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課題

細胞内の外来核酸配列の産物を発現するための方法及び組成物の提供。

解決手段

細胞において内在性ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を不活性化する方法であって、細胞に、特定のアミノ酸配列を有する4つのジンクフィンガー認識領域を含む設計されたジンクフィンガータンパク質DNA結合ドメイン、及び切断ドメイン又は切断ハーフドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入し、それにより当該タンパク質が当該細胞中で発現され、当該タンパク質が内在性dhfr遺伝子の標的部位に結合し、当該dhfr遺伝子を切断する方法。

概要

背景

関連出願の相互参照
本出願は、2005年5月26日に出願された米国特許仮出願第60/702,394号、及び2005年9月26日に出願された米国特許仮出願第60/721,054号の恩恵を請求するものであり、これらの出願の開示は両方とも、全体が本明細書に参照として組入れられている。

背景
ゲノム生物学の関心対象の主要領域は、特に多くのゲノムの完全なヌクレオチド配列が決定されたことを踏まえて、ゲノム配列の標的化された変更である。単に一例を示すと、鎌状赤血球貧血は、ヒトβ-グロビン遺伝子の単ヌクレオチド対の変異により引き起こされる。従ってこの変異体ヌクレオチド対の内在性ゲノムコピー野生型配列へ安定した様式で転換し、正常なβ-グロビンを産生する能力は、機能的β-グロビン遺伝子を変異体β-グロビン遺伝子を含むゲノムへ導入することなどで、鎌状赤血球貧血の治癒を提供するであろう。

相同組換え天然現象を利用し、培養細胞内のゲノム配列を変更する試みがなされている。例えば、Capecchi、(1989) Science, 244:1288-1292;米国特許US 6,528,313及びUS 6,528,314参照のこと。ポリヌクレオチドが、変更されるべき配列を含むゲノム領域に十分な相同性を有するならば、ポリヌクレオチドの配列の一部又は全てを相同組換えによりゲノム配列と交換することは可能であろう。しかし、これらの状況下での相同組換えの頻度は、極めて低い。更に、配列相同性を欠いているゲノム位置での外来ポリヌクレオチドの挿入の頻度は、相同組換えの頻度を数桁上回っている。

外来ポリヌクレオチドへの相同性を有するゲノム領域内の、ゲノムDNAへの二本鎖破損(break)の導入は、培養細胞において数千倍、この位置での相同組換えを刺激することが示されている。Rouetら、(1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106;Choulikaら、(1995) Mol. Cell Biol. 15:1968-1973;Donohoら、(1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078参照のこと。同じく、Johnsonら、(2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201;及び、Yanezら、(1998) Gene Therapy, 5:149-159も参照のこと。これらの方法において、所望のゲノム領域におけるDNA切断は、メガヌクレアーゼ(すなわち、その認識配列が、関心対象のゲノムにおいて生じないか又は稀にしか生じないように非常に大きいエンドヌクレアーゼ)の認識部位の、所望のゲノム領域への挿入により実現された。

しかし、メガヌクレアーゼ切断で刺激された相同組換えは、変更されるげきゲノム領域の近傍の好適なメガヌクレアーゼ認識部位の偶然の存在、又は指示された挿入のいずれかに頼っている。典型的哺乳類ゲノムにおいてメガヌクレアーゼ認識部位は稀であり(又は存在しない)、並びに好適なメガヌクレアーゼ認識部位の挿入は、他のゲノム変更に関連した同じ困難に悩まされるので、これらの方法は広範に適用することができない。

従って、任意のゲノム配列の標的化された変更のための組成物及び方法、又は外来配列のゲノムへの標的化された導入のための組成物及び方法が必要とされている。

概要

細胞内の外来核酸配列の産物を発現するための方法及び組成物の提供。細胞において内在性ジヒドロ葉酸還元酵素(dhfr)遺伝子を不活性化する方法であって、細胞に、特定のアミノ酸配列を有する4つのジンクフィンガー認識領域を含む設計されたジンクフィンガータンパク質DNA結合ドメイン、及び切断ドメイン又は切断ハーフドメインを含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入し、それにより当該タンパク質が当該細胞中で発現され、当該タンパク質が内在性dhfr遺伝子の標的部位に結合し、当該dhfr遺伝子を切断する方法。なし

目的

従ってこの変異体ヌクレオチド対の内在性ゲノムコピーを野生型配列へ安定した様式で転換し、正常なβ-グロビンを産生する能力は、機能的β-グロビン遺伝子を変異体β-グロビン遺伝子を含むゲノムへ導入することなどで、鎌状赤血球貧血の治癒を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

細胞内の外来核酸配列の産物を発現する方法であって、以下のステップ:(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現し、当該第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている;(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質が、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる;並びに(c)この細胞を、外来核酸配列及び関心対象の領域の第一の配列に相同である第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、を含み、ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメイン位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込み及び外来配列の産物の発現を生じる、前記方法。

請求項2

前記外来核酸配列が、cDNAを含む、請求項1記載の方法。

請求項3

前記外来配列が、プロモーターを含む、請求項1又は2記載の方法。

請求項4

前記第一のヌクレオチド配列が、関心対象の領域の第一の配列と同一である、請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。

請求項5

前記ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第二の配列と相同である第二のヌクレオチド配列を更に含む、請求項1〜4のいずれか1項記載の方法。

請求項6

前記第二のヌクレオチド配列が、関心対象の領域の第二の配列と同一である、請求項5記載の方法。

請求項7

前記第一及び第二のヌクレオチド配列が、外来配列に隣接する、請求項5又は6記載の方法。

請求項8

前記ポリヌクレオチドが、プラスミドである、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。

請求項9

前記ポリヌクレオチドが、線状DNA分子である、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。

請求項10

前記関心対象の領域が、細胞クロマチンの接近可能な領域内である、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。

請求項11

前記関心対象の領域が、生存能に必須でないゲノムの領域内である、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。

請求項12

前記関心対象の領域が、転写活性があるゲノムの領域内である、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。

請求項13

前記関心対象の領域が、ヒトRosa26遺伝子である、請求項12記載の方法。

請求項14

前記関心対象の領域が、マウスRosa26遺伝子のヒトホモログである、請求項12記載の方法。

請求項15

前記関心対象の領域が、CCR5遺伝子である、請求項12記載の方法。

請求項16

前記第一及び第二の切断ハーフドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼ由来である、請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。

請求項17

前記IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokI及びStsIからなる群より選択される、請求項16記載の方法。

請求項18

前記関心対象の領域が、染色体内である、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。

請求項19

前記関心対象の領域が、遺伝子を含む、請求項1〜18のいずれか1項記載の方法。

請求項20

前記遺伝子が、変異を含む、請求項19記載の方法。

請求項21

前記変異が、点変異置換欠失、挿入、重複逆位及び転位からなる群より選択される、請求項20記載の方法。

請求項22

前記外来核酸配列が、その遺伝子の野生型配列を含む、請求項20記載の方法。

請求項23

前記外来核酸配列が、その遺伝子の野生型配列の一部を含む、請求項20記載の方法。

請求項24

前記外来核酸配列が、その遺伝子の転写産物のcDNAコピーを含む、請求項20記載の方法。

請求項25

前記外来核酸配列が、siRNAをコードしている、請求項1記載の方法。

請求項26

外来配列を、細胞のゲノム内の関心対象の領域へ組込む方法であって、以下のステップ:(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現し、第一の融合タンパク質が、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている;(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現し、第二の融合タンパク質が、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインが、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる;並びに(c)この細胞を、外来核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触させること、を含み、ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込みを生じる、前記方法。

請求項27

前記組込みが、関心対象の領域の遺伝子発現失活する、請求項26記載の方法。

請求項28

前記外来核酸配列が、1〜50ヌクレオチド長の配列を含む、請求項26又は27記載の方法。

請求項29

前記外来配列が、切断酵素認識部位を含む、請求項26〜28のいずれか1項記載の方法。

請求項30

前記切断酵素が、メガヌクレアーゼである、請求項29記載の方法。

請求項31

前記メガヌクレアーゼが、I-SceIである、請求項30記載の方法。

請求項32

前記メガヌクレアーゼが、非天然の標的部位に結合するように操作されている、請求項30又は31記載の方法。

請求項33

前記関心対象の領域が、細胞クロマチンの接近可能な領域内である、請求項26〜32のいずれか1項記載の方法。

請求項34

前記第一及び第二の切断ハーフドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼ由来である、請求項26〜33のいずれか1項記載の方法。

請求項35

前記IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokI及びStsIからなる群より選択される、請求項34記載の方法。

請求項36

前記細胞が、細胞周期G2期において停止される、請求項1〜35のいずれか1項記載の方法。

請求項37

前記融合タンパク質の少なくとも1種が、切断ハーフ-ドメインの二量体化界面のアミノ酸配列の変更を含む、請求項1〜36のいずれか1項記載の方法。

請求項38

前記細胞が、哺乳類細胞である、請求項1〜37のいずれか1項記載の方法。

請求項39

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項38項記載の方法。

請求項40

前記細胞が、植物細胞である、請求項1〜37のいずれか1項記載の方法。

請求項41

前記外来核酸配列が、検出可能なアミノ酸配列をコードしている、請求項26〜40のいずれか1項記載の方法。

技術分野

0001

技術分野
本開示は、ゲノム操作、遺伝子標的化、標的化された染色体組込み及びタンパク質発現の分野である。

背景技術

0002

関連出願の相互参照
本出願は、2005年5月26日に出願された米国特許仮出願第60/702,394号、及び2005年9月26日に出願された米国特許仮出願第60/721,054号の恩恵を請求するものであり、これらの出願の開示は両方とも、全体が本明細書に参照として組入れられている。

0003

背景
ゲノム生物学の関心対象の主要領域は、特に多くのゲノムの完全なヌクレオチド配列が決定されたことを踏まえて、ゲノム配列の標的化された変更である。単に一例を示すと、鎌状赤血球貧血は、ヒトβ-グロビン遺伝子の単ヌクレオチド対の変異により引き起こされる。従ってこの変異体ヌクレオチド対の内在性ゲノムコピー野生型配列へ安定した様式で転換し、正常なβ-グロビンを産生する能力は、機能的β-グロビン遺伝子を変異体β-グロビン遺伝子を含むゲノムへ導入することなどで、鎌状赤血球貧血の治癒を提供するであろう。

0004

相同組換え天然現象を利用し、培養細胞内のゲノム配列を変更する試みがなされている。例えば、Capecchi、(1989) Science, 244:1288-1292;米国特許US 6,528,313及びUS 6,528,314参照のこと。ポリヌクレオチドが、変更されるべき配列を含むゲノム領域に十分な相同性を有するならば、ポリヌクレオチドの配列の一部又は全てを相同組換えによりゲノム配列と交換することは可能であろう。しかし、これらの状況下での相同組換えの頻度は、極めて低い。更に、配列相同性を欠いているゲノム位置での外来ポリヌクレオチドの挿入の頻度は、相同組換えの頻度を数桁上回っている。

0005

外来ポリヌクレオチドへの相同性を有するゲノム領域内の、ゲノムDNAへの二本鎖破損(break)の導入は、培養細胞において数千倍、この位置での相同組換えを刺激することが示されている。Rouetら、(1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106;Choulikaら、(1995) Mol. Cell Biol. 15:1968-1973;Donohoら、(1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078参照のこと。同じく、Johnsonら、(2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201;及び、Yanezら、(1998) Gene Therapy, 5:149-159も参照のこと。これらの方法において、所望のゲノム領域におけるDNA切断は、メガヌクレアーゼ(すなわち、その認識配列が、関心対象のゲノムにおいて生じないか又は稀にしか生じないように非常に大きいエンドヌクレアーゼ)の認識部位の、所望のゲノム領域への挿入により実現された。

0006

しかし、メガヌクレアーゼ切断で刺激された相同組換えは、変更されるげきゲノム領域の近傍の好適なメガヌクレアーゼ認識部位の偶然の存在、又は指示された挿入のいずれかに頼っている。典型的哺乳類ゲノムにおいてメガヌクレアーゼ認識部位は稀であり(又は存在しない)、並びに好適なメガヌクレアーゼ認識部位の挿入は、他のゲノム変更に関連した同じ困難に悩まされるので、これらの方法は広範に適用することができない。

0007

従って、任意のゲノム配列の標的化された変更のための組成物及び方法、又は外来配列のゲノムへの標的化された導入のための組成物及び方法が必要とされている。

0008

概要
本発明の開示は、細胞内の外来核酸配列の産物(すなわち、タンパク質又はRNA分子)を発現するための方法及び組成物を提供する。外来核酸配列は、例えば、1種又は複数の遺伝子もしくはcDNA分子、又はコード配列もしくは非コード配列の任意の型を含むことができ、予め決定された関心対象の領域が細胞ゲノムへ組込まれるように、細胞へ導入される。外来核酸配列の組込みは、関心対象の領域のゲノムの標的化された二本鎖切断(cleavage)により促進される。切断は、関心対象の領域の選択された任意の配列を結合するように操作することができるジンクフィンガー結合ドメイン、並びに切断ドメイン又は切断ハーフ-ドメインを含む融合タンパク質の使用により、特定の部位に標的化される。このような切断は、切断部位で又はその近傍での、外来ポリヌクレオチド配列の組込みを刺激する。該外来配列の組込みは、相同性-依存型及び相同性-非依存型の両機序を介して進行することができる。

0009

1種又は複数の外来配列の標的化された組込み(相同性-依存型又は相同性-非依存型のいずれか)により、内在性細胞遺伝子の発現を変調するための方法及び組成物も提供される。このような外来配列は、例えば、プロモーター及びエンハンサーのような転写制御配列を含むことができる。変調は、転写活性化(例として、例えば、プロモーター及び/又はエンハンサー配列の挿入による、転写の増強)及び転写抑制(例として、例えば、外来配列の内在性転写調節配列への挿入、転写抑制を促進する配列の挿入、又はコード領域を妨害する配列の挿入による、機能的「ノックアウト」)を含むことができる。

0010

相同性-依存型又は相同性-非依存型の機序のいずれかによる、ゲノムへの外来配列の標的化された挿入のための方法及び組成物も提供され、ここで外来配列は、生成物を発現しないか、又は内在性遺伝子の発現を変調する。例えば、配列-特異的DNA-切断酵素の認識配列は、ゲノム内の予め決定された位置へ導入することができ、その結果この切断酵素によるゲノム内の予め決定された位置での標的化された切断を実現することができる。例証的DNA-切断酵素は、制限酵素、メガヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されるものではない。

0011

ひとつの態様において、細胞内で外来核酸配列産物を発現する方法が、本明細書に開示されており、この方法は:(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現する工程であり、第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインは、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている工程;(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現する工程であり、第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインは、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる工程;並びに、(c)この細胞を、外来核酸配列及び関心対象の領域の第一の配列に相同である第一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触する工程;を含み;ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込み及び外来配列の産物の発現を生じる。

0012

外来核酸配列は、cDNA及び/又はプロモーターを含むことができる。別の実施態様において、外来核酸配列はsiRNAをコードしている。第一のヌクレオチド配列は、関心対象の領域の第一の配列と同一であることができる。

0013

ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、関心対象の領域の第二の配列と相同である第二のヌクレオチド配列を更に含む。第二のヌクレオチド配列は、関心対象の領域の第二の配列と同一であってよい。更に第一及び第二のヌクレオチド配列を含む実施態様において、第一のヌクレオチド配列は、関心対象の領域の第一の配列と同じであってよく、及び第二のヌクレオチド配列は、関心対象の領域の第二の配列と相同であるが同一でなくてよい。本明細書に開示された任意の方法において、第一及び第二のヌクレオチド配列は、外来配列に隣接する。

0014

ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、プラスミドである。別の実施態様において、ポリヌクレオチドは、線状DNA分子である。

0015

本明細書に開示された任意の方法において、関心対象の領域は、細胞クロマチン染色体、及び/又は遺伝子(例えば、点変異置換欠失、挿入、重複逆位及び/又は転位のような変異を含む遺伝子)の接近可能な領域内である。ある実施態様において、外来核酸配列は、遺伝子の野生型配列を含む。別の実施態様において、外来核酸配列は、遺伝子の野生型配列の一部を含む。更に別の実施態様において、外来核酸配列は、遺伝子の転写産物のcDNAコピーを含む。

0016

本明細書に開示された任意の方法において、関心対象の領域は、生存能に必須でないゲノムの領域内である。別の実施態様において、関心対象の領域は、転写活性があるゲノムの領域内である。関心対象の領域は、転写活性があり及び生存能に必須でないゲノムの領域内(例えば、ヒトRosa26ゲノム、マウスのRosa26遺伝子のヒトホモログ又はCCR5遺伝子)である。

0017

別の態様において、外来配列を細胞のゲノム内の関心対象の領域へ組込む方法が、本明細書において提供され、この方法は:(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現する工程であり、第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインは、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている工程;(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現する工程であり、第二の融合タンパク質は第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインは、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる工程;並びに、(c)この細胞を、外来核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触する工程;を含み;ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込みを生じる。ある実施態様において、組込みは、関心対象の領域の遺伝子発現失活する。外来核酸配列は、例えば、1〜50ヌクレオチド長の配列を含む。更に外来核酸配列は、検出可能なアミノ酸配列をコードしてよい。関心対象の領域は、細胞クロマチンが接近可能な領域内であってよい。

0018

本明細書に開示された任意の方法において、第一及び第二の切断ハーフドメインは、IIS型制限エンドヌクレアーゼ、例えばFokI又はStsI由来である。更に本明細書に開示された任意の方法において、融合タンパク質の少なくとも1種は、切断ハーフ-ドメインの二量体化界面のアミノ酸配列の変更を含んでよい。

