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課題

細菌、植物、植物細胞組織及び種子に殺虫活性を付与する組成物及び方法の提供。

解決手段

毒素ポリペプチドコード配列を含む組成物が提供され、形質転換、並びに植物及び細菌中で発現させるためのDNA構築物又は発現カセットにおいて、コード配列を用いることができる。組成物はまた、形質転換した細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子をも含む。特に、単離した毒素核酸分子が提供され、加えて、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列、及びそれらアミノ酸配列に特異的に結合する抗体が包含される。特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子、又は特定のヌクレオチド配列、並びに変異体及びその断片。

概要

背景

概要

細菌、植物、植物細胞組織及び種子に殺虫活性を付与する組成物及び方法の提供。毒素ポリペプチドコード配列を含む組成物が提供され、形質転換、並びに植物及び細菌中で発現させるためのDNA構築物又は発現カセットにおいて、コード配列を用いることができる。組成物はまた、形質転換した細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子をも含む。特に、単離した毒素核酸分子が提供され、加えて、ポリヌクレオチドに対応するアミノ酸配列、及びそれらアミノ酸配列に特異的に結合する抗体が包含される。特定のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子、又は特定のヌクレオチド配列、並びに変異体及びその断片。なし

目的

特許‘332にはまた、エンドトキシンの構造と機能との間の
関係についての知見を提供する

効果

実績

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請求項1

殺虫活性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む組換え核酸分子であって、ここで前記ヌクレオチド配列が、a)配列番号5、1〜4、又は6〜47のいずれかに示されたヌクレオチド配列;b)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;及びc)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択される、組換え核酸分子。

請求項2

前記ヌクレオチド配列が植物中で発現するために設計された合成配列である、請求項1に記載の組換え核酸分子。

請求項3

前記配列が配列番号97〜203のいずれかに示される配列である、請求項2に記載の組換え核酸分子。

請求項4

前記ヌクレオチド配列が、前記ヌクレオチド配列を植物細胞中で発現させることができるプロモーター作動可能に連結される、請求項1に記載の組換え核酸分子。

請求項5

請求項1に記載の核酸分子を含むベクター

請求項6

異種ポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項5に記載のベクター。

請求項7

請求項5に記載のベクターを含む宿主細胞

請求項8

細菌性宿主細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。

請求項9

植物細胞である、請求項7に記載の宿主細胞。

請求項10

請求項9に記載の宿主細胞を含むトランスジェニック植物

請求項11

前記植物が、トウモロコシソルガムコムギキャベツヒマワリトマトアブラナコショウジャガイモワタ、イネ、ダイズテンサイサトウキビタバコオオムギ、及びナタネからなる群より選択される、請求項10に記載のトランスジェニック植物。

請求項12

請求項1に記載の核酸分子を含むトランスジェニック種子。

請求項13

殺虫活性を有する組換えポリペプチドであって、a)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチド;b)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド;及びc)配列番号5、1〜4、又は6〜47のいずれかによりコードされるポリペプチド、からなる群より選択される、組換えポリペプチド。

請求項14

異種アミノ酸配列をさらに含む、請求項13に記載のポリペプチド。

請求項15

請求項13に記載の組換えポリペプチドを含む組成物

請求項16

前記組成物が、粉末塵埃錠剤顆粒スプレー乳濁液コロイド、及び溶液からなる群より選択される、請求項15に記載の組成物。

請求項17

前記組成物が、乾燥、凍結乾燥均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又は細菌細胞培養の濃縮、により調製される、請求項15に記載の組成物。

請求項18

重量にして約1%〜約99%までの前記ポリペプチドを含む、請求項15に記載の組成物。

請求項19

鱗翅目鞘翅目異翅類線虫、又は双翅目害虫集団を、殺虫効果量の請求項13に記載のポリペプチドに接触させる工程を含む、前記集団制御方法

請求項20

鱗翅目、鞘翅目、異翅類、線虫、又は双翅目害虫を、殺虫的効果量の請求項13に記載のポリペプチドに接触させる、又は前記害虫に前記ポリペプチドを摂食させる工程を含む、前記害虫の殺虫方法

請求項21

殺虫活性を有するポリペプチドの生産方法であって、該ポリペプチドをコードする核酸分子が発現する条件下において請求項7に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、生産方法。

請求項22

殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA構築物がそのゲノム中に安定して組み入れられた植物であって、前記ヌクレオチド配列が、a)配列番号5、1〜4、又は6〜47のいずれかに示されたヌクレオチド配列;b)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;及びc)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択され、ここで前記ヌクレオチド配列が、植物細胞中でコード配列の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結される、植物。

請求項23

前記植物が植物細胞である、請求項22に記載の植物。

請求項24

殺虫性ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、植物又はその細胞中で発現させる工程を含む、害虫から植物を保護する方法であって、前記ヌクレオチド配列が、a)配列番号5、1〜4、又は6〜47のいずれかに示されたヌクレオチド配列;b)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;及びc)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択される、方法。

請求項25

前記植物が、鱗翅目、鞘翅目、異翅類、線虫、又は双翅目の害虫に対する殺虫活性を有する殺虫性ポリペプチドを生産する、請求項24に記載の方法。

請求項26

殺虫活性を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むDNA構築物がそのゲノム中に安定して組み入れられた植物又はその種子を、用地において生育させる工程を含む、植物生産量を増加させる方法であって、前記ヌクレオチド配列が、a)配列番号5、1〜4、又は6〜47のいずれかに示されたヌクレオチド配列;b)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列を含むポリペプドチをコードするヌクレオチド配列;及びc)配列番号54、50〜53、又は55〜96のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも96%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、からなる群より選択され、前記用地が、前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫に感染している、方法。

技術分野

0001

本発明は、分子生物学の分野に関する。殺虫性タンパク質をコードする新規の遺伝子が
提供される。これらのタンパク質及びそれらをコードする核酸配列は、殺虫性製剤の調製
及び耐害虫トランスジェニック植物作出に有用である。

0002

発明の背景
Bacillus thuringiensisは、昆虫のある一定の目及び種に特異的に有毒であるが、植物
及び非標的生物には無害結晶封入体生産するその能力によって特徴付けられる、グラ
陽性胞子形成土壌細菌である。そのため、Bacillus thuringiensis株又はその殺虫性
タンパク質を含む組成物は、農業上の害虫、又はヒト若しくは動物の様々な疾患を媒介す
る昆虫を制御するための環境に優しい殺虫剤として用いることができる。

0003

Bacillus thuringiensis由来の結晶(Cry)タンパク質(デルタエンドトキシン)は
、主に鱗翅目(Lepidopteran)、双翅類(Dipteran)、及び鞘翅目(Coleopteran)の幼
虫に対する強力な殺虫活性を有する。これらのタンパク質が、膜翅目(Hymenoptera)、
同翅類(Homoptera)、シラミ(Phthiraptera)、ハジラミ(Mallophaga)、及びダニ(A
cari)害虫目、並びに線形動物(Nemathelminthes)、扁形動物(Platyhelminthes)、及
有毛足虫(Sarcomastigorphora)などのその他の無脊椎動物目に対してもまた活性を有
することが示されている(Feitelson (1993) The Bacillus Thuringiensis family tree.
In Advanced Engineered Pesticides, Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.)。これ
らのタンパク質は、最初は主としてその殺虫活性によって、CryIからCryVに分類
された。主要なクラスは、鱗翅目−特異的(I)、鱗翅目及び双翅類−特異的(II)、
翅目−特異的(III)、双翅類−特異的(IV)、及び線虫−特異的(V)並びに(VI)で
あった。タンパク質は、サブファミリーにさらに分類された;それぞれのファミリーの中
でより密接に関係したタンパク質には、Cry1A、Cry1B、Cry1C、などの区
分を示す文字割り当てられた。それぞれの区分の中でさらにより密接にタンパク質は、
Cry1C1、Cry1C2、などと命名された。

0004

昆虫標的特異性よりもむしろアミノ酸配列相同性に基づいて、Cry遺伝子について新
しい命名法が最近記述された(Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 6
2:807-813)。新しい分類においては、それぞれの毒素には、第一階級(アラビア数字
つ)、第二階級(大文字1つ)、第三階級小文字1つ)、及び第四階級(その他のアラ
ビア数字1つ)を包含する固有名前が割り当てられる。新しい分類においては、第一階
級のローマ数字が、アラビア数字に置き換えられた。45%未満の配列同一性を有するタ
ンパク質は、異なる第一階級を有し、第二及び第三階級における基準は、それぞれ78%
及び95%である。

0005

結晶タンパク質は、昆虫の中腸に摂取され、そして可溶化されるまで殺虫活性を示さな
い。摂取されたプロトキシンは、昆虫の消化管においてプロテアーゼにより加水分解され
、活性な有毒分子となる



この毒素は、標的幼虫の中腸内の頂部刷子縁レセプターに結合し、イオンチャネル又は
孔を形成しながら頂端膜移入し、幼虫の死をもたらす。

0006

デルタエンドトキシンは通常、5つの保存配列ドメイン、及び3つの保存構造ドメイン
を有する(例えば、de Maagd et al. (2001) TrendsGenetics 17:193-199を参照のこと
)。第一の保存された構造ドメインは、7つのアルファヘリックスを含み、膜挿入及び孔
形成に関与する。ドメインIIは、ギリシャキー(Greek key)配置に配置された3つのベ
ータシートからなり、そしてドメインIIIは、「ジェリーロール(jelly roll)」形態の
2つの逆平行ベータシートからなる(de Maagd et al., 2001、前記)。ドメインII及
びIIIは、レセプターの認識及びレセプターとの結合に関与し、そのため、毒素特異性の
決定因子と考えられている。

0007

デルタエンドトキシンとは別に、殺虫性タンパク質毒素にはいくつかのその他の公知の
分類がある。VIP1/VIP2毒素(例えば、米国特許第5,770,696号を参照
のこと)は、その他のバイナリー(「A/B」)毒素の作用機序と同様に、レセプターを
介したエンドサイトーシスとそれに続く細胞被毒を含むと考えられる機序により昆虫に
対して強い活性を表す、バイナリー殺虫性毒素である。VIP、C2、CDT、CST、
又はB. anthracis浮腫及び致死毒素などのA/B毒素は、特異的な、レセプターを介した
単量体としての「B」成分の結合を通して、最初に標的細胞相互作用する。これらの単
量体は、次にホモヘプタマーを形成する。次に、「B」ヘプタマー−レセプター複合体
酵素の「A」成分とその後結合し、レセプターを介したエンドサイトーシスを通した酵
素の「A」成分のサイトゾル中への移動を可能にするドッキングプラットフォームとして
機能する。細胞のサイトゾル中に入ると、「A」成分は、例えばG−アクチンADP
リボシル化、又は環状AMPcAMP)の細胞内レベルを上昇させることにより、正常
な細胞の機能を阻害する。Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373--402を
参照。

0008

Bacillus thuringiensisをベースとする殺虫剤の過度の使用が、既にコナガ、プルテラ
・キシロステラ(Plutella xylostella)の野外個体群における抵抗性を引き起こしてい
る(Ferre and Van Rie (2002) Annu. Rev. Entomol. 47:501-533)。抵抗性の最も一般
的な機序は、毒素の、その特異的中腸レセプターへの結合の減少である。これは同じレセ
プターを共用するその他の毒素への交差耐性をも与える可能性がある(Ferre and Van Ri
e (2002))。

0009

発明の概要
細菌、植物、植物細胞組織及び種子に害虫抵抗性を付与するための組成物及び方法が
提供される。組成物は、毒素ポリペプチドのための配列をコードする核酸分子、それら核
酸分子を含むベクター、及びベクターを含む宿主細胞を含む。組成物はまた、毒素のポリ
ペプチド配列、及びそれらポリペプチドに対する抗体をも含む。ヌクレオチド配列を、D
NA構築物、又は微生物及び植物を含む生物への形質転換及び発現のための発現カセット
において使用することができる。ヌクレオチド又はアミノ酸配列は、微生物又は植物を含
むが、これらに限定されない生物において発現させるために設計された合成配列であって
もよい。組成物はまた、形質転換された細菌、植物、植物細胞、組織、及び種子をも含む

0010

特に、毒素の核酸配列に対応する、単離した核酸分子が提供される。加えて、ポリヌク
レオチドに対応するアミノ酸配列が包含される。特に、本発明は、配列番号50〜96の
いずれか1つに示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸
分子、又は配列番号1〜47に示されるヌクレオチド配列並びに変異体及びその断片を提
供する。本発明のヌクレオチド配列と相補的な、又は本発明の配列とハイブリダイズする
ヌクレオチド配列もまた包含される。

0011

本発明の組成物及び方法は、農薬抵抗性を有する生物、特に細菌及び植物の作出に有用
である。それらに由来するこれらの生物及び組成物は、農業上の目的のために望ましい。
本発明の組成物は、殺虫活性を有する変化した若しくは改良した毒素タンパク質の生成、
又は、産物若しくは生物における毒素タンパク質若しくは核酸の有無の検出のためにもま
た有用である。

0012

詳細な説明
本発明は、生物、特に植物又は植物細胞において害虫抵抗性を制御するための組成物及
び方法に関する。この方法は、本発明の毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列を
用いて生物を形質転換することを含む。特に、本発明のヌクレオチド配列は、殺虫活性を
有する植物及び微生物の調製に有用である。従って、形質転換した細菌、植物、植物細胞
植物組織及び種子が提供される。組成物は、Bacillus thuringiensisの毒素核酸及びタ
ンパク質である。配列は、目的の生物へそ後形質転換するための発現ベクター構築
おいてはその他の毒素遺伝子の単離のためのプローブとして、そしてドメインスワッピン
グ又はDNAシャッフリングなどの当該分野において公知の方法により変化させた殺虫性
タンパク質の生成のために用いられる。タンパク質は、鱗翅目、鞘翅目、及び線虫害虫集
団の制御又は駆除、並びに殺虫活性を有する組成物の生産のために用いられる。

0013

「毒素」という用語は、鱗翅目、双翅目、及び鞘翅目のメンバー又は線虫門のメンバー
を含むがこれらに限定されない、1種類以上の害虫に対する有毒活性をもつ本明細書にお
いて開示された配列、又はそのようなタンパク質との相同性を有するタンパク質を意味す
る。いくつかの例においては、Bacillus sp.から毒素タンパク質が単離された。別の実施
形態において、毒素を、Clostridium bifermentans及びPaenibacillus popilliaeを含む
その他の生物から単離した。毒素タンパク質は、本明細書において開示された完全長ヌク
レオチド配列から推測したアミノ酸配列、及び、下流の別の開始部位を使用すること又は
殺虫活性を有するより短いタンパク質を生産するプロセシングのいずれかによる、完全長
配列よりも短いアミノ酸配列を含む。プロセシングは、タンパク質が発現される生物、又
はそのタンパク質を摂取した後の害虫において生じる場合がある。

0014

様々な実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシン
タンパク質との相同性を有する。デルタエンドトキシンは、cry1〜cry53、cy
t1及びcyt2、及びCyt様毒素として同定されたタンパク質を含む。現在、多様な
特異性及び有毒性を有する250を超える公知の種のデルタエンドトキシンがある。包括
的な一覧については、Crickmore et al. (1998), Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-8
13を、定期的な更新については、www.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index
のCrickmore et al. (2003)「Bacillus thuringiensis toxin nomenclature」を参照。い
くつかの実施形態において、本明細書において開示されたデルタエンドトキシン配列は、
配列番号1〜47又は97〜203のいずれかに示されたヌクレオチド配列、配列番号5
0〜96のいずれかに示されたアミノ酸配列、及びその断片を含む。

