選択される位置に残基の少なくとも1つの変異を含む、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。

請求項9

少なくとも1つの変異がR207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及びE582Rからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。

請求項10

少なくとも1つの変異がD162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及びQ554Rからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の単離されたヒト抗原結合タンパク質。

請求項11

第一の様式で配列番号303のPCSK9タンパク質に結合する抗原結合タンパク質(該抗原結合タンパク質は、第二の様式でPCSK9のバリアントに結合し、前記PCSK9バリアントは、配列番号303の207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及び554からなる群から選択される位置に少なくとも1つの点変異を有し、前記第一の様式が第一のEC50、第一のBmax又は第一のEC50及び第一のBmaxを含み、前記第二の様式は第二のEC50、第二のBmax又は第二のEC50及び第二のBmaxを含み、並びに第一の様式に対する値は第二の様式に対する値と異なる。)。

請求項12

第一の様式が第一のEC50を含み、第二の様式が第二のEC50を含み、並びに点変異がR207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及びE582Rからなる群から選択される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項13

第一のEC50が第二のEC50と少なくとも20%異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項14

第一のEC50が第二のEC50と少なくとも50%異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項15

第二のEC50が第一のEC50より大きな数値である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項16

第一のEC50が多重ビーズ結合アッセイによって測定される、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項17

第二のEC50が1μMより大きい、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項18

抗原結合タンパク質が中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項19

中和抗原結合タンパク質が競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項20

中和抗原結合タンパク質が非競合的中和抗原結合タンパク質である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項21

第一の様式が第一のBmaxを含み、第二の様式が第一のBmaxと異なる第二のBmaxを含み、並びに前記PCSK9バリアントがD162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及びQ554Rからなる群から選択される少なくとも1つの点変異を有する、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項22

第二のBmaxが第一のBmaxの約10%である、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項23

第一のBmaxが第二のBmaxと少なくとも20%異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項24

第一のBmaxが第二のBmaxと少なくとも50%異なる、特許請求の範囲の抗原結合タンパク質請求項の何れか一項の抗原結合タンパク質。

請求項25

LDLRがPCSK9に結合する位置と重複する位置においてPCSK9に結合する単離された抗体。

請求項26

PCSK9に結合し、及びLDLRに対するPCSK9の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)低下効果を低下させる中和抗体

請求項27

配列番号3の残基31から447内の位置においてPCSK9に結合する、PCSK9に結合する中和抗体。

請求項28

配列番号3の残基31から447内のエピトープに結合する、請求項27に記載の抗体。

請求項29

請求項1から28の何れか一項に記載の少なくとも1つの抗原結合タンパク質及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物

請求項30

請求項1から28の何れか一項に記載の抗原結合タンパク質をコードする核酸分子

請求項31

抗原結合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を準備すること;及び抗原結合タンパク質が発現される条件下に宿主細胞を維持すること;を含む、配列番号1のアミノ酸配列を含むPCSK9タンパク質に結合する抗原結合タンパク質(該抗原結合タンパク質はLDLRに対するPCSK9のLDLR低下効果を減少させる。)を作製する方法。

請求項32

配列番号1のアミノ酸配列を含むPCSK9タンパク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含み、前記中和抗原結合タンパク質がLDLRに対するPCSK9のLDLR低下効果を減少させる、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法。

請求項33

上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている患者に、配列番号1のアミノ酸を含むPCSK9タンパク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む(前記中和抗原結合タンパク質は、LDLRに対するPCSK9のLDLR低下効果を減少させる。)、患者中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法。

請求項34

上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている対象に、LDLRタンパク質利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、単離された中和抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む(前記単離された抗原結合タンパク質は、配列番号1のアミノ酸配列を含むPCSK9タンパク質に結合し、前記中和抗原結合タンパク質は、LDLRに対するPCSK9のLDLR低下効果を減少させる。)、対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法。

請求項35

LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤がスタチンを含む、請求項31から34の一項の方法。

請求項36

スタチンがアトロバスタチンセリバスタチン、フルバスタチンロバスタチンメバスタチンピタバスタチンプラバスタチンロスバスタチンシンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される、請求項31から35の一項の方法。

請求項37

血清コレステロールを低下させるための医薬の調製における、請求項1から22の抗原結合タンパク質の使用。

請求項38

対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防するための医薬の調製における、請求項1から22の抗原結合タンパク質の使用。

技術分野

0001

関連出願
本願は、2007年8月23日に出願された米国仮出願60/957,668号、2007年12月21日に出願された61/008,965号及び2008年1月9日に出願された61/010,630号(これらの全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。)の優先権を主張する。

0002

発明の分野
本発明は、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンクシン9型(PCSK9)に結合する抗原結合タンパク質並びに該抗原結合タンパク質を使用及び作製する方法に関する。

背景技術

0003

プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型(PCSK9)は、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)タンパク質のレベルの制御に関与するセリンプロテアーゼである(Horton et al., 2007;Seidah and Prat, 2007)。インビトロ実験は、HepG2細胞へのPCSK9の添加は細胞表面LDLRのレベルを低下させることを示している(Benjannet et al., 2004;Lagace et al., 2006;Maxwell et al., 2005;Park et al., 2004)。マウスを用いた実験は、PCSK9タンパク質レベルを増加させることが肝臓中のLDLRタンパク質のレベルを減少させる(Benjannet et al., 2004; Lagace et al., 2006; Maxwell et al., 2005; Park et al., 2004)が、PCSK9ノックアウトマウスは肝臓中のLDLRの増加したレベルを有する(Rashid et al., 2005)ことを示した。さらに、血漿LDLの増加又は減少したレベルの何れかをもたらす様々なヒトPCSK9変異が同定されている (Kotowski et al., 2006;Zhao et al., 2006)。PCSK9は、LDLRタンパク質と直接相互作用し、LDLRとともに細胞内に取り込まれ、エンドソーム経路全体を通じてLDLRと同時に免疫蛍光を発する(Lagace et al., 2006)ことが示されている。PCSK9によるLDLRの分解は観察されておらず、細胞外LDLRタンパク質レベルを低下させる機序は不明である。

0004

PCSK9は、セリンプロテアーゼのスブチリシン(S8)ファミリー中のプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである(Seidah et al., 2003)。ヒトは、S8AとS8Bサブファミリーに分けることができる9つのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼを有する(Rawlings et al, 2006)。フューリン、PC1/PC3、PC2、PACE4、PC4、PC5/PC6及びPC7/PC8/LPC/SPC7は、サブファミリーS8Bに分類される。マウスフューリン及びPC1由来の異なるドメイン結晶及びNMR構造は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメイン並びに触媒ドメインのすぐC末端Pドメインを明らかにする(Henoch et al, 2003;Tangrea et al, 2002)。このサブファミリー内のアミノ酸配列類似性に基づいて、7つのメンバー全てが類似の構造を有すると予想される(Henrich et al., 2005)。SKI−1/S1P及びPCSK9は、サブファミリーS8Aに分類される。これらのタンパク質との配列比較は、スブチリシン様プロドメイン及び触媒ドメインの存在も示唆する(Sakai et al., 1998; Seidah et al., 2003; Seidah et al, 1999)。これらのタンパク質では、触媒ドメインに対してC末端のアミノ酸配列は、より可変的であり、Pドメインの存在を示唆しない。

0005

プロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼはチモーゲンとして発現され、多段階工程を経て成熟する。この過程におけるプロドメインの機能は2つある。まず、プロドメインはシャペロンとして作用し、触媒ドメインの適切な折り畳みのために必要とされる(Ikemura et al, 1987)。触媒ドメインが折り畳まれたら、プロドメインと触媒ドメインの間で自己触媒が起こる。この最初の切断反応の後に、プロドメインは触媒ドメインに結合された状態を保ち、次いで、触媒活性阻害剤として作用する(Fu et al, 2000)。状態が正しければ、プロドメイン内の部位において、成熟は、第二の自己触媒現象とともに進行する(Anderson et al, 1997)。この第二の切断現象が起こった後に、プロドメインと触媒ドメインは解離し、活性プロテアーゼを与える。

0006

PCSK9チモーゲンの自己触媒がGln152とSer153の間で起こり(VFAQ/SIP)(Naureckiene et al, 2003)、細胞からのその分泌のために必要とされることが示された(Seidah et al,2003)。PCSK9のプロドメイン内の部位での第二の自己触媒現象は、観察されなかった。精製されたPCSK9は、非還元SDS−PAGEによって分離され得る2つの種(17Kdにプロドメイン及び65Kdに触媒+C末端ドメイン)から構成される。PCSK9は、その阻害的プロドメインなしに単離されておらず、PCSK9の触媒活性の測定は変動する(Naureckiene et al, 2003; Seidah et al, 2003)。

先行技術

0007

Horton et al., 2007
Seidah and Prat, 2007
Benjannet et al., 2004
Lagace et al., 2006
Maxwell et al., 2005
Park et al., 2004
Rashid et al., 2005
Kotowski et al., 2006
Zhao et al., 2006
Seidah et al., 2003
Rawlings et al, 2006
Henoch et al, 2003
Tangrea et al, 2002
Henrich et al., 2005
Sakai et al.,1998
Seidah et al, 1999
Ikemura et al, 1987
Fu et al,2000
Anderson et al, 1997
Naureckiene et al, 2003

0008

幾つかの実施形態において、本発明は、PCSK9に対する抗原結合タンパク質を含む。

0009

幾つかの態様において、本発明は、A)(i)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列中のCDRH1から得られるCDRH1;(ii)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列中のCDRH2から得られるCDRH2;(iii)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列中のCDRH3から得られるCDRH3;並びに、(iv)4以下のアミノ酸の1つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換欠失若しくは挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRHからなる群から選択される1つ若しくはそれ以上の重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)(i)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列中のCDRL1から得られるCDRL1;(ii)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列中のCDRL2から得られるCDRL2;(iii)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列中のCDRL3から得られるCDRL3;並びに、(iv)4以下のアミノ酸の1つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRLからなる群から選択される1つ若しくはそれ以上の軽鎖相補性決定領域(CDRL);又はC)A)の1つ若しくはそれ以上の重鎖CDRH及びB)の1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDRLを含む、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、A)の少なくとも1つのCDRH及びB)の少なくとも1つのCDRLを含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、A)の少なくとも2つのCDRH及びB)の少なくとも2つのCDRLを含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、前記CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRL2及びCDRL3を含む。幾つかの実施形態において、A)のCDRHは、(i)配列番号67、78、89及び49からなる群から選択される配列中のCDRH1から選択されるCDRH1アミノ酸配列;(ii)配列番号67、79、89及び49からなる群から選択される配列中のCDRH2から選択されるCDRH2アミノ酸配列;(iii)配列番号67、79、89及び49からなる群から選択される配列中のCDRH3から選択されるCDRH3アミノ酸配列;並びに(iv)2以下のアミノ酸の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRHからなる群の少なくとも1つから選択される。さらに、B)のCDRLは、(i)配列番号12、35、32及び23からなる群から選択される配列中のCDRL1から選択されるCDRL1アミノ酸配列;(ii)配列番号12、35、32及び23からなる群から選択される配列中のCDRL2から選択されるCDRL2アミノ酸配列;(iii)配列番号12、35、32及び23からなる群から選択される配列中のCDRL3から選択されるCDRL3アミノ酸配列;並びに(iv)2以下のアミノ酸の1つ又はそれ以上のアミノ酸置換、欠失又は挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRL又はC)A)の1つ若しくはそれ以上の重鎖CDRH及びBの1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDRLからなる群の少なくとも1つから選択される。幾つかの実施形態において、A)のCDRHは、(i)配列番号67中のCDRH1アミノ酸配列のCDRH1アミノ酸配列;(ii)配列番号67中のCDRH2アミノ酸配列のCDRH2アミノ酸配列;(iii)配列番号67中のCDRH3アミノ酸配列のCDRH3アミノ酸配列;並びに、(iv)2以下のアミノ酸の1つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRHからなる群の少なくとも1つから選択され、B)の前記CDRLは、(i)配列番号12中のCDRL1アミノ酸配列のCDRL1アミノ酸配列;(ii)配列番号12中のCDRL2アミノ酸配列のCDRL2アミノ酸配列;(iii)配列番号12中のCDRL3アミノ酸配列のCDRL3アミノ酸配列;並びに、(iv)2以下のアミノ酸の1つ若しくはそれ以上のアミノ酸置換、欠失若しくは挿入を含有する(i)、(ii)及び(iii)のCDRL又はC)A)の1つ若しくはそれ以上の重鎖CDRH及びB)の1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDRLからなる群の少なくとも1つから選択される。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、A)配列番号67中のCDRH1配列のCDRH1、配列番号67中のCDRH2配列のCDRH2及び配列番号67中のCDRH3配列のCDRH3、並びにB)配列番号12中のCDRL1配列のCDRL1、配列番号12中のCDRL2配列のCDRL2及び配列番号12中のCDRL3配列のCDRL3を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する重鎖可変領域(VH)、並びに/又は配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有する軽鎖可変領域(VL)を含む。幾つかの実施形態において、VHは、配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有し、並びに/又はVLは、配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有する。幾つかの実施形態において、VHは、配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択され、並びに/又はVLは、配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される。

0010

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されているABPの何れかによって結合されるエピトープに特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。

0011

幾つかの態様において、本発明は、A)(i)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列の1つ中のCDRH1と少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH1;(ii)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列の1つ中のCDRH2と少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH2;並びに(iii)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列の1つ中のCDRH3と少なくとも80%の配列同一性を有するCDRH3からなる群の少なくとも1つから選択される1つ又はそれ以上の重鎖CDR(CDRH);B)(i)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列の1つ中のCDRL1と少なくとも80%の配列同一性を有するCDRL1;(ii)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列の1つ中のCDRL2と少なくとも80%の配列同一性を有するCDRL2;並びに(iii)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列の1つ中のCDRL3と少なくとも80%の配列同一性を有するCDRL3からなる群の少なくとも1つから選択される1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDR(CDRL);又はC)A)の1つ若しくはそれ以上の重鎖CDRH及びB)の1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDRLを含む、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、A)(i)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列の1つ中のCDRH1と少なくとも90%の配列同一性を有するCDRH1;(ii)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列の1つ中のCDRH2と少なくとも90%の配列同一性を有するCDRH2;並びに(iii)配列番号74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81及び60からなる群から選択される配列の1つ中のCDRH3と少なくとも90%の配列同一性を有するCDRH3からなる群の少なくとも1つから選択される1つ若しくはそれ以上のCDRH、B)(i)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列の1つ中のCDRL1と少なくとも90%の配列同一性を有するCDRL1;(ii)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列の1つ中のCDRL2と少なくとも90%の配列同一性を有するCDRL2;並びに(iii)配列番号5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44及び46からなる群から選択される配列の1つ中のCDRL3と少なくとも90%の配列同一性を有するCDRL3からなる群の少なくとも1つから選択される1つ若しくはそれ以上のCDRL;又はC)A)の1つ若しくはそれ以上の重鎖CDRH及びB)の1つ若しくはそれ以上の軽鎖CDRLを含む。

