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課題

宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、外因性遺伝子を含む組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞、およびそのような宿主細胞を連続的な形質導入またはトランスフェクションにより作製する方法を提供する。

解決手段

関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクターを用いて、宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させ、より高いレベルのタンパク質を発現する方法。

概要

背景

発明の背景
医薬バイオテクノロジー産業は、哺乳類細胞における組換えタンパク質の産生を拠り所としている。これらのタンパク質は、多くの疾患および状態の治療的処置のために不可欠である。多くの場合、これらのタンパク質の市場は年間10億ドルを上回る。哺乳類細胞における組換え産生が行われているタンパク質の例には、エリスロポエチン、第VIII因子、第IX因子およびインスリンが含まれる。これらのタンパク質の多くに関しては、正しい翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはsilation;例えば、米国特許第5,721,121号(特許文献1)を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる)が必要なことから、哺乳類細胞における発現の方が原核細胞における発現よりも好ましい。

組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための方法はいくつか知られている。最も基本的な方法では、異種タンパク質をコードする遺伝子および適切な調節領域を含む核酸構築物を宿主細胞に導入して組み込ませる。導入方法には、リン酸カルシウム沈殿マイクロインジェクションリポフェクションおよびエレクトロポレーションが含まれる。他の方法では、選択方式を用いて、導入した核酸構築物を増幅する。これらの方法では、増幅可能な選択マーカーをコードする遺伝子および異種タンパク質をコードする遺伝子により、細胞の共トランスフェクションを行う(例えば、SchroderおよびFriedl、Biotech. Bioeng. 53(6):547〜59[1997](非特許文献1)を参照されたい)。最初の形質転換体の選択の後に、培地中の選択用物質(例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ)を段階的に増やすことにより、トランスフェクトした遺伝子を増幅する。場合によっては、これらの手順によって外因性遺伝子を数百倍に増幅しうる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の他の発現方法では、エピソームベクター(例えば、プラスミド)によるトランスフェクションを用いる。

組換えタンパク質の発現用の哺乳類細胞系を作製するための現行の方法にはいくつか欠点がある(例えば、Mielkeら、Biochem. 35:2239〜52[1996](非特許文献2)を参照されたい)。エピソーム系は、組換えタンパク質の高レベルの発現を可能にするが、短期的にしか安定でないことが多い(例えば、KlehrおよびBode、Mol. Genet.(Life Sci. Adv.)7:47〜52[1988](非特許文献3)を参照されたい)。外因性遺伝子が組み込まれた哺乳類細胞系はそれよりも幾分安定しているが、安定性は外因性遺伝子の少数コピー、場合によっては単一のコピーのみの存在に依存しているという知見が増しつつある。

標準的なトランスフェクション法は、導入遺伝子の複数のコピーを宿主細胞のゲノムに導入するのに好都合である。多くの場合、導入遺伝子の複数の組み込みは本質的に不安定であることが判明している。この本質的な不安定性は、相同組換えによるコード配列消失を促す特徴的な頭-尾様式の組み込みに起因すると思われ(例えば、Weidleら、Gene 66:193〜203[1988](非特許文献4)を参照されたい)、これは特に導入遺伝子が転写される際に想定される(例えば、McBurneyら、Somatic Cell Molec. Genet. 20:529〜40[1994](非特許文献5)を参照されたい)。宿主細胞にも、複数のコピーの組み込みイベントに対する後成的防御機構がある。植物では、この機構は「共抑制」と呼ばれている(例えば、Allenら、Plant Cell 5:603〜13[1993](非特許文献6)を参照されたい)。実際に、発現レベルコピー数逆相関することは珍しくない。これらの観察結果は、外因性遺伝子の複数のコピーが、メチル化(例えば、Mehtaliら、Gene 91:179〜84[1990](非特許文献7)を参照されたい)およびそれに続く変異誘発(例えば、Krickerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1075〜79[1992](非特許文献8)を参照されたい)による不活性化、またはヘテロクロマチン形成によるサイレンシング(例えば、DorerおよびHenikoff、Cell 77:993〜1002[1994](非特許文献9)を参照されたい)を受けるようになるという所見と一致する。

したがって、当技術分野においては、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための改良された方法が必要とされている。宿主細胞は、長期間にわたって安定であって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質を高レベルで発現するものが好ましい。

概要

宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、外因性遺伝子を含む組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞、およびそのような宿主細胞を連続的な形質導入またはトランスフェクションにより作製する方法を提供する。関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクターを用いて、宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させ、より高いレベルのタンパク質を発現する方法。なし

目的

本発明は、ゲノムを含む複数の宿主細胞、および複数の組み込みベクターを提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

以下の段階を含む、宿主細胞形質導入を行うための方法:a) i)ゲノムを含む少なくとも1つの宿主細胞、およびii)関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクターを提供する段階;ならびにb)該宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、該少なくとも1つの宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させる段階;c)組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞を提供するために、段階a)およびb)を複数回繰り返す段階。

請求項2

段階aおよびbが少なくとも3回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項3

段階aおよびbが少なくとも4回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項4

段階aおよびbが少なくとも5回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項5

段階aおよびbが少なくとも6回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項6

段階aおよびbが少なくとも7回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項7

段階aおよびbが少なくとも8回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項8

段階aおよびbが少なくとも10回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項9

段階aおよびbが少なくとも20回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項10

段階aおよびbが約3〜20回繰り返される、請求項1記載の方法。

請求項11

組み込まれた複数のベクターを含む宿主細胞が、約10〜約100個の組み込まれたレトロウイルスベクターを含む、請求項1記載の方法。

請求項12

段階1および2において利用されるレトロウイルスベクターが、外被プラスミドおよびベクタープラスミドによりトランスフェクトされたパッケージング細胞より作製される、請求項1記載の方法。

請求項13

以下の段階をさらに含む、請求項1記載の方法:d)関心対象の遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを用いてパッケージング細胞に形質導入を行い、かつ外被タンパク質発現するプラスミドを用いて該パッケージング細胞にトランスフェクションを行うことにより作製されたパッケージング細胞から作製されるベクターを用いて段階1および2により作製された、組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞に、形質導入を行う段階。

請求項14

パッケージング細胞がレトロウイルスのgagおよびpolタンパク質を発現する、請求項12記載の方法。

請求項15

パッケージング細胞が293-GP細胞である、請求項14記載の方法。

請求項16

外被プラスミドがGタンパク質をコードする、請求項12記載の方法。

請求項17

Gタンパク質がVSV-Gタンパク質である、請求項16記載の方法。

請求項18

レトロウイルスベクターがMoMLV因子を含む、請求項1記載の方法。

請求項19

条件が、約10〜1000の感染多重度で、宿主を接触させる段階を含む、請求項1記載の方法。

請求項20

関心対象の遺伝子が外因性プロモーターと機能的に結合した、請求項1記載の方法。

請求項21

関心対象の遺伝子がシグナル配列と機能的に結合した、請求項1記載の方法。

請求項22

レトロウイルスベクターが少なくとも2つの関心対象の遺伝子をコードする、請求項1記載の方法。

請求項23

少なくとも2つの関心対象の遺伝子が多シストロン性配列に配置される、請求項22記載の方法。

請求項24

少なくとも2つの関心対象の遺伝子が免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含む、請求項23記載の方法。

請求項25

レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1記載の方法。

請求項26

宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞ベビーハムスター腎細胞、ヒト293細胞、およびウシ乳腺上皮細胞より選択される、請求項1記載の方法。

請求項27

形質導入された宿主細胞をクローン的に(clonally)選択する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。

請求項28

関心対象の遺伝子によりコードされる関心対象のタンパク質が産生されるような条件下で、クローン的に選択された宿主細胞を培養する段階をさらに含む、請求項27記載の方法。

請求項29

組み込みベクターが、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む、請求項1記載の方法。

請求項30

関心対象のタンパク質を単離する段階をさらに含む、請求項28記載の方法。

請求項31

培養条件が、回転瓶培養、灌流培養流加培養(batch fed culture)、およびペトリ皿培養からなる群より選択される、請求項28記載の方法。

請求項32

宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約1ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項28記載の方法。

請求項33

宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約10ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項28記載の方法。

請求項34

宿主細胞が、細胞1個当たり1日につき約50ピコグラムを上回る関心対象のタンパク質を合成する、請求項28記載の方法。

請求項35

レトロウイルスベクターが増幅可能なマーカーをさらにコードする、請求項1記載の方法。

請求項36

増幅可能なマーカーがDHFRおよびグルタミン合成酵素からなる群より選択される、請求項35記載の方法。

請求項37

組み込まれたレトロウイルスベクターの増幅を可能にする条件下で、形質導入された宿主細胞を培養する段階をさらに含む、請求項35記載の方法。

請求項38

条件が、メトトレキセートホスフィノトリシン(phosphinothricin)、およびメチオニンサルフォシム(methionine sulphoxime)からなる群より選択される選択物質の存在下において、形質導入された宿主細胞を培養する段階を含む、請求項37記載の方法。

