図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2015年9月17日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (8)

課題

種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質薬力学的および/または薬物動態特性を改善する、水溶性ポリマーをタンパク質に複合化させるための物質および方法を提供する。

解決手段

本発明は、タンパク質にポリマーを複合化させるための物質および方法を提供し、それは種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する。本発明の種々の実施形態において、アニリンの代わりに使用するための代替的な触媒が提供される。

概要

背景

水溶性ポリマー治療用タンパク質との間の共有結合を形成することによる複合体の調製が、様々な化学方法によって実施することができる。ポリペプチド薬物のPEG化は、循環中にそれらを保護し、それらの薬力学的および薬物動態プロファイルを改善させる(Harris and Chess,Nat Rev Drug Discov.2003;2:214−21)。PEG化プロセスは、エチレングリコール反復単位ポリエチレングリコール(PEG))を、ポリペプチド薬物に付着させる。PEG分子は、大きな流体力学的体積球状タンパク質の5〜10倍の大きさ)を有し、非常に水溶性であり、水和されており、非毒性であって、非免疫原性であり、身体から迅速に除去される。分子のPEG化は、薬物の酵素分解に対する耐性の増大、インビボでの半減期の増大、投与頻度の減少、免疫原性の減少、物理的および熱安定性の増大、溶解度の増大、液体定性の増大、凝集の低減をもたらすことができる。最初のPEG化薬物は、1990年代初期FDAによって承認された。それ以降、FDAは、経口、注入可能、および局所投与のための種々のPEG化薬物を承認している。

コロミン酸(CA)とも称されるポリシアル酸(PSA)は、天然由来多糖である。それは、α(2→8)ケトシド連結を有するN−アセチルノイラミン酸ホモポリマーであり、その非還元末端において隣接ジオール基を含有する。それは負荷電され、かつヒトの身体の天然成分である。それは細菌から大量に、および規定の物理的特徴を有して容易に産生することができる(特許文献1)。細菌によって産生されたPSAが、ヒトの身体内で産生されたPSAと化学的および免疫学的に同一であるため、細菌性PSAは、タンパク質に結合したときでさえ、非免疫原性である。幾つかのポリマーとは異なり、PSA酸は、生物分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼへのコロミン酸の共有結合は、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を増大することが明らかになっている。ポリシアル酸化および非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした(Fernandes and Gregoriadis,Int J Pharm 2001;217:215−24)。

ペプチドまたはタンパク質へのPEG誘導体の結合は、Robertsら (Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459−76)によって検討されている。治療用タンパク質への水溶性ポリマーの結合のための1つのアプローチは、タンパク質の炭水化物部分を介するポリマーの複合化である。タンパク質中の炭水化物の隣接ヒドロキシル(OH)基は、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)で容易に酸化され、活性アルデヒド基を形成することができる(Rothfus et Smith,J Biol Chem 1963;238:1402−10、van Lenten et Ashwell,J Biol Chem 1971;246:1889−94)。その後、ポリマーは、例えば、活性ヒドラジド基を含有する試薬の使用によって、炭水化物のアルデヒド基に結合することができる(Wilchek M and Bayer EA,MethodsEnzymol 1987;138:429−42)。より近年の技術は、アルデヒドと反応してオキシム連結を形成するアミノオキシ基を含有する試薬の使用である(特許文献2、特許文献3)。

治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化を説明する更なる例は、フォンヴィレブランド因子中の炭水化物部分の酸化、およびそれに続くヒドラジド化学を使用するPEGへの結合を教示する特許文献4、rFVIIIの酸化、ならびにそれに続くヒドラジド化学を使用するPEGおよび他の水溶性ポリマー(例えば、PSA、HES、デキストラン)への結合を教示する特許文献5、異なる凝固因子(例えば、rFIX、FVIII、およびFVIIa)の酸化、ならびにそれに続くオキシム連結を形成することによって、アミノオキシ化学を使用する、例えば、PEGへの結合を教示する特許文献3、およびFIXの酸化、ならびにそれに続くヒドラジド化学を使用するPEGへの結合を教示する特許文献6に説明されている。

近年、アルデヒドを生成するためのシアル酸の緩やかなな過ヨウ素酸塩酸化後、触媒量のアニリンの存在下での、試薬を含有するアミノオキシ基との反応を含む、改善された方法が、説明された(Dirksen A.,and Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008;19,2543−8、およびZeng Y et al.,Nature Methods2009;6:207−9)。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。求核触媒の使用はまた、Dirksen,A.,et al.,J Am Chem Soc.,128:15602−3(2006)、Dirksen,A.,et al.,Angew chem.Int Ed.,45:7581−4(2006)、Kohler,J.J.,ChemBioChem.,10:2147−50(2009)、Giuseppone,N.,et al.,J Am Chem Soc.,127:5528−39(2005)、およびThygesen,M.B.,et al.,J Org Chem.,75:1752−5(2010)にも説明されている。

アニリン触媒は、オキシムライゲーションを加速させ、短い反応時間および低い濃度のアミノオキシ試薬の使用を可能にするが、アニリンは、例えば、複合化される治療用タンパク質が、薬剤基礎を形成する際には、考慮しなければならない、有毒性を有する。例えば、アニリンは、メトヘモグロビン血症を誘発することが示されている(Harrison,J.H..,and Jollow,D.J.,Molecular Pharmacology,32(3)423−431,1987)。ラットの長期間の食餌療法は、膵臓中に腫瘍を誘発することが示されている(Goodman,DG.,et al.,J Natl Cancer Inst.,73(1):265−73,1984)。インビトロ研究はまた、アニリンが、染色体突然変異を誘発する可能性があり、遺伝毒性作用を起こす可能性があることも示している(Bombhard E.M.et Herbold B,Critical Reviews in Toxicology 35,783−835,2005)。

アニリンの危険な特性の可能性を考慮し、水溶性ポリマーを治療用タンパク質に複合化させるための方法が使用可能であるにもかかわらず、種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する、水溶性ポリマーをタンパク質に複合化させるための物質および方法を開発する必要性が、依然として存在する。

概要

種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する、水溶性ポリマーをタンパク質に複合化させるための物質および方法を提供する。本発明は、タンパク質にポリマーを複合化させるための物質および方法を提供し、それは種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する。本発明の種々の実施形態において、アニリンの代わりに使用するための代替的な触媒が提供される。なし

目的

本発明によって企図される治療用タンパク質を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

明細書中に記載の発明。

技術分野

0001

本発明は、水溶性ポリマータンパク質複合化させるための物質および方法に関する。

背景技術

0002

水溶性ポリマーと治療用タンパク質との間の共有結合を形成することによる複合体の調製が、様々な化学方法によって実施することができる。ポリペプチド薬物のPEG化は、循環中にそれらを保護し、それらの薬力学的および薬物動態プロファイルを改善させる(Harris and Chess,Nat Rev Drug Discov.2003;2:214−21)。PEG化プロセスは、エチレングリコール反復単位ポリエチレングリコール(PEG))を、ポリペプチド薬物に付着させる。PEG分子は、大きな流体力学的体積球状タンパク質の5〜10倍の大きさ)を有し、非常に水溶性であり、水和されており、非毒性であって、非免疫原性であり、身体から迅速に除去される。分子のPEG化は、薬物の酵素分解に対する耐性の増大、インビボでの半減期の増大、投与頻度の減少、免疫原性の減少、物理的および熱安定性の増大、溶解度の増大、液体定性の増大、凝集の低減をもたらすことができる。最初のPEG化薬物は、1990年代初期FDAによって承認された。それ以降、FDAは、経口、注入可能、および局所投与のための種々のPEG化薬物を承認している。

0003

コロミン酸(CA)とも称されるポリシアル酸(PSA)は、天然由来多糖である。それは、α(2→8)ケトシド連結を有するN−アセチルノイラミン酸ホモポリマーであり、その非還元末端において隣接ジオール基を含有する。それは負荷電され、かつヒトの身体の天然成分である。それは細菌から大量に、および規定の物理的特徴を有して容易に産生することができる(特許文献1)。細菌によって産生されたPSAが、ヒトの身体内で産生されたPSAと化学的および免疫学的に同一であるため、細菌性PSAは、タンパク質に結合したときでさえ、非免疫原性である。幾つかのポリマーとは異なり、PSA酸は、生物分解性である。カタラーゼおよびアスパラギナーゼへのコロミン酸の共有結合は、タンパク質分解酵素または血漿の存在下での酵素安定性を増大することが明らかになっている。ポリシアル酸化および非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした(Fernandes and Gregoriadis,Int J Pharm 2001;217:215−24)。

0004

ペプチドまたはタンパク質へのPEG誘導体の結合は、Robertsら (Adv Drug Deliv Rev 2002;54:459−76)によって検討されている。治療用タンパク質への水溶性ポリマーの結合のための1つのアプローチは、タンパク質の炭水化物部分を介するポリマーの複合化である。タンパク質中の炭水化物の隣接ヒドロキシル(OH)基は、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)で容易に酸化され、活性アルデヒド基を形成することができる(Rothfus et Smith,J Biol Chem 1963;238:1402−10、van Lenten et Ashwell,J Biol Chem 1971;246:1889−94)。その後、ポリマーは、例えば、活性ヒドラジド基を含有する試薬の使用によって、炭水化物のアルデヒド基に結合することができる(Wilchek M and Bayer EA,MethodsEnzymol 1987;138:429−42)。より近年の技術は、アルデヒドと反応してオキシム連結を形成するアミノオキシ基を含有する試薬の使用である(特許文献2、特許文献3)。

0005

治療用タンパク質への水溶性ポリマーの複合化を説明する更なる例は、フォンヴィレブランド因子中の炭水化物部分の酸化、およびそれに続くヒドラジド化学を使用するPEGへの結合を教示する特許文献4、rFVIIIの酸化、ならびにそれに続くヒドラジド化学を使用するPEGおよび他の水溶性ポリマー(例えば、PSA、HES、デキストラン)への結合を教示する特許文献5、異なる凝固因子(例えば、rFIX、FVIII、およびFVIIa)の酸化、ならびにそれに続くオキシム連結を形成することによって、アミノオキシ化学を使用する、例えば、PEGへの結合を教示する特許文献3、およびFIXの酸化、ならびにそれに続くヒドラジド化学を使用するPEGへの結合を教示する特許文献6に説明されている。

0006

近年、アルデヒドを生成するためのシアル酸の緩やかなな過ヨウ素酸塩酸化後、触媒量のアニリンの存在下での、試薬を含有するアミノオキシ基との反応を含む、改善された方法が、説明された(Dirksen A.,and Dawson PE,Bioconjugate Chem.2008;19,2543−8、およびZeng Y et al.,Nature Methods2009;6:207−9)。アニリン触媒は、オキシムライゲーションを著しく加速させ、非常に低い濃度の試薬の使用を可能にする。求核触媒の使用はまた、Dirksen,A.,et al.,J Am Chem Soc.,128:15602−3(2006)、Dirksen,A.,et al.,Angew chem.Int Ed.,45:7581−4(2006)、Kohler,J.J.,ChemBioChem.,10:2147−50(2009)、Giuseppone,N.,et al.,J Am Chem Soc.,127:5528−39(2005)、およびThygesen,M.B.,et al.,J Org Chem.,75:1752−5(2010)にも説明されている。

0007

アニリン触媒は、オキシムライゲーションを加速させ、短い反応時間および低い濃度のアミノオキシ試薬の使用を可能にするが、アニリンは、例えば、複合化される治療用タンパク質が、薬剤基礎を形成する際には、考慮しなければならない、有毒性を有する。例えば、アニリンは、メトヘモグロビン血症を誘発することが示されている(Harrison,J.H..,and Jollow,D.J.,Molecular Pharmacology,32(3)423−431,1987)。ラットの長期間の食餌療法は、膵臓中に腫瘍を誘発することが示されている(Goodman,DG.,et al.,J Natl Cancer Inst.,73(1):265−73,1984)。インビトロ研究はまた、アニリンが、染色体突然変異を誘発する可能性があり、遺伝毒性作用を起こす可能性があることも示している(Bombhard E.M.et Herbold B,Critical Reviews in Toxicology 35,783−835,2005)。