0015

cry8ホモログ
1つの実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシン
のcry8ファミリーとの相同性を有する。デルタエンドトキシンのcry8ファミリー
は、鞘翅目の昆虫に対して有毒であることが示されている。例えば、鞘翅目に活性なCr
y8変異体は、米国特許第7,105,332号に記載されている(その全体を参照によ
り明細書に組み入れる)。特許‘332にはまた、エンドトキシンの構造と機能との間の
関係についての知見を提供する、Cry3A遺伝子の決定した構造(Li et al. (1991) N
ature 353:815 821)から構築したcry8相同性モデルが示されている。

0016

いくつかの実施形態において、本明細書に包含されるcry8ホモログは、配列番号1
、2、及び3に示されたヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列、並びに配列番号50
、51、及び52に示されたアミノ酸配列を含む。生物学的に活性な変異体及びこれら配
列の断片もまた包含される。

0017

cry7様配列
1つの実施形態において、本明細書において開示された配列は、cry7様デルタエン
トキシンである。様々な実施形態において、本発明のcry7様配列は、配列番号4に
示されるヌクレオチド配列、配列番号53に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活
性な変異体及びその断片を含む。

0018

cry1Iホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンの
cry1Iファミリーとの相同性を有する。いくつかの実施形態において、cry1Iホ
ログは、配列番号5に示されるヌクレオチド配列、配列番号54に示されるアミノ酸
列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

0019

cry1I遺伝子(以前のcryV遺伝子)は、結晶状蓄積しない約70〜81kDaのタンパク質をコードし(Choi et al. (2000) Curr. Microbiol. 41:65-69; Gleave et al. (1993) Appl. Environ. Microbiol. 59:1683-1687; Kostichka et al. (1996) J. Bacteriol. 178:2141-2144;米国特許第6,232,439号;米国特許第5,723,758号;Selvapandiyan et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5855-5858; Shinet al. (1995) Appl. Environ. Microbiol. 61:2402-2407; Song et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:5207-5211; Tailor et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:1211-1217;及びTounsi et al. (2003) J. Appl. Microbiol. 95:23-28);これらは、Cry1群のタンパク質との類似性によって、Cry1Iタンパク質として分類されてきた(Crickmore et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:807-813)。昆虫からの攻撃から、形質転換植物を保護することにおけるCry1の有効性が示されてきた(Lagnaoui et al. (2001)CIP Program Rep. 1999-2000:117-121; Liu et al. (2004) Acta Biochim. Biophys. Sin. 36:309-313;及びSelvapandiyan et al. (1998) Mol. Breed. 4:473-478)。通常、cry1I遺伝子は、発現していないか又は成長期において発現するかのいずれかであり、そして成長懸濁液中分泌される(Kostichka et al. (1996) J. Bacteriol. 178:2141-2144; Selvapandiyan et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5855-5858; Song et al. (2003) Appl. Environ. Microbiol. 69:5207-5211;及びTounsi et al. (2003) J. Appl. Microbiol. 95:23-28)。Cry1Iタンパク質は、大部分のその他のCry1タンパク質よりも広い宿主域を有し、そして宿主は、鱗翅目及び鞘翅目害虫の重要な種を含む(Tailor et al. (1992) Mol. Microbiol. 6:1211-1217)。

0020

cry9ホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンの
cry9ファミリーとの相同性を有する。いくつかの実施形態において、cry9ホモロ
グは、配列番号6に示されるヌクレオチド配列、配列番号55に示されるアミノ酸配列、
並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

0021

cry4ホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、デルタエンドトキシンの
cry4ファミリーとの相同性を有する。様々な実施形態において、本明細書において包
含されるcry4ホモログは、配列番号7、8、9、10、11、及び12に示されたヌ
クレオチド配列、配列番号56、57、58、59、60、及び61に示されたアミノ酸
配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

0022

デルタエンドトキシンのcry4ファミリーは、双翅目の害虫に対する活性を有するこ
とが示されてきた。Angsuthanasombat et al. ((2004) Journal of Biochemistry and Mo
lecular Biology 37(3):304-313、その全体、特にcry4の構造解析に関して、を参照
により明細書に組み入れる)は、cry4の3次元構造及び構造と双翅類活性との相関
ついて記載している。

0023

cryC35/53様配列
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、cryC35/cryC
53様配列である。いくつかの実施形態において、cryC35/cryC53様配列は
、配列番号13、14、15、又は16に示されるヌクレオチド配列、配列番号62、6
3、64、及び65に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断
片を含む。

0024

cry21/cry12様配列
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、cry21/cry12
様配列である。cry12/21ファミリーは、線虫害虫に対する活性を有することが示
されている(Wei (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100(5): 2760-2765及び欧州特許
第0462721A2号、このそれぞれは参照により本明細書に組み入れる)。様々な実
施形態において、本明細書に包含されるcry21/cry12様配列は、配列番号17
、18、19、及び20に示されるヌクレオチド配列、配列番号66、67、68、及び
69に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

0025

VIP様又はバイナリー様配列
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、VIP様又はバイナリー
様タンパク質である。植物性殺虫タンパク質(VIP)は、細菌の栄養成長の際に生産さ
れる殺虫タンパク質であり、従って外毒素に分類される。VIP遺伝子は、様々な鱗翅目
に対する殺虫活性を示す。

0026

VIP1/VIP2毒素(例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、米国
特許第5,770,696号を参照)は、その他のバイナリー(「A/B」)毒素の作用
機序と同様に、レセプターを介したエンドサイトーシスとそれに続く細胞の被毒を含むと
考えられる機序により昆虫に対して強い活性を表す、バイナリー殺虫性毒素である。VI
P、C2、CDT、CST、又はB. anthracis浮腫及び致死毒素などのバイナリーA/B
毒素は、特異的なレセプターを介した単量体としての「B」成分の結合を通して、最初に
標的細胞と相互作用する。これらの単量体は、次にホモヘプタマーを形成する。次に「B
」ヘプタマー−レセプター複合体は、その後、酵素の「A」成分と結合し、レセプターを
介したエンドサイトーシスを通した酵素の「A」成分のサイトゾル中への移動を可能にす
るドッキングプラットフォームとして機能する。細胞のサイトゾル中に入ると、「A」成
分は、例えばG−アクチンのADP−リボシル化、又は環状AMP(cAMP)の細胞内
レベルを上昇させることにより、正常な細胞の機能を阻害する。その全体を参照により本
明細書に組み入れる、Barth et al. (2004) Microbiol Mol Biol Rev 68:373-402を参照

0027

A/B型バイナリー毒素とは別に、殺虫性タンパク質として作用するその他の型のバイ
ナリー毒素も当該分野において公知である。Cry34Ab1及びCry35Ab1は、
PS149B1株より同定された、殺虫活性を有するバイナリー毒素を含む(Ellis et a
l. (2002) Appl Environ Microbiol. 68:1137-45、参照によりその全体を本明細書に組み
入れられる)。これらの毒素はそれぞれ、およそ14及び44kDaの分子量を有する。同
様の機構並びにCry34Aa及びCry34Abとの相同性を有するその他のバイナリ
ー毒素も同定された(Baum et al. (2004) Appl Environ Microbiol. 70:4889-98、参照
によりその全体を本明細書に組み入れる)。

0028

BinA及びBinBは、殺性(mosquitocidal)バイナリー毒素タンパク質を含むB
acillus sphaericus由来のタンパク質である(Baumann et al. (1991) Micriobiol. Rev.
55:425-36)。Cry35は、これらBinA及びBinBタンパク質とのアミノ酸類
性を示す。Cry36(ET69)及びCry38(ET75)(国際公開第00/66
742−B号、参照によりその全体を本明細書に組み入れる)もまた、BinA及びBi
nBとのアミノ酸類似性を示す独立して単離されたペプチドであり、従って、バイナリー
毒素を含むと考えられる。

0029

様々な実施形態において、本明細書に包含されるVIP様又はバイナリー様配列は、配
列番号21、22、23、及び24に示されるヌクレオチド配列、配列番号70、71、
72、及び73に示されるアミノ酸配列、並びにその生物学的に活性な変異体及び断片を
含む。

0030

MTX様配列
さらに別の実施形態において、本明細書に包含される配列は、MTX様配列である。当
該分野で使用される場合、「MTX」という用語は、当該技術において、Bacillus sphae
ricusにより生産される一組の殺虫性タンパク質を説明するために用いられる。当該分野
においてはしばしばMTX1と称される、これらの第一は、蚊に対して有毒な副胞子結晶
として合成される。結晶の主要な成分は51及び42kDaの2つのタンパク質である。有
毒性には両方のタンパク質が存在することが必要とされるため、MTX1は、「バイナリ
ー」毒素だと考えられる(Baumann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425-436)。

0031

異なる有毒性を有する異なるBacillus sphaericus株の解析によって、2つの新しいク
ラスのMTX毒素が同定された。MTX2及びMTX3は、殺虫活性を示す関連したクラ
スの別個の殺虫性毒素を表す。例えば、参照によりその全体を本明細書に組み入れる、Ba
umann et al. (1991) Microbiol. Rev. 55:425-436を参照。MTX2は、100kDaの毒
素である。Bacillus sphaericus由来のMTX3のアミノ酸配列は、Bacillus sphaericus
SSII−1のMTX2毒素と38%同一であるが、より最近になって、MTX3は、別
個の毒素として同定された(Liu, et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62: 2174-
2176)。Mtx毒素は、Bacillus sphaericus株の殺虫活性を増大させること、及び蚊集
団におけるBin毒素への抵抗性の進展を管理することの両方において有用な可能性があ
る(Wirth et al. (2007) Appl Environ Microbiol 73(19):6066-6071)。

0032

様々な実施形態において、MTX様配列は、配列番号25、26、27、28、及び2
9に示されるヌクレオチド配列、配列番号74、75、76、77、及び78に示される
アミノ酸配列、及びその生物学的に活性な変異体及びその断片を含む。

0033

Cry毒素
本発明はさらに、デルタエンドトキシンではないが、バチルスから単離された毒素配列
を含む。1つの実施形態において、これらの毒素は、ホスファチジルイノシトールホスホ
ジエステラーゼ(ホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PI−PLC)
とも称される)との相同性を有する。ホスファチジルイノシトールホスホジエステラーゼ
は、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)とホスファチジルイノシトール(
PI)アンカーを分解する。これらのタンパク質は、PI−PLC X−ボックスドメ
ンを含み、そして細菌細胞膜を通じて培養培地中に酵素を分泌する、Bacillus cereus、B
acillus thuringiensis、Staphylococcus aureus、及びClostridium novyiの培養から単
離された。Bacillus cereus由来のホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC
(PI−PLC)(Heinz et al. (1995)EMBO J. 14, 3855-3863、参照によりその全体
を本明細書に組み入れる)の活性部位ポケット局在するアミノ酸残基役割は、部位特
異的突然変異生成動力学、及び結晶構造解析により研究された(Gassler et al. (1997
) Biochemistry 36:12802-12813、参照によりその全体を本明細書に組み入れる)。

0034

様々な実施形態において、本明細書において開示された毒素配列は、配列番号30に示
されるヌクレオチド配列、配列番号79に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性
な変異体及び断片を含む。

0035

従って、本明細書において、殺虫活性を付与する新規の単離したヌクレオチド配列のフ
ァミリーが提供される。毒素タンパク質のアミノ酸配列もまた提供される。この遺伝子の
翻訳から生じたタンパク質は、その細胞がそれを摂取した害虫を制御又は殺虫することを
可能にする。

0036

cry55ホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、cry55ホモログであ
る。いくつかの実施形態において、cry55ホモログは、配列番号43及び44に示さ
れるヌクレオチド配列、配列番号92及び93に示されるアミノ酸配列、並びにその生物
学的に活性な変異体及びその断片を含む。

0037

cry15Aホモログ
別の実施形態において、本明細書において開示された配列は、cry15Aホモログで
ある。Cry15A毒素は、鱗翅目の害虫に対して活性を有することが示された(Rang e
t al. (2000) Curr Microbiol. 40(3):200-4)。いくつかの実施形態において、cry1
5Aホモログは、配列番号45、46、及び47に示されるヌクレオチド配列、配列番号
94、95、及び96に示されるアミノ酸配列、並びに生物学的に活性な変異体及びその
断片を含む。

0038

単離した核酸分子、及びその変異体並びにその断片
本発明の1つの態様は、毒素タンパク質及びポリペプチド又はその生物学的に活性な一
部分をコードするヌクレオチド配列を含む単離した又は組換え核酸分子、並びに毒素をコ
ードする核酸を同定するためのハイブリダイゼーションプローブとしての使用に十分であ
る核酸分子に関する。本明細書で使用する場合、「核酸分子」という用語は、DNA分子
(例えば、組換えDNAcDNA又はゲノムDNA)及びRNA分子(例えば、mRN
A)及びヌクレオチドアナログを用いて生成されたDNA又はRNAのアナログを含むこ
とを意味する。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは二本
鎖DNAである。

0039

「単離した」又は「精製した」核酸分子若しくはタンパク質、又はその生物学的に活性
な一部分は、組換え技術により生産される場合には、その他の細胞物質若しくは培地を実
質的に含まず、又は化学的に合成する場合には、原料となる化学物質若しくはその他の化
物質を実質的に含まない。好ましくは、「単離した」核酸は、その核酸が由来する生物
のゲノムDNA中で、その配列と天然に隣接している配列(すなわち、その核酸の5’及
び3’端に位置する配列)(好ましくはタンパク質をコードする配列)、を含まない。本
発明の目的のために、核酸分子について言及する場合、「単離した」は単離したクロモソ
ームを除外する。例えば、様々な実施形態において、単離した毒素をコードする核酸分子
は、核酸が由来した細胞のゲノムDNAにおいて、天然に隣接した核酸分子である、約5
kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb、又は0.1kb未満のヌクレオチド配列を含むこ
とが可能である。実質的に細胞物質を含まない毒素タンパク質は、(乾燥重量により)約
30%、20%、10%、又は5%未満の非毒素タンパク質(本明細書においては「混入
タンパク質」とも称される)を有するタンパク質の調製物を含む。

0040

本発明のタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号1〜47に示される配
列、及びその変異体、断片、並びに相補鎖を含む。「相補鎖」とは、示されたヌクレオ
ド配列にハイブリダイズすることができ、それによって安定な二本鎖を形成することがで
きる、示されたヌクレオチド配列と十分に相補的なヌクレオチド配列を意味する。このヌ
クレオチド配列によりコードされる、毒素タンパク質に対応するアミノ酸配列は、配列番
号50〜96に示される。

0041

これらの毒素をコードするヌクレオチド配列の断片である核酸分子もまた、本発明に包
含される。「断片」とは、毒素タンパク質をコードするヌクレオチド配列の一部分を意味
する。ヌクレオチド配列の断片は、毒素タンパク質の生物学的に活性な一部分をコードし
てもよく、又は以下に開示された方法を用いるハイブリダイゼーションプローブ若しくは
PCRプライマーとして使用することが可能な断片であってもよい。毒素ヌクレオチド配
列の断片である核酸分子は、使用の目的により、少なくとも約50、100、200、3
00、400、500、600、700、800、900、1000、1050、110
0、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、150
0、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、190
0、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、230
0、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、270
0、2750、2800、2850、2900、2950、3000、3050、310
0、3150、3200、3250、3300、3350の連続したヌクレオチド、又は
本明細書において開示された完全長毒素をコードするヌクレオチド配列中に存在するヌク
レオチドの数までのヌクレオチドを含む。「連続した」ヌクレオチドは、それぞれ直接隣
接したヌクレオチド残基を意味する。本発明のヌクレオチド配列断片は、毒素タンパク質
生物学的活性を保持するタンパク質断片をコードし、それにより、殺虫活性が保持され
る。「活性を保持する」とは、断片が、少なくとも約30%、少なくとも約50%、少な
くとも約70%、80%、90%、95%又はそれ以上の毒素タンパク質の殺虫活性を有
するものであることを意味する。殺虫活性の測定方法は当該分野において周知である。例
えば、参照によりそれらすべての全体を本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990)
J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206;
Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;及び米国特許第5,7
43,477号を参照。