請求項39

免疫グロブリンIgGIgAIgMIgDIgE、およびsIgからなる群より選択される、請求項24記載の方法。

請求項40

宿主細胞に、異なる関心対象の遺伝子をコードする少なくとも2つの異なるベクターによって形質導入が行われる、請求項1記載の方法。

請求項41

請求項1記載の方法により作製される、宿主細胞。

請求項42

以下の段階を含む、宿主細胞に形質導入を行うための方法:a) i)ゲノムを含む少なくとも1つの宿主細胞を提供する段階、およびii)関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクターを提供する段階;ならびにb)該宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、該少なくとも1つの宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させる段階;c)組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞を提供するために、段階1)および2)を複数回繰り返す段階;d)該関心対象の遺伝子を発現する宿主細胞をクローン的に選択する段階;ならびにe)該関心対象の遺伝子によりコードされる関心対象のタンパク質を精製する段階。

技術分野

0001

発明の分野
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、外因性遺伝子を含む組み込みベクターの組み込まれた複数のコピーを含む宿主細胞、および連続的な形質導入またはトランスフェクションによるそのような宿主細胞の作製方法に関する。

0002

本出願は、00年7月3日出願の仮出願番号60/215,925に対し優先権を主張する、01年6月29日出願の米国特許出願第09/897,511号の一部継続出願である、03年3月26日出願の、米国特許出願第10/397,079号の一部継続出願である。

背景技術

0003

発明の背景
医薬バイオテクノロジー産業は、哺乳類細胞における組換えタンパク質の産生を拠り所としている。これらのタンパク質は、多くの疾患および状態の治療的処置のために不可欠である。多くの場合、これらのタンパク質の市場は年間10億ドルを上回る。哺乳類細胞における組換え産生が行われているタンパク質の例には、エリスロポエチン、第VIII因子、第IX因子およびインスリンが含まれる。これらのタンパク質の多くに関しては、正しい翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはsilation;例えば、米国特許第5,721,121号(特許文献1)を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる)が必要なことから、哺乳類細胞における発現の方が原核細胞における発現よりも好ましい。

0004

組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための方法はいくつか知られている。最も基本的な方法では、異種タンパク質をコードする遺伝子および適切な調節領域を含む核酸構築物を宿主細胞に導入して組み込ませる。導入方法には、リン酸カルシウム沈殿マイクロインジェクションリポフェクションおよびエレクトロポレーションが含まれる。他の方法では、選択方式を用いて、導入した核酸構築物を増幅する。これらの方法では、増幅可能な選択マーカーをコードする遺伝子および異種タンパク質をコードする遺伝子により、細胞の共トランスフェクションを行う(例えば、SchroderおよびFriedl、Biotech. Bioeng. 53(6):547〜59[1997](非特許文献1)を参照されたい)。最初の形質転換体の選択の後に、培地中の選択用物質(例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ)を段階的に増やすことにより、トランスフェクトした遺伝子を増幅する。場合によっては、これらの手順によって外因性遺伝子を数百倍に増幅しうる。哺乳類細胞における組換えタンパク質の他の発現方法では、エピソームベクター(例えば、プラスミド)によるトランスフェクションを用いる。

0005

組換えタンパク質の発現用の哺乳類細胞系を作製するための現行の方法にはいくつか欠点がある(例えば、Mielkeら、Biochem. 35:2239〜52[1996](非特許文献2)を参照されたい)。エピソーム系は、組換えタンパク質の高レベルの発現を可能にするが、短期的にしか安定でないことが多い(例えば、KlehrおよびBode、Mol. Genet.(Life Sci. Adv.)7:47〜52[1988](非特許文献3)を参照されたい)。外因性遺伝子が組み込まれた哺乳類細胞系はそれよりも幾分安定しているが、安定性は外因性遺伝子の少数のコピー、場合によっては単一のコピーのみの存在に依存しているという知見が増しつつある。

0006

標準的なトランスフェクション法は、導入遺伝子の複数のコピーを宿主細胞のゲノムに導入するのに好都合である。多くの場合、導入遺伝子の複数の組み込みは本質的に不安定であることが判明している。この本質的な不安定性は、相同組換えによるコード配列消失を促す特徴的な頭-尾様式の組み込みに起因すると思われ(例えば、Weidleら、Gene 66:193〜203[1988](非特許文献4)を参照されたい)、これは特に導入遺伝子が転写される際に想定される(例えば、McBurneyら、Somatic Cell Molec. Genet. 20:529〜40[1994](非特許文献5)を参照されたい)。宿主細胞にも、複数のコピーの組み込みイベントに対する後成的防御機構がある。植物では、この機構は「共抑制」と呼ばれている(例えば、Allenら、Plant Cell 5:603〜13[1993](非特許文献6)を参照されたい)。実際に、発現レベルコピー数逆相関することは珍しくない。これらの観察結果は、外因性遺伝子の複数のコピーが、メチル化(例えば、Mehtaliら、Gene 91:179〜84[1990](非特許文献7)を参照されたい)およびそれに続く変異誘発(例えば、Krickerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1075〜79[1992](非特許文献8)を参照されたい)による不活性化、またはヘテロクロマチン形成によるサイレンシング(例えば、DorerおよびHenikoff、Cell 77:993〜1002[1994](非特許文献9)を参照されたい)を受けるようになるという所見と一致する。

0007

したがって、当技術分野においては、組換えタンパク質を発現する宿主細胞を作製するための改良された方法が必要とされている。宿主細胞は、長期間にわたって安定であって、導入遺伝子によってコードされるタンパク質を高レベルで発現するものが好ましい。

0008

米国特許第5,721,121号

先行技術

0009

SchroderおよびFriedl、Biotech. Bioeng. 53(6):547〜59[1997]
Mielkeら、Biochem. 35:2239〜52[1996]
KlehrおよびBode、Mol. Genet.(Life Sci. Adv.)7:47〜52[1988]
Weidleら、Gene 66:193〜203[1988]
McBurneyら、Somatic Cell Molec. Genet. 20:529〜40[1994]
Allenら、Plant Cell 5:603〜13[1993]
Mehtaliら、Gene 91:179〜84[1990]
Krickerら、Proc. Natl. Acad. Sci. 89:1075〜79[1992]
DorerおよびHenikoff、Cell 77:993〜1002[1994]

0010

発明の概要
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、外因性遺伝子を含む組み込みベクターの組み込まれた複数のコピーを含む宿主細胞、および連続的な形質導入またはトランスフェクションによるそのような宿主細胞の作製方法に関する。

0011

従って、いくつかの態様において、本発明は、少なくとも1つの組み込まれた組み込みベクターを含むゲノムを含む宿主細胞を提供し、ここで組み込みベクターは、プロモーターと機能的に結合した、少なくとも1つの外因性遺伝子を含み、かつここで組み込みベクターは選択マーカーをコードする遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む。いくつかの態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合したRNA安定化因子をさらに含む。いくつかの態様において、組み込みベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクターである。特定の態様において、偽型のレトロウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルスピリウイルスチャンディプラウイルス、コイウイルス血症ウイルス、およびモコラウイルスのG糖タンパク質を含むが、これらに限定されない群より選択されるG糖タンパク質を含む。さらなる態様において、レトロウイルスベクターはMoMLV、MoMuSV、およびMMTVの末端反復配列を含むが、これらに限定されない群より選択される末端反復配列を含む。いくつかの態様において、宿主細胞はクローン由来である。別の態様において、宿主細胞は非クローン由来である。いくつかの好ましい態様において、ゲノムは10回を上回る継代に対して安定であり、好ましくは100回を上回る継代に対して安定である。特定の特に好ましい態様において、組み込まれた外因性遺伝子は、選択の非存在下において安定である。いくつかの態様において、少なくとも1つの外因性遺伝子は、抗原結合タンパク質医薬用タンパク質、キナーゼホスファターゼ核酸結合タンパク質膜受容体タンパク質、シグナル伝達タンパク質、イオンチャネルタンパク質、および腫瘍性タンパク質をコードする遺伝子からなる群より選択される。いくつかの態様において、ゲノムは、少なくとも5つの、および好ましくは少なくとも100個の組み込まれた組み込みベクターを含む。いくつかの好ましい態様において、宿主細胞は、1日につき、約3ピコグラムを上回る、および好ましくは、約10ピコグラムを上回る外因性タンパク質を発現する。

