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技術 免疫応答を誘発するための組成物、方法およびキット

出願人 デユーク・ユニバーシテイ
発明者 ジヨン・エイチ・サンプソンデユアン・エイ・ミツチエル
出願日 2015年1月30日 (5年0ヶ月経過) 出願番号 2015-016782
公開日 2015年7月27日 (4年7ヶ月経過) 公開番号 2015-134767
状態 拒絶査定
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 動物,微生物物質含有医薬 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード フィルターチャンバー 方形波形 接着期 ボルト数 二次救命処置 ブール型 軸方向面 微粒子放射
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2015年7月27日)のものです。
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図面 (20)

課題

サイトメガロウイルス(CMV)抗原発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための組成物、方法およびキットの提供。

解決手段

キャプシドポリペプチド外皮ポリペプチド及びエンベロープポリペプチドより選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、最低1種CMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的許容できる組成物。最低1種のアジュバント若しくは該アジュバントをコードする核酸を更に含む組成物。

概要

背景

癌の処置方法化学療法剤放射線治療および外科手術の使用を包含する。多数の腫瘍抗原の同定が細胞に基づく治療の開発での試みにつながった。いくつかの方法は、腫瘍抗原、すなわち非腫瘍細胞に関して腫瘍細胞優先的に発現されるポリペプチドを最初に同定することに頼っている。例えば、数種のヒト腫瘍抗原黒色腫患者から単離され、同定されかつ特徴付けられている。

CMVはβ−ヘルペスウイルスである。ヒトサイトメガロウイルスHCMV)はヒト集団固有であり、また、該ウイルス免疫無防備状態宿主でを除き通常は臨床的疾患を引き起こさないことが報告されている。数種のヒトヘルペスウイルスリンパ腫上咽頭癌子宮頚癌およびカポジ肉腫を包含する多数のヒト悪性病変関与している。最近、無傷のウイルスのHCMV抗原の発現および検出が数種の腫瘍で起こることが報告された。

外科手術、放射線照射および化学療法を包含する攻撃的多様式治療にもかかわらず、癌を伴う患者の予後は比較的不良なままである。さらに、癌に対する慣習的治療の非特異的な性質は、しばしば、周囲の正常および全身組織に対する無能力にする損傷をもたらす。従って、癌細胞を標的とする有効な診断ならびに治療および予防戦略の開発に対する必要性が存在する。

概要

サイトメガロウイルス(CMV)抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための組成物、方法およびキットの提供。キャプシドポリペプチド外皮ポリペプチド及びエンベロープポリペプチドより選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、最低1種CMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的許容できる組成物。最低1種のアジュバント若しくは該アジュバントをコードする核酸を更に含む組成物。

目的

本発明は、サイトメガロウイルス(CMV)抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

サイトメガロウイルス(CMV)抗原発現する細胞に対する免疫応答被験体での誘発方法であって、該方法が最低1種CMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は被験体に投与された時に該細胞に対する免疫応答を誘発する、上記方法。

請求項2

細胞が、前癌細胞癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項1に記載の方法。

請求項3

製薬学的に許容できる組成物が、被験体におけるCMVと関連する癌を予防若しくは処置するのに十分な予防的若しくは治療的有効量で提供される、請求項1に記載の方法。

請求項4

最低1種のCMV抗原が、キャプシドポリペプチド外皮ポリペプチドおよびエンベロープポリペプチドよりなる群から選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、請求項1に記載の方法。

請求項5

最低1種のCMV抗原が、リンタンパク質uniquelong83(ppUL83;pp65として知られる)、糖タンパク質UL55(gpUL55;gBとして知られる)、UL123前初期1(IE1)タンパク質、UL122IE2タンパク質、UL111A(mtrIIとして知られる)、US28、ppUL32、ppUL65、ppUL80a、ppUL82、ppUL98a、ppUL99、gpUL4(gp48として知られる)、gpUL16、gpUL18(MHCとして知られる)、gpUL75(gHとして知られる)、gpUL100、gpUL110(gMとして知られる)、gpUL115(gLとして知られる)、pUL46、pUL48、pUL56、pUL86(MCPとして知られる)、糖タンパク質uniqueshort10(gpUS10)、gpUS11、糖タンパク質複合体II(gcII)、gp65およびgp93よりなる群から選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する、請求項1に記載の方法。

請求項6

該最低1種のCMV抗原をコードする核酸がRNAである、請求項1に記載の方法。

請求項7

該最低1種のCMV抗原をコードする核酸がcDNAである、請求項1に記載の方法。

請求項8

該最低1種のCMV抗原が全CMV抗原、全不活化CMVウイルス若しくはそれらの画分である、請求項1に記載の方法。

請求項9

製薬学的に許容できる組成物が、最低1種のアジュバント若しくは該アジュバントをコードする核酸をさらに含んでなる、請求項1に記載の方法。

請求項10

アジュバントが、GMCSF、G−CSF、IL−2、IL−4、IL−7、IL−12、IL−15、IL−21、TNF−αおよびM−CSFよりなる群から選択されるサイトカインである、請求項9に記載の方法。

請求項11

アジュバントが、フロイント不完全アジュバント(モンタニドISA51)若しくはコリネバクテリウムグラロサム(Corynebacteriumgranulosum)P40を含んでなる、請求項9に記載の方法。

請求項12

最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物であって、該製薬学的に許容できる組成物が、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、上記組成物。

請求項13

生理学的に許容できる担体希釈剤若しくは賦形剤をさらに含んでなる、請求項12に記載の製薬学的に許容できる組成物。

請求項14

アジュバントをさらに含んでなる、請求項12に記載の製薬学的に許容できる組成物。

請求項15

アジュバントがサイトカインである、請求項14に記載の製薬学的に許容できる組成物。

請求項16

アジュバントが、GM−CSF、G−CSF、IL−2、IL−4、IL−7、IL−12、IL−15、IL−21、TNF−αおよびM−CSFよりなる群から選択されるサイトカインである、請求項14に記載の製薬学的に許容できる組成物。

請求項17

アジュバントが、フロイントの不完全アジュバント(モンタニドISA51)若しくはコリネバクテリウムグラヌロサム(Corynebacteriumgranulosum)P40を含んでなる、請求項14に記載の製薬学的に許容できる組成物。

請求項18

予防的若しくは治療的有効量の請求項12−17のいずれか1つに記載の製薬学的に許容できる組成物。

請求項19

CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が、有効量の抗原提示細胞Tリンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞およびTリンパ球は感作有効量の最低1種のCMV抗原でinvitroで感作されており、抗原提示細胞、Tリンパ球若しくは双方の有効量は該CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、上記方法。

請求項20

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項19に記載の方法。

請求項21

該抗原提示細胞若しくはTリンパ球が自己である、請求項19に記載の方法。

請求項22

抗原提示細胞の作成方法であって、該方法が最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でinvitroで最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させることを含んでなり、該抗原提示細胞が該最低1種のCMV抗原を提示する、上記方法。

請求項23

最低1種のCMV抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でinvitroで最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と接触された抗原提示細胞を含んでなる組成物。

請求項24

リンパ球の作成方法であって、該方法がa)最低1種のCMV抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でinvitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させること;およびb)リンパ球を製造するのに十分な条件下で、段階a)の抗原提示細胞とリンパ球を接触させることを含んでなり、該リンパ球はCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能である、上記方法。

請求項25

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項24に記載の方法。

請求項26

リンパ球がTリンパ球である、請求項24に記載の方法。

請求項27

CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なTリンパ球を製造するのに十分な条件下で抗原提示細胞と接触されたTリンパ球を含んでなる組成物であって、該抗原提示細胞は、最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でinvitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と接触されている、上記組成物。

請求項28

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項27に記載の組成物。

請求項29

被験体での癌の処置若しくは重症度低下方法であって、該方法が請求項23若しくは28に記載の組成物の治療的若しくは予防的有効量を被験体に投与することを含んでなる、上記方法。

請求項30

CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸をexvivoで負荷された樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は被験体に投与された時にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、を含んでなる、上記方法。

請求項31

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項30に記載の方法。

請求項32

CMV抗原を発現する細胞の処置方法であって、該方法は、治療的若しくは予防的有効量の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与して該被験体での該細胞の増殖若しくは広がりを低減若しくは阻害することを含んでなり、該組成物はa)最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードするポリヌクレオチド;b)抗CMV抗体;c)該最低1種のCMV抗原を提示する抗原提示細胞、該CMV抗原に対しプライミングされたリンパ球、若しくは双方;またはd)それらの組合せを含んでなる、上記方法。

請求項33

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項32に記載の方法。

請求項34

CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞およびリンパ球は感作有効量の最低1種のCMV抗原でinvitroで感作されており、抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方の有効量がCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、上記方法。

請求項35

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項34に記載の方法。

請求項36

抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方が自己である、請求項34に記載の方法。

請求項37

CMV抗原を発現する細胞の処置方法であって、該方法が、有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞は、最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下で該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸とinvitroで接触されており、該リンパ球が、該最低1種のCMV抗原を提示する抗原提示細胞と接触されている、上記方法。

請求項38

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項37に記載の方法。

請求項39

リンパ球がTリンパ球である、請求項37に記載の方法。

請求項40

CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法であって、該方法が、抗CMV抗体を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなる、上記方法。

請求項41

細胞が、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症させる細胞型を特徴とする、請求項40に記載の方法。

請求項42

抗体が毒性部分に結合され、それにより該抗体が細胞傷害性容量の該毒性部分を細胞に効果的に送達する、請求項40に記載の方法。

請求項43

毒性部分が放射性同位元素であり、それにより抗体が細胞傷害性線量を微粒子放射線として細胞に効果的に送達する、請求項40に記載の方法。

請求項44

最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を含んでなるキットであって、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、上記キット。

請求項45

アジュバントをさらに含んでなる、請求項44に記載のキット。

請求項46

化学療法剤をさらに含んでなる、請求項44に記載のキット。

請求項47

被験体からの生物学的サンプルから核酸分子増幅してアンプリコンを得ることをさらに含んでなる請求項1、19、30、32、34、37、40のいずれか1つに記載の方法であって、増幅することは第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満である、上記方法。

請求項48

アンプリコンが長さ200塩基対(bp)若しくはそれ未満である、請求項47に記載の方法。

請求項49

増幅する段階が、検出可能な標識を含んでなる核酸プローブを提供することをさらに含んでなる、請求項47に記載の方法。

請求項50

第一のプライマーが配列番号67に示されるところの第一のプライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号68に示されるところの第二のプライマー配列を含んでなり、プローブが配列番号69に示されるところのプローブ配列を有する、請求項49に記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の交差引用
本出願は、35 USC §119の下で、2008年6月20日に出願された米国仮出願第61/074,582号明細書(そっくりそのまま引用することより本明細書に組み込まれる)に対する優先権を主張する。

0002

政府の利権
米国政府は、国立保健研究所、国立癌研究所、および国立神経疾患・卒中研究所(Natioanl Institute of Neurological Disorders and Stroke)からの助成金(脳癌におけるNINDS SPORE(NINDS SPORE in Brain Cancer)P50−CA1−0876;NC悪性神経膠腫樹状細胞免疫療法(NCI Dendritic Cell Immunotherapy of Malignant Glioma)R01 CA 97222)を介して本出願にある種の利権を有する。

0003

本発明は、サイトメガロウイルス(CMV)抗原発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための組成物、方法およびキットに関する。本発明はまた、CMVを測定するための方法、組成物およびキットにも関する。

背景技術

0004

癌の処置方法化学療法剤放射線治療および外科手術の使用を包含する。多数の腫瘍抗原の同定が細胞に基づく治療の開発での試みにつながった。いくつかの方法は、腫瘍抗原、すなわち非腫瘍細胞に関して腫瘍細胞優先的に発現されるポリペプチドを最初に同定することに頼っている。例えば、数種のヒト腫瘍抗原が黒色腫患者から単離され、同定されかつ特徴付けられている。

0005

CMVはβ−ヘルペスウイルスである。ヒトサイトメガロウイルスHCMV)はヒト集団固有であり、また、該ウイルス免疫無防備状態宿主でを除き通常は臨床的疾患を引き起こさないことが報告されている。数種のヒトヘルペスウイルスリンパ腫上咽頭癌子宮頚癌およびカポジ肉腫を包含する多数のヒト悪性病変関与している。最近、無傷のウイルスのHCMV抗原の発現および検出が数種の腫瘍で起こることが報告された。

0006

外科手術、放射線照射および化学療法を包含する攻撃的多様式治療にもかかわらず、癌を伴う患者の予後は比較的不良なままである。さらに、癌に対する慣習的治療の非特異的な性質は、しばしば、周囲の正常および全身組織に対する無能力にする損傷をもたらす。従って、癌細胞を標的とする有効な診断ならびに治療および予防戦略の開発に対する必要性が存在する。

0007

[発明の要約]
一局面において、本発明は、サイトメガロウイルス(CMV)抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する。該方法は、最低1種CMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する。

0008

別の局面において,本発明は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原
をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を提供し、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。

0009

いくつかの局面において、予防的若しくは治療的有効量の製薬学的組成物が本発明により提供され、該製薬学的に許容できる組成物は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。

0010

他の局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は
有効量の抗原提示細胞Tリンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することであって、該抗原提示細胞およびTリンパ球は、感作有効量(sensitizing−effective amount)の最低1種のCMV抗原でin vitroで感作されており、抗原提示細胞、Tリンパ球若しくは双方の有効量は、該CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、
を含んでなる。

0011

一局面において、本発明は抗原提示細胞の作成方法を提供し、該方法は、最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でin vitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させることを含んでなり、該抗原提示細胞が該最低1種のCMV抗原を提示する。

0012

なおさらなる一局面において、本発明は、最低1種のCMV抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でin vitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と接触された抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。

0013

いくつかの局面において、本発明はリンパ球の作成方法を提供し、該方法は、
a)最低1種のCMV抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でin vitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させること;および
b)リンパ球を産生するのに十分な条件下で段階a)の抗原提示細胞とリンパ球を接触させることであって、該リンパ球はCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能である、
を含んでなる。

0014

他の局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なTリンパ球を産生するのに十分な条件下で抗原提示細胞と接触されたTリンパ球を含んでなる組成物を提供し、該抗原提示細胞は、最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でin vitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と接触されている。

0015

一局面において、被験体における癌の処置方法若しくはその重症度低減方法が本発明により提供される。該方法は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なTリンパ球を産生するのに十分な条件下で抗原提示細胞と接触されたTリンパ球を含んでなる組成物の治療的若しくは予防的有効量を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞は、最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でin vitroで該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と接触されている。

0016

別の局面において、本発明はCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する。該方法は、
最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸をex vivoで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することであって、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する、
を含んでなる。

0017

いくつかの局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞の処置方法を提供し、該方法は、被験体における細胞の増殖若しくは広がりを低減若しくは阻害するために治療的若しくは予防的有効量の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該組成物は、
a)最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードするポリヌクレオチド
b)抗CMV抗体;
c)最低1種のCMV抗原を提示する抗原提示細胞、該CMV抗原に対しプライミングされたリンパ球、若しくは双方;または
d)それらの組合
を含んでなる。

0018

他の局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することであって、該抗原提示細胞およびリンパ球は、感作有効量の最低1種のCMV抗原でin vitroで感作されており、抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方の有効量は、該CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、
を含んでなる。