0012

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、A)(i)配列番号67、79及び49からなる群から選択される配列内のCDRH3から選択されるCDRH3、(ii)(i)のCDRH3から得られるアミノ酸配列において、2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換が異なるCDRH3、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号404)(X1はD、A、R及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2はY、I、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3はD、A、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4はF、A、L及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5はW、L、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X6はS、Y、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X7はA、Y、R及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X8はY、P及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X9はY、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X10はD、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X11はA、M及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X12はF、D及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X13はD、V及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X14はV及びアミノ酸なしからなる群から選択される。)からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)(i)配列番号12、35及び23からなる群から選択される配列内のCDRL3から選択されるCDRL3;(ii)(i)のCDRL3から得られるアミノ酸配列において、2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換が異なるCDRL3、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(配列番号405)(X1はQ及びGからなる群から選択され、X2はS、T、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3はY、アミノ酸なし及びWからなる群から選択され、X4はD及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5はS及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X6はS及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X7はL、T及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X8はアミノ酸なし、A及びSからなる群から選択され、X9はアミノ酸なし、G、A及びVからなる群から選択され、X10はアミノ酸なし、S、Y及びVからなる群から選択され、X11はアミノ酸なし及びVからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRL3アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。

0013

幾つかの態様において、本発明は、5、7、9、10、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、26、28、30、31、32、33、35、36、37、38、39、40、42、44、46及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖を含む単離された抗原結合タンパク質を含む。

0014

幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質の少なくとも1つによって結合されるエピトープに特異的に結合する。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、74、85、71、72、67、87、58、52、51、53、48、54、55、56、49、57、50、91、64、62、89、65、79、80、76、77、78、83、69、81、60及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖をさらに含む。幾つかの実施形態において、ABPのアミノ酸配列は、配列番号12、35、23及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、ABPの重鎖は、配列番号67のCDRH3、配列番号67のCDRH2及び配列番号67のCDRH1を含み、並びに前記軽鎖は配列番号12のCDRL3、配列番号12のCDRL2及び配列番号12のCDRL1を含む。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体ポリクローナル抗体組換え抗体ヒト抗体ヒト化抗体キメラ抗体多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、ヒト抗体である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4型である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、IgG4又はIgG2型である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、標識基に結合される。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、PCSK9への結合に関して、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質と競合する。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異的抗体又はこれらの抗体断片である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、Fab断片、Fab’断片、F(ab’)2断片、Fv断片、ダイアボディ又は一本鎖抗体分子である。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、標識基に結合される。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、LDLRへのPCSK9の結合を低下させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在するLDLの量を減少させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在する血清コレステロールの量を減少させる。幾つかの実施形態において、単離された抗原結合タンパク質は、対象に投与されたときに、対象中に存在するLDLRの量を増加させる。

0015

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている核酸分子を含むベクターを含む。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書中に記載されている核酸分子を含む宿主細胞を含む。

0016

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9への結合に関して、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質と競合する単離された抗原結合タンパク質を含む。

0017

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質をコードする核酸分子を含む。

0018

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも1つの抗原結合タンパク質を含む医薬組成物を含む。

0019

幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている患者に、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、患者中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。

0020

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも1つの抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中のLDLRへのPCSK9の結合を阻害する方法を含む。

0021

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9に選択的に結合する抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は100pMより小さなKDでPCSK9に結合する。

0022

幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている対象に、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。

0023

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。

0024

幾つかの態様において、本発明は、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。

0025

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中のLDLRタンパク質を増加させる方法を含む。

0026

幾つかの態様において、本発明は、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中のLDLRタンパク質レベルを増加させる方法を含む。

0027

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に開示されているABP及びLDLRタンパク質レベルの利用可能性を上昇させる薬剤を含む医薬組成物を含む。幾つかの実施形態において、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチンセリバスタチン、フルバスタチンロバスタチンメバスタチンピタバスタチンプラバスタチンロスバスタチンシンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。

0028

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質を分泌する宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を調製する工程を含む、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質を作製する方法を含む。

0029

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも1つの抗原結合タンパク質及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物を含む。幾つかの実施形態において、医薬組成物は、さらなる活性因子をさらに含む。幾つかの実施形態において、前記さらなる活性因子は、放射性同位体放射性核種毒素又は治療基及び化学療法基からなる群から選択される。

0030

幾つかの態様において、本発明は、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状を治療又は予防する方法を含む。この方法は、患者中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状の治療又は予防を必要としている患者へ、本明細書中に開示されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む。幾つかの実施形態において、症状は、高コレステロール血症である。

0031

幾つかの態様において、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも1つの抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、患者中のLDLRへのPCSK9の結合を阻害する方法を含む。

0032

幾つかの態様において、本発明は、100pMより小さいKdでPCSK9に結合する抗原結合タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、10pMより小さいKdで結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、5pMより小さいKaで結合する。

0033

幾つかの態様において、本発明は、上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状の治療又は予防を必要としている対象に、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を投与することを含む、対象中の上昇した血清コレステロールレベルを伴う症状を治療又は予防する方法を含む。幾つかの実施形態において、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。

0034

幾つかの態様において、本発明は、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。この方法は、本明細書中に記載されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む。

0035

幾つかの態様において、本発明は、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することを含む、対象中の血清コレステロールレベルを低下させる方法を含む。幾つかの実施形態において、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。

0036

幾つかの態様において、本発明は、本明細書中に記載されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することによって、対象中のLDLRタンパク質レベルを増加させる方法を含む。

0037

幾つかの態様において、本発明は、LDLRタンパク質の利用可能性を上昇させる薬剤と同時に又は順次に、本明細書中に記載されている少なくとも1つの単離された抗原結合タンパク質の有効量を対象に投与することによって、対象中のLDLRタンパク質レベルを増加させる方法を含む。幾つかの実施形態において、LDLRタンパク質レベルの利用可能性を上昇させる薬剤はスタチンを含む。幾つかの実施形態において、スタチンは、アトロバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、シンバスタチン及びこれらの幾つかの組み合わせからなる群から選択される。

0038

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9に結合し、LDLRに対するPCSK9の低密度リポタンパク質受容体(LDLR)低下効果を低減させる中和抗体を含む。幾つかの実施形態において、抗体はPCSK9に特異的に結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号3の残基31から447内のエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗体は、配列番号3と少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を有するPCSK9に結合する。

0039

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9に結合する中和抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は配列番号3の残基31から447内の位置においてPCSK9に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質がPCSK9に結合されている場合には、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから8オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375又はC378。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから8オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、I154、P155、R194、D238、A239、1369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376又はQ382。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380又はS381。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも2つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380又はS381。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも4つから5オングストローム又はそれ以下である。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380又はS381。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから8オングストローム又はそれ以下に位置している。W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386又はQ387。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383又はG384。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも2つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383又はG384。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも4つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383又はG384。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから8オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375又はC378。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377又はF379。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも2つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377又はF379。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも4つから5オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377又はF379。

0040

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9に結合する中和抗体を含み、該抗体はPCSK9に結合し、PCSK9がLDLRに結合する可能性を低下させる。

0041

幾つかの実施形態において、PCSK9に結合する抗体又は抗原結合分子が想定される。抗体は、配列番号3の残基31から447内の位置において、PCSK9に結合する。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合分子は、PCSK9に結合されたときに、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから8オングストローム又はそれ以下に位置している。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375又はC378。

0042

幾つかの実施形態において、PCSK9の残基の8オングストローム内で、PCSK9への抗体の結合を遮断する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、PCSK9の残基は、以下のPCSK9残基の少なくとも1つから選択される。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376、Q382、W72、F150、A151、Q152、T214、R215、F216、H217、A220、S221、K222、S225、H226、C255、Q256、G257、K258、N317、F318、T347、L348、G349、T350、L351、E366、D367、D374、V380、S381、Q382、S383、G384、K69、D70、P71、S148、V149、D186、T187、E211、D212、G213、R218、Q219、C223、D224、G227、H229、L253、N254、G259、P288、A290、G291、G316、R319、Y325、V346、G352、T353、G365、I368、I369、S372、S373、C378、F379、T385、S386、Q387、S153、S188、I189、Q190、S191、D192、R194、E197、G198、R199、V200、D224、R237、D238、K243、S373、D374、S376、T377、F379、I154、T187、H193、E195、I196、M201、V202、C223、T228、S235、G236、A239、G244、M247、I369、S372、C375又はC378。

0043

幾つかの実施形態において、LDLRがPCSK9に結合する位置と重複する位置において、PCSK9に結合する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、LDLRがPCSK9に結合する位置には、S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380及びS381からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が含まれる。

0044

幾つかの実施形態において、PCSK9に結合する単離された抗体又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合分子は、PCSK9上の以下の残基の少なくとも1つの8オングストローム以内で、EGFaがPCSK9に結合する可能性を低下させる。S153、I154、P155、R194、D238、A239、I369、S372、D374、C375、T377、C378、F379、V380、S381、W156、N157、L158、E159、H193、E195、H229、R237、G240、K243、D367、I368、G370、A371、S373、S376又はQ382。

0045

幾つかの実施形態において、EGFaが結合し、Ab21B12が結合し、及び/又は31H4が結合する表面と重複するPCSK9の表面に結合する抗体、抗原結合タンパク質又は抗原結合分子が提供される。幾つかの実施形態において、図面に図示されているものと同様の様式でPCSK9に結合する抗体、抗原結合タンパク質又は抗原結合分子が提供される。

0046

幾つかの実施形態において、上記実施形態は、中和抗体又は抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、LDLR又はその断片(EGFaなど)でない。

0047

幾つかの態様において、本発明は、単離された中和抗体を含み、該抗体がPCSK9に結合されたときに、抗体は、PCKS9の以下の残基の少なくとも1つから8オングストローム又はそれ以下に位置する。配列番号3のT468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592、E593、S465、G466、P467、A473、I474、R476、G497、E498、M500、G504、K506、L507、V508、A511、N513、A514、G516、V536、T538、A539、A544、T548、D570、L571、H591、A594、S595及びH597。幾つかの実施形態において、抗体は、PCSK9の以下の残基の少なくとも1つから5オングストローム又はそれ以下に位置する。配列番号3のT468、R469、M470、A471、T472、R496、R499、E501、A502、Q503、R510、H512、F515、P540、P541、A542、E543、H565、W566、E567、V568、E569、R592及びE593。

0048

幾つかの態様において、本発明は、単離された抗原結合タンパク質を含む。抗原結合タンパク質は、A)配列番号89中のCDRH1配列のCDRH1、配列番号89中のCDRH2配列のCDRH2及び配列番号89中のCDRH3配列のCDRH3、並びにB)配列番号32中のCDRL1配列のCDRL1、配列番号32中のCDRL2配列のCDRL2及び配列番号32中のCDRL3配列のCDRL3を含む。

0049

幾つかの態様において、本発明は、配列番号1のPCSK9タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記単離された抗原結合タンパク質とバリアントPCSK9タンパク質との間の結合は、単離された抗原結合タンパク質と配列番号1及び/又は配列番号303のPCSK9タンパク質との間の結合の50%未満である。幾つかの実施形態において、バリアントPCSK9タンパク質は、配列番号1に示されている207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及び554からなる又はこれらを含む群から選択される位置に、残基の少なくとも1つの変異を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも1つの変異は、R207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及びE582Rを含む又はこれらからなる群から選択される。幾つかの実施形態において、少なくとも1つの変異は、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及びQ554Rからなる群から選択される。

0050

幾つかの態様において、本発明は、配列番号303のPCSK−9タンパク質に第一の様式で結合し、及びPCSK9のバリアントに第二の様式で結合する抗原結合タンパク質を含む。PCSK9バリアントは、配列番号303及び/又は配列番号1の207、208、185、181、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及び554を含む又はこれらからなる群から選択される位置に、残基の少なくとも1つの点変異を有する。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のEC50、第一のBmax又は第一のEC50と第一のBmaxを含む。幾つかの実施形態において、第二の様式は第二のEC50、第二のBmax又は第二のEC50と第二のBmaxを含む。第一の様式に対する値は、第二の様式に対する値とは異なる。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のEC50を含み、第二の様式は第二のEC50を含み、及び点変異はR207E、D208R、E181R、R185E、R439E、E513R、V538R、E539R、T132R、S351R、A390R、A413R及びE582Rからなる又はこれらを含む群から選択される。幾つかの実施形態において、第一のEC50は第二のEC50と少なくとも20%異なる。幾つかの実施形態において、第一のEC50は第二のEC50と少なくとも50%異なる。幾つかの実施形態において、第二のEC50は第一のEC50より大きな数値である。幾つかの実施形態において、第一のEC50は多重ビーズ結合アッセイによって測定される。幾つかの実施形態において、第二のEC50は1μmより大きい。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、中和抗原結合タンパク質は競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、中和抗原結合タンパク質は非競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、第一の様式は第一のBmaxを含み、及び第二の様式は第一のBmaxとは異なる第二のBmaxを含む。PCSK9バリアントは、D162R、R164E、E167R、S123R、E129R、A311R、D313R、D337R、R519E、H521R及びQ554Rからなる又はこれらを含む群から選択される少なくとも1つの点変異を有する。幾つかの実施形態において、第二のBmaxは第一のBmaxの約10%である。幾つかの実施形態において、第一のBmaxは第二のBmaxと少なくとも20%異なる。幾つかの実施形態において、第一のBmaxは第二のBmaxと少なくとも50%異なる。