0019

本明細書に開示された任意の方法において、細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞であることができる。更に細胞は、細胞周期G2期において停止されてよい。

0020

従って本主題は、以下の実施態様を含むが、これらに限定されるものではない:
1.細胞内で外来核酸配列の産物を発現する方法であり、この方法は:
(a)この細胞内の第一の融合タンパク質を発現する工程であり、第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフドメインを含み、ここで第一のジンクフィンガー結合ドメインは、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第一の標的部位に結合するように操作されている工程;
(b)この細胞内の第二の融合タンパク質を発現する工程であり、第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフドメインを含み、ここで第二のジンクフィンガー結合ドメインは、この細胞のゲノム内の関心対象の領域の第二の標的部位へ結合し、ここで第二の標的部位は第一の標的部位とは異なる工程;並びに、
(c)この細胞を、外来核酸配列を含むポリヌクレオチドと接触する工程;を含み;
ここで第一の融合タンパク質の第一の標的部位への結合、及び第二の融合タンパク質の第二の標的部位への結合は、細胞のゲノムが関心対象の領域で切断されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めし、これにより関心対象の領域の細胞のゲノムへの外来配列の組込み及び外来配列の産物の発現を生じる。

0021

2.外来核酸配列が、cDNAを含む、第1項記載の方法。
3.外来配列が、プロモーターを含む、第1項記載の方法。
4.ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第一の配列と同一である第一のヌクレオチド配列を更に含む、第1項記載の方法。
5. ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第二の配列と同一である第二のヌクレオチド配列を更に含む、第4項記載の方法。
6. ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第一の配列と相同であるが同一でない第一のヌクレオチド配列を更に含む、第1項記載の方法。
7. ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第二の配列と相同であるが同一でない第二のヌクレオチド配列を更に含む、第6項記載の方法。
8. ポリヌクレオチドが、関心対象の領域の第一の配列と同一である第一のヌクレオチド配列及び関心対象の領域の第二の配列と相同であるが同一でない第二のヌクレオチド配列を更に含む、第1項記載の方法。
9. 第一及び第二のヌクレオチド配列が、外来配列の側方に位置する、第5項記載の方法。
10. 第一及び第二のヌクレオチド配列が、外来配列の側方に位置する、第7項記載の方法。

0022

11. 第一及び第二のヌクレオチド配列が、外来配列の側方に位置する、第8項記載の方法。
12.ポリヌクレオチドが、プラスミドである、第1項記載の方法。
13. ポリヌクレオチドが、線状DNA分子である、第1項記載の方法。
14.関心対象の領域が、細胞クロマチンの接近可能な領域内である、第1項記載の方法。
15. 関心対象の領域が、生存能に必須でないゲノムの領域内である、第1項記載の方法。
16. 関心対象の領域が、転写活性があるゲノムの領域内である、第1項記載の方法。
17. 関心対象の領域が、転写活性があるが生存能に必須でないゲノムの領域内である、第1項記載の方法。
18. 関心対象の領域が、ヒトRosa26遺伝子である、第17項記載の方法。
19. 関心対象の領域が、マウスRosa26遺伝子のヒトホモログである、第17項記載の方法。
20. 第一及び第二の切断ハーフドメインが、IIS型制限エンドヌクレアーゼ由来である、第1項記載の方法。

0023

21. IIS型制限エンドヌクレアーゼが、FokI及びStsIからなる群より選択される、第1項記載の方法。
22.関心対象の領域が、染色体内である、第1項記載の方法。
23. 関心対象の領域が、遺伝子を含む、第1項記載の方法。
24. 遺伝子が、変異を含む、第13項記載の方法。
25. 変異が、点変異、置換、欠失、挿入、重複、逆位及び転位からなる群より選択される、第14項記載の方法。
26.外来核酸配列が、その遺伝子の野生型配列を含む、第24項記載の方法。
27. 外来核酸配列が、その遺伝子の野生型配列の一部を含む、第24項記載の方法。
28. 外来核酸配列が、その遺伝子の転写産物のcDNAコピーを含む、第24項記載の方法。
29. 外来核酸配列が、siRNAをコードしている、第1項記載の方法。
30.細胞が、細胞周期のG2期において停止される、第1項記載の方法。

0024

31.融合タンパク質の少なくとも1種が、切断ハーフ-ドメインの二量体化界面のアミノ酸配列の変更を含む、第1項記載の方法。
32.細胞が、哺乳類細胞である、第1項記載の方法。
33. 細胞が、ヒト細胞である、第32項記載の方法。