0019

一局面において、本発明はCMV抗原を発現する細胞の処置方法を提供し、該方法は、有効量の抗原提示細胞、リンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該抗原提示細胞は、最低1種のCMV抗原が該抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下で、該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸とin vitroで接触されており、該リンパ球は、該最低1種のCMV抗原を提示する抗原提示細胞と接触されている。

0020

別の局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
抗CMV抗体を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与すること
を含んでなる。

0021

多様な他の局面において、本発明は、被験体中のCMV核酸、好ましくは血液若しくは他の生物学的液体中のCMV DNAを測定する、例えば被験体から得られる血液のサンプル中の無症候性ウイルス血症を決定するための組成物および方法を提供する。従って、該組成物および方法は、例えば、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症する素因となる細胞型と関連する疾患若しくは状態の予防的かつ/若しくは治療的処置のような、本明細書に記述される方法を包含する多様な診断および/若しくは治療処置(procedure)および処置(treatment)を補完する診断、モニタリングおよび予後試験アッセイを提供する。

0022

他の局面において、本発明は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を含んでなるキットを提供し、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発する。

図面の簡単な説明

0023

(A)ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)タンパク質免疫組織化学的検出を示し:(a)陰性対照一次抗体なし;対物レンズ10倍);(b)抗平滑筋アクチンマウスIgG2a mAb;10倍);(c)抗HCMVIE1(マウスIgG2a mAb、10倍)で染色された多形神経膠芽腫(GBM)試料1;(d)抗IE1染色のより高倍率は、陽性の腫瘍細胞および内皮細胞しかし陰性のリンパ球および血管内膜を示す(20倍);(e)血管周囲腫瘍細胞の染色しかし壊死領域の検出の欠如を示す抗HCMV IE1で染色されたGBM試料2(10倍);(f)抗IE1 mAbで染色された血管周囲腫瘍細胞(20倍);(gおよびh)GBM試料全体散乱した腫瘍細胞の核および核周囲染色を示す、抗HCMV pp65 mAbで染色されたGBM試料3(それぞれ10倍および20倍);(iおよびj)抗平滑筋アクチンmAbで染色されたCMVに感染した(10倍);(k)抗HCVIE1で染色されたCMVに感染した肺(20倍);(l)抗HCMV pp65 mAbで染色されたCMVに感染した肺(20倍);ならびに(B)一致させたGBMおよび正常脳中のHCMV検出。正常脳および腫瘍の領域を含有する2種のGBM試料からの代表的組織化学切片を、アイソタイプ対照抗体(患者1、左列)若しくは抗HCMV pp65(患者1腫瘍、中列;患者2、右列)を使用して検出のため染色した。HCMV pp65抗体に対する反応性中心領域が腫瘍に関与する領域全体で観察されたが、しかし正常脳はHCMV特異的抗体に対する免疫反応性を欠いた(IE1染色は腫瘍中のIE1のより偏在性検出(示されない)と同一の知見を示した)。全部の写真は40倍対物拡大で撮影した。
悪性神経膠腫試料中のHCMVのポリメラーゼ連鎖反応PCR)検出を示す。レーン1:100bpラダー、レーン2−E:MG試料;レーン4:MGサンプル4+100bpラダー;レーンF:陰性対照(DNA鋳型なし)。
CMVについて血清陽性および血清陰性である被験体での自己リンパ球移植ALT)を伴う若しくは伴わない治療的TMZ誘発性リンパ球減少症からの回復の間のCMV pp65−LAMPRNAを負荷したDCを使用する新たに診断されたGBMを伴う被験体のワクチン接種プロトコル図解を示す。
CMV pp65 RNAを負荷したDCで処置した新たに診断されたGBMを伴う患者の腫瘍増殖停止期間を示すグラフである。GBMを伴う13例の患者を、CMV pp65を標的とするDCワクチンで処置した。腫瘍増殖停止期間は既存対照被験者と比較して好都合である(P=0.0008)。
CMV pp65 RNAを負荷したDCワクチンで処置したGBMを伴う患者の全体生存を示すグラフである。
GBMを伴う33女性被験体のpp65 RNAを負荷したDCワクチン接種の間のほぼ完全なX線検査応答を示す磁気共鳴画像MRI)である。
CMV pp65に対する多機能細胞応答分析を示す。CMV血清陽性ドナーからの末梢血単核細胞(PBMC)をCMV pp65ペプチド混合物でin vitroで刺激し、そしてHIVワクチン試験ネットワーク免疫学的モニタリング中央検査室(Immunologic Monitoring Core Laboratory of the HIV Vaccine Trials Network)で、検証済みの11色多色フローサイトメトリー分析を使用して分析した。機能的およびブール型ゲーティングソフトウェアを使用して多機能T細胞(複数のサイトカイン分泌しかつグランザイム活性マーカーCD107aを表示する)の比率を決定した。多機能免疫応答は、HIV感染を伴う進行者(progressor)を非進行者(non−progressor)から識別することが示されており、また、特定の1サイトカインを分泌する細胞の絶対数若しくはパーセンテージよりもウイルス感染の免疫保護とより良好に相関した。
pp65mRNAパルスした自己樹状細胞を用いるワクチン接種を受領する新たに診断されたGBMを伴う患者でのpp65抗体応答の増大を示すグラフである。左の図は、組換えpp65タンパク質で被覆されたビーズへのpp65特異的モノクローナル抗体標準曲線結合を示す。右図は、組換えpp65で被覆されたビーズへの患者の血清希釈中に存在する抗体の特異的結合を示す。ワクチン前血清は、低力価のpp65特異的抗体、およびワクチン#5で増大する力価(抗ヒトIgG蛍光抗体での検出後の平均倍数増大(mean fold increase)(MFI)として示される)、ならびにワクチン#9によるさらなる増大を含有する。さらに、これらの応答はテモゾロミド周期の間に誘導され、同時の化学療法投与の間の強力な体液性応答を誘発する能力を示す。
pp65 mRNAでパルスした自己樹状細胞でのワクチン接種を受領する新たに診断されたGBMを伴う患者での遅延型過敏性(DTH)応答の増大を示す棒グラフである。pp65および対照抗原破傷風およびカンジダ)に対しワクチン接種前および後に陽性のDTH応答(10mm2以上)を示す患者の比率を左に示し;ならびに、ワクチン接種の前および後の皮膚紅斑面積を右に示す。さらに、これらの応答はテモゾロミドの周期の間に誘発され、同時の化学療法投与の間の細胞性DTH応答を誘発する能力を示す。
蛍光標示細胞分取(FACSプロファイルである。PBMCからの非接着細胞を、抗CD3被覆プレートを使用してin vitroで72時間刺激し、そして収集し、洗浄し、そして下の実施例10および11に記述されるとおり緑色蛍光タンパク質(GFP)若しくはCXCケモカイン受容体2(CXCR2)をコードするRNA(106細胞あたり2μgのRNA)で電気穿孔した。細胞を培地AIM−V培地、2%AB血清、hIL−2[100U/ml])中で48時間培養し、洗浄し、そしてアロフィコシアニンAPC)結合CXCR2特異的モノクローナル抗体の投与およびフローサイトメトリーによりGFP発現およびCXCR2について分析した。上:GFP(上左)およびCXCR2(上右)の未トランスフェクトT細胞発現。下:GFP RNAでの電気穿孔後のGFP発現(下左)およびCXCR2 RNAでの電気穿孔後のCXCR2発現(下右)。本実験は類似の結果を伴い2回反復した。
FACSプロファイルである。HLA−A2陽性ドナーからのPBMCを、HLA−A2拘束性pp65ペプチド(N9V)でパルスした自己DCで7日間刺激し、収集し、そしてGFP RNAで電気穿孔した。48時間後にGFP発現をN9V四量体陽性およびN9V四量体陰性CD8+ T細胞で検査した。左:芽球様リンパ球(R1;上)およびCD8+ T細胞(R2;下)上でのゲーティング。中:対照RNA(CXCR2)でトランスフェクトした細胞でのGFP発現なし。右:四量体染色(リンパ球(R1)およびCD8+細胞(R2)でゲートされる)(下右)により示されるところのpp65特異的T細胞からほぼ完全になる、24.57%のCD8+ T細胞でのGFP発現(上右)。
GFP発現細胞のパーセンテージおよびFACSプロファイルを示すグラフである。(A)DCで刺激されたRNAでトランスフェクトしたT細胞でのGFP発現のキネティクス。PBMCを、下の実施例10および11に記述されるところのpp65 mRNAでパルスした自己DCでin vitroで11日間刺激した。細胞を収集しかつGFP RNA(2μg/106細胞)でトランスフェクトした。四量体陽性(HLA−A2B)および四量体陰性細胞でのGFP発現を、電気穿孔24時間後に開始して評価しかつ電気穿孔後第7日までモニターした。(B)分取したGFP RNAでトランスフェクトしたT細胞の増殖。PBMCは材料および方法に記述されるとおりpp65 mRNAでパルスした自己DCでin vitroで11日間刺激した。細胞を収集しかつGFP RNA(2μg/106細胞)でトランスフェクトした。48時間後に細胞をGFP発現(GFP+およびGFP−)に基づきフローサイトメトリーにより分取し、そして高用量のIL−2を含む培地に戻し入れた。細胞の増殖をトリパンブルー染色および3〜4日ごとの細胞のアリコート計数により評価した。本実験を別のドナーからのPBMCを用いて反復し、類似の結果を伴った。(C)HLA−A2およびHLA−B7拘束性pp65特異的T細胞の四量体分析。四量体の一団を使用して、四量体により検出可能なpp65に対する1種類以上のハプロタイプ拘束性T細胞反応性を伴う患者を同定した。左:GFP−画分中のHLA−A2およびHLA−B7 pp65特異的T細胞の頻度。右:GFP画分中の四量体陽性細胞の頻度。(D)RNA電気穿孔によるCMV抗原特異的CD4 T細胞の単離。pp65 RNAでパルスしたDCで刺激したPBMCを前述されたとおり生成し、そしてDC刺激後第11日にGFP RNAで電気穿孔した。細胞をGFP+およびGFP−画分に分取し、そして48時間後に抗原なし、SEB(1Bg/ml)若しくはCMV pp65ペプチド混合物(Beckman Coulter)への曝露後のIFN−B産生について細胞内サイトカインフローサイトメトリーにより分析した。左:GFP−CD4+ T細胞中のIFN−Bの発現。右:GFP+CD4+ T細胞中のIFN−B。
FACSプロファイルである。RNA電気穿孔後のpp65特異的T細胞中のCXCR2の選択的発現。PBMCを、実施例10および11に記述されるとおりpp65 mRNAでパルスした自己DCでin vitroで11日間刺激した。細胞を収集しかつCXCR2 RNA(2μg/106細胞)でトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、そして四量体陽性(HLA−A2拘束性ドナー)および四量体陰性CD8+細胞でのCXCR2発現について分析した。CXCR2の活性化されたCD8+ T細胞中の基礎発現はおよそ10%であった(データは示されない)。結果は、RNA電気穿孔が、四量体陽性細胞の49.1%での発現を伴い、CMV特異的T細胞のみで増大されたCXCR2発現をもたらした一方、基礎を上回る発現の増大はDC刺激後四量体陰性細胞で観察されなかったことを示した。
グラフである。(A)CXCR2およびGFP RNAでトランスフェクトしたT細胞のIL−8へのin vitro走化性。PBMCを、実施例10および11に記述されるとおり固定した抗CD3抗体媒介性刺激を使用してin vitroで活性化した。細胞を収集しかつCXCR2若しくはGFP RNA(2μg/106細胞)でトランスフェクトした。48時間後に細胞を収集し、計数し、そして実施例10および11に記述されるとおりフィルターチャンバー培養プレート三重で入れた。増大する濃度のIL−8に応答しての未トランスフェクト、GFP RNAでトランスフェクト、およびCXCR2 RNAでトランスフェクトしたT細胞の移動を、下チャンバー中の示される濃度のIL−8の存在下で45分の培養後に評価した。結果は、未トランスフェクトおよびGFP RNAでトランスフェクトした細胞に比較してのCXCR2 RNAでトランスフェクトしたT細胞の高められた走化性応答を示した(*p<0.05;t検定)。本実験を数回反復し同一の結果を伴った。(B)CXCR2およびGFP RNAでトランスフェクトしたT細胞のGRO−αへのin vitro走化性。細胞は、フィルターチャンバープレートの下チャンバー中の増大する濃度のGRO−αに対して上述されたとおりアッセイした。CXCR2でトランスフェクトしたT細胞はGRO−αに応答して有意に増大された走化性活性を表した一方、GFP RNAでトランスフェクト、および未トランスフェクトのT細胞はGRO−αに応答しての移動の有意の変化を示さなかった(*p<0.05;t検定)。(C)CXCR2およびGFP RNAでトランスフェクトしたT細胞のUL146へのin vitro走化性。細胞は、フィルターチャンバープレートの下チャンバー中の増大する濃度のCMVに分泌されるケモカインUL146に対して上述されたとおりアッセイした。CXCR2でトランスフェクトしたT細胞はUL146に応答して顕著に増大された走化性活性を表した一方、GFP RNAでトランスフェクト、および未トランスフェクトのT細胞はUL146に応答しての移動の変化を示さなかった(**p<0.01;t検定)。
グラフおよびFACSプロファイルである。(A)CXCR2 RNAでトランスフェクトしたT細胞の腹腔中への移動。PBMCを、下の実施例10および11に記述されるとおりpp65 mRNAでパルスした自己DCでin vitroで11日間刺激した。細胞を収集しかつCXCR2 RNA(2Bg/106細胞)でトランスフェクトした。48時間後に、未トランスフェクトおよびCXCR2 RNAでトランスフェクトした細胞を収集し、そしてCFSE(未トランスフェクト細胞について1μM、およびCXCR2 RNAでトランスフェクトした細胞について10BM)でPBS中5分間示差的に標識し、洗浄し、混合し、そしてSCIDマウスに静脈内注入した(マウスあたり2×107細胞、群あたりn=3)。マウスに、PBSのみ、若しくはPBS中1μg/mlのケモカイン(GRO−α、IL−8若しくはUL146)を、T細胞の注入後24時間、8時間ごとに腹腔内注入した。殺した後に腹腔洗浄によりリンパ球を収集しかつ遠心分離し、そして未トランスフェクトおよびCXCR2 RNAでトランスフェクトした細胞の相対的蓄積をフローサイトメトリー分析により評価した。PBS処置動物のCFSEhigh細胞(CXC2 RNAでトランスフェクトしたT細胞)およびCFSElow細胞(未トランスフェクトT細胞)の蓄積を、サイトカイン処置動物の細胞の蓄積との比較のための基礎として使用した。データはPBS処置動物と比較しての倍数変化として表す。(B)CXCR2 RNAでトランスフェクトしたT細胞のCNSへの移動。PBMCは、実施例10および11に記述されるとおりpp65 mRNAでパルスした自己DCでin vitroで11日間刺激した。細胞を収集しかつCXCR2 RNA(2μg/106細胞)でトランスフェクトした。48時間後に、未トランスフェクト、およびCXCR2 RNAでトランスフェクトした細胞を収集しかつCFSE(5μM)でPBS中5分間標識し、洗浄し、そしてSCIDマウスに静脈内注入した(マウスあたり1×107細胞、群あたりn=3)。麻酔したマウスにその後、右頭頂葉を介してCMVのケモカインUL146(5μl PBS中1μg)を、および左頭頂葉を介してPBSのみを注入した。右および左頭頂葉でのCFSE標識細胞の蓄積を6時間後に大脳半球切開および頭頂葉からの単細胞消化調製後にフローサイトメトリーにより評価した。CXCR2 RNAでトランスフェクトしたT細胞を注入したマウスの代表的フローサイトメトリードットプロットは、CXCR2リガンドUL146を注入した右頭頂葉内のリンパ球のより多い蓄積を示す。(C)CXCR2でトランスフェクトしたT細胞のin vitro移動。右(UL146注入)および左(PBS注入)頭頂葉内のT細胞の蓄積をフローサイトメトリーにより評価し、そして100,000事象あたりのヒトT細胞をプロットした。結果は、UL146に応答してのCNS内のCXCR2 RNAでトランスフェクトしたT細胞の有意の蓄積を示した一方、未トランスフェクトT細胞はいかなる優先的蓄積も表さなかった(*p<0.05;t検定)。
GBMを伴う患者の末梢血および腫瘍からのCMV gB(UL55)DNAの増幅を示す電気泳動ゲルである。A:レーン1:100bp DNAラダー;レーン2−12:腫瘍の初回切除時点で採取された新たに診断されたGBMを伴う11例の患者からの末梢血サンプルは、11例の患者のうち6例でウイルスDNAの強い検出、および11例の患者のうち3例で適切な大きさの弱いバンドを示す。B:レーン1:100bp DNAラダー;レーン2−F:高悪性度星状細胞腫を伴う14例の患者(11例GBM、3例AA)からのGBM腫瘍サンプルは、14例の患者のうち11例で適切な大きさの明瞭なバンドを示す。レーン4は、増幅されたバンドとの整列のため100bp DNAラダーをサンプルと混合している。
GBM患者血清からのHCMV gp64リアルタイムPCRの融解曲線グラフである。
GBM患者血清からのHCMV gp64リアルタイムPCRのPCR増幅周期グラフである。
配列相同性を示す。22種の新たに切除したGBM試料からの増幅されたgB(UL55)DNAを、デュークDNA配列決定中核施設(Duke DNA Sequencing Core Facility)で実施されたDNA配列決定により評価した。配列アライメントはVectorNTI Advance 10(Invitrogen、カリフォルニアカールバッド)を使用して実施した。同定されたCMV株に対する相同性をNCBI DNAデータベースBLASTにより評価した。サンプル間の配列変動の領域を青色で示し、ヌクレオチドの差違を白色で強調している。黄色は全22種の試料全体の保存された同一性を示す。白色および青色は配列変動の領域を示す。