0012

本発明は、ゲノムを含む複数の宿主細胞、および複数の組み込みベクターを提供する段階であって、ここで組み込みベクターは少なくとも1つの外因性遺伝子を含み、かつここで組み込みベクター選択マーカーをコードする遺伝子を欠くものである段階;組み込みベクターの少なくとも1つの組み込まれたコピーを含む、トランスフェクトされた宿主細胞を作製するため、宿主細胞を複数の組み込みベクターに接触させる段階;ならびにトランスフェクトされた宿主細胞をクローン的に(clonally)選択する段階を含む、宿主細胞をトランスフェクトするための方法もまた提供する。いくつかの好ましい態様において、組み込まれた外因性遺伝子は選択の非存在下において安定である。いくつかの態様において、宿主は10を上回る感染多重度で組み込みベクターに接触される。いくつかの態様において、宿主細胞は、少なくとも2つ、好ましくは5つ、さらにより好ましくは10個の組み込みベクターが宿主細胞のゲノムに組み込まれるような条件下で、複数の組み込みベクターに接触される。いくつかの態様において、クローン的な選択は、外因性遺伝子の核酸を検出することを含む。いくつかの態様において、外因性遺伝子の核酸を検出することは、PCRアッセイおよびハイブリダイゼーションアッセイからなる群より選択される検出アッセイを含む。別の態様において、クローン的な選択は、外因性遺伝子により発現されるタンパク質を検出することを含む。いくつかの態様において、外因性遺伝子により発現されるタンパク質を検出することは、免疫アッセイおよび生化学的アッセイからなる群より選択される検出アッセイを含む。いくつかの態様において、免疫アッセイは、ELISAおよびウェスタンブロット法からなる群より選択される。いくつかの態様において、組み込みベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの好ましい態様において、宿主細胞は、細胞1個当たり1日につき、約1ピコグラムを上回る、好ましくは、約10ピコグラムを上回る、およびさらにより好ましくは約50ピコグラムを上回る、関心対象の外因性遺伝子由来のタンパク質を合成する。

0013

本発明は、プロモーターと機能的に結合した外因性遺伝子を含む、少なくとも1つの組み込みベクターの、少なくとも1つの組み込まれたコピーを含むゲノムを含む宿主細胞を提供する段階であって、ここで組み込みベクターは選択マーカーをコードする遺伝子を欠き、かつ外因性遺伝子は関心対象のタンパク質をコードするものである段階;および関心対象のタンパク質が産生されるような条件下で宿主細胞を培養する段階を含む、関心対象のタンパク質を産生する方法をさらに提供する。いくつかの好ましい態様において、組み込まれた外因性遺伝子は選択の非存在下において安定である。いくつかの態様において、組み込みベクターは、外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、関心対象のタンパク質を単離する段階をさらに含む。いくつかの態様において、本方法は、少なくとも10個のコロニーをクローン的に選択する段階をさらに含む。いくつかの態様において、クローン的な選択は、外因性遺伝子により発現されるタンパク質を検出することを含む。いくつかの態様において、外因性遺伝子により発現されるタンパク質を検出することは、免疫アッセイおよび生化学的アッセイからなる群より選択される検出アッセイを含む。いくつかの態様において、免疫アッセイは、ELISAおよびウェスタンブロット法からなる群より選択される。いくつかの態様において、宿主細胞のゲノムは、組み込みベクターの、5つを上回る、および好ましくは10個を上回る組み込まれたコピーを含む。いくつかの態様において、組み込みベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、宿主細胞は、細胞1個当たり1日につき、約1ピコグラムを上回る、好ましくは、10ピコグラムを上回る、およびさらにより好ましくは50ピコグラムを上回る、関心対象のタンパク質を合成する。

0014

本発明は、外因性遺伝子と機能的に結合した外因性プロモーターを含む遺伝子構築物を含むレトロウイルスベクターもまた提供し、ここでベクターは選択マーカーをコードする遺伝子を欠いている。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは偽型のレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、偽型のレトロウイルスベクターは水疱性口内炎ウイルス、ピリウイルス、チャンディプラウイルス、コイ春ウイルス血症ウイルス、およびモコラウイルスのG糖タンパク質を含むが、これらに限定されない群より選択されるG糖タンパク質を含む。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターはMoMLV、MoMuSV、およびMMTVの末端反復配列を含むが、これらに限定されない群より選択される末端反復配列を含む。

0015

いくつかの態様において、本発明は、以下を含む、宿主細胞に形質導入を行うための方法を提供する:a)i)ゲノムを含む少なくとも1つの宿主細胞、およびii)関心対象の遺伝子をコードする複数のレトロウイルスベクターを提供すること;ならびにb)該宿主細胞に形質導入が行われて形質導入された宿主細胞が作製されるような条件下で、該少なくとも1つの宿主細胞を該複数の組み込みベクターに接触させる段階;ならびにc)組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む宿主細胞を提供するために、段階a)およびb)を複数回繰り返す段階。本発明は、段階a)およびb)を任意の特定回数繰り返すことに限定されない。実際、いくつかの態様において、段階a)およびb)は、少なくとも3、4、5、6、7、8、10回、または約3〜20回繰り返してもよい。本発明は、任意の特定数個のベクターの組み込みに限定されない。いくつかの態様において、約10〜約100個のレトロウイルスベクターが組み込まれる。本発明は、任意の特定の方法により作製されたレトロウイルスベクターに限定されない。いくつかの態様において、段階1および2において利用されるレトロウイルスベクターは、外被プラスミドおよびベクタープラスミドによりトランスフェクトされたパッケージング細胞より作製される。

0016

いくつかの態様において、本発明の方法は、d)該関心対象の遺伝子をコードするレトロウイルスベクターを用いてパッケージング細胞に形質導入を行う段階、および外被タンパク質を発現するプラスミドを用いて該パッケージング細胞をトランスフェクトすることにより作製されたパッケージング細胞から作製されるベクターを用いて、段階1および2により作製される組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを含む該宿主細胞に形質導入を行う段階をさらに含む。いくつかの態様において、パッケージング細胞はレトロウイルスのgagおよびpolタンパク質を発現する。いくつかの好ましい態様において、パッケージング細胞は293-GP細胞である。いくつかの態様において、外被プラスミドはGタンパク質をコードする。いくつかの好ましい態様において、Gタンパク質はVSV-Gタンパク質である。また他の態様において、レトロウイルスベクターはMoMLV因子を含む。

0017

本発明のいくつかの態様において、条件は約10〜1000の感染多重度で該宿主を接触させることを含む。いくつかの態様において、関心対象の遺伝子は外因性プロモーターと機能的に結合する。さらなる態様において、関心対象の遺伝子はシグナル配列と機能的に結合する。またさらなる態様において、レトロウイルスベクターは少なくとも2つの関心対象の遺伝子をコードする。いくつかの態様において、少なくとも2つの関心対象の遺伝子は多シストロン性配列として配置される。いくつかの好ましい態様において、少なくとも2つの関心対象の遺伝子は免疫グロブリン重鎖および軽鎖を含む。また他の態様において、レトロウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。いくつかの態様において、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣細胞、ベビーハムスター腎細胞、ヒト293細胞、およびウシ乳腺上皮細胞より選択される。

0018

いくつかの態様において、本方法は、該形質導入された宿主細胞をクローン的に選択する段階をさらに含む。さらなる態様において、本方法は、該関心対象の遺伝子によりコードされる関心対象のタンパク質が産生されるような条件下で、該クローン的に選択された宿主細胞を培養する段階を含む。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、該外因性遺伝子と機能的に結合した分泌シグナル配列をさらに含む。またさらなる態様において、本方法は、該関心対象のタンパク質を単離する段階を含む。いくつかの好ましい態様において、培養条件は、回転瓶培養、灌流培養流加培養(batch fed culture)およびペトリ皿培養からなる群より選択される。いくつかの態様において、宿主細胞は細胞1個当たり1日につき約1ピコグラムを上回る該関心対象のタンパク質を合成する。いくつかの態様において、宿主細胞は細胞1個当たり1日につき約10ピコグラムを上回る該関心対象のタンパク質を合成する。いくつかの態様において、宿主細胞は細胞1個当たり1日につき約50ピコグラムを上回る該関心対象のタンパク質を合成する。

0019

いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは増幅可能なマーカーをさらにコードする。いくつかの好ましい態様において、増幅可能なマーカーはDHFRおよびグルタミン合成酵素からなる群より選択される。さらなる態様において、本方法は、組み込まれたレトロウイルスベクターの増幅を可能にする条件下で、該形質導入された宿主細胞を培養する段階を含む。いくつかの態様において、条件は、メトトレキセートホスフィノトリシン(phosphinothricin)、およびメチオニンサルフォシム(methionine sulphoxime)からなる群より選択される選択物質の存在下において、該形質導入された宿主細胞を培養することを含む。いくつかの態様において、免疫グロブリンは、IgGIgAIgMIgDIgE、およびsIgからなる群より選択される。他の態様において、宿主細胞に、異なる関心対象の遺伝子をコードする、少なくとも2つの異なるベクターを用いて形質導入が行われる。