0008

アニリンの危険な特性の可能性を考慮し、水溶性ポリマーを治療用タンパク質に複合化させるための方法が使用可能であるにもかかわらず、種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する、水溶性ポリマーをタンパク質に複合化させるための物質および方法を開発する必要性が、依然として存在する。

先行技術

0009

米国特許第5,846,951号明細書
国際公開第96/40662号
国際公開第2008/025856号
国際公開第06/071801号
米国公開第2009/0076237号明細書
米国特許第5,621,039号

課題を解決するための手段

0010

本発明は、タンパク質にポリマーを複合化させるための物質および方法を提供し、それは種々の試薬に関連する費用を最小限に抑え、患者の受容者への健康上のリスクを最小限に抑えつつ、タンパク質の薬力学的および/または薬物動態特性を改善する。本発明の種々の実施形態において、アニリンの代わりに使用するための代替的な触媒が提供される。

0011

一実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプンヒドロキシアルキルデンプンHAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類プルランキトサンヒアルロン酸コンドロイチン硫酸塩デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストランポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリンポリアクリロイルモルホリンポリビニルアルコールPVA)、ポリカルボン酸塩ポリビニルピロリドンポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェートMPC)からなる群から選択され、該炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結の形成が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸スルファニル酸、o−アミノベンズアミドo−トルイジンm−トルイジンp−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される。

0012

別の実施形態において、水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法が提供され、本方法は、複合化を可能にする条件下で、酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、該治療用タンパク質は、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインCプロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼIL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチンTPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン血管内皮増殖因子VEGF)、アンジオゲニンアクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子カルジオトロフィン−1、繊毛神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプトクリティックサイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子エピゲンエピレグリン上皮誘導好中球誘引物質線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子肝細胞増殖因子受容体肝細胞癌由来増殖因子インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質ケラチノサイト増殖因子白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体ニューロエチンニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリンレクチンリシンプロラクチン絨毛性ゴナドトロピン卵胞刺激ホルモン甲状腺刺激ホルモン組織プラスミノゲン活性化因子IgGIgEIgMIgA、およびIgDα−ガラクトシダーゼβ−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン黄体形成ホルモンエストロゲン、インスリン、アルブミンリポタンパク質フェトプロテイントランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチンヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、水溶性ポリマーは、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、該炭水化物部分は、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、オキシム連結が、酸化炭水化物部分と水溶性ポリマー上の活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結の形成は、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される。

0013

更に別の実施形態において、活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、約0.3mg/mL〜約3.0mg/mLの初期濃度の治療用タンパク質を含む溶液が、pH値が約5.0〜約8.0になるように調整される、上述の方法が提供される。

0014

本明細書で使用される「約」という用語は、所与の値を上回るまたは下回る値を意味する。種々の実施形態において、「約」という用語は、所与の値の0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10%をプラスまたはマイナスした所与の値を含む。

0015

また別の実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度は約1.0mg/mLであり、pHは約6.0である、上述の方法が提供される。関連した実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度は約0.75mg/mLであり、pHは約6.0である。また別の関連した実施形態において、治療用タンパク質の初期濃度は約1.25mg/mLであり、pHは約6.0である。

0016

別の実施形態において、治療用タンパク質は所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、過剰濃度は約1モル〜約300モル過剰である、上述の方法が提供される。別の実施形態において、過剰濃度は約50倍のモル過剰である。

0017

更に別の実施形態において、治療用タンパク質は、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、上述の方法が提供される。別の実施形態において、該条件は、約120分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。本明細書で使用される「撹拌」という用語は、一般に使用される実験または製造装置および製品によって様々な速度および強度で撹拌する(例えば、穏やかに撹拌する)ことを含むことを意味する。

0018

別の実施形態において、求核触媒が、約0.1分〜約30分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1.0mM〜約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、求核触媒の最終濃度は約10mMであり、該条件は、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。

0019

更に別の実施形態において、酸化剤は、約0.1分〜120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM〜約1000μMの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、酸化剤の最終濃度は、約400μMであり、該条件は、約10分の期間、約22oCの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。

0020

また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分への水溶性ポリマーの複合化が、L−システインメチオニングルタチオングリセロールメタ重亜硫酸ナトリウム(Na2S2O5)、トリプトファンチロシンヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾールイミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、該反応停止剤が、約5分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約100mMの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される、上述の方法が提供される。別の実施形態において、反応停止剤は、L−システインである。更に別の実施形態において、L−システインは、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、該条件は、約60分の期間、約22oCの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。

0021

別の実施形態において、a)pH値が約5.0〜約8.0になるように、治療用タンパク質を含む溶液のpH値を調整させることを含み、治療用タンパク質濃度が約0.3mg/mL〜約3.0mg/mLである、第1のステップと、b)治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、酸化剤が、約0.1分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM〜約1000μMの最終濃度をもたらすように、第1のステップ中の溶液に添加される、第2のステップと、c)所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと治療用タンパク質を接触させることを含み、過剰濃度が約1モル過剰〜約300モル過剰であり、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下である、第3のステップと、d)第3のステップの溶液に、求核触媒を添加することを含み、求核触媒が、約0.1分〜約30分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約50mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと、e)治療用タンパク質が、治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への活性化水溶性ポリマーの複合化を可能にする条件下で、活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、該条件が、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第5のステップと、f)第5のステップ中の治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への水溶性ポリマーの複合化が、L−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Na2S2O5(メタ重亜硫酸ナトリウム)、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、反応停止剤が、約5分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約100mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、を含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、第1のステップ中の治療用タンパク質の初期濃度が約1mg/mLであり、pHが約6.0であり、第2のステップ中の酸化剤の最終濃度が約400μMであり、第5のステップ中の条件が、約10分の期間、約22oCの温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第3のステップ中の過剰濃度が約50モル過剰であり、第3のステップ中の条件が、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第4のステップ中の求核触媒の最終濃度が約10mMであり、第4のステップ中の条件が、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第5のステップ中の活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに治療用タンパク質をインキュベートする条件が、約2時間の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、第6のステップ中の反応停止剤がL−システインであり、L−システインが約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、第6のステップ中の条件が、約60分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む。

0022

別の実施形態において、水溶性ポリマーはPSAである、上述の方法が提供される。別の実施形態において、PSAは約10〜300個のシアル酸単位からなる。別の実施形態において、水溶性ポリマーはPEGである。別の実施形態において、水溶性ポリマーはHESである。更に別の実施形態において、水溶性ポリマーはHASである。

0023

更に別の実施形態において、治療用タンパク質はFIXである、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質はFVIIaである。別の実施形態において、治療用タンパク質はFVIIIである。

0024

また別の実施形態において、酸化剤は過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)である、上述の方法が提供される。

0025

別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分は血液凝固タンパク質活性化ペプチド内に位置する、上述の方法が提供される。

0026

一実施形態において、PSAが、活性化アミノオキシリンカーを酸化PSAと反応させることによって調製される、上述の方法が提供され、該アミノオキシリンカーが、
a)式:

0027

の3−オキサペンタン−1,5−ジオキシアミンリンカー、
b)式:

0028

の3,6,9−トリオキサウンデカン−1,11−ジオキシアミンリンカー、
および
c)式:

0029

の3,6,9,12,15−ペナトキサ(penatoxa)−ヘプタデカン−1,17−ジオキシアミンリンカーからなる群より選択され、
PSAが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、PSAの非還元末端において末端アルデヒド基を形成する。関連した実施形態において、アミノオキシリンカーは3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンである。

0030

更に別の実施形態において、酸化剤はNaIO4である、上述の方法が提供される。

0031

別の実施形態において、求核触媒は約1mM〜約50mMである、上述の方法が提供される。一実施形態において、求核触媒はm−トルイジンである。更に別の実施形態において、m−トルイジンは、約10mMの濃度で、複合化反応物において存在する。

0032

また別の実施形態において、シアホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)、アスコルビン酸ビタミンC)、およびNaBH3からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝液中で複合化された治療用タンパク質をインキュベートすることによって複合化された治療用タンパク質中のオキシム連結を還元するステップを更に含む、上述の方法が提供される。一実施形態において、還元化合物はシアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)である。

0033

更に別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される。別の実施形態において、クロマトグラフィは疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)、イオン交換クロマトグラフィIEC)、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される。更に別の実施形態において、抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される。また別の実施形態において、クロマトグラフィはカラムにおいて行われる。別の実施形態において、カラムはフェニルセファロースFFおよびブチル−セファロースFFからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む。別の実施形態において、樹脂は約5cm〜約20cmの床高さでカラム中に存在する。一実施形態において、床高さは約10cmである。

0034

別の実施形態において、流れ方向が上向流に設定され、流速が約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップを含む、上述の方法が提供される。本明細書で使用される「下向流」という用語は、クロマトグラフィカラムの上部からクロマトグラフィカラムの底部への流れ方向(正常な流れ方向/標準モード)を指す。本明細書で使用される「上向流」という用語は、カラムの底部から上部への流れ方向(逆の流れ方向)を指す。一実施形態において、流速は約2cm/分である。

0035

別の実施形態において、流れ方向が下向流に設定され、流速が約0.1cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップを含む、上述の方法が提供される。関連した実施形態において、流速は約1cm/分である。

0036

更に別の実施形態において、限外濾過透析濾過(UF/DF)によって複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質の最終濃度は約0.5〜約3mg/mLである。

0037

別の実施形態において、治療用タンパク質は約5〜約11個の水溶性ポリマー部分を含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、治療用タンパク質は約1〜約3個の水溶性ポリマーを含む。

0038

更に別の実施形態において、複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用され、本方法は、流れ方向が上向流に設定され、流速が約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が下向流に設定され、流速が約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップと、を含み、限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、上述の方法が提供される。別の実施形態において、クロマトグラフィが疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)であり、1つ以上の洗浄ステップの流速が約2cm/分であり、1つ以上の溶出ステップの流速が約1cm/分である。

0039

別の実施形態において、上述の方法のいずれかによって産生される、修飾された治療用タンパク質が提供される。

0040

更に別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法が提供され、本方法は、a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに該タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b)該オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、活性アミノオキシ基を含有する該水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、該求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む。

0041

また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法が提供され、本方法は、a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともにタンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b)該オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、活性アミノオキシ基を含有する該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む。

0042

また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法が提供され、本方法は、a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を用いて該タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b)ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間の該ヒドラゾン連結を形成するステップであって、活性ヒドラジド基を含有する該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、該求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む。

0043

また別の実施形態において、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、本方法は、a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともにタンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、b)ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間の該ヒドラゾン連結を形成するステップであって、治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、活性ヒドラジド基を含有する該水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む。

0044

別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。一実施形態において、「活性化水溶性ポリマー」という用語は、アルデヒド基を含有する水溶性ポリマーを指す。

0045

また別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコサミン連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、c)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。

0046

更に別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、c)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。

0047

また別の実施形態において、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーが、a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む活性化アミノオキシリンカーとともに、酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、求核触媒とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、c)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップb)の活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、d)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、上述の方法が提供される。

0048

別の実施形態において、酸化水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、該水溶性ポリマーが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、該水溶性ポリマーの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、上述の方法が提供される。一実施形態において、水溶性ポリマーはPSAである。

0049

別の実施形態において、酸化剤はNaIO4である、上述の方法が提供される。

0050

更に別の実施形態において、アミノオキシリンカーが、
a)式:

0051

の3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンリンカー、
b)式:

0052

の3,6,9−トリオキサ−ウンデカン−1,11−ジオキシアミンリンカー、および
c)式:

0053

の3,6,9,12,15−ペナトキサ(penatoxa)−ヘプタデカン−1,17−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択される、上述の方法が提供される。