図面の簡単な説明

0025

図1は、タンパク質のアミノ末端部分をコードしているヒトhSMC1L1遺伝子の一部の二本鎖型のヌクレオチド配列(配列番号:1)、及びコードされたアミノ酸配列(配列番号:2)を示す。hSMC1-特異的ZFP標的配列には、下線を付けている(各DNA鎖にひとつ)。
図2は、hSMC1遺伝子の標的化された切断のためのZFP-FokI融合をコードしているプラスミドの概略図を示す。
図3は、hSMC1遺伝子の概略図を示す。図3のAは、hSMC1遺伝子を含むヒトX染色体の一部の概略を示す。図3のBは、上流領域(+1の左側)、第一のエクソン(+1と矢印で表示した「SMC1コード配列」の右端の間)及び第一のイントロンの一部を含むhSMC1遺伝子の一部の概略を示す。最初の増幅プライマー及び染色体-特異的プライマーに相同な配列の位置(表3参照)も提供する。図3のCは、SMC1開始コドンの領域内のヒトX染色体のヌクレオチド配列(配列番号:3)、コードされたアミノ酸配列(配列番号:4)、及びSMC1-特異的ジンクフィンガータンパク質の標的部位を示す。図3のDは、ドナー配列及び染色体配列の間の差異に下線を付けた、ドナー分子の対応する領域の配列(配列番号:5)を示す。ドナー-特異的増幅プライマーに含まれた配列(表3)は、二重下線により示した。
図4は、hSMC1ドナー構築体の概略図を示す。
図5は、形質移入されたHEK293細胞由来のDNAのPCR分析を示す。レーンは左側から、GFPをコードしているプラスミド(対照プラスミド)により形質移入された細胞、各々ふたつのhSMC1-特異的ZFP-FokI融合タンパク質をコードしているふたつのプラスミドにより形質移入された細胞(ZFPのみ)、2種の濃度のhSMC1ドナープラスミドにより形質移入された細胞(ドナーのみ)、並びに2種のZFP-コードしているプラスミド及びドナープラスミドにより形質移入された細胞(ZFP+ドナー)の結果を示す。詳細は実施例1を参照のこと。
図6は、標的化された相同組換えにより作出された変異したhSMC1遺伝子由来の増幅産物のヌクレオチド配列(配列番号:6)を示す。増幅産物がクローニングされたベクター由来の配列には、一本下線を付け、ドナー分子内に存在しない染色体配列には、破線で下線を付け(ヌクレオチド32-97)、ドナー及び染色体の共通配列には、下線を付けず(ヌクレオチド98-394及び402-417)、並びにドナー独自の配列には、二重下線を付けた(ヌクレオチド395-401)。小文字は、染色体とドナーの間で異なる配列を表す。
図7は、第二のイントロンの3'末端及び第三のエクソンの5'末端を含むヒトIL2Rγ遺伝子の一部のヌクレオチド配列(配列番号:7)及び第三のエクソンの示された部分によりコードされたアミノ酸配列(配列番号:8)を示す。IL2Rγ-特異的ZFPの第二の対の標的配列には、下線を付けた。詳細については実施例2を参照のこと。
図8は、IL2Rγ遺伝子の標的化された切断のためのZFP-FokI融合体をコードしているプラスミドの概略図を示す。
図9は、IL2Rγ遺伝子の概略図を示す。図9のAは、IL2Rγ遺伝子を含むヒトX染色体の一部の概略を示す。図9のBは、第二のイントロンの一部、第三のエクソン及び第三のイントロンの一部を含む、IL2Rγ遺伝子の一部の概略を示す。最初の増幅プライマー及び染色体-特異的プライマーに相同な配列の位置(表5参照)も提供されている。図9のCは、IL2Rγ遺伝子の第三のエクソン領域のヒトX染色体のヌクレオチド配列(配列番号:9)、コードされたアミノ酸配列(配列番号: 10)、及びIL2Rγ-特異的ジンクフィンガータンパク質の第一の対の標的部位を示す。図9のDは、ドナー配列及び染色体配列の間の差異に下線を付けた、ドナー分子の対応する領域の配列(配列番号:11)を示す。ドナー-特異的増幅プライマーに含まれた配列(表5)は、二重上線により示される。
図10は、IL2Rγドナー構築体の概略図を示す。
図11は、形質移入されたK652細胞由来のDNAのPCR分析を示す。レーンは左側から、各々IL2Rγ-特異的ZFP-FokI融合タンパク質の対のひとつをコードしている、ふたつのプラスミドにより形質移入された細胞(ZFPのみ、レーン1)、2種の濃度のIL2Rγドナープラスミドにより形質移入された細胞(ドナーのみ、レーン2及び3)、並びに2種のZFP-コードしているプラスミド及びドナープラスミドにより形質移入された細胞(ZFP+ドナー、レーン4-7)の結果を示す。IL2Rγ-特異的ZFP-FokI融合体の2種の対(「対1」及び「対2」と特定)の各々を使用し、両方の対の使用は、診断的増幅産物の生成を生じた(図において「予想されるキメラ産物」と表示)。詳細は実施例2を参照のこと。
図12は、標的化された相同組換えにより作出された変異したIL2Rγ遺伝子由来の増幅産物のヌクレオチド配列(配列番号:12)を示す。増幅産物がクローニングされたベクター由来の配列には、一本下線を付け、ドナー分子内に存在しない染色体配列には、破線で下線を付け(ヌクレオチド460-552)、ドナー及び染色体の共通配列には、下線を付けず(ヌクレオチド32-42及び59-459)、並びにドナー配列を染色体配列から識別するヌクレオチドを含む一続きの配列には、二重下線を付けた(ヌクレオチド44-58)。小文字は、その配列が、染色体とドナーの間で異なるヌクレオチドを表す。
図13は、コアプロモーターセグメント、第一の2個のエクソン及び第一のイントロンをコードしているヒトβグロビン遺伝子の一部のヌクレオチド配列(配列番号:13)を示す。染色体11(BLAT, UCSC Genome Bioinformaticssaitoサイト)上の5212541位のA(太字及び下線付き)をTに変化するミスセンス変異は、鎌状赤血球貧血を生じる。第一のジンクフィンガー/FokI融合タンパク質は、一次接触が下線の付いた12-ヌクレオチド配列AAGGTGAACGTG(配列番号:13のヌクレオチド305-316)とであるようにデザインし、並びに第二のジンクフィンガー/FokI融合タンパク質は、一次接触が下線の付いた12-ヌクレオチド配列CCGTTACTGCCC(配列番号:13のヌクレオチド325-336)の相補体とであるようにデザインした。
図14は、ヒトβグロビン遺伝子の標的化された切断の ZFP-FokI融合体をコードしているプラスミドの概略図である。
図15は、上流領域、第一及び第二のエクソン、第一のイントロン並びにプライマー結合部位を示す、クローニングされたヒトβグロビン遺伝子の概略図である。
図16は、βグロビンドナー構築体pCR4-TOPO-HBBドナーの概略図である。
図17は、β-グロビン-特異的ZFPヌクレアーゼのふたつの対及びβグロビンドナープラスミドにより形質移入された細胞のDNAのPCR分析を示す。左側のパネルは、「初回amp1」及び「初回amp2」プライマー(表7)が増幅に使用された負荷対照である。右側パネルに示された実験において、「染色体-特異的」及び「ドナー-特異的」プライマー(表7)が増幅に使用された。各パネルの最も左側のレーンは、分子量マーカーを含み、次のレーンは、-形質移入された細胞から得られた増幅産物を示す。残りのレーンは、左から右へ、以下で形質移入された細胞からの増幅産物を示す:GFP-コードしているプラスミド、各ZFP/FokI-コードしているプラスミド100ng、各ZFP/FokI-コードしているプラスミド200ng、ドナープラスミド200ng、ドナープラスミド600ng、ドナープラスミド200ng+各ZFP/FokI-コードしているプラスミド100ng、及びドナープラスミド600ng +各ZFP/FokI-コードしているプラスミド200ng。
図18は、標的化された相同組換えにより作出された変異したβグロビン遺伝子由来の増幅産物のヌクレオチド配列(配列番号:14)を示す。ドナー分子内に存在しない染色体配列には破線で下線を付け(ヌクレオチド1-72)、ドナー及び染色体の共通配列には、下線を付けず(ヌクレオチド73-376)、並びにドナー配列を染色体配列から識別するヌクレオチドを含む一続きの配列には、二重下線を付けた(ヌクレオチド377-408)。小文字は、その配列が、染色体とドナーの間で異なるヌクレオチドを表す。
図19は、インターロイキン-2受容体γ鎖(IL-2Rγ)遺伝子の第五のエクソンの一部のヌクレオチド配列(配列番号:15)を示す。同じく5-8及び5-10 ZFP/FokI融合タンパク質の標的配列も示される(下線付き)。詳細は実施例5を参照のこと。
図20は、ヒトIL-2Rγ遺伝子のエクソン5に標的化された5-8 ZFP/FokI融合体のアミノ酸配列(配列番号:16)を示す。アミノ酸残基1-17は、核局在化配列(NLS、下線付き)を含み;残基18-130は、ZFP部分を含み、成分ジンクフィンガーの認識領域は太字で示し;ZFP-FokIリンカー(ZCリンカー、下線付き)は、残基131から140まで伸び、及びFokI切断ハーフ-ドメインは、残基141で始まり、残基336のタンパク質の末端まで伸びる。Q486E変異を作出するために変更された残基は、下線の付いた太字で示した。
図21は、ヒトIL-2Rγ遺伝子のエクソン5に標的化された5-10 ZFP/FokI融合体のアミノ酸配列(配列番号:17)を示す。アミノ酸残基1-17は、核局在化配列(NLS、下線付き)を含み;残基18-133は、ZFP部分を含み、成分ジンクフィンガーの認識領域は太字で示し;ZFP-FokIリンカー(ZCリンカー、下線付き)は、残基134から143まで伸び、及びFokI切断ハーフ-ドメインは、残基144で始まり、残基339のタンパク質末端まで伸びる。E490K変異を作出するために変更された残基は、下線の付いた太字で示した。
図22は、Aequorea victoriaGFP遺伝子由来の増強型緑色蛍光タンパク質遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号:18)を示す(Tsien (1998) Ann. Rev. Biochem. 67:509-544)。ATG開始コドンに加え、変異された領域には、下線を付けた。
図23は、変異欠損eGFP遺伝子のヌクレオチド配列(配列番号:19)を示す。ZFP-ヌクレアーゼの結合部位には、下線を付け、及びこれらの結合部位間の領域は、修飾された領域に対応している。
図24は、eGFP遺伝子に標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているプラスミドの構造を示す。
図25は、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼによる変異体eGFP遺伝子の標的化されたDNA切断を分析するために使用した10%アクリルアミドゲルオートラジオグラフを示す。詳細は実施例8を参照のこと。
図26は、プラスミドpcDNA4/TO/GFPmutの構造を示す(実施例9参照)。
図27は、ヒトHEK293細胞の形質移入から得られた様々な細胞株における、GAPDHmRNAに対し標準化された、eGFPmut mRNAのレベルを示す。白色バーは、未処理細胞のレベルを示し;黒色バーは、2ng/mlドキシサイクリンにより処理された細胞のレベルを示す。詳細は実施例9を参照のこと。
図28は、プラスミドpCR(R)4-TOPO-GFPドナー5の構造を示す。詳細は実施例10を参照のこと。
図29は、pCR(R)4-TOPO-GFPドナー5のeGFP挿入断片のヌクレオチド配列(配列番号:20)を示す。この挿入断片は、開始コドンを欠いている、修飾されない増強型緑色蛍光タンパク質の一部をコードしている配列を含む。詳細は実施例10を参照のこと。
図30は、48時間の100ng/mlノコダゾールにより、形質移入の24時間後細胞周期のG2期で停止した、2種のZFPヌクレアーゼをコードしているプラスミド並びにドナー配列をコードしているプラスミドにより形質移入されたT18細胞のFACS追跡を示す。培地は交換し、細胞は更に48時間回収させ、遺伝子補正は、FACS分析により測定した。詳細は実施例11を参照のこと。
図31は、48時間の0.2μMビンブラスチンにより、形質移入の24時間後細胞周期のG2期で停止した、2種のZFPヌクレアーゼをコードしているプラスミド並びにドナー配列をコードしているプラスミドにより形質移入されたT18細胞のFACS追跡を示す。培地は交換し、細胞は更に48時間回収させ、遺伝子補正は、FACS分析により測定した。詳細は実施例11を参照のこと。
図32は、pCR(R)4-TOPOの1,527ヌクレオチドeGFP挿入断片のヌクレオチド配列(配列番号:21)を示す。この配列は、開始コドンを欠いている、修飾されない増強型緑色蛍光タンパク質をコードしている。詳細は実施例13を参照のこと。
図33は、内在性ヒトIL-2Rγ遺伝子の校正頻度を測定するために使用されるアッセイの概略図を示す。詳細は実施例14を参照のこと。
図34は、標的化された切断及び相同組換えによる内在性細胞遺伝子の校正頻度を測定するためのアッセイにおいて使用されたアクリルアミドゲルのオートラジオグラフを示す。「GFP」と表示したレーンは、細胞がeGFP-コードしているベクターにより形質移入された対照からのアッセイ結果を示し;「ZFPのみ」と表示したレーンは、細胞が2種のZFP/ヌクレアーゼ-コードしているプラスミド(各50ng)により形質移入されたがドナー配列によりされなかった別の対照実験の結果を示す。「ドナーのみ」と表示したレーンは、細胞が、ドナープラスミド1μgにより形質移入されたがZFP/ヌクレアーゼ-コードしているプラスミドによりされなかった対照実験の結果を示す。実験レーンにおいて、50Zは、50ngの各ZFP/ヌクレアーゼ発現プラスミドにより形質移入された細胞を意味し、100Zは、100ngの各ZFP/ヌクレアーゼ発現プラスミドにより形質移入された細胞を意味し、0.5Dは、0.5μgのドナープラスミドにより形質移入された細胞を意味し、並びに1Dは、1.0μgのドナープラスミドにより形質移入された細胞を意味する。「+」は、0.2μMビンブラスチンに曝露された細胞を意味し;「−」は、ビンブラスチンに曝露されなかった細胞を意味する。「wt」は、野生型染色体IL-2Rγ遺伝子を含む染色体から得られた増幅産物のBsrBI消化後に得られた断片を意味し;「rflp」は、相同組換えにより組込まれたドナープラスミド由来の配列を含む染色体から得られた増幅産物のBsrBI消化後に得られたふたつの断片(ほぼ等しい分子量)を意味する。
図35は、K562細胞におけるヒトIL-2Rγ遺伝子座での標的化された組換えを測定するアッセイにおいて使用したゲルの4時間曝露のオートラジオグラフ像を示す。「wt」は、未変性のK562 IL-2Rγ配列を含む染色体DNAの診断用であるバンドを特定し;「rflp」は、ドナーDNA分子内に存在する変更されたIL-2Rγ配列を含む染色体DNAの二重診断用を特定する。レーン上の印「+」は、細胞が0.2μMビンブラスチンで処理されたことを示し;印「−」は、細胞がビンブラスチンで処理されなかったことを示す。「ZFP+ドナー」レーンの数値は、ドナーDNA分子に当初存在する配列を含む総染色体DNAの割合を示し、製造業者マニュアル(Molecular Dynamics ImageQuant User's Guide;パート218-415)の第8章に説明されたように、Molecular Dynamics' ImageQuant、バージョン5.1ソフトウェアの「peak finder, automatic baseline」関数を用い算出された。「Untr」は、形質移入されない細胞を示す。更なる詳細は実施例15を参照のこと。
図36は、K562細胞におけるヒトIL-2Rγ遺伝子座での標的化された組換えを測定するアッセイにおいて使用したゲルの4時間曝露のオートラジオグラフ像を示す。「wt」は、未変性のK562 IL-2Rγ配列を含む染色体DNAの診断用であるバンドを特定し;「rflp」は、ドナーDNA分子内に存在する変更されたIL-2Rγ配列を含む染色体DNAの二重診断用を特定する。レーン上の印「+」は、細胞が0.2μMビンブラスチンで処理されたことを示し;印「−」は、細胞がビンブラスチンで処理されなかったことを示す。「ZFP+ドナー」レーンの数値は、ドナーDNA分子に当初存在する配列を含む総染色体DNAの割合を示し、実施例35に説明されたように算出された。更なる詳細は実施例15を参照のこと。
図37は、ヒトIL-2Rγ遺伝子に特異的な断片でプローブされたDNAブロットの4時間曝露のオートラジオグラフを示す。この画像の右側の矢印は、その配列が相同組換えにより変更されているゲノムDNAに対応するバンドの位置を示す。レーン上の印「+」は、細胞が0.2μMビンブラスチンで処理されたことを示し;印「−」は、細胞がビンブラスチンで処理されなかったことを示す。「ZFP+ドナー」レーンの数値は、ドナーDNA分子に当初存在する配列を含む総染色体DNAの割合を示し、実施例35に説明されたように算出された。更なる詳細は実施例15を参照のこと。
図38は、CD34+ヒト骨髄細胞におけるヒトIL-2Rγ遺伝子座での標的化された組換えを測定するアッセイにおいて使用されたゲルのオートラジオグラフ像を示す。左側パネルは、正常ヒトゲノムDNA(MaeII部位を含む)の示された割合がJurkat細胞由来のゲノムDNA(MaeII部位を含まない)に添加され、この混合物がPCRにより増幅され、放射標識された増幅産物を作出し、並びに増幅産物がMaeIIにより消化された、参照標準を示す。「wt」は、未消化のDNAを表すバンドを特定し;「rflp」は、MaeII消化から生じるバンドを特定する。右側パネルは、CD34+細胞が、BsrBI部位を含むドナーDNA及びジンクフィンガー-FokI融合体エンドヌクレアーゼをコードしているプラスミドにより形質移入された実験の結果を示す。その後関連のあるゲノム領域は、増幅されかつ標識され、標識された増幅産物はBsrBIで消化される。「GFP」は、GFP-コードしているプラスミドで形質移入された対照細胞を示し;「ドナーのみ」は、ドナーDNAのみで形質移入された対照細胞を示し、及び「ZFP+ドナー」は、ドナーDNA及びジンクフィンガー/FokIヌクレアーゼをコードしているプラスミドで形質移入された細胞を示す。「wt」は、未変性のIL-2Rγ配列を含む染色体DNAの診断用であるバンドを特定し;「rflp」は、ドナーDNA分子に存在する変更されたIL-2Rγ配列を含む染色体DNAの診断用であるバンドを特定する。最も右側のレーンは、DNAサイズマーカーを含む。更なる詳細は実施例16を参照のこと。
図39は、Ku70-標的化されたsiRNAにより形質移入された細胞におけるKu70タンパク質レベル試験するために使用される免疫ブロット法の画像を示す。T7細胞株(実施例9、図27)は、2種の異なるsiRNAプールからの各siRNAのふたつの濃度で形質移入された(実施例18参照)。レーン1:siRNAプールDの70ng;レーン2:siRNAプールDの140ng;レーン3:siRNAプールEの70ng;レーン4:siRNAプールEの140ng。「Ku70」は、Ku70タンパク質を表すバンドを示し;「TFIIB」は、対照として使用されるTFIIB転写因子を表すバンドを示す。
図40は、ヒトβ-グロビン遺伝子;sca-29b(配列番号:22);sca-36a(配列番号:23);sca-36b(配列番号:24)、及びsca-36c(配列番号:25)へ標的化された4種のジンクフィンガードメインのアミノ酸配列を示す。sca-29bドメインの標的部位はひとつのDNA鎖上であり、sca-36a、sca-36b及びsca-36cドメインの標的部位は、反対鎖にある。実施例20を参照のこと。
図41は、配列-特異的DNA切断に関してジンクフィンガー/FokI融合体ヌクレアーゼ(ZFN)の様々な組合せが試験された、in vitroアッセイの結果を示す。「U」と表示したレーンは、DNA鋳型試料を示す。次の4つのレーンは、DNA鋳型の4種のβ-グロビン-標的化されたZFNの各々とのインキュベーションの結果を示す(これらのZFNの特徴については実施例20参照)。最も右側の3個のレーンは、鋳型DNAのsca-29b ZFN及びsca-36a、sca-36b又はsca-36c ZFNのひとつ(それらは全て、sca-29bが標的化された鎖と反対鎖に標的化される。)とのインキュベーションの結果を示す。
図42は、ドキシサイクリン濃度(横座標上に示した)の関数としてのT18細胞におけるeGFP mRNAのレベル(バー)を示す。各バー上の数値は、ドキシサイクリン濃度の関数としての、ドナーDNA及びeGFP-標的化されたジンクフィンガーヌクレアーゼをコードしているプラスミドにより形質移入された細胞における、eGFP変異の補正率(%)を表す。
図43は、様々な融合タンパク質立体配置の概略図を示す。図43のAは、ジンクフィンガードメインがN-末端の最も近くであり、及びFokI切断ハーフ-ドメインがC-末端の最も近くであり、その5'末端が互いに近接している反対鎖上のDNA標的部位へ結合している、2種の融合タンパク質を示す。図43のBは、FokI切断ハーフ-ドメインがN-末端の最も近くであり、及びジンクフィンガードメインがC-末端の最も近くであり、その3'末端が互いに近接している反対鎖上のDNA標的部位へ結合している、2種の融合タンパク質を示す。図43のCは、FokI切断ハーフ-ドメインがN-末端の最も近くであり、及びジンクフィンガードメインがC-末端の最も近くである第一のタンパク質、並びにジンクフィンガードメインがN-末端の最も近くであり、及びFokI切断ハーフ-ドメインがC-末端の最も近くである第二のタンパク質が、同じ鎖のDNA標的部位へ結合しているものを示し、ここで第一のタンパク質の標的部位は、第二のタンパク質の結合部位の上流(すなわち、5'側)である。 全ての例において、3個のフィンガータンパク質は、9個のヌクレオチド標的部位に結合するように示されている。DNA鎖の5'及び3'極性が示され、及び融合タンパク質のN-末端が特定されている。
図44は、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼによるモデル基質の切断がアッセイされたアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。レーン1は、切断されない基質の移動を示す。レーン2は、IL2-1Rジンクフィンガー/FokI融合タンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。レーン3は、5-9DRジンクフィンガー/FokI融合タンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。レーン4は、両方のタンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。基質及びその切断生成物のおおよそのサイズ(塩基対)は、画像の右側に示されている。画像の下側に、5-9D及びIL2-1ジンクフィンガー結合ドメインの結合部位を含む基質の部分のヌクレオチド配列(配列番号:211)が示される。結合部位は特定され、かつ下線により示される。
図45は、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼによるモデル基質の切断がアッセイされたアクリルアミドゲルのオートラジオグラフである。レーン1は、切断されない基質の移動を示す。レーン2は、IL2-1Rジンクフィンガー/FokI融合タンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。レーン3は、IL2-1Rジンクフィンガー/FokI融合タンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。レーン4は、5-9DRジンクフィンガー/FokI融合タンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。レーン5は、IL2-1R及び5-9DRの両方の融合タンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。レーン6は、IL2-1C及び5-9DRの両方のタンパク質とのインキュベーション後の基質を示す。基質及びその切断生成物のおおよそのサイズ(塩基対)は、画像の右側に示されている。画像の下側の、5-9D及びIL2-1ジンクフィンガー結合ドメインの結合部位を含む基質の部分のヌクレオチド配列(配列番号:212)が示される。結合部位は特定され、かつ下線により示される。
図46は、IL-2Rγ遺伝子のエクソン5由来の配列の挿入を含む変異体eGFPコード配列を含むプラスミドの概略図である。詳細は実施例29を参照のこと。
図47は、形質移入されたK562細胞由来のDNAの増幅産物が、制限酵素StuIと共にインキュベーションされたゲルのオートラジオグラフ像を示す。レーンの上の見出しは、GFP-コードプラスミドにより形質移入された細胞由来のDNA(GFP);5-8G及び5-9D ZFP/FokI融合タンパク質をコードしているベクターにより形質移入された細胞由来のDNA(ZFN);IL-2Rγ遺伝子のエクソン5に相同な配列の750ヌクレオチド対のいずれかの側上で側方に位置する、12-ヌクレオチド対の外来配列(StuI認識部位を含む)を含むプラスミドにより形質移入された細胞由来のDNAであり、ここでこれら2種のエクソン5-相同配列は、野生型IL-2Rγ遺伝子において互いに隣接しているもの(ドナー);並びに、5-8G及び5-9D ZFP/FokI融合タンパク質をコードしているベクター並びにIL-2Rγ遺伝子のエクソン5及び隣接領域に相同な配列の750ヌクレオチド対のいずれかの側の上の側方に位置する、12-ヌクレオチド対の外来配列(StuI認識部位を含む)を含むプラスミドにより形質移入された細胞由来のDNAであり、ここでこれら2種のエクソン5-相同配列は、野生型IL-2Rγ遺伝子において互いに隣接しているもの(ZFN+ドナー)を示す。野生型IL-2R配列を含む染色体(「WT」)及び外来配列が組込まれた染色体(「+patch」)から生じるバンドが示されている。最も右側のレーンは、分子量マーカーを含む。実施例33も参照のこと。
図48は、形質移入されたK562細胞由来のDNAの増幅産物が分析されたゲルの画像を示す。レーンの上の見出しは、5-8G及び5-9D ZFP/FokI融合タンパク質をコードしているベクターにより形質移入された細胞由来のDNA(ZFN);eGFPをコードしている720ヌクレオチド対のオープンリーディングフレームを含むプラスミドで形質移入された細胞由来のDNA(ドナー1);eGFPオープンリーディングフレームに含まれた924ヌクレオチド対配列及び下流のポリアデニル化シグナルを含むプラスミドで形質移入された細胞由来のDNA(ドナー2);5-8G及び5-9D ZFP/FokI融合タンパク質をコードしているベクター並びにeGFPをコードしている720ヌクレオチド対オープンリーディングフレームを含むプラスミドにより形質移入された細胞由来のDNA(ZFN+ドナー1);並びに、5-8G及び5-9D ZFP/FokI融合タンパク質をコードしているベクター及びeGFP オープンリーディングフレーム及び下流ポリアデニル化シグナルが含まれた924ヌクレオチド対配列を含むプラスミドにより形質移入された細胞由来のDNA(ZFN+ドナー2)を示す。上側パネルの最も左側及び最も右側のレーンは、分子量マーカーを含む。上側パネルは、臭化エチジウム-染色されたゲルの写真であり;下側パネルは、標識された増幅産物が分析される別の実験からのゲルのオートラジオグラフを示す。実施例34も参照のこと。
図49は、「治療ハーフ-遺伝子」が、内在性ヒトIL-2Rγ遺伝子に導入される実験を説明する概略図である。上側ラインは、染色体のIL-2Rγ配列を示し、中央ラインはドナー配列を示し、エクソンはボックスで示され及びイントロンは水平線により示されている。ボックス内の数値は、IL-2Rγ遺伝子のエクソンを特定し、「5」は、染色体のIL-2R遺伝子の5番目のエクソンを表し、「5u」は、5番目のエクソンの上流部分を表し、「5d」は、5番目のエクソンの下流部分を表し、並びに「5d(m)」は、いくつかのサイレント配列変化(すなわち、コードされたアミノ酸配列を変更しない変化)を含む5番目のエクソンの下流部分を表す。斜線は、ドナー配列と染色体配列の間の相同性の領域の境界を定める。下側ラインは、エクソン5d(m)、6、7、及び8が、染色体遺伝子の5番目のエクソン内に挿入された相同組換えの予想される生成物を示す。実施例35も参照のこと。
図50は、形質移入されたK562細胞由来のDNAの増幅産物が分析されたゲルの画像を示す。レーンの上の見出しは、緑色蛍光タンパク質をコードしているベクターで形質移入された対照細胞由来のDNA(「GFP」)、並びに5-8G及び5-9D ZFP/FokI融合タンパク質をコードしているベクター及びIL-2Rγ遺伝子のエクソン5及び周囲領域と相同な配列の750ヌクレオチドのいずれかの側上の側方に位置したIL-2Rγ遺伝子のエクソン5部分及びエクソン6、7及び8を含む720-ヌクレオチドcDNA構築体を含むプラスミドで形質移入された実験細胞由来のDNAであり、ここで2種のエクソン5-相同配列は、野生型IL-2Rγ遺伝子において互いに隣接しているもの(ZFN+ドナー)を示す。野生型IL-2R配列を含む染色体(「WT」)及び外来配列が組込まれている染色体(「+ORF」)から生じるバンドを示している。実施例35も参照のこと。
図51は、7.7kbp抗体発現構築体が、内在性染色体のIL-2Rγ遺伝子へ挿入された、実験のデザイン及び結果を示す。この図の上側部分は、7.7キロベース対発現構築体(影付き)の内在性染色体のIL-2Rγ遺伝子のエクソン5への相同性-依存型に標的化された組込みの結果を示す概略図である。矢印は、標的化された組込みから生じる外来配列と内在性配列の間の接合を検出するために使用された増幅プライマーの位置及び極性を示す。この図の下側部分は、増幅産物が分析された臭化エチジウム-染色されたゲルの写真を示す。左側パネルは、上流接合を検出するプライマー(プライマーセットA)を使用し増幅された、細胞DNAの産物を示し、及び右側パネルは、下流接合を検出するプライマー(プライマーセットB)を使用し増幅された、細胞DNAの産物を示す。増幅の鋳型として使用されるDNA試料は、以下のように、ゲル下に特定される:緑色蛍光タンパク質をコードしているベクターで形質移入された細胞由来のDNA(GFP);7.7kbp発現構築体を含むドナーDNA分子のみで形質移入された細胞由来のDNA(don);5-8G及び5-9D ZFF/FokI融合タンパク質をコードしているベクターにより及びドナーDNA分子により形質移入された細胞由来のDNA(ZFN+ドナー)。ドナーDNAのトポロジー(環状又は線状)も、示されている。実施例36も参照のこと。
図52は、CHO DHFR遺伝子由来の増幅産物が、Ce1-1アッセイを使用し、ミスマッチについて分析された、ゲルのオートラジオグラフである。増幅産物は、野生型CHO細胞DNA(W)又はジンクフィンガーヌクレアーゼで処理されたCHO細胞由来のDNA(Mu)から得、その後ゲルの上に示されたように、Cel-1ヌクレアーゼに曝露される(+)か、又は曝露されない(-)。ゲルの右側に、野生型DHFR配列(WT)及び157-ヌクレオチド挿入体を含む変異体DHFR配列(Mutant)のバンド指標が示されている。実施例37も参照のこと。
図53は、CHOジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR)遺伝子のヌクレオチド配列の一部(上側ライン)及び外来配列の標的化された相同性-非依存型組込みにより作出された変異体DHFR遺伝子のヌクレオチド配列の一部(下側ライン)を示す。表28において説明されたジンクフィンガーヌクレアーゼに関する標的配列にはボックスを付け;野生型配列からの変化には下線を付けた。実施例37も参照のこと。
図54は、野生型FokI切断ハーフ-ドメインのアミノ酸配列及び二量体化界面のアミノ酸配列の変更を含むいくつかの変異体切断ハーフ-ドメインのアミノ酸配列を示す。配列が変更された位置(アミノ酸486、490及び538)には、下線を付けた。