0051

幾つかの態様において、本発明は、配列番号3のPCSK9タンパク質に結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、抗原結合タンパク質のエピトープは、配列番号1の以下のアミノ酸の少なくとも1つを含む。207、208、181、185、439、513、538、539、132、351、390、413、582、162、164、167、123、129、311、313、337、519、521及び554。

0052

幾つかの態様において、本発明は、配列番号1のアミノ酸配列を含むPCSK9タンパク質に結合する単離された中和抗原結合タンパク質を含み、前記中和抗原結合タンパク質はLDLRに対するPCSK9のLDLR低下効果を減少させる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はLDLR非競合的中和抗原結合タンパク質である。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はLDLR競合的中和抗原結合タンパク質である。

0053

幾つかの態様において、本発明は単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、A)配列番号49中のCDRH1配列のCDRH1、配列番号49中のCDRH2配列のCDRH2及び配列番号49中のCDRH3配列のCDRH3、並びにB)配列番号23中のCDRL1配列のCDRL1、配列番号23中のCDRL2配列のCDRL2及び配列番号23中のCDRL3配列のCDRL3を含む。

0054

幾つかの態様において、本発明は、結晶化されたPCSK9タンパク質及びPCSK9に結合する抗原結合タンパク質を含む組成物を含む。組成物は、約2.2オングストローム又はそれ以上の解像度になるように、PCSK9タンパク質の三次元構造を決定できるような結晶化されたPCSK9タンパク質を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、抗体又はその断片である。

0055

幾つかの態様において、本発明は、結晶化されたPCSK9タンパク質及びLDLRタンパク質の少なくともEGFa部分を含み、LDLRタンパク質のEGFa部分はPCSK9タンパク質によって結合され、前記結晶化されたPCSK9タンパク質は、約2.2オングストローム又はそれ以上の解像度になるように、PCSK9タンパク質の三次元構造を決定できるような結晶化されたPCSK9タンパク質である。幾つかの実施形態において、分子モデルは、コンピュータ読み取り可能な媒体上にある。

0056

幾つかの態様において、本発明は、血清コレステロールを低下させるための医薬の調製における、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の使用を含む。

0057

幾つかの態様において、本発明は、対象中の上昇した血清コレステロールレベルと関連する症状を治療又は予防するための医薬の調製における、本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の使用を含む。

0058

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、A)(i)配列番号67、79、89及び49からなる群から選択される配列内のCDRH1から選択されるCDRH1、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRH1とアミノ酸配列が異なるCDRH1、及び(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(配列番号406)(X1はGからなる群から選択され、X2はY、F及びGからなる群から選択され、X3はT及びSからなる群から選択され、X4はL及びFからなる群から選択され、X5はT、S及びNからなる群から選択され、X6はS及びAからなる群から選択され、X7はY及びFからなる群から選択され、X8はG、S及びYからなる群から選択され、X9はI、M及びWからなる群から選択され、X10はS、N及びHからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRH1アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)(i)配列番号12、32、35及び23からなる群から選択される配列内のCDRL1から選択されるCDRL1、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRL3とアミノ酸配列が異なるCDRL1、及び(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号407)(X1はT及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2はG及びSからなる群から選択され、X3はS、T及びGからなる群から選択され、X4はSからなる群から選択され、X5はSからなる群から選択され、X6はN、D及びSからなる群から選択され、X7はI、V及びNからなる群から選択され、X8はG及びIからなる群から選択され、X9はA及びGからなる群から選択され、X10はG、Y、S及びNからなる群から選択され、X11はY及びNからなる群から選択され、X12はD、S、T及びFからなる群から選択され、X13はVからなる群から選択され、X14はS、N及びHからなる群から選択される。)からなる群の少なくとも1つから選択されるCDRL1アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。当業者は、単一のABP又は抗体が上記選択肢の1つ又はそれ以上を充足することができ、この実施形態に対して記載された発明になお属することを理解する。

0059

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、該抗原結合タンパク質は、A)以下のもの:(i)配列番号67、79、89及び49からなる群から選択される配列内のCDRH2から選択されるCDRH2、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRH2とアミノ酸配列が異なるCDRH2、及び(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号408)(X1はW、S、L及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2はV、I及びEからなる群から選択され、X3はS、W及びIからなる群から選択され、X4はF、S及びNからなる群から選択され、X5はY、S、D及びHからなる群から選択され、X6はN、S及びGからなる群から選択され、X7はS及びGからなる群から選択され、X8はN、Y、D及びRからなる群から選択され、X9はT、I及びEからなる群から選択され、X10はN、S、Y及びDからなる群から選択され、X11はYからなる群から選択され、X12はA及びNからなる群から選択され、X13はQ、D及びPからなる群から選択され、X14はK及びSからなる群から選択され、X15はL及びVからなる群から選択され、X16はQ及びKからなる群から選択され、X17はG及びSからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRH2アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)以下のもの:(i)配列番号12、32、35及び23からなる群から選択される配列内のCDRL3から選択されるCDRL2、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRL3とアミノ酸配列が異なるCDRL2、及び(iii)X1X2X3X4X5X6X7(配列番号409)(X1はG、E、S及びDからなる群から選択され、X2はN、V及びYからなる群から選択され、X3はS及びNからなる群から選択され、X4はN、Q及びKからなる群から選択され、X5はRからなる群から選択され、X6はPからなる群から選択され、X7はSからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRL2アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。

0060

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、A)以下のもの:(i)配列番号67、79、89及び49からなる群から選択される配列内のCDRH3から選択されるCDRH3、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRH3とアミノ酸配列が異なるCDRH3、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号410)(X1はD及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2はY、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3はD、I及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X4はF、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X5はW、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X6はS、L及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X7はA、Y、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X8はY、Q及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X9はG、Y及びLからなる群から選択され、X10はY、D及びVからなる群から選択され、X11はG、A及びPからなる群から選択され、X12はM及びFからなる群から選択され、X13はDからなる群から選択され、X14はV及びYからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRH3アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)以下のもの:(i)配列番号12、32、35及び23からなる群から選択される配列内のCDRL3から選択されるCDRL3;(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRL3とアミノ酸配列が異なるCDRL3、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11(配列番号411)(X1はQ、A、G及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2はS、V、T及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X3はY、N及びWからなる群から選択され、X4はS及びDからなる群から選択され、X5はS、Y及びDからなる群から選択され、X6はS及びTからなる群から選択され、X7はL及びSからなる群から選択され、X8はS、T及びNからなる群から選択され、X9はG、S及びAからなる群から選択され、X10は、S、M、W及びYからなる群から選択され、並びにX11はVからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRL3アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。幾つかの実施形態において、上記アミノ酸の何れもが、保存的アミノ酸置換によって置換され得る。

0061

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、A)(i)配列番号47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57及び58からなる群から選択される配列内のCDRH1から選択されるCDRH1、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、(i)のCDRH1とアミノ酸配列が異なるCDRH1、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10(配列番号412)(X1はG、P及びAからなる群から選択され、X2はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X3はT、P、S及びA、C、V、L及びIからなる群から選択され、X4はL、F、I、V、M、A及びYからなる群から選択され、X5はT、P、S及びAからなる群から選択され、X6はS、T、A及びCからなる群から選択され、X7はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X8はG、P及びAからなる群から選択され、X9はI、L、V、M、A及びFからなる群から選択され、X10はS、T、A及びCからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRH1アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)(i)配列番号14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24からなる群から選択される配列内のCDRL1から選択されるCDRL1;(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、(i)のCDRL3とアミノ酸配列が異なるCDRL1、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14(配列番号413)(X1はT及びSからなる群から選択され、X2はG、P及びAからなる群から選択され、X3はT及びSからなる群から選択され、X4はS、N、T、A、C及びQからなる群から選択され、X5はS、T、A及びCからなる群から選択され、X6はD及びEからなる群から選択され、X7はV、I、M、L、F及びAからなる群から選択され、X8はG、P及びAからなる群から選択され、X9はG、A、R、P、V、L、K、K、Q及びNからなる群から選択され、X10はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X11はN及びQからなる群から選択され、X12はY、S、W、F、T、A及びCからなる群から選択され、X13はV、I、M、L、F及びAからなる群から選択され、X14はS、T、A及びCからなる群から選択される。)からなる群の少なくとも1つから選択されるCDRL1アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。

0062

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、A)(i)配列番号47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57及び58からなる群から選択される配列内のCDRH2から選択されるCDRH2、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRH2とアミノ酸配列が異なるCDRH2、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17(配列番号414)(X1はW、Y及びFからなる群から選択され、X2はV、I、M、L、F及びAからなる群から選択され、X3はS、T、A及びCからなる群から選択され、X4はA、F、V、L、I、Y及びMからなる群から選択され、X5はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X6はN及びQからなる群から選択され、X7はG、P及びAからなる群から選択され、X8はN及びQからなる群から選択され、X9はT及びSからなる群から選択され、X10はN及びQからなる群から選択され、X11はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X12はA、V、L及びIからなる群から選択され、X13はQ、E、N及びDからなる群から選択され、X14はK、R、Q及びNからなる群から選択され、X15はL、F、V、I、M、A及びYからなる群から選択され、X16はQ及びNからなる群から選択され、X17はG、P及びAからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRH2アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)(i)配列番号14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24からなる群から選択される配列内のCDRL3から選択されるCDRL2;(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRL3とアミノ酸配列が異なるCDRL2、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7(配列番号415)(X1はE及びDからなる群から選択され、X2はV、I、M、L、F及びAからなる群から選択され、X3はS、T、A及びCからなる群から選択され、X4はN及びQからなる群から選択され、X5はR、K、Q及びNからなる群から選択され、X6はP及びAからなる群から選択され、X7はS、T、A及びCからなる群から選択される。)からなる群の少なくとも1つから選択されるCDRL2アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。

0063

幾つかの態様において、本発明は、PCSK9を結合する単離された抗原結合タンパク質を含み、前記抗原結合タンパク質は、A)(i)配列番号47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57及び58からなる群から選択される配列内のCDRH3から選択されるCDRH3、(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換だけ、(i)のCDRH3とアミノ酸配列が異なるCDRH3、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6(配列番号416)(X1はG、P、A及びアミノ酸なしからなる群から選択され、X2はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X3はG、V、P、A、I、M、L及びFからなる群から選択され、X4はM、L、F及びIからなる群から選択され、X5はD及びEからなる群から選択され、X6はV、I、M、L、F及びAからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRH3アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される重鎖相補性決定領域(CDRH)、B)(i)配列番号14、15、16、17、18、19、20、21、22、23及び24からなる群から選択される配列内のCDRL3から選択されるCDRL3;(ii)2以下のアミノ酸のアミノ酸付加、欠失又は置換により、(i)のCDRL3とアミノ酸配列が異なるCDRL3、並びに(iii)X1X2X3X4X5X6X7X8X9(配列番号417)(X1はS、N、T、A、C及びQからなる群から選択され、X2はS、T、A及びCからなる群から選択され、X3はY、W、F、T及びSからなる群から選択され、X4はT及びSからなる群から選択され、X5はS、T、A及びCからなる群から選択され、X6はS、T、A及びCからなる群から選択され、X7はN、S、Q、T、A及びCからなる群から選択され、X8はM、V、L、F、I及びAからなる群から選択され、X9はV、I、M、L、F及びAからなる群から選択される。)からなる群から選択されるCDRL3アミノ酸配列からなる群の少なくとも1つから選択される軽鎖相補性決定領域(CDRL)を含む。