0054

また別の実施形態において、還元剤が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびNaBH3からなる群から選択される、上述の方法が提供される。一実施形態において、還元剤はシアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)である。

0055

別の実施形態において、求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、上述の方法が提供される。一実施形態において、求核触媒はm−トルイジンである。別の実施形態において、求核触媒は約1.0mM〜約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される。

0056

別の実施形態において、限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、上述の方法が提供される。
本願は特定の実施形態において例えば以下の項目を提供する:
(項目1)
水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分へ複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記水溶性ポリマーが、活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、
前記オキシム連結形成が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって触媒される、方法。
(項目2)
水溶性ポリマーを治療用タンパク質の酸化炭水化物部分に複合化させる方法であって、複合化を可能にする条件下で、前記酸化炭水化物部分を活性化水溶性ポリマーと接触させることを含み、
前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチンリシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
前記水溶性ポリマーが活性アミノオキシ基を含有し、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記炭水化物部分が、過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤を含む緩衝液とともにインキュベーションすることによって酸化され、
オキシム連結が、前記酸化炭水化物部分と前記水溶性ポリマー上の前記活性アミノオキシ基との間に形成され、前記オキシム連結中、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される求核触媒によって形成が触媒される、方法。
(項目3)
約0.3mg/mL〜約3.0mg/mLの初期濃度の前記治療用タンパク質を含む溶液が、前記活性化水溶性ポリマーと接触させる前に、pH値が約5.0〜約8.0になるように調整される、項目2に記載の方法。
(項目4)
前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約1.0mg/mLであり、前記pHが、約6.0である、項目3に記載の方法。
(項目5)
前記治療用タンパク質が、所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーによって接触され、前記過剰濃度が、約1モル〜約300モル過剰である、項目2に記載の方法。
(項目6)
前記過剰濃度が、約50倍のモル過剰である、項目5に記載の方法。
(項目7)
前記治療用タンパク質が、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、前記活性化水溶性ポリマーとともにインキュベートされる、項目5に記載の方法。
(項目8)
前記条件が、約120分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記求核触媒が、約0.1分〜約30分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1.0mM〜約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、項目2に記載の方法。
(項目10)
前記求核触媒の前記最終濃度が、約10mMであり、前記条件が、最大約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記酸化剤が、約0.1分〜120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM〜約1000μMの酸化剤の最終濃度をもたらす量で添加される、項目2に記載の方法。
(項目12)
前記酸化剤の最終濃度が、約400μMであり、前記条件が、約10分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目11に記載の方法。
(項目13)
前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分への前記水溶性ポリマーの前記複合化が、L−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、メタ重亜硫酸ナトリウム(Na2S2O5)、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、
前記反応停止剤が、約5分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約100mMの反応停止剤の最終濃度をもたらす量で添加される、項目2に記載の方法。
(項目14)
前記反応停止剤が、L−システインである、項目13に記載の方法。
(項目15)
前記L−システインが、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、前記条件が、約60分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目14に記載の方法。
(項目16)
a)pH値が約5.0〜約8.0になるように、前記治療用タンパク質を含む溶液の前記pH値を調整させることを含み、前記治療用タンパク質濃度が、約0.3mg/mL〜約3.0mg/mLである、第1のステップと、
b)前記治療用タンパク質において、1つ以上の炭水化物を酸化させることを含み、前記酸化剤が、約0.1分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約50μM〜約1000μMの最終濃度をもたらすように、前記第1のステップ中の前記溶液に添加される、第2のステップと、
c)所望の過剰濃度の活性化水溶性ポリマーと前記治療用タンパク質を接触させることを含み、前記過剰濃度が、約1モル過剰〜約300モル過剰であり、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下である、第3のステップと、
d)前記第3のステップの前記溶液に、求核触媒を添加することを含み、前記求核触媒が、約0.1分〜約30分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約50mMの最終濃度をもたらすように添加される、第4のステップと、
e)前記治療用タンパク質が、前記治療用タンパク質の1つ以上の酸化炭水化物への前記活性化水溶性ポリマーの前記複合化を可能にする条件下で、前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともにインキュベートされ、前記条件が、約0.5時間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、第5のステップと、
f)第5のステップ中の前記治療用タンパク質の前記1つ以上の酸化炭水化物への前記水溶性ポリマーの前記共役が、L−システイン、メチオニン、グルタチオン、グリセロール、Na2S2O5(メタ重亜硫酸ナトリウム)、トリプトファン、チロシン、ヒスチジン、またはそれらの誘導体、クレゾール、イミダゾール、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される反応停止剤の添加によって停止され、前記反応停止剤が、約5分〜約120分の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、約1mM〜約100mMの最終濃度をもたらすように添加される、第6のステップと、を含む、項目2に記載の方法。
(項目17)
前記第1のステップ中の前記治療用タンパク質の前記初期濃度が、約1mg/mLであり、前記pHが、約6.0であり、
前記第2のステップ中の前記酸化剤の最終濃度が、約400μMであり、前記第5のステップ中の前記条件が、約10分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第3のステップ中の前記過剰濃度が、約50モル過剰であり、前記第3のステップ中の前記条件が、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第4のステップ中の前記求核触媒の前記最終濃度が、約10mMであり、前記第4のステップ中の前記条件が、約15分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第5のステップ中の前記活性化水溶性ポリマーおよび求核触媒とともに前記治療用タンパク質をインキュベートする条件が、約2時間の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含み、
前記第6のステップ中の前記反応停止剤が、L−システインであり、前記L−システインが、約10mMの最終濃度をもたらすように添加され、前記第6のステップ中の前記条件が、約60分の期間、約22℃の温度、光の非存在下、および撹拌しながらを含む、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記水溶性ポリマーがPSAである、項目2に記載の方法。
(項目19)
前記水溶性ポリマーがPEGである、項目2に記載の方法。
(項目20)
前記水溶性ポリマーがHESである、項目2に記載の方法。
(項目21)
前記水溶性ポリマーが、HASである、項目2に記載の方法。
(項目22)
前記PSAが約10〜300個のシアル酸単位からなる、項目18に記載の方法。
(項目23)
前記治療用タンパク質がFIXである、項目2〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目24)
前記治療用タンパク質がFVIIaである、項目2〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記治療用タンパク質がFVIIIである、項目2〜22のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
前記酸化剤が過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)である、項目2〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目27)
前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分が、前記血液凝固タンパク質の活性化ペプチド内に位置する、項目23〜25のいずれか1項に記載の方法。
(項目28)
前記PSAが、活性化アミノオキシリンカーを、酸化PSAと反応させることによって、調製され、
前記アミノオキシリンカーが、
a)式:



の3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンリンカー、
b)式:



の3,6,9−トリオキサ−ウンデカン−1,11−ジオキシアミンリンカー、および
c)式:



の3,6,9,12,15−ペナトキサ(penatoxa)−ヘプタデカン−1,17−ジオキシアミンリンカーからなる群より選択され、
前記PSAが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前記PSAの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、項目18に記載の方法。
(項目29)
前記アミノオキシリンカーが、3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンである、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記酸化剤が、NaIO4である、項目1〜29のいずれか1項に記載の方法。
(項目31)
前記求核触媒が、約1mM〜約50mMの濃度で提供される、項目1〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記求核触媒が、m−トルイジンである、項目31に記載の方法。
(項目33)
前記m−トルイジンが、約10mMの濃度で、複合化反応において存在する、項目32に記載の方法。
(項目34)
シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびNaBH3からなる群から選択される還元化合物を含む緩衝液中で前記複合化された治療用タンパク質をインキュベートすることによって、前記複合化された治療用タンパク質中のオキシム連結を還元するステップを更に含む、項目1〜33のいずれか1項に記載の方法。
(項目35)
前記還元化合物が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)である、項目34に記載の方法。
(項目36)
前記複合化された治療用タンパク質を精製するステップを更に含む、項目1〜35のいずれか1項に記載の方法。
(項目37)
前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって精製される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)、イオン交換クロマトグラフィ(IEC)、サイズ排除クロマトグラフィ(SEC)、親和性クロマトグラフィ、および逆相クロマトグラフィからなる群から選択される、項目37に記載の方法。
(項目39)
抗カオトロピック塩が、クロマトグラフィの負荷ステップおよびクロマトグラフィの洗浄ステップにおいて使用される、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記クロマトグラフィが、カラムにおいて行われる、項目38に記載の方法。
(項目41)
前記カラムが、フェニル−セファロースFFおよびブチル−セファロースFFからなる群から選択されるクロマトグラフィ樹脂を含む、項目40に記載の方法。
(項目42)
前記樹脂が、約5cm〜約20cmの床高さでカラム中に存在する、項目41に記載の方法。
(項目43)
前記床高さが、約10cmである、項目42に記載の方法。
(項目44)
流れ方向が、上向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップを含む、項目40に記載の方法。
(項目45)
前記流速が、約2cm/分である、項目44に記載の方法。
(項目46)
流れ方向が、下向流に設定され、前記流速が、約0.1cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップを含む、項目40〜45のいずれか1項に記載の方法。
(項目47)
前記流速が、約1cm/分である、項目46に記載の方法。
(項目48)
限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目36〜47のいずれか1項に記載の方法。
(項目49)
前記治療用タンパク質の前記最終濃度が、約0.5〜約3mg/mLである、項目36〜48のいずれか1項に記載の方法。
(項目50)
前記治療用タンパク質が、約5〜約11個の水溶性ポリマー部分を含む、項目36〜49のいずれか1項に記載の方法。
(項目51)
前記複合化された治療用タンパク質が、クロマトグラフィを用いて精製され、抗カオトロピック塩が、負荷ステップおよび洗浄ステップにおいて使用され、前記方法が、流れ方向が、上向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の洗浄ステップと、流れ方向が、下向流に設定され、前記流速が、約0.2cm/分〜約6.7cm/分である、1つ以上の溶出ステップと、を含み、限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目2に記載の方法。
(項目52)
前記クロマトグラフィが、疎水性相互作用クロマトグラフィ(HIC)であり、前記1つ以上の洗浄ステップの流速が、約2cm/分であり、前記1つ以上の溶出ステップの流速が、約1cm/分である、項目51に記載の方法。
(項目53)
項目1〜52のいずれか1項に記載の方法によって産生される、修飾された治療用タンパク質。
(項目54)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目55)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記オキシム連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と、活性アミノオキシ基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のオキシム連結を形成するステップであって、
前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、オキシム連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目56)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する前記活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結を形成するステップであって、
活性ヒドラジド基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目57)
治療用タンパク質の酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結の形成方法であって、
a)過ヨウ素酸ナトリウム(NaIO4)、四酢酸鉛(Pb(OAc)4)、および過ルテニウム酸カリウム(KRuO4)からなる群から選択される酸化剤とともに前記タンパク質をインキュベートすることによって、治療用タンパク質の炭水化物成分を酸化させるステップと、
b)前記ヒドラゾン連結の形成を可能にする条件下で、求核触媒の存在下で、前記治療用タンパク質の前記酸化炭水化物部分と活性ヒドラジド基を含有する前記活性化水溶性ポリマーとの間のヒドラゾン連結を形成するステップであって、
前記治療用タンパク質が、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、ADAMTS13プロテアーゼ、IL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、Ang−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y、アンジオポエチン様ポリペプチド1(ANGPTL1)、アンジオポエチン様ポリペプチド2(ANGPTL2)、アンジオポエチン様ポリペプチド3(ANGPTL3)、アンジオポエチン様ポリペプチド4(ANGPTL4)、アンジオポエチン様ポリペプチド5(ANGPTL5)、アンジオポエチン様ポリペプチド6(ANGPTL6)、アンジオポエチン様ポリペプチド7(ANGPTL7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチン リシン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、IgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、インテグリン、トロンビン、レプチン、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、表1中のタンパク質、またはその生物学的に活性なフラグメント、誘導体、もしくは変異体からなる群から選択され、
活性ヒドラジド基を含有する前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、ヒドラゾン連結を形成するステップと、を含む、方法。
(項目58)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目59)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン(alkoxamine)連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
c)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目60)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、求核触媒とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
c)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目61)
活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーが、
a)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、酸化水溶性ポリマーと活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したオキシム連結の形成を可能にする条件下で、活性アミノオキシ基を含む前記活性化アミノオキシリンカーとともに、前記酸化水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートし、それによって、活性アミノオキシ基を含有する水溶性ポリマーを形成することと、
b)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む条件下で、求核触媒とともに、ステップa)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
c)約1分間〜約24時間の期間、約2℃〜約37℃の温度、光の存在または非存在下、および撹拌しながらまたは撹拌なしを含む、前記酸化水溶性ポリマーと前記活性化アミノオキシリンカーとの間の安定したアルコキサミン(alkoxamine)連結の形成を可能にする条件下で、還元剤とともに、ステップb)の活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを含む溶液をインキュベートすることと、
d)クロマトグラフィ、濾過、および沈殿からなる群から選択される方法によって、活性アミノオキシ基を含有する前記水溶性ポリマーを精製することと、を含む、方法によって調製される、項目1〜52のいずれか1項に記載の方法。
(項目62)
前記酸化水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、PolyPEG(登録商標)(Warwick Effect Polymers、Coventry,UK)、ポリシアル酸(PSA)、デンプン、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)からなる群から選択され、前記水溶性ポリマーが、酸化剤とともにインキュベーションすることによって酸化され、前記水溶性ポリマーの非還元末端において、末端アルデヒド基を形成する、項目58〜61のいずれか1項に記載の方法。
(項目63)
前記水溶性ポリマーが、PSAである、項目62に記載の方法。
(項目64)
前記酸化剤が、NaIO4である、項目62に記載の方法。
(項目65)
前記アミノオキシリンカーが、
a)式:



