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技術 試料の調製方法及びビタミン類の免疫測定方法

出願人 東ソー株式会社
発明者 堀田秀樹
出願日 2014年1月21日 (5年10ヶ月経過) 出願番号 2014-008763
公開日 2015年7月30日 (4年4ヶ月経過) 公開番号 2015-137891
状態 特許登録済
技術分野 生物学的材料の調査,分析
主要キーワード 免疫反応試薬 測定用血液 自動免疫測定装置 生物化学発光 免疫測定用試薬 増加速度 免疫測定装置 前処理剤
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年7月30日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

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課題

アルカリ処理された血液試料中ビタミン類の濃度を精度よく測定する方法を提供する。

解決手段

アルカリ処理された血液試料界面活性剤(好ましくはノニデッドP−40等の非イオン性界面活性剤)を混合することで、ビタミン類(好ましくは25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2等のビタミンD代謝産物ビタミンB12又は葉酸測定用血液試料混合物を調製し、その測定用血液試料混合物を、分離や抽出を行わずにそのまま免疫学的測定法によってビタミン類を測定する。

概要

背景

免疫測定法によって測定されるビタミン類にはビタミンD代謝産物ビタミンB12及び葉酸などの小分子がある。血液中のそれらの小分子は、その大部分が特異的又は非特異的に蛋白質、脂質などと結合している。そのためそれらの小分子を測定するためには、小分子を前記蛋白質等から遊離する必要がある(以下、前処理と記載することがある)。なお、ビタミン類にはそれぞれ特異的な結合蛋白質が存在し、血液中での安定性に貢献している。例えばビタミンDバインディングプロテイン(DBP)、ハプトコリン内因子などが良く知られている。

従来知られているビタミン類の結合蛋白質の遊離方法として、アルカリ処理報告されており、特にアルカリ剤として水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合が多い。特許文献1ではβ−ランダムメチル化シクロデキストリンサリチル酸ナトリウムを含む水酸化ナトリウム水溶液、特許文献2ではEDTA、DTT、炭酸エチレンを含む水酸化ナトリウム水溶液が報告されている。

しかしながらアルカリ処理は血液中の蛋白質を変性させ、不溶物を発生させる。そのため中和後、免疫反応にその処理した試料を用いる場合、測定精度が悪化するといった問題を有している。

概要

アルカリ処理された血液試料中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法を提供する。 アルカリ処理された血液試料界面活性剤(好ましくはノニデッドP−40等の非イオン性界面活性剤)を混合することで、ビタミン類(好ましくは25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2等のビタミンD代謝産物、ビタミンB12又は葉酸)測定用血液試料混合物を調製し、その測定用血液試料混合物を、分離や抽出を行わずにそのまま免疫学的測定法によってビタミン類を測定する。 なし

目的

本発明の目的は、アルカリ処理された血液試料中に界面活性剤を混合することによって測定用試料を調製し、血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

請求項2

界面活性剤が非イオン性界面活性剤である請求項1に記載の調製方法。

請求項3

ビタミン類がビタミンD代謝産物ビタミンB12又は葉酸である、請求項1又は2に記載の調製方法。

請求項4

請求項1〜3いずれかに記載の方法で得られた血液試料混合物中のビタミン類を、免疫学的方法によって測定することを特徴とする、ビタミン類の免疫測定方法

技術分野

0001

本発明は、血液中ビタミン類免疫学的に測定する方法において、アルカリ処理された血液試料中界面活性剤を混合することによって血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法に関するものである。

背景技術

0002

免疫測定法によって測定されるビタミン類にはビタミンD代謝産物ビタミンB12及び葉酸などの小分子がある。血液中のそれらの小分子は、その大部分が特異的又は非特異的に蛋白質、脂質などと結合している。そのためそれらの小分子を測定するためには、小分子を前記蛋白質等から遊離する必要がある(以下、前処理と記載することがある)。なお、ビタミン類にはそれぞれ特異的な結合蛋白質が存在し、血液中での安定性に貢献している。例えばビタミンDバインディングプロテイン(DBP)、ハプトコリン内因子などが良く知られている。

0003

従来知られているビタミン類の結合蛋白質の遊離方法として、アルカリ処理が報告されており、特にアルカリ剤として水酸化ナトリウム水溶液を用いる場合が多い。特許文献1ではβ−ランダムメチル化シクロデキストリンサリチル酸ナトリウムを含む水酸化ナトリウム水溶液、特許文献2ではEDTA、DTT、炭酸エチレンを含む水酸化ナトリウム水溶液が報告されている。