0042

本発明のタンパク質の生物学的に活性な一部分をコードする毒素をコードするヌクレオ
チド配列の断片は、少なくとも約15、25、30、50、75、100、125、15
0、175、200、250、300、350、400、450、500、550、60
0、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、
1100の連続したアミノ酸、又は本発明の完全長毒素タンパク質中に存在するアミノ酸
総数までのアミノ酸をコードする。いくつかの実施形態において、断片は、タンパク質
分解性の切断断片である。例えば、タンパク質分解性の切断断片は、配列番号50〜96
に関連した、少なくとも約100アミノ酸、約120、約130、約140、約150、
又は約160アミノ酸のN末端又はC末端欠損を含んでいてもよい。いくつかの実施形
態において、本明細書に包含される断片は、例えば、タンパク質分解又はコード配列への
停止コドンの挿入による、C末端結晶化ドメインの除去により生じる。

0043

本発明の好ましい毒素タンパク質は、配列番号1〜47のヌクレオチド配列と十分に同
一なヌクレオチド配列によってコードされる。「十分に同一」とは、本明細書において記
載したアライメントプログラムのうちの一つを用いて標準的な指標を使用して参照配列
比較した場合に、少なくとも約60%又は65%配列同一性、約70%又は75%配列同
一性、約80%又は85%配列同一性、約90%、91%、92%、93%、94%、9
5%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸又は
ヌクレオチド配列を意味する。当業者は、コドン縮重、アミノ酸類似性、読み枠位置など
を考慮に入れることにより、2つのヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の
対応する同一性を決定するための、これらの値は適宜調整されることを認識するであろう

0044

2つのアミノ酸配列又は2つの核酸の同一性のパーセンテージを決定するためには、最
適な比較目的について配列を整列させる。2つの配列間の同一性のパーセンテージは、そ
の配列において共通した、同一の位置の数の関数である(すなわち、同一性のパーセン
ージ=同一な位置の数/位置の総数(例えば、重複している位置)×100)。1つの実
施形態において、2つの配列は同じ長さである。別の実施形態において、比較は参照配列
全長に及ぶ(例えば、配列番号1〜47のうちの一つの全長に及ぶ、又は配列番号50
〜96のうちの一つの全長に及ぶ)。2つの配列間の同一性のパーセンテージは、許容
きるギャップを含む、又は含まない、以下に記載した技術と同様の技術によって決定する
ことができる。典型的には、同一性のパーセンテージの算出においては、完全な一致が計
測される。

0045

2つの配列間の同一性のパーセンテージの決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することができる。2つの配列の比較に用いられるそれら数学的アルゴリズムの非限定的な例としては、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において変更された、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264、のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403のBLASTN及びBLASTXプログラムに組み込まれる。本発明の毒素様核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得るために、BLASTNプログラム、スコア=100、ワード長=12、を使用したBLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本発明の毒素タンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得るために、BLASTXプログラム、スコア=50、ワード長=3を使用してBLASTタンパク質検索を行うことができる。比較目的のためのギャップのあるアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic AcidsRes. 25:3389に記載されたように、Gapped BLAST(BLAST2.0中の)を用いることができる。あるいはまた、分子間の距離関係を検出するための反復検索を行うためには、PSI−Blastを用いることができる。Altschulet al. (1997)前記を参照。BLAST、Gapped BLAST、及びPSI−Blastプログラムを使用する場合には、それぞれのプログラム(例えば、BLASTX及びBLASTN)において既定された指標を用いることができる。アライメントはまた、検査によって手動で行ってもよい。

0046

配列を比較するために用いる、数学的アルゴリズムの別の非限定的な例としては、Cl
ustalWアルゴリズム(Higgins et al. (1994) Nucleic AcidsRes. 22:4673-4680
)がある。ClustalWは、配列を比較し、アミノ酸又はDNA配列の全長を整列さ
せ、こうして、全アミノ酸配列の保存配列についてのデータを提供することができる。C
lustalWアルゴリズムは、VectorNTI Program Suite(Invitrogen Corporation,
Carlsbad, CA)のALIGNXモジュールなどの、いくつかの市販されているDNA/ア
ミノ酸解析ソフトウェアにおいて使用される。ClustalWを用いてアミノ酸配列を
アライメントした後、アミノ酸同一性のパーセンテージを評価することができる。Clu
stalWのアライメント解析に有用なソフトウェアプログラムの非限定的な例としては
、GENEDOC(商標)がある。GENEDOC(商標)(Karl Nicholas)は、複数
タンパク質間のアミノ酸(又はDNA)の類似性及び同一性の評価を可能にする。配列
を比較するために用いられる、数学的アルゴリズムの別の非限定的な例としては、Myers
and Miller (1988) CABIOS 4:11-17のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、
GCG Wisconsin Genetics Software Package, Version 10(Accelrys, Inc, 9685 Scranto
n Rd., San Diego, CA, USAより入手可能)の一部分である、ALIGNプログラム(ver
sion 2.0)に組み込まれる。ALIGNプログラムを用いてアミノ酸配列を比較する場合
には、PAM120重量残基表(weight residue table)、12のギャップ長ペナルティ
、及び4のギャップペナルティを使用することができる。

0047

特にことわりがない限り、配列同一性又は類似性の決定には、以下の指標を用いて、Ne
edleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48(3):443-453を使用したGAPVersion 10
が用いられる:ヌクレオチド配列の%同一性及び%類似性については、50のGAP Wei
ght及び3のLength Weight、並びにnwsgapdna.cmp採点マトリックスを用い
;アミノ酸配列の%同一性又は%類似性については8のGAP weight及び2のlength we
ight、並びにBLOSUM62採点プログラムを用いた。等価のプログラムもまた用いる
ことができる。「等価のプログラム」とは、GAP Version 10により生成した対応する
アライメントと比較した場合に、同一のヌクレオチド残基の一致及び同一の配列同一性の
パーセンテージを有するアライメントを生成する、対象となる任意の2つの配列のための
任意の配列比較プログラムを意味する。本発明は、変異体核酸分子もまた包含する。毒素
をコードするヌクレオチド配列の「変異体」は、本明細書において開示された毒素タンパ
ク質をコードするが、遺伝コードの縮重により保存的に異なる配列、並びに上記で議論
たように十分に同一な配列を含む。天然に生じるアレル変異体を、以下に概説する、ポリ
メラーゼ連鎖反応PCR)及びハイブリダイゼーション技術などの周知の分子生物学技
術を用いて、同定することができる。変異体ヌクレオチド配列はまた、例えば、以下で議
論するように、部位特異的突然変異を使用して生成されたが、本発明において開示された
毒素タンパク質をなおもコードする、合成的に誘導したヌクレオチド配列をも含む。本発
明に包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性であり、すなわちネイティブタン
パク質の所望の生物学的活性を持ち続けており、すなわち殺虫活性を保持している。「活
性を保持する」とは、ネイティブなタンパク質の殺虫活性の少なくとも約30%、少なく
とも約50%、少なくとも約70%、又は少なくとも約80%を有する変異体を意味する
。殺虫活性の測定方法は、当該分野において周知である。例えば、参照によりそれらすべ
ての全体を本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 248
0-2485;Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone et al. (1985) J.
of Economic Entomology 78:290-293;及び米国特許第5,743,477号を参照。

0048

当業者はさらに、本発明のヌクレオチド配列の変異により変化を導入することができ、
そのことによって、タンパク質の生物学的活性を変えることなく、毒素タンパク質をコー
ドするアミノ酸配列を変化させることができる。従って、本明細書に開示された対応する
ヌクレオチド配列中に、コードされるタンパク質に1つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠
損を導入するような1つ以上のヌクレオチド置換、付加、又は欠損を導入することにより
、単離した核酸分子の変異体を作出することができる。変異は、部位特異的突然変異生成
及びPCRを介した突然変異生成などの標準的な技術によって導入することができる。そ
のようなヌクレオチド配列変異体もまた、本発明に包含される。

0049

例えば、保存的アミノ酸置換を、1つ以上の予想される非必須アミノ酸残基に行っても
よい。「非必須」アミノ酸残基とは、生物学的活性を変化させることなく、毒素タンパク
質の野生型配列から変化させることの可能な残基であり、一方「必須」アミノ酸残基とは
、生物学的活性に必要とされる残基である。「保存的アミノ酸置換」とは、類似した側鎖
を有するアミノ酸残基でアミノ酸残基を置換することである。類似の側鎖を有するアミノ
酸残基のファミリーが、当該分野において明らかとなっている。これらのファミリーは、
塩基性側鎖(例えば、リジンアルギニンヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラ
ギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシンアスパラギングルタミ
ン、セリントレオニンチロシンシステイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バ
リンロイシンイソロイシンプロリンフェニルアラニンメチオニントリプト
ァン)、ベータ分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香性側鎖
(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を有するアミノ
酸を含む。

0050

一般に、デルタエンドトキシンは、5つの保存配列ドメイン、及び3つの保存構造ドメインを有する(例えば、de Maagd et al. (2001) TrendsGenetics 17:193-199を参照)。第一の保存構造ドメインは7つのアルファヘリックスからなり、膜挿入及び孔形成に関与する。ドメインIIは、ギリシャキー配置に配置された3つのベータシートを含み、そしてドメインIIIは、「ジェリーロール」形態2つの逆平行のベータシートをからなる(de Maagd et al. (2001)、前記)。ドメインII及びIIIは、レセプターの認識及びレセプターとの結合に関与し、そのため、毒素特異性の決定因子と考えられている。

0051

アミノ酸置換を、機能を保持する非保存領域中で行うことが可能である。通常、それら
の置換は、残基がタンパク質活性のために必須である、保存されたアミノ酸残基又は保存
されたモチーフ中のアミノ酸残基に対しては行われない。保存された及びタンパク質活性
に必須でありうる残基の例としては、例えば、本発明のアミノ酸配列及び公知の毒素配列
のアライメントに含まれるすべてのタンパク質の間で同一な残基が挙げられる。保存され
ているが保存的アミノ酸置換が可能で、なお活性を保持するであろう残基の例としては、
例えば、本発明のアミノ酸配列及び公知の毒素配列のアライメントに含まれるすべてのタ
ンパク質の間で保存的置換のみを有する残基が挙げられる。しかしながら、機能的変異体
は、保存された残基中にわずかの保存された又は非保存の変化を有することを当業者は理
解するだろう。

0052

あるいは、ヌクレオチド配列変異体を、飽和突然変異生成などによりコード配列の全て
又は一部分にわたってランダムに変異を導入することにより作出することができ、そして
活性を保持する変異体を同定するために、毒素活性を付与する能力について、得られた変
異体をスクリーニングすることができる。突然変異生成の後には、コードされたタンパク
質を組換え的に発現させることができ、そしてタンパク質の活性を標準的なアッセイ技術
を用いて決定することができる。

0053

PCR、ハイブリダイゼーションなどの方法を用いて、本発明の配列と実質的な同一性
を有する、対応する毒素配列を同定することができる。例えば、Sambrook and Russell (
2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, NY) and Innis, et al. (1990) PCR Protocols: A Guide to M
ethodsand Applications (Academic Press, NY)を参照。

0054

ハイブリダイゼーション法において、cDNA又はゲノムライブラリースクリーニン
グするために、毒素ヌクレオチド配列の全て又は一部分を用いることができる。それらc
DNA及びゲノムライブラリーの構築方法は、一般に当該分野において公知であり、また
、Sambrook and Russell, 2001、前記に開示されている。いわゆるハイブリダイゼーショ
ンプローブは、ゲノムDNA断片cDNA断片、RNA断片、又はその他のオリゴヌク
レオチドであってよく、及び32Pなどの検出可能な基又は、その他の放射性同位元素
蛍光化合物、酵素、もしくは酵素補因子などのその他の任意の検出可能マーカーを用いて
標識してもよい。ハイブリダイゼーション用のプローブを、本明細書において開示された
公知の毒素をコードするヌクレオチド配列に基づいて合成オリゴヌクレオチドを標識する
ことにより作出することができる。加えて、ヌクレオチド配列又はコードされたアミノ酸
配列における、保存されたヌクレオチド又はアミノ酸残基に基づいて設計された縮重プラ
イマーを用いることもできる。プローブは典型的には、本発明の毒素をコードするヌクレ
オチド配列若しくは断片、又はその変異体の少なくとも約12、少なくとも約25、少な
くとも約50、75、100、125、150、175、200、250、300、35
0、又は400の連続したヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズす
るヌクレオチド配列領域を含む。ハイブリダイゼーション用のプローブの調製方法は、一
般に当該分野において公知であり、また参照により本明細書に組み入れる、Sambrook and
Russell, 2001、前記に開示されている。

0055

例えば、本明細書において開示された全毒素配列、又は1つ以上のその一部分を、対応
する毒素様配列及びメッセンジャーRNAに特異的にハイブリダイズすることができるプ
ローブとして用いてもよい。様々な条件下で特異的なハイブリダイゼーションを達成する
ためには、それらのプローブは、ユニークな、そして好ましくは少なくとも約10ヌクレ
オチドの長さの又は少なくとも約20ヌクレオチドの長さの配列を含む。それらのプロー
ブを、選択した生物から対応する毒素配列をPCRによって増幅させるために用いても良
い。この技術を、所望の生物からのさらなるコード配列を単離するために、又は生物中の
コード配列の有無を検出するための診断アッセイとして用いてもよい。ハイブリダイゼー
ション技術は、プレーティングしたDNAライブラリーのハイブリダイゼーションスクリ
ニングを含む(プラーク又はコロニーのいずれか;例えば、Sambrook et al. (1989) M
olecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor, New York)を参照)。

0056

そのような配列のハイブリダイゼーションを、ストリンジェントな条件下で行ってもよ
い。「ストリンジェントな条件」又は「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件
」とは、その条件下においてプローブが、その他の配列よりも、その標的配列に検出可能
に、より強度にハイブリダイズする(例えば、少なくともバックグラウンドよりも2倍)
条件を意味する。ストリンジェント条件配列依存性であり、かつ、異なる環境において
は異なるだろう。ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄の条件のストリンジェンシー
制御することにより、プローブと100%相補的な標的配列を同定することができる(相
同性プロービング)。あるいは、より低い類似性を検出するために、配列中のいくつかの
不一致を許容するようにストリンジェンシー条件を調整することができる(異種プロービ
ング)。通常、プローブは長さにして約1000ヌクレオチド未満であり、好ましくは長
さにして500ヌクレオチド未満である。