0020

またさらなる態様において、本発明は前述の方法により作製された宿主細胞を提供する。

図面の簡単な説明

0021

変性条件下で泳動させ、抗ヒトIgG(Fc)および抗ヒトIgG(κ)によりプローブ検索を行った15%SDS-PAGEゲルウエスタンブロットである。
経時的なMN14発現に関するグラフである。
非変性条件下で泳動させ、抗ヒトIgG(Fe)および抗ヒトIgG(κ)によりプローブ検索を行った15%PAGEのウエスタンブロットである。
ハイブリッド型ヒト-ウシα-ラクトアルブミンプロモーターの配列を提示したものである(SEQID NO:1)。
変異型PPE配列の配列を提示したものである(SEQ ID NO:2)。
IRES-シグナルペプチド配列の配列を提供する(SEQ ID NO:3)。
CMV MN14ベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:4)。
図7Aの続きを示す図である。
CMVLL2ベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:5)。
図8Aの続きを示す図である。
MMTV MN14ベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:6)。
図9Aの続きを示す図である。
図9Bの続きを示す図である。
α-ラクトアルブミンMN14ベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:7)。
図10Aの続きを示す図である。
図10Bの続きを示す図である。
図10Cの続きを示す図である。
α-ラクトアルブミンBotベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:8)。
図11Aの続きを示す図である。
図11Bの続きを示す図である。
LSRNLベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:9)。
図12Aの続きを示す図である。
α-ラクトアルブミンcc49IL2ベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:10)。
図13Aの続きを示す図である。
α-ラクトアルブミンYPベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:11)。
図14Aの続きを示す図である。
図14Bの続きを示す図である。。
IRES-カゼインシグナルペプチド配列の配列を提供する(SEQ ID NO:12)。
LNBOTDCベクターの配列を提供する(SEQ ID NO:13)。
図16Aの続きを示す図である。
図16Bの続きを示す図である。
CMVプロモーター細胞系における、INVADERアッセイによる遺伝子比を示すグラフを提供する。
α-ラクトアルブミンプロモーター細胞系における、INVADERアッセイによる遺伝子比を示すグラフを提供する。
Gタンパク質共役受容体および抗体軽鎖を発現するレトロウイルスベクターの配列を提供する。
図19Aの続きを示す図である。
図19Bの続きを示す図である。
図19Cの続きを示す図である。
選択マーカーの非存在下における、関心対象の遺伝子の発現の増加を示すグラフを示す。
IgMをコードするベクターのコード配列である、SEQ ID NO:37を提供する。
図21Aの続きを示す図である。
図21Bの続きを示す図である。
図21Cの続きを示す図である。
IgMを作製するための2ベクター系の1つのベクターのコード配列である、SEQ ID NO:38を提供する。
図22Aの続きを示す図である。
図22Bの続きを示す図である。
図22Cの続きを示す図である。
IgMを作製するための2ベクター系の1つのベクターのコード配列である、SEQ ID NO:39を提供する。
図23Aの続きを示す図である。
図23Bの続きを示す図である。
増幅可能なマーカー(dhfr)を含むレトロウイルスベクターのコード配列である、SEQ ID NO:40を提供する。
図24Aの続きを示す図である。
図24Bの続きを示す図である。
増幅可能なマーカー(gs)を含むレトロウイルスベクターのコード配列である、SEQ ID NO:41を提供する。
図25Aの続きを示す図である。
図25Bの続きを示す図である。

0022

定義
本発明の理解を容易にするために、数多くの用語を以下に定義する。

0023

本明細書において用いられるように「宿主細胞」という用語は、インビトロまたはインビボのいずれにあるかを問わず、任意の真核生物細胞(例えば、哺乳類細胞、鳥類細胞両生類細胞、植物細胞魚類細胞および昆虫細胞)のことを指す。

0024

本明細書において用いられるように「細胞培養」という用語は、細胞の任意のインビトロ培養物のことを指す。この用語には、連続継代細胞系(例えば、不死化した表現型を有するもの)、初代細胞培養物有限継代性細胞系(例えば、非形質転換細胞)ならびに、卵母細胞およびを含む、インビトロで維持される任意の他の細胞集団が含まれる。

0025

本明細書において用いられるように「ベクター」という用語は、適切な制御因子を伴った場合に複製可能であり、細胞間の遺伝子配列移行を可能とする、プラスミド、ファージトランスポゾンコスミド染色体、ウイルス、ビリオンなどの任意の遺伝因子のことを指す。このため、この用語には、クローニング用および発現用の媒体、さらにウイルスベクターも含まれる。

0026

本明細書において用いられるように「組み込みベクター」という用語は、核酸(例えば、染色体)へのその組み込みまたは挿入がインテグラーゼを介して行われるベクターのことを指す。「組み込みベクター」の例には、レトロウイルスベクター、トランスポゾンおよびアデノ随伴ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

0027

本明細書において用いられるように「組み込まれた」という用語は、ゲノム中(すなわち、宿主細胞の染色体中)に安定的に挿入されたベクターのことを指す。

0028

本明細書において用いられるように「感染多重度」または「MOI」という用語は、宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入の際に用いられる組み込みベクター:宿主細胞の比のことを指す。例えば、100,000個の宿主細胞の形質導入に1,000,000個のベクターを用いる場合には、感染多重度は10である。この用語の使用は形質導入を伴うイベントには限定されず、リポフェクション、マイクロジェクション、リン酸カルシウム沈殿および電気穿孔などの方法による宿主細胞へのベクターの導入も含まれる。

0029

本明細書において用いられるように「ゲノム」という用語は、生物体遺伝物質(例えば、染色体)のことを指す。

0030

「関心対象のヌクレオチド配列」という用語は、その操作が何らかの理由(例えば、疾患の治療、質の改善、宿主細胞における関心対象のタンパク質の発現、リボザイムの発現など)で望ましいと当業者が考える、任意のヌクレオチド配列(例えば、RNAまたはDNA)のことを指す。このようなヌクレオチド配列には、構造遺伝子のコード配列(例えば、レポーター遺伝子選択マーカー遺伝子癌遺伝子薬剤耐性遺伝子増殖因子など)、および、mRNAまたはタンパク質産物をコードしない非コード性調節配列(例えば、プロモーター配列ポリアデニル化配列転写終結配列エンハンサー配列など)が含まれるが、これらに限定されない。

0031

本明細書において用いられるように「関心対象のタンパク質」とは、関心対象の核酸によってコードされるタンパク質のことを指す。

0032

本明細書において用いられるように「シグナルタンパク質」という用語は、関心対象のタンパク質とともに発現され、適切なアッセイによって検出された場合に関心対象のタンパク質の発現の間接的な証拠となるタンパク質のことを指す。本発明において有用なシグナルタンパク質の例には、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖、β-ガラクトシダーゼ、β-ラクタマーゼ緑色蛍光タンパク質およびルシフェラーゼが含まれるが、これらに限定されない。

0033

本明細書において用いられるように「外因性遺伝子」という用語は、宿主生物もしくは細胞に自然条件下では存在しない、または宿主生物もしくは細胞に人工的に導入された遺伝子のことを指す。

0034

「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆物質(例えば、プロインスリン)の産生のために必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNAまたはRNA)配列のことを指す。ポリペプチドは完全長コード配列によってコードされてもよく、または、完全長もしくは断片の必要な活性または機能的特性(例えば、酵素活性リガンド結合、シグナル伝達など)が保たれている限り、コード配列の任意の部分によってコードされてもよい。この用語には構造遺伝子のコード領域も含まれ、遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するような、コード領域の5'および3'端に隣接して位置する約1kbまたはそれ以上の範囲にわたる配列も含まれる。コード領域の5'側に位置し、mRNAにも存在する配列は5'非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3'側または下流に位置し、mRNAにも存在する配列は3'非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノム型の両方を含む。遺伝子のゲノム型またはクローンは、コード領域が「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたものを含む。イントロンは、核RNAhnRNA)へと転写される遺伝子の区域である;イントロンはエンハンサーなどの調節因子を含むことがある。イントロンは核内転写産物または一次転写産物から除去または「スプライスアウト(splice out)」される;このため、イントロンはメッセンジャーRNA(mRNA)転写産物中には存在しない。mRNAは翻訳時に新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順序を特定する働きをする。