0026

詳細な説明
例えば、標的化された切断、それに続く非-相同末端連結(それらの間に挿入された外来配列を伴う又は伴わない)によるか、又は、標的化された切断、それに続く外来ポリヌクレオチド(細胞ヌクレオチド配列と相同である1個又は複数の領域を含む)とゲノム配列の間の相同組換えによる、細胞クロマチンの標的化された切断及び細胞ヌクレオチド配列の標的化された変更のために有用な組成物及び方法が、ここで明らかにされている。ゲノム配列は、染色体、エピソームオルガネラゲノム(例えば、ミトコンドリア葉緑体)、人工の染色体及び細胞に存在する他の種類の核酸、例えば、増幅された配列、二重微小染色体並びに内在性ゲノム又は細菌及びウイルスを感染するゲノムに存在するものを含む。ゲノム配列は、正常(すなわち野生型)又は変異体であることができ;変異体配列は、例えば、挿入、欠失、転位、再配列、及び/又は点変異を含むことができる。ゲノム配列は、多くの異なる対立遺伝子のひとつを含むこともできる。

0027

標的化された切断及び組換えに有用な組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及びジンクフィンガー結合ドメインを含む融合タンパク質、これらのタンパク質をコードしているポリヌクレオチド並びにポリペプチド及びポリペプチド-コードしているポリヌクレオチド組合せを含む。ジンクフィンガー結合ドメインは、1個又は複数のジンクフィンガー(例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又はそれよりも多いジンクフィンガー)を含むことができ、任意にゲノム配列に結合するように操作することができる。従って、そこでの切断又は組換えが望ましい関心対象の標的ゲノム内の領域を同定することにより、本明細書に開示された方法に従い、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及び該ゲノム領域において標的配列を認識するように操作されるジンクフィンガードメインを含む、1種又は複数の融合タンパク質を構築することができる。細胞内のそのような融合タンパク質(又はタンパク質類)の存在は、融合タンパク質(複数)のその(それらの)結合部位(複数)への結合、及び該ゲノム領域内又はその近傍での切断を生じるであろう。更にこのゲノム領域に相同である外来ポリヌクレオチドも、そのような細胞に存在することができ、相同組換えは、ゲノム領域と外来ポリヌクレオチドの間で高率で生じる。

0028

(概要)
本方法の実践に加え、本明細書に開示された組成物の調製及び使用は、特に指定されない限り、分子生物学生化学クロマチン構造及び分析、コンピュータ化学、細胞培養組換えDNA及び当該技術の関連分野における通常の技術を利用する。これらの技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、「MOLECULAR CLONING: A LABORATORYMANUAL」、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989、及び第3版、2001;Ausubelら、「CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY」、John Wiley & Sons、ニューヨーク、1987及び定期的改訂版;「METHODS IN ENZYMOLOGY」シリーズ、Academic Press、サンディエゴ;Wolffe、「CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION」、第3版、Academic Press、サンディエゴ、1998;「METHODS IN ENZYMOLOGY」、第304巻、「Chromatin」(P.M. Wassarman及びA. P. Wolffe編集)、Academic Press、サンディエゴ、1999;及び、「METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY」、第119巻、「Chromatin Protocols」(P.B. Becker編集)、Humana Press、トトワ、1999を参照のこと。

0029

(定義)
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、線状又は環状のコンホメーションで、及び一本鎖又は二本鎖型のいずれかの、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する。本開示の目的に関して、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定として構築されるものではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログに加え、塩基部分、糖部分及び/又はリン酸部分が修飾されたヌクレオチド(例えばホスホチオアート主鎖)を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有し、すなわちAのアナログは、Tとの塩基対を形成するDNAあろう。

0030

用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを意味するように互換的に使用される。この用語は、1種又は複数のアミノ酸が対応する天然のアミノ酸の化学アナログ又は修飾された誘導体であるアミノ酸ポリマーにもあてはまる

0031

「結合」は、巨大分子間(例えばタンパク質及び核酸の間)の配列-特異的、非共有的相互作用を意味する。結合相互作用の全ての成分は、全体としての相互作用が配列-特異性である限りは、配列-特異性を必要としない(例えばDNA主鎖中のリン酸残基との接触)。このような相互作用は一般に、10-6/M又はそれ未満の解離定数(Kd)により特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を意味し:増加した結合親和性は、より低いKdと相関している。

0032

結合タンパク質」は、別の分子に非共有的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子(DNA-結合タンパク質)、RNA分子(RNA-結合タンパク質)及び/又はタンパク質分子(タンパク質-結合タンパク質)と結合することができる。タンパク質-結合タンパク質の場合、これはそれ自身結合することができ(ホモ二量体ホモ三量体など形成)、及び/又はこれは異なるタンパク質もしくはタンパク質類の1種もしくは複数の分子に結合することができる。結合タンパク質は、1種よりも多い結合活性型を有することができる。例えばジンクフィンガータンパク質は、DNA-結合、RNA-結合及びタンパク質-結合活性を有する。

0033

「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」(又は結合ドメイン)は、その構造が亜鉛イオンとの配位により安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域内である、1個又は複数のジンクフィンガーを介して、配列-特異的様式で DNAに結合する、タンパク質、又は比較的大きいタンパク質のドメインである。用語ジンクフィンガーDNA結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質又はZFPと略されることが多い。

0034

ジンクフィンガー結合ドメインは、予め決定されたヌクレオチド配列に結合するように「操作する」ことができる。ジンクフィンガータンパク質を操作する方法の非限定的例は、デザイン及び選択される。デザインされたジンクフィンガータンパク質は、そのデザイン/組成は主に理論的基準から生じる天然に生じないタンパク質である。デザインの理論的基準は、置換則並びに現存するZFPデザインの情報及び結合データを保存しているデータベース内の情報の処理のためのコンピュータ化されたアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許US 6,140,081;US 6,453,242;及び、US 6,534,261を参照のこと;同じく、WO 98/53058;WO 98/53059;WO 98/53060;WO 02/016536及びWO 03/016496も参照のこと。

0035

「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その生成がファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択などのような経験的プロセスから主に生じる、天然には認められないタンパク質である。例えば、US 5,789,538;US 5,925,523;US 6,007,988;US 6,013,453;US 6,200,759;WO 95/19431;WO 96/06166;WO 98/53057;WO 98/54311;WO 00/27878;WO 01/60970;WO 01/88197及びWO 02/099084を参照のこと。

0036

用語「配列」は、DNA又はRNAであることができ;線状、環状又は分枝鎖であることができ、及び一本鎖又は二本鎖であることができる、任意の長さのヌクレオチド配列を意味する。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されたヌクレオチド配列を意味する。ドナー配列は、任意の長さ、例えば、2〜10,000ヌクレオチド長(又はそれらの間もしくはそれらを超える任意の整数値)、好ましくは約100〜1,000ヌクレオチド長(又はそれらの間の整数)、より好ましくは約200〜500ヌクレオチド長であることができる。

0037

「相同の非同一の配列」は、第二の配列とある程度の配列同一性共有するが、その配列は第二の配列と同一でない、第一の配列を意味する。例えば、変異遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、変異遺伝子の配列に相同かつ非同一である。ある実施態様において、ふたつの配列間の相同性の程度は、通常の細胞機序を利用し、それらの間での相同組換えをもたらすのに十分である。ふたつの相同で非同一の配列は、任意の長さであることができ、及びそれらの非-相同性の程度は、単独のヌクレオチドのように小さい(例えば標的化された相同組換えによるゲノム点変異の補正)か、又は10キロベースもしくはそれ以上と大きい(例えば染色体内の予め決定された異所での遺伝子の挿入)であることができる。相同の非同一の配列を含むふたつのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば20〜10,000ヌクレオチド又はヌクレオチド対の外来ポリヌクレオチド(すなわちドナーポリヌクレオチド)を使用することができる。

0038

核酸及びアミノ酸配列同一性を決定する技術は、当該技術分野において公知である。典型的にはそのような技術は、遺伝子のmRNAのヌクレオチド配列の決定及び/又はそれによりコードされたアミノ酸配列の決定、並びにこれらの配列の第二のヌクレオチド又はアミノ酸配列との比較を含む。ゲノム配列は、この様式で決定及び比較することもできる。一般に同一性は、2種のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の、各々、正確なヌクレオチド-対-ヌクレオチド又はアミノ酸-対-アミノ酸への対応を意味する。2種以上の配列(ポリヌクレオチド又はアミノ酸)は、それらの%同一性を決定することにより比較することができる。核酸又はアミノ酸配列のいずれかふたつの配列の%同一性は、ふたつの並置された配列間の正確なマッチ数の、より短い配列の長さで除算され、かつ100倍された値である。核酸配列に関するおおよその並置は、Smith及びWaterman、Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによりもたらされる。このアルゴリズムは、Dayhoffにより開発され(Atlas of Protein Sequences and Structure. M.O. Dayhoff編集,補遺5. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation,ワシトンD.C., 米国)及びGribskovにより標準化された(Nucl. AcidsRes. 14(6):6745-6763 (1986))、スコア化マトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用することができる。配列の%同一性を決定するためのこのアルゴリズムの履行の例は、「BestFit」ユーティリティーアプリケーションにおいてGenetics Computer Group(マジソン, WI)により提供されている。この方法のデフォルトパラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual,バージョン8 (1995)(Genetics Computer Group, マジソン, WIから入手可能)に説明されている。本発明の開示の状況において%同一性を確立する好ましい方法は、エジンバラ大学に版権があり、John F. Collins及びShane S. Sturrokにより開発され、並びにIntelliGenetics, Inc. (マウンテンビュー, CA)により頒布されている、MPSRCHパッケージプログラムを使用することである。このパッケージの一揃いから、スコアリングテーブルに関してデフォルトのパラメータを使用する、Smith-Watermanアルゴリズムを利用することができる(例えば、ギャップオープンペナルティ12、ギャップイクステンションペナルティ1、及びギャップ6)。作製されたデータから、「Match」値は配列同一性を反映している。配列間の%同一性又は類似性を算出する他の好適なプログラムは、当該技術分野において一般に公知であり、例えば、別のアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータと共に使用されるBLASTである。例えば、BLASTN及びBLASTPは、以下のデフォルトのパラメータを使って、使用することができる:遺伝暗号標準フィルター=なし;鎖=両鎖;カットオフ=60;除外=10;マトリックス=BLOSUM62;説明=50配列;ソート=HIGHSCORE;データベース=非-冗長,GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss Protein+Spupdate+PIR。これらのプログラムの詳細は、インターネット上で調べることができる。本明細書に説明された配列に関して、所望の配列同一性の程度の範囲は、およそ80%〜100%及びその間の任意の整数値である。典型的には、配列間の%同一性は、少なくとも70〜75%、好ましくは80〜82%、より好ましくは85〜90%、なおより好ましくは92%、更により好ましくは95%、最も好ましくは98%配列同一性である。

0039

あるいは、ポリヌクレオチド間の配列類似性の程度は、相同領域間の安定した二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、引き続きの一本鎖-特異的ヌクレアーゼ(複数)による消化及び消化された断片のサイズ決定により決定することができる。2種の核酸、又は2種のポリペプチド配列が前述の方法を用い決定される場合、それらの配列が分子の規定された長さについて少なくとも約70%〜75%、好ましくは80%〜82%、より好ましくは85%〜90%、なおより好ましくは92%、更により好ましくは95%、最も好ましくは98%配列同一性である場合に、互いに実質的に相同である。本明細書において使用される実質的に相同とは、特定されたDNA又ポリペプチド配列と完全な同一性を示す配列も意味する。実質的に相同であるDNA配列は、特定のシステムについて規定されたような、例えばストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は、当該技術分野内である。例えばSambrookらの前掲;Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, B.D. Hames及びS.J. Higgins編集、(1985) Oxford;ワシントンDC; IRL Press)を参照のこと。

0040

2種の核酸断片の選択的ハイブリダイゼーションは、以下のように決定することができる。2種の核酸分子間の配列同一性の程度は、そのような分子間のハイブリダイゼーション事象の効率及び強度に影響を及ぼす。部分的に同一である核酸配列は、完全に同一の配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害するであろう。完全に同一の配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当該技術分野において周知であるハイブリダイゼーションアッセイを用いて評価することができる(例えばサザン(DNA)ブロット、ノーザン(RNA)ブロット、液中ハイブリダイゼーションなど、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、(1989) Cold Spring Harbor, NY参照)。そのようなアッセイは、変動する選択性の程度を用い、例えば、低から高まで変動するストリンジェンシー条件を用い、実行することができる。低ストリンジェンシーの条件が使用される場合、非-特異的結合非存在は、配列同一性の程度をほんの一部欠いている二次的プローブ(例えば、標的分子との約30%未満の配列同一性を有するプローブ)を用いて評価することができ、その結果非特異的結合事象の非存在下で、二次的プローブは標的にはハイブリダイズしないであろう。

0041

ハイブリダイゼーション-ベースの検出システムを利用する場合、参照核酸配列相補的である核酸プローブが選択され、従って適当な条件の選択により、このプローブ及び参照配列は、互いに選択的にハイブリダイズ、又は結合し、二重鎖分子を形成する。中等度ストリンジェントのハイブリダイゼーション条件下で、参照配列への選択的ハイブリダイズが可能である核酸分子は、典型的には選択された核酸プローブの配列と少なくとも約70%配列同一性を有する少なくとも約10〜14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は典型的には選択された核酸プローブの配列と約90〜95%よりも大きい配列同一性を有する少なくとも約10〜14ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブ/参照配列ハイブリダイゼーションに有用なハイブリダイゼーション条件は、プローブ及び参照配列が特定の配列同一性の程度を有する場合、当該技術分野において公知のように決定することができる(例えば、Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, B.D. Hames及びS.J. Higgins編集、(1985) Oxford;ワシントンDC;IRL Press参照のこと)。

0042

ハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知である。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション条件が、ミスマッチしたヌクレオチドを含むハイブリッドの形成を疎んじる程度を意味し、より高いストリンジェンシーは、ミスマッチしたハイブリッドのより低い忍容性に相関している。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は、当業者に周知であり、温度、pH、イオン強度、並びに例えばホルムアミド及びジメチルスルホキシドのような有機溶媒の濃度を含むが、これらに限定されるものではない。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、温度の上昇、イオン強度の低下及び溶媒濃度の低下により増大する。

0043

ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関して、例えば以下の因子を変動することにより、特定のストリンジェンシーを確立するために、多くの同等の条件を使用することができることは当該技術分野において周知である:配列の長さ及び性質、様々な配列の塩基組成、塩及び他のハイブリダイゼーション液成分の濃度、ハイブリダイゼーション液内のブロック剤の存在もしくは非存在(例えば硫酸デキストラン、及びポリエチレングリコール)、ハイブリダイゼーション反応温度及び時間パラメータ、更には洗浄条件の変動。ハイブリダイゼーション条件の特定のセットの選択は、以下の当該技術分野における標準的方法に従い選択される(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A. Laboratory Manual. 第2版, (1989) Cold Spring Harbor, NY参照)。

0044

「組換え」は、ふたつのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換するプロセスを意味する。本開示の目的に関して、「相同組換え(HR)」は、例えば、細胞内の二本鎖破損の修復時に生じる、そのような交換の特定された型を意味する。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性、「標的」分子(すなわち二本鎖破損を経験したもの)の修復の鋳型のための「ドナー」分子の使用を必要とし、並びにこれは遺伝情報のドナーから標的への移行につながるので、「非-クロスオーバー遺伝子転換」又は「ショートトラクト(short tract)遺伝子転換」として様々に知られている。いずれか特定の理論に結びつけられることを欲するものではないが、そのような移行は、破損された標的及びドナーの間で形成するヘテロ二本鎖DNAのミスマッチ補正、並びに/又はドナーが標的の一部となり始める遺伝情報の再合成に使用される「合成-依存鎖アニーリング」及び/もしくは関連したプロセスに関与することができる。そのような特定されたHRは、標的分子の配列の変更を生じることが多く、その結果ドナーポリヌクレオチド配列の一部又は全ては、標的ポリヌクレオチドへ組込まれる。

0045

「切断」は、DNA分子の共有的主鎖の破損を意味する。切断は、ホスホジエステル結合酵素的又は化学的加水分解を含むが、これらに限定されるものではない、様々な方法により開始することができる。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、ふたつの個別の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。DNA切断は、平滑末端又は付着末端のいずれかの形成を生じることができる。ある実施態様において、融合ポリペプチドは、標的化された二本鎖DNAの切断のために使用される。

0046

「切断ドメイン」は、DNA切断に関する触媒活性を有する、1種又は複数のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは、単ポリペプチド鎖に含まれることができるか、又は切断活性は、2種(又はそれよりも多い)ポリペプチドの会合から生じることができる。
「切断ハーフ-ドメイン」は、第二のポリペプチド(同一又は異なるのいずれか)と共に、切断活性(好ましくは二本鎖切断活性)を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。