0057

典型的には、ストリンジェントな条件とは、pH7.0〜8.3においては塩濃度が約
1.5M未満のNaイオン、典型的には約0.01〜1.0MのNaイオン濃度(又はその
他の塩)となるであろう条件であり、かつ、温度は、短いプローブ(例えば、10〜50
ヌクレオチド)については少なくとも約30℃、及び長いプローブ(例えば、50ヌクレ
オチドより長い)については少なくとも約60℃である。ストリンジェントな条件はまた
ホルムアミドなどの安定化剤の添加によっても達成され得る。低ストリンジェンシー条
件の例としては、30〜35%ホルムアミドの緩衝液溶液、1M NaCl、1% SDS
ドデシル硫酸ナトリウム)を用いた37℃でのハイブリダイゼーション、及び1X〜2
SSC(20X SSC=3.0M NaCl/0.3Mクエン酸三ナトリウム)中、5
0〜55℃での洗浄が挙げられる。中程度のストリンジェント条件の例としては、40〜
45%ホルムアミド、1.0M NaCl、1% SDS中、37℃でのハイブリダイゼー
ション、及び0.5X〜1X SSC中、55〜60℃での洗浄が挙げられる。高ストリ
ンジェンシー条件の例としては、50% ホルムアミド、1M NaCl、1% SDS中、
37℃でのハイブリダイゼーション、及び0.1X SSC中、60〜65℃での洗浄が
挙げられる。任意に、洗浄緩衝液は約0.1%〜約1% SDSを含んでもよい。ハイブ
リダイゼーションを行う時間は通常約24時間未満であり、一般的には約4〜約12時間
である。

0058

特異性は、典型的には、重要な因子最終洗浄溶液イオン強度及び温度である、ハイブリダイゼーション後の洗浄の関数である。DNA−DNAハイブリダイゼーションについては、TmはMeinkoth and Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284の式から概算することができる:Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)−0.61(%form)−500/L;式中Mは一価陽イオンモル濃度、%GCはそのDNA中のグアノシン及びシトシンヌクレオチドのパーセンテージ、%formはハイブリダイゼーション溶液中のホルムアミドのパーセンテージ、及びLは塩基対中のハイブリダイズした長さである。Tmは、(明確なイオン強度及びpHの下で)相補的な標的配列の50%が、完全に一致したプローブとハイブリダイズする温度である。Tmはそれぞれ1%の不一致につき、約1℃低下する;従って、Tm、ハイブリダイゼーション、及び/又は洗浄条件を、所望の同一性を有する配列がハイブリダイズするように、調整することができる。例えば、≧90%同一性を有する配列を探索する場合、Tmを10℃低下させることができる。通常、ストリンジェントな条件は、特異的配列及びその相補のための明確なイオン強度及びpHにおいての熱融点(thermal melting point、Tm)よりも約5℃低く設定される。しかしながら、厳しいストリンジェント条件は、熱融点(Tm)よりも1、2、3、又は4℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄を使用することができ;中程度にストリンジェントな条件は、熱融点(Tm)よりも6、7、8、9、又は10℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄を使用することができ;低いストリンジェント条件は、熱融点(Tm)よりも11、12、13、14、15、又は20℃低い温度でのハイブリダイゼーション及び/又は洗浄を使用することができる。式、ハイブリダイゼーション及び洗浄組成物、及び所望のTmを用いることで、ハイブリダイゼーション及び/又は洗浄溶液のストリンジェンシーにおける変動が本質的に記載されることを、当業者は理解するであろう。所望する不一致の度合いが45℃未満(水溶液)又は32℃未満(ホルムアミド溶液)のTmを生じる場合には、より高い温度が使用できるように、SSC濃度を上昇させることが好ましい。核酸のハイブリダイゼーションについての広範囲指針は、Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York); 及びAusubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York)を参照。Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)。

0059

単離したタンパク質及びその変異体並びにその断片
毒素タンパク質もまた本発明に包含される。「毒素タンパク質」とは、配列番号50〜
96に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。断片、生物学的に活性な一
部分、及びその変異体もまた提供され、及び本発明の方法を実施するために用いてもよい

0060

「断片」又は「生物学的に活性な一部分」とは、配列番号50〜96のいずれかに示されたアミノ酸配列を十分に同一であり、かつ、殺虫活性を示すアミノ酸配列を含むポリペプチド断片を含む。毒素タンパク質の生物学的に活性な一部分は、例えば、10、25、50、100又はそれ以上の長さのアミノ酸であるポリペプチドである場合がある。それらの生物学的に活性な一部分は、組み換え技術によって調製すること、及び殺虫活性を評価することができる。殺虫活性の測定方法は、当該分野において周知である。例えば、そのすべての全体を参照により本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485; Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-206;Marrone etal. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;及び米国特許第5,743,477号を参照。本明細書で使用する場合、断片は、配列番号50〜96の少なくとも8つの連続したアミノ酸を含む。本発明は、その他の断片を包含するが、例えば、約10、20、30、50、100、150、200、250、300、350、400、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、又は1300を超えるアミノ酸の、そのタンパク質中の任意の断片などである。

0061

「変異体」とは、配列番号50〜96いずれかのアミノ酸配列と少なくとも約60%、
65%、約70%、75%、約80%、85%、約90%、91%、92%、93%、9
4%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性を有するアミノ酸配列を有す
るタンパク質又はポリペプチドを意味する。変異体はまた、ストリンジェントな条件下で
、配列番号1〜47の核酸分子又はその相補鎖とハイブリダイズする核酸分子によってコ
ードされるポリペプチドをも含む。変異体は、突然変異生成により、アミノ酸配列が異な
るポリペプチドを含む。本発明によって包含される変異体タンパク質は、生物学的に活性
であり、すなわちネイティブなタンパク質における所望の生物学的活性をもち続けており
、すなわち殺虫活性を保持している。殺虫活性の測定方法は当該分野において周知である
。例えば、それらすべての全体を参照により本明細書に組み入れる、Czapla and Lang (1
990) J. Econ. Entomol. 83:2480-2485;Andrews et al. (1988) Biochem. J. 252:199-2
06; Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293;及び米国特許第5
,743,477号を参照。

0062

本発明のaxmi遺伝子などの細菌の遺伝子はしばしば、オープンリーディングフレ
ムの開始点近接した、複数のメチオニン開始コドンを有する。しばしば、1つ以上のこ
れら開始コドンからの翻訳の開始は、機能性タンパク質の生成を生じる場合がある。これ
らの開始コドンは、ATGコドンを含んでもよい。しかしながら、バチルス種などの細菌
は、開始コドンとしてGTGコドンもまた認識し、そしてGTGコドンから翻訳が開始さ
れたタンパク質は、最初のアミノ酸としてメチオニンを含む。さらに、細菌においてこれ
らコドンのどれが天然に使用されているかの予測がなされていることが少ない。従って、
別のメチオニンコドンのうちの1つを使用することもまた、殺虫活性をコードする毒素タ
ンパク質の生成を誘導し得ることを理解されたい。これらの毒素タンパク質は本発明に包
含され、及び本発明の方法の使用において用いられ得る。

0063

本発明のポリペプチド又は変異体に対する抗体、又はその断片もまた包含される。抗体
作成方法は、当該分野において周知である(例えば、Harlow and Lane (1988) Antibod
ies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY
;米国特許第4,196,265号を参照のこと)。

0064

変化させた又は改良した変異体
毒素のDNA配列を様々な方法により変化させてもよく、そしてこれらの変化が、本発
明の毒素によってコードされるアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質
をコードするDNA配列を生じてもよいことが認識される。このタンパク質は、最大約2
、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約3
0、約35、約40、約45、約50、約55、約60、約65、約70、約75、約8
0、約85、約90、約100、約105、約110、約115、約120、約125、
約130又はそれ以上までのアミノ酸置換、欠失又は挿入を含む、配列番号50〜96の
1つ以上のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、切断、及び、挿入を含む、様々な方法によっ
て変化させてもよい。

0065

そのような操作の方法は、当該分野において一般に公知である。例えば、毒素タンパク
質のアミノ酸配列変異体は、DNA中の突然変異により、調製することができる。これは
、突然変異生成及び/又は定方向進化における複数の形態のうちの1つによってもまた達
成され得る。いくつかの態様においては、アミノ酸配列中でコードされる変化は、そのタ
ンパク質の機能に実質的に影響を及ぼさない。それらの変異体は、所望の殺虫活性を有す
るだろう。しかしながら、本発明の組成物へのそれら技術の使用により、殺虫活性を付与
する毒素の能力を改善し得ることを理解されたい。例えば、XL−1 Red(Stratagen
e)などは、DNA複製に際して高頻度塩基の誤取り込みを示す宿主細胞において、毒
素を発現し得る。それらの株を増殖させた後に、毒素DNAを(例えば、プラスミドDN
Aの調製により、又はPCRによる増幅と得られたPCR断片をベクター中にクローニン
グすることにより)単離し、非変異原性株中で毒素突然変異体を培養し、そして殺虫活性
を有する突然変異した毒素遺伝子を、例えば、殺虫活性について試験するアッセイを行う
ことによって、同定することができる。通常、タンパク質を混合し、そして摂食アッセイ
に用いる。例えば、Marrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293を参
照。それらのアッセイは、植物を1種類以上の害虫に接触させ、そして植物の生存能力
び/又は害虫の致死率を決定することを含む場合がある。高められた有毒性を生じる突然
変異の例は、Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:775-806に見られ
る。

0066

あるいは、実質的に活性に影響を及ぼすことなく、数多くのタンパク質のタンパク質配
列のアミノ又はカルボキシ末端に変化を作出してもよい。これは、PCR増幅において用
いられるオリゴヌクレオチド中にアミノ酸をコードする配列が含まれるために、タンパク
質のコード配列を変化又は伸張させるPCR増幅を含む、PCRなどの、近年の分子法に
より導入された、挿入、欠失、又は、変化を含む場合がある。あるいは、付加されたタン
パク質配列は、タンパク質融合体を生成するために、当該分野において一般的に用いられ
るタンパク質の、全タンパク質コード配列を含む場合がある。それらの融合タンパク質
、(1)目的のタンパク質の発現を上昇させる(2)タンパク質精製、タンパク質検出、
又はその他の当該分野において公知の実験方法のいずれかを促進するための、結合ドメイ
ン、酵素活性、又はエピトープを導入する(3)グラム陰性細菌細胞周辺腔、又は真核
細胞の小胞体、後者はしばしばタンパク質のグリコシル化を生じる、などの細胞内小器官
への標的分泌又はタンパク質の翻訳、のためにしばしば用いられる。

0067

本発明のヌクレオチド及びアミノ酸配列の変異体は、DNAシャッフリングなどの突然
変異原性及び組換え的手法により誘導された配列をもまた包含する。それらの手法では、
所望の特性を有する新しい毒素タンパク質の作出のために、1つ以上の異なる毒素タンパ
ク質のコード領域を用いることができる。この方法においては、組換えポリヌクレオチド
ライブラリーが、十分な配列同一性を有する領域を含む、関連するポリヌクレオチド
列の集団から生成され、そして、インビトロ又はインビボにおいて相同的に再結合する可
能性がある。例えばこの方法を用いて、高められた殺虫活性などの、目的の改善された特
性を有するタンパク質をコードしている新しい遺伝子を得るために、本発明の毒素遺伝子
とその他の公知の毒素遺伝子との間で目的のドメインをコードするモチーフ配列を、シャ
フリングする場合がある。それらDNAシャッフリングの方法は、当該分野において公
知である。例えば、Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stem
mer (1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15:436-438;
Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291;及び米国
特許第5,605,793号及び第5,837,458号を参照。

0068

ドメインスワッピング又はシャッフリングは、変化させたデルタエンドトキシンタンパク質を生成する別の機序である。ドメインII及びIIIを、デルタエンドトキシンタンパク質間でスワッピングさせてもよく、その結果、改善した殺虫活性又は標的スペクトル有する雑種又はキメラ毒素が生じる。組換えタンパク質作出方法及びそれらの殺虫活性について試験する方法は、当該分野において周知である(例えば、Naimov et al. (2001) Appl. Environ. Microbiol. 67:5328-5330; de Maagd et al. (1996) Appl. Environ. Microbiol. 62:1537-1543; Ge et al. (1991) J. Biol. Chem. 266:17954-17958; Schnepf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265:20923-20930; Rang et al. 91999) Appl. Environ. Microbiol. 65:2918-2925を参照)。

0069

ベクター
本発明の毒素配列は、目的の植物中で発現させるための発現カセットにおいて提供され
得る。「植物発現カセット」とは、植物細胞においてオープンリーディングフレーム由来
のタンパク質の発現を誘導することができるDNA構築物を意味する。典型的には、これ
らは、プロモーター及びコード配列を含む。しばしば、それらの構築物は、3’非翻訳
域をもまた含む場合がある。それらの構築物は、葉緑体(又はその他の色素体)、小胞体
、又はゴルジ装置などの特定の細胞内構造への、翻訳と同時の又は翻訳後の、ペプチドの
輸送を促進するための「シグナル配列」又は「リーダー配列」を含んでもよい。

0070

「シグナル配列」とは、細胞膜を通じた、ペプチドの、翻訳と同時の又は翻訳後の輸送
を誘導することが公知である、又はそう考えられている配列を意味する。真核生物におい
ては、これは典型的には、ゴルジ装置への分泌を含み、その結果多少のグリコシル化を伴
う。「リーダー配列」とは、翻訳されると、翻訳と同時にペプチド鎖の細胞内小器官への
輸送を引き起こすのに十分なアミノ酸配列を生じる、いずれかの配列を意味する。従って
、これは、小胞体への移行液胞、葉緑体を含む色素体、ミトコンドリアなどへの移行に
よる輸送及び/又はグリコシル化を標的としているリーダー配列を含む。

0071

「植物形質転換ベクター」とは、植物細胞の効率的な形質転換に必要なDNA分子を意
味する。それらの分子は、1つ以上の植物発現カセットを含んでいてもよく、そして1つ
以上の「ベクター」DNA分子を構成していてもよい。例えば、バイナリーベクターは、
植物細胞の形質転換のための、すべての必須なシス及びトランス作用機能をコードするた
めの、2つの非連続なDNAベクターを使用する植物形質転換ベクターである(Hellens
and Mullineaux (2000) Trendsin Plant Science 5:446-451)。「ベクター」は、異な
る宿主細胞間を移動させるために設計された核酸構築物を意味する。「発現ベクター」は
、他の細胞において、異種DNA配列又は断片を組み入れる、組み込む、及び発現させる
能力を有するベクターを意味する。カセットは、本発明の配列に作動可能に連結した、5
’及び3’制御配列を含む場合がある。「作動可能に連結した」とは、そのプロモーター
配列が第二の配列に対応するDNA配列の転写を開始及び媒介する、プロモーターと第二
の配列との間の機能的な結合を意味する。通常、作動可能に連結したとは、結合した核酸
配列が連続していること、及び、2つのコード領域を結合させる必要がある場合には、結
合した核酸配列が連続し、かつ、同じリーディングフレーム中にあることを意味する。加
えて、カセットは、生物に共に形質転換される、少なくとも1つのさらなる遺伝子を含ん
でいてもよい。あるいは、さらなる遺伝子を、複数の発現カセットにおいて提供すること
ができる。

0072

「プロモーター」は、下流のコード配列の転写を指令するように機能する核酸配列を意
味する。プロモーターは、その他の転写及び翻訳制御核酸配列(「制御配列」とも称され
る)と一緒に、目的のDNA配列の発現に必須である。

0073

そのような発現カセットは、毒素を制御領域の転写制御下になるように挿入するための
、複数の制限部位と共に提供される。

0074

5’〜3’の方向の転写において発現カセットは、植物において機能する、転写及び翻
開始領域(すなわち、プロモーター)、本発明のDNA配列、並びに翻訳及び転写終止
領域(すなわち、終止領域)を含む場合がある。プロモーターは、宿主植物及び/又は本
発明のDNA配列に対して、ネイティブであっても若しくは類似であってもよく、又は外
来若しくは異種であってもよい。加えて、プロモーターは、天然の配列であっても又は合
成配列であってもよい。プロモーターが宿主植物に対して「ネイティブ」又は「同種」で
ある場合、そのプロモーターが、プロモーターを導入する天然の植物においてみられるこ
とを意味する。プロモーターが、本発明のDNA配列に対して「外因性外来」又は「異種
」である場合、本発明の作動可能に連結したDNA配列に対して、プロモーターが、ネイ
ティブではない又は天然に生じるプロモーターではないことを意味する。