図面の簡単な説明

0064

図1Aは、PCSK9の成熟形態のアミノ酸配列を図示しており、プロドメインに下線が付されている。
図1B1は、PCSK9のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列太字で記載されている。
図1B2は、PCSK9のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
図1B3は、PCSK9のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
図1B4は、PCSK9のアミノ酸及び核酸配列を図示しており、プロドメインには下線が付され、シグナル配列は太字で記載されている。
図2Aは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。
図2Bは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。
図2Cは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図2Cは、図2Aから始まる配列の続きである。
図2Dは、様々な抗原結合タンパク質の様々な軽鎖の配列比較表である。図2Dは、図2Bから始まる配列の続きである。
図3Aは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。
図3Bは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。
図3Cは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図3Cは、図3Aから始まる配列の続きである。
図3Dは、様々な抗原結合タンパク質の様々な重鎖の配列比較表である。図3Dは、図3Bから始まる配列の続きである。
図3Eは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Fは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Gは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Hは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Iは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Jは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Kは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Lは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Mは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Nは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Oは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Pは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Qは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Rは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Sは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Tは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Uは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Vは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Wは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Xは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Yは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3Zは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3AAは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3BBは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3CCは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3DDは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3EEは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3FFは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3GGは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3HHは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3IIは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3JJは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3KKは、様々な定常ドメインに対するアミノ酸配列を図示する。
図3LLは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3MMは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3NNは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3OOは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3PPは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3QQは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3RRは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3SSは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3TTは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3UUは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3VVは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3WWは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3XXは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3YYは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3ZZは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3AAAは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3BBBは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の可変ドメインに対するアミノ酸及び核酸配列を図示する。
図3CCCは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3DDDは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3EEEは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3FFFは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3GGGは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3HHHは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3IIIは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図3JJJは、抗原結合タンパク質の幾つかの実施形態の様々な重鎖及び軽鎖の配列比較表である。
図4Aは、ヒトPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
図4Bは、ヒトPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
図4Cは、カニクイザルPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
図4Dは、カニクイザルPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
図4Eは、マウスPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。図4Fは、マウスPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
図4Fは、マウスPCSK9への抗原結合タンパク質の結合曲線である。
図5Aは、PCSK9及び様々な抗原結合タンパク質を用いたSDSPAGE実験の結果を図示しており、タンパク質の相対的純度及び濃度を示している。
図5Bは、21B12に対するbiacore溶液平衡アッセイから得られたグラフを図示している。
図5Cは、21B12に対するbiacore溶液平衡アッセイから得られたグラフを図示している。
図5Dは、biacore捕捉アッセイから得られた速度論のグラフを図示している。
図5Eは、3つのABPに対するビニングの結果を図示する棒グラフを図示している。
図6Aは、インビトロPCSK9:LDLR結合アッセイにおける、PCSK9への抗原結合タンパク質31H4IgG2の阻害曲線である。
図6Bは、インビトロPCSK9:LDLR結合アッセイにおける、PCSK9への抗原結合タンパク質31H4IgG4の阻害曲線である。
図6Cは、インビトロPCSK9:LDLR結合アッセイにおける、PCSK9への抗原結合タンパク質21B12IgG2の阻害曲線である。
図6Dは、インビトロPCSK9:LDLR結合アッセイにおける、PCSK9への抗原結合タンパク質21B12IgG4の阻害曲線である。
図7Aは、PCSK9のLDL取り込み遮断効果を低下させるABPの効果を示す細胞LDL取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質31H4IgG2の阻害曲線である。
図7Bは、PCSK9のLDL取り込み遮断効果を低下させるABPの効果を示す細胞LDL取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質31H4IgG4の阻害曲線である。
図7Cは、PCSK9のLDL取り込み遮断効果を低下させるABPの効果を示す細胞LDL取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質21B12IgG2の阻害曲線である。
図7Dは、PCSK9のLDL取り込み遮断効果を低下させるABPの効果を示す細胞LDL取り込みアッセイにおける抗原結合タンパク質21B12IgG4の阻害曲線である。
図8Aは、マウス中でのABP31H4の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである(IgG対照処理マウスと比較した変化)(*p<0.01)。
図8Bは、マウス中でのABP31H4の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである(時間=ゼロ時と比較した変化)(*p<0.05)。
図8Cは、C57B1/6マウス中でのHDLコレステロールレベルに対するABP31H4の効果を図示するグラフである(*p<0.01)。
図8Dは、C57B1/6マウス中でのHDLコレステロールレベルに対するABP31H4の効果を図示するグラフである(#p<0.05)。
図9は、様々な時点後に存在する肝臓LDLRタンパク質の量を増大させるABP31H4の能力ウェスタンブロット分析を図示している。
図10Aは、野生型マウス中で、総血清コレステロールを低下させる抗原結合タンパク質31H4の能力を図示するグラフである。
図10Bは、野生型マウス中で、HDLを低下させる抗原結合タンパク質31H4の能力を図示するグラフである。
図10Cは、様々な抗原結合タンパク質31H4及び16F12の血清コレステロール低下能力を図示するグラフである。
図11Aは、抗原結合タンパク質が血清コレステロールを低下させる期間及び能力を調べるための注射プロトコールを図示している。
図11Bは、図11Aのプロトコールの結果を図示するグラフである。
図12Aは、スタチンとABP21B12の組み合わせに応答した、HepG2細胞中のLDLRレベルを図示する。
図12Bは、スタチンとABP31H4の組み合わせに応答した、HepG2細胞中のLDLRレベルを図示する。
図12Cは、スタチンと(中和抗体である「25A7」とは異なり)非中和抗体であるABP25A7.1の組み合わせに応答した、HepG2細胞中のLDLRレベルを図示する。
図12Dは、スタチンとABP21B12の組み合わせに応答した、PCSK9を過剰発現するHepG2細胞中のLDLRレベルを図示する。
図12Eは、スタチンとABP31H4の組み合わせに応答した、PCSK9を過剰発現するHepG2細胞中のLDLRレベルを図示する。
図12Fは、スタチンと(中和抗体である「25A7」とは異なり)非中和抗体であるABP25A7.1の組み合わせに応答した、PCSK9を過剰発現するHepG2細胞中のLDLRレベルを図示する。
図13Aは、PCSK9に対する様々なABPの様々な軽鎖アミノ酸配列を図示する。点(.)は、アミノ酸が存在しないことを示す。
図13Bは、PCSK9に対する様々なABPに対する軽鎖分岐図を図示する。
図13Cは、PCSK9に対する様々なABPの様々な重鎖アミノ酸配列を図示する。点(.)は、アミノ酸が存在しないことを示す。
図13Dは、PCSK9に対する様々なABPに対する重鎖樹形図を図示する。
図13Eは、軽鎖と重鎖CDRの比較及びコンセンサスを与える群の表記を示す。
図13Fは、群1及び2に対するコンセンサス配列を図示する。
図13Gは、群3及び4に対するコンセンサス配列を図示する。
図13Hは、群1及び2に対するコンセンサス配列を図示する。点(.)は、同一の残基を示した。
図13Iは、群2に対するコンセンサス配列を図示する。点(.)は、同一の残基を示した。
図13Jは、群3及び4に対するコンセンサス配列を図示する。点(.)は、同一の残基を示した。
図14Aは、(10mg/kgでの)様々なABPのインビボでのLDL低下能を図示するグラフである。
図14Bは、(30mg/kgでの)様々なABPのインビボでのLDL低下能を図示するグラフである。
図15Aは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。
図15Bは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。図15Bは、図15Aから始まる配列の続きである。
図15Cは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。
図15Dは、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の様々な軽鎖の配列比較表である。図15Dは、図15Cから始まる配列の続きである。
図16Aは、Ab21B12がPCSK9のProCat又はVD部分に結合する能力を調べるために使用されるゲル図解である。
図16Bは、Ab31H4がPCSK9のProCat又はVD部分に結合する能力を調べるために使用されるゲルの図解である。
図17は、PCSK9及びLDLRのEGFa部分の構造の図解である。
図18Aは、PCSK9及び31H4Abの構造の図解である。
図18Bは、PCSK9及び31H4Abの構造の図解である。
図19Aは、PCSK9、31H4Ab及び21B12Abの構造の図解である。
図19Bは、PCSK9及び21B12Abの構造の図解である。
図20Aは、PCSK9に結合された抗体31H4及び21B12の構造と重ね合わせたPCSK9及びLDLR由来のEGFaの構造の図解である。
図20Bは、PCSK9及びLDLRの構造モデルの図解である。
図20Cは、別の方向から得られたPCSK9及びLDLRの構造モデルの図解である。
図20Dは、31H4及び21B12を含めた構造的表示とともに、PCSK9及びLDLRの構造モデルを図示したものである。
図20Eは、表記の軸周りに90°回転させた図20Dの構造モデルの図解である。
図20Fは、表記の軸周りに180°回転させた図20Dの構造モデルの図解である。
図21Aは、PCSK9及び31A4の構造の図解である。
図21Bは、PCSK9及び31A4の構造の図解である。図21Cは、PCSK9及び31A4の構造の図解である。
図21Cは、PCSK9及び31A4の構造の図解である。
図21Dは、完全長PCSK9及び31A4の構造モデルの図解である。
図22は、ヒトABP配列とイー・コリ(E.coli)中で産生され、結晶構造のために使用されたABP配列との間での様々な差を同定する一群のABP配列である。
図23は、様々なビニングの結果の表である。
図23Aは、様々なビニングの結果を図示する表の第一の部分である。
図23Bは、様々なビニングの結果を図示する表の第二の部分である。
図23Cは、様々なビニングの結果を図示する表の第三の部分である。
図23Dは、様々なビニングの結果を図示する表の第四の部分である。
図24Aは、非還元条件下でのウェスタンブロットの図示である。
図24Bは、還元条件下でのウェスタンブロットの図示である。
図25Aは、PCSK9の表面の被覆の図解である。
図25Bは、PCSK9の表面の被覆の図解である。
図25Cは、PCSK9の表面の被覆の図解である。
図25Dは、PCSK9の表面の被覆の図解である。
図25Eは、PCSK9の表面の被覆の図解である。
図25Fは、PCSK9の表面の被覆の図解である。
図26は、様々な抗体のエピトープを調べるための、PCSK9アミノ酸配列とPCSK9バリアント中の変異された残基の全ての配列比較である。
図27Aは、21B12とのPCSK9の結晶構造上にマッピングされた、21B12エピトープのヒットを図示する。
図27Bは、31H4及び21B1とのPCSK9の結晶構造上にマッピングされた、31H4エピトープのヒットを図示する。
図27Cは、31H4及び21B12とのPCSK9の結晶構造上にマッピングされた、31H4エピトープのヒットを図示する。
図27Dは、31H4及び21B12とのPCSK9の結晶構造上にマッピングされた、12H11エピトープのヒットを図示する。
図27Eは、31H4及び21B12とのPCSK9の結晶構造上にマッピングされた、3C4エピトープのヒットを図示する。
図28Aは、様々なABPがPCSK9の様々な部分に結合する能力を示すグラフである。
図28Bは、様々なABPがPCSK9の様々な部分に結合する能力を示すグラフである。
図28Cは、2つのABPのLDLR結合能力を比較するグラフである。
図28Dは、2つのABPの細胞LDL取り込み活性を比較するグラフである。

0065

PCSK9に結合する抗原結合タンパク質(抗体及びその機能的結合断片など)が、本明細書に開示されている。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はPCSK9に結合し、様々な様式でPCSK9が機能を発揮するのを妨げる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、PCSK9が他の物質と相互作用する能力を遮断し、又は低下させる。例えば、幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、PCSK9がLDLRに結合する可能性を妨げ、又は低下させる様式で、PCSK9に結合する。他の実施形態において、抗原結合タンパク質はPCSK9に結合するが、PCSOがLDLRと相互作用する能力を遮断しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、ヒトモノクローナル抗体である。

0066

当業者によって理解されるように、本発明の開示に照らせば、PCSK9とLDLRの間の相互作用を変化させることは、LDLへの結合に利用可能なLDLRの量を増加させ、続いて、これは、対象中の血清LDLの量を減少させ、対象の血清コレステロールレベルの低下をもたらす。従って、PCSK9に対する抗原結合タンパク質は、上昇した血清コレステロールレベルを有する対象、上昇した血清コレステロールレベルのリスクを有する対象又は血清コレステロールレベルの低下が有益であり得る対象を治療するための様々な方法及び組成物において使用することができる。従って、血清コレステロールの増加を低下させ、維持し、又は妨げるための様々な方法及び技術も、本明細書中に記載されている。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質はPCSK9とLDLRの間の結合を可能とするが、抗原結合タンパク質はLDLRに対するPCSK9の有害な活性を妨げ、又は低下させる。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、LDLRへのPCSK9の結合を妨げ、又は低下させる。

0067

便宜のため、以下の節は、本明細書において使用される用語の様々な意味を全般的概観する。この論述の後に、抗原結合タンパク質に関する一般的な態様が論述されており、その後に、抗原結合タンパク質の様々な実施形態の特性及びそれらをどのように使用することができるかを示す具体例が続く。

0068

定義及び実施形態
前記一般的な記述及び以下の詳細な説明は何れも例示的及び説明的なものに過ぎず、特許請求の範囲に記載されている本発明を限定するものではないことを理解しなければならない。本願において、単数形の使用は、特に別段の記載がなければ、複数形を含む。本願において、「又は」の使用は、別段の記載がなければ、「及び/又は」を意味する。さらに、「含んでいる」という用語並びに「含む」及び「含まれた」などのその他の形式の使用は、限定的なものではない。また、「要素」又は「成分」などの用語は、特に別段の記載がなければ、一つのユニットを含む要素及び成分並びに2以上のサブユニットを含む要素及び成分の両方を包含する。また、「部分」という用語の使用は、構成部分の一部又は構成部分の全体を含み得る。

0069

本明細書に記載されている見出しは、整理を目的とするものに過ぎず、記載されている主題を限定するものと解釈すべきではない。特許、特許出願、論説、書物及び論文などの(但し、これらに限定されない。)、本願に引用されている全ての文献又は文献の一部は、あらゆる目的のために、その全体が、参照により、本明細書に明示的に組み込まれる。本開示において使用される場合、以下の用語は、別段の記載がなければ、以下の意味を有するものと理解しなければならない。

0070

「プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型」又は「PCSK9」という用語は、配列番号1及び/又は3に記載されているポリペプチド又はその断片、並びに対立遺伝子バリアントスプライスバリアント誘導体バリアント、置換バリアント、欠失バリアント及び/又は挿入バリアント(N末端メチオニンの付加を含む。)、融合ポリペプチド及び種間相同体を含む(但し、これらに限定されない。)関連ポリペプチドを表す。ある種の実施形態において、PCSK9ポリペプチドは、リーダー配列残基、標的化残基、アミノ末端メチオニン残基リジン残基タグ残基及び/又は融合タンパク質残基などの(但し、これらに限定されない。)末端残基を含む。「PCSK9」は、FH3、NARC1、HCHOLA3、プロタンパク質コンベルターゼスブチリシン/ケクシン9型及び神経アポトーシス制御コンベルターゼ1とも称されている。PCSK9遺伝子は、分泌性スブチラーゼファミリーのプロテイナーゼKサブファミリーに属するプロタンパク質コンベルターゼタンパク質をコードする。「PCSK9」という用語は、プロタンパク質及びプロタンパク質の自己触媒後に生成される産物の両方を表す。(例えば、切断されたPCSK9に選択的に結合する抗原結合タンパク質に対して)自己触媒された産物のみが引用されている場合には、タンパク質は、「成熟」、「切断された」、「プロセッシングされた」又は「活性な」PCSK9と称され得る。非活性形態のみが引用されている場合には、タンパク質は、PCSK9の「非活性」、「プロ型」又は「プロセッシングを受けていない」形態と称され得る。本明細書において使用されるPCSK9という用語は、変異D374Y、S127R及びF216Lなどの天然に存在する対立遺伝子も含む。PCSK9という用語は、グリコシル化、PEG化されたPCSK9配列、そのシグナル配列が切断されたPCSK9配列、触媒ドメインからそのプロドメインから切断されているが、触媒ドメインから分離されていないPCSK9配列(例えば、図1A及び1B)など、PCSK9アミノ酸配列の翻訳後修飾を取り込んだPCSK9分子も包含する。