0035

本明細書において用いられるように「遺伝子発現」という用語は、遺伝子の「転写」により(すなわち、RNAポリメラーゼ酵素作用による)、遺伝子にコードされた遺伝情報がRNA(例えば、mRNA、rRNAtRNAまたはsnRNA)に変換されるプロセス、タンパク質をコードする遺伝子の場合には、mRNAの「翻訳」によってタンパク質に変換される過程のことを指す。遺伝子発現はその過程における多くの段階で調節可能である。「上方制御(up-regulation)」または「活性化」とは、遺伝子発現産物(すなわち、RNAまたはタンパク質)の産生を増加させる調節のことを指し、「下方制御(down-regulation)」または「抑制」とは、産生を減少させる調節のことを指す。上方制御または下方制御に関与する分子(例えば、転写因子)はしばしば、それぞれ「活性化因子(activator)」および「抑制因子(repressor)」と呼ばれる。

0036

天然タンパク質分子アミノ酸配列に言及して本明細書に「アミノ酸配列」を詳述する場合、「アミノ酸配列」および類似の用語、例えば「ポリペプチド」または「タンパク質」は、アミノ酸配列を、詳述するタンパク質分子にみられる完全な天然型アミノ酸配列には限定しないものとする。

0037

本明細書において用いられるように「コードする核酸分子」「コードするDNA配列」「コードするDNA」「コードするRNA配列」および「コードするRNA」という用語は、デオキシリボ核酸またはリボ核酸ストランドに沿って並んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序または配列のことを指す。これらのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの順序が、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿って並ぶアミノ酸の順序を決定する。したがって、DNA配列またはRNA配列はアミノ酸配列をコードする。

0038

本明細書において用いられるように「変種」という用語は、タンパク質に言及して用いる場合、部分的に相同な核酸によってコードされるタンパク質のことを指し、このため、タンパク質のアミノ酸配列は異なる。本明細書において用いられるように「変種」という用語は、タンパク質の機能の変化を引き起こさない保存的および非保存的なアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質のほかに、タンパク質の機能の低下(例えば、ヌル変異)またはタンパク質の機能の上昇を引き起こすアミノ酸置換を有する相同遺伝子によってコードされるタンパク質も含む。

0039

本明細書において用いられるように「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対合則により関連づけられたポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)に言及して用いられる。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は配列「3'-T-C-A-5'」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って合致するというように「部分的」でもよい。または、核酸の間に「完全」または「全体的」な相補性があってもよい。核酸鎖の間の相補性の程度は、核酸鎖の間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは核酸同士の結合に依存する増幅反応ならびに検出方法において特に重要である。

0040

相同性」および「一致率(percent identity)」という用語は、核酸に関して用いる場合、相補性の程度のことを指す。これは部分的な相同性(すなわち、部分的同一性)でもよく、完全な相同性(すなわち、完全な同一性)でもよい。部分的に相補的な配列とは、完全に相補的な配列が標的核酸配列ハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するもののことであり、これは「実質的に相同な」という機能的用語を用いて呼ばれる。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、ハイブリダイゼーションアッセイ(サザンまたはノーザンブロット法溶液ハイブリダイゼーションなど)を低ストリンジェンシー条件下で用いて検討しうる。実質的に相同な配列またはプローブ(すなわち、関心対象の別のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド)は、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同な配列と標的配列との結合(すなわち、ハイブリダイゼーション)と競合する、またはそれを阻害すると考えられる。低ストリンジェンシー条件は非特異的な結合が許容されるような条件という訳ではない;低ストリンジェンシー条件は、2つの配列の相互の結合が特異的な(すなわち、選択的な)相互作用であることを必要とする。非特異的結合がないことは、部分的な程度の相補性すらない(例えば、同一性が約30%未満)第2の標的を用いることによって検証しうる;非特異的結合がないとプローブは第2の非相補的な標的とハイブリダイズしないと考えられる。

0041

当技術分野においては、さまざまな同等な条件を用いて低ストリンジェンシー条件を構成しうることが周知である;プローブの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成物)ならびに標的の性質(DNA、RNA、塩基組成物、溶液中に存在する、または固定化されているなど)ならびに塩および他の成分の濃度(例えば、ホルムアミドデキストラン硫酸ポリエチレングリコールの有無)などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して、上に挙げた条件とは異なるものの同等な低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を得ることができる。さらに、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促す条件(例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄段階の温度を高める、ハイブリダイゼーション溶液中にホルムアミドを用いるなど)も当技術分野において周知である。

0042

cDNAまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列の一方または両方のストランドとハイブリダイズしうる任意のプローブのことを指す。

0043

一本鎖核酸配列に言及して用いる場合、「実質的に相同な」という用語は、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズしうる(すなわち、その相補物である)任意のプローブのことを指す。

0044

本明細書において用いられるように「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的核酸対合を指して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の会合の強度)は、核酸間の相補性の程度、用いる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのTm、および核酸内部のG:C比などの要因による影響を受ける。単一の分子が構造の内部に相補的核酸の対合を含む場合には「自己ハイブリダイズした」という。

0045

本明細書において用いられるように「Tm」という用語は、核酸の「融解温度」を指して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子集団の半分が一本鎖解離する温度のことである。核酸のTmを算出するための式は当技術分野において周知である。標準的な参考文献に示されているように、核酸が1MNaCl水溶液中にある場合、T値の単純な推定値は以下の式によって算出しうる:
Tm=81.5+0.41(%G+C)
(例えば、AndersonおよびYoung、Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization[1985]を参照されたい)。その他の参考文献には、Tmの算出に配列特性のほかに構造特性も考慮に入れた、より精巧な計算が含まれる。

0046

本明細書において用いられるように「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う温度、イオン強度および有機溶媒などの他の化合物の存在といった条件を指して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件では、相補的塩基配列頻度が高い核酸断片の間のみで核酸塩基対合が起こると考えられる。このため、遺伝的に異なる生物に由来する核酸同士に対しては、相補的配列の頻度が通常低いことから、「弱」または「低」ストリンジェンシーの条件がしばしば必要となる。

0047

「高ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2Oおよび1.85g/lEDTA、pHはNaOHで7.4に調整)、0.5%SDS、5×デンハル試薬および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、0.1×SSPE、1.0%SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。

0048

「中程度のストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2Oおよび1.85g/lEDTA、pHはNaOHで7.4に調整)、0.5%SDS、5×デンハルト試薬および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、1.0×SSPE、1.0%SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。

0049

「低ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに言及して用いる場合、約500ヌクレオチド長のプローブを用いた際に、5×SSPE(43.8g/l NaCl、6.9g/l NaH2PO4・H2Oおよび1.85g/lEDTA、pHはNaOHで7.4に調整)、0.1%SDS、5×デンハルト試薬[50×デンハルト試薬は500ml当たり以下のものを含む:5g Ficoll(400型、Pharamcia)、5gBSA(第V画分;Sigma)]および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる42℃の溶液中での結合またはハイブリダイゼーションの後に、5×SSPE、0.1%SDSを含む42℃の溶液中で洗浄を行うことと同等な条件を含む。

0050

1つの遺伝子から、RNA一次転写産物の異なるスプライシングによって生成される多数のRNA種が生じてもよい。同一遺伝子のスプライス変種であるcDNAは、配列同一性または完全な相同性を有する領域(両方のcDNAに同じエクソンまたは同じエクソンの部分が存在することを表す)および完全に同一でない領域(例えば、cDNA 1にエクソン「A」が存在し、cDNA 2はその代わりにエクソン「B」を含むことを表す)を含む。2つのcDNAは配列同一性のある領域を含むため、それらはいずれも、両方のcDNAに認められる配列を含む遺伝子全体または遺伝子の部分に由来するプローブとハイブリダイズすると考えられる;このため、2つのスプライス変種はこのようなプローブおよびお互いと実質的に相同である。

0051

「機能的な組み合わせにある(in operable combination)」「機能的な順序にある(in operable order)」および「機能的に結合した」という用語は、本明細書で用いる場合、所定の遺伝子の転写および/または望ましいタンパク質分子の合成を指令しうる核酸分子が生じる様式で複数の核酸配列が結び付いていることを指す。この用語は、機能的なタンパク質が生じる様式で複数のアミノ酸配列が結び付いていることも指す。

0052

本明細書において用いられるように「選択マーカー」という用語は、通常であれば必須栄養素と考えられるものを含まない培地中での増殖能力を付与する酵素活性をコードする遺伝子(例えば、酵母細胞におけるHIS3遺伝子)のことを指す;さらに、選択マーカーは、選択マーカーが発現された細胞に抗生物質または薬剤に対する耐性を付与するものでもよい。選択マーカーは「優性」であってもよい;優性選択マーカーは、あらゆる真核生物細胞系で検出可能な酵素活性をコードする。優性選択マーカーの例には、薬剤G418に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド3'リン酸転移酵素遺伝子(neo遺伝子とも呼ばれる)、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンGリン酸転移酵素(hyg)遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt遺伝子とも呼ばれる)が含まれる。他の選択マーカーには、関連する酵素活性を欠く細胞系とともに用いる必要があるという点で優性でないものがある。非優性選択マーカーの例には、tk-細胞系とともに用いられるチミジンキナーゼ(tk)遺伝子、CAD欠損細胞とともに用いられるCAD遺伝子、およびhprt-細胞系とともに用いられる哺乳類ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(hprt)遺伝子が含まれる。哺乳類における選択マーカーの使用に関する総説は、Sambrook, J.ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York(1989)pp.16.9〜16.15にある。