0047

クロマチン」は、細胞のゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にDNA、並びにヒストン及び非-ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形で存在し、ここでヌクレオソームコアは、ヒストンH2A、H2B,、H3及びH4の各ふたつを含む八量体に結合しているDNAの約150塩基対を含み;並びに、リンカーDNA(生物に応じ様々な長さ)が、ヌクレオソームコア間に伸びている。ヒストンH1の分子は、一般にリンカーDNAに結合している。本開示の目的に関して、用語「クロマチン」は、原核及び真核の両細胞の核タンパク質の全ての種類を包含することを意味する。細胞クロマチンは、染色体及びエピソームの両方のクロマチンを含む。

0048

「染色体」は、細胞ゲノムの全て又は一部を含む、クロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞ゲノムを含む染色体の全ての集合であるその核型により特徴付けられることが多い。細胞のゲノムは、1種又は複数の染色体を含むことができる。
「エピソーム」は、細胞の染色体の核型の一部ではない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体又は他の構造である。エピソームの例は、プラスミド及びある種のウイルスゲノムを含む。

0049

「接近可能な領域」は、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外来分子により結合され得る、細胞クロマチン内の部位である。いずれか特定の理論に結びつけられることを欲するものではないが、接近可能な領域は、ヌクレオソーム構造へパッケージングされないものであると考えられる。接近可能な領域の個別の構造は、化学的及び酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感度により検出されることが多い。

0050

「標的部位」又は「標的配列」は、結合に十分な条件が存在する場合に、結合分子が結合する核酸の部分を規定する核酸配列である。例えば配列5'-GAATTC-3'は、EcoRI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
「外来」分子は、通常細胞内に存在しないが、1種又は複数の遺伝的方法、生化学的方法又はその他の方法により、細胞へ導入することができる分子である。「細胞内の通常の存在」は、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関して決定される。従って例えば、筋肉胚発生時にのみ存在する分子は、成体筋細胞に関して、外来分子である。同様に、熱ショックにより誘導された分子は、非-熱ショック細胞に関して外来分子である。外来分子は、例えば、多機能内在性分子の機能型、又は正常に-機能する内在性分子の機能不全型を含むことができる。

0051

外来分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスにより作出されるような小型分子、又はタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質リポタンパク質多糖のような巨大分子、並びに前記分子の修飾された誘導体、又は1種又は複数の前記分子を含む任意の複合体であることができる。核酸は、DNA及びRNAを含み、一本鎖又は二本鎖であることができ;線状、分枝鎖又は環状であることができ;並びに、任意の長さであることができる。核酸は、二重鎖を形成することが可能であるものに加え、三重鎖形成する核酸を含む。例えば、米国特許US 5,176,996及びUS 5,422,251を参照のこと。タンパク質は、DNA-結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化されたDNA結合タンパク質、ポリメラーゼメチラーゼデメチラーゼアセチラーゼデアセチラーゼキナーゼホスファターゼインテグラーゼリコンビナーゼリガーゼトポイソメラーゼジャイレース及びヘリカーゼを含むが、これらに限定されるものではない。

0052

外来分子は、内在性分子と同じ型の分子、例えば外来タンパク質又は核酸であることができる。例えば、外来核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞へ導入されるプラスミドもしくはエピソーム、又は通常細胞内に存在しない染色体であることができる。外来分子の細胞への導入法は、当業者に公知であり、脂質-媒介型移入(すなわち、リポソーム中性脂質及び陽イオン性脂質を含む)、電気穿孔法直接注入細胞融合粒子リン酸カルシウム共沈DEAE-デキストラン-媒介型移入及びウイルスベクター媒介型移入を含むが、これらに限定されるものではない。

0053

対照的に「内在性」分子は、特定の環境条件下、特定の発生段階で特定の細胞内に通常存在するものである。例えば内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他の細胞小器官のゲノム、又は天然のエピソームの核酸を含むことができる。追加の内在性分子は、タンパク質、例えば転写因子及び酵素を含むことができる。

0054

「融合」分子は、2個又はそれよりも多いサブユニット分子が、好ましくは共有的に連結された分子である。サブユニット分子は、同じ分子の化学型であるか、又は異なる分子の化学型であることができる。融合分子の第一の型の例は、融合タンパク質(例えば、ZFPDNA-結合ドメインと切断ドメインの間の融合)並びに融合核酸(例えば、先に説明された融合タンパク質をコードしている核酸)を含むが、これらに限定されるものではない。融合分子の第二の型の例は、三重鎖-形成核酸とポリペプチドの間の融合、及び副溝バインダーと核酸の間の融合を含むが、これらに限定されるものではない。

0055

細胞内の融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から、又は融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドの細胞への送達により、生じ、ここでポリヌクレオチドは転写され、転写産物は翻訳され、融合タンパク質を作出する。トランス-スプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチド連結も、細胞内のタンパク質発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチド送達法は、本開示の別所に記されている。

0056

本開示を目的とする「遺伝子」は、遺伝子産物をコードしているDNA領域(下記参照)に加え、遺伝子産物の生成を調節する全てのDNA領域を含み、そのような調節配列は、コード配列及び/又は転写配列に隣接してもしなくてもよい。従って遺伝子は、プロモーター配列ターミネーターリボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサーインスレーター境界エレメント複製起点マトリックス結合領域及び遺伝子座調節領域を含むが、必ずしもこれらに限定されるものではない。

0057

「遺伝子発現」は、遺伝子に含まれた情報の、遺伝子産物への転換を意味する。遺伝子産物は、遺伝子の直接の転写産物(例えばmRNA、tRNArRNAアンチセンスRNAリボザイム構造的RNAもしくはいずれか他の型のRNA)、又はmRNAの翻訳により産生されたタンパク質であることができる。遺伝子産物は、キャッピングポリアデニル化、メチル化、及び校正などのプロセスにより修飾されたRNA、並びに例えば、メチル化、アセチル化リン酸化ユビキチン化ADP-リボシル化ミリストイル化(myristilation)、及びグリコシル化などにより修飾されたタンパク質も含む。

0058

遺伝子発現の「変調」は、遺伝子の活性の変化を意味する。発現の変調は、遺伝子活性化及び遺伝子抑制を含むが、これらに限定されるものではない。
「真核」細胞は、真菌細胞(例えば酵母)、植物細胞動物細胞、哺乳類細胞及びヒト細胞を含むが、これらに限定されるものではない。

0059

「関心対象の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、その中で外来分子に結合することが望ましい遺伝子の内側又は隣接する遺伝子又は非-コード領域配列である。結合は、標的化されたDNA切断及び/又は標的化された組換えの目的のためであることができる。関心対象の領域は、例えば、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム(例えばミトコンドリア、葉緑体)、又は感染性ウイルスゲノム中に存在することができる。関心対象の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非-コード領域内、例えば、リーダー配列トレーラー配列もしくはイントロンなど、又はコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非-転写領域内であることができる。関心対象の領域は、長さが単ヌクレオチド対のように小さいか、又は最大2,000ヌクレオチド対、もしくは任意の整数値のヌクレオチド対であることができる。

0060

用語「機能的連結」及び「機能的に連結される」(又は「機能連結される」)は、2種又はそれよりも多い成分(配列エレメントなど)の近位部に関して互換的に使用され、ここでこれらの成分は、両方の成分が正常に機能し、かつこれらの成分の少なくとも1種が、他方の成分の少なくとも1種が作用する機能を媒介することが恐らく可能であるように配置される。例としてプロモーターのような転写調節配列は、1種又は複数の転写調節因子の存在又は非存在に反応して、この転写調節配列がコード配列の転写のレベルを制御する場合に、コード配列に機能的に連結される。転写調節配列は一般に、コード配列とcisで機能的に連結されるが、これに直接隣接する必要はない。例えばエンハンサーは、例えそれらが連続していなくとも、コード配列に機能的に連結された転写調節配列である。

0061

融合ポリペプチドに関して、用語「機能的に連結された」は、これらの成分の各々が、他方の成分への連結においてそのように連結していない場合と同じ機能を発揮するという事実を意味する。例えば、ZFPDNA-結合ドメインが切断ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、ZFP DNA-結合ドメイン及び切断ドメインは、融合ポリペプチドにおいて、ZFP DNA-結合ドメイン部分がその標的部位及び/又は結合部位に連結することができると同時に、切断ドメインは標的部位の近傍でDNAを切断することができる場合に、機能的である。

0062

タンパク質、ポリペプチド又は核酸の「機能断片」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同一でないが、依然完全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチド又は核酸である。機能断片は、対応する未変性の分子よりもより多く、より少なくもしくは同じ数の残基を有し、及び/又は1個よりも多いアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含むことができる。核酸の機能(例えばコード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力)の決定法は、当該技術分野において周知である。同様に、タンパク質機能の決定法も周知である。例えば、ポリペプチドのDNA-結合機能は、フィルター-結合アッセイ電気泳動移動度シフトアッセイ、又は免疫沈降アッセイなどにより決定することができる。DNA切断は、ゲル電気泳動によりアッセイすることができる。Ausubelら、前掲を参照のこと。タンパク質の別のタンパク質との相互作用能は、例えば、遺伝子的及び生化学的の両方で、同時免疫沈降、ツー-ハイブリッドアッセイ又は相補性により決定することができる。例えば、Fieldsら、(1989) Nature, 340:245-246;米国特許US 5,585,245及びPCT WO 98/44350を参照のこと。

0063

(標的部位)
開示された方法及び組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及びジンクフィンガードメインを含む、融合タンパク質を含み、ここでジンクフィンガードメインは、細胞クロマチン内の配列(例えば標的部位又は結合部位)に結合することにより、その配列の近傍へ切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)の活性を方向付け、その結果標的配列の近傍で切断を誘導する。本開示の別所に記したように、ジンクフィンガードメインは、任意の所望の配列に事実上結合するように操作することができる。従って、そこでの切断又は組換えが望ましい配列を含む関心対象の領域の同定後、1個又は複数のジンクフィンガー結合ドメインは、関心対象の領域の1個又は複数の配列に結合するように操作することができる。細胞内における、ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質(又は各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む、ふたつの融合タンパク質)の発現は、関心対象の領域の切断に作用する。

0064

ジンクフィンガードメインによる結合に関する細胞クロマチン内の配列(例えば標的部位)の選択は、例えば、共有の米国特許US 6,453,242(2002年9月17日)に開示された方法に従い実現され、これは選択された配列に結合するZFPをデザインする方法も開示している。当業者には、ヌクレオチド配列の簡単な目視検査も、標的部位の選択のために使用することができることは明らかであろう。従って標的部位選択の任意の手段を、請求された方法において使用することができる。

0065

標的部位は一般に、多くの隣接する標的サブサイトで構成される。標的サブサイトは、個々のジンクフィンガーにより結合された配列(通常、ヌクレオチドトリプレット、又は隣接クアドプレットと1個のヌクレオチドが重複することができるヌクレオチドクアドロプレットのいずれか)を意味する。例えば、WO 02/077227を参照のこと。ジンクフィンガータンパク質がほとんどの接触を生じる鎖が、標的鎖「一次認識(primary recoginition)鎖」又は「一次接触(primary contact)鎖」と称される場合、一部のジンクフィンガータンパク質は、標的鎖の3個の塩基トリプレット及び非-標的鎖上の4番目の塩基に結合する。標的部位は一般に、少なくとも9ヌクレオチドの長さを有し、従って少なくとも3個のジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインにより結合される。しかし例えば、4-フィンガー結合ドメインの12-ヌクレオチド標的部位への、5-フィンガー結合ドメインの15-ヌクレオチド標的部位への、又は6-フィンガー結合ドメインの18-ヌクレオチド標的部位への結合も可能である。明らかなように、より大きい結合ドメイン(例えば7-、8-、9-フィンガー又はそれよりも多い)のより長い標的部位への結合も可能である。

0066

標的部位に関して、複数の3ヌクレオチドであることは必要ではない。例えば、鎖間相互作用が生じる(例えば米国特許US 6,453,242及びWO 02/077227を参照)ような場合、マルチ-フィンガー結合ドメインの個々のジンクフィンガーの1個又は複数は、重複するクアドロプレットサブサイトに結合することができる。結果的に、3-フィンガータンパク質は、10-ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで10番目のヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合されたクアドロプレットの一部であり、4-フィンガータンパク質は、13-ヌクレオチド配列に結合することができ、ここで13番目のヌクレオチドは、末端フィンガーにより結合されたクアドロプレットの一部であるなどである。

0067

マルチ-フィンガー結合ドメイン中の個々のジンクフィンガー間のアミノ酸リンカー配列の長さ及び性質も、標的配列への結合に影響を及ぼす。例えば、マルチ-フィンガー結合ドメイン内の隣接ジンクフィンガー間のいわゆる「非-正準リンカー」、「長いリンカー」又は「構造されたリンカー」の存在は、これらのフィンガーが、すぐに隣接しないサブサイトへ結合することを可能にする。そのようなリンカーの非限定的例は、例えば、米国特許US 6,479,626及びWO 01/53480に説明されている。従ってジンクフィンガー結合ドメインの標的部位中の1個又は複数のサブサイトは、1、2、3、4、5又はそれよりも多いヌクレオチドにより、互いに隔てられ得る。単なる一例を提供すると、4-フィンガー結合ドメインは、配列において、2個の近接する3-ヌクレオチドサブサイト、介在ヌクレオチド、及び2個の近接するトリプレットサブサイトを含む、13-ヌクレオチド標的部位に結合することができる。

0068

配列(例えば標的部位)間の距離は、互いに最も近い配列の端から測定される、ふたつの配列間に介在する、ヌクレオチド又はヌクレオチド対の数を意味する。
切断が、標的部位を分離するためのふたつのジンクフィンガードメイン/切断ハーフ-ドメイン融合分子の結合により決まるある実施態様において、これらふたつの標的部位は、反対DNA鎖上であることができる。別の実施態様において、両方の標的部位は、同じDNA鎖上である。

0069

(ジンクフィンガー結合ドメイン)
ジンクフィンガー結合ドメインは、1個又は複数のジンクフィンガーを含む。Millerら、(1985)EMBO J. 4:1609-1614;Rhodes、(1993) Scientific American, Feb.:56-65;US 6,453,242。典型的には単独のジンクフィンガードメインの長さは、約30個のアミノ酸である。構造試験は、各ジンクフィンガードメイン(モチーフ)は、2個のβシート(2個の不可変システイン残基を含むβターンに保持される)及びαヘリックス(2個の不可変ヒスチジン残基を含む)を含み、これらは、2個のシステイン及び2個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位により特定のコンホメーションで保持されていることを明らかにしている。

0070

ジンクフィンガーは、正準C2H2ジンクフィンガー(すなわち、2個のシステイン及び2個のヒスチジンにより亜鉛イオンが配位されているもの)、並びに非-正準ジンクフィンガー、例えば、C3Hジンクフィンガー(3個のシステイン残基及び1個のヒスチジン残基により亜鉛イオンが配位されているもの)及びC4ジンクフィンガー(4個のシステイン残基により亜鉛イオンが配位されているもの)などの両方を含む。同じくWO 02/057293も参照のこと。

0071

ジンクフィンガー結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作することができる。例えば、Beerliら、(2002) Nature Biotechnol. 20:135-141;Paboら、(2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340;Isalanら、(2001) Nature Biotechnol. 19:656-660;Segalら、(2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637;Chooら、(2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然のジンクフィンガータンパク質と比べ、新規の結合特異性を有することができる。操作法は、理論的デザイン及び様々な種類の選択を含むが、これらに限定されるものではない。理論的デザインは、例えば、トリプレット(又はクアドロプレット)ヌクレオチド配列及び個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、ここで各トリプレット又はクアドロプレットヌクレオチド配列は、特定のトリプレット又はクアドロプレット配列に結合するジンクフィンガーの1種又は複数のアミノ酸配列に関連している。例えば、共有の米国特許US 6,453,242及びUS 6,534,261を参照のこと。

0072

ファージディスプレイ及びツー-ハイブリッドシステムを含む選択法の例は、米国特許US 5,789,538;US 5,925,523;US 6,007,988;US 6,013,453;US 6,410,248;US 6,140,466;US 6,200,759;及びUS 6,242,568;更にはWO 98/37186;WO 98/53057;WO 00/27878;WO 01/88197及びGB 2,338,237に開示されている。
ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の増強は、例えば共有のWO 02/077227に開示されている。

0073

個々のジンクフィンガーは、3-ヌクレオチド(すなわちトリプレット)配列(又は1個のヌクレオチドが隣接ジンクフィンガーの4-ヌクレオチド結合部位と重複する4-ヌクレオチド配列)に結合するので、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作される配列(例えば標的配列)の長さは、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数を決定するであろう。例えば、フィンガーモチーフが重複するサブサイトに結合していないようなZFPに関して、6-ヌクレオチド標的配列は、2-フィンガー結合ドメインにより結合され;9-ヌクレオチド標的配列は、3-フィンガー結合ドメインにより結合されるなどである。本明細書に記されたように、標的部位内の個々のジンクフィンガー(すなわちサブサイト)の結合部位は、近接する必要はないが、1個又は複数のヌクレオチドにより隔てられ、マルチ-フィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間のアミノ酸配列(すなわちフィンガー内リンカー)の長さ及び性質により左右される。