の3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンリンカー、
b)式:



の3,6,9−トリオキサ−ウンデカン−1,11−ジオキシアミンリンカー、および
c)式:



の3,6,9,12,15−ペナトキサ(penatoxa)−ヘプタデカン−1,17−ジオキシアミンリンカーからなる群から選択される、項目58〜64のいずれか1項に記載の方法。
(項目66)
前記還元剤が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)、アスコルビン酸(ビタミンC)、およびNaBH3からなる群から選択される、項目59および61のいずれか1項に記載の方法。
(項目67)
前記還元剤が、シアノホウ化水素ナトリウム(NaCNBH3)である、項目66に記載の方法。
(項目68)
前記求核触媒が、o−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、スルファニル酸、o−アミノベンズアミド、o−トルイジン、m−トルイジン、p−トルイジン、o−アニシジン、m−アニシジン、およびp−アニシジンからなる群から選択される、項目60および61のいずれか1項に記載の方法。
(項目69)
前記求核触媒が、m−トルイジンである、項目68に記載の方法。
(項目70)
前記求核触媒が、約1.0mM〜約50mMの求核触媒の最終濃度をもたらす量で添加される、項目68〜69のいずれか1項に記載の方法。
(項目71)
限外濾過/透析濾過(UF/DF)によって、前記複合化された治療用タンパク質を濃縮させることを更に含む、項目58〜70のいずれか1項に記載の方法。

図面の簡単な説明

0057

凝固第IX因子(配列番号1)の一次構造を示す。
アミノオキシ−PSAへの酸化rFIXの結合を示す。
水溶性ジアミノオキシリンカー(3−オキサ−ペンタン−1,5−ジオキシアミンおよび3,6,9−トリオキサ−ウンデカン−1,11−ジオキシアミン)の合成を示す。
アミノオキシ−PSAの調製を示す。
SDS PAGEによって異なる触媒の存在下で調製されるPSA−FIX複合体の可視化を示す。a)異なる濃度を用いた、アニリンとm−トルイジンとの比較、b)アニリンとo−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、p−アミノベンズアミド、およびスルファニル酸との比較、c)アニリンおよびm−トルイジンとo−アニシジンおよびm−アニシジンとの比較。
SDS PAGEによって異なる触媒の存在下で調製されるPSA−FIX複合体の可視化を示す。a)異なる濃度を用いた、アニリンとm−トルイジンとの比較、b)アニリンとo−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、p−アミノベンズアミド、およびスルファニル酸との比較、c)アニリンおよびm−トルイジンとo−アニシジンおよびm−アニシジンとの比較。
SDS PAGEによって異なる触媒の存在下で調製されるPSA−FIX複合体の可視化を示す。a)異なる濃度を用いた、アニリンとm−トルイジンとの比較、b)アニリンとo−アミノ安息香酸、m−アミノ安息香酸、p−アミノ安息香酸、p−アミノベンズアミド、およびスルファニル酸との比較、c)アニリンおよびm−トルイジンとo−アニシジンおよびm−アニシジンとの比較。
種々の求核触媒を用いたポリシアル化の割合(%)を示す。

0058

治療用タンパク質の薬理学的および免疫学的特性は、化学修飾、およびポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレンコマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)等のポリマー化合物との複合化によって改善することができる。得られる複合体の特性は、一般に、ポリマーの構造および大きさに強く左右される。したがって、画定された狭い大きさの分布を有するポリマーが、通常、当該技術分野において好ましいとされる。PEG等の合成ポリマーは、狭い大きさの分布で容易に製造することができ、一方、PSAは、狭い大きさの分布を有する最終PSA調製をもたらすような様式で精製することができる。加えて、画定されたポリマー鎖および狭い大きさの分布を有するPEG化試薬は、市場に出回っており、手な価格で市販されている。

0059

ポリシアル化等を介する可溶性ポリマーの添加は、血液凝固タンパク質FIX、ならびに他の凝固タンパク質(例えば、VWF、FVIIa(例えば、米国特許第2008/0221032A1号(参照によって本明細書に組み込まれる)を参照)およびFVIII等)等の治療用タンパク質の特性を改善するための1つの方法である。
治療用タンパク質
本発明のある実施形態において、上述のポリペプチドおよびポリヌクレオチドの典型的なものは以下の治療用タンパク質である:酵素、抗原、抗体、受容体、血液凝固タンパク質、増殖因子、ホルモン、およびリガンド。ある実施形態において、治療用タンパク質は、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼ等の血液凝固タンパク質である。一実施形態において、本発明による治療用タンパク質は糖タンパク質であるか、または様々な実施形態において、インビボで自然にグリコシル化されないタンパク質(即ち、天然グリコシル化部位を含有しないタンパク質か、または精製前に宿主細胞中においてグリコシル化されないタンパク質)である。

0060

ある実施形態において、治療用タンパク質は、免疫グロブリン、サイトカイン、例えばIL−1α、IL−1β、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−11、コロニー刺激因子−1(CSF−1)、M−CSF、SCF、GM−CSF、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)、EPO、インターフェロンα(IFN−α)、コンセンサスインターフェロン、IFN−β、IFN−γ、IFN−ω、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12、IL−13、IL−14、IL−15、IL−16、IL−17、IL−18、IL−19、IL−20、IL−21、IL−22、IL−23、IL−24、IL−31、IL−32α、IL−33、トロンボポエチン(TPO)、例えばAng−1、Ang−2、Ang−4、Ang−Y等のアンジオポエチン、ヒトアンジオポエチン様ポリペプチド(ANGPTL1〜7)、ビトロネクチン、血管内皮増殖因子(VEGF)、アンジオゲニン、アクチビンA、アクチビンB、アクチビンC、骨形態形成タンパク質1、骨形態形成タンパク質2、骨形態形成タンパク質3、骨形態形成タンパク質4、骨形態形成タンパク質5、骨形態形成タンパク質6、骨形態形成タンパク質7、骨形態形成タンパク質8、骨形態形成タンパク質9、骨形態形成タンパク質10、骨形態形成タンパク質11、骨形態形成タンパク質12、骨形態形成タンパク質13、骨形態形成タンパク質14、骨形態形成タンパク質15、骨形態形成タンパク質受容体IA、骨形態形成タンパク質受容体IB、骨形態形成タンパク質受容体II、脳由来神経栄養因子、カルジオトロフィン−1、繊毛様神経栄養因子、繊毛様神経栄養因子受容体、クリプト、クリプティック、サイトカイン誘導好中球走化性因子1、サイトカイン誘導好中球走化性因子2α、サイトカイン誘導好中球走化性因子2β、β内皮細胞増殖因子、エンドセリン1、上皮増殖因子、エピゲン、エピレグリン、上皮誘導好中球誘引物質、線維芽細胞増殖因子4、線維芽細胞増殖因子5、線維芽細胞増殖因子6、線維芽細胞増殖因子7、線維芽細胞増殖因子8、線維芽細胞増殖因子8b、線維芽細胞増殖因子8c、線維芽細胞増殖因子9、線維芽細胞増殖因子10、線維芽細胞増殖因子11、線維芽細胞増殖因子12、線維芽細胞増殖因子13、線維芽細胞増殖因子16、線維芽細胞増殖因子17、線維芽細胞増殖因子19、線維芽細胞増殖因子20、線維芽細胞増殖因子21、酸性線維芽細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α1、グリア細胞株誘導好中球因子受容体α2、増殖関連タンパク質、増殖関連タンパク質α、増殖関連タンパク質β、増殖関連タンパク質γ、ヘパリン結合上皮増殖因子、肝細胞増殖因子、肝細胞増殖因子受容体、肝細胞癌由来増殖因子、インスリン様増殖因子I、インスリン様増殖因子受容体、インスリン様増殖因子II、インスリン様増殖因子結合タンパク質、ケラチノサイト増殖因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受容体α、神経増殖因子 神経増殖因子受容体、ニューロポエチン、ニューロトロフィン−3、ニューロトロフィン−4、オンコスタチンM(OSM)、胎盤増殖因子、胎盤増殖因子2、血小板由来内皮細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、血小板由来増殖因子A鎖、血小板由来増殖因子AA、血小板由来増殖因子AB、血小板由来増殖因子B鎖、血小板由来増殖因子BB、血小板由来増殖因子受容体α、血小板由来増殖因子受容体β、プレB細胞増殖刺激因子、幹細胞因子(SCF)、幹細胞因子受容体、TNF、TNF0、TNF1、TNF2、形質転換増殖因子α、形質転換増殖因子β、形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β1.2、形質転換増殖因子β2、形質転換増殖因子β3、形質転換増殖因子β5、潜伏形質転換増殖因子β1、形質転換増殖因子β結合タンパク質I、形質転換増殖因子β結合タンパク質II、形質転換増殖因子β結合タンパク質III、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)、I型腫瘍壊死因子受容体、II型腫瘍壊死因子受容体、ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性剤受容体、血管内皮増殖因子、ならびにそれらのキメラタンパク質および生物学的もしくは免疫学的に活性なフラグメントである。

0061

ある実施形態において、治療用タンパク質は、α−、β−、およびγ−インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、ホスホリパーゼ活性化タンパク質(PUP)、インスリン、レクチンおよびリシン等の植物タンパク質、腫瘍壊死因子および関連対立遺伝子、腫瘍壊死因子受容体の可溶性形態インターロイキン受容体および可溶性形態のインターロイキン受容体、増殖因子、例えばTGFαまたはTGFβおよび上皮増殖因子のような組織増殖因子、ホルモン、ソマトメジンエリスロポエチン色素ホルモン、視床下部放出因子抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノゲン活性化因子、および免疫グロブリン、例えばIgG、IgE、IgM、IgA、およびIgD、ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、DNAse、フェチュイン、黄体形成ホルモン、エストロゲン、コルチコステロイド、インスリン、アルブミン、リポタンパク質、フェトプロテイン、トランスフェリン、トロンボポエチン、ウロキナーゼ、DNase、インテグリン、トロンビン、造血成長因子、レプチン、グリコシダーゼ、ヒュミラ(アダリムマブ)、Prolia(デノスマブ)、Enbrel(エタネルセプト)、ならびにそれらのフラグメント、または上記のタンパク質もしくはそれらのフラグメントのいずれかを含む任意の融合タンパク質である。上記のタンパク質に加えて、下表1は、本発明によって企図される治療用タンパク質を提供する。