0071

「PCSK9活性」という用語は、PCSK9のあらゆる生物学的効果を含む。ある種の実施形態において、PCSK9活性は、基質若しくは受容体と相互作用し、又は基質若しくは受容体に結合するPCSK9の能力を含む。幾つかの実施形態において、PCSK9活性は、LDL受容体(LDLR)に結合するPCSK9の能力によって表される。幾つかの実施形態において、PCSK9は、LDLRを含む反応に結合し、触媒する。幾つかの実施形態において、PCSK9活性は、LDLRの利用可能性を変化させる(例えば、低下させる)PCSK9の能力を含む。幾つかの実施形態において、PCSK9活性は、対象中のLDLの量を増加させるPCSK9の能力を含む。幾つかの実施形態において、PCSK9活性は、LDLへの結合に利用可能なLDLRの量を減少させるPCSK9の能力を含む。幾つかの実施形態において、「PCSK9活性」は、PCSK9シグナル伝達から生じるあらゆる生物活性を含む。典型的な活性には、LDLRへのPCSK9の結合、LDLR又は他のタンパク質を切断するPCSK9酵素活性、PCSK9作用を促進するLDLR以外のタンパク質へのPCSK9の結合、APOB分泌を変化させるPCSK9(Sun X−M et al, “Evidence for effect of mutant PCSK9 on apoliprotein B secretion as the cause of unusually severe dominant hypercholesterolemia”, Human Molecular Genetics 14:1161−1169, 2005 and Ouguerram K et al, “Apolipoprotein B100 metabolism in autosomal−dominant hypercholesterolemia related to mutations in PCSK9, Arterioscler thromb Vase Biol.24:1448−1453, 2004)、肝臓の再生及び神経細胞分化におけるPCSK9の役割(Seidah NG et al, “The secretory proprotein convertase neural apoptosis−regulated convertase 1(NARC−I):Liver regeneration and neuronal differentiation” PNAS 100:928−933, 2003)及び肝臓のグルコース代謝におけるPCSK9の役割(Costet et al., “Hepatic PCSK9 expression is regulated by nutritional status via insulin and sterol regulatory element−binding protein 1c” J.Biol.Chem.281(10):6211−18,2006)が含まれるが、これらに限定されない。

0072

本明細書において使用される「高コレステロール血症」という用語は、コレステロールレベルが所望のレベルを上回って上昇している症状を表す。幾つかの実施形態において、これは、血清コレステロールレベルが上昇していることを表す。幾つかの実施形態において、所望のレベルは、当業者に公知である(及び、本明細書に記載され、又は引用されている)様々な「リスク因子」を考慮に入れる。

0073

ポリヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、一本鎖及び二本鎖ヌクレオチドポリマーの両方を含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又はヌクレオチドの何れかの種類の修飾された形態であり得る。前記修飾には、ブロモウリジン及びイノシン誘導体などの塩基修飾、2’,3’−ジデオキシリボースなどのリボース修飾並びにホスホチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニラダート及びホスホロアミダートなどのヌクレオチド間結合修飾が含まれる。

0074

オリゴヌクレオチド」という用語は、200又はそれ以下のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、10から60塩基の長さである。他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、12、13、14、15、16、17、18、19又は20から40ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、例えば、変異体遺伝子の構築において使用するために、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識蛍光標識ハプテン又は抗原性標識などの標識を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマークローニングプライマー又はハイブリッド形成プローブとして使用することができる。

0075

「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドがその中に本来見出されるポリヌクレオチドの全部若しくは一部を伴っていない、又は本来連結されていないポリヌクレオチドに連結されているゲノムのDNA又はRNA、mRNAcDNA又は合成起源又はこれらの幾つかの組み合わせを意味する。この開示において、あるヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は完全な状態の染色体を包含しないことを理解すべきである。指定された核酸配列を「含む」単離された核酸分子は、指定された配列に加えて、最大10個の若しくは最大20個の他のタンパク質若しくはその一部に対するコード配列を含むことができ、又は引用されている核酸配列のコード領域の発現を調節する作用可能に連結された制御配列を含むことができ、及び/又はベクター配列を含むことができる。

0076

別段の記載がなければ、本明細書中に論述されているあらゆる一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手の方向が5’方向と称される。新生RNA転写物の5‘から3’への付加の方向は、転写方向と称される。RNA転写物の5’末端に対して5’である、RNA転写物と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。RNA転写物の3’末端に対して3’である、RNA転写物と同じ配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

0077

調節配列」という用語は、調節配列が連結されているコード配列の発現及びプロセッシングに影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を表す。このような調節配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物に対する調節配列には、プロモーターリボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれ得る。例えば、真核生物に対する調節配列には、転写因子に対する認識部位の1つ又は複数を含むプロモーター、転写強化配列及び転写終結配列が含まれ得る。「調節配列」には、リーダー配列及び/又は融合対配列が含まれ得る。

0078

「ベクター」という用語は、宿主細胞中にタンパク質コード情報を伝達するために使用されるあらゆる分子又は実体(例えば、核酸、プラスミドバクテリオファージ又はウイルス)を意味する。

0079

発現ベクター」又は「発現構築物」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、並びに核酸配列に作用可能に連結された1つ又はそれ以上の異種のコード領域の発現を(宿主細胞と一緒に)誘導し、及び/又は調節する核酸配列を含有するベクターを表す。発現構築物には、転写、翻訳に影響を及ぼし又は調節し、イントロンが存在する場合には、作用可能に連結されているコード領域のRNAスプライシングに影響を及ぼす配列が含まれ得るが、これらに限定されない。

0080

本明細書において使用される「作用可能に連結された」とは、この用語が適用される成分が、適切な条件下でその固有の機能を発揮できる関係にあることを意味する。例えば、タンパク質のコード配列に「作用可能に連結された」ベクター中の調節配列は、調節配列の転写活性適合的な条件下で、タンパク質コード配列の発現が達成されるように、タンパク質コード配列に連結されている。

0081

「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されており、又は核酸配列で形質転換されることができ、これにより、目的の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、目的の遺伝子が存在する限り、子孫が元の親細胞と形態的に同一であるかどうか、又は元の親細胞と遺伝的組成が同一であるかどうかを問わず、親細胞の子孫を含む。

0082

形質移入」という用語は、細胞による外来又は外因性DNAの取り込みを意味し、外因性DNAが細胞膜内に導入された場合に、細胞は「形質移入されている」。多数の形質移入技術が本分野において周知であり、本明細書中に開示されている。例えば、「Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning:A Laboratory Manual、上記; Davis et al., 1986, Basic Methodsin Molecular Biology, Elsevier; Chu et al, 1981, Gene 13:197」を参照されたい。このような技術は、適切な宿主細胞中に1つ又はそれ以上の外来DNA部分を導入するために使用することができる。

0083

「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特性の変化を表し、新しいDNA又はRNAを含有するように修飾された場合に、細胞は形質転換されている。例えば、形質移入、形質導入又は他の技術を介して新しい遺伝物質を導入することによって、その固有状態から遺伝的に修飾されている場合に、細胞は形質転換されている。形質移入又は形質導入後に、細胞の染色体中に物理的に統合することによって、形質転換されているDNAは細胞のDNAと組み換えることができ、又は複製されずに、エピソーム要素として一過性に維持されることができ、又はプラスミドとして独立に複製することができる。形質転換されているDNAが細胞分裂とともに複製されるときに、細胞は、「安定に形質転換された」と考えられる。

0084

「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は、原型のタンパク質、すなわち、天然に存在する非組換え細胞によって産生されたタンパク質のアミノ酸配列を有する高分子を意味し又は「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、遺伝子操作された細胞若しくは組換え細胞によって産生され、原型のタンパク質のアミノ酸配列を有する分子又は原型配列の1つ若しくはそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び/又は置換を有する分子を含む。この用語は、1つ又はそれ以上のアミノ酸が天然に存在する対応するアミノ酸及びポリマーの化学的類縁体であるアミノ酸ポリマーも含む。具体的には、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、抗原結合タンパク質の1つ又はそれ以上のアミノ酸からの欠失、付加及び/又は置換を有するPCSK9抗原結合タンパク質、抗体又は配列を包含する。「ポリペプチド断片」という用語は、完全長の原型タンパク質と比べて、アミノ末端の欠失、カルボキシル末端の欠失及び/又は内部欠失を有するポリペプチドを表す。このような断片は、原型のタンパク質と比べて、修飾されたアミノ酸も含有する。ある種の実施形態において、断片は約5から500アミノ酸長である。例えば、断片は、少なくとも5、6、8、10、14、20、50、70、100、110、150、200、250、300、350、400又は450アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチド断片には、抗体の免疫学的に機能的な断片(結合ドメインを含む。)が含まれる。PCSK9結合抗体の場合、有用な断片には、CDR領域、重鎖及び/又は軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部又は2つのCDRを含むその可変領域のみなどが含まれるが、これらに限定されない。

0085

引用されている「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が(1)通常一緒に見出される少なくとも幾つかの他のタンパク質を含まない、(2)同じ源からの(例えば、同じ種からの)他のタンパク質を実質的に含まない、(3)異なる種からの細胞によって発現されている、(4)自然の状態で一緒に存在するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物又は他の物質の少なくとも約50%から分離されている、(5)自然の状態で一緒に存在しないポリペプチドと、(共有又は非共有的相互作用によって)作用可能に結合されている、又は(6)自然の状態で存在しないことを意味する。典型的には、「単離されたタンパク質」は、ある試料の少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約25%又は少なくとも約50%を占める。ゲノムDNA、cDNA、mRNA若しくは合成起源の他のRNA又はこれらのあらゆる組み合わせが、このような単離されたタンパク質をコードし得る。好ましくは、単離されたタンパク質は、その治療的、診断的、予防的な研究又はその他の使用を妨害する、その天然環境中に見出されるタンパク質又はポリペプチド又は他のきょう雑物質を実質的に含まない。

0086

「アミノ酸」という用語は、本分野におけるその通常の意味を含む。

0087

ポリペプチド(例えば、抗原結合タンパク質又は抗体)の「バリアント」は、別のポリペプチド配列と比べて、アミノ酸配列中に1つ又はそれ以上のアミノ酸残基が挿入され、欠失され、及び/又は置換されているアミノ酸配列を含む。バリアントは、融合タンパク質を含む。

0088

同一性」という用語は、配列を並置及び比較することによって決定された、2つ若しくはそれ以上のポリペプチド分子又は2つ若しくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を表す。「%同一性」とは、比較されている分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同じ残基のパーセントを意味し、比較されている分子のうち最も小さなサイズに基づいて計算される。これらの計算のために、ある種の数学的モデル又はコンピュータプログラム(すなわち、「アルゴリズム」)によって、好ましくは、(ギャップが存在する場合)並置中のギャップが割り当てられる。並置された核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用することができる方法には、「Computational Molecular Biology,(Lesk,A.M.,ed.),1988,New York:Oxford University Press;Biocomputing Informatics and Genome Projects,(Smith,D.W.,ed.),1993,New York:Academic Press;Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,(Griffin,A.M.,and Griffin,H.G.,eds.),1994,New Jersey:Humana Press;von Heinje,G.,1987,Sequence Analysis in Molecular Biology,New York:Academic Press(1987);Sequence Analysis Primer,(Gribskov,M. and Devereux,J.,eds.),1991,New York:M. Stockton Press;及びCarillo et al.,1988,SIAMJ.Applied Math.,48:1073」に記載されているものが含まれる。

0089

%同一性を計算する際には、比較されている配列は、配列間で最大の合致を与えるように通例並置される。%同一性を測定するために使用することができるコンピュータプログラムの一例は、GAPを含むGCプログラムパッケージである(Devereux et al., 1984, Nucl.AcidRes.12:387; Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI)。コンピュータアルゴリズムGAPは、%配列同一性を測定すべき2つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを併置するために使用される。配列は、それぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適な合致が得られるように並置される(アルゴリズムによって決定される「合致したスパン」)。ギャップオープニングペナルティ(3×平均対角として計算される。「平均対角」は、使用されている比較行列の対角の平均である。「対角」は、この比較行列による各完全なアミノ酸の合致に対して割り当てられるスコア又は数である。)及びギャップ伸長ペナルティー(通常、ギャップオープニングペナルティの1/10である。)並びにPAM250又はBLOSUM62などの比較行列が、アルゴリズムとともに使用される。ある種の実施形態において、標準的な比較行列も、アルゴリズムによって使用される(PAM250比較行列に関して、Dayhoff et al.,Atlas of Protein Sequence and Structure,5:345−35;BLOSUM62比較行列に関して、Henikoff et al.,1992,Proc.Natl.Acad.Sci USA,89:10915−10919(1992)を参照)。

0090

APプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列に対する%同一性を測定する際に使用することができるパラメータの例は、以下のとおりである。

0091

・アルゴリズム:Needleman et al.,1970,J.Mol.Biol.,48:443−453
・比較行列:Henikoff et al.,1992,上記から得られるBLOSUM62
・ギャップペナルティー:12(末端ギャップに対するペナルティーはなし)
ギャップ長ペナルティー:4
・類似性の閾値:0

0092

2つのアミノ酸配列を並置するためのある種の並置スキームは、2つの配列の短い領域の合致のみをもたらす場合があり得、2つの完全長配列の間には有意な関係が存在しなくても、この小さな並置された領域は極めて高い配列同一性を有し得る。従って、標的ポリペプチドの連続するアミノ酸の少なくとも50又は他の数値を包含する並置をもたらすことが所望されるのであれば、選択された並置法(GAPプログラム)を調整することができる。

0093

本明細書において使用される、20の慣用(例えば、天然に存在する)アミノ酸及びそれらの略号は、慣用的な用法に従う。「Immunology−A Synthesis(2nd Edition,E.S. Golub and D. R. Gren,Eds.,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991))」(あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。)を参照されたい。20の慣用アミノ酸立体異性体(例えば、D−アミノ酸)、α、α−二置換されたアミノ酸、N−アルキルアミノ酸、乳酸及び他の非慣用アミノ酸などの非天然アミノ酸も、本発明のポリペプチドに対する適切な成分であり得る。非慣用アミノ酸の例には、4−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−N,N,N−トリメチルリジン、ε−N−アセチルリジン、O−ホスホセリン、N−アセチルセリンN−ホルミルメチオニン、3−メチルヒスチジン、5−ヒドロキシリジン、σ−N−メチルアルギニン並びに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸(例えば、4−ヒドロキシプロリン)が含まれる。本明細書において使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法と慣習に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。

0094

同様に、別段の記載がなければ、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端が5’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方法が5’方向と称される。新生RNA転写物の5‘から3’への方向の付加は、転写の方向と称される。RNAと同じ配列を有し、及びRNA転写物の5’末端に対して5’であるDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称される。RNAと同じ配列を有し、及びRNA転写物の3’末端に対して3’であるDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