0004

しかしながらアルカリ処理は血液中の蛋白質を変性させ、不溶物を発生させる。そのため中和後、免疫反応にその処理した試料を用いる場合、測定精度が悪化するといった問題を有している。

先行技術

0005

特許第4130958号公報
国際公開第2011/144661号パンフレット

発明が解決しようとする課題

0006

臨床検査の分野において血液中のビタミン類の測定は、アルカリ処理、免疫反応の順に実施されることが多く、アルカリ処理を含め、迅速かつ全自動とすることが求められている。アルカリ処理は血液中の蛋白質を変性させ、不溶物を発生させる。そのため中和後、免疫反応にその処理した試料を用いる場合、測定精度が悪化するといった問題を有している。変性した蛋白質を除去するために一般的な方法として分離や抽出が用いられるが、迅速な測定を実現しつつ、それらを自動化することは困難である。

0007

そこで本発明の目的は、アルカリ処理された血液試料中に界面活性剤を混合することによって測定用試料を調製し、血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定する方法を提供することにある。

課題を解決するための手段

0008

本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討を行なった結果、ビタミン類を免疫学的に測定する方法において、アルカリ処理された血液試料中に界面活性剤を混合することによって測定用試料を調製することにより、血液中のビタミン類の濃度を精度よく測定できることを見出し、本発明を完成するに至った。

0009

即ち本発明は以下のとおりである。
(1)アルカリ処理された血液試料に界面活性剤を混合することを特徴とする、ビタミン類測定用血液試料混合物調製方法
(2) 界面活性剤が非イオン性界面活性剤である(1)に記載の調製方法。
(3) ビタミン類がビタミンD代謝産物、ビタミンB12又は葉酸である、(1)又は(2)に記載の調製方法。
(4) (1)〜(3)いずれかに記載の方法で得られた血液試料混合物中のビタミン類を、免疫学的方法によって測定することを特徴とする、ビタミン類の免疫測定方法

0010

以下、本発明を詳細に説明する。

0011

本発明において、ビタミン類とはビタミンD代謝産物、ビタミンB12又は葉酸のことをいう。ビタミンD代謝産物としてはビタミンD3(コレカルシフェロール)、ビタミンD2(エルゴカルシフェロール)、25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2、1,25−ジヒドロキシビタミンD3、1,25−ジヒドロキシビタミンD2、24,25−ジヒドロキシビタミンD3、24,25−ジヒドロキシビタミンD2を例示することができる。中でも、臨床検査の測定項目として注目されている、25−ヒドロキシビタミンD3、25−ヒドロキシビタミンD2、ビタミンB12及び葉酸に対して、本発明を適用すると好ましい。

0012

血液試料のアルカリ処理に用いられるアルカリ剤としては特に限定されるものではないが、水酸化ナトリウム水酸化カリウムアンモニア等を使用することができ、中でも、水酸化ナトリウムが好ましい。アルカリ処理中のアルカリ剤の濃度は、0.01〜10Mが好ましい。その時の温度、時間には特に限定はないが、34〜40℃で、5〜15分間処理することが好ましい。

0013

また、アルカリ剤と混合して使用する前処理剤として、他の種々の薬剤水溶性溶媒還元剤乖離剤等)を用いても差し支えない。

0014

界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤カチオン性界面活性剤両性界面活性剤が用いられる。好ましくは非イオン性界面活性剤が用いられる。
非イオン性界面活性剤としては、例えば、ノニデッドP−40、TWEEN20、TWEEN80、TritonX−100等、アニオン性界面活性剤としては、アルキルベンゼンスルホン酸塩、SDS等、カチオン性界面活性剤としては、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ジドデシルジメチルアンモニウムクロリド等、両性界面活性剤としては、CHAPS、CHAPSO等が用いられる。

0015

本発明においては、非イオン性界面活性剤が好ましく用いられ、特に好ましくはノニデッドP−40が用いられる。

0016

アルカリ処理された血液試料に混合する界面活性剤の濃度としては、0.001〜1%重量%が好ましく、さらに好ましくは0.001〜0.1重量%であり、とりわけ0.001〜0.05重量%が好ましいが、測定対象物や使用する界面活性剤によって至適濃度を決定するのが好ましい。このときの温度、時間には特に限定はないが、20〜40℃で、1〜30秒間処理することが好ましい。