0062

0063

0064

0065

0066

0067

0068

0069

0070

0071

0072

0073

0074

0075

0076

0077

0078

0079

0080

0081

0082

0083

0084

0085

0086

0087

0088

0089

0090

0091

0092

0093

0094

0095

0096

本明細書に提供される治療用タンパク質は、排他的であると考えられるべきではない。むしろ、本明細書に提供される開示から明白であるように、本発明の方法は、本発明に従って水溶性ポリマーの付着が望ましい任意のタンパク質に適用可能である。例えば、治療用タンパク質は、米国特許第2007/0026485号に記載され、これはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
血液凝固タンパク質
一態様では、本発明の出発物質は、血液凝固タンパク質であり、これは、米国特許第4,757,006号、米国特許第5,733,873号、米国特許第5,198,349号、米国特許第5,250,421号、米国特許第5,919,766号、欧州特許第306 968号に説明されるように、ヒト血漿に由来され得るか、または組換え体操作技術によって産生され得る。

0097

第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子(FXI)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼを含む血液凝固タンパク質等の治療的ポリペプチドは、タンパク質分解酵素によって急速に分解され、酵素によって中和される。これは、それらの半減期および循環時間を低下させ、それによってその治療効果を制限する。これらの凝固タンパク質の所望の治療効果または予防効果を達成し、かつ維持するには、比較的に高い投与量および頻繁な投与が必要である。結果として、適切な投与量の調節を得るのは困難であり、頻繁な静脈内投与を必要とするために、患者の生活様式を制限する。

0098

本明細書で説明されるように、第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XI因子、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない、血液凝固タンパク質が、本発明によって企図される。本明細書で使用される「血液凝固タンパク質」という用語は、任意の第IX因子(FIX)、第VIII因子(FVIII)、第VIIa因子(FVIIa)、フォンヴィレブランド因子(VWF)、第FV因子(FV)、第X因子(FX)、第XII因子(FXII)、トロンビン(FII)、プロテインC、プロテインS、tPA、PAI−1、組織因子(TF)、およびADAMTS13プロテアーゼを指し、それらは特定の天然血液凝固タンパク質に関連する、生物学的活性を呈する。

0099

血液凝固カスケードは、3つの異なるセグメント、即ち、内因性外因性、および一般的経路に分割される(Schenone et al.,Curr Opin Hematol.2004;11:272−7)。カスケードには、一連セリンプロテアーゼ酵素チモーゲン)およびタンパク質補因子関与する。必要なとき、不活性キモーゼン前駆体が活性形態に変換され、それは、その後、カスケード中の次の酵素を変換する。

0100

内因性経路は、凝固因子VIII、IX、X、XI、およびXIIを必要とする。内因性経路の開始は、プレカリクレイン高分子量キニノゲン、第XI因子(FXI)、および第XII因子(FXII)が負荷電された表面に暴露されるときに生じる。血小板から分泌されるカルシウム鉄およびリン脂質も必要とされる。

0101

外因性経路は、血管の血管腔が損傷されたときに開始される。膜糖タンパク質組織因子が暴露され、次いで、循環因子VII(FVII)に、次いで既存の少量のその活性型FVIIaに結合する。この結合は、FVIIaへのFVIIの完全な変換を促進し、続いてカルシウムおよびリン脂質の存在下で、第IX因子(FIX)の第IXa因子(FIXa)への変換、および第X因子(FX)の第Xa因子(FXa)への変換を促進する。組織因子とのFVIIaの会合は、基質(FIXおよびFX)のためのFVIIの結合部位を接近させることによって、および構造変化を誘発させて、FVIIaの酵素活性増進することにより、タンパク質分解活性を増進させる。

0102

FXの活性化は、2つの経路の共有点である。リン脂質およびカルシウムとともに、第Va因子(FVa)および第Xa因子は、プロトロンビンをトロンビンに変換させ(プロトロンビナーゼ複合体)、それは、次いで、フィブリノゲン開裂して、フィブリンモノマーを形成する。モノマーは、重合してフィブリン鎖を形成する。第XIIIa因子(FXIIIa)は、これらの鎖を互いに共有結合させて、剛性メッシュを形成する。

0103

FVIIのFVIIaへの変換もまた、トロンビン、FIXa、FXa、第XIa因子(FXIa)、および第XIIa因子(FXIIa)を含む、多くのプロテアーゼによって触媒される。カスケードの初期段階阻害のために、組織因子経路阻害剤は、FVIIa/組織因子/FXa産物複合体を標的にする。
第VIIa因子
FVII(安定因子またはプロコンベルチンとしても公知である)は、止血および凝固で中枢的役割を有する、ビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質である(Eigenbrot,Curr Protein Pept Sci.2002;3:287−99)。

0104

FVIIは、肝臓内で合成され、48kDの単鎖糖タンパク質として分泌される。FVIIは、すべてのビタミンK依存性セリンプロテアーゼ糖タンパク質と、脂質膜とのタンパク質の相互作用に関与する、9〜12残基を有するアミノ末端γカルボキシグルタミン酸(Gla)ドメインカルボキシ末端セリンプロテアーゼドメイン触媒ドメイン)、および組織因子との相互作用を媒介する、カルシウム鉄結合部位を含有する2つの上皮成長因子様ドメインからなる類似するタンパク質ドメイン構造共有する。γグルタミルカルボキシラーゼは、分子のアミノ末端部分でGla残基のカルボキシル化を触媒する。カルボキシラーゼは、その作用のために還元型ビタミンKに依存し、それは、エポキシド型に酸化される。ビタミンKエポキシド還元酵素が、ビタミンKのエポキシド型を還元型に再変換するために必要である。

0105

FVIIの主要部分は、チモーゲン型で、血漿中で循環し、この型の活性化は、アルギニン152とイソロイシン153との間のペプチド結合の開裂をもたらす。結果として生じる活性化FVIIaは、単一ジスルフィド結合(Cys135〜Cys262)を介して連結した、NH2由来軽鎖(20kD)およびCOOH末端由来重鎖(30kD)からなる。軽鎖は、膜結合Glaドメインを含有し、重鎖は、触媒ドメインを含有する。

0106

遺伝因子および環境因子によって決定されるFVIIの血漿濃度は約0.5mg/mLである(Pinotti et al.,Blood.2000;95:3423−8)。FVIIの異なる遺伝子型は、FVIIの平均レベルにおいて数倍の差異をもたらし得る。血漿中FVIIレベルは、健康な女性では妊娠中に上昇し、また、年齢とともに上昇し、女性および高トリグリセリド血症罹患しているヒトにおいてより高い。FVIIは、すべての凝固原因子のうちで最短の半減期(3〜6時間)を有する。健康な個人におけるFVIIaの平均血漿濃度は3.6ng/mLであり、FVIIaの循環半減期は、他の凝固因子と比較して、比較的長い(2.5時間)。

0107

遺伝性FVII欠損症は、稀な常染色体劣性出血性障害であり、その有病率は一般集団において500,000人当たり1症例であると推定される(Acharya et al.,J Thromb Haemost.2004;2248−56)。阻害剤からの後天的FVII欠損症もまた、非常に稀である。セファロスポリンペニシリン、および経口抗凝固剤等の薬物に関連して生じる欠損症の症例も報告されている。更にまた、後天的FVII欠損症は、自然発症的に、または例えば骨髄腫敗血症再生不良性貧血等の他の状態とともに、インターロイキン−2および抗胸腺細胞グロブリン療法で生じることが報告されている。

0108

参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、ゲノム配列GenBank受託番号J02933、cDNAのM13232(Hagen et al.PNAS 1986;83:2412−6)、およびポリペプチド配列のP08709(参照は、その全体が本明細書に組み込まれる)が挙げられる。FVIIの種々の多型性は、例えば、Sabater−Llealら(Hum Genet.2006;118:741−51を参照)(参照は、その全体が本明細書に組み込まれる)に説明されている。
第IX因子
FIXは、カルシウム鉄、リン脂質、およびFVIIIaの存在下で、FXをその活性型に変換することによって、血液凝固の内因性経路に関与するビタミンK依存性血漿タンパク質である。FIXの主な触媒能は、FX内の特定のアルギニン−イソロイシン結合に対して特異性を有するセリンプロテアーゼとしての触媒能である。FIXの活性化は、FIXからの活性化ペプチドの除去をもたらし、1つまたは複数のジスルフィド結合によって保持される2つの鎖を含む活性化したFIX分子を産生する、FXIaによって生じる。FIXの欠損は、劣性X連鎖血友病Bの原因である。

0109

血友病AおよびBはそれぞれ、FVIIIおよびFIXポリペプチドの欠損を特徴とする遺伝性疾患である。欠損の根本的な原因は、頻繁に、FVIIIおよびFIX遺伝子突然変異の結果であり、それらの両方は、X染色体上に位置する。血友病に対する従来の療法は、しばしば、正常の個人からのプール血漿または半精製された凝固タンパク質の静脈内投与を伴う。これらの調製は、感染性プリオンHIVパルボウイルスA型肝炎、およびC型肝炎等の病原体またはウイルスによって汚染される可能性がある。したがって、ヒト血清の使用を必要としない治療薬に対する緊急の必要性がある。

0110

FIX活性の減少レベルは、血友病Bの重症度正比例する。血友病Bの現在の治療は、血漿由来または組換えFIX(FIX置換または交換治療もしくは療法と称される)による、不足したタンパク質の交換からなる。

0111

FIXのポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、例えば、UniProtKB/Swiss−Prot受託番号P00740、米国特許第6,531,298号、および図1(配列番号1)において見出すことができる。
第VIII因子
凝固第VIII因子(FVIII)は、非常に低い濃度で血漿中を循環し、フォンヴィレブランド因子(VWF)に非共有結合する。止血中、FVIIIは、VWFから分離され、カルシウムおよびリン脂質、または細胞膜の存在下で、活性化の速度を強化させることによって、活性化第IX因子(FIXa)媒介のFX活性化のための補因子として機能する。

0112

FVIIIは、ドメイン構造A1−A2−B−A3−C1−C2を有する、約270〜330kDの単鎖前駆体として合成される。血漿から精製されるとき(例えば、「血漿由来」または「血漿性」)、FVIIIは、重鎖(A1−A2−B)および軽鎖(A3−C1−C2)からなる。軽鎖の分子量は80kDであり、Bドメイン内のタンパク質分解により、重鎖は90〜220kDの範囲内である。

0113

FVIIIはまた、出血性障害における治療用途のための組換えタンパク質としても合成される。種々のインビトロアッセイが、治療薬物としての組換えFVIII(rFVIII)の潜在的有効性を決定するために考案されている。これらのアッセイは、内在性FVIIIのインビボ効果模倣する。FVIIIのインビトロトロンビン治療は、インビトロアッセイによって測定される、その凝固促進活性の迅速な増加およびその後の減少をもたらす。この活性化および不活性化は、例えば、FVIIIをVWFから解離させ、かつリン脂質表面に結合させて、異なる結合エピトープの有効性を調整するか、またはある特定のモノクローナル抗体への結合能を調整する、重鎖および軽鎖の両方における特定の制限されたタンパク質分解と一致する。

0114

FVIIIの欠如および機能不全は、最も頻度の高い出血性障害である血友症Aと関連する。血友症Aの管理のための治療選択は、血漿由来、またはrFVIII濃縮物を用いる交換療法である。1%を下回るFVIIIレベルを有する重篤な血友症Aに罹患している患者は、一般に、FVIIIを用量との間で1%を超えて維持することを目的とする予防療法を受けている。循環血中の種々のFVIII産物の平均半減期を考慮すると、この結果は、通常、FVIIIを週に2〜3回投与することによって達成することができる。