0075

終止領域は、転写開始領域に対してネイティブであってもよく、目的の作動可能に連結
したDNA配列に対してネイティブであってもよく、宿主植物に対して天然であってもよ
く、又は別の資源(すなわち、プロモーター、目的のDNA配列、宿主植物、又はそのい
ずれの組み合わせにとって、外因性外来又は異種)に由来してもよい。オクトピンシンタ
ーゼ及びノパリンシンターゼ終止領域などの便利な終止領域は、A. tumefaciensのTi−
プラスミドから入手可能である。Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-1
44; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-14
9; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-
158; Ballas et al. (1989) Nucleic AcidsRes. 17:7891-7903; 及び Joshi et al. (19
87) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639もまた参照。

0076

適切な場合、形質転換した宿主細胞中での発現を上昇させるように、遺伝子を最適化し
てもよい。すなわち、発現の改善のために、宿主細胞に好ましいコドンを用いて遺伝子を
合成することができ、又は宿主に好ましいコドン使用頻度でのコドンを用いて遺伝子を合
成してもよい。通常、遺伝子のGC含量が上昇する。宿主に好ましいコドン使用頻度の議
論については、例えば、Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11を参照。当
該分野においては、植物に好ましい遺伝子を合成する方法が使用可能である。例えば、参
照により本明細書に組み入れる、米国特許第5,380,831号及び第5,436,3
91号、及び、Murray et al. (1989) Nucleic AcidsRes. 17:477-498を参照。

0077

1つの実施形態において、毒素が、葉緑体で発現するためにターゲティングされる。この方法において、毒素が葉緑体中に直接挿入されない場合には、発現カセットが、毒素を葉緑体に誘導する輸送ペプチドをコードする核酸をさらに含む場合がある。それら輸送ペプチドは当該分野において公知である。例えば、Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; 及び Shah et al. (1986) Science 233:478-481を参照。

0078

葉緑体を標的とする毒素遺伝子は、植物の核と該器官との間のコドン使用頻度を考慮し
て、葉緑体において発現させるために最適化してもよい。この方法において、葉緑体に好
ましいコドンを用いて目的の核酸を合成してもよい。例えば、参照により本明細書に組み
入れる、米国特許第5,380,831号を参照。

0079

植物形質転換
本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を植物に導入する工程を含む。「導入する」とは
、植物細胞の内部に構築物が侵入する方法において、ヌクレオチド構築物を植物に与える
ことを意味する。本発明の方法は、ヌクレオチド構築物を用いる植物に導入する特定の方
法の使用を必要とせず、植物の少なくとも1つの細胞にヌクレオチド構築物が侵入するこ
とだけが必要とされる。ヌクレオチド構築物を植物に導入する方法は、当該分野において
公知であり、安定な形質転換方法一過性の形質転換方法、及びウイルスを介した方法を
含むが、これらに限定されない。

0080

「植物」とは、植物全体、植物器官(例えば、葉、、根など)、種子、植物細胞、
余子(むかご)、及びその後代を意味する。植物細胞は、分化した、又は未分化の細胞
である場合がある(例えばカルス懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師
部細胞、花粉)。

0081

「トランスジェニック植物」又は「形質転換した植物」又は「安定に形質転換した」植
物又は細胞又は組織は、植物細胞中に組み入れられた又は組み込まれた外因性の核酸配列
又はDNA断片を有する植物を意味する。これらの核酸配列は、外因性の又は非形質転換
植物細胞中に存在しない核酸配列、並びに内因性の、又は非形質転換植物細胞中に存在す
る核酸配列を含む。通常「異種」は、細胞又はそれらが存在する天然のゲノムの一部に対
して内因性でない、そして、感染、形質転換、マイクロインジェクションエレクトロ
レーション、マクロプロジェクションなどにより、細胞に付加された核酸配列を意味する

0082

本発明のトランスジェニック植物は、本明細書において開示された1つ以上の殺虫性配
列を発現する。様々な実施形態において、トランスジェニック植物は、さらに、1つ以上
のさらなる昆虫抵抗性遺伝子、例えば、1種類以上の鞘翅目、鱗翅目、異翅類、又は線虫
害虫を制御するさらなる遺伝子を含む。トランスジェニック植物が、目的の農業上の特性
を付与するいずれの遺伝子を含んでもよいことを、当業者は理解するであろう。

0083

植物細胞の形質転換は、当該分野において公知の複数の技術のうちの1つにより達成す
ることができる。植物細胞における発現を得る又は増強するために、本発明の毒素遺伝子
改変してもよい。典型的には、それらのタンパク質を発現する構築物は、その遺伝子の
転写を駆動するプロモーター、並びに転写の終止及びポリアデニル化を可能にする3’非
翻訳領域を含む。それら構築物の構成は、当該分野において公知である。いくつかの例に
おいてそれは、生じるペプチドが分泌されるように、さもなければ、植物細胞中で標的と
されるように、遺伝子を処理するために有用な場合がある。例えば、ペプチドの小胞体へ
の輸送を促進するためのシグナルペプチドを含むように、遺伝子を改変することができる
イントロンmRNAプロセシングが発現に必要とされるため、植物発現がイントロン
を含むように処理することもまた好ましい。

0084

典型的には、この「植物発現カセット」を「植物形質転換ベクター」中に挿入する。こ
の植物形質転換ベクターは、植物形質転換を達成するために必要とされる、1つ以上のD
NAベクターを含んでいてもよい。例えば、1つ以上の連続したDNAセグメントを含む
植物形質転換ベクターを使用することが、当該分野における一般的な方法である。当該分
野においては、これらのベクターはしばしは、「バイナリーベクター」と称される。Agro
bacteriumを介した形質転換においては、バイナリーベクター並びにヘルパープラスミド
を有するベクターが最も頻繁に用いられ、そこでは効率的な形質転換を達成するために必
要とされるDNAセグメントの大きさ及び複雑性が非常に大きく、かつ、機能を別個のD
NA分子上に分けるのに有利である。典型的には、バイナリーベクターは、T−DNA輸
送に必要なシス作用配列(レフトボーダー及びライトボーダーなど)、植物細胞中で発現
できるように改変された選択マーカー、及び「目的の遺伝子」(トランスジェニック植物
の作出が望まれる植物細胞中で発現できるように改変された遺伝子)を含むプラスミドベ
クターを含む。このプラスミドベクター上には、細菌の複製に必要とされる配列もまた存
在する。シス作用配列は、植物細胞への効率的な輸送、及びそこにおける発現を可能にす
る様式で配置される。例えば、選択マーカー遺伝子及び毒素は、レフト及びライトボーダ
ーの間に位置する。しばしば、第二のプラスミドベクターが、Agrobacteriumから植物細
胞へのT−DNA輸送を仲介する、トランス作用因子を含む。このプラスミドはしばしば
、当該分野において理解されるような、Agrobacteriumによる植物細胞への感染、並びに
ボーダー配列における開裂によるDNAの輸送、及びvirを介したDNAの輸送を可能
にする、病原性機能(Vir遺伝子)を含む(Hellens and Mullineaux (2000) Trendsi
n Plant Science 5:446-451)。複数の型のAgrobacterium株(例えばLBA4404、G
V3101、EHA101、EHA105、など)を、植物の形質転換に用いることがで
きる。マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション
ポリエチレングリコールなどによる、その他の方法を用いた植物の形質転換においては
、第二のプラスミドベクターは必須ではない。

0085

一般的に、植物の形質転換方法は、異種DNAを標的植物細胞(例えば未成熟又は成熟
胚、懸濁培養、未分化細胞、プロトプラストなど)中に移す工程と、その後、非形質転換
細胞集団の群から形質転換された植物細胞を回収するために、最大閾値レベルの適した選
抜(選択マーカー遺伝子による)を適用する工程を含む。典型的には、移植片を、新しく
準備した同じ培地に移し、慣習的に培養する。その後、最大閾値レベルの選択試薬を含む
再生培地静置し、形質転換した細胞を茎に分化させる。その茎を次に、発根した茎又は
植物体を回収するために選択発根培地に移す。トランスジェニック植物体はその後、成熟
した植物に生育し、そして稔性の種子を生産する(例えば、Hiei et al. (1994) The Pla
nt Journal 6:271-282; Ishida et al. (1996) Nature Biotechnology 14:745-750)。典
型的には、移植片を、新しく準備した同じ培地に移し、慣習的に培養する。この技術の一
般的な記載及びトランスジェニック植物の作出方法は、Ayres and Park (1994) Critical
Reviews in Plant Science 13:219-239 及び Bommineni and Jauhar (1997) Maydica 42
:107-120において見られる。形質転換した材料は多くの細胞を含むため、形質転換された
及び非形質転換の両方の細胞が、対象となる標的カルス若しくは組織又は細胞群のいずれ
の一部分にも存在する。非形質転換細胞死滅させ、そして形質転換細胞を増殖させるこ
とを可能にする能力が、形質転換植物培養を生じる。しばしば非形質転換細胞を除去する
能力は、形質転換植物細胞の迅速な回収及びトランスジェニック植物の作出の成功への制
限となる。

0086

形質転換プロトコール並びにヌクレオチド配列を植物に導入するプロトコールは、形質
転換される標的植物又は植物細胞の型、すなわち単子葉又は双子葉かにより、多様になり
得る。トランスジェニック植物の作出は、マイクロインジェクション、エレクトロポレー
ション、遺伝子直接導入、Agrobacteriumによる異種DNAの植物細胞中への導入(Agrob
acteriumを介した形質転換)、粒子接着させた異種外因性DNAを用いた植物細胞のボ
バードメント、バリスティック粒子加速(ballistic particle acceleration)、エア
ゾルビーム(aerosol beam)形質転換(米国特許出願第20010026941号;米
国特許第4,945,050号;国際公開第91/00915号;米国特許出願第200
2015066号)、Lec1形質転換、及びDNAを移すための、その他の様々な粒子
を介さない方法を含むが、これらに限定されない、複数の方法のうちの1つによって行わ
れてもよい。

0087

葉緑体の形質転換方法は、当該分野において公知である。例えば、Svab et al. (1990)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 90:913-917; Svab and Maliga (1993)EMBO J. 12:601-606を参照。この方
法は、選択マーカーを含み、かつ、同種組換えを介して色素体ゲノムにDNAを標的とす
るDNAのパーティクルガンによる送達による。加えて、色素体の形質転換は、核にコー
ドされ、かつ、色素体を標的としたRNAポリメラーゼを組織優先的に発現させることに
より、色素体が有する発現していない導入遺伝子トランス活性化することによって達成
することができる。このような系は、McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 91:7301-7305において報告された。

0088

異種外因性DNAを植物細胞へ組み込んだ後、次に、非形質転換細胞を死滅させるため
に培地中に最大閾値レベルの適した選抜を適用し、そして、この選択処理によっても生存
した形質転換したと推測される細胞を、定期的に新しい培地に移すことにより、分離及び
増殖させる。継代及び適した選択を続けることにより、プラスミドベクターによって形質
転換された細胞を同定し、増殖させる。その後、トランスジェニック植物のゲノム中に組
み込まれた目的の異種遺伝子の有無を確認するために、分子及び生化学的手法を用いるこ
とができる。

0089

標準的な方法に従い、形質転換した細胞を植物中で生育させてもよい。例えば、McCorm
ick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84を参照。次にこれらの植物を生育させ、
そして同じ形質転換株又は異なる株のいずれかを用いて受粉させる。得られた雑種は、同
定した所望の表現型特徴の構成的発現を有する。所望の表現型特徴の発現が安定して維持
され、かつ、遺伝的に引き継がれたかを確認するために2世代以上生育させてもよく、そ
の後、所望の表現型特徴の発現が達成されたかを確認するために、種子を収穫してもよい
。この方法において本発明は、本発明のヌクレオチド構築物、例えば、安定してそれらの
ゲノムに組み入れられた本発明の発現カセット、を有する形質転換した種子を提供する(
トランスジェニック種子」とも称される)。

0090

植物形質転換の評価
異種外因性DNAを植物細胞へ導入した後、植物ゲノムへの異種遺伝子の形質転換又は
組換えを、核酸、タンパク質及び、組み換えた遺伝子に関連する代謝産物の解析などの様
々な方法より確認する。

0091

PCR解析は、植物を土壌移植する前の早い段階において、形質転換細胞、組織、又
は茎を、組み入れた遺伝子の有無についてスクリーニングする迅速な方法である(Sambro
ok and Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。PCRは、目的の遺伝子又はバック
ラウンドのAgrobacteriumベクターなどに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを用い
て行われる。

0092

植物の形質転換を、ゲノムDNAのサザンブロット解析によって確認してもよい(Samb
rook and Russell, 2001、前記)。通常、トータルDNAを形質転換体から抽出し、適切
制限酵素消化し、アガロースゲル中で分画し、そしてニトロセルロース又はナイロン
膜上に移す。膜又は「ブロット」を次に、標準的な技術に従って、例えば、放射性標識
た32P標的DNA断片を用いてプロービングし、導入した遺伝子の植物ゲノム中への組
み込みを確認する(Sambrook and Russell, 2001、前記)。

0093

ノーザンブロット解析においては、当該分野において慣習的に用いられる標準的な方法
に従って、RNAを形質転換体の特定の組織から単離し、ホルムアルデヒドゲル中で分画
し、そしてナイロンフィルター上にブロッティングする(Sambrook and Russell, 2001、
前記)。毒素によりコードされるRNAの発現を次に、当該分野において公知の方法を用
いて、このフィルターを毒素に由来する放射性プローブとハイブリダイゼーションするこ
とによって試験する(Sambrook and Russell, 2001、前記)。

0094

毒素タンパク質上に存在する1つ以上のエピトープに結合する抗体を用いて、標準的な
手法により、毒素遺伝子によってコードされるタンパク質の有無を確認するために、トラ
スジニック植物についてウェスタンブロット生化学的アッセイなどを行ってもよい
(Sambrook and Russell, 2001、前記)。

0095

植物における殺虫活性
本発明の別の態様において、殺虫活性を有する毒素を発現しているトランスジェニック
植物を作出してもよい。一例として、トランスジェニック植物を作出するためには上述し
た方法を用いることができるが、トランスジェニック植物細胞の作出方法は、本発明にと
って重要ではない。Agrobacteriumを介した形質転換、微粒子銃を用いた形質転換、及び
粒子を介さない方法などの、当該分野において公知の又は記載された方法を実験者の判断
で用いてもよい。毒素を発現している植物は、当該分野において記載された一般的な方法
、例えば、カルスの形質転換、トランスジェニックカルスの選抜、及びそれら形質転換化
するからの稔性のある植物の再生により、単離され得る。それらの過程においては、植物
細胞におけるその発現が形質転換細胞の同定する又は選別する能力を付与する限り、いず
れの遺伝子を選択マーカーとして使用してもよい。