0024

[発明の詳細な記述]
発明者は、CMV抗原を発現する細胞を、例えばワクチンを必要とする免疫療法を包含するCMV特異的免疫学的技術を使用して標的とし得ることを発見した。本発明は、限定されるものでないがCMV抗原を発現する細胞に対する診断薬および治療薬のための組成物、方法およびキットの開発に応用可能である。

0025

I.定義
「免疫応答」という用語は、本明細書で、抗原若しくは抗原決定基に対する免疫系によるいかなる応答も指す。例示的免疫応答は、体液性免疫応答(例えば抗原特異的抗体中和若しくは別のもの)の産生)および細胞媒介性免疫応答(例えばリンパ球増殖)を包含する。

0026

II.方法および組成物
一局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供する。該方法は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を該被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する。

0027

CMV抗原を発現する細胞はいかなる種類の細胞でもあり得る。該細胞は、癌細胞、前癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発生する素因となる細胞型を特徴とすることができる。癌は、限定されるものでないが脳癌(例えば神経膠腫)、肺癌肝癌、子宮頚癌、軟組織肉腫内分泌腫瘍造血癌、黒色腫膀胱癌乳癌膵癌前立腺癌結腸癌および卵巣癌を挙げることができる。癌は良性若しくは悪性もまた特徴とし得る。一態様において、癌は高悪性度神経膠腫である。別の態様において、高悪性度神経膠腫は多形神経膠芽腫、未分化星状細胞腫若しくは乏突起神経膠腫である。

0028

一般に、免疫応答は、体液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答若しくは双方を包含し得る。例えば、MHCIIタンパク質が関わる免疫学的経路若しくは直接B細胞刺激による抗原提示は体液性応答を生じ得;また、MHC Iタンパク質が関わる経路により提示される抗原は免疫系の細胞アームを誘導し得る。

0029

体液性応答は、製薬学的に許容できる組成物を受領する被験体からの血清サンプル中の抗体レベル標準イムノアッセイにより測定し得る。細胞性免疫応答はT細胞が関わる応答であり、そしてin vitro若しくはin vivoで測定し得る。例えば、一般的細胞性免疫応答は、製薬学的に許容できる組成物の投与後適切な時点で被験体からサンプリングした細胞(例えば末梢血白血球(PBL))中のT細胞増殖活性として測定し得る。例えばPBMCの刺激物質との適切な時間のインキュベーション後に[3H]チミジン取り込みを測定し得る。増殖しているT細胞のサブセットはフローサイトメトリーを使用して測定し得る。T細胞の細胞傷害性(CTh)もまた測定し得る。

0030

一態様において、誘発される免疫応答は、腫瘍性疾患若しくはそれに伴う症状、具体的にはCMVに関連する癌の予防的若しくは治療的処置に十分である。従って、製薬学的に許容できる組成物の有益な影響は、一般に少なくとも部分的に免疫媒介性であることがで
きるとは言え、免疫応答は、本明細書に記述される組成物および方法が本発明の範囲内にあるために確実に示される必要はない。

0031

ヒトおよびヒト以外の脊椎動物の双方に投与することを本発明の範囲内で企図している。獣医学の応用もまた企図している。一般に、被験体は免疫応答を誘発し得るいかなる生存生物体でもある。被験体の例は、限定されるものでないが、ヒト、家畜イヌネコ、マウス、ラットおよびそれらのトランスジェニック種を挙げることができる。

0032

被験体は腫瘍性疾患(例えば腫瘍)を有し得るか、若しくは腫瘍性疾患を発症する危険にさらされていることができるかのいずれかである。被験体は、臨床基準、例えば臨床で測定可能な腫瘍を表す進行腫瘍性疾患若しくは高腫瘍負荷を伴うものを特徴とし得る。臨床で測定可能な腫瘍は(例えば触診、MRI、CATスキャンX線により)腫瘍体積に基づき検出し得るものである。従って、例えば、本発明の製薬学的に許容できる組成物は、それらの状態を緩和するという目的を伴い進行疾患を伴う被験体に投与し得る。好ましくは、腫瘍体積の減少は本発明の製薬学的に許容できる組成物を投与することの結果として発生するが、しかしいかなる臨床的改善も利益を構成する。臨床的改善は、例えば低下された危険性若しくは進行速度、または腫瘍の病理学意義の低下を包含する。

0033

別の例として、被験体は、癌の病歴を有しかつ別の治療様式応答性であったものであり得る。該他の治療は、例えば外科的切除、放射線治療、化学療法、およびそれにより該他の治療の結果として被験体が臨床で測定可能な腫瘍を呈しない他の様式の免疫療法を包含していたかもしれない。しかしながら、該被験体は元の腫瘍部位の近くで若しくは転移によるかのいずれかで癌の再発若しくは進行の危険にさらされていることが決定されるものであり得る。こうした被験体は高リスクおよび低リスク被験体とさらに分類し得る。該細分は初期治療の前若しくは後に観察される特徴に基づき行い得る。これらの特徴は臨床の技術分野で既知であり、そして各異なる癌について適して定義されている。高リスクサブグループの典型的な特徴は、腫瘍が隣接組織侵襲したか若しくはリンパ節の関与を示すものである。従って、例えば、本発明の製薬学的に許容できる組成物は、主に再発に対する予防的措置として抗癌応答を誘発するため被験者に投与し得る。好ましくは、該組成物を投与することは癌の再発を遅らせるか、若しくは、より好ましくは再発のリスクを低減する(すなわち治癒率を向上させる)。こうしたパラメータは他の患者集団および他の治療様式と比較して決定し得る。

0034

該製薬学的に許容できる組成物は適切であるいずれの時点でも投与し得る。例えば、該投与することは、腫瘍負荷を有する被験体の伝統的治療の前若しくは間に実施し得、そして該腫瘍が臨床で検出不可能になった後に継続し得る。該投与することは再発の徴候を示す被験体でもまた継続し得る。

0035

該製薬学的に許容できる組成物は、治療的若しくは予防的有効量で投与し得、該製薬学的に許容できる組成物は、単独でまたは1種若しくはそれ以上の他の抗原と組合せのいずれかで最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる。本発明の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することは、既知の手順を使用して、および所望の効果を達成するのに十分な投薬量でかつ時間実施し得る。例えば、該製薬学的に許容できる組成物の治療的若しくは予防的有効量は、被験体の齢、性および重量のような因子に従って変動し得る。投与計画は、治療若しくは予防効果を提供する免疫応答を包含する所望の免疫応答を誘発するように当業者により調節し得る。

0036

該製薬学的に許容できる組成物は、いずれかの適する部位、例えば原発腫瘍遠位若しくは近位である部位で被験体に投与し得る。投与経路は、非経口筋肉内、皮下、皮内、腹腔内、内、静脈内(留置カテーテルを介してを包含する)、輸入リンパ管を介して、
若しくは処置される腫瘍性疾患および被験体の状態を鑑みて適するいずれかの他の経路によることができる。好ましくは、用量は、それが免疫応答または腫瘍性疾患および/若しくはそれに伴う症状の予防的若しくは治療的処置を誘発する場合は、所望の応答をもたらす際に有効な量および時間で投与することができる。

0037

該製薬学的に許容できる組成物は、被験体で免疫応答をまた誘発する治療を包含する他の治療の後、それに先行して、若しくはそれと同時期に与えることができる。例えば、被験体は、化学療法(例えばテモゾロミドのようなアルキル化剤により)、放射線治療、および他の形態の免疫療法により事前に若しくは同時に処置してもよく、こうした他の治療は、好ましくは、本発明の組成物の免疫原性を妨害しないような方法で提供される。

0038

投与することは、医療提供者(例えば医師獣医師)により適正に時刻を設定することができ、そして、被験体の臨床状態、投与することの目的、および/またはまた企図している若しくは投与されている他の治療に依存し得る。いくつかの態様において、初回用量を投与し得、そして被験体を免疫学的若しくは臨床いずれかの応答、好ましくは双方についてモニターし得る。免疫学的モニタリングの適する手段は、レスポンダーとして患者の末梢血リンパ球(PBL)および刺激物質として腫瘍細胞を使用することを包含する。免疫学的反応は投与の部位の遅延性炎症反応によってもまた決定し得る。初回用量後の1若しくはそれ以上の用量を、所望の効果が達成されるまで適切なように、典型的には月1回、月2回、若しくは好ましくは週1回与えることができる。その後、付加的な追加免疫若しくは維持用量を、必要とされるとおり、具体的には免疫学的若しくは臨床的利益が低下したようである場合に与えることができる。

0039

A.CMV抗原
一態様において、該最低1種のCMV抗原は、CMV遺伝子によりコードされるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントである。上で示されたとおり、本明細書で使用されるところの「CMV」という用語は、動物、例えばヒトおよびサルのような哺乳動物を感染させるウイルスのいかなる株も包含する。ヒトを感染させるCMVの株は典型的にヒトCMV(HCMV)と呼称される。HCMVからのORFおよび/若しくはそれらの対応するポリペプチドは、例えばCheeら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.,154:125(1990)およびSpaeteら、J.General Virology,74:3287(1994)(それらのそれぞれはこうしたポリペプチドおよびそれらの命名法のそれらの教示について引用することにより本明細書に組み込まれる)により記述されるところの命名法を使用して言及することができる。CMVからのこうしたリーディングフレームおよびポリペプチドへの言及は、いずれかの天然に存在するCMV株中の配列、およびこうした株に対する突然変異ならびにスプライスバリアントを包含する多様な株で見出される対応する配列および位置ホモログ(positional homolog)もまた言及することができる。

0040

限定されるものでないが、HCMV AD169(American Type Culture Collection(ATCC)#VR538)、HCMV Towne(ATCC# VR 977)、HCMV Davis(ATCC# VR 807)、HCMV Toledo(Quinnanら、Ann.Intern.Med.,101:478−83(1984))、サルCMV Rh68.1(ATCC# VR 677)、サルCMVCSG(ATCC# VR 706)、ラットCMV Priscott(ATCC# VR 991)、およびマウスCMV Smith(ATCC# VR 1399)を挙げることができる多様な株のCMVの遺伝子配列ならびにORFおよびコードされるポリペプチドが当該技術分野で既知である。別の一例として、HCMV
AD169株の遺伝子およびポリペプチド配列情報はGENBANK受託番号BK000394.2およびX17403.1(それらのそれぞれはそっくりそのまま引用するこ
とにより本明細書に組み込まれる)によってもまた記述されている。また、1種のCMV株(例えばHCMV AD169株)に対応する既知の配列情報を使用して、別のCMV株の遺伝子およびポリペプチドの配列情報を決定し得る。例えば、共通の進化起源、構造/機能を共有しかつその産物が最低約20%のアミノ酸配列同一性、具体的には約20ないし約100%、約30ないし約90%、約40ないし約80%、約50ないし約70%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を包含するホモログを決定し得る。ホモログは、BLASTのようなコンピュータプログラムを使用する相互との核酸若しくはアミノ酸配列の比較のような当該技術分野で既知の方法により、または配列間の予め決定された量のミスマッチを検出するよう設計されている緊縮性下のハイブリダイゼーションにより同定し得る。また、ホモログに基づく配列情報を、特定の1単離物を単離しかつ例えばプライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してその配列を特徴付けるのに使用し得る。

0041

いくつかの態様において、最低1種のCMV抗原は、HCMV遺伝子若しくはそのホモログのオープンリーディングフレーム(ORF)によりコードされるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントである。一態様において、該ポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントは、GENBANK受託番号BK000394.2若しくはX17403.1により示されるCMV株に対応する遺伝子によりコードされる。

0042

他の態様において、最低1種のCMV抗原は、リンタンパク質unique long
83(ppUL83;pp65として知られる)、糖タンパク質UL55(gpUL55;gBとして知られる)、UL123前初期(immediate early)1(IE1)タンパク質、UL122 IE2タンパク質、UL111A(mtrIIとして知られる)、US28、ppUL32、ppUL65、ppUL80a、ppUL82、ppUL98a、ppUL99、gpUL4(gp48として知られる)、gpUL16、gpUL18(MHCとして知られる)、gpUL75(gHとして知られる)、gpUL100、gpUL110(gMとして知られる)、gpUL115(gLとして知られる)、pUL46、pUL48、pUL56、pUL86(MCPとして知られる)、糖タンパク質unique short 10(gpUS10)、gpUS11、糖タンパク質複合体(glycoprotein complex)II(gcII)、gp65およびgp93よりなる群から選択されるポリペプチド若しくはその免疫原性フラグメントに対応する。