0095

保存的アミノ酸置換は、生物系内での合成ではなく、通例、化学的なペプチド合成によって取り込まれる天然に存在しないアミノ酸を包含することができる。これらには、ペプチド模倣物及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転された形態が含まれる。

0096

天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて、クラスに分類され得る。

0097

1)疎水性ノルロイシン、Met、Ala、VaI、Leu、Ile;
2)中性親水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;
3)酸性:Asp、Glu;
4)塩基性:His、Lys、Arg;
5)鎖の方向性に影響を与える残基:Gly、Pro及び
6)芳香族:Trp、Tyr、Phe。

0098

例えば、非保存的置換は、これらのクラスの1つの一員を別のクラスの一員で交換することを含み得る。このような置換された残基は、例えば、非ヒト抗体相同であるヒト抗体の領域中に、又は分子の非相同領域中に導入することができる。

0099

抗原結合タンパク質又はPCSK9タンパク質に対して変化を施す上で、ある種の実施形態に従えば、アミノ酸のヒドロパチー指数を検討し得る。各アミノ酸は、その疎水性及び電荷特性に基づいて疎水性親水性指標を割り当てられている。疎水性親水性指標は、イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システインシスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(−0.4)、トレオニン(−0.7)、セリン(−0.8)、トリプトファン(−0.9)、チロシン(−1.3)、プロリン(−1.6)、ヒスチジン(−3.2)、グルタミン酸(−3.5)、グルタミン(−3.5)、アスパラギン酸(−3.5)、アスパラギン(−3.5)、リジン(−3.9)及びアルギニン(−4.5)である。

0100

タンパク質に対する相互作用性生物機能を付与する上での疎水性親水性アミノ酸指標重要性は、本分野において理解されている。Kyte et al,J.Mol.Biol.,157:105−131(1982)。ある種のアミノ酸は、類似の疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、それでもなお類似の生物活性を保持することが知られている。疎水性親水性指標に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、疎水性親水性指標が±2以内であるアミノ酸の置換を含む。ある実施形態において、±1以内であるアミノ酸の置換を含み、ある実施形態においては±0.5以内であるアミノ酸の置換を含む。

0101

類似アミノ酸の置換は、本事例のように、それによって産生される生物学的に機能的なタンパク質又はペプチドを免疫学的実施形態に用いようとする場合には特に、親水性に基づいて効果的に実施することができることも当分野では理解されている。ある実施形態においては、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の局所的な最大平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわち、タンパク質の生物学的特性相関がある。

0102

以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている:アルギニン(+3.0)、リジン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、トレオニン(−0.4)、プロリン(−0.5±1)、アラニン(−0.5)、ヒスチジン(−0.5)、システイン(−1.0)、メチオニン(−1.3)、バリン(−1.5)、ロイシン(−1.8)、イソロイシン(−1.8)、チロシン(−2.3)、フェニルアラニン(−2.5)及びトリプトファン(−3.4)。類似の親水性値に基づいて変化させる際には、ある実施形態において、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±1以内であるアミノ酸の置換が含まれ、ある実施形態において、±0.5以内であるアミノ酸の置換が含まれる。親水性に基づいて、一次アミノ酸配列からエピトープを特定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。

0103

アミノ酸置換の例が表1に示されている。

0104

0105

「誘導体」という用語は、アミノ酸(又は核酸)の挿入、欠失又は置換以外の化学的修飾を含む分子を表す。ある種の実施形態において、誘導体は、ポリマー、脂質又は他の有機若しくは無機部分との化学的結合などの(但し、これらに限定されない。)共有修飾を含む。ある種の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、化学的に修飾されていない抗原結合タンパク質より大きな循環半減期を有することができる。ある種の実施形態において、化学的に修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織及び/又は臓器に対する改善された標的誘導能力を有し得る。幾つかの実施形態において、誘導体抗原結合タンパク質は、ポリエチレングリコールポリオキシエチレングリコール又はポリプロピレングリコールなど(但し、これらに限定されない。)、1つ又はそれ以上の水溶性ポリマー付着を含むように共有的に修飾される。例えば、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号及び同第4,179,337号を参照されたい。ある種の実施形態において、誘導体抗原結合タンパク質は、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストランセルロース又は他の炭水化物をベースとするポリマー、ポリ−(N−ビニルピロリドン)−ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマーポリプロピレンオキシドエチレンオキシド共重合体ポリオキシエチル化されたポリオール(例えば、グリセロール)及びポリビニルアルコール並びにこのようなポリマーの混合物などの(但し、これらに限定されない。)1つ又はそれ以上のポリマーを含む。

0106

ある種の実施形態において、誘導体は、ポリエチレングリコール(PEG)サブユニットで共有的に修飾されている。ある種の実施形態において、1つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、1つ又はそれ以上の特定の位置で、例えば、誘導体のアミノ末端で結合されている。ある種の実施形態において、1つ又はそれ以上の水溶性ポリマーは、誘導体の1つ又はそれ以上の側鎖に無作為に付着されている。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質に対して治療能力を向上させるためにPEGが使用される。ある種の実施形態において、ヒト化抗体に対して治療能力を向上させるためにPEGが使用される。ある種のこのような方法が、例えば、米国特許第6,133,426号(参照により、あらゆる目的のために組み込まれる。)に論述されている。

0107

ペプチド類縁体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する非ペプチド薬として、医薬産業において一般的に使用されている。非ペプチド化合物のこれらの種類は、「ペプチド模倣物(“peptide mimetics”又は“peptidomimtics”」と称されている。「Fauchere,J.Adv. Drug Res.15:29(1986);Veber and Freidinger TINS p.392(1985);及びEvans et al.J.Med. Chem.,30:1229(1987)」(あらゆる目的のために、参照により、本明細書に組み込まれる。)。このような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣物は、類似の治療効果又は予防効果を生じさせるために使用し得る。一般に、ペプチド模倣物は、ヒト抗体などの模範ポリペプチド(すなわち、生化学的特性又は薬理学的活性を有するポリペプチド)と構造的に類似するが、本分野で周知の方法によって、−CH2NH−、−CH2S−、−CH2−CH2−、−CH=CH−(シス及びトランス)、−COCH2−、−CH(OH)CH2−及び−CH2SO−から選択される結合によって必要に応じて置換された1つ又はそれ以上のペプチド結合を有する。コンセンサス配列の1つ又はそれ以上のアミノ酸を同種のDアミノ酸で体系的に置換すること(例えば、L−リジンに代えてD−リジン)は、ある種の実施形態において、より安定なペプチドを作製するために使用し得る。さらに、コンセンサス配列又は実質的に同一なコンセンサス配列変異を含む拘束されたペプチドは、本分野で公知の方法によって、例えば、ペプチドを環状化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製され得る(Rizo and Gierasch Ann.Rev.Biochem.61:387(1992)、参照により、あらゆる目的のために、本明細書に組み込まれる。)。

0108

ポリペプチド、核酸、宿主細胞などの生物学的物質に関連して本明細書を通じて使用される「天然に存在する」という用語は、自然の状態で見出される物質又は自然の状態で見出される物質の形態を表す。

0109

本明細書において使用される「抗原結合タンパク質」(「ABP」)は、特定された標的抗原を結合するあらゆるタンパク質を意味する。本願において、特定された標的抗原は、PCSK9タンパク質又はその断片である。「抗原結合タンパク質」には、抗体及びその結合部分(免疫学的に機能的な断片など)が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、抗原結合タンパク質の別の例である。本明細書において使用される抗体又は免疫グロブリン鎖(重鎖又は軽鎖)抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的な断片」(又は単に「断片」)という用語は、完全長の鎖中に存在するアミノ酸の少なくとも幾つかを欠如するが、抗原になお特異的に結合することができる抗体の部分(当該部分がどのようにして取得され、又は合成されたかを問わない。)を含む抗原結合タンパク質の種である。このような断片は、標的抗原に結合し、あるエピトープへの結合に関して、完全な状態の抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合し得るという点で生物学的に活性を有する。幾つかの実施形態において、断片は、中和断片である。幾つかの実施形態において、断片は、LDLRとPCSK9の間の相互作用の可能性を遮断し、又は低下させることができる。一態様において、このような断片は、完全長の軽鎖又は重鎖中に存在する少なくとも1つのCDRを保持し、幾つかの実施形態において、単一の重鎖及び/又は軽鎖又はその一部を含む。これらの生物学的に活性な断片は、組換えDNA技術によって作製することが可能であり、又は完全な状態の抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的若しくは化学的切断によって作製することが可能である。免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片には、Fab、ダイアボディ(同一鎖上の2つのドメイン間での対形成を可能にするには短すぎる短いペプチドリンカーを介して接続された、軽鎖可変ドメインと同一のポリペプチド上の重鎖可変ドメイン)、Fab’、F(ab’)2、Fv、ドメイン抗体及び一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラットラクダ科動物又はウサギなどの(但し、これらに限定されない)あらゆる哺乳動物源に由来し得る。本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば、1つ又はそれ以上のCDRは、体内の特定の標的に誘導され、二機能性治療特性を有し、又は延長された血清半減期を有する治療剤を作製するために、第二のタンパク質又は小分子に共有結合され得る。当業者によって理解されるように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含むことができる。本開示の幾つかの節において、ABPの例は、「数字文字/数字」(例えば、25A7)の形式で本明細書中に記載されている。これらの場合、正確な名前特異的抗体を表す。すなわち、25A7という名前のABPは、(本明細書において、同じであることが明示的に教示されていなければ(例えば、25A7及び25A7.3))、必ずしも25A7.1という名前の抗体と同じであるとは限らない。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、LDLRは抗原結合タンパク質ではない。幾つかの実施形態において、LDLRの結合サブセクションは、抗原結合タンパク質ではない(例えば、EGFa)。幾つかの実施形態において、PCSK9がそれを通じてインビボでシグナル伝達する他の分子は、抗原結合タンパク質でない。このような実施形態は、そのようなものとして明示的に特定される。

0110

本明細書に記載されているある種の抗原結合タンパク質は、抗体であり、又は抗体に由来する。ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、モノクローナル抗体、二重特異的抗体ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書では、「抗体模倣物」と称される場合がある。)、キメラ抗体、ヒト化抗、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。)及びそれぞれ、これらの断片を含む(但し、これらに限定されない。)抗体を基礎とする。幾つかの実施形態において、ABPは、アビマー(強固に結合するペプチド)を含み、又はアビマーからなる。これらの様々な抗原結合タンパク質は、本明細書中にさらに記載されている。

0111

「Fc」領域は、抗体のCH1及びCH2ドメインを含む2つの重鎖断片を含む。2つの重鎖断片は、2つ又はそれ以上のジスルフィド結合によって、及びCH3ドメインの疎水的相互作用によって一緒に固定される。

0112

「Fab断片」は、1つの軽鎖並びに1つの重鎖のCH1及び可変領域を含む。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。

0113

「Fab’断片」は、1つの軽鎖とVHドメイン及びCH1ドメインを含有し、並びに2つのFab’断片の2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成して、F(ab’)2分子を形成できるように、CH1及びCH2ドメインの間の領域も含有する1つの重鎖の一部を含む。

0114

「F(ab’)2断片」は、2つの軽鎖及び鎖間ジスルフィド結合が2つの重鎖間で形成されるように、CH1とCH2ドメインの間の定常領域の一部を含有する2つの重鎖を含有する。従って、F(ab’)2断片は、2つの重鎖間のジスルフィド結合によって一緒に固定された2つのFab’断片から構成される。

0115

「Fv領域」は、重鎖及び軽鎖の両方に由来する可変領域を含むが、定常領域を欠如する。

0116

「一本鎖抗体」は、柔軟なリンカーによって重鎖及び軽鎖可変領域が接続されて、抗原結合領域を形成する単一のポリペプチド鎖を形成するFv分子である。一本鎖抗体は、国際特許出願公開WO88/01649並びに米国特許第4,946,778号及び同第5,260,203号(これらの開示は、参照により組み込まれる。)に詳しく論述されている。

0117

「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域又は軽鎖の可変領域のみを含有する免疫学的に機能的な免疫グロブリン断片である。幾つかの事例において、二価のドメイン抗体を作製するために、2つ又はそれ以上のVH領域がペプチドリンカーを用いて共有結合される。二価のドメイン抗体の2つのVH領域は、同一又は別異の抗原を標的とし得る。

0118

「二価の抗原結合タンパク質」又は「二価の抗体」は、2つの抗原結合部位を含む。幾つかの事例において、2つの結合部位は同じ抗原特異性を有する。二価の抗原結合タンパク質及び二価の抗体は、二重特異的であり得る。下記を参照。「多重特異的」又は「多重機能的」抗体以外の二価の抗体は、ある種の実施形態において、典型的には、同一のその結合部位の各々を有するものと理解される。

0119

「多重特異的抗原結合タンパク質」又は「多重特異的抗体」は、2以上の抗原又はエピトープを標的とするものである。

0120

「二重特異的」、「デュアル特異的」又は「二重機能的」抗原結合タンパク質又は抗体は、それぞれ、2つの異なる抗原結合部位を有するハイブリッド抗原結合タンパク質又は抗体である。二重特異的抗原結合タンパク質及び抗体は、多重特異的抗原結合タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合又はFab’断片の連結を含む(但し、これらに限定されない。)様々な方法によって作製することができる。例えば、「Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin.Exp.Immunol.79:315−321; Kostelny et al, 1992, J. Immunol.148:1547−1553」を参照されたい。二重特異的抗原結合タンパク質又は抗体の2つの結合部位は、同一又は別異のタンパク質標的上に存在し得る2つの異なるエピトープに結合する。

0121

抗原結合タンパク質は、解離定数(Kd)が10−7M以下である場合に、その標的抗原を「特異的に結合する」と称される。ABPは、Kdが5×10−9M以下である場合に、「高い親和性」で抗原を特異的に結合し、Kdが5×10−10M以下である場合に、「極めて高い親和性」で抗原を特異的に結合する。一実施形態において、ABPは、10−9M以下のKdを有する。一実施形態において、オフ速度は、1×10−5未満である。別の実施形態において、ABPは、約10−9Mと10−13Mの間のKdでヒトPCSK9に結合し、さらに別の実施形態において、ABPは5×10−10以下のKdで結合する。当業者によって理解されるように、幾つかの実施形態において、抗原結合断片の何れも又は全てが、PCSK9に特異的に結合し得る。