0074

マルチ-フィンガージンクフィンガー結合ドメインにおいて、隣接ジンクフィンガーは、約5個のアミノ酸のアミノ酸リンカー配列(いわゆる「正準」インター-フィンガーリンカー)によるか、あるいは1個又は複数の非-正準リンカーにより、隔てられることができる。例えば共有の米国特許US 6,453,242及びUS 6,534,261を参照のこと。3個よりも多いフィンガーを含む操作されたジンクフィンガー結合ドメインに関して、ある種のジンクフィンガー間の比較的長い(「非-正準」)インター-フィンガーリンカーの挿入は、結合ドメインによる結合の親和性及び/又は特異性を増大するので、好ましいであろう。例えば、米国特許US 6,479,626及びWO 01/53480を参照のこと。従って、マルチ-フィンガージンクフィンガー結合ドメインは、非-正準インター-フィンガーリンカーの存在及び位置に関して特徴付けることもできる。例えば、3個のフィンガー(2個の正準インター-フィンガーリンカーにより連結)、長いリンカー及び3個の追加のフィンガー(2個の正準インター-フィンガーリンカーにより連結)を含む6-フィンガージンクフィンガー結合ドメインは、2x3立体配置と表示される。同様に、2個のフィンガー(それらの間に正準リンカーを伴う)、長いリンカー及び2個の追加のフィンガー(正準リンカーにより連結)を含む結合ドメインは、2x2タンパク質と表示される。3個の2-フィンガーユニット(各々において、2個のフィンガーが正準リンカーにより連結されている)、及び各々において、2-フィンガーユニットが長いリンカーにより隣接する2フィンガーユニットと連結されているものを含むタンパク質は、3x2タンパク質と称される。

0075

マルチ-フィンガー結合ドメイン内の2個の隣接ジンクフィンガー間の長い又は非-正準インター-フィンガーリンカーの存在は、これらの2個のフィンガーを、しばしば標的配列内の直ぐ近接しないサブサイトに結合させることができる。従って標的部位のサブサイト間には1個又は複数のヌクレオチドのギャップが存在し得;すなわち、標的部位は、ジンクフィンガーにより接触されない、1個又は複数のヌクレオチドを含むことができる。例えば、2x2ジンクフィンガー結合ドメインは、1個のヌクレオチドにより隔てられた2個の6-ヌクレオチド配列に結合することができ、すなわちこれは13-ヌクレオチド標的部位に結合する。Mooreら、 (2001a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1432-1436;Mooreら、(2001b) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1437-1441、及びWO 01/53480も参照のこと。

0076

前述のように、標的サブサイトは、単独のジンクフィンガーにより結合されている3-又は4-ヌクレオチド配列である。ある目的に関して、2-フィンガーユニットは、結合モジュールと表示される。結合モジュールは、例えば、特定の6-ヌクレオチド標的配列に結合するマルチ-フィンガータンパク質(一般に3個のフィンガー)の状況で2個の隣接フィンガーの選択により得ることができる。あるいは、モジュールは、個々のジンクフィンガーの集成により構築することができる。WO 98/53057及びWO 01/53480も参照のこと。

0077

(切断ドメイン)
本明細書に開示された融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。それに切断ドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの例は、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、New England Biolabsの2002-2003年カタログ(ビバリー, MA);及び、Belfortら、(1997) Nucleic AcidsRes. 25:3379-3388を参照のこと。DNAを切断する追加の酵素が公知である(例えば、S1ヌクレアーゼリョクトウヌクレアーゼ;DNase I;小球菌ヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linnら(編集)、Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照のこと)。これらの酵素(又はそれらの機能断片)の1種又は複数は、切断ドメイン及び切断ハーフ-ドメインの給源として使用することができる。

0078

同様に、切断ハーフ-ドメイン(例えばジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む融合タンパク質)は、切断活性に二量体化を必要とする、先に示した、任意のヌクレアーゼ又はそれらの一部に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフ-ドメインを含む場合には、2個の融合タンパク質が切断に必要とされる。あるいは、2個の切断ハーフ-ドメインを含む単独のタンパク質を使用することができる。2個の切断ハーフ-ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ(又はそれらの機能断片)に由来することができるか、又は各切断ハーフ-ドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ(又はそれらの機能断片)に由来することができる。加えて、2個の融合タンパク質の標的部位は、互いに関して、2個の融合タンパク質のそれらの各標的部位への結合が、例えば二量体化により、互いに切断ハーフ-ドメインが機能的切断ドメインを形成することができるような空間的配向に、切断ハーフ-ドメインを位置するように配置されることが好ましい。従ってある実施態様において、標的部位の近端は、5〜8個のヌクレオチドによるか又は15〜18個のヌクレオチドにより隔てられる。しかし任意の整数のヌクレオチド又はヌクレオチド対は、ふたつの標的部位の間(例えば2〜50個のヌクレオチド又はそれ以上)に介在することができる。一般に切断点は、標的部位の間に位置する。

0079

制限エンドヌクレアーゼ(制限酵素)は、多くの種に存在し、DNAへの配列-特異的結合(認識部位)、及び結合部位でのもしくはその近傍でのDNAの切断が可能である。ある種の制限酵素(例えばIIS型)は、認識部位から除去されかつ分離可能な結合及び切断ドメインを有する位置で、DNAを切断する。例えば、IIS型酵素FokIは、一方の鎖上のその認識部位から9ヌクレオチドで、及び他方の鎖上のその認識部位から13ヌクレオチドでのDNAの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許US 5,356,802;US 5,436,150及びUS 5,487,994;更にはLiら、(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279;Liら、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768;Kimら、(1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887;Kimら、(1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982を参照のこと。従ってひとつの実施態様において、融合タンパク質は、少なくともひとつのIIS型制限酵素由来の切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)、及び操作されてもされなくてもよいジンクフィンガー結合ドメインを1個又は複数含む。

0080

その切断ドメインは結合ドメインから分離可能であるIIS型制限酵素の例は、FokIである。この特定の酵素は、二量体として活性がある。Bitinaiteら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575。従って本開示の目的のために、開示された融合タンパク質において使用されるFokI酵素は、切断ハーフ-ドメインと考えられる。従ってジンクフィンガー-FokI融合を使用する細胞配列の標的化された二本鎖の切断及び/又は標的化された置換に関して、各々FokI切断ハーフ-ドメインを含む2個の融合タンパク質を使用し、触媒活性のある切断ドメインを再構築することができる。あるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び2個のFokI切断ハーフ-ドメインを含む単ポリペプチド分子も使用することができる。ジンクフィンガー-FokI融合体を使用する標的化された切断及び標的化された配列変更のためのパラメータは、本開示の別所に記されている。

0081

切断ドメイン又は切断ハーフ-ドメインは、切断活性を保持するタンパク質、又は機能的切断ドメインを形成するための多量体化(例えば二量体化)の能力を保持するタンパク質の任意の部分であることができる。
IIS型制限酵素の例を、表1に列記する。追加の制限酵素も、分離可能な結合及び切断ドメインを含み、これらは本開示により企図されている。例えば、Robertsら、(2003) Nucleic AcudsRes. 31:418-420参照。

0082

0083

0084

(ジンクフィンガードメイン切断ドメイン融合)
融合タンパク質(及びこれをコードしているポリヌクレオチド)のデザイン及び構築の方法は、当業者に公知である。例えば、ジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質(及びこれをコードしているポリヌクレオチド)のデザイン及び構築の方法は、共有の米国特許US 6,453,242及びUS 6,534,261に開示されている。ある実施態様において、このような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが構築される。これらのポリヌクレオチドは、ベクターに挿入することができ、及びこれらのベクターは、細胞へ導入することができる(ベクター及びポリヌクレオチドの細胞への導入法に関する以下及び追加の開示を参照のこと)。

0085

本明細書に開示された方法のある実施態様において、融合タンパク質は、ジンクフィンガー結合ドメイン及びFokI制限酵素由来の切断ハーフ-ドメインを含み、並びに2種のそのような融合タンパク質は細胞において発現される。細胞における2種の融合タンパク質の発現は、2種のタンパク質の細胞への送達;1種のタンパク質及びタンパク質のひとつをコードしている1種の核酸の細胞への送達;各々ひとつのタンパク質をコードしている2種の核酸の細胞への送達;又は、両方のタンパク質をコードしている単独の核酸の細胞への送達から生じることができる。追加の実施態様において、融合タンパク質は、2種の切断ハーフドメイン及びジンクフィンガー結合ドメインを含む、単独のポリペプチド鎖を含む。この場合、単独の融合タンパク質は、細胞において発現され、理論に結びつけられることを欲するものではないが、切断ハーフ-ドメインの分子内二量体の形成の結果として、DNAを切断すると考えられる。

0086

ある実施態様において、融合タンパク質の成分(例えばZFP-FokI融合体)は、ジンクフィンガードメインが、融合タンパク質のアミノ末端の最も近くであり、及び切断ハーフ-ドメインは、カルボキシ末端の最も近くであるように、配置される。このことは、DNA-結合ドメインはアミノ末端の最も近くであり、及び切断ハーフ-ドメインはカルボキシ末端の最も近くであるような、FokI酵素に由来するもののような、天然の二量体化切断ドメインにおける切断ドメインの相対配向を映し出している。これらの実施態様において、機能性ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフ-ドメインの二量体化は、融合タンパク質の反対のDNA鎖上の部位への結合によりもたらされ、結合部位の5'末端は、互いに近接している。図43A参照。

0087

追加の実施態様において、融合タンパク質の成分(例えばZFP-FokI融合体)は、切断ハーフ-ドメインは融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、及びジンクフィンガードメインはカルボキシ末端に最も近いように、配置される。これらの実施態様において、機能性ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフ-ドメインの二量体化は、融合タンパク質の反対DNA鎖上の部位への結合によりもたらされ、結合部位の3'末端は、互いに近接している。図43B参照。

0088

更に追加の実施態様において、第一の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に最も近い切断ハーフ-ドメイン、及びカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含み、並びに第二の融合タンパク質は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端の最も近くであり、及び切断ハーフ-ドメインがカルボキシ末端の最も近くであるように配置される。これらの実施態様において、両方の融合タンパク質は、同じDNA鎖に結合し、第一の融合タンパク質の結合部位は、アミノ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む第二の融合タンパク質の結合部位の5'側に位置したカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む。図43C参照。

0089

開示された融合タンパク質において、ジンクフィンガードメインと切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)の間のアミノ酸配列は、「ZCリンカー」と示される。ZCリンカーは、前述のインター-フィンガーリンカーとは区別される。ZCリンカーの長さを決定する目的で、Paboらの論文((2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340)に説明されたジンクフィンガー構造が使用される:
X-X-C-X2-4-C-X12-H-X3-5-H (配列番号:201)

0090

この構造において、ジンクフィンガーの第一の残基は、第一の保存されたシステイン残基に対し2残基のアミノ末端側に位置したアミノ酸である。天然のジンクフィンガータンパク質の多くにおいて、この位置は、疎水性アミノ酸(通常フェニルアラニン又はチロシンのいずれか)により占有される。開示された融合タンパク質において、従ってジンクフィンガーの第一の残基は、疎水性残基であることが多いが、これは任意のアミノ酸であることができる。先に示されたようなジンクフィンガーの最後のアミノ酸残基は、第二の保存されたヒスチジン残基である。

0091

従ってジンクフィンガー結合ドメインが、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)のアミノ末端である極性を有する開示された融合タンパク質において、ZCリンカーは、最もC-末端側の(C-terminal-most)ジンクフィンガーの第二の保存されたヒスチジン残基と、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)の最もN-末端側のアミノ酸の間のアミノ酸配列である。例えば、その構築が実施例項において例証されているある融合タンパク質において、切断ハーフ-ドメインの最もN-末端側のアミノ酸は、Looneyらの論文((1989) Gene, 80:193-208)のFokI配列のアミノ酸番号384に対応するグルタミン(Q)残基である。

0092

切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)がジンクフィンガー結合ドメインのアミノ末端である極性を有する融合タンパク質に関して、ZCリンカーは、切断ドメイン(又はハーフドメイン)の最もC-末端側のアミノ酸残基と、ジンクフィンガー結合ドメインの最もN-末端側のジンクフィンガーの第一の残基(すなわち第一の保存されたシステイン残基の上流の2個の残基に位置した残基)の間のアミノ酸配列である。ある融合タンパク質の例において、切断ハーフ-ドメインの最もC-末端側のアミノ酸は、Looneyらの論文((1989) Gene, 80:193-208)のFokI配列のアミノ酸番号579に対応するフェニルアラニン(F)残基である。

0093

ZCリンカーは、任意のアミノ酸配列であることができる。最適の切断を得るために、ZCリンカーの長さ、及び標的部位(結合部位)間の距離は、相互に関連付けられている。例えば、Smithら、(2000) Nucleic AcidsRes. 28:3361-3369;Bibikovaら、(2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297を参照することとし、それらのリンカー長に関する注記は、本明細書に示されたものと異なることに注意。例えば、ジンクフィンガー結合ドメインが切断ハーフ-ドメインのアミノ末端であり、及び本明細書に規定されたように4個のアミノ酸のZCリンカー長を有する(及び他ではLOと記される)ZFP-FokI融合体について、最適の切断は、融合タンパク質の結合部位が、6又は16ヌクレオチド離れて存在する(各結合部位の近端から測定)場合に生じる。実施例4参照。

0094

(標的化された切断の方法)
開示された方法及び組成物を使用し、細胞クロマチンの関心対象の領域で(例えば変異体又は野生型のいずれかの、例えば遺伝子の、ゲノム内の所望の部位又は予め決定された部位で)DNAを切断することができる。そのような標的化されたDNA切断に関して、ジンクフィンガー結合ドメインは、標的部位が、予め決定された切断部位で又はその近傍で結合するように操作され、並びに融合タンパク質は、操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含み、及び切断ドメインは細胞において発現される。融合タンパク質のジンクフィンガー部分の標的部位への結合時に、DNAは、切断ドメインにより標的部位の近傍で切断される。切断の正確な部位は、ZCリンカーの長さにより左右され得る。

0095

あるいは、各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む2種の融合タンパク質は、細胞で発現され、並びに機能的切断ドメインが再構成され及びDNAが標的部位の近傍で切断されるような方法で、並列される標的部位に結合する。ひとつの実施態様において、切断は、2個のジンクフィンガー結合ドメインの標的部位の間で生じる。ジンクフィンガー結合ドメインの一方又は両方は、操作することができる。

0096

ジンクフィンガー結合ドメイン切断ドメイン融合ポリペプチドを使用する標的化された切断に関して、結合部位は、切断部位を包含するか、又は結合部位の近端は、切断部位から1、2、3、4、5、6、10、25、50もしくはそれ以上のヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチドの間の任意の整数値)であることができる。切断部位に関して、結合部位の正確な位置は、特定の切断ドメイン、及びZCリンカーの長さにより左右されるであろう。各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む2種の融合ポリペプチドが使用される方法に関して、結合部位は一般に、切断部位にまたがる。従って第一の結合部位の近端は、切断部位の片側上で1、2、3、4、5、6、10、25もしくはそれ以上のヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチドの間の任意の整数値)であることができ、並びに第二の結合部位の近端は、切断部位の他方の側上で1、2、3、4、5、6、10、25もしくはそれ以上のヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチドの間の任意の整数値)であることができる。In vitro及びin vivoにおいて切断部位をマッピングする方法は、当業者に公知である。

0097

従って、本明細書に開示された方法は、切断ドメインに融合された操作されたジンクフィンガー結合ドメインを使用することができる。これらの場合において、結合ドメインは、そこ又はその近傍での切断が望ましいような標的配列に結合するように操作される。融合タンパク質、又はこれをコードしているポリヌクレオチドは、細胞へ導入される。一旦細胞へ導入されるか、又は細胞で発現されたならば、この融合タンパク質は、標的配列へ結合し、標的配列で又はその近傍で切断する。切断の正確な位置は、切断ドメインの性質並びに/又は結合ドメインと切断ドメインの間のリンカー配列の存在及び/もしくは性質により左右される。各々切断ハーフ-ドメインを含む2種の融合タンパク質が使用される場合、結合部位の近端の間の距離は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、25又はそれ以上のヌクレオチド(又は1〜50ヌクレオチドの間の任意の整数値)であることができる。切断の最適レベルも、2種の融合タンパク質の結合部位間の距離(例えば、Smith ら、(2000) Nucleic AcidsRes. 28:3361-3369;Bibikovaら、(2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297参照)及び各融合タンパク質内のZCリンカーの長さの両方により左右される。

0098

ZFP-FokI融合ヌクレアーゼに関して、ZFPとFokI切断ハーフ-ドメインの間のリンカー(すなわちZCリンカー)の長さは、切断効率に影響を及ぼし得る。4アミノ酸残基のZCリンカーによるZFP-FokI融合を利用するひとつの実験システムにおいて、最適な切断は、2種のZFP-FokIヌクレアーゼの結合部位の近端が6塩基対により隔てられた場合に得られた。この特定の融合ヌクレアーゼは、ジンクフィンガー部分とヌクレアーゼハーフ-ドメインの間に、以下のアミノ酸配列を含み:
HQRTHQNKKQLV (配列番号:26)
ここで、ジンクフィンガーのC-末端部分の2個の保存されたヒスチジン及びFokI切断ハーフ-ドメイン中の最初の3個の残基に下線が付けられている。従ってこの構築体中のZCリンカー配列は、QNKKである。Bibikovaら、(2001) Mol. Cell Biol. 21:289-297。本発明者らは、様々なZCリンカー長及び配列を有する多くのZFP-FokI融合体ヌクレアーゼを構築し、かつZFP結合部位間に様々な距離を有する一連の基質に対する、これらのヌクレアーゼの切断効率を分析した。実施例4参照。

0099

ある実施態様において、切断ドメインは、2種の切断ハーフ-ドメインを含み、その両方とも結合ドメイン、第一の切断ハーフ-ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含む単独のポリペプチドの一部である。切断ハーフ-ドメインは、それらがDNAを切断するように機能する限りは、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有することができる。