0017

このようにして調製された血液試料混合物は、分離や抽出を行わなくてもそのまま免疫学的測定法によってビタミン類を測定することができる。

0018

ビタミン類の測定に適用される免疫測定方法は、その原理や検出のためのラベルの種類を問わないものである。即ち、原理としてはサンドイッチ法競合法、凝集法等を使用することができ、ラベルとしては放射性同位元素酵素化学発光、又は生物化学発光等を使用することができる。中でも、酵素、蛍光物質又は化学発光基質をラベルとして用いた、競合法が好ましい。

発明の効果

0019

本発明によれば、アルカリ処理された血液試料に界面活性剤を混合させるという簡便な操作で、ビタミン類測定用の試料混合物を調製することができ、その測定用試料混合物は、分離や抽出を行わなくてもそのまま免疫学的測定法によってビタミン類の濃度を精度良く測定することが可能となる。例えば、臨床検査において有効な手段であるEIARIAで測定されているビタミン類は、その大部分が特異的、非特異的に蛋白質や脂質などと結合しているため、アルカリ処理をする例が多数を占める。その場合、精度良くビタミン類の濃度を測定することは容易ではないため、本発明によって高精度な測定、自動化への発展に対する多くの要望を簡便に解決するものであり、その応用範囲は広い。

0020

以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は本実施例により限定されるものではない。

0021

実施例1
免疫測定装置として全自動エンザイムイムノアッセイ装置(AIA−2000、東ソー社製)と免疫測定用試薬として当該装置用25−ヒドロキシビタミンD免疫反応試薬を用い、自動前処理1ステップ競合法により25−ヒドロキシビタミンDの測定を行った。なお、その他の測定に必要な試薬は後述したようにして調製した。

0022

血液試料のアルカリ処理に用いるアルカリ剤は0.3M水酸化ナトリウム水溶液を調製した。

0023

中和液として使用する界面活性剤を含む溶液は、防腐剤を含む0.2Mリン酸緩衝溶液に、ノニデッドP−40をそれぞれ0重量%(試薬A)、0.001重量%(試薬B)、0.005重量%(試薬C)、0.01重量%(試薬D)、0.02重量%(試薬E)、0.05重量%(試薬F)、0.1重量%(試薬G)になるように添加して7種類を調製した。

0024

測定用の血液試料として血清に25−ヒドロキシビタミンD3を80、160ng/mL添加して2種類の血清サンプルを調製した。

0025

次に、上記のように調製したアルカリ剤と中和液として試薬A、B、C、D、E、F、Gを用い、前記自動免疫測定装置と当該装置用25−ヒドロキシビタミンD免疫反応試薬で血清サンプル2種類を測定し、アルカリフォスファターゼ蛍光基質である4−メチルウンベリフェロン蛍光強度増加速度[nM/s]をそれぞれ測定した。なお、各試薬(中和液)で各血清サンプルを3回ずつ測定した。このとき血清サンプルはアルカリ剤を混合してアルカリ処理し、次いで界面活性剤を含む中和液を混合した後、分離・抽出することなく免疫測定を行った。

0026

結果を表1,2に示す。なお表1,2に示す測定精度の指標となるCV(Coefficient of Variation)は、以下の式に基づき算出している。

0027

CV[%]=[(3回測定した蛍光強度増加速度の標準偏差)÷(3回測定した蛍光強度増加速度の平均値)]×100

0028

0029

ノニデッドP−40が未添加(0重量%:試薬A)の場合は2サンプルのCVがそれぞれ9.8%、6.9%であったが、ノニデッドP−40を添加した場合(試薬B〜G)は、CVは1.0〜3.8%であり、明らかにCVが低くなる傾向が見られた。これはノニデッドP−40を添加したことで測定精度が向上したことを示している。但し、ノニデッドP−40を0.1重量%添加すると蛍光強度増加速度が低下し、CVもわずかながら高くなったため、0.001〜0.05重量%が最も好ましいと考えられる。このことからノニデッドP−40の濃度を上げすぎると免疫測定に影響を与えると推測される。つまり、ノニデッドP−40を添加する場合、免疫測定に影響を与えるような高濃度は好ましくないが、適当な濃度を添加することで血液試料中に含まれるビタミン類を精度よく測定することができることが確認された。

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