0096

クロラムフェニコールアミノグリコシドG418、ハイグロマイシンなどに対する抵
抗性などの、植物細胞に使用するための数多くのマーカーが開発された。葉緑体代謝に含
まれる産物をコードするその他の遺伝子もまた、選択マーカーとして使用され得る。例え
ば、グリホサートブロモキシニル、又はイミダゾリノンなどの、植物除草剤への抵抗性
を提供する遺伝子は特定の使用を見出す可能性がある。それらの遺伝子は報告されている
(Stalker et al. (1985) J. Biol. Chem. 263:6310-6314(ブロモキシニル抵抗性ニトリ
ルラーゼ遺伝子);及びSathasivan et al. (1990) Nucl. AcidsRes. 18:2188(AH
Sイミダゾリノン抵抗性遺伝子)。加えて、本明細書において開示された遺伝子は、細菌
の又は植物細胞の形質転換を評価するためのマーカーとして有用である。植物、植物器官
(例えば、葉、茎、根など)、種子、植物細胞、零余子(むかご)、胚又はその後代にお
ける、導入遺伝子の有無の検出方法は当該分野において周知である。1つの実施形態にお
いて、導入遺伝子の有無は、殺虫活性について試験することにより、検出される。

0097

毒素を発現している稔性植物を、殺虫活性について試験し、そして、最適な活性を示さ
れている植物をその後の育種のために選択してもよい。害虫活性ついてアッセイするため
の方法は当該分野において使用可能である。通常、タンパク質は混合され、摂食アッセイ
において用いられる。例えばMarrone et al. (1985) J. of Economic Entomology 78:290
-293を参照。

0098

単子葉及び双子葉を含むがこれらに限定されない、いずれの種の植物形質転換において
も本発明を用いることができる。目的の植物の例としては、穀草トウモロコシ)、ソル
ガムコムギヒマワリトマトアブラナコショウジャガイモワタ、イネ、ダイ
ズ、テンサイサトウキビタバコオオムギ、及びナタネアブラナ属アルファルフ
ァ、ライムギキビベニバナ落花生サツマイモキャッサバコーヒーココヤシ
パイナップル柑橘樹木ココアチャバナナアボカドイチジクグアバマン
ゴー、オリーブパパイヤカシューマカダミア、アーモンドエンバク野菜、装飾
用植物、及び針葉樹が挙げられるがこれらに限定されない。

0099

野菜には、トマト、レタスインゲンライマメエンドウ、並びにキュウリカン
ロープ、及びマスクメロンなどのキュウリ属のメンバーが含まれるがこれらに限定されな
い。装飾用植物には、アザレアアジサイハイビスカスバラチューリップ、スイセ
ン、ペチュニアカーネーションポインセチア、及びキクが含まれるがこれらに限定さ
れない。好ましくは、本発明の植物は、穀物(例えば、トウモロコシ、ソルガム、コムギ
、ヒマワリ、トマト、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、ワタ、イネ、ダイズ、テンサイ
、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど)である。

0100

害虫制御における使用
農薬制御又は殺虫性薬剤としてのその他の生物の改変における、本発明のヌクレオチド
配列を含む株又はその変異体の一般的な使用方法は、当該分野において公知である。例え
ば米国特許第5,039,523号及び欧州特許第0480762A2号を参照。

0101

本発明のヌクレオチド配列を含むBacillus株、若しくはその変異体、又は殺虫性遺伝子
及びタンパク質を含むように遺伝的に変化させた微生物を、農業穀物及び産物を害虫から
保護するために使用することができる。本発明の1つの態様において、細胞を標的害虫
環境に適用した場合に細胞中で生産された毒素の活性を延長する試薬を用いて、全部、す
なわち溶解していない、毒素(農薬)を生産する生物の細胞を処理する。

0102

あるいは、毒素遺伝子を細胞宿主中に導入することにより農薬を生産する。毒素遺伝子
の発現は、農薬の細胞内因性産及び維持を、直接又は間接的にもたらす。本発明の1つの
態様においては、これらの細胞を、細胞を標的害虫の環境に適用した場合に細胞中で生産
された毒素の活性を延長する条件下でその後処理する。得られた産物は、毒素の有毒性を
保持する。その後、標的害虫を宿している環境、例えば、土壌、水、及び植物の枝葉に適
用するために、これらを天然に包含する農薬を、標準的な技術に従って調製することがで
きる。例えば欧州特許出願第0192319号、及びそこに引用された参考文献を参照。
あるいは、得られた材料を農薬として適用することを可能にするなどの、本発明の遺伝子
を発現している細胞を調製してもよい。

0103

殺虫性組成物
本発明の活性成分は、通常、組成物の形態において適用され、そして、同時に又は連続
して、その他の化合物共に農地又は処理する植物に適用することができる。これらの化合
物は、肥料、除草剤、凍結防止剤界面活性剤洗浄剤、殺虫性石鹸ドーマントオイル
ポリマー、及び/又は、製剤の単回投与の後に、標的地域での長期投与を可能にする、
持続放出型又は生分解性担体製剤である可能性がある。それらはまた、選択的除草剤、化
学的な殺虫剤、殺ウイルス剤殺菌薬、殺アメーバ剤、農薬、抗真菌剤殺菌剤殺線虫
剤、軟体動物駆除剤又は複数のこれら調整物の混合物となる可能性があり、所望ならば、
さらに、製剤分野において習慣的に用いられる農業上許容可能な担体、界面活性剤又は適
用を促進するアジュバントと一緒に用いられる。好適な担体及びアジュバントは、固体
あっても液体であってもよく、かつ、製剤技術において通常用いられる物質、例えば天然
の又は再生した鉱物溶媒分散剤湿潤剤粘着剤結合剤又は肥料に相当する。同様
に、製剤を食用の「」として調製してもよく、又は殺虫性製剤の標的害虫が、摂食又は
摂取することを可能にする、害虫「わな」の様式としてもよい。

0104

本発明の細菌株によって生産された少なくとも一つの殺虫性タンパク質を含む、本発明
の活性成分又は本発明の農薬組成物適用方法は、葉への適用、種子コーティング及び土
壌への適用を含む。適用の数、及び適用率は、対応する害虫による感染の強度に依存する

0105

組成物は、粉末塵埃錠剤顆粒スプレー乳濁液コロイド、溶液などとして処
方することができ、及び乾燥、凍結乾燥均質化、抽出、ろ過、遠心分離、沈降、又はポ
リペプチドを含む培養細胞濃縮などの標準的な手段によって調製することができる。少
なくとも1つのそれら殺虫性ポリペプチドを含むすべてのそれら組成物においては、ポリ
ペプチドは、約1%〜約99重量%の濃度で存在し得る。

0106

本発明の方法により、指定された地域における鱗翅目、双翅目、鞘翅目の、又は線虫害
虫を殺す、若しくはその数を減少させることができ、又は感染しやすい害虫による感染を
防ぐために、環境地域に予防的に適用することができる。好ましくは、害虫が殺虫的効果
量のポリペプチドを摂取、又はそれと接触する。「殺虫的効果量」とは、少なくとも1つ
の害虫の死、又は害虫増殖、摂食、又は通常の生理的な発達の顕著な減少をもたらす農薬
の量を意味する。この量は、例えば、制御する特定の標的害虫、特定の環境、場所、植物
、穀物、又は処理する農業用地環境条件、及び方法、率、濃度、安定性、及び殺虫効果
のあるポリペプチド組成物の適用量などの因子によって、多様になり得る。製剤はまた、
気候条件、環境の考慮、及び/又は適用の頻度及び/又は害虫感染の強度より、多様にな
り得る。

0107

記載される農薬組成物を、細菌細胞、結晶及び/又は胞子懸濁液、又は単離したタンパ
ク質成分のいずれかを所望の農業上許容可能な担体と共に配合することにより、製造して
もよい。投与に先だち、組成物を、凍結乾燥、フリーズドライ、乾燥、又は水性担体、培
地若しくは好適な希釈剤生理食塩水若しくはその他の緩衝液など)中、などの適切な手
段中において調製してもよい。調製した組成物を、塵埃若しくは顆粒材料、又は油中の懸
濁液(植物若しくは鉱物)、又は水若しくは油/水乳濁液、又は可溶性粉末、又は農業上
の適用において好適な任意のその他担体材料との組み合わせ、の様式をとってもよい。好
適な農業上の担体は、固体又は液体であってよく、かつ、当該分野において周知である。
「農業上許容可能な担体」という用語は、農薬製剤技術において通常用いられる、アジ
バント、不活性化合物、分散剤、界面活性剤、粘着剤、結合剤など全てを含み;これらは
農薬製剤分野の当業者において周知である。製剤を、1種類以上の固体又は液体のアジュ
バントと混合してもよく、そして例えば、標準的な製剤技術に用いる好適なアジュバント
と共に殺虫性組成物を均質に混合する、調合する及び/又は粉砕するなどの様々な手段に
より調製することができる。好適な製剤及び適用方法は、参照により本明細書に組み入れ
る、米国特許第6,468,523号に記載される。

0108

あるいは、毒素遺伝子をシュードモナス(Pseudomonas)種中にクローニングして、タ
ンパク質を発現させ、そしてそれらを細菌の細胞壁中にマイクロカプセル化させてもよい
。マイクロカプセル化された毒素を、スプレー散布において単独で、又はその他の毒素を
含むBacillus thuringiensisを用いた殺虫剤と順番に用いてもよい。