0053

本明細書において用いられるように、「選択マーカーを欠くこと」という用語は、選択マーカーをコードする遺伝子を欠く組み込みベクターにおけるように、選択マーカーをコードする遺伝子を含まない組み込みベクターを指す。

0054

本明細書において用いられるように「無選択増殖(selection free growth)」という用語は、所定の選択マーカーに必要な選択条件(例えば、抗生物質または酵素活性の栄養素の欠損)の非存在下における増殖を指す。いくつかの好ましい態様において、「選択マーカーを欠く」組み込みベクターを含む宿主細胞もまた、無選択増殖に供される。

0055

本明細書において用いられるように「調節因子」という用語は、核酸配列の発現の何らかの局面を制御する遺伝因子のことを指す。例えば、プロモーターは、機能的に結合したコード領域の転写開始を促す調節因子である。他の調節因子には、スプライシングシグナルポリアデニル化シグナル、転写終結シグナル、RNA移行因子リボソーム内部進入部位などがある(以下に定義する)。

0056

真核生物における転写制御シグナルには、「プロモーター」因子および「エンハンサー」因子が含まれる。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するDNAの短い配列からなる(Maniatisら、Science 236:1237[1987])。プロモーター因子およびエンハンサー因子は、酵母昆虫および哺乳類細胞の遺伝子を含む種々の真核生物供給源、ならびにウイルスから単離されている(類似の制御因子、すなわちプロモーターは原核生物にも認められる)。個々のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、関心対象のタンパク質を発現させるためにどの細胞種を用いるかに依存する。真核生物プロモーターおよびエンハンサーの中には、宿主範囲幅広いものもあり、限定的な細胞種のサブセットのみで機能するものもある(総説については、Vossら、TrendsBiochem. Sci.、11:287[1986];およびManiatisら、前記を参照されたい)。例えば、SV40初期遺伝子エンハンサーは、多くの哺乳類種に由来するさまざまな細胞種で高い活性を示し、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く用いられている(Dijkemaら、EMBO J. 4:761[1985])。広範囲の哺乳類種において活性のあるプロモーター/エンハンサー因子の他の2つの例は、ヒト伸長因子1α遺伝子(Uetsukiら、J. Biol. Chem.、264:5791[1989];Kimら、Gene 91:217[1990];ならびにMizushimaおよびNagata、Nuc. Acids. Res.、18:5322[1990])、ならびにラウス肉腫ウイルス(Gormanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6777[1982])およびヒトサイトメガロウイルス(Boshartら、Cell 41:521[1985])の末端反復配列からのものである。

0057

本明細書において用いられるように「プロモーター/エンハンサー」という用語は、プロモーターおよびエンハンサーの両方の機能(すなわち、プロモーター因子およびエンハンサー因子によって与えられる機能、これらの機能に関する考察については上記参照)を提供しうる配列を含むDNAの区域のことを指す。例えば、レトロウイルスの末端反復配列はプロモーターおよびエンハンサーの両方の機能を含む。エンハンサー/プロモーターは「内因性」でもよく、「外因性」または「異種」でもよい。「内因性」エンハンサー/プロモーターは、ゲノム中で所定の遺伝子と自然条件下で結合しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー/プロモーターは、遺伝子の転写が結合したエンハンサー/プロモーターによって指令されるように、遺伝子操作(すなわち、クローニングおよび組換えなどの分子生物学技法)によって遺伝子と並置されたものである。

0058

調節因子は組織特異的または細胞特異的なものでもよい。「組織特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の組織(例えば、肝臓)に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、異なる種類の組織(例えば、)における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。

0059

調節因子の組織特異性を、例えば、レポーター遺伝子をプロモーター配列(組織特異的でないもの)および調節因子と機能的に結合させてレポーター構築物を作製し、レポーター構築物を動物のゲノムに導入して、その結果得られるトランスジェニック動物の全組織にレポーター構築物を組み込んだ上で、トランスジェニック動物の種々の組織におけるレポーター遺伝子の発現を検出すること(例えば、レポーター遺伝子によってコードされるmRNA、タンパク質またはタンパク質の活性を検出すること)によって評価してもよい。1つまたは複数の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルが他の組織におけるレポーター遺伝子の発現レベルよりも高いことを検出することにより、調節因子が、相対的に高い発現レベルが検出された組織に対して「特異的」であることが示される。したがって、本明細書において用いられるように「組織特異的「(例えば、肝特異的)」という用語は、発現の絶対的特異性を必要としない相対的な用語である。言い換えると、「組織特異的」という用語は、1つの組織の発現レベルが極めて高く、別の組織には全く発現がないことを要しない。1つの組織の発現が別のものよりも高いことで十分である。これに対して、「厳密な」または「絶対的な」組織特異的発現とは、単一の種類の組織(例えば、肝臓)における発現がみられ、他の組織における発現が検出不能であることを示すものとする。

0060

「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、特定の種類の細胞に対するヌクレオチド配列の選択的発現を指令し、同じ組織中の異なる種類の細胞における同じ関心対象のヌクレオチド配列の発現は相対的に引き起こさない調節因子のことを指す。「細胞種特異的」という用語は、調節因子に対して用いる場合、単一組織中のある領域における関心対象のヌクレオチド配列の選択的発現を促しうる調節因子のことも意味する。

0061

調節因子の細胞種特異性は、当技術分野において周知の方法(例えば、免疫組織化学的染色および/またはノーザンブロット分析)を用いて評価しうる。簡潔に述べると、免疫組織化学的染色のためには、組織切片パラフィン中に包埋し、このパラフィン切片を、調節因子によって発現が調節される関心対象のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド産物に対して特異的な一次抗体と反応させる。一次抗体に対して特異的な標識化した(例えば、ペルオキシダーゼを結合させた)二次抗体切片化した組織と結合させ、特異的結合顕微鏡によって検出する(例えば、アビジン/ビオチンを用いる)。簡潔に述べうると、ノーザンブロット分析のためには、RNAを細胞から単離し、アガロースゲル上で電気泳動を行ってRNAをサイズ別分画した後に、RNAをゲルから固体支持体(例えば、ニトロセルロースまたはナイロン膜)に移す。続いて、固定化したRNAを標識化したオリゴデオキシリボヌクレオチドプローブまたはDNAプローブにより検索し、用いたプローブに対して相補的なRNA種を検出する。ノーザンブロットは分子生物学者にとって標準的なツールである。

0062

「プロモーター」「プロモーター因子」または「プロモーター配列」という用語は、本明細書で用いる場合、関心対象のヌクレオチド配列と連結した場合に関心対象のヌクレオチド配列のmRNAへの転写を制御しうるDNA配列のことを指す。プロモーターは、mRNAへの転写を制御する関心対象のヌクレオチド配列の5'側(すなわち、上流)に位置し、転写開始のためにRNAポリメラーゼおよび他の転写因子による特異的結合が起こる部位を備えることが、必然的ではないものの一般的である。

0063

プロモーターは構成性でも調節性でもよい。「構成性」という用語は、プロモーターに言及する場合、プロモーターが、刺激(例えば、熱ショック化学物質など)がなくとも、機能的に結合した核酸配列の転写を指令しうることを意味する。これに対して、「調節性」プロモーターとは、刺激(例えば、熱ショック、化学物質など)の存在下で、機能的に結合した核酸配列の、刺激の非存在下における機能的に結合した核酸配列の転写レベルとは異なるレベルの転写を指令しうるもののことである。

0064

発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在すると、組換え転写産物の発現レベルの上昇がしばしば起こる。スプライシングシグナルはRNA一次転写産物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナー部位およびアクセプター部位からなる(Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York[1989]、pp.16.7〜16.8)。よく用いられるスプライスドナー部位およびアクセプター部位は、SV40の16S RNAに由来するスプライス部位である。