0043

一態様において、該最低1種のCMV抗原はCMVの同一抗原若しくは異なる抗原からの1個若しくはそれ以上のエピトープに対応するアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの態様において、該1個若しくはそれ以上のエピトープは単一MHCクラスIハプロタイプに拘束される若しくは拘束されないことを特徴とし得る。他の態様において、該1個若しくはそれ以上のエピトープは、人種的起源若しくは民族性に関係なく一般集団の最低約5%、具体的には一般集団の最低約5、10、20、30、40、50、60、70、80、90および100%の適用範囲を提供するのに十分な数のMHCクラスI分子に特異的である。当業者は、HLA特異性実験を使用して、いずれかの所定の集団の適用範囲を提供するのに必要とされる個々のHCMV細胞傷害性Tリンパ球(CTL)エピトープの数を決定するための立場に容易にあることができる。場合によっては、該1個若しくはそれ以上のエピトープは、HLAスーパータイプ特異性をさらに表し、かつ/または被験体におけるTヘルパー機能を助長するのに十分な1個若しくはそれ以上のCD4+決定基を含んでなる。

0044

CMVエピトープの例は、限定されるものでないが、Trivediら、Blood,105:2793(2005)および米国特許出願公開第2005/0019344号明細書(それらのそれぞれはCMVエピトープのそれらの教示について引用することにより
本明細書に組み込まれる)により記述されるところのアミノ酸配列を含んでなるペプチドを挙げることができる。一態様において、該最低1種のCMV抗原は、配列番号1、2若しくは3のアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド若しくはその抗原フラグメントである。

0045

別の態様において、該最低1種の抗原はドミナントHLAアレルにより拘束されている1個若しくはそれ以上のCMVCTLエピトープを含んでなる。例えば、ワクチン戦略は、例えば複数のペプチドを混合することにより、または、あるいは、組換え若しくは合成ポリエピトープポリペプチド構築するために融合し得る最小CTLエピトープを使用することにより、CMVで誘発されるCTL応答により認識されることが既知の免疫優性エピトープ模倣する合成ペプチドの製剤(formulation)を用いるCD8+
T細胞レパートリーの生成を必要とし得る。また、潜在性抗原からのCTLエピトープに基づくワクチン設計は、CMVで形質転換された潜伏感染細胞に向けることができ、ならびに、CMVウイルスで誘発される状態に対するそれらの増大された感受性によりCMV血清陰性移植レシピエントでもまた使用し得る。

0046

他の態様において、該最低1種の抗原はペプチドのプールに対応する。一態様において、該ペプチドのプールは最低約8merのアミノ酸配列、具体的には約8merないし約30mer、約9merないし約25mer、約10merないし約20mer、約11merないし約18mer、約12merないし約16mer、および約13merないし約15merを含んでなり、該ペプチドの配列は最低約6アミノ酸オーバーラップ、具体的には約6ないし約20、約7ないし約19、約8ないし約18、約9ないし約17、約10ないし約16、および約11ないし約14アミノ酸のオーバーラップを有し、ペプチドの該プールは、HCMVタンパク質の最低約10%、具体的にはHCMVタンパク質の約10ないし約100%、約20ないし約90%、約30ないし約80%、約40ないし約70%、および約50ないし約60%を包括する。

0047

一態様において、該HCMVタンパク質はIE−1タンパク質(例えばHCMV株AD169のIE−1タンパク質;例えばSwiss−Prot受託番号P13202(そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい)である。別の態様において、HCMVタンパク質はpp65タンパク質(例えばHCMV株AD169のpp65タンパク質;例えばSwiss−Prot受託番号P06725(そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる)を参照されたい)である。

0048

他の態様において、該ペプチドのプールは、1種若しくはそれ以上のHCMVタンパク質の完全な若しくは実質的に完全な配列を包括する11アミノ酸のオーバーラップの15merアミノ酸配列を含んでなる。いくつかの態様において、該1種若しくはそれ以上のHCMVタンパク質はIE−1タンパク質若しくはpp65タンパク質である。例えば、いくつかの態様において、ペプチドの該プールはPepTivatorTM CMV pp65(Miltenyi Biotec、独国グラードバッハ)若しくはPepTivatorTM CMV IE−1(Miltenyi Biotec、独国グラードバッハ)を含んでなる。

0049

いくつかの態様において、ペプチドエピトープの使用は現在の優良医薬品製造基準cGMP等級製品を製造することをより容易にし得る。従って、いくつかの態様において、本発明はペプチドの該プールを含んでなる免疫原性組成物を提供する。

0050

従って、いくつかの局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する細胞性免疫応答を誘発することが可能な1種若しくはそれ以上の免疫学的に活性のペプチドおよびそれらの機能的バリアントを提供する。例えば、該細胞は、癌細胞、前癌細胞、若し
くはCMVと関連する癌を発症する素因となる細胞型を特徴とし得る。いくつかの態様において、該ペプチドは該細胞を認識しかつ溶解するようヒトCTLに指図することが可能である。こうした免疫学的に活性のペプチドは、MHCクラスI分子と関連して、潜伏若しくは活動性HCMV感染を有する個体のCTLにより認識され得る。

0051

こうしたペプチド(1種若しくは複数)(例えばペプチドの該プール)は、場合によってはアジュバントを含むペプチド(1種若しくは複数)またはリポペプチド(1種若しくは複数)ワクチンの形態で投与しうる。いくつかの態様において、該ペプチド(1種若しくは複数)は、それらの表面上に該プールのペプチドを提示するようにin vitroで処理された自己若しくは同種の抗原提示細胞若しくは樹状細胞の投与を介する細胞ワクチンの形態で投与しうる。別の態様において、T細胞を個体から取り出しかつin vitroで該ペプチド(1種若しくは複数)で処理し得、該生じるCTLを該被験体に自己若しくは同種再注入する。多様な他の態様において、本発明のペプチド(1種若しくは複数)は、ポリヌクレオチドワクチンの形態で被験体に若しくはin vitroでT細胞にもまた投与することができ、適切な発現制御配列の制御下にペプチドフラグメント(1種若しくは複数)をコードするDNAを含有するプラスミド若しくは工作されたウイルスベクターのような1種若しくはそれ以上の適する遺伝子移入ベクターを、被験体に若しくはin vitroでT細胞に投与する。

0052

ペプチドのプールは、例えばKieckerら、Hum Immunol.65:523−36(2204)(ペプチドのプール、およびT細胞を刺激するためにペプチドのプールを使用することのその教示について引用することにより本明細書に組み込まれる)により開示されている。

0053

該最低1種のCMV抗原は当該技術分野で既知の技術を使用する慣例の実験によってもまた決定し得る。例えば、免疫系により認識される特定の1CMV株の抗原決定基をクローン化し得、そしてライブラリーおよび発現ベクターを使用して特徴付け得る。例として、DNAのランダムフラグメントをHCMV DNAのコスミドライブラリーから生成し得る。多様な長さ、例えば長さ約50ないし600bpのフラグメントを選択しかつオープンリーディングフレーム(ORF)発現ベクターにクローン化して、ウイルスゲノム全体若しくは定義される小領域のいずれかを表すORFライブラリーを創製し得る。クローンを単離し、そして、レポーター例えば大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ分子に結合されたCMV配列によりコードされる抗原ペプチドよりなる融合タンパク質の合成について免疫学的にスクリーニングする。動物で生じられた抗CMV血清ならびにヒト過免疫グロブリンコロニースクリーニングに使用し得る。異なる組の抗原融合タンパク質は異なる抗血清により認識され得る。免疫血清との強い反応を示すクローンをCMVゲノム上でマッピングし得、そしてCMV挿入物の配列を決定し得る。融合タンパク質に対する抗体を、対応するCMVタンパク質を同定するためにマウス若しくはウサギで生じさせ得る。

0054

他の態様において、該最低1種のCMV抗原は、1種若しくはそれ以上のシグナル配列、例えば、限定されるものでないがgp96小胞体標的化ペプチドシグナル配列、LAMP−1リソソーム標的化ペプチドシグナル配列などをさらに含んでなる。シグナル配列は、MHCクラスIおよびクラスIIの抗原プロセシングおよび提示を高めることができ、ならびに他の標的化特性を提供し得る。他の態様において、該最低1種のCMV抗原は、担体タンパク質(例えばキーホールリンペットヘモシアニン(KLH))に複合し得るか、若しくは核酸コーディング配列の組換えにより融合タンパク質として合成し得る。

0055

下でさらに具体的に説明されるとおり、該製薬学的に許容できる組成物は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含み得る。

0056

A.核酸
一般に、被験体は核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物をいずれかの非経口経路により接種し得る。例えば、被験体は、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、吸入若しくは筋肉内経路により、または遺伝子銃を使用する微粒子銃により接種し得る。好ましくは、筋組織がポリヌクレオチドの送達および発現の部位となり得る。1用量のポリヌクレオチドを、例えば投与を長期にわたり延長するために複数および/若しくは反復注入により筋中に投与し得る。従って、筋細胞に該最低1種のCMV抗原をコードするポリヌクレオチドを注入し得、そして発現される抗原は、主要組織適合複合体の抗原の状況で筋細胞により提示されて、該最低1種のCMV抗原に対する免疫応答を誘発し得る。

0057

表皮は、例えば直接注入若しくは微粒子銃いずれかによるポリヌクレオチドの送達および発現のための別の有用な部位であり得る。1用量のポリヌクレオチドを、例えば投与することを長期にわたり延長するために複数注入若しくは照射により表皮中に投与し得る。例えば、皮膚細胞に該最低1種のCMV抗原をコードするポリヌクレオチドを注入し得、そして、発現される抗原は、主要組織適合複合体の抗原の状況で皮膚細胞により提示されて、該最低1種のCMV抗原に対する免疫応答を誘発し得る。

0058

被験体は粘膜経路によってもまた接種し得る。ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド含有点鼻薬吸入薬坐剤ミクロスフェア被包化ポリヌクレオチドを包含する多様な方法により、若しくはポリヌクレオチド被覆金粒子を用いる照射により、粘膜表面に投与し得る。例えば、最低1種のCMV抗原をコードする核酸を呼吸器粘膜表面に投与し得る。

0059

注入のための生理的食塩水若しくは微粒子銃のための金粒子のようないかなる適切な生理学的に適合性媒体も、被験体にポリヌクレオチドを導入するのに適する。

0060

1.RNA
いくつかの態様において、該製薬学的に許容できる組成物は最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなり、該核酸はRNAである。RNAは、該最低1種のCMV抗原を提供するアミノ酸鎖の細胞内合成を導くための翻訳可能RNA鋳型を含んでなる。該最低1種のCMV抗原をコードするRNAはまたin vitroで転写、例えば逆転写されてcDNAを産生することもまたでき、このcDNAをその後、所望の場合はPCRにより増幅し得、そしてその後該cDNAをクローン化することを伴い若しくは伴わずにin vitroで転写し得る。該最低1種のCMV抗原をコードするRNAの多数の製造方法が当業者に利用可能である。従って、例えば、慣習的なin vitro転写技術および細菌ポリメラーゼを使用してin vitroで転写されるRNAを製造し得るか、若しくは、in vitroで転写されるRNAを、該最低1種のCMV抗原をコードするクローン化されたDNA配列から合成し得る。

0061

2.DNA
別の態様において、該最低1種のCMV抗原をコードする核酸は、該最低1種のCMV抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するDNAを含んでなる。例えば、該最低1種のCMV抗原をコードするDNAオープンリーディングフレームを有する発現ベクターを含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与し得る。

0062

該最低1種のCMV抗原をコードするオープンリーディングフレームを含んでなるゲノムDNAフラグメントおよび/若しくはcDNAを本発明の方法で使用し得る。cDNAは、当業者に既知の技術を使用して、該最低1種のCMV抗原をコードする上述されたRNAから製造し得る。所望の場合は、DNAを例えば物理断片化により、若しくは好ましくは酵素切断すなわち制限エンドヌクレアーゼの使用により断片化し得る。断片化法は
当業者に公知であり、そして大きさおよび組成の異なるフラグメントを得るために(例えば多様な制限エンドヌクレアーゼ若しくは組合せおよび消化時間の使用により)変動させ得る。該最低1種のCMV抗原をコードするオープンリーディングフレームを有するDNA若しくはそれらのフラグメントは、当該技術分野で既知の方法および試薬により発現ベクターにクローン化し得る。

0063

選択可能なマーカー(例えばアンピシリン)、ならびに好ましくは複製起点(例えばori)および適するプロモーターを有する標準的クローニングベクターを使用し得る。細菌(例えば大腸菌(E.coli))若しくは他の適する宿主をその後該ベクターで形質転換し得、そして形質転換体を標準的手順により培養し得かつプラスミドDNAをクロマトグラフィー若しくは有機分離のような方法により単離し得る。例えば、該オープンリーディングフレームにより発現される該最低1種のCMV抗原をMHCI若しくはIIに向けることができる部位にクローン化するためのプラスミドが利用可能である。免疫応答を誘発するのに使用される発現ベクターおよびそれの使用方法は、米国特許出願公開第20040241140号明細書(免疫応答を誘発するのに使用される発現ベクターおよびそれの使用方法のその教示について本明細書に組み込まれる)に記述されている。

0064

細胞(例えば筋細胞、樹状細胞のような抗原提示細胞(APC)、マクロファージなど)により取り込まれる場合、DNA分子は細胞中で染色体外分子として存在し得かつ/若しくは染色体に組込み得る。DNAは、別個遺伝子材料として留まることができるプラスミドの形態で細胞に導入し得る。あるいは、染色体に組込み得る直鎖状DNAを細胞に導入し得る。場合によっては、DNAを細胞に導入する場合に、染色体へのDNA組込みを促進する試薬を添加し得る。

0065

従って、好ましくは、DNAはオープンリーディングフレームの発現に必要な調節エレメントを包含する。こうしたエレメントは、例えばプロモーター、開始コドン終止コドンおよびポリアデニル化シグナルを包含し得る。加えてエンハンサーを包含し得る。当該技術分野で既知であるとおり、これらのエレメントは、好ましくは、該最低1種のCMV抗原をコードする配列に作動可能に連結されている。それらが投与されるはずである被験体の種で作動可能である調節エレメントを好ましくは選択する。コーディング配列とインフレームの開始コドンおよび終止コドンが好ましくは包含される。

0066

プロモーターの例は、限定されるものでないが、SV40(SV40)、マウス乳癌ウイルス(MMTV)プロモーター、HIV末端反復配列LTR)プロモーターのようなヒト免疫不全ウイルス(HIV)、モロニーウイルス、CMV前初期プロモーターのようなサイトメガロウイルス(CMV)、エプスタイン−バーウイルスEBV)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)からのプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシンヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンおよびヒトメタロチオネインのようなヒト遺伝子からのプロモーターを挙げることができる。適するポリアデニル化シグナルの例は、限定されるものでないがSV40ポリアデニル化シグナルおよびLTRポリアデニル化シグナルを挙げることができる。

0067

DNA発現に必要とされる調節エレメントに加え、他のエレメントもまたDNA分子に包含しうる。こうした付加的なエレメントはエンハンサーを包含する。エンハンサーは上述されたプロモーターを包含する。好ましいエンハンサー/プロモーターは、例えば、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、ならびにCMV、RSVおよびEBVからのもののようなウイルスエンハンサーを包含する。