0115

参照ポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列としては、例えば、UniProtKB/Swiss−Prot P00451(FA8_HUMAN)、Gitschier J et al.,Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992):326−30(1984)、VeharGHet al.,Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992):337−42(1984)、Thompson AR.Structure and Function of the Factor VIII gene and protein,Semin Thromb Hemost,2003:29;11−29(2002)が挙げられる。フォンヴィレブランド因子フォンヴィレブランド因子(VWF)は、約500〜20,000kDの範囲のサイズの一連の多量体として血漿中を循環する糖タンパク質である。VWFの多量体形態は、ジスルフィド結合によって相互に連結された250kDのポリペプチドサブユニットからなる。VWFは、損傷した血管壁内皮下層への初期血小板粘着を媒介する。より大きな多量体のみが止血活性を呈する。内皮細胞は大きいポリマー形態のVWFを分泌し、低分子重量を有するVWFの形態(低分子重量のVWF)はタンパク質分解開裂から生じることが想定されている。高分子質量を有する多量体は、内皮細胞のバイベルパラーデ小体内に保存され、刺激時に遊離される。

0116

VWFは、大部分の反復ドメインからなるプレプロVWFとして内皮細胞および巨核球によって合成される。シグナルペプチドの開裂時に、プロVWFは、そのC末端領域においてジスルフィド連結を介して二量体化する。二量体は、多量体化のためのプロトマーとして機能し、それは、遊離末端間のジスルフィド連結によって支配される。多量体へのアセンブリの後、プロペプチド配列のタンパク質分解除去が続く(Leyte et al.,Biochem.J.274(1991),257−261)。

0117

VWFのクローン化cDNAから予測される一次翻訳生成物は、2813残基の前駆体ポリペプチド(プレプロVWF)である。プレプロVWFは、22個のアミノ酸シグナルペプチドおよび741個のアミノ酸プロペプチドからなり、成熟VWFは2050個のアミノ酸を含む(Ruggeri Z.A.,and Ware,J.,FASEB J.,308−316(1993)。

0118

VWFの欠損は、ある程度の顕著な出血性表現型を特徴とする、フォンヴィレブランド病(VWD)の原因である。3型VWDは、VWFが完全に欠損している最も重度な形態であり、1型VWDは、VWFの量的減少に関連し、その表現型は、非常に軽度である可能性がある。2型VWDは、VWFの質的欠損に関連し、3型VWDと同様の重度である可能性がある。2型VWDは、多くの亜種形態を有し、そのうちの幾つかは、高分子重量の多量体の損失または減少に関連する。2a型フォンヴィレブランド病(VWD−2A)は、中間体および大きい多量体の両方の損失を特徴とする。VWD−2Bは、最も高い分子重量の多量体の損失を特徴とする。VWFに関連する他の疾患および障害は、当該技術分野において既知である。

0119

プレプロVWFのポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ、GenBankアクセッション番号NM_000552およびNP_000543で入手可能である。

0120

本発明に従う他の血液凝固タンパク質は、例えば、Mann KG,Thromb Haemost,1999;82:165−74の当該技術分野において説明されている。
A.ポリペプチド
一態様では、本発明の出発物質は、タンパク質またはポリペプチドである。本明細書に説明するとき、治療用タンパク質という用語は、治療用タンパク質に関連する生物学的活性を呈する、任意の治療用タンパク質分子を指す。本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質である。

0121

企図される治療用タンパク質分子は、完全長のタンパク質、完全長のタンパク質の前駆体、完全長のタンパク質の生物学的に活性なサブユニットまたはフラグメント、ならびに治療用タンパク質のこれらの形態のうちのいずれかの生物学的に活性な誘導体および変異体を含む。したがって、治療用タンパク質は、(1)少なくとも約25、約50、約100、約200、約300、約400、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、参照核酸、または本明細書に説明されるアミノ酸配列によってコードされたポリペプチドと、約60%超、約65%超、約70%超、約75%超、約80%超、約85%超、約90%超、約91%超、約92%超、約93%超、約94%超、約95%超、約96%超、約97%超、約98%超、または約99%超、またはそれ以上より高いアミノ酸配列同一性を有する、アミノ酸配列を有する、および/または(2)本明細書に説明される参照アミノ酸配列を含む免疫原、その免疫原性フラグメント、および/またはその保存的に修飾された変異体に対して生成された抗体、例えば、ポリクロナールまたはモノクローナル抗体に特異的に結合する、治療用タンパク質を含む。

0122

本発明に従い、「組換え治療用タンパク質」という用語は、組換えDNA技術を介して得られた任意の治療用タンパク質を含む。ある実施形態において、この用語は、本明細書に説明されるタンパク質を包含する。

0123

本明細書で使用される「内在性治療用タンパク質」は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来する治療用タンパク質を含む。該用語はまた、該哺乳動物に存在する導入遺伝子または任意の他の外来DNAから転写された治療用タンパク質を含む。本明細書で使用される「外在性治療用タンパク質」は、治療を受けることを意図されている哺乳動物に由来しない治療用タンパク質を含む。

0124

本明細書で使用される「血漿由来治療用タンパク質」または「血漿性」は、凝固経路に関与する特性を有する哺乳動物から得られた、血中に見られるタンパク質のすべての形態を含む。

0125

本明細書で使用される「生物学的に活性な誘導体」または「生物学的に活性な変異体」は、該分子の実質的に同一の機能的および/または生物学的特性結合特性等)、および/または同一の構造基盤(ペプチド主鎖または塩基ポリマー単位)を有する分子の任意の誘導体または変異体を含む。

0126

「変異体」または「誘導体」等の「類似体」は、天然由来の分子と構造が実質的に同様であり、ある特定の例では、異なる程度ではあるが、同一の生物学的活性を有する化合物である。例えば、ポリペプチド変異体は、参照ポリペプチドと実質的に同様の構造を共有し、同一の生物学的活性を有するポリペプチドを指す。変異体または類似体は、類似体が由来する天然ポリペプチドと比較して、(i)ポリペプチドの1つまたは複数の末端および/または天然ポリペプチド配列(例えば、フラグメント)の1つまたは複数の内部領域における1つまたは複数のアミノ酸残基欠失、(ii)ポリペプチドの1つまたは複数の末端(一般的に「付加」または「融合」)、および/または天然ポリペプチド配列の1つまたは複数の内部領域(一般的に「挿入」)における1つまたは複数のアミノ酸の挿入または付加、あるいは(iii)天然ポリペプチド配列での1つまたは複数のアミノ酸の他のアミノ酸に代えての置換を含む1つまたは複数の変異に基づき、それらのアミノ酸配列の組成が異なる。例として、「誘導体」は、一種の類似体であり、例えば、化学的に修飾されている参照ポリペプチドと同一または実質的に同様の構造を共有するポリペプチドを指す。

0127

変異体ポリペプチドは、1種の類似体ポリペプチドであり、挿入変異体を含み、そこでは1つまたは複数のアミノ酸残基が本発明の治療用タンパク質アミノ酸配列に付加される。挿入は、タンパク質のいずれか末端または両末端に位置してもよい、および/または治療用タンパク質アミノ酸配列の内部領域内に位置付けられてもよい。いずれかの末端または末端に付加残基を有する挿入変異体は、例えば、融合タンパク質、およびアミノ酸タグまたは他のアミノ酸標識を含むタンパク質を含む。一態様では、血液凝固タンパク質分子は、特に、分子が大腸菌等の細菌性細胞内に組換え発現させるとき、任意に、N−末端Metを含有する。

0128

欠失変異体では、本明細書に説明される治療用タンパク質ポリペプチド内の1つまたは複数のアミノ酸残基が除去される。欠失は、治療用タンパク質ポリペプチドの1つまたは両方の末端において、および/または治療用タンパク質アミノ酸配列内の1つまたは複数の残基の除去によって達成することができる。したがって、欠失変異体は、治療用タンパク質ポリペプチド配列のフラグメントを含む。

0129

置換変異体では、治療用タンパク質ポリペプチドの1つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、代替の残基と置き換えられる。一態様では、置換は、保存的な性質を有し、このタイプの保存的置換は、当該技術分野において周知である。あるいは、本発明は、非保存的でもある置換を包含する。例示的な保存的置換を、Lehninger,[Biochemistry,2nd Edition;Worth Publishers,Inc.,New York(1975),pp.71−77]に記載されており、すぐ下に提示する。



あるいは、例示的な保存置換をすぐ下に提示する。



B.ポリヌクレオチド
本発明の治療用タンパク質をコードする核酸としては、例えば、遺伝子、pre−mRNA、mRNA、cDNA、多形変異体、対立遺伝子、合成、および天然変異体が挙げられるが、これらに限定されない。

0130

また、本発明の治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドとしては、(1)ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に説明される参照アミノ酸配列をコードする核酸、およびその保存的に修飾された変異体に特異的にハイブリダイズする、(2)少なくとも約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000、またはそれ以上のヌクレオチド(最大、成熟タンパク質の1218ヌクレオチドの完全長配列)の領域にわたって、本明細書に説明される参照核酸配列と、約95%超、約96%超、約97%超、約98%超、約99%超、またはそれ以上より高いのヌクレオチド配列同一性を有する、核酸配列を有するポリヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」条件は、50%のホルムアミド、5×SSC、20mMのNa PO4、pH6.8中の42oCでのハイブリダイゼーション、および30分間、55oCでの1×SSCの洗浄を含む。これらの例示的な条件の変化は、ハイブリダイズされる配列の長さおよびGCヌクレオチド含有量に基づき行うことができることを理解されたい。当該技術分野における標準的な式は、適切なハイブリダイゼーション条件を決定するために適切である。Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Second ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)§§9.47−9.51を参照。

0131

「天然(naturally−occurring)」ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的には、霊長類(例えば、ヒト)、齧歯類(例えば、ラット、マウスハムスター)、ウシブタウマヒツジ、または任意の哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない哺乳動物に由来する。本発明の核酸およびタンパク質は、組換え分子(例えば、異種であり、野生型配列またはその変異体をコードする、または非天然の)であり得る。
C.治療用タンパク質の産生
治療用タンパク質の産生には、(i)遺伝子操作による組換えDNAの産生、(ii)例えば、トランスフェクションエレクトロポレーション、またはマイクロインジェクションによる(これらに限定されない)原核細胞または真核細胞への組換えDNAの導入、(iii)該形質転換細胞の培養、(iv)例えば構造的または誘発時の治療用タンパク質の発現、(v)精製した治療用タンパク質を得るために、例えば培養培地から、または形質転換細胞を収集することによる該血液凝固タンパク質の単離、に関して当該技術分野で公知の任意の方法が含まれる。

0132

他の態様では、治療用タンパク質は、薬理学的に許容される血液凝固タンパク質分子を産生することによって特徴付けられる好適な原核または真核宿主系内の発現によって産生される。真核細胞の例は、CHO、COS、HEK293、BHKSK−Hep、およびHepG2等の哺乳動物細胞である。

0133

多種多様ベクターが治療用タンパク質の調製に使用され、真核および原核発現ベクターから選択される。原核発現のためのベクターの例としては、pRSET、pET、およびpBAD等のプラスミドが挙げられるが、これらに限定されず、原核発現ベクターに使用されるプロモーターは、lac、trc、trp、recA、またはaraBADのうちの1つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。真核発現のためのベクターの例としては、(i)酵母における発現では、AOX1、GAP、GAL1、またはAUG1等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、pAO、pPIC、pYES、またはpMET等であるが、これらに限定されないベクター、(ii)昆虫細胞における発現では、PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64、またはpolh等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、pMT、pAc5、pIB、pMIB、またはpBAC等であるが、これらに限定されないベクター、および(iii)哺乳動物細胞における発現では、pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3、またはpBPV等であるが、これらに限定されないベクター、および一態様では、CMV、SV40、EF−1、UbC、RSV、ADV、BPV、およびβ−アクチン等であるが、これらに限定されないプロモーターを使用する、ワクシニアウイルスアデノ随伴ウイルスヘルペスウイルス、またはレトロウイルス等であるが、これらに限定されないウイルス系に由来するベクターが挙げられる。
D.投与
一実施形態において、本発明の複合化された治療用タンパク質は、静脈内、筋肉内、または腹腔内注入等の注入によって投与されてもよい。