0100

切断ハーフ-ドメインは、個別の分子に提供されてもよい。例えば、2種の融合ポリペプチドが、細胞へ導入されてもよく、ここで各ポリペプチドは、結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む。切断ハーフ-ドメインは、それらがDNAを切断するように機能する限りは、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有することができる。更に結合ドメインは典型的には、融合ポリペプチドとの結合時に、2種の切断ハーフ-ドメインが、切断ドメインを再構成することができ(例えばハーフ-ドメインの二量体化により)るような互いの空間的配向で示され、これにより機能的切断ドメインを形成するように、互いに対しハーフ-ドメインを位置づけし、関心対象の領域での細胞クロマチン切断を生じるように配置されている標的配列に結合する。一般に再構成された切断ドメインによる切断は、ふたつの標的配列間に位置した部位で生じる。タンパク質の一方又は両方は、その標的部位に結合するように操作され得る。

0101

2種の融合タンパク質は、同じ又は反対の極性で関心対象の領域内で結合することができ、それらの結合部位(すなわち標的部位)は、任意の数のヌクレオチド、例えば0〜200個のヌクレオチド又はその間の任意の整数により隔てられ得る。ある実施態様において、各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む2種の融合タンパク質の結合部位は、他方の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定して、5〜18ヌクレオチド離れて、例えば、5〜8ヌクレオチド離れて、又は15〜18ヌクレオチド離れて、又は6ヌクレオチド離れて、又は16ヌクレオチド離れて位置することができ、並びに切断はこれらの結合部位の間で生じる。

0102

DNAが切断される部位は、一般に、2種の融合タンパク質の結合部位の間に位置する。DNAの二本鎖破損は、ふたつの一本鎖破損、又は1、2、3、4、5、6又はそれ以上のヌクレオチドオフセットである「ニック」から生じることが多い(例えば未変性のFokIによる二本鎖DNAの切断は、4ヌクレオチドによる一本鎖破損オフセットから生じる)。従って切断は、各DNA鎖の正確に反対の位置では、必ずしも生じない。加えて融合タンパク質の構造及び標的部位間の距離は、切断が単独のヌクレオチド対に隣接して生じるかどうか、又は切断がいくつかの部位で生じるかどうかに影響を及ぼし得る。しかし標的化された組換え及び標的化された変異誘発を含む多くの適用について(下記参照)、幅のあるヌクレオチドの切断は、一般に十分であり、特定の塩基対間の切断は不要である。

0103

前述のように、融合タンパク質(複数)は、ポリペプチド及び/又はポリヌクレオチドとして導入することができる。例えば、各々前述のポリペプチドのひとつをコードしている配列を含む2個のポリヌクレオチドは、細胞へ導入され、ポリペプチドが発現され及び各々がその標的配列に結合する場合、切断は標的配列で又はその近傍で生じることができる。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードしている配列を含む単独のポリヌクレオチドは、細胞へ導入される。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA又はDNA及び/もしくはRNAの修飾型もしくはアナログであることができる。

0104

切断特異性を増強するために、本明細書において開示された方法において、追加の組成物も使用することができる。例えば、単独の切断ハーフ-ドメインは、限定された二本鎖切断活性を示すことができる。各々3-フィンガージンクフィンガードメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む2種の融合タンパク質が細胞に導入される方法において、いずれかのタンパク質は、約9-ヌクレオチド標的部位を特定する。18ヌクレオチドの凝集標的配列は、恐らく哺乳類ゲノムに特有であるが、所定の9-ヌクレオチド標的部位は、ヒトゲノムにおいて平均して約23,000倍生じる。従って、単独のハーフ-ドメインの位置-特異的結合に起因した、非-特異的切断が生じ得る。従って本明細書に説明された方法は、細胞において2種の融合タンパク質と共に発現されるFokI(又はこれをコードしている核酸)などの切断ハーフ-ドメインのドミナント-ネガティブ変異の使用を企図している。このドミナント-ネガティブ変異は、二量体化は可能であるが、切断することはできず、並びにそれが二量体化されるハーフ-ドメインの切断活性も阻止する。融合タンパク質に対し過剰なモル数のドミナント-ネガティブ変異を提供することにより、両方の融合タンパク質が結合される領域のみが、二量体化及び切断が発生するのに十分に高い機能的切断ハーフ-ドメインの局所的濃度を有するであろう。ただひとつの2種の融合タンパク質が結合される部位で、その切断ハーフ-ドメインは、ドミナント-ネガティブ変異であるハーフ-ドメインと二量体を形成し、望ましくない非-特異的切断は生じない。

0105

FokI切断ハーフ-ドメインの3種の触媒アミノ酸残基が同定されている:Asp 450、Asp 467及びLys 469。Bitinaiteら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575。従ってこれらの残基のひとつでの1個又は複数の変異を使用し、ドミナント-ネガティブ変異を作出することができる。更に他のIIS型エンドヌクレアーゼの多くの触媒アミノ酸残基が公知であり、並びに/又は例えば、FokI配列とのアラインメントによるか及び/もしくは触媒活性の変異の作出及び試験により、決定され得る。

0106

(切断ハーフ-ドメインにおける二量体化ドメイン変異)
ZFP及び切断ハーフ-ドメインの間の融合(例えばZFP/FokI融合体など)の使用に関連する標的化された切断の方法は、各々一般に個別の標的配列に方向付けられた2種のそのような融合分子の使用を必要としている。これら2種の融合タンパク質の標的配列は、標的化された切断が、先に説明されたように、ゲノム内の独自の部位へ方向付けられるように、選択することができる。低下した切断特異性の可能性のある給源は、2種のZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体の一方のホモ二量体化から生じるであろう。これは例えば、ゲノム内の、2種のZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体のひとつの標的配列の逆方向反復の存在により生じ、同じ融合タンパク質の2種のコピーは、機能的二量体の形成を可能にする配向及び間隔で結合することができるように配置される。

0107

意図された標的部位以外の配列でのこの型の異常な切断の可能性を低下するひとつの方法は、ホモ二量体化を最小化又は防止する切断ハーフ-ドメインの変種の作出が関連している。好ましくは、その二量体化に関与したハーフ-ドメインの領域内の1個又は複数のアミノ酸が変更される。FokIタンパク質二量体の結晶構造において、その切断ハーフ-ドメインの構造は、FokIによるDNA切断時の切断ハーフ-ドメインの配置に類似していることが報告されている。Wahら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569。この構造は、483及び487位のアミノ酸残基が、FokI切断ハーフ-ドメインの二量体化において重要な役割を果たすことを示している。この構造は、446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537、及び538位のアミノ酸残基が全て、二量体化に影響を及ぼすのに十分に二量体化界面に近いことを示している。従って前述の位置の1種又は複数のアミノ酸配列変更は、恐らく切断ハーフ-ドメインの二量体化特性を変更するであろう。そのような変化は、例えば、これらの位置に異なるアミノ酸残基を含む(又はコードしている)ライブラリーの構築、並びに所望の特性を伴う変種の選択によるか、又は個々の変異体の理論的デザインにより導入することができる。ホモ二量体化の防止に加え、これらの変異の一部は、ふたつの野生型切断ハーフ-ドメインにより得られるものを上回るよう切断効率を増加することも可能である。

0108

従って、二量体化に影響を及ぼす任意のアミノ酸残基でのFokI切断ハーフ-ドメインの変更は、ZFP/FokI融合体の対のひとつが、望ましくない配列での切断につながり得るホモ二量体化を受けることを防止するために使用することができる。従ってZFP/FokI融合体の対を使用する標的化された切断に関して、一方又は両方の融合タンパク質は、自己-二量体化を阻害するが、切断が所望の標的部位で生じるための2種の融合タンパク質のヘテロ二量体の発生を可能にする、1種又は複数のアミノ酸変更を含むことができる。ある実施態様において、変更は、両方の融合タンパク質において存在し、並びに変更は、追加作用を有し;すなわち、異常な切断につながる、いずれかの融合体のホモ二量体化は、最小化又は消滅されるが、2種の融合タンパク質のヘテロ二量体化は、野生型切断ハーフ-ドメインで得られるものと比較して促進される。実施例5参照。

0109

(ゲノム配列の標的化された変更及び標的化された組換えの方法)
本明細書において、相同の非同一の配列による、ゲノム配列(例えば細胞クロマチンの関心対象の領域)の複製の方法(すなわち標的化された組換え)も説明される。特定の配列を交換する先行する試みは、細胞の、染色体領域と相同性を持つ配列(すなわちドナーDNA)を含むポリヌクレオチドとの接触、それに続くドナーDNA分子がゲノムへの相同組換えを受けている細胞の選択が関連している。相同組換えの貧弱な効率及びドナーDNAの標的部位以外のゲノム領域への非-特異的挿入の高い頻度のために、これらの方法の成功率は低い。

0110

本開示は、より大きい標的化された組換えの効率及びより低い非-特異的挿入事象の頻度を特徴とする標的化された配列変更の方法を提供する。これらの方法は、細胞DNAにおいて1個又は複数の標的化された二本鎖破損を作製するための、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)に融合された操作されたジンクフィンガー結合ドメインの作出及び使用に関連している。細胞DNAの二本鎖破損は、切断部位の近傍で細胞修復機序を数千倍刺激するので、そのような標的化された切断は、ゲノム内の事実上任意の部位での配列の変更又は置換(相同性-方向付けられた修復による)を可能にする。

0111

本明細書に説明された融合分子に加え、選択されたゲノム配列の標的化された置換も、置換(又はドナー)配列の導入を必要とする。ドナー配列は、融合タンパク質(複数)の発現の前に、同時に又は引き続き、細胞へ導入することができる。ドナーポリヌクレオチドは、それとそれに相同性を持つゲノム配列の間の相同組換え(又は相同性-方向付けられた修復)を支援するのに十分な、ゲノム配列への相同性を含む。約25、50、100、200、500、750、1,000、1,500、2,000ヌクレオチド又はそれよりも多い(又は10〜2,000ヌクレオチドの間の任意の整数値、もしくはそれ以上)ドナー及びゲノム配列間の配列相同性は、それらの間の相同組換えを支援するであろう。ドナー配列は、長さ10〜5,000ヌクレオチド(又はそれらの間のヌクレオチドの任意の整数値)又はそれ以上の範囲であることができる。ドナー配列は典型的には、それと置換されるゲノム配列と同じでないことは容易に明らかであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分な相同性が存在する限りは、ゲノム配列に関する1個又は複数の単塩基の変化、挿入、欠失、逆位又は再配列を含むことができる。あるいはドナー配列は、相同性のふたつの領域が側方に位置した非-相同配列を含むことができる。加えてドナー配列は、細胞クロマチンの関心対象の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含むことができる。一般にドナー配列の相同領域(複数)は、組換えが望ましいゲノム配列と、少なくとも50%の配列同一性を有するであろう。ある実施態様において、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、又は99.9%の配列同一性が存在する。1%〜100%の配列同一性の間の任意の値は、ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、存在することができる。

0112

ドナー分子は、細胞クロマチンの相同性のいくつかの不連続領域を含むことができる。例えば、関心対象の領域に通常存在しない配列の標的化された挿入に関して、該配列は、ドナー核酸分子内に存在し、及び関心対象の領域の配列に相同な領域が側方に位置することができる。
ドナー配列の挿入の成功を決定するためのアッセイ(例えばハイブリダイゼーション、PCR、制限酵素消化)を簡略化するために、ある種の配列差が、ゲノム配列と比較してドナー配列に存在することができる。好ましくはコード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列差は、アミノ酸配列を変更しないか、又はサイレントアミノ酸変化(すなわちタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼさない変化)であろう。ドナーポリヌクレオチドは任意に、関心対象の領域のジンクフィンガードメイン結合部位に対応する配列の変化を含むことができ、相同組換えにより細胞クロマチンに導入されるドナー配列の切断を防止する。

0113

ドナーポリヌクレオチドは、DNA又はRNA、一本鎖又は二本鎖であることができ、並びに線状又は環状の形で細胞へ導入することができる。線状の形で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法により、(例えばエキソヌクレアーゼの分解から)保護される。例えば、1種又は複数のジデオキシヌクレオチド残基は、線状分子の3'末端に付加され、及び/又は自己-相補的オリゴヌクレオチドは、片端又は両端に連結される。例えば、Changら、(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963;Nehlsら、(1996) Science, 272:886-889を参照のこと。外来ポリヌクレオチドを分解から保護する追加の方法は、末端アミノ基(複数)の付加及び修飾されたヌクレオチド内連結、例えばホスホロチオアート、ホスホロアミダート及びO-メチルリボースもしくはデオキシリボース残基の使用を含むが、これらに限定されるものではない。ポリヌクレオチドは、例えば、複製起点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードしている遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として、細胞へ導入することができる。更にドナーポリヌクレオチドは、の核酸として、リポソーム又はポロキサマーのような物質と複合された核酸として導入することができるか、又はウイルス(例えばアデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルスレトロウイルスレンチウイルス)により送達することができる。

0114

ある理論に結びつけられるものではないが、細胞配列内の二本鎖破損の存在は、破損に隣接する領域又はその周囲の領域に相同性を有する外来DNA分子の存在と組合せて、ドナー分子から細胞(例えばゲノム又は染色体)配列への配列情報の移行により;すなわち、「遺伝子変換」としても公知である、相同性-方向付けられた修復のプロセスにより、破損を修復する細胞機序を活性化することは明らかである。本出願人の方法は有利なことに、外来配列の挿入が望ましいゲノムの領域へ二本鎖破損を特異的に標的化するために、操作されたZFPの強力な標的化能を、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)と組合せている。

0115

染色体配列の変更に関して、ドナー配列が望ましい配列変更を実現するために十分にコピーされる限りは、ドナーの全配列が染色体にコピーされることは必要ではない。
相同組換えによるドナー配列の挿入効率は、細胞内DNAにおいて、二本鎖破損と組換えが望ましい部位の間の距離に反比例する。別の表現をすると、より高い相同組換え効率は、二本鎖破損が組換えが望ましい部位により近い場合に認められる。組換えの正確な部位が予め決定されていない(例えば、望ましい組換え事象がゲノム配列の間隔を超えて生じる)場合は、ドナー核酸の長さ及び配列は、切断部位(複数)と一緒に、所望の組換え事象を得るように選択される。望ましい事象がゲノム配列の単ヌクレオチド対の配列を変更するようにデザインされる場合において、細胞クロマチンは、そのヌクレオチド対のいずれかの側で10,000ヌクレオチド以内で切断される。ある実施態様において、切断は、その配列が変更されるヌクレオチド対のいずれかの側で、1,000、500、200、100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、又は2ヌクレオチド以内、又は2〜1,000ヌクレオチドの間の任意の整数値で生じる。

0116

先に詳述されたように、各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質の結合部位は、他方の結合部位に最も近い各結合部位の端から測定して、5-8又は15-18ヌクレオチド離れて位置することができ、並びに切断はこれらの結合部位の間で生じる。切断が結合部位の間の単独部位又は複数部位で生じるかどうかは、切断されたゲノム配列は、ドナー配列により置換されるので、重要ではない。従って標的化された組換えによる単ヌクレオチド対の配列の効率的変更に関して、結合部位の間の領域の中間点は、そのヌクレオチド対の10,000ヌクレオチド以内、好ましくは1,000ヌクレオチド以内、又は500ヌクレオチド、もしくは200ヌクレオチド、もしくは100ヌクレオチド、もしくは50ヌクレオチド、もしくは20ヌクレオチド、もしくは10ヌクレオチド、もしくは5ヌクレオチド、もしくは2ヌクレオチド、もしくは1ヌクレオチド以内、又は関心対象のヌクレオチド対の上である。

0117

ある実施態様において、相同染色体は、ドナーポリヌクレオチドとして利用することができる。従って例えば、ヘテロ接合体における変異の補正は、染色体上の変異体配列に結合し及び切断するが、相同染色体上の野生型配列は切断しない融合タンパク質を操作することにより実現することができる。変異を持つ染色体上の二本鎖破損は、相同染色体からの野生型配列が切断された染色体へコピーされ、その結果野生型配列の2種のコピーが回復される、相同性-ベースの「遺伝子変換」プロセスを刺激する。

0118

例えばRAD52エピスタシス群の一員(例えば、Rad50、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad52、Rad54、Rad54B、Mrell、XRCC2、XRCC3)、その生成物が前述の遺伝子産物と相互作用する遺伝子(例えば、BRCA1、BRCA2)、及び/又はNBS1複合体内の遺伝子のような、相同組換えに関連した遺伝子の発現を活性化するための、追加のZFP-機能ドメイン融合体の使用を含むが、これらに限定されるものではない、標的化された組換えのレベルを増強することができる方法及び組成物も提供される。同様に、ZFP-機能ドメイン融合体は、非-相同末端連結に関連した遺伝子(例えば、Ku70/80、XRCC4、ポリ(ADPリボース)ポリメラーゼ、DNAリガーゼ4)の発現を抑制するために、本明細書に開示された方法及び組成物と組合せて使用することができる。例えば、Yanezら、(1998) Gene Therapy, 5:149-159;Hoeijmakers (2001) Nature, 411:366-374;Johnsonら、(2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201;Tauchiら、(2002) Oncogene, 21:8967-8980を参照のこと。ジンクフィンガー結合ドメインと機能ドメインの間の融合体を用い、遺伝子発現を活性化及び抑制する方法は、例えば、共有の米国特許US 6,534,261;US 6,824,978及びUS 6,933,113に開示されている。追加の抑制法は、抑制される遺伝子の配列に標的化されたアンチセンスオリゴヌクレオチド及び/又は低分子干渉RNA(siRNA又はRNAi)の使用を含む。