0068

場合によっては、該DNAは担体若しくは送達ベクターに作動可能に組み込み得る。有用な送達ベクターは、限定されるものでないが、生物分解可能なマイクロカプセル、免疫
刺激性複合体(ISCOM)若しくはリポソーム、およびウイルス若しくは細菌のような遺伝子的に工作された弱毒化生存担体を挙げることができる。

0069

いくつかの態様において、ベクターは、レンチウイルスレトロウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルスアデノ随伴ウイルスワクシニアウイルスバキュロウイルス鶏痘、AVポックス改変ワクシニアアンカラ(MVA)および他の組換えウイルスのようなウイルスベクターである。例えば、ワクシニアウイルスベクターは樹状細胞を感染させるのに使用し得る。

0070

従って、該最低1種のCMV抗原若しくはその免疫原性フラグメントをコードするベクターを、ウイルスベクターを使用して、若しくはDNAの直接導入により、in vivo、ex vivo若しくはin vitroで導入し得る。標的化された組織での発現は、ウイルスベクター若しくは受容体リガンドを用いて、または組織特異的プロモーターを使用することにより、あるいは双方でのように、該トランスジェニックベクターを特定の細胞に標的化することにより遂げることができる。

0071

in vivo若しくはex vivo標的化およびワクチン接種処置に普遍的に使用されるウイルスベクターは、DNAに基づくベクターおよびレトロウイルスベクターである。ウイルスベクターの構築および使用方法は当該技術分野で既知である(例えば、MillerとRosman、BioTechniques,7:980−990,1992を参照されたい)。好ましくはウイルスベクターは複製欠損である。すなわちそれらは標的細胞中で自律的に複製することが不可能である。好ましくは複製欠損ウイルスは最小ウイルス(minimal virus)である。すなわち、それは、ウイルス粒子を産生するためゲノムを被包化するのに必要であるそのゲノムの配列のみを保持する。

0072

DNAウイルスベクターは、限定されるものでないが、単純ヘルペスウイルス(HSV)、パピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス(EBV)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、ワクシニアウイルスなどを挙げることができる弱毒化若しくは欠損DNAウイルスを包含する。特定のベクターの例は、限定されるものでないが欠損ヘルペスウイルス1(HSV1)ベクター(Kaplittら、Molec.Cell.Neurosci.2:320−330,1991;国際特許公開第WO 94/21807号明細書、1994年9月29日公開;国際特許公開第WO 92/05263号明細書、1994年4月2日公開);Stratford−Perricaudetら、(J.Clin.Invest.90:626−630,1992;La Salleら、Science 259:988−990,1993もまた参照されたい)により記述されるベクターのような弱毒化アデノウイルスベクター;および欠損アデノ随伴ウイルスベクター(Samulskiら、J.Virol.61:3096−3101,1987;Samulskiら、J.Virol.63:3822−3828,1989;Lebkowskiら、Mol.Cell.Biol.8:3988−3996,1988)を挙げることができる。ウイルスベクターは商業的にもまた入手可能である。

0073

場合によっては、該DNAは細胞による遺伝子材料の取り込みを改善する試薬とともにもまた提供し得る。例えば、該DNAは、安息香酸エステルアニリドアミジンおよびウレタンよりなる群から選択される取り込み促進剤試薬とともに処方若しくは投与し得る。

0074

B.樹状細胞
当業者は、in vitroで樹状細胞(DC)を生成する能力もまた、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の誘発戦略としての該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸でのDCのex vivo負荷およびDCワクチン
の投与のために本発明により使用し得ることを認識するであろう。前臨床研究は、DCが新規の強力な活性化因子でありかつBおよびTリンパ球で応答を復活させることを示している。

0075

いくつかの態様において、本発明はCMVを発現する細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸をex vivoで負荷した樹状細胞を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与することを含んでなり、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する。

0076

従って、本発明のCMV抗原でプライミングされた抗原提示細胞、およびこれらの抗原提示細胞を用いて生成されるCMV抗原特異的Tリンパ球を、予防的若しくは治療的応用のための免疫調節組成物中で有効成分として使用し得る。下述されるとおり、いくつかの態様において、本発明の抗原でプライミングされた抗原提示細胞を、被験体への養子移入のための細胞傷害性Tリンパ球(CTL)(例えばCD8+若しくはCD4+ CTL)を生成するのに使用し得る。

0077

C.組成物
他の局面において、本発明は、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を提供する。該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合にCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発し得る。本発明の製薬学的に許容できる組成物は、腫瘍性疾患若しくはその症状の予防的若しくは治療的処置のため、とりわけ被験体におけるCMVが関連する癌(例えば腫瘍)を予防若しくは処置するためのワクチン組成物として有用であり得る。

0078

いくつかの態様において、該製薬学的に許容できる組成物は生理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤をさらに含んでなる。処方および投与技術はRemington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.、ペンシルニアイーストン、最新版にもまた見出し得る。

0079

当該技術分野で既知の製薬学的に許容できる担体は、限定されるものでないが滅菌水、生理的食塩水、グルコース右旋糖若しくは緩衝溶液を挙げることができる。希釈剤、安定剤(例えば糖およびアミノ酸)、保存剤湿潤剤乳化剤、pH緩衝剤、粘度を高める添加物などのような剤。好ましくは、媒体若しくは担体は最小限の副作用を生じるか若しくは副作用を生じないことができる。

0080

他の態様において、該製薬学的に許容できる組成物は生理学的に許容できるアジュバントをさらに含んでなる。好ましくは、使用されるアジュバントは増大された免疫原性を提供する。アジュバントは抗原の徐放を提供するものであり得る(例えばアジュバントはリポソームであり得る)か、若しくは、それはそれ自体で免疫原性でありそれにより抗原と相乗的に機能するアジュバントであり得る。例えば、アジュバントは、既知のアジュバント、または核酸の取り込みを促進するか、免疫系細胞を投与の部位に動員するか、若しくは応答するリンパ系細胞免疫活性化を助長する他の物質であり得る。アジュバントは、限定されるものでないが、免疫調節分子(例えばサイトカイン)、油および水乳剤、水酸化アルミニウムグルカンデキストラン硫酸酸化鉄アルギン酸ナトリウム、Bacto−Adjuvant、ポリアミノ酸およびアミノ酸のコポリマーのような合成ポリマーサポニンパラフィン油ならびにムラミルジペプチドを挙げることができる。

0081

一態様において、アジュバントは免疫調節分子である。例えば、免疫調節分子は、組換えタンパク質サイトカイン、ケモカイン、若しくは免疫刺激剤、またはサイトカイン、ケ
モカイン若しくは免疫学的応答を高めるよう設計された免疫調節剤をコードする核酸であり得る。

0082

免疫調節性サイトカインの例は、インターフェロン(例えばIFNα、IFNβおよびIFNγ)、インターロイキン(例えばIL−1、IL−2、IL−3、IL−4、IL−5、IL−6、IL−7、IL−8、IL−9、IL−10、IL−12およびIL−20)、腫瘍壊死因子(例えばTNFαおよびTNFβ)、エリスロポエチン(EPO)、FLT−3リガンド、gIp10、TCA−3、MCP−1、MIFMIP−1α、MIP−1β、Rantes、マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)、顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)ならびに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM−CSF)、ならびに前述のいずれかの機能的フラグメントを包含する。ケモカイン受容体、すなわちCXC、CC、C若しくはCX3Cケモカイン受容体に結合するいかなる免疫調節性ケモカインもまた本発明の文脈で使用し得る。ケモカインの例は、限定されるものでないが、Mip1α、Mip−1β、Mip−3α(Larc)、Mip−3β、Rantes、Hcc−1、Mpif−1、Mpif−2、Mcp−1、Mcp−2、Mcp−3、Mcp−4、Mcp−5、エオタキシン、Tarc、Elc、I309、IL−8、Gcp−2 Gro−α、Gro−β、Gro−γ、Nap−2、Ena−78、Gcp−2、Ip−10、Mig、I−Tac、Sdf−1およびBca−1(Blc)、ならびに前述のいずれかの機能的フラグメントを挙げることができる。

0083

別の態様において、アジュバントは、GM−CSF、G−CSF、IL−2、IL−4、IL−7、IL−12、IL−15、IL−21、TNF−αおよびM−CSFよりなる群から選択されるサイトカインである。いくつかの態様において、アジュバントはフロイント不完全アジュバント(モンタニドISA51)若しくはコリネバクテリウムグラロサム(Corynebacterium granulosum)P40より構成される。

0084

当業者は、これらのアジュバントのいくつかがベクターから発現され得ないことを認識することができ、この場合、該アジュバントは、使用される場合に同時に若しくはいずれかの順序で連続して投与し得る。

0085

当業者は、本発明の方法および組成物が併用療法の一部として、例えば、限定されるものでないが化学療法剤、免疫療法剤、免疫調節剤、抗血管新生剤抗ウイルス剤およびホルモン剤を挙げることができる1種若しくはそれ以上の他の剤を含んでなる方法および/若しくは組成物として使用し得ることを知っている。

0086

抗ウイルス剤の例は、限定されるものでないが、ガンシクロビル(例えばCYTOVENE(R))、バルガンシクロビル(例えばValcyte(R))、ホスカルネット(例えばFOSCAVIR(R))、シドフォビル(例えばVISTIDE(R)、HPMPC)、アデフォビル(例えば、PMEA、PREVEON(R)、HEPSERA(R))、アシクロビル(例えばZOVIRAX(R))、バラシクロビル(例えばVALTREXTM、ZELITREXTM)、ポリアニオン、およびタンパク質キナーゼ阻害剤(例えばビスインドリルレイド(bis−indolylmaleide))を挙げることができる。一態様において、本発明の組成物および方法と組合せで使用される抗ウイルス剤は、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、シドフォビル若しくはホスカルネットである。

0087

他の態様において、該1種若しくはそれ以上の他の剤は、好ましくはCMV抗原発現を高めることにより、好ましくは潜伏感染細胞、好ましくは神経膠腫細胞中のCMV抗原発現を高めることにより、CMV抗原発現を遂げる。一態様において、該1種若しくはそれ以上の剤は、レチノイン酸(RA)、アレムツズマブ(Campath 1H)および免
抑制剤(例えばシクロホスファミドシクロスポリン)よりなる群から選択される。別の態様において、照射および/若しくは免疫除去が本発明の組成物および方法とともに提供される。

0088

多様な態様において、該1種若しくはそれ以上の他の剤は、例えば“Cancer Chemotherapeutic Agents”,American Chemical Society,1995,W.O.Foye編に記述されるとろこの天然に存在する若しくは合成の化学療法剤であり得る。

0089

一態様において、化学療法剤は、場合によっては製薬学的に許容できる塩の形態の、水和物および/若しくは溶媒和物の形態の、ならびに場合によっては個々の光学異性体、個々の鏡像異性体の混合物若しくはそれらのラセミ化合物の形態の、バタラニブ、SU 11248若しくはAZD−6474のような小分子受容体アンタゴニストゲフィニチブエルロチニブ、CI−1033若しくはHerceptinのようなEGFR若しくはHER2アンタゴニスト、ベバシズマブセツキシマブリツキシマブのような抗体、シスプラチンオキザリプラチン若しくはカルボプラチンのようなDNAアルキル化薬ドキソルビシン若しくはエピルビシンのようなアントラサイクリン、5−FU、ペメトレキセドゲムシタビン若しくはカペシタビンのような代謝拮抗剤イリノテカン若しくはトポテカンのようなカンプトテシンパクリタキセル若しくはドセタキセルのような抗癌剤エトポシド若しくはテニポシドのようなエピポフィトキシンボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤、またはセレコキシブ若しくはロフェコキシブのような抗炎症剤よりなる群から選択される。