0109

植物を、1つ以上の除草剤、殺虫剤、又は抗真菌剤を含む、1つ以上の化学組成物を用
いて処理することもできる。化学組成物の例としては、:果実/野菜除草剤:アトラジン
(Atrazine)、ブロマシル(Bromacil)、ジウロン(Diuron)、グリホサート、リヌロン
(Linuron)、メトリブジン(Metribuzin)、シマジン(Simazine)、トリフルラリン(T
rifluralin)、フルアホップ(Fluazifop)、グルホシネート(Glufosinate)、ハロ
フロンゴワン(HalosulfuronGowan)、パラコート(Paraquat)、プロピザミド(Propy
zamide)、セトキシジム(Sethoxydim)、ブタフェナシル(Butafenacil)、ハロスル
ロン(Halosulfuron)インジフラム(Indaziflam);果実/野菜殺虫剤:アルジカルブ
(Aldicarb)、Bacillus thuringiensis、カルバリル(Carbaryl)、カルボフラン(Carb
ofuran)、クロルピリホス(Chlorpyrifos)、シペルメトリン(Cypermethrin)、デルタ
メトリン(Deltamethrin)、ダイアジノン(Diazinon)、マラチオン(Malathion)、ア
バメクチン(Abamectin)、シフルトリン/ベータ−シフルトリン(Cyfluthrin/beta-cyf
luthrin)、エスフェンバレレート(Esfenvalerate)、ラムダシハロトリン(Lambda-c
yhalothrin)、アセキシル(Acequinocyl)、ビフェナゼト(Bifenazate)、メトキシ
フェノジド(Methoxyfenozide)、ノバルロン(Novaluron)、クロマフェノジド(Chroma
fenozide)、チアクロプリド(Thiacloprid)、ジノテフラン(Dinotefuran)、フルアク
ピリム(Fluacrypyrim)、トルフェンピラド(Tolfenpyrad)、クロチアニジン(Cloth
ianidin)、スピロジクロフェン(Spirodiclofen)、ガンマ−シハロトリン、スピロメシ
フェン(Spiromesifen)、スピノサド(Spinosad)、リナキシピル(Rynaxypyr)、シア
ジピル(Cyazypyr)、スピネトラム(Spinoteram)、トリフルムロン(Triflumuron)、
スピロテトラマト(Spirotetramat)、イミダクロプリド(Imidacloprid)、フルベン
アミド(Flubendiamide)、チオジカルブ(Thiodicarb)、メタフルミゾン(Metaflumizo
ne)、スルホサフロール(Sulfoxaflor)、シフルメトフェン(Cyflumetofen)、シエ
ノメトフェン(Cyanopyrafen)、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム
スピトラム(Spinotoram)、チオジカルブ、フロニカミド(Flonicamid)、メチオカル
ブ(Methiocarb)、エマメクチンベンゾエート(Emamectin-benzoate)、インドキサカ
ルブ(Indoxacarb)、ホスチアゼート(Fozthiazate)、フェナミホス(Fenamiphos)、
カズサホス(Cadusaphos)、ピリプロキシフェン(Pyriproxifen)、酸化フェンブタスズ
(Fenbutatin-oxid)、ヘキシチアゾクス(Hexthiazox)、メソミル(Methomyl)、4−
[[(6−クロロピリジン−3−イルメチル](2,2−ジフルオレチル)アミノ]フ
ラン−2(5H)−オン;果実/野菜抗真菌剤:カルベンダジム(Carbendazim)、クロ
ロタロニル(Chlorothalonil)、EBDC、スルホール(Sulphur)、チオファネート−
メチル(Thiophanate-methyl)、アゾキシストロビン(Azoxystrobin)、シモキサニル
Cymoxanil)、フルアジナム(Fluazinam)、ホセチル(Fosetyl)、イプロジオン(Iprod
ione)、クレソキシム−メチル(Kresoxim-methyl)、メタラキシルメフェノキサム(M
etalaxyl/mefenoxam)、トリフロキシストロビン(Trifloxystrobin)、エタボキサム(E
thaboxam)、イプロバリカルブ(Iprovalicarb)、トリフロキシストロビン、フェンヘキ
サミド(Fenhexamid)、フマル酸オキシコナゾール(Oxpoconazolefumarate)、シアゾ
ファミド(Cyazofamid)、フェンアミドン(Fenamidone)、ゾキサミド(Zoxamide)、ピ
クオキシストロビン(Picoxystrobin)、ピラクロストロビン(Pyraclostrobin)、シフ
ルフェナミド(Cyflufenamid)、ボスカリド(Boscalid);穀類除草剤:イソプロチュ
ン(Isoproturon)、ブロモキシニル、イオキシニル(Ioxynil)、フェノキシ類、クロル
スルフロン(Chlorsulfuron)、クロジナホップ(Clodinafop)、ジクロホップ(Diclofo
p)、ジフルフェニカン(Diflufenican)、フェノキサプロップ(Fenoxaprop)、フロラ
スラム(Florasulam)、フルロキシピル(Fluroxypyr)、メツルフロン(Metsulfuron)
トリアスルフロン(Triasulfuron)、フルカルバゾン(Flucarbazone)、ヨードスルフ
ロン(Iodosulfuron)、プロポキシカルバゾン(Propoxycarbazone)、ピコリナフェン
Picolinafen)、メソスルフロン(Mesosulfuron)、ベフルフタミド(Beflubutamid)、
ピノキサデン(Pinoxaden)、アミドフスルフロン(Amidosulfuron)、チフェンスフロ
ン(Thifensulfuron)、トリベヌロン(Tribenuron)、フルピルスルフロン(Flupyrsulf
uron)、スルホスルフロン(Sulfosulfuron)、ピラスルホトール(Pyrasulfotole)、ピ
ロックススラム(Pyroxsulam)、フルフェナセット(Flufenacet)、トラルコキシジム
Tralkoxydim)、ピロキサスルホン(Pyroxasulfon);穀類抗真菌剤:カルベンダジム、
クロロタロニル、アゾキシストロビン、シプロコナゾール(Cyproconazole)、シプロジ
ニル(Cyprodinil)、フェンプロピモルフ(Fenpropimorph)、エポキシコナゾール(Epo
xiconazole)、クレソキシム−メチル、キノキシフェン(Quinoxyfen)、テブコナゾール
(Tebuconazole)、トリフロキシストロビン、シメコナゾール(Simeconazole)、ピクオ
シストロビン、ピラクロストロビン、ジモキシストラビン(Dimoxystrobin)、プロチ
オコナゾール(Prothioconazole)、フロキサストロビン(Fluoxastrobin);穀類殺虫剤
ジメトエート(Dimethoate)、ラムダ−シハロトリン(Lambda-cyhalthrin)、デルタ
メトリン、アルファ−シペルメトリン、β−シフルトリン、ビフェントリン(Bifenthrin
)、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリド、アセタミプ
リド(Acetamiprid)、ジノテフラン(Dinetofuran)、クロルピリホス(Clorphyriphos
)、メタミドホス(Metamidophos)、オキシデメトン−メチル(Oxidemethon-methyl)、
ピリミカルブ(Pirimicarb)、メチオカルブ;トウモロコシ除草剤:アトラジン、アラク
ロール(Alachlor)、ブロモキシニル、アセトクロール(Acetochlor)、ジカンバ(Dica
mba)、クロピラリド(Clopyralid)、(S−)ジメテナミド(Dimethenamid)、グルホ
シネート、グリホサート、イソキサフルトール(Isoxaflutole)、(S−)メトラクロル
(Metolachlor)、メソトリオン(Mesotrione)、ニコスルフロン(Nicosulfuron)、プ
ミスルフロン(Primisulfuron)、リムスルフロン(Rimsulfuron)、スルコトリオン
Sulcotrione)、フォラムスルフロン(Foramsulfuron)、トプラメゾン(Topramezone)
テンボトリオン(Tembotrione)、サフルフェナシル(Saflufenacil)、チエンカルバ
ゾン(Thiencarbazone)、フルフェナセット、ピロキサスルホン;トウモロコシ殺虫剤:
カルボフラン、クロルピリホス、ビフェントリン、フィプロニル(Fipronil)、イミダク
プリド、ラムダ−シハロトリン、テフルトリン(Tefluthrin)、テルブホス(Terb
ufos)、チアメトキサム、クロチアニジン、スピロメシフェンフルベンジアミド
トリフルムロン、リナキシピル、デルタメトリン、チオジカルブ、β−シフルトリン、シ
ペルメトリン、ビフェントリン、ルフェヌロン(Lufenuron)、トリフルムロン(Triflum
oron)、テフルトリン、テブプリムホス(Tebupirimphos)、エチプロル(Ethiprole)、
シアジピル、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、アベルメクチン(Averme
ctin)、メチオカルブ、スピロジクロフェン、スピロテトラマト;トウモロコシ抗真菌剤
:フェニトパン(Fenitropan)、チウラム(Thiram)、プロチオコナゾール、テブコナ
ゾール、トリフロキシストロビン;イネ除草剤:ブタクロール(Butachlor)、プロパ
ル(Propanil)、アジムスルフロン(Azimsulfuron)、ベンスルフロン(Bensulfuron)
シハロホップ(Cyhalofop)、ダイムロン(Daimuron)、フェントラザミド(Fentrazam
ide)、イマゾスルフロン(Imazosulfuron)、メフェナセット(Mefenacet)、オキサ
クロメホン(Oxaziclomefone)、ピラゾスルフロン(Pyrazosulfuron)、ピリブチカルブ
(Pyributicarb)、キンクロラック(Quinclorac)、チオベンカルブ(Thiobencarb)、
インダノファン(Indanofan)、フルフェナセット、フェントラザミド、ハロスルフロン
(Halosulfuron)、オキサジクロメホン、ベンゾビシクロン(Benzobicyclon)、ピリフ
タリド(Pyriftalid)、ペノキススラム(Penoxsulam)、ビスピリバック(Bispyribac)
、オキサジアルキル(Oxadiargyl)、エトキシスルフロン(Ethoxysulfuron)、プレチラ
クロール(Pretilachlor)、メソトリオン、テフリルトリオン(Tefuryltrione)、オキ
サジアゾン(Oxadiazone)、フェノキサプロップ、ピリミスルファン(Pyrimisulfan);
イネ殺虫剤:ダイアジノン、フェニトロチオン(Fenitrothion)、フェノブカルブ(Feno
bucarb)、モノクロトホス(Monocrotophos)、ベンフラカルブ(Benfuracarb)、ブプロ
フェジン(Buprofezin)、ジノテフラン、フィプロニル、イミダクロプリド、イソプロカ
ルブ(Isoprocarb)、チアクロプリド、クロマフェノジド、チアクロプリド、ジノテフラ
ン、クロチアニジン、エチプロル、フルベンジアミド、リナキシピル、デルタメトリン、
アセタミプリド、チアメトキサム、シアジピル、スピノサド、スピノトラム、エマメクチ
ン−ベンゾエート、シペルメトリン、クロルピリホス(Chlorpyriphos)、カルタップ(C
artap)、メタミドホス(Methamidophos)、エトフェンプロックス(Etofenprox)、トリ
アゾホス(Triazophos)、4−[[(6−クロロピリジン−3−イル)メチル](2,2
−ジフルオレチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、カルボフラン、ベンフラカルブ
;イネ抗真菌剤:チオファネート−メチル、アゾキシストロビン、カルプロパミド(Carp
ropamid)、エジフェンホス(Edifenphos)、フェリムゾン(Ferimzone)、イプロベンホ
ス(Iprobenfos)、イソプロチオラン(Isoprothiolane)、ペンシクロン(Pencycuron)
プロベナゾール(Probenazole)、ピロキロン(Pyroquilon)、トリシクラゾール(Tri
cyclazole)、トリフロキシストロビン、ジクロシメット(Diclocymet)、フェノキサニ
ル(Fenoxanil)、シメコナゾール、チアジニル(Tiadinil);ワタ除草剤:ジウロン、
フルオメツロン(Fluometuron)、MSMA、オキシフルオルフェン(Oxyfluorfen)、プ
ロメトリン(Prometryn)、トリフルラリン、カルフェントラゾン(Carfentrazone)、ク
レトジム(Clethodim)、フルアジホップ−ブチル、グリホサート、ノルフルラゾン(Nor
flurazon)、ペンディメタリン(Pendimethalin)、ピリチオバックナトリウム(Pyrithi
obac-sodium)、トリキシスルフロン(Trifloxysulfuron)、テプラロキシジム(Tepralo
xydim)、グルホシネート、フルミオキサジン(Flumioxazin)、チジアズロン(Thidiazu
ron);ワタ殺虫剤:アセフェート(Acephate)、アルジカルブ、クロルピリホス、シペ
ルメトリン、デルタメトリン、マラチオン、モノクロトホス、アバメクチン、アセタミプ
リド、エマメクチンベンゾエート、イミダクロプリド、インドキサカルブ、ラムダ−シハ
ロトリン、スピノサド、チオジカルブ、ガンマ−シハロトリン、スピロメシフェン、ピリ
リル(Pyridalyl)、フロニカミド、フルベンジアミド、トリフルムロン、リナキシピ
ル、ベータ−シフルトリン、スピロテトラマト、クロチアニジン、チアメトキサム、チア
クロプリド、ジノテフラン、フルベンジアミド、シアジピル、スピノサド、スピノトラム
、ガンマシハロトリン、4−[[(6−クロロピリジン−3−イル)メチル](2,2−
ジフルオレチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、チオジカルブ、アベルメクチン、
フロニカミド、ピリダリル、スピロメシフェン、スルホクサフロール、プロフェノホス(
Profenophos)、トリアゾホス(Thriazophos)、エンドスルファン(Endosulfan);ワタ
抗真菌剤:エ
トリジアゾール(Etridiazole)、メタラキシル、キントゼン(Quintozene);ダイズ除
草剤アラクロールベンタゾン(Bentazone)、トリフルラリン、クロリムロン−エチ
ル(Chlorimuron-Ethyl)、クロランスラム−メチル(Cloransulam-Methyl)、フェノキ
サプロップ、フォメサフェン(Fomesafen)、フルアジホップ、グリホサート、イマザモ
クス(Imazamox)、イマザキン(Imazaquin)、イマゼタピル(Imazethapyr)、(S−
)メトラクロル、メトリブジン、ペンディメタリン、テプラロキシジム、グルホシネート
;ダイズ殺虫剤:ラムダ−シハロトリン、メソミル、パラチオン(Parathion)、チオカ
ルブ(Thiocarb)、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、チアクロプリ
ド、アセタミプリド、ジノテフラン、フルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、ス
ピノサド、スピノトラム、エマメクチン−ベンゾエート、フィプロニル、エチプロル、デ
タメトリン、β−シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、4−[[(6−クロ
ピリジン−3−イル)メチル](2,2−ジフルオレチル)アミノ]フラン−2(5H
)−オン、スピロテトラマト、スピノジクロフェン(Spinodiclofen)、トリフルムロン
、フロニカミド、チオジカルブ、ベータ−シフルトリン;ダイズ抗真菌剤:アゾキシスト
ロビン、シプロコナゾール、エポキシコナゾール、フルトリアホール(Flutriafol)、ピ
クロストロビン、テブコナゾール、トリフロキシストロビン、プロチオコナゾール、テ
トラコナゾール(Tetraconazole);テンサイ除草剤:クロリダゾン(Chloridazon)、デ
スメジファム(Desmedipham)、エトフメセート(Ethofumesate)、フェンメジファム(P
henmedipham)、トリアレート(Triallate)、クロピラリド、フルアジホップ、レナシル
(Lenacil)、メタミトロン(Metamitron)、キンメラック(Quinmerac)、シクロキシジ
ム(Cycloxydim)、トリフルスルフロン(Triflusulfuron)、テプラロキシジム、キザロ
ホップ(Quizalofop);テンサイ殺虫剤:イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメト
サム、チアクロプリド、アセタミプリド、ジノテフラン、デルタメトリン、β−シフル
トリン、ガンマ/ラムダシハロトリン、4−[[(6−クロロピリジン−3−イル)メチ
ル](2、2−ジフルオレチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、テフルトリン、リ
ナキシピル、シアジピル(Cyaxypyr)、フィプロニル、カルボフラン;カノーラ除草剤:
クロピラリド、ジクロホップ、フルアジホップ、グルホシネート、グリホサート、メタ
クロル(Metazachlor)、トリフルラリンエタメツルフロン(TrifluralinEthametsulfuro
n)、キンメラック、キザロホップクレトジム、テプラロキシジム;カノーラ抗真菌剤
:アゾキシストロビン、カルベンダジム、フルジオキソニル(Fludioxonil)、イプロジ
オン、プロクロラズ(Prochloraz)、ビンクロゾリン(Vinclozolin);カノーラ殺虫剤
:カルボフラン、有機リン剤(Organophosphates)、ピレスロイド(Pyrethroids)、チ
アクロプリド、デルタメトリン、イミダクロプリド、クロチアニジン、チアメトキサム、
アセタミプリド、ジノテフラン、β−シフルトリン、ガンマ及びラムダシハロトリン、タ
ウ−フルバリレート(tau-Fluvaleriate)、エチプロル、スピノサド、スピノトラム、フ
ルベンジアミド、リナキシピル、シアジピル、4−[[(6−クロロピリジン−3−イル
)メチル](2,2−ジフルオレチル)アミノ]フラン−2(5H)−オン、が挙げられ
る。

0110

「害虫」とは、昆虫、真菌、細菌、線虫、ダニ、マダニ、などを含むがこれらに限定さ
れない。害虫は、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目(Hymenoptera)、
鱗翅目(Lepidoptera)、ハジラミ(Mallophaga)、同翅類(Homoptera)、半翅目(Hemi
ptera)、直翅目(Orthroptera)、総翅目(Thysanoptera)、ハサミムシ目(Dermaptera
)、シロアリ目(Isoptera)、シラミ目(Anoplura)、ノミ目(Siphonaptera)、毛翅目
(Trichoptera)などの目、特に鞘翅目、鱗翅目、及び双翅目から選択された昆虫を含む

0111

鞘翅目は、Adephaga及びPolyphaga亜目を含む。Adephaga亜目は、Caraboidea及びGyrin
oidea上科を含み、Polyphaga亜目はHydrophiloidea、Staphylinoidea、Cantharoidea、Cl
eroidea、Elateroidea、Dascilloidea、Dryopoidea、Byrrhoidea、Cucujoidea、Meloidea
、Mordelloidea、Tenebrionoidea、Bostrichoidea、Scarabaeoidea、Cerambycoidea、Chr
ysomeloidea、及びCurculionoidea上科を含む。Caraboidea上科は、Cicindelidae、Carab
idae、及びDytiscidae科を含む。Gyrinoidea上科は、Gyrinidae科を含む。Hydrophiloide
a上科は、Hydrophilidae科を含む。Staphylinoidea上科は、Silphidae及びStaphylinidae
科を含む。Cantharoidea上科は、Cantharidae及びLampyridae科を含む。Cleroidea上科は
、Cleridae及びDermestidae科を含む。Elateroidea上科は、Elateridae及びBuprestidae
科を含む。Cucujoidea上科は、Coccinellidae科を含む。Meloidea上科は、Meloidae科を
含む。Tenebrionoidea上科は、Tenebrionidae科を含む。Scarabaeoidea上科は、Passalid
ae及びScarabaeidae科を含む。Cerambycoidea上科は、Cerambycidae科を含む。Chrysomel
oidea上科は、Chrysomelidae科を含む。Curculionoidea上科は、Curculionidae及びScoly
tidae科を含む。

0112

双翅目は、Nematocera、Brachycera、及びCyclorrhapha亜目を含む。Nematocera亜目は
、Tipulidae、Psychodidae、Culicidae、Ceratopogonidae、Chironomidae、Simuliidae、
Bibionidae、及びCecidomyiidae科を含む。Brachycera亜目は、Stratiomyidae、Tabanida
e、Therevidae、Asilidae、Mydidae、Bombyliidae、及びDolichopodidae科を含む。Cyclo
rrhapha亜目は、Aschiza及びAschiza門を含む。Aschiza門は、Phoridae、Syrphidae、及
びConopidae科を含む。Aschiza門は、Acalyptratae及びCalyptratae節を含む。Acalyptra
tae節は、Otitidae、Tephritidae、Agromyzidae、及びDrosophilidae科を含む。Calyptra
tae節は、Hippoboscidae、Oestridae、Tachinidae、Anthomyiidae、Muscidae、Calliphor
idae、及びSarcophagidae科を含む。

0113

鱗翅目は、Papilionidae、Pieridae、Lycaenidae、Nymphalidae、Danaidae)、Satyrid
ae、Hesperiidae、Sphingidae、Saturniidae、Geometridae、Arctiidae、Noctuidae、Lym
antriidae、Sesiidae、及びTineidae科を含む。

0114

線虫は、根瘤、シスト、及び、病原性線虫などの寄生線虫を含み、Heterodera spp、Me
loidogyne spp、及びGlobodera sppを含み;特にシスト線虫のメンバー(これらに限定さ
れない)であって以下を含む、Heterodera glycines(ダイズシスト線虫);Heterodera
schachtii(ビートシスト線虫);Heterodera avenae(ムギシスト線虫);並びにGlobod
era rostochiensis及びGlobodera pailida(ジャガイモシスト線虫)。病原性線虫は、Pr
atylenchus sppを含む。