0119

相同組換えに関連した遺伝子産物発現の活性化の代わりに又はこれに加えて、これらのタンパク質(又はそれらの機能断片)の、関心対象の領域に標的化されたジンクフィンガー結合ドメインとの融合は、これらのタンパク質(組換えタンパク質)の関心対象の領域への動員に使用することができ、これによりそれらの局所的濃度を増大し、かつ更に相同組換えプロセスを刺激する。あるいは、先に説明された相同組換えに関連したポリペプチド(又はそれらの機能断片)は、ジンクフィンガー結合ドメイン、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及び組換えタンパク質(又はそれらの機能断片)を含む、トリプル融合タンパク質の一部であることができる。前述の方法及び組成物において使用することができる、遺伝子変換及び組換え-関連したクロマチンリモデリングに関連した追加のタンパク質は、ヒストンアセチル転移酵素(例えばEsa1p、Tip60)、ヒストンメチル転移酵素(例えばDot1p)、ヒストンキナーゼ及びヒストンホスファターゼを含む。

0120

p53タンパク質は、相同組換え(HR)の抑制において中心的役割を果たすことが報告されている。例えば、Valerieら、(2003) Oncogene, 22:5792-5812;Janzら、(2002) Oncogene, 21:5929-5933参照のこと。例えば、p53-欠損ヒト腫瘍株におけるHR率は、初代ヒト線維芽細胞よりも10,000倍大きく、非-機能的p53を伴う腫瘍細胞においては、機能的p53を伴うものよりも、HRの100倍の増加が存在する。Mekeelら、(1997) Oncogene, 14:1847-1857。加えてp53ドミナントネガティブ変異体過剰発現は、自然発生組換えの20倍の増加につながる。Bertrandら、(1997) Oncogene, 14:1117-1122。様々なp53変異の分析は、転写トランス活性化及びG1細胞周期チェックポイント制御におけるp53の役割は、HRにおけるその関与から分離可能であることを明らかにしている。Saintignyら、(1999) Oncogene, 18:3553-3563;Boehdenら、(2003) Oncogene, 22:4111-4117。従ってp53活性の下方制御は、本明細書に開示された方法及び組成物を使用し、標的化された相同組換えの効率を増大するために役立つ。例えば共有の米国特許US 6,534,261に開示された方法に従う、p53ドミナントネガティブ変異体の同時形質移入及び過剰発現、又はp53遺伝子発現の標的化された抑制を含むが、これらに限定されるものではない、p53活性の下方制御のあらゆる方法を使用することができる。

0121

ジンクフィンガー/ヌクレアーゼ融合分子及びドナーDNA分子を含む細胞における、標的化された組換え効率の更なる増加は、相同性-駆動した修復プロセスが最大に活性化される場合に、細胞周期のG2期における細胞のブロックにより活性化される。そのような停止は、多くの方法で実現することができる。例えば細胞は、G2期で細胞を停止するために、細胞周期の進行に影響を及ぼす薬物、化合物及び/又は小型分子などにより処理することができる。この型の分子の例は、微小管重合に影響する化合物(例えばビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール)、DNAと相互作用する化合物(例えばcis-白金(II)ジアミンジクロリドシスプラチンドキソルビシン)、及び/又はDNA合成に影響する化合物(例えば、チミジンヒドロキシ尿素、L-ミモシンエトポシド5-フルオロウラシル)を含むが、これらに限定されるものではない。組換え効率の更なる増加は、細胞組換え機構により接近可能であるゲノムDNAを作出するように、クロマチン構造を変更する、ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)阻害剤(例えば、酪酸ナトリウムトリコスタチンA)の使用により実現される。

0122

細胞周期停止のための追加の方法は、例えば、そのタンパク質をコードしているcDNAを細胞へ導入することによるか、又はそのタンパク質をコードしている遺伝子の発現を活性化する操作されたZFPを細胞へ導入することにより、CDK細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質の過剰発現を含む。細胞周期停止は、例えば、RNAi法(例えば米国特許US 6,506,559)を使用することによるか、又は細胞周期進行に関連した1種又は複数の遺伝子、例えばサイクリン及び/又はCDK遺伝子などの発現を抑制する操作されたZFPの細胞への導入などによる、サイクリン及びCDKの活性の阻害によっても実現される。遺伝子発現の調節のための操作されたジンクフィンガータンパク質の合成法については、例えば共有の米国特許US 6,534,261を参照のこと。
あるいは、ある場合において、ドナーポリヌクレオチドの非存在下において標的化された切断が実行され(好ましくはS又はG2期)、並びに組換えは、相同染色体間で生じる。

0123

(相同組換えを促進する細胞因子スクリーニング法)
相同組換えは、DNA末端の修飾及びいくつかの細胞因子のタンパク質複合体への動員を必要とする多工程プロセスであるので、ドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体をコードしているベクターと一緒の、1種又は複数の外来因子の添加を、標的化された相同組換えを促進するために使用することができる。そのような因子のひとつ又は複数を同定する方法の例は、異なる細胞のmRNA発現パターンを比較するために、マイクロアレイ(例えばAffymetrix Gene Chip(登録商標アレイ)を用いる、遺伝子発現の分析を使用する。例えば、自発的な(unaided)又は遺伝子補正のレベルを増加することがわかっている条件下のいずれかでの、ドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体の存在下での二重鎖破損-駆動した相同組換えを刺激するより高い能力を発揮する細胞は、それらの遺伝子発現パターンについて、そのような能力を欠いている細胞と比較し、分析することができる。これにより相同組換えの増加したレベルと直接相関するように上方制御又は下方制御された遺伝子は同定され、多くの発現ベクターのいずれかひとつにクローニングされ得る。これらの発現構築体は、ジンクフィンガー-切断ドメイン融合体及びドナー構築体と共に同時-形質移入され、高い効率の相同組換えを実現する改善された方法を得ることができる。あるいは、そのような遺伝子の発現は、これらの遺伝子の1種又は複数の発現を変調する(活性化又は抑制のいずれか)操作されたジンクフィンガータンパク質を使用し、適宜調節することができる。遺伝子発現を調節するための操作されたジンクフィンガータンパク質の合成法については、例えば共有の米国特許US 6,534,261を参照のこと。

0124

例として、ドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体をコードしているプラスミドを形質移入した場合に、実施例9及び図27に説明された実験において得られた様々なクローンは、広範な相同組換え頻度を示したことが観察された。こうして標的化された組換えの高い頻度を示すクローンにおける遺伝子発現は、低い頻度を示すクローンにおける発現と比べることができ、前者のクローンに特有の発現パターンが同定され得る。

0125

追加の例として、細胞周期インヒビター(例えばノコダゾール又はビンブラスチン、例えば実施例11、14及び15参照)を使用する研究は、細胞周期のG2期で停止された細胞は、より高い率で相同組換えを実行することを示し、このことは相同組換えに責任を果たす細胞因子は、G2において優先的に発現されるか又は活性があることを示している。これらの因子を同定する一法は、高及び低レベルで遺伝子補正を実行する安定して形質移入されたHEK 293細胞クローン(例えばクローンT18、対、クローンT7)の間のmRNA発現パターンを比較することである。細胞をG2期で停止する化合物に対する反応の同様の比較が、これらの細胞株間において行われる。自発的に又はG2で細胞を停止する化合物に反応してのいずれかで、より高率で相同組換えを実行する細胞において異なって発現される候補遺伝子は、同定され、クローニングされ、及び細胞へ再導入され、それらの発現が、改善された割合を再度-低下する(re-capitulate)のに十分であるかどうかを決定する。あるいは、該候補遺伝子の発現は、共有の米国特許US 6,534,261に開示された操作されたジンクフィンガー転写因子を用い、活性化される。

0126

(発現ベクター)
1種又は複数のZFP又はZFP融合タンパク質をコードしている核酸は、複製及び/又は発現のための原核細胞又は真核細胞への形質転換のために、ベクターへクローニングすることができる。ベクターは、原核ベクター、例えばプラスミド、又はシャトルベクター昆虫ベクター、又は真核ベクターであってよい。ZFPをコードしている核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原虫細胞へ投与するために、発現ベクターにクローニングすることもできる。

0127

クローニングされた遺伝子又は核酸配列を得るために、ZFP又はZFP融合タンパク質をコードしている配列は典型的には、転写を指示するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。好適な細菌プロモーター及び真核プロモーターは、当該技術分野において周知であり、例えばSambrookら、「Molecular Cloning, A Laboratory Manual」(第2版, 1989;第3版, 2001);Kriegler, 「Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual」(1990);及び、「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubelら、前掲, Bacterial expression systems for expressing the ZFP are available in, e.g., E. coli, Bacillus sp., and Salmonella (Palvaら、Gene, 22:229-235 (1983))に説明されている。そのような発現システムキットは、市販されている。哺乳類細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現システムは、当業者に周知であり、同じく市販されている。

0128

ZFP-コードしている核酸の発現を指示するために使用されるプロモーターは、特定の用途によって決まる。例えば、強力な構成的プロモーターは典型的には、ZFPの発現及び精製に使用される。対照的にZFPが遺伝子調節のためにin vivo投与される場合、ZFPの特定の使用によって左右される、構成的又は誘導的のいずれかのプロモーターが使用される。加えて、ZFPの投与に好ましいプロモーターは、HSVTK又は同様の活性を有するプロモーターのように、弱いプロモーターであることができる。プロモーターは典型的には、トランス活性化応答性であるエレメント、例えば、低酸素症応答エレメントなど、Gal4応答エレメント、lacリプレッサー応答エレメント、及び小型分子制御システム、例えばtet-調節システム及びRU-486システムを含むことができる(例えば、Gossen & Bujard, PNAS 89:5547 (1992);Oliginoら、Gene Ther. 5:491-496 (1998);Wangら、Gene Ther. 4:432-441 (1997);Neeringら、Blood, 88:1147-1155 (1996);及び、Rendahlら、Nat. Biotechnol. 16:757-761 (1998)を参照のこと)。MNDU3プロモーターも使用することができ、CD34+造血幹細胞において優先的に活性化される。

0129

発現ベクターは典型的には、プロモーターに加え、原核又は真核のいずれかの、宿主細胞における核酸の発現に必要な追加エレメントを全て含む、転写ユニット又は発現カセットを含む。従って典型的発現カセットは、例えばZFPをコードしている核酸配列に機能的に連結されたプロモーター、及び例えば転写産物の有効なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、もしくは翻訳終結のために必要なシグナルを含む。カセットの追加のエレメントは、例えばエンハンサー、及び異種スプライシングシグナルを含んでよい。

0130

遺伝情報の細胞への輸送に使用される特定の発現ベクターは、ZFPの意図された用途、例えば植物、動物、細菌、真菌、原虫などにおける発現に関して選択される(下記に説明された発現ベクター参照)。標準の細菌発現ベクターは、pBR322-ベースのプラスミド、pSKF、pET23Dなどのプラスミド、並びにGST及びLacZのような市販の融合発現システムを含む。例証的融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質「MBP」である。このような融合タンパク質は、ZFPの精製に使用される。例えばc-myc又はFLAGなどの、エピトープタグも、発現をモニタリングするため、並びに細胞及び細胞下局在をモニタリングするための、単離の簡便な方法を提供するために、組換えタンパク質に追加することができる。

0131

真核ウイルス由来調節エレメントを含む発現ベクターは、真核発現ベクター、例えばSV40ベクター、パピローマウイルスベクター、及びエプスタイン・バーウイルス由来のベクターにおいて頻繁に使用される。他の真核ベクターの例は、pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、バキュロウイルスpDSVE、及びSV40初期プロモーター、SV40後期プロモーターメタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、もしくは真核細胞における発現に効果があることが示された他のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にするいずれか他のベクターを含む。

0132

一部の発現システムは、チミジンキナーゼハイグロマイシンBリン酸転移酵素、及びジヒドロ葉酸還元酵素などの、安定して形質移入された細胞株の選択マーカーを有する。ポリヘドリンプロモーター又は他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下で、ZFPコード配列と共に、昆虫細胞においてバキュロウイルスベクターを使用するような、高収率の発現システムも適している。
典型的には発現ベクターに含まれるエレメントは、E. coliにおいて機能するレプリコン組換えプラスミドを収容する細菌の選択を可能にするために抗生物質耐性をコードしている遺伝子、及び組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域の独自の制限部位も含む。

0133

標準形質移入法を使用し、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳類、酵母又は昆虫の細胞株を作出し、次にこれらは標準技術により精製される(例えば、Colleyら、J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989);「Guide to Protein Purification, in Methodsin Enzymology」, vol.182 (Deutscher編集、1990)参照)。真核細胞及び原核細胞の形質転換は、標準技術に従い実行される(例えば、Morrison、J. Bact. 132:349-351 (1977);Clark-Curtiss & Curtiss, 「Methods in Enzymology」 101:347-362(Wuら編集、1983)参照)。

0134

異物ヌクレオチド配列の宿主細胞への導入の任意の周知の手順を使用しても良い。これらは、リン酸カルシウム形質移入、ポリブレンプロトプラスト融合、電気穿孔法、超音波法(例えばソノポレーション)、リポソーム、微量注入、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター、エピソームの及び組込みの両方、並びにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAもしくは他の異物遺伝物質の宿主細胞への導入に関する他の周知の方法のいずれかの使用を含む(例えば、Sambrookら、前掲参照)。使用される特定の遺伝子操作手順は、少なくとも1種の遺伝子を、選択されたタンパク質を発現することが可能である宿主細胞へうまく導入することが可能であることのみが必要である。

0135

(融合タンパク質をコードしている核酸及び細胞への送達)
従来のウイルス及び非-ウイルスベース遺伝子導入法を使用し、細胞(例えば哺乳類細胞)及び標的組織において、操作されたZFPをコードしている核酸を導入することができる。そのような方法は、in vitroにおけるZFPをコードしている核酸の細胞への投与にも使用することができる。ある実施態様において、ZFPをコードしている核酸は、in vivo又はex vivo遺伝子治療の用途のために投与される。非-ウイルスベクター送達システムは、DNAプラスミド、裸の核酸、及びリポソーム又はポロキサマーなどの送達ビヒクルとの核酸複合体を含む。ウイルスベクター送達システムは、DNA及びRNAウイルスを含み、これは細胞への送達後にエピソームの又は組込まれたゲノムのいずれかを有する。遺伝子治療手順の検証については、Anderson、Science, 256:808-813 (1992);Nabel及びFeigner、TIBTECH, 11:211-217 (1993);Mitani及びCaskey、TIBTECH, 11:162-166 (1993);Dillon、TIBTECH, 11:167-175 (1993);Miller、Nature, 357:455-460 (1992);Van Brunt、Biotechnology, 6(10):1149-1154 (1988);Vigne、Restorative Neurology and Neuroscience, 8:35-36 (1995);Kremer及びPerricaudet、British Medical Bulletin, 51(1):31-44 (1995);Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler及びBohm(編集) (1995);及び、Yuら、Gene Therapy, 1:13-26 (1994)を参照のこと。

0136

操作されたZFPをコードしている核酸の非-ウイルス送達の方法は、電気穿孔法、リポフェクション、微量注入、遺伝子銃ビロソーム、リポソーム、イムノリポソームポリカチオン又は脂質:核酸複合体、裸のDNA、人工ビリオン、並びにDNAの物質で増強された取込を含む。例えばSonitoron 2000システム(Rich-Mar)を使用するソノポレーションを、核酸の送達に使用することもできる。
追加の核酸送達システムの例は、Amaxa Biosystems(Cologne, 独国)、Maxcyte, Inc.(ロックビル, MD)及びBTXMolecular Delivery Systems(ホリストン, MA)により提供されたものを含む。

0137

リポフェクションは、例えばUS 5,049,386、US 4,946,787;及び、US 4,897,355に開示されており、リポフェクション試薬は市販されている(例えば、Transfectam(商標)及びLipofectin(商標))。ポリヌクレオチドの効率的受容体-認識リポフェクションに適している陽性及び中性の脂質は、FelgnerのWO 91/17424、WO 91/16024のものを含む。送達は、細胞(ex vivo投与)又は標的組織(in vivo投与)であってよい。

0138

イムノ脂質複合体のような標的化されたリポソームを含む、脂質:核酸複合体の調製は、当業者に周知である(例えばCrystal、Science, 270:404-410 (1995);Blaeseら、Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995);Behrら、Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994);Remyら、Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994);Gaoら、Gene Therapy, 2:710-722 (1995);Ahmadら、Cancer Res. 52:4817-4820 (1992);米国特許US 4,186,183、US 4,217,344、US 4,235,871、US 4,261,975、US 4,485,054、US 4,501,728、US 4,774,085、US 4,837,028、及びUS 4,946,787を参照のこと)。

0139

操作されたZFPをコードしている核酸の送達のためのRNA又はDNAウイルスベースのシステムの使用は、体内の特異的細胞へのウイルスの標的化及び核へのウイルスペイロードの輸送のために、高度に進展したプロセスを利用する。ウイルスベクターは、患者へ直接投与(in vivo)することができるか、又はこれらは、in vitroにおいて細胞を処理するために使用することができ、これらの修飾された細胞が、患者へ投与される(ex vivo)。ZFPの送達のための通常のウイルスベースのシステムは、遺伝子導入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスワクシニアウイルス及び単純ヘルペスウイルスのベクターを含むが、これらに限定されるものではない。宿主ゲノムにおける組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルス遺伝子導入法において可能であり、挿入された導入遺伝子の長期発現を生じることが多い。加えて高い形質導入効率が、多くの様々な細胞型及び標的組織において認められる。

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