0090

別の態様において、化学療法剤は、バタラニブ(PTK−787/ZK222584)、SU−5416、SU−6668、SU−11248、SU−14813、AZD−6474、AZD−2171、CP−547632、CEP−7055、AG−013736、IM−842若しくはGW−786034のような小分子VEGF受容体アンタゴニスト、ゲフィニチブ、エルロチニブ、CI−1033若しくはGW−2016のような二重EGFR/HER2アンタゴニスト、イレッサ(iressa)(ZD−1839)、タルセバ(tarceva)(OSI−774)、PKI−166、EKB−569、HKI−272若しくはハーセプチン(herceptin)のようなEGFRアンタゴニスト、BAY−43−9006若しくはBAY−57−9006のようなマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、4−[(3−クロロ−4−フルオロフェニルアミノ]−6−{[4−(N,N−ジメチルアミノ)−1−オキソ−2−ブテン−1イル]アミノ}−7−((S)−テトラヒドロフラン−3−イルオキシキナゾリン若しくは4−[(3−クロロ−4−フルオロフェニル)アミノ]−6−{[4−(ホモモルホリン−4−イル)−1−オキソ−2−ブテン−1−イル]アミノ}−7−[(S)−(テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ]−キナゾリンのようなキナゾリン誘導体、またはそれらの製薬学的に許容できる塩、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、AvastinTM(ベバシズマブ)、IMC−1C11、アービタクス(erbitux)(C−225)、DC−101、EMD−72000、ビタキシン(vitaxin)、イマニチブのような合成小分子に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト、VEGFtrapのような融合タンパク質であるタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤メルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、サトラプラチン(satraplatin)、テトラプラチン(tetraplatin)、イプロプラチン、マイトマイシンストレプトゾシンカルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ブスルファンイホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパクロラムブシルのようなアルキル化剤若しくは白金化合物、メクロレタミンのようなナイトロジェンマスタードエチレンイミン化合物アルキルスルホネートダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、リポソームドキ
ルビシン(ドキシル(doxil))、エピルビシン、イダルビシンミトキサントロンアムサクリンダクチノマイシンディスタマイシン若しくはそれらの誘導体、ネトロプシン、ピベンモール、マイトマイシン、CC−1065、デュオカルマイシンミトラマイシンクロモマイシンオリマイシン、プロパミジン若しくはスチルバミジンのようなフタラニリド(phtalanilide)、アントラマイシン、アジリジンニトロソウレア若しくはその誘導体、シタラビン5−フルオロウラシル(5−FU)、ペメトレキセド、テガフールウラシルウラシルマスタードフルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリンクラドリビンチオグアニンメトトレキセートペントスタチンヒドロキシウレアのようなピリミジン若しくはプリンアナログまたはヌクレオシド二リン酸還元酵素の阻害剤若しくはアンタゴニスト、あるいは葉酸フレオマイシンブレオマイシンまたはそれらの誘導体若しくは塩、CHPP、BZPP、MTPP、BAPP、リブロマイシン、アクリジン若しくはその誘導体、リファマイシンアクチノマイシンアドラマイシン(adramycin)、イリノテカン(カンプトサール(camptosar))若しくはトポテカンのようなカンプトテシン、アムサクリン若しくはそのアナログ、三環カルボキサミド、SAHA、MD−275、トリコスタチンA、CBHA、LAQ824若しくはバルプロ酸のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤、パクリタキセル(タキソール(taxol))、ドセタキセル若しくはタキソテール(taxotere)のような植物からの抗癌剤、ナベルビンビンブラスチンビンクリスチンビンデシン若しくはビノレルビンのようなビンカアルカロイドコルヒチンのようなトロポロンアルカロイド若しくはその誘導体、マイタンシン、アンサマイトシン(ansamitocin)若しくはリゾキシン(rhizoxin)のようなマクロライド、ホモプシン(phomopsin)若しくはドラスタチンのような抗有糸分裂ペプチド、エトポシド若しくはテニポシド、ステガナシンのようなエピポドフィロトキシン若しくはポドフィロトキシンの誘導体、コンブレタスタチン若しくはアンフェチニル(amphetinile)のような抗有糸分裂カルバメート誘導体プロカルバジン、ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤、アスパラギナーゼペグ化アスパラギナーゼ(ペグアスパルガーゼ)のような酵素、または、チミジンホスホリラーゼ阻害剤、エストラムスチン(T−66)若しくはメゲストロールのようなゲスターゲン若しくはエストロゲンフルタミドカソデックス(casodex)、アナンドロン(anandron)若しくはシプロテロン酢酸塩のような抗アンドロゲンアミノグルテチミドアナストロゾールホルメスタン若しくはレトロゾールのようなアロマターゼ阻害剤リュープロレリンブセレリンゴセレリン若しくはトリプトレリンのようなGNrHアナログ、タモキシフェン若しくはそのクエン酸塩ドロロキシフェントリオキシフェンラロキシフェンまたはジンドキシフェン(zindoxifene)のような抗エストロゲン、ICI
164,384若しくはICI 182,780のような17β−エストラジオールの誘導体、アミノグルテチミド、ホルメスタン、ファドロゾールフィナステリドケトコナゾールリュープロリドのようなLH−RHアンタゴニスト、プレドニゾンプレドニゾロンメチルプレドニゾロンデキサメサゾン、ブデノシド、フルオコルトロン若しくはトリアムシノロンのようなステロイドインターフェロンβのようなインターフェロン、IL−10若しくはIL−12のようなインターロイキン、エタネルセプトのような抗TNFα抗体、サリドマイド、そのRおよびS鏡像異性体ならびにその誘導体すなわちレビミド(revimid)(CC−5013)のような免疫調節薬ロイコトリエンアンタゴニストマイトマイシンC、BMY−42355、AZQ若しくはEO−9のようなアジリドキノン(aziridoquinone)、ミソニダゾールNLP−1若しくはNLA−1のような2−ニトロイミダゾールニトロアクリジン、ニトロキノリン、ニトロピラゾロアクリジン、RSU−1069若しくはRB−6145、CB−1954のような「二重機能」ニトロ芳香族、ニトロミン(nitromin)のようなナイトロジェンマスタードのN−オキシド、ナイトロジェンマスタードの金属錯体、抗CD3若しくは抗CD25抗体耐性誘導剤ミノドロン酸若しくはその誘導体(YM−529、Ono−5920、YH−529)、ゾレドロン酸一水和物イバンドロン酸ナトリウム水和
物若しくはクロドロン酸二ナトリウムのようなビホスホネート若しくはその誘導体、メトロニダゾール、ミソニダゾール、ベンズニダゾール若しくはニモラゾールのようなニトロイミダゾール、RSU−1069のようなニトロアリール化合物、SR−4233のようなニトロキシル若しくはN−オキシド、ブロモデオキシウリジンヨードデオキシウリジンのようなハロゲン化ピリミジンアナログ、WR−272 1のようなチオホスフェートポルフィマーフォトフリン(photofrin)のような光化学的に活性化される薬物、ベンゾポルフィリン誘導体フェオホルビド(pheophorbide)誘導体、メロシアニン(merocyanin)540(MC−540)若しくはスズエチオポルプリン(etioporpurin)、オブメルセンのようなant−template若しくはアンチセンスRNA若しくはDNA、アセチルサリチル酸メサラジンイブプロフェンナプロキセンフルルビプロフェンフェノプロフェンフェンブフェンケトプロフェンインドプロフェンピルプロフェンカルプロフェンオキサプロジンプラノプロフェン、ミロプロフェン、チオキサプロフェン、スプロフェンアルミノプロフェン、チアプロフェン酸、フルプロフェン、インドメタシンスリンダクトルメチン、ゾメピラク、ナブメトンジクロフェナク、フェンクロフェナク、アルクロフェナク、ブロムフェナクイブフェナク、アセクロフェナクアセメタシンフェンチアザク、クリダナク、エトドラク、オクスピナク(oxpinac)、メフェナム酸メクロフェナム酸フルフェナム酸、ニフルミン酸、トルフェナム酸ジフルニサル、フルフェニサル、ピロキシカムテノキシカム、ロモキシカム、ニメスリドメロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブのような非ステロイド性炎症薬、若しくは非ステロイド性炎症薬の製薬学的に許容できる塩、細胞傷害性抗生物質アポリズマブ若しくは1D09C3のような癌細胞の表面分子を標的とする抗体、TIMP−1若しくはTIMP−2のようなメタロプロテイナーゼの阻害剤、亜鉛、P53およびRbのような癌遺伝子の阻害剤、ランタニド複素錯体のような希土類元素の錯体、PUVAのような光化学治療剤転写因子複合体ESX/DRIP130/Sur−2の阻害剤、熱ショックタンパク質HSP90調節物質ゲルダナマイシンおよびその誘導体17−アリルアミノゲルダナマイシンすなわち17−AAGのようなHER−2発現の阻害剤、あるいは、IM−842、テトラチオモリブデン酸スクアラミンコムブレスタチン(combrestatin)A4、TNP−470、マリマスタット、ネオバスタット(neovastat)、ビカルタミド、アバレリックス、オレゴボマブ、ミツモマブ、TLK−286、アレムツズマブ、イブリツモマブ、テモゾロミド、デニロイキンジフチトクス、アルデスロイキンダカルバジンフロクスウリジンプリカマイシン、ミトタンピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェンおよびテストラクトンから選択される治療薬よりなる群から選択される。好ましい化合物は、バタラニブ(PTK−787/ZK222584)、SU−5416、SU−6668、SU−11248、SU−14813、AZD−6474のような小分子VEGF受容体アンタゴニスト、CI−1033若しくはGW−2016のようなEGFR/HER2アンタゴニスト、イレッサ(iressa)(ゲフィニチブ、ZD−1839)、タルセバ(tarceva)(エルロチニブ、OSI−774)、PKI−166、EKB−569、HKI−272若しくはハーセプチン(herceptin)のようなEGFRアンタゴニスト、BAY−43−9006若しくはBAY−57−9006のようなマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、Avastin.TM.(ベバシズマブ)、IMC−1C11、アービタックス(erbitux)(C−225)、DC−101、EMD−72000、ビタキシン(vitaxin)、イマニチブ、メルファラン、シクロホスファミド、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、サトラプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、リポソームドキソルビシン(ドキシル(doxil))、エピルビシン、イダルビシンのようなアルキル化剤若しくは白金化合物、シタラビン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ペメトレキセド、テガフール/ウラシル、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、メトトレキサートのようなピリミジン若しくはプリンアナログまたはヌクレオシド二リン酸還元酵素のアンタゴニスト若し
くは阻害剤、パクリタキセル(タキソール(taxol))若しくはドセタキ
セルのような抗癌剤、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン若しくはビノレルビンのようなビンカアルカロイド、ドラスタチンのような抗有糸分裂ペプチド、エトポシド若しくはテニポシドのようなエピポドフィロトキシン若しくはポドフィロトキシンの誘導体、メロキシカム、セレコキシブ、ロフェコキシブのような非ステロイド性炎症薬、アポリズマブ若しくはID09C3のような癌細胞の表面分子を標的とする抗体、または熱ショックタンパク質HSP90調節物質ゲルダナマイシンおよびその誘導体17−アリルアミノゲルダナマイシンすなわち17−AAGを包含する。

0091

別の態様において、化学療法剤は、チューブリン相互作用する若しくはそれを結合する化合物、合成小分子VEGF受容体アンタゴニスト、小分子増殖因子受容体アンタゴニスト、EGF受容体および/若しくはVEGF受容体および/若しくはインテグリン受容体、または合成小分子に分類されないいずれかの他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体の阻害剤、EGF受容体および/若しくはVEGF受容体および/若しくはインテグリン受容体または融合タンパク質であるいずれかの他のタンパク質チロシンキナーゼ受容体に向けられる阻害剤、核酸と相互作用しかつアルキル化剤若しくは白金化合物に分類される化合物、核酸と相互作用しかつアントラサイクリン、DNA挿入剤、若しくはDNA副溝結合化合物を包含するDNA架橋剤に分類される化合物、代謝拮抗剤、天然に存在する、半合成性若しくは合成のブレオマイシン型抗生物質、DNA転写酵素の阻害剤、ならびにとりわけトポイソメラーゼI若しくはトポイソメラーゼII阻害剤クロマチン修飾剤、有糸分裂阻害剤抗有糸分裂剤細胞周期阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素、ホルモン、ホルモンアンタゴニスト、ホルモン阻害剤、ステロイド生合成の阻害剤、ステロイド、サイトカイン、低酸素選択的細胞毒、サイトカイン、リンホカインの阻害剤、サイトカインに向けられる抗体、経口および非経口耐性誘導剤、支持剤(supportive agent)、化学的放射線増感剤および保護剤、光化学的に活性化される薬物、場合によっては修飾若しくは複合されている合成ポリ若しくはオリゴヌクレオチド非ステロイド性抗炎症薬、細胞傷害性抗生物質、癌細胞の表面分子を標的とする抗体、増殖因子若しくはそれらの受容体を標的とする抗体、メタロプロテイナーゼの阻害剤、金属、癌遺伝子の阻害剤、遺伝子転写またはRNA転写若しくはタンパク質発現の阻害剤、希土類元素の錯体、ならびに光化学治療剤よりなる群から選択される。

0092

他の態様において、化学療法剤は、パクリタキセル(タキソール(taxol))、ドセタキセル、ナベルビン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン若しくはビノレルブンのようなビンカアルカロイド、メルファラン、シクロホスファミド、オキサザホスホリン、シスプラチン、カルボプラチン、オキザリプラチン、サトラプラチン、テトラプラチン、イプロプラチン、マイトマイシン、ストレプトゾシン、カルムスチン(BCNU)、ロムスチン(CCNU)、ブスルファン、イホスファミド、ストレプトゾシン、チオテパ、クロラムブシルのようなアルキル化剤若しくは白金化合物、メクロレタミンのようなナイトロジェンマスタード、サリドマイド、そのRおよびS鏡像異性体ならびにその誘導体すなわちレビミド(revimid)(CC−5013)のような免疫調節剤、エチレンイミン化合物、アルキルスルホネート、ダウノルビシン、ドキソルビシン(アドリアマイシン)、リポソームドキソルビシン(ドキシル(doxil))、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、ダクチノマイシン、ディスタマイシン若しくはその誘導体、ネトロプシン、ピベンジモール、マイトマイシン、CC−1065、デュオカルマイシン、ミトラマイシン、クロモマイシン、オリボマイシン、プロパミジン若しくはスチルバミジンのようなフタラニリド(phtalanilide)、アントラマイシン、アジリジン、ニトロソウレア若しくはその誘導体、シタラビン、5−フルオロウラシル(5−FU)、ウラシルマスタード、フルダラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、メルカプトプリン、クラドリビン、チオグアニン、メトトレキサート、ペントスタチン、ヒドロキシウレアのようなピリミジン若しくはプリンアナログまたはヌクレオシド
リン酸還元酵素のアンタゴニスト若しくは阻害剤、あるいは葉酸、アクリジン若しくはその誘導体、リファマイシン、アクチノマイシン、アドラマイシン(adramycin)、イリノテカン(カンプトサール(camptosar))若しくはトポテカンのようなカンプトテシン、アムサクリン若しくはそのアナログ、三環性カルボキサミド、SAHA、MD−275、トリコスタチンA、CBHA、LAQ824、若しくはバルプロ酸のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ボルテゾミブのようなプロテアソーム阻害剤、バタラニブ(PTK−787/ZK222584)、SU−5416、SU−6668、SU−11248、SU−14813、AZD−6474、AZD−2171、CP−547632、CEP−7055、AG−013736、IM−842若しくはGW−786034のような小分子VEGF受容体アンタゴニスト、BAY−43−9006若しくはBAY−57−9006のようなマイトジェン活性化タンパク質キナーゼのアンタゴニスト、ゲフィニチブ、エルロチニブ、CI−1033若しくはGW−2016のような二重EGFR/HER2アンタゴニスト、イレッサ(iressa)(ZD−1839)、タルセバ(tarceva)(OSI−774)、PKI−166、EKB−569、HKI−272若しくはハーセプチン(herceptin)のようなEGFRアンタゴニスト、4−[(3−クロロ−4−フルオロフェニル)アミノ]−6−{[−4−(N,N−ジメチルアミノ)−1−オキソ−2−ブトエン−1−イル]アミノ}−7−((S)−テトラヒドロフラン−3−イルオキシ)−キナゾリン若しくは4−[(3−クロロ−4−フルオロ−フェニル)アミノ]−6−{[4−(ホモモルホリン−4−イル)−1−オキソ−2−ブテン−1−イル]アミノ}−7−[(S)−(テトラヒドロフラン−3−イル)オキシ]−キナゾリンのようなキナゾリン誘導体、またはその製薬学的に許容できる塩、転写因子複合体ESX/DRIP130/Sur−2の阻害剤、熱ショックタンパク質HSP90調節物質ゲルダナマイシンおよびその誘導体17−アリルアミノゲルダナマイシンすなわち17−AAGのようなHER−2発現の阻害剤、アトラセンタン、リツキシマブ、セツキシマブ、AvastinTM(ベバシズマブ)、IMC−1C11、アービタックス(erbitux)(C−225)、DC−101、EMD−72000、ビタキシン(vitaxin)、イマチニブのような合成小分子に分類されないタンパク質キナーゼ受容体アンタゴニスト、ならびにアポリズマブ若しくは1D09C3のような癌細胞の表面分子を標的とする抗体よりなる群から選択される。

0093

いくつかの他の態様において、化学療法剤は、1種若しくはそれ以上のABCトランスポーターにより媒介されるヒアルロナン輸送を低下させる化合物、またはP−糖タンパク質(P−gp)阻害剤分子若しくは阻害剤ペプチドのような薬物輸送阻害剤、MRP1阻害剤、ABCトランスポーターに向けられかつそれを阻害することが可能な抗体、1種若しくはそれ以上のABCトランスポーターに向けられるアンチセンスオリゴマー、iRNA、siRNA若しくはアプタマーである。本発明のP−糖タンパク質(P−gp)阻害剤分子の例は、ゾスキダル(LY 335973)、その塩(とりわけ三塩化物塩)、ならびにその多形、シクロスポリン(cyclosporin)A(シクロスポリン(cyclosporine)としてもまた知られる)、ベラパミル若しくはそのR異性体、タモキシフェン、キニジン、d−αトコフェリルポリエチレングリコール1000サクシネート、VX−710、PSC833、フェノチアジン、GF120918(II)、SDZ PSC 833、TMBY、MS−073、S−9788、SDZ 280−446、XR(9051)ならびにこれらの機能的誘導体、アナログおよび異性体である。

0094

D.養子免疫療法
他の局面において、該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸は、例えば、免疫調節組成物中の有効成分としての使用のためのCMV抗原でプライミングされた抗原提示細胞および/若しくはこれらの抗原提示細胞を用いて生成されるCMV抗原特異的Tリンパ球を提供するための組成物および方法、ならびにCMV抗原を発現する細胞に向けられる予防若しくは治療的応用のための方法もまた提供し得る。