0122

第二の標的への結合より、ある標的により強固に結合する場合に、抗原結合タンパク質は「選択的」である。

0123

「抗原結合領域」は、特定の抗原(例えば、パラトープ)を特異的に結合するタンパク質又はタンパク質の一部を意味する。例えば、抗原と相互作用し、抗原に対するその特異性及び親和性を抗原結合タンパク質に対して付与するアミノ酸残基を含有する抗原結合タンパク質のその部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、通例、1つ又はそれ以上の「相補性結合領域」(「CDR」)を含む。ある種の抗原結合領域は、1つ又はそれ以上の「フレームワーク」領域も含む。「CDR」は、抗原結合特異性及び親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、CDRの適切な立体構造の維持を補助して、抗原結合領域と抗原の間の結合を促進することができる。構造的には、フレームワーク領域は、抗体中においてCDR間に位置することができる。フレームワーク及びCDR領域の例は、図2Aから3D、3CCC−JJJ及び15Aから15Dに示されている。幾つかの実施形態において、抗体3B6の軽鎖に対するCDRの配列は以下のとおりである。CDR1TLSSGSSEVD(配列番号279);CDR2VDTGIVGSKGE(配列番号280);CDR3 GADHGSGTNFVVV(配列番号281)、FRは、以下のとおりである。FR1 QPVLTQPLFASASLGASVTLTC(配列番号282);FR2 WYQQRPGKGPRFVMR(配列番号283);FR3 GIPDRFSVLGSGLNRYLTIKNIQEEDESDYHC(配列番号284);及びFR4 FGGGTKLTVL(配列番号285)。

0124

ある態様において、PCSK9、例えば、ヒトPCSK9を結合する組換え抗原結合タンパク質が提供される。この文脈において、「組換え抗原結合タンパク質」は、組換え技術を用いて、すなわち、本明細書中に記載されている組換え核酸の発現を通じて作製されたタンパク質である。組換えタンパク質を作製するための方法及び技術は、本分野において周知である。

0125

「抗体」という用語は、あらゆるイソタイプの完全な免疫グロブリン又は標的抗原への特異的結合に関して完全な状態の抗体と競合することができるその断片を表し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト及び二重特異的抗体が含まれる。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。完全な状態の抗体は、少なくとも2つの完全長重鎖及び2つの完全長軽鎖を一般に含むが、幾つかの事例では、重鎖のみを含み得る、ラクダ科の動物中に天然に存在する抗体などのように、より少ない鎖を含み得る。抗体は、単一の源からのみ得ることが可能であり、又は「キメラ」であり得る(すなわち、抗体の異なる部分が、以下でさらに記載されているように2つの異なる抗体に由来し得る。)。抗原結合タンパク質、抗体又は結合断片は、組換えDNA技術によって、又は完全な状態の抗体の酵素的若しくは化学的切断によって、ハイブリドーマ中で製造することができる。別段の記載がなければ、「抗体」という用語は、2つの完全長重鎖及び2つの完全長軽鎖を含む抗体の他に、その誘導体、バリアント、断片及び変異タンパク質を含み、その例は以下に記載されている。さらに、明示的に除外されていなければ、抗体には、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書において、「抗体模倣物」と称される場合がある。)、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合物(本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。)及びそれぞれ、これらの断片が含まれる。幾つかの実施形態において、この用語は、ペプチボディも包含する。

0126

天然に存在する抗体構造単位は、典型的には、四量体を含む。このような四量体の各々は、ポリペプチド鎖の2つの同じ対から通例構成され、各対は、1つの完全長「軽」鎖(ある種の実施形態において、約25kDa)及び1つの完全長「重」鎖(ある種の実施形態において、約50から70kDa)を有する。各鎖のアミノ末端部分は、通例、抗原認識に必要とされる約100から110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を通例含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に必要とされ得る定常領域を通例規定する。ヒト軽鎖は、κ及びλ軽鎖として典型的に分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α又はεとして典型的に分類され、抗体のイソタイプをそれぞれIgMIgD、IgG、IgA及びIgEとして規定する。IgGは、IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4などの(但し、これらに限定されない。)幾つかのサブクラスを有する。IgMは、IgM1及びIgM2などの(但し、これらに限定されない。)サブクラスを有する。IgAは、IgA1及びIgA2などの(但し、これらに限定されない。)サブクラスへ同様に細分される。完全長の軽鎖及び重鎖内に、典型的には、可変及び定常領域は、約12又はそれ以上のアミノ酸の「J」領域によって連結されており、重鎖は約10以上のアミノ酸の「D」領域も含む。例えば、「Fundamental Immunology, Ch.7(Paul, W., ed., 2nd ed.Raven Press, N.Y. (1989))(参照により、全ての目的のために、その全体が組み込まれる。)」を参照されたい。各軽/重鎖対の可変領域は、通例、抗原結合部位を形成する。

0127

可変領域は、3つの超可変領域(相補性決定領域又はCDRとも称される。)によって連結された、相対的に保存されたフレームワーク領域(FR)の同じ一般的構造を典型的に呈する。各対の2つの鎖から得られるCDRは、フレームワーク領域によって通例並列され、これにより、特異的なエピトープへの結合が可能となり得る。N末端からC末端へ、軽鎖及び重鎖可変領域は何れも、通例、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及びFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、通例、免疫学的に関心が持たれるタンパク質のKabat配列の定義(National Institutes of Health, Bethesda, Md.(1987 and 1991))、又は「Chothia & Lesk, J.Mol.Biol.,196:901−917 (1987); Chothia et al., Nature, 342:878−883 (1989)」に従う。

0128

ある種の実施形態において、抗体重鎖は、抗体軽鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、抗体軽鎖は、抗体重鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、抗体結合領域は、抗体軽鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、抗体結合領域は、抗体重鎖の不存在下で、抗原に結合する。ある種の実施形態において、各可変領域は、他の可変領域の不存在下で、抗原へ特異的に結合する。

0129

ある種の実施形態において、CDRの確定的な描写及び抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解明し、及び/又は抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある種の実施形態において、これは、X線結晶学など、当業者に公知の様々な技術の何れによっても達成することができる。ある種の実施形態において、CDR領域を同定し、又は概測するために、様々な分析の方法を使用することができる。このような方法の例には、Kabat定義、Chothia定義、AbM定義及び接触定義が含まれるが、これらに限定されない。

0130

Kabat定義は、抗体中の残基に付番するための標準であり、CDR領域を同定するために典型的に使用される。例えば、「Johnson & Wu, Nucleic AcidsRes., 28:214−8(2000)」を参照されたい。Chothia定義はKabat定義に類似しているが、Chothia定義はある種の構造的ループ領域の位置を考慮に入れている。例えば、「Chothia et al, J.Mol.Biol., 196:901−17 (1986); Chothia et al, Nature, 342:877−83 (1989)」を参照されたい。AbM定義は、抗体構造をモデル化するOxford Molecular Groupによって産生されるコンピュータプログラムの一体化されたパッケージを使用する。例えば、「Martin et al, Proc Natl Acad Sci (USA), 86:9268−9272 (1989);“AbMTM,A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies,”Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltd」を参照されたい。AbM定義は、公知のデータベースとPROTEINS, Structure, Function and Genetics Suppl., 3:194−198 (1999)中の「Samudrala et al,“Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach,”によって記載されているようなアブニシオ法の組み合わせを用いて、一次配列から抗体の四次構造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の解析を基礎とする。例えば、「MacCallum et al, J. Mol.Biol., 5:732−45 (1996)」を参照されたい。

0131

慣例により、重鎖中のCDR領域は、通例、H1、H2及びH3と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。軽鎖中のCDR領域は、通例、L1、L2及びL3と称され、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に順に付番される。

0132

「軽鎖」という用語は、完全長の軽鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長軽鎖は、可変領域ドメイン、VL及び定常領域ドメイン、CLを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端に位置する。軽鎖は、κ鎖及びλ鎖を含む。

0133

「重鎖」という用語は、完全長の重鎖及び結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するその断片を含む。完全長の重鎖は、可変領域ドメインVH及び3つの定常領域ドメインCH1、CH2及びCH3を含む。VHドメインはポリペプチドのアミノ末端に、及びCHドメインはカルボキシル末端に位置し、CH3がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、IgG(IgG1、IgG2、IgG3及びIgG4サブタイプを含む。)、IgA(IgA1及びIgA2サブタイプを含む。)、IgM及びIgEなどのあらゆるイソタイプのものであり得る。

0134

二重特異的又は二重機能的抗体は、典型的には、2つの異なる重/軽鎖対及び2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異的抗体は、ハイブリドーマの融合又はFab’断片の連結などの(但し、これらに限定されない。)様々な方法によって産生され得る。例えば、「Songsivilai et al., Clin.Exp.Immunol., 79:315−321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547−1553 (1992)」を参照されたい。

0135

哺乳動物の幾つかの種は、単一の重鎖のみを有する抗体も産生する。

0136

それぞれの各免疫グロブリン鎖は、それぞれ概ね90から110のアミノ酸からなり、特徴的な折り畳みパターンを有する数個の「免疫グロブリンドメイン」から典型的に構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトでは、IgA及びIgDイソタイプは4つの重鎖と4つの軽鎖を含有し、IgG及びIgEイソタイプは2つの重鎖と2つの軽鎖を含有し、並びにIgMイソタイプは5つの重鎖と5つの軽鎖を含有する。重鎖C領域は、エフェクター機能に必要とされ得る1つ又はそれ以上のドメインを典型的に含む。重鎖定常領域ドメインの数は、イソタイプに依存する。IgG重鎖は、例えば、CH1、CH2及びCH3として知られる3つのC領域ドメインを含有する。提供される抗体は、これらのイソタイプ及びサブタイプの何れをも有し得る。本発明のある種の実施形態において、抗PCSK9抗体はIgG2又はIgG4サブタイプの抗体である。

0137

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、重鎖中にアミノ末端の約120から130個のアミノ酸及び軽鎖中に約100から110個のアミノ末端アミノ酸を通例含む、抗体の軽鎖及び/又は重鎖の一部を表す。ある種の実施形態において、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でさえ、アミノ酸配列が大幅に異なる。抗体の可変領域は、ある抗体の標的に対する特異性を通例決定する。

0138

「中和抗原結合タンパク質」又は「中和抗体」という用語は、リガンドに結合し、そのリガンドの生物学的効果を妨げ、又は低下させる、それぞれ、抗原結合タンパク質又は抗体を表す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接封鎖することによって、又はリガンドに結合し、間接的な手段(リガンド中の構造的又はエネルギー的変化など)を通じて、リガンドの結合能を変化させることによって行うことができる。幾つかの実施形態において、この用語は、それが結合しているタンパク質が生物学的機能を発揮するのを妨げる抗原結合タンパク質も表し得る。抗原結合タンパク質(例えば、抗体又は免疫学的に機能的なその断片)の結合及び/又は特異性を評価する際に、抗体の過剰が(インビトロ競合的結合アッセイで使用された場合に)少なくとも約1から20、20から30%、30から40%、40から50%、50から60%、60から70%、70から80%、80から85%、85から90%、90から95%、95から97%、97から98%、98から99%又はそれ以上、リガンドに結合された結合対の量を低下させるときに、抗体又は断片はその結合対へのリガンドの結合を大幅に阻害することができる。幾つかの実施形態において、PCSK9抗原結合タンパク質の場合には、このような中和分子は、PCSK9がLDLRを結合する能力を低減させることができる。幾つかの実施形態において、競合アッセイを介して、中和能力性質決定し、及び/又は記載する。幾つかの実施形態において、中和能力は、IC50又はEC50値の観点で記載される。幾つかの実施形態において、ABP27B2、13H1、13B5及び3C4は、非中和ABPであり、3B6、9C9及び31A4は弱い中和物質であり、表2中の残りのABPは強い中和物質である。幾つかの実施形態において、抗体又は抗原結合タンパク質は、PCSK9へ結合し、PCSK9がLDLRに結合するのを妨げる(又はPCSK9がLDLRに結合する能力を低下させる)ことによって中和する。幾つかの実施形態において、抗体又はABPは、PCSK9に結合し、PCSK9をLDLRへ結合させながら、LDLRのPCSK9媒介性分解を妨げ、又は低下させることによって中和する。従って、幾つかの実施形態において、中和ABP又は抗体は、PCSK9/LDLR結合をなお可能にしながら、PCSK9が関与するLDLRのその後の分解を妨げる(又は低下させる)。

0139

「標的」という用語は、抗原結合タンパク質によって結合されることができる分子又は分子の一部を表す。ある実施形態において、標的は、1つ又はそれ以上のエピトープを有することができる。ある実施形態において、標的は抗原である。「抗原結合タンパク質」という用語における「抗原」の使用は、抗原を含むタンパク質配列が抗体によって結合され得ることを単に表す。この文脈において、タンパク質は外来であること、又は免疫応答を誘導可能であることは必要とされない。

0140

同じエピトープに対して競合する抗原結合タンパク質(例えば、中和抗原結合タンパク質又は中和抗体)という文脈において使用される場合の「競合する」という用語は、検査されている抗原結合タンパク質(例えば、抗体又は免疫学的に機能的なその断片)が共通の抗原(例えば、PCSK9又はその断片)への参照抗原結合タンパク質(例えば、リガンド又は参照抗体)の特異的結合を妨げ、又は阻害する(例えば、低下させる)アッセイによって測定された抗原結合タンパク質間の競合を意味する。ある抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するために、競合的結合アッセイの多数の種類、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイRIA)、固相直接又は間接酵素イムノアッセイEIA)、サンドイッチ競合アッセイ(例えば、Stahli et al, 1983, Methodsin Enzymology 9:242−253参照);固相直接ビオチンアビジンEIA(例えば、Kirkland et al, 1986, J.Immunol.137:3614−3619参照)、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press);I−125標識を用いた固相直接標識RIA(例えば、Morel et al, 1988,Molec.Immunol.25:7−15);固相直接ビオチン−アビジンEIA(例えば、Cheung, et al., 1990, Virology 176:546−552参照);及び直接標識RIA(Moldenhauer et al., 1990, Scand.J.Immunol.32:77−82参照)を使用することができる。典型的には、このようなアッセイは、これらの何れかを有する固体表面又はセルに結合された精製抗原、標識されていない検査抗原結合タンパク質及び標識された基準抗原結合タンパク質を使用することを含む。競合的阻害は、検査抗原結合タンパク質の存在下で、固体表面又はセルに結合された標識の量を測定することによって測定される。通常、検査抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質(競合抗原結合タンパク質)には、基準抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質及び立体的妨害が生じるのに、基準抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分に近接した隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質が含まれる。競合結合を測定するための方法に関するさらなる詳細は、本明細書中の実施例に提供されている。通常、競合抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合には、少なくとも40から45%、45から50%、50から55%、55から60%、60から65%、65から70%、70から75%又は75%又はそれ以上、共通の抗原への基準抗原結合タンパク質の特異的結合を阻害する(例えば、低下させる)。幾つかの事例において、少なくとも80から85%、85から90%、90から95%、95から97%又は97%又はそれ以上、結合が阻害される。