0065

真核生物細胞における組換えDNA配列の効率的発現には、効率的な転写終結およびその結果生じた転写産物のポリアデニル化を指令するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは一般にポリアデニル化シグナルの下流に認められ、長さは数百ヌクレオチドである。本明細書において用いられるように「ポリA部位」または「ポリA配列」という用語は、転写終結および新生RNA転写産物のポリアデニル化を指令するDNA配列のことを表す。ポリA尾部を持たない転写産物は不安定で急速に分解されるため、組換え転写産物が効率的にポリアデニル化されることが望ましい。発現ベクター中に用いるポリAシグナルは「異種」でも「内因性」でもよい。内因性ポリAシグナルとは、ゲノム中で所定の遺伝子のコード領域の3'端に天然に認められるもののことである。異種ポリAシグナルとは、1つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の3'側に配置されたもののことである。よく用いられる異種ポリAシグナルはSV40ポリAシグナルである。SV40ポリAシグナルは237bpのBamHI/BclI制限断片に含まれており、転写終結およびポリアデニル化の両方を指令する(Sambrook、前記、16.6〜16.7)。

0066

真核生物発現ベクターが「ウイルスレプリコン」または「ウイルス複製起点」を含んでいてもよい。ウイルスレプリコンは、適切な複製因子を発現する宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を可能とするウイルスDNA配列である。SV40またはポリオーマウイルスの複製起点を含むベクターは、適切なウイルスT抗原を発現する細胞内で高「コピー数」(最大104コピー/細胞)へと複製される。ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン-バーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは染色体外で「低コピー数」(ほぼ100コピー/細胞)の複製が起こる。しかし、発現ベクターは何らかの特定のウイルス複製起点には限定されないものとする。

0067

本明細書において用いられるように「末端反復配列」または「LTR」とは、レトロウイルスゲノムの5'および3'側のU3領域に位置するか、またはそこから単離された転写制御因子のことを指す。当技術分野において公知のように、末端反復配列をレトロウイルスベクター中の制御因子として用いてもよく、または、レトロウイルスゲノムから単離して他の種類のベクターからの発現を制御するために用いてもよい。

0068

本明細書において用いられるように「分泌シグナル」という用語は、シグナルペプチドをコードする組換えDNA配列と機能的に結合させた場合に組換えポリペプチド分泌を引き起こすことができる任意のDNA配列のことを指す。一般に、シグナルペプチドは一連の約15〜30個の疎水性アミノ酸残基を含む(例えば、Zwizinskiら、J. Biol. Chem. 255(16):7973〜77[1980]、Grayら、Gene 39(2):247〜54[1985]およびMartialら、Science 205:602〜607[1979]を参照されたい)。このような分泌シグナル配列は、組織特異的発現の標的となる細胞種から分泌されるポリペプチド(例えば、乳腺分泌細胞における発現およびそれからの分泌の目的には乳タンパク質)をコードする遺伝子に由来することが好ましい。しかし、分泌性DNA配列はこのような配列には限定されない。多くの細胞種および生物体から分泌されるタンパク質に由来する分泌性DNA配列を用いてもよい(例えば、t-PA、血清アルブミンラクトフェリンおよび成長ホルモンに対する分泌シグナル、ならびに酵母、糸状菌および細菌などの分泌性ポリペプチドをコードする微生物遺伝子に由来する分泌シグナル)。

0069

本明細書において用いられるように「RNA移行因子」または「mRNA前駆体プロセシングエンハンサー(PPE)」とは、核からのRNAの輸送を増強する3'および5'シス作用性転写後調節因子のことを指す。「PPE」因子には、メルツ(Mertz)配列(米国特許第5,914,267号および第5,686,120号に記載、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)およびウッドチャックmRNAプロセシングエンハンサー(WPRE;国際公開公報第99/14310号および米国特許第6,136,597号、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる)が含まれるが、これらに限定されない。

0070

本明細書において用いられるように「多シストロン性」と言う用語は、複数のポリペプチド鎖をコードするmRNAのことを指す(例えば、国際公開公報第93/03143号、国際公開公報第88/05486号および欧州特許第117058号を参照されたい、これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。同様に「多シストロン性配列中に配置された」という用語は、単一のmRNA中に2つの異なるポリペプチド鎖をコードする遺伝子の配置のことを指す。

0071

本明細書において用いられるように「リボソーム内部進入部位」または「IRES」という用語は、二シストロン性mRNAの翻訳の内部開始によって第2の遺伝子から生じる発現産物の産生を可能とする、多シストロン性遺伝子の間に位置する配列のことを指す。リボソーム内部進入部位には、口蹄疫ウイルスFDV)、脳心筋炎ウイルスポリオウイルスおよびRDVに由来するものが含まれるが、これらに限定されない(Scheperら、Biochem. 76:801〜809[1994];Meyerら、J. Virol. 69:2819〜2824[1995];Jangら、1988、S. Virol. 62:2636〜2643[1998];Hallerら、J. Virol. 66:5075〜5086[1995])。IRESが組み入れられたベクターは当技術分野において公知のように構成しうる。例えば、多シストロン性配列を含むレトロウイルスベクターは、機能的に結び付いた以下の因子を含みうる:ヌクレオチドポリリンカー、関心対象の遺伝子、リボソーム内部進入部位および哺乳類選択マーカーまたは関心対象の別の遺伝子。多シストロン性カセットは、5'LTRプロモーターからの転写によって多シストロン性メッセージカセットが転写されるような、レトロウイルスベクター内部の5' LTRと3' LTRとの間の位置に置かれる。多シストロン性メッセージカセットの転写を、用途に即して好ましいと思われる内部プロモーター(例えば、サイトメガロウイルスプロモーター)または誘導性プロモーターによって駆動させてもよい。多シストロン性メッセージカセットはさらに、機能的に結び付いたcDNAまたはゲノムDNA(gDNA)配列をポリリンカー内部に含みうる。任意の哺乳類選択マーカーを、多シストロン性メッセージカセットの哺乳類選択マーカーとして用いることができる。このような哺乳類選択マーカーは当業者に周知であり、これにはカナマイシン/G418、ハイグロマイシンBまたはミコフェノール酸耐性マーカーが含まれるが、これらに限定されない。

0072

本明細書において用いられるように「レトロウイルス」という用語は、細胞内に侵入し、レトロウイルスゲノム(二本鎖プロウイルスとして)を宿主細胞のゲノムに組み込むことができるレトロウイルス粒子のことを指す(すなわち、この粒子は、宿主細胞表面と結合して宿主細胞の細胞質へのウイルス粒子の侵入を促進しうる、外被タンパク質またはウイルスG糖タンパク質などの膜関連タンパク質を含む)。「レトロウイルス」という用語には、オンコウイルス亜科(例えば、モロニーマウス白血病ウイルス(MoMOLV)、モロニーマウス肉腫ウイルス(MoMSV)およびマウス乳腺癌ウイルス(MMTV))、スプマウイルス亜科およびレンチウイルス亜科(例えば、ヒト免疫不全ウイルスサル免疫不全ウイルスウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルスが含まれる;例えば、米国特許第5,994,136号および第6,013,516号を参照されたい。これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる)。

0073

本明細書において用いられるように「レトロウイルスベクター」という用語は、関心対象の遺伝子を発現するように改変されたレトロウイルスのことを指す。レトロウイルスベクターは、ウイルスの感染プロセスを利用することにより、宿主細胞に遺伝子を効率的に導入するために用いることができる。レトロウイルスゲノム中にクローニングされた(すなわち、分子生物学の技法を用いて挿入された)外来遺伝子または異種遺伝子を、レトロウイルス感染に対する感受性のある宿主細胞に効率的に送達することができる。よく知られた遺伝子操作により、レトロウイルスゲノムの複製能を消失させることが可能である。この結果得られる複製能欠損ベクターは新たな遺伝物質を細胞に導入するために用いうるが、自らは複製を行えない。ヘルパーウイルスまたはパッケージング細胞系を、ベクター粒子集合および細胞からの流出を可能にするために用いることができる。このようなレトロウイルスベクターは、少なくとも1つの関心対象の遺伝子をコードする核酸配列(多シストロン性核酸配列は複数の関心対象の遺伝子をコードしうる)、5'レトロウイルス末端反復配列(5'LTR);および3'レトロウイルス末端反復配列(3' LTR)を含む複製能欠損レトロウイルスのゲノムを含む。

0074

「偽型のレトロウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質を含むレトロウイルスベクターのことを指す。「膜関連タンパク質」という用語は、ウイルス粒子を取り囲む膜に付随するタンパク質のことを指す(例えば、VSV、ピリー、チャンディプラおよびモコラなどのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはGタンパク質);これらの膜関連タンパク質はウイルス粒子の宿主細胞への侵入を媒介する。レトロウイルス外被タンパク質の場合のように膜関連タンパク質が特異的な細胞表面タンパク質受容体と結合する場合もあり、またはラブドウイルス科のメンバーに由来するGタンパク質の場合のように膜関連タンパク質が宿主細胞の原形質膜リン脂質成分と相互作用する場合もある。