0095

従って、一局面において、本発明は、
最低1種のCMV抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下でin vitroで最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と抗原提示細胞を接触させること
による、CMV抗原でプライミングされた抗原提示細胞の作成方法を提供する。該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸は上述されるとおりである。

0096

該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸は、抗原提示細胞を含んでなる均一な、実質的に均一な若しくは不均一な組成物と接触し得る。例えば、該組成物は、全血新鮮血、若しくは、限定されるものでないが末梢血単核細胞、全血のバフィーコート画分、濃縮赤血球、照射血、樹状細胞、単球、マクロファージ、好中球、リンパ球、ナチュラルキラー細胞およびナチュラルキラーT細胞を挙げることができるそれらの画分を限定されるものでないが包含し得る。場合によっては、抗原提示細胞の前駆細胞を使用する場合、該前駆細胞が抗原提示細胞に分化するのに十分な適する培養条件下で該前駆細胞を培養し得る。好ましくは、該抗原提示細胞(若しくは場合によっては前駆細胞)は、単球、マクロファージ、骨髄球系統の細胞、B細胞、樹状細胞若しくはランゲルハンス細胞から選択される。

0097

抗原提示細胞との接触に置かれるべき最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸の量は、慣例の実験により当業者により決定され得る。一般に、抗原提示細胞は、T細胞の調節のためにプロセシングされた形態の抗原を細胞が提示するのに十分な時間、該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸と接触される。一態様において、抗原提示細胞を、該最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸の存在下で約1週未満、具体的には約1分ないし約48時間、約2分ないし約36時間、約3分ないし約24時間、約4分ないし約12時間、約6分ないし約8時間、約8分ないし約6時間、約10分ないし約5時間、約15分ないし約4時間、約20分ないし約3時間、約30分ないし約2時間、および約40分ないし約1時間インキュベートする。抗原提示細胞が該抗原をプロセシングしかつ提示するのに必要な時間および抗原若しくは該抗原をコードする核酸の量は、例えば、接触の後に洗浄期間、および読み取り系例えば抗原反応性T細胞への曝露が起こるパルスチェイス法を使用して決定し得る。

0098

典型的には、抗原提示細胞がその表面上に抗原を提示するのに必要な時間の長さは、使用される抗原若しくは抗原の形態(例えばペプチド対コーディングポリヌクレオチド)、その用量、および使用される抗原提示細胞、ならびに抗原負荷が始められる条件を包含する多数の因子に依存して変動し得る。これらのパラメータは慣例の手順を使用して当業者により決定され得る。抗原提示細胞のプライミングの効率は、T細胞の細胞傷害活性をin vitroでアッセイすること、若しくはCTLの標的として抗原提示細胞を使用することにより決定し得る。抗原提示細胞の表面上の抗原の存在を検出し得る他の方法もまた本発明により企図している。

0099

抗原提示細胞の内因性プロセシング経路への抗原の多数の送達方法が既知である。こうした方法は、限定されるものでないが、pH感受性リポソームを必要とする方法、強力なアジュバントへの抗原の結合、アポトーシス細胞送達、樹状細胞上へ細胞をパルス(pulse)すること、抗原を含んでなる組換えキメラウイルス様粒子(VLP)を樹状細胞株のMHCクラスIプロセシング経路に送達することを挙げることができる。

0100

一態様において、可溶化CMV抗原を抗原提示細胞とともにインキュベートする。他の
態様において、該最低1種のCMV抗原を細胞溶解素に結合して、MHCクラスI経路への送達のための抗原提示細胞のサイトゾル中への該抗原の移動を高め得る。例示細胞溶解素は、サポニン含有免疫刺激複合体(ISCOM)のようなサポニン化合物ポア形成毒素(例えばαトキシン)、ならびにリスリオリジンO(LLO)、ストレプトリジンOSLO)およびパーフリンゴリジンO(PFO)のようなグラム陽性細菌の天然の細胞溶解素を包含する。

0101

別の例として、他の態様において、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞およびマクロファージを当該技術分野で既知の方法により単離し得、そして、CMV抗原をコードする核酸をAPCに導入するための当該技術分野で既知の方法によりポリヌクレオチドでトランスフェクトし得る。トランスフェクション試薬および方法(例えばSuperFect(R))もまた商業的に入手可能である。例えば、CMV抗原をコードするRNAを適する媒体(例えばOpti−MEM(R))中で提供し得、そしてAPCとの接触前に脂質(例えば陽イオン性脂質)と組合せ得る。脂質の制限しない例は、LIPOFECTINTM、LIPOFECTAMINETM、DODAC/DOPEおよびCHOL/DOPEを包含する。生じるポリヌクレオチド−脂質複合体をその後APCと接触させ得る。あるいは、ポリヌクレオチドを、電気穿孔法若しくはリン酸カルシウムトランスフェクションのような技術を使用してAPCに導入し得る。ポリヌクレオチドを負荷したAPCをその後、in
vivo若しくはex vivoで細胞傷害性Tリンパ球(CTL)増殖を刺激するのに使用し得る。一態様において、ex vivoで増殖させたCTLを養子免疫療法の方法で被験体に投与する。ポリヌクレオチドを負荷した抗原提示細胞のCTL応答を刺激する能力は、既知の方法により、例えば標的細胞を溶解するエフェクター細胞の能力をアッセイすることにより測定し得る。例えばRNAを負荷した抗原提示細胞を使用する方法および組成物は、Nairらへの米国特許第6,306,388号明細書(RNAを負荷したAPCの生成および使用方法のその教示について引用することにより本明細書に組み込まれる)に記述されている。

0102

別の局面において、本発明は、最低1種のCMV抗原が抗原提示細胞により提示されるのに十分な条件下で最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸とin vitroで接触された抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。

0103

別の局面において、本発明は、最低1種のCMV抗原に特異的なリンパ球の製造方法を提供する。該方法は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することが可能なCMV抗原特異的リンパ球を産生するのに十分な条件下で、上述された抗原提示細胞とリンパ球を接触されることを含んでなる。従って、該抗原提示細胞は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための、Tリンパ球およびBリンパ球を包含するリンパ球を提供するのにもまた使用し得る。

0104

一態様において、Tリンパ球の調製物を、抗原提示細胞により提示される最低1種のCMV抗原に対しTリンパ球をプライミングするために、ある期間、好ましくは最低約24時間、上述された抗原提示細胞と接触させる。

0105

例えば、別の態様において、抗原提示細胞の1集団を、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原を含んでなる核酸と一緒末梢血Tリンパ球の不均一な集団と共培養し得る。該細胞は、ある期間、および、CMV抗原若しくはそれらのプロセシングされた形態が該抗原提示細胞により提示されかつ該抗原提示細胞がCMV抗原を発現する細胞に応答するようTリンパ球の1集団をプライミングするのに十分な条件下で共培養し得る。従って、CMV抗原を発現する細胞に応答するようプライミングされているTリンパ球およびBリンパ球を製造し得る。

0106

本明細書に記述されるとおり、免疫応答を表すようにリンパ球を誘導する能力は、限定されるものでないが、CMV抗原特異的細胞溶解性Tリンパ球(CTL)の標的として例えばCMV抗原特異的抗原提示細胞を使用してTリンパ球の細胞溶解活性をin vitroで測定すること;CMV抗原特異的Tリンパ球増殖をアッセイすること;およびCMV抗原を発現する細胞に対するB細胞応答を例えばELISA法を使用して測定することを挙げることができるいずれかの方法により決定し得る。

0107

Tリンパ球は末梢血、およびリンパ節のようないずれかの適する供給源から得ることができる。Tリンパ球は、粗調製物として、または、限定されるものでないが抗体を使用する免疫磁気若しくはフローサイトメトリー技術を必要とする方法を挙げることができる標準的技術により得ることができる部分的に精製された若しくは実質的に精製された調製物として使用し得る。

0108

CMV抗原を発現する細胞の特異的認識のために遺伝子的に改変された細胞(例えばそれらの表面上に細胞特異的抗体を発現するよう遺伝子的に工作されたT細胞)もまた本発明の範囲内で企図している。いくつかの態様において、抗原特異的T細胞を、1種若しくはそれ以上の異種遺伝子、例えばマーカー遺伝子、または遺伝子産物が特定の表現型若しくは機能をを高め得るか若しくは抗原特異的T細胞に賦与し得る遺伝子を発現するように、当該技術分野で既知の遺伝子移入技術により改変する。従って、例えば、抗原でパルスした樹状細胞に応答する活性化T細胞内でマーカー遺伝子を発現させ得、そして抗原特異的T細胞の選択的濃縮および改変を見込み得る。別の例として、抗原特異的T細胞は、in vitroおよびin vivoで受容体のリガンドに向けて移動させるため受容体(例えばケモカイン受容体)を発現するように改変し得る。

0109

他の局面において、本発明は上述された抗原提示細胞若しくはリンパ球、ならびに製薬学的に許容できる担体および/若しくは希釈剤を含んでなる組成物を提供する。いくつかの態様において、該組成物は上述されたところのアジュバントをさらに含んでなる。

0110

別の局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答の誘発方法を提供し、該方法は、免疫応答を誘発するのに十分な有効量の上述された抗原提示細胞若しくはリンパ球を被験体に投与することを含んでなる。いくつかの態様において、本発明は、CMVと関連する腫瘍性疾患若しくは症状の処置若しくは予防方法を提供し、該方法は、有効量の上述された抗原提示細胞若しくはリンパ球を被験体に投与することを含んでなる。一態様において、該抗原提示細胞若しくは該リンパ球は好ましくは注入により全身に投与される。あるいは、例えば組織中に直接注入を介して、好ましくはデポー若しくは徐放製剤で全身よりはむしろ局所に投与し得る。さらに、標的化ドラッグデリバリーリステム、例えば組織特異的抗体で被覆されているリポソーム中で投与し得る。該リポソームは組織に向けられかつ該組織により選択的に取り込まれることができる。別の態様において、本発明は、好ましくは癌を処置若しくは予防するための、CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するための医薬品の製造における該抗原提示細胞若しくは該リンパ球の使用を提供する。

0111

従って、本発明の抗原でプライミングされた抗原提示細胞およびこれらの抗原提示細胞を用いて生成される抗原特異的Tリンパ球を、癌の予防的若しくは治療的応用のための免疫調節組成物中の有効成分として使用し得る。いくつかの態様において、本発明のCMV抗原でプライミングされた抗原提示細胞を、被験体への養子移入のためのCD8+ CTL、CD4+ CTLおよび/若しくはBリンパ球を生成するのに使用し得る。従って、例えば、CMV抗原特異的CTLを、神経膠種のような悪性腫瘍で苦しめられている被験体で治療目的上養子移入し得る。

0112

上述された抗原提示細胞および/若しくはリンパ球は、免疫応答を誘発するため、とりわけCMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するために、単独で若しくは組合せでのいずれかで被験体に投与し得る。こうした細胞に基づく組成物は、従って癌を処置若しくは予防するのに有用である。該細胞は、CMV抗原を発現する細胞に対する所望の免疫応答を誘発するいずれかの様式により被験体に導入し得る。さらに、該抗原提示細胞および/若しくはリンパ球は、該被験体(すなわち自己細胞)または該被験体とMHCが適合する若しくは不適合である異なる被験体(すなわち同種)に由来し得る。注入部位は、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、静脈内若しくはリンパ系内から選択し得る。

0113

該抗原提示細胞およびリンパ球の単回若しくは複数回投与は、医療提供者(例えば医師)により選択されている細胞数および処置を用いて実施し得る。好ましくは、該抗原提示細胞および/若しくはリンパ球は製薬学的に許容できる担体中で投与される。適する担体は、細胞が増殖された増殖培地、若しくはリン酸緩衝生理的食塩水のようないずれかの適する緩衝媒体であり得る。該細胞は単独で若しくは他の治療薬とともにの補助療法として投与し得る。

0114

従って、本発明は、CMV抗原を発現する細胞、好ましくはCMVに関連する癌細胞の処置および/若しくは予防方法を企図しており、該方法は、こうした処置若しくは予防の必要な被験体に治療的/予防的有効量の本明細書に記述される組成物を投与することを含んでなる。

0115

処方および投与技術はRemington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Co.,ペンシルバニア州イーストン、最新版に見出し得る。適する経路は、例えば、経口、直腸、経粘膜若しくは腸投与;筋肉内、皮下、内注入、ならびにくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内若しくは眼内注入を包含する非経口送達を包含し得る。注入のために、本発明の治療的/予防的組成物は、水性溶液、好ましくはハンクス液リンゲル液若しくは生理学的食塩水緩衝液のような生理学的に適合性の緩衝液中で処方し得る。

0116

F.抗体
本発明の組成物は、CMV抗原を発現する細胞を標的とする抗体を生じさせるのにもまた使用し得る。従って、他の局面において、本発明の組成物および方法は、CMV抗原を発現する細胞に対する1種若しくはそれ以上の抗体を提供し、こうした抗体それら自身は、例えば、受動免疫若しくはエフェクター標的特異的送達のような多くの用途、ならびに免疫学的結合に基づく診断試験およびキットのための用途を有する。従って、いくつかの態様において、本発明は治療的および/若しくは診断的応用で使用し得るCMVに関連する癌細胞特異的抗体を提供する。

0117

本発明の抗体はスクリーニング若しくは診断の応用で使用し得る。本発明の抗体はin
vitroおよびin vivo診断目的上貴重である。例えば、該抗体は、ウエスタンブロット免疫沈降法、酵素結合免疫吸着検定法ELISA)、蛍光標示式細胞分取(FACS)、間接免疫蛍光顕微鏡検査免疫組織化学(IHC)などで使用し得る。一態様において、本発明はCMV抗原を発現する細胞の免疫学的決定方法を提供し、該方法は、本明細書に開示されるところの最低1種の抗体と該細胞を接触させることを含んでなる。

0118

例えば、該抗体は、CMV抗原を発現する細胞の検出についてアッセイするための診断薬として使用し得る。本発明の抗体は、CMV抗原を発現する細胞に対するそれらの結合親和性を考えれば、診断薬としてとりわけ適するはずである。本質的に、細胞(例えば癌細胞)を含んでなるサンプルを、免疫学的相互作用が発生することを可能にするのに十分
な時間、抗体とともにインキュベートすることができる。当業者はこれらの基礎的手順に多くの変形が存在することを認識するであろう。これらの変形は、例えばRIA、ELISA、沈殿凝集補体固定および免疫蛍光を包含する。好ましくは、主題の抗体は抗体−細胞免疫複合体の検出を可能にするよう標識することができる。さらに、本発明の抗体は、CMV抗原を発現する細胞のin vitroでの検出および定量のため、若しくは他の細胞の精製の一段階として混合された細胞の1集団からこうした細胞を殺しかつ排除するためにもまた有用である。

0119

抗体の標識されたバージョンの作成において使用される標識は、放射標識および蛍光色素のような直接検出されうる部分、ならびに検出されるために反応若しくは誘導体化されなければならない酵素のような部分を包含する。放射標識は、限定されるものでないが99Tc、203Pb、67Ga、68Ga、72As、111In、113mIn、97Ru、62Cu、641Cu、52Fe、52mMn、51Cr、186Re、188Re、77As、90Y、67Cu、169Er、121Sn、127Te、142Pr、143Pr、198Au、199Au、161Tb、109Pd、165Dy、149Pm、151Pm、153Sm、157Gd、159Gd、166Ho、172Tm、169Yb、175Yb、177Lu、105Rhおよび111Agを挙げることができる。放射標識は現在利用可能な計数手順のいずれによっても検出し得る。