0134

本発明の複合化された治療用タンパク質を含む組成物をヒトまたは試験動物に投与するために、一態様では、組成物は、1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含む。「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、下に説明されるように、安定しており、凝集および開裂生成物等のタンパク質分解を阻害し、加えて、当該技術分野で周知の経路を使用して投与されるとき、アレルギー反応または他の有害反応を起こさない分子的実体および組成物を指す。「薬学的に許容される担体」としては、上に開示した薬剤を含む、任意かつ全ての臨床的に有用な溶媒分散媒体コーティング抗菌剤および抗真菌剤等張剤および吸収遅延剤等が挙げられる。

0135

本明細書で使用される「有効量」は、疾患または障害を治療するまたは疾患または障害の症状を改善するために好適な用量を含む。一実施形態において、「有効量」は、本明細書に説明される出血性障害を有する哺乳動物を治療するために好適な用量を含む。

0136

組成物は、経口的、局所的、経皮的、非経口的、吸引スプレーによって、経膣的、経直腸的、または頭蓋内注入によって、投与されてもよい。本明細書で使用される非経口という用語には、皮下注射静脈注射筋肉内注射胸骨内注射、または注入技法が含まれる。静脈内、皮下、筋肉内、乳房内、腹腔内、髄腔内、眼球後、肺内注入、およびまたは特定の部位での外科的移植による投与も企図される。一般に、組成物は、発熱物質、ならびに受容者に有害である可能性がある他の不純物を本質的に含んでいない。

0137

組成物の単回または複数回投与は、治療する医師によって選択される用量レベルまたはパターンで実行することができる。疾患の予防または治療では、適切な投与量は、上述のように、治療すべき疾患の種類、疾患の重症度および経過、薬物が予防または治療目的のために投与されているか、治療歴、患者の病歴および薬物への応答、ならびに担当医の裁量に依存する。

0138

本発明はまた、本明細書に定義する有効量の複合化された治療用タンパク質を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、塩、緩衝液、または賦形剤を更に含んでもよい。薬学的組成物は、上に定義する出血性障害を治療するために使用することができる。本発明の薬学的組成物は、溶液または凍結乾燥された生成物であってもよい。薬学的組成物の溶液は、任意の好適な凍結乾燥プロセスに供してもよい。

0139

さらなる態様として、本発明は、対象に投与するためのその使用を促進する様式で梱包された本発明の組成物を含むキットを含む。一実施形態において、かかるキットは、本明細書に説明される化合物または組成物(例えば、複合化された治療用タンパク質を含む組成物)を含み、それは密封ボトルまたは器等の容器に梱包され、方法を実践する上での化合物または組成物の使用法を説明するラベルがその容器に貼られているか、パッケージに含まれる。一実施形態において、キットは、複合化された治療用タンパク質を含む組成物を有する第1の容器、および第1の容器内の組成物のための生理的に許容される再構成溶液を有する第2の容器を含有する。一態様では、化合物または組成物は、単位容量形態で梱包される。キットは、特定の投与経路に従い組成物を投与するための好適な装置を更に含んでもよい。好ましくは、キットは、治療用タンパク質またはペプチド組成物の使用法を説明するラベルを含有する。
水溶性ポリマー
一態様では、提供される治療用タンパク質誘導体(即ち、複合化された治療用タンパク質)分子は、ポリエチレングリコール(PEG)、分岐PEG、ポリシアル酸(PSA)、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)、ヒドロキシエチルデンプン(HES)、炭水化物、多糖類、プルラン、キトサン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸塩、デルマタン硫酸塩、デンプン、デキストラン、カルボキシメチル−デキストラン、ポリアルキレンオキシド(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、ポリプロピレングリコール(PPG)、ポリオキサゾリン、ポリアクリロイルモルホリン、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボン酸塩、ポリビニルピロリドン、ポリホスファゼン、ポリオキサゾリン、ポリエチレンコマレイン酸無水物、ポリスチレン−コマレイン酸無水物、ポリ(1−ヒドロキシメチルエチレンヒドロキシメチルホルマール)(PHF)、2−メタクリロイルオキシ−2’−エチルトリメチルアンモニウムホスフェート(MPC)が挙げられるが、これらに限定されない、水溶性ポリマーに結合される。本発明の一実施形態において、水溶性ポリマーは、350〜120,000、500〜100,000、1000〜80,000、1500〜60,000、2,000〜45,000Da、3,000〜35,000Da、および5,000〜25,000Daの範囲の分子量を有する、シアル酸分子からなる。水溶性ポリマーの結合は、タンパク質への直接結合によって、またはリンカー分子を介して実行することができる。化学的リンカーの一例は、炭水化物−選択的ヒドラジドおよびスルフヒドリル反応マレイミド基を含有する、MBPH(4−[4−N−マイレインイミドフェニル]酪酸ヒドラジド)である(Chamow et al.,J Biol Chem 1992;267:15916−22)。他の例示的および好ましいリンカーは、下に説明される。

0140

一実施形態において、誘導体は、天然の治療用タンパク質生成物の完全な機能活性を保持し、天然の治療用タンパク質生成物と比較して、延長したインビボ半減期を提供する。別の実施形態において、誘導体は、天然の血液凝固タンパク質に対して、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56,57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、または150パーセント(%)の生物学的活性を保持する。関連する態様では、誘導体および天然の血液凝固タンパク質の生物学的活性は、血液凝固因子抗原値に対する色原体活性の比(血液凝固因子:Chr:血液凝固因子:Ag)によって決定される。本発明の更に別の実施形態において、構築物の半減期は、天然の治療用タンパク質のインビボ半減期に対して、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、または10倍減少または増大する。
A.シアル酸およびPSA
PSAは、N−アセチルノイラミン酸のポリマー(通常、ホモポリマー)からなる。二級アミノ基は、一般に、アセチル基を保有するが、その代わりにグリコシル基を保有してもよい。ヒドロキシル基における可能な置換基としては、アセチル基、ラクチル基、エチル基硫酸基、およびリン酸基が挙げられる。

0141

シアル酸(N−アセチルノイラミン酸)の構造
PSAおよびmPSAは、一般的には、2,8−または2,9−グリコシド連結、あるいはこれらの組み合わせ(例えば、2,8−および2,9−で交互に連結したもの)によって連結されたN−アセチルノイラミン酸部分から本質的になる直鎖状ポリマーを含む。特に好ましいPSAおよびmPSAでは、グリコシド連結はa−2,8である。そのようなPSAおよびmPSAは、好都合には、コロミン酸に由来し、本明細書中では「CA」および「mCA」と称される。典型的なPSAおよびmPSAは、少なくとも2個、好ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個、および最も好ましくは少なくとも20個のN−アセチルノイラミン酸部分を含む。したがって、それらは、2〜300個のN−アセチルノイラミン酸部分、好ましくは5〜200個のN−アセチルノイラミン酸部分、または最も好ましくは10〜100個のN−アセチルノイラミン酸部分を含み得る。PSAおよびCAは、好ましくは、N−アセチルノイラミン酸以外の糖部分を本質的に含まない。したがって、PSAおよびCAは、好ましくは、少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、および最も好ましくは少なくとも98%のN−アセチルノイラミン酸部分を含む。

0142

PSAおよびCAがN−アセチルノイラミン酸以外の部分を含む場合(例えば、mPSASおよびmCA等の場合)、これらは、好ましくは、ポリマー鎖の一端または両端に位置している。例えば、そのような「他の」部分は、酸化または還元により末端N−アセチルノイラミン酸部分から誘導された部分であり得る。

0143

例えば、国際公開第−A−0187922号には、過ヨウ素酸ナトリウムとの反応によって、非還元末端N−アセチルノイラミン酸単位がアルデヒド基に変換されたmPSAおよびmCAが記載されている。更に、国際公開第2005/016974号には、還元末端N−アセチルノイラミン酸単位が還元を受け、この還元末端N−アセチルノイラミン酸単位で還元的に開環し、それによって隣接ジオール基が形成され、続いて、酸化され、隣接ジオール基をアルデヒド基に変換したmPSAおよびmCAが記載されている。

0144

シアル酸リッチの糖タンパク質は、ヒトおよび他の生物でセレクチンに結合する。それらは、ヒトインフルエンザ感染に重要な役割を果たす。例えば、シアル酸は、マンノース結合レクチンから、宿主細胞または細菌の表面上のマンノース抗原を隠し得る。このことは、補体の活性化を妨げる。また、シアル酸は、最後から2番目の位置にあるガラクトース残基を隠し、肝実質細胞上のガラクトース受容体による、糖タンパク質の急速な排除を妨げる。

0145

コロミン酸(N−アセチルノイラミン酸のホモポリマー)の構造
コロミン酸(PSAの部分集合)は、α(2→8)ケトーシス連結によるN−アセチルノイラミン酸(NANA)のホモポリマーであり、とりわけ、K1抗原を有する大腸菌の特定の株によって産生される。コロミン酸は、多くの生理学的機能を有する。それらは、薬物および化粧品原材料として重要である。

0146

ポリシアル酸化および非修飾アスパラギナーゼとのインビボ比較研究は、ポリシアル酸化が酵素の半減期を増大させたことを明らかにした(Fernandes and Gregoriadis,Biochimica Biophysica Acta 1341:26−34,1997)。

0147

本明細書で使用される「シアル酸部分」は、水性溶液または懸濁液中で可溶性であり、薬学的に有効量のPSA−血液凝固タンパク質複合体の投与時に、哺乳動物への副作用等の悪影響がわずか、または全くない、シアル酸モノマーまたはポリマー(「多糖類」)を含む。一態様では、ポリマーは、1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、または500個のシアル酸単位を有することを特徴とする。ある特定の態様では、異なるシアル酸単位が鎖に組み込まれる。

0148

本発明の一実施形態において、多糖化合物のシアル酸部分は、非常に親水性であり、別の実施形態において、全化合物は、非常に親水性である。親水性は、主に、シアル酸単位のペンダントカルボキシル基、ならびにヒドロキシル基によって与えられる。糖類単位は、アミン基、ヒドロキシル基、または硫酸基等の他の官能基、またはその組み合わせを含有してもよい。これらの基は、天然の糖類化合物上に存在してもよいか、または誘導体多糖類化合物中に導入されてもよい。

0149

天然ポリマーPSAは、広域な大きさの分布(例えば、Sigma C−5762)、および高い多分散性(PD)を示す、多分散調製物として利用可能である。多糖類は、通常、共精製する内毒素特有のリスクを持つ細菌内で産生されるため、長いシアル酸ポリマー鎖の精製は、内毒素含有量の増大の可能性を上げる場合がある。1〜4個のシアル酸単位を有する短いPSA分子はまた、合成的に調製することができ(Kang SH et al.,Chem Commun.2000;227−8、Ress DK and
Linhardt RJ,Current Organic Synthesis.2004;1:31−46)、したがって、高い内毒素レベルのリスクを最小限化させる。しかしながら、ここで、内毒素もない、狭い大きさの分布および低い多分散性を有するPSA調製物を製造することができる。一態様では、本発明のための特定の使用の多糖類化合物は、細菌によって産生された多糖類化合物である。これらの天然の多糖類のうちの幾つかは、糖脂質として知られている。一実施形態において、多糖類化合物には、末端ガラクトース単位を実質的に含まない。
B.ポリエチレングリコール(PEG)およびPEG化
ある特定の態様では、治療用タンパク質は、種々の化学的方法のいずれかによって、水溶性ポリマーに複合化される(Roberts JM et al.,Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459−76)。例えば、一実施形態において、治療用タンパク質は、PEGの複合化によって、N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)エステルを使用して、タンパク質の遊離アミノ基に修飾される。別の実施形態において、水溶性ポリマー、例えば、PEGは、マレインイミド化学、または前酸化後に、治療用タンパク質の炭水化物部分へのPEGヒドラジドもしくはPEGアミンの結合を使用して、遊離SH基に結合される。