0141

「抗原」という用語は、抗原結合タンパク質(例えば、抗体又はその免疫学的機能断片など)などの選択的結合因子によって結合され得る分子又は分子の一部を表す。幾つかの実施形態において、抗原は、その抗原に結合することができる抗体を作製するために、動物内で使用することができる。抗原は、異なる抗原結合タンパク質(例えば、抗体)と相互作用することができる1つ又はそれ以上のエピトープを有することができる。

0142

「エピトープ」という用語は、抗体又はT細胞受容体などの抗原結合タンパク質によって結合され得るあらゆる決定基を含む。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質によって結合される抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合タンパク質に直接接触する特定のアミノ酸を含む。最も頻繁には、エピトープはタンパク質上に存在するが、幾つかの事例では、核酸などの分子の他の種類上に存在することができる。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面基を含むことができ、特異的な三次元構造の特徴及び/又は特異的な電荷的特長を有することができる。一般に、特定の標的抗原に対して特異的な抗体は、タンパク質及び/又は高分子の複雑な混合物中において、標的抗原上のエピトープを優先的に認識する。

0143

本明細書において使用される「実質的に純粋な」とは、分子の記載されている種が存在している主要な種であること、すなわち、モル濃度ベースで、同じ混合物中の他の何れの個別の種より豊富に存在することを意味する。ある種の実施形態において、実質的に純粋な分子は、対象種が存在する全ての高分子種の少なくとも50%(モル濃度を基礎とする。)を占める組成物である。他の実施形態において、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する全ての高分子種の少なくとも80%、85%、90%、95%又は99%を含む。他の実施形態において、慣用の検出法によって、きょう雑種を組成物中に検出することができず、従って、組成物が単一の検出可能な高分子種からなる実質的均一状態になるまで対象種が精製される。

0144

因子」という用語は、本明細書において、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生物学的高分子又は生物学的材料から作製された抽出物を表すために使用される。

0145

本明細書において使用される「標識」又は「標識された」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の取り込み又は標識されたアビジン(例えば、蛍光マーカー又は光学的若しくは色素測定法によって検出可能な酵素活性を含有するストレプトアビジン)によって検出することが可能なビオチン部分のポリペプチドへの付着によって、検出可能マーカーを取り込むことを表す。ある実施形態において、標識又はマーカーは、治療用でもあり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する様々な方法が本分野において公知であり、使用することが可能である。ポリペプチドに対する標識の例には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。放射性同位体又は放射性核種(例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、蛍光性標識(例えば、FITCローダミンランタニドリン光物質)、酵素標識(例えば、西ワサビペルオキシダーゼβ−ガラクトシダーゼルシフェラーゼアルカリホスファターゼ)、化学発光ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ(例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメインエピトープタグ)。ある種の実施形態において、立体障害の可能性を低減するために、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着される。

0146

本明細書において使用される「生物学的試料」という用語には、生物又は以前に生物であった物から得られる物質のあらゆる量が含まれるが、これらに限定されない。このような生物には、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギ及び他の動物が含まれるが、これらに限定されない。このような物質には、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄リンパ節及び皮膚が含まれるが、これらに限定されない。

0147

本明細書において使用される「薬剤組成物」(又は薬剤又は薬物)という用語は、患者に適切に投与された場合に、所望の治療効果を誘導することができる、化学的化合物、組成物、組成物、薬剤又は薬物を表す。薬剤組成物は、成分の2以上の種類を必ずしも必要としない。

0148

「治療的有効量」という用語は、哺乳動物中の治療的応答を生じさせることが決定されたPCSK9抗原結合タンパク質の量を表す。このような治療的有効量は、当業者によって容易に確定される。

0149

本明細書において使用される「調節物質」という用語は、分子の活性又は機能を変化又は改変させる化合物である。例えば、調節物質は、調節物質の不存在下で観察される活性又は機能の規模と比べて、分子のある種の活性又は機能の規模の増加又は減少を引き起こすことができる。ある種の実施形態において、調節物質は、分子の少なくとも1つの活性又は機能の規模を減少させる阻害剤である。分子のある種の典型的な活性及び機能には、結合親和性、酵素活性及びシグナル伝達が含まれるが、これらに限定されない。ある種の典型的な阻害剤には、タンパク質、ペプチド、抗体、ペプチボディ、炭水化物又は小有機分子が含まれるが、これらに限定されない。ペプチボディは、例えば、米国特許第6,660,843号(PCT出願WO01/83525に対応する。)に記載されている。

0150

「患者」と「対象」という用語は互換的に使用され、ヒト及び非ヒト動物対象並びに以前に診断された疾患を有する対象、以前に認識された疾患を持たない対象、医学的な治療を受けた対象、疾患を発症するリスクを有する対象などが含まれる。

0151

「治療する」及び「治療」という用語は、治療的処置予防的処置及び対象が疾患又は他のリスク因子を発症するリスクを低減する適用が含まれる。治療は、疾患の完全な治癒を必要とするものではなく、症候又は伏在するリスク因子を低減させる実施形態を包含する。

0152

「予防する」という用語は、事象の確率を100%除去することを必要とするものではない。むしろ、「予防する」という用語は、化合物又は方法の存在下で、事象の発生の確率が低下されることを表す。

0153

組換えDNA、オリゴヌクレオチド技術及び組織培養及び形質転換(例えば、電気穿孔リポフェクション)のための標準的な技術を使用することができる。酵素反応及び精製技術は、製造業者仕様に従って、又は本分野で一般的に実施されるように、又は本明細書中に記載されているように実施することができる。前記技術及び手技は、本分野において周知の方法に従って、並びに本明細書を通じて引用及び論述されている様々な一般的な、及びより具体的な参考文献に記載されているように、一般に実施することができる。例えば、「Sambrook et al, Molecular Cloning:A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989))」(参照により、あらゆる目的のために本明細書中に組み込まれる。)を参照されたい。特別な定義が与えられていなければ、本明細書中に記載されている分析化学、合成有機化学並びに医学及び薬剤化学に関連して使用される命名法並びにこれらの研究手技及び技術は、本分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成化学分析、医薬の調製、製剤化及び送達及び患者の治療のための標準的な技術を使用することができる。

0154

PCSK9に対する抗原結合タンパク質
プロタンパク質コンベルターゼスブチリシンケクシン9型(PCSK9)は、低密度リポタンパク質受容体(LDLR)タンパク質のレベルの制御に関与しているセリンプロテアーゼである(Horton et al, 2007; Seidah and Prat, 2007)。PCSK9は、セリンプロテアーゼのスブチリシン(S8)ファミリーのプロホルモン−プロタンパク質コンベルターゼである(Seidah et al.,2003)。典型的なヒトPCSK9アミノ酸配列は、図1A(下線が付されているタンパク質の「プロ」ドメインを図示する。)及び図1B(太字のシグナル配列及び下線が付されたプロドメインを図示する。)において、配列番号1及び3として表されている。典型的なヒトPCSK9のコード配列が、配列番号2として表されている(図1B)。本明細書に記載されているように、PCSK9タンパク質は、完全長PCSK9タンパク質の断片も含むことができる。PCSK9タンパク質の構造は、2つのグループによって最近解決された(Cunningham et al., Nature Structural & Molecular Biology, 2007, and Piper et al., Structure, 15:1−8, 2007)(何れも、参照により、全体が本明細書に組み込まれる。)。PCSK9は、シグナル配列、N末端プロドメイン、スブチリシン様触媒ドメイン及びC末端ドメインを含む。

0155

ヒトPCSK9を含むPCSK9を結合する抗原結合タンパク質(ABP)は、本明細書中に記載されている。幾つかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されているように、1つ又はそれ以上の相補性決定領域(CDR)を含むポリペプチドである。同じ抗原結合タンパク質において、CDRは、CDRの適切な抗原結合特性が達成されるようにCDRを方向付ける「フレームワーク」領域中に包埋されている。幾つかの実施形態において、本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質は、PCSK9とLDLR間の相互作用を妨害し、遮断し、低下させ、又は調節することができる。このような抗原結合タンパク質は、「中和」と表される。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質が中和性であり、PCSK9に結合されている場合でさえ、PCSK9とLDLR間の結合はなお起こり得る。例えば、幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9上のLDLR結合部位を封鎖することなく、LDLRに対するPCSK9の悪影響を妨げ、又は低下させる。従って、幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9とLDLR間の結合相互作用を抑制する必要なしに、LDLRの分解をもたらすPCSK9の能力を調節し、又は変化させる。このようなABPは、「非競合的に中和する」ABPと特に記載することができる。幾つかの実施形態において、中和ABPは、PCSK9がLDLRに結合するのを妨げる位置及び/又は様式で、PCSK9に結合する。このようなABPは、「競合的に中和する」ABPと特に記載することができる。上記中和物質は何れも、対象中に存在している遊離のLDLRのより大きな量をもたらすことができ、これにより、LDLに結合しているより多くのLDLRがもたらされる(これにより、対象中のLDLの量を低下させる。)。続いて、これは、対象中に存在する血清コレステロールの量の低下をもたらす。

0156

幾つかの実施形態において、本明細書に提供されている抗原結合タンパク質は、PCSK9によって媒介される活性(結合を含む。)を阻害することができる。幾つかの実施形態において、これらのエピトープに結合する抗原結合タンパク質は、とりわけ、PCSK9とLDLRの間の相互作用及びPCSK9によって媒介される他の生理学的効果を阻害する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、PCSKに対する完全ヒト抗体など、ヒトである。

0157

幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9の触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9の成熟形態に結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9のプロドメイン中に結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9の成熟形態に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9がLDLRに結合できない様式で、又は効率的には結合できない様式で、触媒ドメインに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのC末端に結合しない。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、触媒ドメインのN末端に結合しない。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9タンパク質のN末端又はC末端に結合しない。幾つかの実施形態において、ABPは、本明細書中に論述されている抗体によって結合されるエピトープの何れか1つに結合する。幾つかの実施形態において、これは、本明細書中に開示されている抗体と他の抗体の間の競合アッセイによって測定することができる。幾つかの実施形態において、ABPは、表2に記載されている抗体の1つによって結合されるエピトープに結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、PCSK9の特異的な立体構造状態に結合して、PCSK9がLDLRと相互作用するのを妨げる。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9のVドメインに結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9のVドメインに結合し、PCSK9がLDLRに結合するのを妨げる(低下させる)。幾つかの実施形態において、ABPは、PCSK9のVドメインに結合し、LDLRへのPCSK9の結合を妨げずに(又は低下させずに)、PCSK9を通じて媒介されるLDLRに対する有害な活性を妨げ、又は低下させる。

0158

本明細書中に開示されている抗原結合タンパク質は、様々な用途を有する。抗原結合タンパク質の幾つかは、例えば、特異的結合アッセイ、PCSK9、特に、ヒトPCSK9又はそのリガンドのアフィニティー精製において、及びPCSK9活性の他のアンタゴニストを同定するためのスクリーニングアッセイにおいて有用である。抗原結合タンパク質の幾つかは、LDLRへのPCSK9の結合を阻害し、又はPCSK9によって媒介される活性を阻害するのに有用である。

0159

抗原結合タンパク質は、本明細書中に説明されているように、様々な治療用途において使用することができる。例えば、幾つかの実施形態において、PCSK9抗原結合タンパク質は、本明細書中にさらに記載されているように、高コレステロール血症などのコレステロール関連疾患(又は「血清コレステロール関連疾患」)など、PCSK9と関連する症状を治療するのに有用である。抗原結合タンパク質に対する他の使用には、例えば、PCSK9関連疾患又は症状の診断及びPCSK9の存在又は不存在を決定するためのスクリーニングアッセイが含まれる。本明細書中に記載されている抗原結合タンパク質の幾つかは、PCSK9活性と関連する結果、症候及び/又は病変を治療する上で有用である。

0160

幾つかの実施形態において、提供される抗原結合タンパク質は、1つ又はそれ以上のCDR(例えば、1、2、3、4、5又は6個のCDR)を含む。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、(a)ポリペプチド構造及び(b)ポリペプチド構造中に挿入され、及び/又は連結された1つ又はそれ以上のCDRを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態を採ることができる。例えば、ポリペプチド構造は、天然に存在する抗体のフレームワーク又はその断片若しくはバリアントであり得、若しくはこれらを含むことができ、又は性質上、完全に合成であり得る。様々なポリペプチド構造の例は、以下にさらに記載されている。

0161

ある種の実施形態において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、抗体であり、又はモノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体(本明細書では、「抗体模倣物」と称される場合がある。)、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物(本明細書において、「抗体連結物」と称される場合がある。)及びそれぞれ、各々の一部若しくは断片を含む(但し、これらに限定されない。)抗体に由来する。幾つかの事例において、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的断片である(例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2又はscFv)。様々な構造は、本明細書中にさらに記載及び定義されている。

0162

本明細書中に提供されている抗原結合タンパク質の幾つかは、ヒトPCSK9に特異的に及び/又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号3の残基153から692を有する及び/又はからなるヒトPCSK9タンパク質に、特異的に及び/又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、配列番号3の残基31から152を有する及び/又はからなるヒトPCSK9に、特異的に及び/又は選択的に結合する。幾つかの実施形態において、ABPは、図1Aに図示されているヒトPCSK9タンパク質(配列番号1)に選択的に結合する。幾つかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、PCSK9タンパク質の少なくとも断片及び/又はシグナル配列あり若しくはなしの完全長PCSK9タンパク質に特異的に結合する。

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