0120

酵素標識は、現在利用されている比色、分光測光、蛍光分光測光若しくは気体定量技術のいずれによっても検出し得る。酵素は、カルボジイミド、過ヨウ素酸ジイソシアネートグルタルアルデヒドなどのような架橋分子を用いて抗体と結合する。これらの手順で使用し得る多くの酵素が既知でありかつ利用し得る。例は、ペリオキシダーゼ(perioxidase)、アルカリホスファターゼβ−グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼウレアーゼグルコース酸化酵素およびペルオキシダーゼガラクトース酸化酵素およびペルオキシダーゼ、ならびに酸ホスファターゼである。使用しうる蛍光物質は、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、オーラミンダンシルウンベリフェロンルシフェリア(luciferia)、2,3−ジヒドロフタラジンジオンワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチーム、ならびにグルコース−6−リン酸脱水素酵素を包含する。抗体は既知の方法によりこうした標識で標識しうる。例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドイミダートスクシンイミド、ビス−ジアゾ化ベンザジン(benzadine)などのようなカップリング剤を使用して、上述された蛍光、化学発光および酵素標識で抗体を標識しうる。多様な標識技術が、Morrison,Methodsin Enzymology,(1974),32B,103;Syvanenら、J.Biol.Chem.,(1973),284,3762;およびBoltonとHunter,Biochem J.,(1973),133,529に記述されている。

0121

該抗体および標識された抗体は、被験体でCMV抗原を発現する細胞の存在を検出するため、または該被験体でのこうした細胞若しくは癌の状態をモニターするために、多様な免疫画像化若しくはイムノアッセイ手順で使用しうる。CMV抗原を発現する細胞の状態をモニターするのに使用される場合、定量的イムノアッセイ手順を使用し得る。例えば、こうしたモニタリングアッセイを定期的に実施しかつ該結果を比較する場合、被験者の腫瘍負荷が増大したか若しくは減少したかに関する決定を行うことができ、該腫瘍はCMV関連腫瘍である。使用しうる一般的アッセイ技術は直接および間接アッセイを包含する。

0122

例えば、治療的応用の場合、疾患の進行に関与する標的を阻害する、若しくは標的細胞の細胞傷害死をもたらすために該抗体を使用し得る。また、こうした治療的抗体は、シグナル伝達経路を阻害、若しくは抗体依存性細胞傷害補体依存性細胞傷害などを誘発し得る。

0123

本発明の抗体は、従って、エフェクターに一過性に若しくは永続的に結合され得(それによりハイブリッド分子若しくはキメラ部分を形成する)かつそのエフェクターを特定の1標的細胞(例えば癌細胞)に向けるのに使用し得るがその必要はない、効果的標的化部分を提供する。

0124

エフェクター分子は、標的細胞に特異的に輸送されるはずである分子若しくは分子の群を指す。エフェクター分子は、典型的に、標的細胞に送達されるはずである特徴的活性を有する。エフェクター分子は、限定されるものでないが細胞毒、標識、放射性核種(例えば211At)、リガンド、抗体、薬物、リポソーム、エピトープ標識などを挙げることができる。好ましいエフェクターは、細胞毒(例えばシュードモナス属(Pseudomonas)外毒素ゲロニンリシンアブリンジフテリア毒素など)、本明細書に記述されるところの免疫調節物質、または細胞傷害性の薬物若しくはプロドラッグを包含し、この場合ハイブリッド分子は、CMV抗原を発現する細胞にサイトトキシンの標的を特異的に定める強力な細胞死滅剤として作用しうる。

0125

エフェクターのさらなる例は、限定されるものでないが、グランザイム、ルシフェラーゼ血管内皮増殖因子、β−ラクタマーゼ、Tr−apo−1、Ang II、TAT、アルキル化剤、ダウノマイシン、アドリアマイシン、クロラムブシル、代謝拮抗剤(例えばメトトレキサート)、モダシン(modaccin)A鎖、α−サルシンシナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシン(dianthin)タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ(Phytolacca amaricana)タンパク質(PAPI、PAPIIおよびPAP−S)、ツルレイシ(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サパオリアオフィシナリス(Sapaonaria officinalis)阻害剤、ミトリン(mitogellin)、レストクトコイン(restrictocoin)、フェノマイシンおよびエノマイシンを挙げることができる。

0126

なお他の態様において、エフェクターは、薬物(例えばドキソルビシン、ビンブラスチン、タキソール(taxol)のような抗癌剤若しくは本明細書に記述される他の化学療法剤)を被包化するリポソーム、免疫系の成分による結合された細胞の認識を刺激する抗原、および免疫系の成分を特異的に結合しかつCMV抗原を発現する細胞にそれらを向ける抗体、などを包含し得る。

0127

他の適するエフェクター分子は、薬理学的剤、若しくは多様な薬理学的剤を含有する被包化系を包含する。従って、ハイブリッド分子の標的化分子は、CMV抗原を発現する細胞に直接送達されるはずである薬物に直接結合しうる。こうした薬物は当業者に公知であり、そして限定されるものでないがドキソルビシン、ビンブラスチン、ゲニステインアンチセンス分子、本明細書に記述される多様な他の化学療法剤などを挙げることができる。

0128

あるいは、エフェクター分子は、薬物、核酸(例えばアンチセンス核酸)、若しくは循環系への直接曝露から好ましくは遮蔽されている別の治療的部分のような治療的組成物を含有するウイルスキャプシド、リポソーム若しくはミセルのような被包化系でありうる。抗体に結合されるリポソームの製造方法は当業者に公知である。例えば米国特許第4,957,735号明細書;Connor,J.ら(1985)Pharmacol.Ther.,28:341−365を参照されたい。

0129

G.CMV核酸の測定
他の態様において、本発明は、被験体中のCMV核酸、好ましくは血液若しくは他の生物学的液体中のCMV DNAを測定するための、例えば被験体から得られる血液のサン
プル中の無症候性ウイルス血症を決定するための組成物および方法を提供する。従って、多様な態様において、該組成物および方法は、例えば、前癌細胞、癌細胞、若しくはCMVと関連する癌を発症する素因となる細胞型と関連する疾患若しくは状態の予防的および/若しくは治療的処置のような本明細書に記述される方法を包含する多様な診断および/若しくは治療的処置(procedure)および処置(treatment)を企図している有効な診断、モニタリングおよび予後試験/アッセイを提供する。

0130

例として、同種骨髄移植(aBMT)を受けるヒト患者でのCMV再活性化の決定、およびいくつかの場合には、現在使用されている臨床で承認されている診断的CMVPCRアッセイと比較して約6週先行するウイルス再活性化の検出において信頼できる増幅方法が提供される。本明細書に提供される実施例によってもまた具体的に説明されるとおり、外科的に切除されたGBM試料からのCMV DNAを、例えばHCMVゲノム中のgB遺伝子の可変領域(領域82801−84180、NCBIGenBank受託番号NC_001347)にわたるPCR増幅およびその後のDNA配列決定を使用して分析し得る。

0131

一態様において、本発明は被験体中のCMV核酸の測定方法を提供し、該方法は、(a)生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満であり;ならびに(b)アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在が被験体中のCMV核酸を暗示する、を含んでなる。

0132

いくつかの態様において、該アンプリコンは長さが約1000bpを超えない、具体的には、長さが約900bpを超えない、約800bpを超えない、約700bpを超えない、約600bpを超えない、約500bpを超えない、約400bpを超えない、約300bpを超えない、約200bpを超えない、約150bpを超えない、約100bpを超えない、約90bpを超えない、約80bpを超えない、約70bpを超えない、約60bpを超えない、約50bpを超えない、および約40bpを超えない。いくつかの態様において、該アンプリコンは長さが200塩基対(bp)若しくはそれ未満である。

0133

プライマー対およびそれらの対応する標的遺伝子の制限しない例を表1および2に示す。

0134

0135

0136

0137

0138

0139

一態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、gBの一領域(例えばUL55)若しくはMIE遺伝子に対応するアンプリコンを提供するのに十分である。しかしながら、CMV核酸のいずれかの領域に対応するアンプリコンを提供し得るいかなるプライマー対もまた本発明の範囲内にある。いくつかの態様において、本発明の使用のためのプライマーは配列番号8〜63に示されるところのヌクレオチド配列を含んでなる。

0140

別の態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号8により示されるところの第一プライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号9により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。他の態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号10により示されるところの第一プライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号11により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。

0141

別の態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号16により示されるところの第一プライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号17により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。一態様において、第一のプライマーおよび第二のプライマーは、第一のプライマーが配列番号34により示されるところの第一のプライマー配列を含んでなり、第二のプライマーが配列番号35により示されるところの第二のプライマー配列を含んでなるプライマー対に対応する。

0142

他の態様において、本発明は被験体中のCMV核酸の測定方法を提供し、該方法は、(a)生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることを含んでなり、増幅することは、表2に示されるところの最低一対のプライマーおよび最低1種の対応するプローブと該核酸分子を接触させることを含んでなる。一態様において、該プライマー対は配列番号67および68として示される配列を有し;ならびに対応するプローブは配列番号69として示される配列を有する。

0143

いくつかの態様において、被験体中のCMV核酸の測定方法は、生物学的サンプルを急速凍結にかけることをさらに含んでなる。急速凍結法は当該技術分野で公知であり、そして、例えば液体窒素若しくはアルコールドライアイス(例えばMeOH/ドライアイス)中で急速凍結することを包含する多様な試薬および技術を使用して実施し得る。

0144

好ましくは、方法は急速凍結の段階後に核酸を濃縮することをさらに含んでなる。一態様において、濃縮する段階は、核酸を沈殿させること、次いで急速凍結の段階を含んでなる。別の態様において、沈殿させることは核酸をアルコールと接触させること(例えばEtOH沈殿)を含んでなる。

0145

なおさらなる態様において、アンプリコンの存在を決定する段階は、アンプリコンのいずれかの適する検出方法、例えば、臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルのもの最低10倍の検出感度を有することを特徴とする検出方法により実施する。

0146

他の局面において、本発明は細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
(a)被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満であり;
(b)アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在は該被験体中のCMV核酸を暗示し;ならびに
(c)最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を含んでなる製薬学的に許容できる組成物を該被験体に投与することであって、該製薬学的に許容できる組成物は、被験体に投与される場合に該細胞に対する免疫応答を誘発する
を含んでなる。段階(a)、(b)および(c)は上述されるとおりである。

0147

別の局面において、本発明は細胞に対する免疫応答の被験体での誘発方法を提供し、該方法は、
(a)被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満であり;
(b)アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在は該被験体中のCMV核酸を暗示し;ならびに
(c)有効量の抗原提示細胞、Tリンパ球若しくは双方を含んでなる組成物を該被験体に投与することであって、該抗原提示細胞およびTリンパ球は感作有効量の最低1種のCMV抗原でin vitroで感作されており、抗原提示細胞、Tリンパ球若しくは双方の該有効量は、該CMV抗原を発現する細胞に対する免疫応答を誘発するのに十分である、を含んでなる。

0148

一局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞の増殖若しくは広がりの低減若しくは阻害方法を提供し、該方法は、
(a)被験体からの生物学的サンプルから核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることであって、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満であり;
(b)アンプリコンの存在を決定することであって、該アンプリコンの存在は該被験体中のCMV核酸を暗示し;ならびに
(c)治療的若しくは予防的有効量の製薬学的に許容できる組成物を被験体に投与して該被験体での該細胞の増殖若しくは広がりを低減若しくは阻害すること
を含んでなる。段階(a)、(b)および(c)は上述されるとおりである。

0149

なおさらなる局面において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞を有する被験体を処
置することの治療的有効性モニタリング方法を提供し、該方法は、
(a)該被験体からの第一の生物学的サンプル中でCMV核酸の第一の量を測定することであって、測定することは、該生物学的サンプルからの核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることを含んでなり、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満であり、該アンプリコンの存在が該被験体中のCMV核酸を暗示し;
(b)被験体を処置すること;
(c)適する期間の後に、該処置された被験体から得た第二のサンプル中のCMV核酸の第二の量を測定すること;ならびに
(d)第一の量を第二の量と比較することであって、該第一の量と該第二の量の間の差違は該処置の有効性を暗示する、
を含んでなる。

0150

いくつかの態様において、段階(b)の処置することは、治療若しくは予防量の上述されたところの製薬学的組成物を被験体に投与することを含んでなる。

0151

他の態様において、本発明は、CMV抗原を発現する細胞に対する活性を有する製薬学的剤を決定することに向けられるアッセイを提供し、該方法は、
(a)被験体からの第一の生物学的サンプル中でCMV核酸の第一の量を測定することであって、測定することは、該生物学的サンプルからの核酸分子を増幅してアンプリコンを得ることを含んでなり、増幅することは、第一のプライマーおよび第二のプライマーを含んでなる最低一対のプライマーと該核酸分子を接触させることを含んでなり、該アンプリコンは長さが約1000塩基対(bp)若しくはそれ未満であり、該アンプリコンの存在が該被験体中のCMV核酸を暗示し;
(b)該被験体を該製薬学的剤で処置すること;
(c)適する期間の後に、処置された被験体から得た第二のサンプル中のCMV核酸の第二の量を測定すること;ならびに
(d)第一の量を第二の量と比較することであって、該製薬学的剤は、該第二の量が該第一の量未満である場合に該細胞に対する活性を有する、
を含んでなる。

0152

III.キット
本発明の組成物は単位投薬量若しくはキットの形態で供給し得る。キットは、個別の容器中で提供される製薬学的に許容できる組成物若しくはそのワクチンの多様な成分、ならびに化学療法剤を包含する多様な他の有効成分若しくは剤を含み得る。例えば、該容器は、キットの他の成分と一緒に組合せられる場合に単位投薬量若しくは複数剤形の製薬学的に許容できる組成物を構成するような、最低1種のCMV抗原若しくは該最低1種のCMV抗原をコードする核酸を個別に含み得る。好ましいキットは、少なくとも、個別の容器中に、抗原(例えば最低1種のCMV抗原若しくはそれらをコードする核酸)の供給源;および1種若しくはそれ以上のアジュバント(例えばサイトカイン)を含んでなる。該キットは、生理学的に許容できる担体、希釈剤若しくは賦形剤を別個の容器中にさらに含み得る。場合によっては、該キットはナノ粒子若しくはトランスフェクション試薬のような送達剤をさらに含み得る。本発明の包装された組成物およびキットは、貯蔵、調製および投与のための説明書もまた包含し得る。本発明の1種若しくはそれ以上の核酸プライマーは、場合によっては、好ましくは1個若しくはそれ以上の個別の容器中で提供されて該キットに包含される。

0153

本発明は実施例によってより詳細に具体的に説明されることができるが、しかし本発明は該実施例に制限されないことに注意されるべきである。

0154

実施例

0155

HCMVタンパク質は悪性神経膠腫中で発現される
HCMVタンパク質が悪性神経膠種(MG)中で発現されたかどうか決定するため、われわれの脳腫瘍バンクから選択した45個のGBM試料からのパラフィン切片を免疫組織化学(IHC)により検査した。

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