0150

一態様では、複合化は、水溶性ポリマーの直接結合(またはリンカー系を介する結合)によって、安定結合の形成下で、治療用タンパク質に対して実行される。さらに、分解性放出性または加水分解性リンカー系が本発明のある特定の態様に使用される(Tsubery et al.J Biol Chem 2004;279:38118−24/Greenwald et al.,J Med Chem 1999;42:3657−67/Zhao et al.,Bioconj Chem 2006;17:341−51/国際公開第2006/138572A2号/米国特許第7259224B2号/米国特許第7060259B2号)。

0151

本発明の一実施形態において、治療用タンパク質は、コハク酸スクシンイミジルグルタル酸スクシンイミジル、またはプロピオン酸スクシンイミジル等のN−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)を含有するポリエチレングリコール誘導体の使用によって、リシン残基を介して修飾される。これらの誘導体は、安定アミド結合を形成することによって、温和な条件下で、治療用タンパク質のリシン残基と反応する。本発明の一実施形態において、PEG誘導体の鎖長は、5,000Daである。直鎖および分岐構造を含む、500〜2,000Da、2,000〜5,000Da、5,000以上〜最大10,000Da、または10,000以上〜最大20,000Da、または20,000以上〜最大150,000Daの鎖長を有する他のPEG誘導体が、種々の実施形態に使用される。

0152

アミノ基のPEG化のための代替の方法としては、ウレタン結合を形成することによるPEGカルボン酸との化学的複合化、または二級アミド結合を形成する還元アミノ化によるアルデヒドもしくはケトンとの反応が挙げられるが、これらに限定されない。

0153

本発明の一実施形態において、治療用タンパク質分子は、市販されるPEG誘導体を使用して化学修飾される。代替的態様におけるこれらのPEG誘導体は、直鎖または分岐構造を有する。NHS基を含有するPEG誘導体の例が、下に列挙される。

0154

以下のPEG誘導体は、Nektar Therapeutics(Huntsville,Ala.、www.nektar.com/PEG試薬カタログ、Nektar Advanced PEGylation、価格表2005〜2006を参照)から市販されるPEG誘導体の非制限的な例である:
mPEG−プロピオン酸スクシンイミジル(mPEG−SPA)

0155

mPEG−スクシンイミジルα−メチルブタノアート(mPEG−SMB)

0156

mPEG−CM−HBA−NHS(CM=カルボキシメチル、HBA=ヒドロキシ酪酸

0157

分岐PEG誘導体(Nektar Therapeutics)の構造:
分岐PEG N−ヒドロキシスクシンイミド(mPEG2−NHS)

0158

分岐構造を有するこの試薬は、Kozlowskiら(BioDrugs 2001;5:419−29)によって、より詳細に記載されている。

0159

PEG誘導体の他の非制限的例は、NOF Corporation(Tokyo,Japan、www.nof.co.jp/english:カタログ2005を参照)から市販されている。
直鎖PEG誘導体(NOF Corp.)の一般構造

0160

X=カルボキシメチル

0161

X=カルボキシペンチル

0162

X=コハク酸

0163

X=グルタル酸

0164

分岐PEG誘導体(NOF Corp.)の構造:2,3−ビスメチルポリオキシエチ
レン−オキシ)−1−(1,5−ジオキソ−5−スクシンイミジルオキシ、ペンチルオキシ)プロパン

0165

2,3−ビス(メチルポリオキシエチレン−オキシ)−1−(スクシンイミジルカルボキシペンチルオキシ)プロパン

0166

これらのプロパン誘導体は、1,2置換パターンを有するグリセロール主鎖を示す。本発明では、1,3置換を有するグリセロール構造、または米国特許第2003/0143596A1号に説明される他の分岐構造に基づく分岐PEG誘導体もまた、企図される。

0167

Tsuberyら(J Biol Chem 2004;279:38118−24)およびShechterら(国際公開第04089280A3号)によって説明される、分解性を有するPEG誘導体(例えば、加水分解性リンカー)もまた、企図される。

0168

驚くべきことに、本発明のPEG化された治療用タンパク質は、延長したインビボ半減期と組み合わせて、機能活性を呈する。加えて、PEG化されたrFVIII、FVIIa、FIX、または他の血液凝固因子は、トロンビン不活性化に対してより耐性であるように思える。
C.ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)およびヒドロキシエチルデンプン(HES)
本発明の種々の実施形態において、治療用タンパク質分子は、ヒドロキシアルキルデンプン(HAS)もしくはホドロキシエチルデンプン(HES)、またはそれらの誘導体を使用して化学的に修飾される。

0169

HESは、天然アミロペクチンの誘導体であり、体内ではα−アミラーゼによって分解される。HESは、炭水化物ポリマーのアミロペクチンの置換誘導体であり、これはコーンスターチ中に最大95重量%の濃度で存在する。HESは、有利な生物学的特性を示し、血液量置換剤として診療所血液療法で使用される(Sommermeyer et al.,1987,Krankenhauspharmazie,8(8),271−278、およびWeidler et al.,1991,Arzneim.−Forschung/Drug Res.g 419 494−498)。

0170

アミロペクチンは、主鎖においてα−1,4−グリコシド結合が存在し、分岐鎖部位においてα−1,6−グリコシド結合が見出される、グルコース部分からなる。この分子の物理化学的特性は、主に、グリコシド結合の型によって決定される。ギザギザの(nicked)α−1,4−グリコシド結合のために、1回転当たり約6つのグリコースモノマーを有するらせん構造が作られる。ポリマーの物理化学的特性ならびに生化学的特性は、置換により改変し得る。ヒドロキシエチル基の導入は、アルカリ性ヒドロキシエチル化により達成することができる。反応条件適合させることにより、ヒドロキシエチル化に関して非置換グルコースモノマーにおけるそれぞれのヒドロキシ基の異なる反応性活用することが可能である。この事実により、当業者は限定される程度まで置換パターンに影響を及ぼすことができる。

0171

HASは、少なくとも1つのヒドロキシアルキル基によって置換されているデンプン誘導体を指す。したがって、ヒドロキシアルキルデンプンという用語は、末端炭水化物成分がヒドロキシアルキル基R1、R2、および/またはR3を含む化合物に限定されず、少なくとも1つのヒドロキシ基がどこかに存在し、末端炭水化物成分および/またはデンプン分子の残りの部分のいずれかにて、HAS’がヒドロキシアルキル基R1、R2、またはR3で置換されている化合物も指す。

0172

アルキル基は、直鎖または分岐鎖アルキル基であってもよく、これは好適に置換されてもよい。好ましくは、ヒドロキシアルキル基は、1〜10個の炭素原子、より好ましくは1〜6個の炭素原子、より好ましくは1〜4個の炭素原子、なおより好ましくは2〜4個の炭素原子を含有する。したがって、「ヒドロキシアルキルデンプン」は、好ましくは、ヒドロキシエチルデンプン、ヒドロキシプロピルデンプン、およびヒドロキシブチルデンプンを含み、ヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプンが特に好ましい。

0173

2つ以上の異なるヒドロキシアルキル基を含むヒドロキシアルキルデンプンもまた、本発明に含まれる。HASに含まれる少なくとも1つのヒドロキシアルキル基は、2つ以上のヒドロキシ基を含有してもよい。一実施形態によれば、HASを含む少なくとも1つのヒドロキシアルキル基は、1つのヒドロキシ基を含有する。

0174

HASという用語はまた、アルキル基がモノ置換または多置換である誘導体も含む。一実施形態において、アルキル基がハロゲン、特にフッ素、またはアリール基で置換されていることが好ましいが、但し、HASは水溶性のままであるものとする。更に、ヒドロキシアルキル基の末端ヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化することができる。HAS誘導体は、国際公開第2004/024776号に説明されており、これは参照によってその全体が組み込まれる。
D.付着方法
治療用タンパク質は、当業者に公知の種々の技術のいずれかによって、多糖類化合物に共有連結され得る。本発明の種々の態様では、シアル酸部分は、例えば、米国特許第4,356,170号に説明される方法(参照により、本明細書に組み込まれる)によって、治療用タンパク質、例えば、FIX、FVIII、FVIIa、またはVWFに結合される。

0175

PSAをポリペプチドに結合するための他の技術もまた、知られており、本発明によって企図される。例えば、米国公開第2007/0282096号は、例えば、PSAのアミンまたはヒドラジド誘導体をタンパク質に複合化させることを説明する。加えて、米国公開第2007/0191597号は、還元末端において基質(例えば、タンパク質)との反応のためのアルデヒド基を含有するPSA誘導体を説明する。これらの参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

0176

種々の方法が米国特許第5,846,951号の7列、15行〜8列、5行に開示される(参照によりその全体が組み込まれる)。例示的な技術は、血液凝固タンパク質または多糖類のうちのいずれかの上のカルボキシル基と、血液凝固タンパク質または多糖のアミン基との間のペプチド結合、または血液凝固タンパク質または多糖のカルボキシル基と、治療用タンパク質または多糖類のヒドロキシル基との間のエステル連結を介する連結を含む。治療用タンパク質が多糖類化合物に共有結合される、別の連結は、過ヨウ素酸塩酸化によって多糖類の非還元末端において形成されたアルデヒド基と反応させられる血液凝固タンパク質上の遊離アミノ基の間のシッフ塩基を介する(Jennings HJ and Lugowski C,J Immunol.1981;127:1011−8、FernandesAIand Gregoriadis G,Biochim Biophys Acta.1997;1341;26−34)。一態様では、生成されたシッフ塩基は、NaCNBH3での特異的還元によって安定化され、二級アミンを形成する。代替のアプローチは、前酸化後のNH4Clでの還元アミノ化によるPSA内の末端遊離アミノ基の生成である。二官能性試薬を、2つのアミノ基または2つのヒドロキシル基に連結するために使用することができる。例えば、アミノ基を含有するPSAが、BS3(ビス(スルホスクシンイミジル)スベリン酸/Pierce,Rockford,IL)等の試薬で、タンパク質のアミノ基に結合される。加えて、スルホ−EMCS(N−ε−マレインイミドカプロイルオキシ)スルホスクシンイミドエステル/Pierce)等のヘテロ二官能性架橋連結試薬を使用して、例えば、アミン基およびチオール基を連結する。

0177

別のアプローチでは、PSAヒドラジドが、前酸化、およびアルデヒド官能基の生成の後に調製され、タンパク質の炭水化物部分に結合される。

0178

上述の通り、治療用タンパク質の遊離アミノ基は、シアル酸残基の1−カルボキシル基と反応してペプチジル結合を形成するか、またはエステル連結が1−カルボキシル酸基と血液凝固タンパク質上のヒドロキシルまたは他の好適な活性基との間に形成される。代替的には、カルボキシル基は、脱アセチル化5−アミノ基とのペプチド連結を形成するか、または治療用タンパク質の分子のアルデヒド基は、シアル酸残基のN−脱アセチル化5−アミノ基を有するシッフ塩基を形成する。

0179

代替的には、多糖類化合物は、非共有様式で治療用タンパク質と会合する。例えば、一態様では、多糖類化合物および薬学的に活性な化合物は、疎水性相互作用を介して連結される。他の非共有会合は、相互に求引する逆帯電されたイオンでの静電相互作用を含む。

0180

種々の実施形態において、治療用タンパク質は、化学量論量(例えば1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:7、1:8、1:9、または1:10等)の多糖類化合物に連結、または会合される。種々の実施形態において、1〜6、7〜12、または13〜20の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。更に他の実施形態において、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、またはそれ以上の多糖類が血液凝固タンパク質に連結される。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