0115

主要作物に対する本発明の昆虫害虫は、以下を含む:トウモロコシ: Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ(European corn borer);Agrotis ipsilon)、タマナヤガ(black cutworm);Helicoverpa zea、アメリカタバコガ(corn earworm);Spodoptera frugiperda、ヨトウガ(fall armyworm);Diatraea grandiosella、西部アワノメイガ(southwestern corn borer);Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ(lesser cornstalk borer);Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー(surgarcane borer);Diabrotica virgifera、ウエスタンコーンルートワーム(western corn rootworm);Diabrotica longicornis barberi、ノーザンコーンルートワーム(northern corn rootworm);Diabroti caundecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム(southern corn rootworm);Melanotus spp.、ハリガネムシ(wireworms);Cyclocephala borealis、ノーザンマスクドコネムシ(northern masked chafer)(ホワイトグラブ(white grub));Cyclocephala immaculata、サザンマスクドコガネムシ(southern masked chafer)(ホワイトグラブ(white grub));Popillia japonica、マメコガネ(Japanese beetle);Chaetocnema pulicaria、トウモロコシノミハムシ(corn flea beetle);Sphenophorus maidis、トウモロコシゾウムシ(maize billbug);Rhopalosiphum maidis、トウモロコシ葉アブラムシ(corn leaf aphid);Anuraphis maidiradicis、トウモロコシ根アブラムシ(corn root aphid);Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ(chinch bug);Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ(redlegged grasshopper);Melanoplus sanguinipes、移動性バッタ(migratory grasshopper);Hylemya platura、シードコーンマゴット(seedcorn maggot);Agromyza parvicornis、トウモロコシ斑点ハモグリバエ(cornblot leaf miner);Anaphothrips obscrurus、アザミウマ(grass thrips);Solenopsis milesta、盗賊アリ(thief ant);Tetranychus urticae、ナミハダニ(twospotted spider mite);ソルガム:Chilo partellus、ソルガムボーラー(sorghum borer);Spodoptera frugiperda、ヨトウガ;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ;Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ(Fall armyworm);Feltia subterranea、グラニュレートカットワーム(granulate cutworm);Phyllophaga crinita、ホワイトグラブ(white grub);Eleodes、Conoderus、及びAeolus spp.、ハリガネムシ;Oulema melanopus、穀類のハムシ(cereal leaf beetle);Chaetocnema pulicaria、トウモロコシノミハムシ;Sphenophorus maidis、トウモロコシゾウムシ;Rhopalosiphum maidis;トウモロコシ葉アブラムシ;Sipha flava、イエローシュガーケーンアブラムシ(yellow sugarcane aphid);Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ;Contarinia sorghicola、ソルガムミッジ(sorghum midge);Tetranychus cinnabarinus、ニセナミハダニ(carmine spider mite);Tetranychus urticae、ナミハダニ;コムギ: Pseudaletia unipunctata、アーミーワーム(army worm);Spodoptera frugiperda、ヨトウガ;Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Agrotis orthogonia、ウェスタンカトワーム(western cutworm);Elasmopalpus lignosellus、モロコシマダラメイガ;Oulema melanopus、穀類のハムシ;Hypera punctata、クローバーゾウムシ(clover leaf weevil);Diabrotica undecimpunctata howardi、サザンコーンルートワーム;ロシアコムギアブラムシ(Russian wheat aphid);Schizaphis graminum、ムギミドリアブラムシ(greenbug);Macrosiphum avenae、イングリッシュグレインフィド(English grain aphid);Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー(differential grasshopper);Melanoplus sanguinipes、移動性バッタ;マイチオラデストラクター(Mayetiola destructor)、ヘシアンバエ(Hessian fly);Sitodiplosis mosellana、ムギアカタマバエ(wheat midge);Meromyza americana、ムギキモグリバエ(wheat stem maggot);Hylemya coarctata、コムギハナアブ(wheat bulb fly);Frankliniella fusca、タバコアザミウマ(tobacco thrips);Cephuscinctus、ムギクキハバチ(wheat stem sawfly);Aceria tulipae、チューリップサビダニ(wheat curl mite);ヒマワリ: Suleima helianthana、サンフラワーバッドモス(sunflower bud moth);Homoeosoma electellum、サンフラワーモス(sunflowermoth);zygogramma exclamationis、サンフラワービートル(sunflower beetle);Bothyrus gibbosus、キャロットビートル(carrot beetle);Neolasioptera murtfeldtiana、サンフラワーシードミッジ(sunflower seed midge);ワタ: Heliothisvirescens、コットンバッドワーム(cotton budworm);Helicoverpa zea、コットンボールワーム(cotton bollworm);Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ(beet armyworm);Pectinophora gossypiella、ピンクボールワーム(pink bollworm);Anthonomusgrandis、ワタミゾムシ(boll weevil);Aphis gossypii、ワタアブラムシ(cotton aphid);Pseudatomoscelis seriatus、ワタノミハムシ(cotton fleahopper);Trialeurodes abutilonea、バンデッドウィングド・ホワイトフライ(bandedwinged whitefly);Lygus lineolaris、ターニシドプラントバグ(tarnished plant bug);Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー; Thrips tabaci、タマネギアザミウマ(onion thrips);Franklinkiella fusca、タバコアザミウマ;Tetranychus cinnabarinus、ニセナミハダニ;Tetranychus urticae、ナミハダニ;イネ: Diatraea saccharalis、シュガーケーンボーラー;Spodopterafrugiperda、ヨトウガHelicoverpa zea、アメリカタバコガ;Colaspis brunnea、ブドウコラスピス;Lissorhoptrus oryzophilus、イネミズゾウムシ(rice water weevil);Sitophilus oryzae、イネゾウムシ(rice weevil);Nephotettix nigropictus、クロスジツマグロヨコバイ(rice leafhopper);Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ;Acrosternum hilare、アオカメムシ(green stink bug);ダイズ:Pseudoplusia includens、ダイズシャクトリムシ(soybean looper);Anticarsia gemmatalis、ハッショウマメケムシ(velvetbean caterpillar);Plathypena scabra、グリーンクローバーワーム(green cloverworm);Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ;Agrotis ipsilon、タマヤナガ;Spodoptera exigua、シロイチモジヨトウ;Heliothis virescens、コットンバッドワーム;Helicoverpa zea、アメリカタバコガ;Epilachna varivestis、インゲンテントウ(Mexican bean beetle);Myzus persicae、モモアカアブラムシ(greenpeach aphid); Empoasca fabae、(potato leafhopper);Acrosternum hilare、アオカメムシ;Melanoplus femurrubrum、アカアシバッタ;Melanoplus differentialis、ディファレンシャルグラスホッパー;Hylemya platura、タネバエ; Sericothrips variabilis、ダイズアザミウマ(soybean thrips);Thrips tabaci、タマネギアザミウマ; Tetranychus turkestani、イチゴハダニ(strawberry spider mite);Tetranychus urticae、ナミハダニ;オオムギ:Ostrinia nubilalis、ヨーロッパアワノメイガ;Agrotis ipsilon、タマヤナガ;Schizaphis graminum、ムギミドリアブラムシ;Blissus leucopterus leucopterus、チンチバグ;Acrosternum hilare、アオカメムシ;Euschistus servus、チャイロカメムシ(brown stink bug);Delia platura、タネバエ;Mayetiola destructor、ヘシアンバエ;Petrobia latens、チャイロコムギダニ(brown wheat mite);ナタネ: Brevicoryne brassicae、ダイコンアブラムシ(cabbage aphid);Phyllotreta cruciferae、ノミハムシ;Mamestra configurata、バーサアーミーワーム(Bertha armyworm);Plutella xylostella、コナガ;Delia ssp.、ネクイムシ(Root maggots)。

0116

植物の収量を増加させる方法
植物の収量を増加させる方法が提供される。該方法は、本明細書において開示された殺
虫性ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを発現している植物又は植物細胞を
提供する工程、及び前記ポリペプチドが殺虫活性を有する害虫によって感染された用地に
その植物又は種子を生育させる工程を含む。いくつかの実施形態において、該ポリペプチ
ドは鱗翅目、鞘翅目、双翅目、半翅目、又は線虫害虫、に対する殺虫活性を有し、前記用
地は鱗翅目、半翅目、鞘翅目、双翅目、又は線虫害虫により感染される。

0117

本明細書において使用される場合、植物の「収量」とは、植物によって生産されたバイ
マスの質及び/又は量を意味する。「バイオマス」とは、任意の測定された植物産物
意図する。バイオマス生産の増加とは、測定された植物産物の生産量における任意の改善
である。増加する植物生産量は、複数の商業的応用を有する。例えば、増加する植物葉
イオマスは、人類又は動物が消費する葉野菜の生産量を増加させる可能性がある。加えて
、増加する葉バイオマスを、植物由来医薬又は工業製品の生産を増加させるために使用
することができる。生産量の増加は、殺虫性配列を発現していない植物と比較して、少な
くとも1%の増加、少なくとも3%の増加、少なくとも5%の増加、少なくとも10%の
増加、少なくとも20%の増加、少なくとも30%、少なくとも50%、少なくとも70
%、少なくとも100%又はそれを超える生産量の増加を含むがこれらに限定されない、
任意の統計学的に有意な増加を含み得る。

0118

特定の方法においては、植物生産量は、本明細書において開示された殺虫性タンパク質
を発現している植物の害虫抵抗性の改善の結果として増加する。殺虫性タンパク質の発現
は、害虫がその植物を摂取する又は摂食する能力の低下をもたらし、そのために植物生産
量が改善される。

0119

以下の実施例は、説明のために提供されるものであり、本発明を限定しない。

0120

実施例
実施例1新規遺伝子の同定
以下のような方法を用いて、本明細書において記載した細菌株より、新規の殺虫性遺伝
子を同定した:

0121

方法1
・デルタエンドトキシン遺伝子を典型的に有するプラスミドを含む株からの、染色体
外DNAの調製
・ 大きさによって分散する断片を生成するための、染色体外DNAの機械的切断
・ 〜2Kbから〜10Kbの染色体外DNA断片のクローニング
・ 染色体外DNA〜1500クローンの増殖
クローニングベクター特異的プライマーを用いた1500クローンの部分的なシー
クエンシング末端読み出し
・ (その全文を参照により本明細書に組み入れる、米国特許第2004001409
1号に記載されたような)MiDAS法を介した相同性解析を通じての、推定毒素遺伝子
の同定
・ 目的の推定毒素遺伝子の断片を含むクローンの配列解読完了(ウォーキング

0122

方法2
・ (様々な大きさのプラスミド;ファージ染色体;精製プロトコールによって分離さ
れていないゲノムDNA断片;その他の解析されていない染色体外分子、のいくつか又は
すべての混合物を含む)株からの染色体外DNAの調製
・ 大きさによって分散する断片を生成するための、染色体外DNAの機械的又は酵素
的切断
断片化DNAのハイスループットパイロシークエンシング法によるシークエンシ
ング
・相同性及び/又はその他のコンピューター解析を介した推定毒素遺伝子の同定
・ 複数のPCR又はクローニング法(例えばTAIL−PCR)のうちの1つを用い
た、目的の遺伝子配列解読完了

0123

実施例2 Bacillus thuringiensisからの、cry8との相同性を有する新規殺虫性遺伝
子の発見

0124

0125

実施例3 Bacillus thuringiensisからの、新規cry7様殺虫性遺伝子の発見
実施例1において開示された方法を用い、表2に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0126

0127

実施例4 Bacillus thuringiensisからの新規cry1Iホモログの発見
実施例1において開示された方法を用い、表3に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0128

0129

実施例5 Bacillus thuringiensisからの新規cry9ホモログの発見
実施例1において開示された方法を用い、表4に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0130

0131

実施例6 Bacillus thuringiensisからの新規cry4ホモログの発見
実施例1において開示された方法を用い、表5に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0132

0133

実施例7 Bacillus thuringiensisからの新規cryC53/cryC53様配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表6に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。axmi−153とaxmi−154の両方をコードする完全長配列を配
列番号48に示した。axmi−157とaxmi−158の両方をコードする完全長配
列を配列番号49に示した。

0134

0135

実施例8 Bacillus thuringiensisからの新規cry21/cry12様配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表7に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0136

0137

実施例9 Bacillus thuringiensisからの新規VIP様又はバイナリー様配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表8に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0138

0139

実施例10 Bacillus thuringiensisからの新規MTX様配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表9に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺伝
子を同定した。

0140

0141

実施例11 Bacillus thuringiensisからの新規毒素配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表10に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺
伝子を同定した。

0142

0143

実施例12 Bacillus thuringiensisからの新規毒素配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表11に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺
伝子を同定した。

0144

0145

実施例13 Bacillus thuringiensisからの新規毒素遺伝子配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表12に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺
伝子を同定した。

0146

0147

実施例14 Bacillus thuringiensisからの新規毒素遺伝子配列の発見
実施例1において開示された方法を用い、表13に挙げた細菌株から、新規の殺虫性遺
伝子を同定した。

0148

0149

実施例15バチルスにおける発現
本明細書において開示された毒素遺伝子をpAX980からPCRによって増幅し、そ
してPCR産物を当該分野において周知の方法により、バチルス発現ベクターpAX91
6、又は別の好適なベクターにクローニングした。axmi遺伝子を有するベクターを含
む得られたバチルス株を、CYS培地(10g/lバクト−カシトン;3g/l酵母エキ
ス;6g/l KH2PO4;14g/l K2HPO4;0.5mM MgSO4;0.0
5mM MnCl2;0.05mM FeSO4)などの標準的な成長培地上で、顕微鏡的試験
によって胞子形成が明かになるまで培養した。試料を調製し、バイオアッセイにおいて活
性について試験した。

0150

実施例16 合成配列の構築
本発明の1つの態様においては、合成毒素配列を生成した。これら合成配列は、親毒素
配列に関連した変化したDNA配列を有し、及び対応する親毒素タンパク質と同一線上の
タンパク質をコードするが、多くのデルタエンドトキシンタンパク質に存在するC末端「
クリスタルドメイン」を欠いた。本明細書において開示された新規の毒素に対応する合成
配列を表14に示す。

0151

0152

本発明の別の態様において、得られたペプチドが、小胞体又はアポプラストなどの植物
小器官を標的とするように、改変した合成遺伝子を設計する。融合タンパク質を植物小器
官を標的として送ることが公知であるペプチド配列は、当該分野において公知である。例
えば、シロバナルピナス(Lupinus albus)由来の酸性ホスファターゼ遺伝子のN末端領
域(Genebank IDGI:14276838;Miller et al. (2001) Plant Physiology 127: 594-606
)は、異種タンパク質の小胞体ターゲティングをもたらすことが当該分野において公知で
ある。得られた融合タンパク質が、C末端に、N末端−リジン−アスパラギン酸−グルタ
ミン酸−ロイシン(すなわち「KDEL」モチーフペプチド(配列番号208)を含む小
胞体保持配列をもまた含む場合には、融合タンパク質は小胞体に輸送されるだろう。融合
タンパク質がC末端における小胞体ターゲティング配列を欠損する場合、タンパク質は小
胞体に輸送されるが、最終的にはアポプラスト内に隔離されるだろう。

0153

実施例17 Axmi156のバイオアッセイ
遺伝子発現及び精製
Axmi156の毒素ドメインをコードするDNA領域を、E. coli発現ベクターpMAL−C4xに、マルトース結合タンパク質(MBP)をコードしているmalE遺伝子の後ろで、別個にクローニングした。これらのインフレーム融合は、E.coliでのMBP−Axmi融合タンパク質の発現を生じた。E.coliにおける発現のためには、BL21*DE3を個々のプラスミドを用いて形質転換した。単一のコロニーを、カルベニシリン及びグルコースを含むLB中に播種し、そして一晩37℃で生育させた。翌日、1%の一晩培養に新しい培地を加え、そして37℃で対数期まで生育させた。その後培養を、0.3mMIPTG、20℃で一晩誘導した。それぞれの細胞ペレットを、200mM NaCl、1mM DTT、プロテアーゼインヒビターを含む20mM Tris−Cl緩衝液、pH7.4に懸濁し、そして超音波破砕した。SDS−PAGEによる解析により、融合タンパク質の発現を確認した。

0154

MBP−axmi融合タンパク質をアフィニティ精製するために、全無細胞抽出液を、
FPLCに結合したアミロースカラムに流した。10mMマルトース溶液を用いて、結合
した融合タンパク質を樹脂から溶出した。精製した融合タンパク質を因子Xa又はトリプ
シンのいずれかを用いて分解し、Axmiタンパク質からアミノ末端MBPタグを除去し
た。タンパク質の分解及び可溶性を、SDS−PAGEを用いて決定した。

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