0075

「異種膜関連タンパク質」という用語は、ベクター粒子のヌクレオキャプシドタンパク質の由来である同じウイルスまたは科のメンバーではないウイルスに由来する膜関連タンパク質のことを指す。「ウイルス綱または科」とは、国際ウイルス分類委員会(International Committee on Taxonomy of Virus)により指定された網または科という分類学上の等級を指す。

0076

「ラブドウイルス科」という用語は、ヒトを含む動物および植物を感染させる、外被を有するRNAウイルスの科のことを指す。ラブドウイルス科は、水疱性口内炎ウイルス(VSV)、球菌ウイルス、ピリーウイルス、チャンディプラウイルスおよびコイ春ウイルス病ウイルスを含むベシクロウイルス属を含む(コイ春ウイルス病ウイルスをコードする配列はGenBankアクセッション番号U18101で入手可能)。ベシクロウイルス属のウイルスのGタンパク質はウイルスにコードされた内在性膜タンパク質であり、受容体結合および膜融合に必要な、外側に突出したホモ三量体棘状糖タンパク質複合体を形成する。ベシクロウイルス属のウイルスのGタンパク質には、共有結合したパルミチン酸(C16)部分がある。ベシクロウイルス由来のGタンパク質のアミノ酸配列はかなりよく保存されている。例えば、ピリーウイルスのGタンパク質とVSVのGタンパク質の同一性は約38%であり、類似性は約55%である(VSVにはIndiana株、New Jersey株、Orsay株、San Juan株などの複数の株が知られており、それらのGタンパク質の相同性は高い)。チャンディプラウイルスのGタンパク質とVSV Gタンパク質の同一性は約37%であり、類似性は52%である。ベシクロウイルスのGタンパク質の保存性(アミノ酸配列)が高度であり、機能特性(例えば、合胞体形成を含む、ウイルスの宿主細胞との結合および膜融合)が類似していることを考えると、ウイルス粒子の偽型化のために、VSV以外のベシクロウイルス由来のGタンパク質をVSV Gタンパク質の代わりに用いうると考えられる。リサウイルス(ラブドウイルス科に属する別の属)のGタンパク質も、VSV Gタンパク質との間に高度の保存性があり、同様の様式で作用するため(例えば、膜融合を媒介する)、ウイルス粒子の偽型化のためにVSV Gタンパク質の代わりに用いうる。リサウイルスには、モコラウイルスおよび狂犬病ウイルスが含まれる(狂犬病ウイルスには複数の株が知られており、それらのGタンパク質はクローニングおよび配列決定がなされている)。モコラウイルスのGタンパク質にはVSV Gタンパク質と相同な領域があり(特に細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン)、VSV Gタンパク質との同一性は約31%、類似性は48%である。好ましいGタンパク質は、VSV Gタンパク質と少なくとも25%の同一性、好ましくは少なくとも30%の同一性、最も好ましくは少なくとも35%の同一性を有するものである。ニュージャージー株からのVSV Gタンパク質(このGタンパク質の配列はGenBankアクセッション番号M27165およびM21557に示されている)を、基準VSV Gタンパク質として用いる。

0077

本明細書において用いられるように「レンチウイルスベクター」という用語は、レンチウイルス亜科(例えば、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびヤギ関節炎脳炎ウイルス)に由来する、非分裂細胞への組み込みが可能なレトロウイルスベクターのことを指す(例えば、米国特許第5,994,136号および第6,013,516号を参照されたい。これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる)。

0078

「偽型のレンチウイルスベクター」という用語は、異種膜タンパク質(例えば、VSV、ピリー、チャンディプラおよびモコラなどのラブドウイルス科のウイルスのウイルス外被糖タンパク質またはGタンパク質)を含むレンチウイルスベクターのことを指す。

0079

本明細書において用いられるように「トランスポゾン」という用語は、ゲノム中の1つの位置から別の位置への移動または転位が可能な転位因子(例えば、Tn5、Tn7およびTn10)のことを指す。一般に、転位はトランスポザーゼによって制御される。本明細書において用いられるように「トランスポゾンベクター」という用語は、関心対象の核酸がトランスポゾンの末端と隣接したものをコードするベクターのことを指す。トランスポゾンベクターの例には、米国特許第6,027,722号;第5,958,775号;第5,968,785号;第5,965,443号および第5,719,055号(これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。

0080

本明細書において用いられるように「アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクター」という用語は、AAV-1、AAV-2、AAV3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むが、これらに限定されない血清型のアデノ随伴ウイルスに由来するベクターのことを指す。AAVベクターは、全体または一部、好ましくはrepおよび/もしくはcap遺伝子欠失しているものの機能的なフランキングITR配列は保持している、1つまたは複数のAAV野生型遺伝子を有しうる。

0081

AAVベクターは、当技術分野において公知の組換え技術を用いて、機能的なAAV ITRが両端(5'および3')に隣接した1つまたは複数の異種ヌクレオチド配列を含むように構築することができる。本発明の実施に際して、AAVベクターは少なくとも1つのAAV ITR、異種ヌクレオチド配列の上流に位置する適したプロモーター配列、および異種配列の下流に位置する少なくとも1つのAAV ITRを含みうる。「組換えAAVベクタープラスミド」とは、ベクターがプラスミドを含む、ある種の組換えAAVベクターのことを指す。一般的なAAVベクターの場合と同じく、5'および3' ITRが選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する。

0082

AAVベクターは、ポリアデニル化部位などの転写配列のほか、選択マーカーまたはレポーター遺伝子、エンハンサー配列、および転写の誘導を可能とする他の制御因子を含むこともできる。このような制御因子については上に述べた。

0083

本明細書において用いられるように「AAVビリオン」という用語は、完全なウイルス粒子のことを指す。AAVビリオンは野生型AAVウイルス粒子(線状の一本鎖AAV核酸ゲノムを含み、AAVキャプシド、すなわちタンパク質外被を伴う)でもよく、組換えAAVウイルス粒子(以下に述べる)でもよい。この点に関して、一本鎖AAV核酸分子(センス/コード鎖またはアンチセンス/アンチコード鎖のいずれか。これらの用語は一般的な定義による)はAAVビリオンへのパッケージングが可能である;センス鎖およびアンチセンス鎖には同じ感染性がある。

0084

本明細書において用いられるように「組換えAAVビリオン」または「rAAV」という用語は、5'および3'側にAAV ITRが隣接した異種ヌクレオチド配列がAAVタンパク質外殻キャプシド化された(すなわち、タンパク質外被で囲まれた)ものから構成される、感染性のある複製能欠損ウイルスのことを指す。組換えAAVビリオンを構築するための技法は当技術分野において数多く公知である(例えば、米国特許第5,173,414号;国際公開公報第92/01070号;国際公開公報第93/03769号;Lebkowskiら、Molec. Cell. Biol. 8:3988〜3996[1988];Vincentら、Vaccines 90[1990](Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter、Current Opinion in Biotecnhnology 3:533〜539[1992];Muzyczka、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97〜129[1992];Kotin、Human Gene Therapy 5:793〜801[1994];ShellingおよびSmith、Gene Therapy 1:165〜169[1994];ならびにZhouら、J. Exp. Med. 179:1867〜1875[1994]を参照されたい。これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。

0085

AAVベクター(実際には、本明細書に記載のすべてのベクター)中に用いるのに適したヌクレオチド配列には、機能的に適切な任意のヌクレオチド配列が含まれる。このため、本発明のAAVベクターは、標的細胞ゲノムでは欠陥があるもしくは欠失しているタンパク質をコードする、または望ましい生物的もしくは治療的効果(例えば、抗ウイルス作用)を有する非天然タンパク質をコードする任意の望ましい遺伝子を含むことができ、または、配列がアンチセンスもしくはリボザイムの機能を有する分子に対応してもよい。適した遺伝子には、以下の疾患の治療のために用いられるものが含まれる:AIDS、癌、神経疾患心血管疾患高コレステロール血症などの疾患を含む炎症性疾患自己免疫疾患慢性疾患および感染症;種々の貧血サラセミアおよび血友病を含む種々の血液疾患嚢胞性線維症ゴーシェ病アデノシンデアミナーゼ(ADA)欠損症肺気腫などの遺伝的欠損。癌およびウイルス性疾患に対するアンチセンス療法において有用な、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド(例えば、mRNAの翻訳開始部位(AUGコドン)の周りの配列に対して相補的な短いオリゴヌクレオチド)が当技術分野において記載されている(例えば、Hanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4313〜4317[1991];Uhlmannら、Chem. Rev. 90:543〜584[1990];Heleneら、Biochim. Biophys. Acta. 1049:99〜125[1990];Agarwalら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:7079〜7083[1989];およびHeikkilaら、Nature 328:445〜449[1987]を参照されたい)。適したリボザイムに関する考察については、例えば、Cechら(1992)J. Biol. Chem. 267:17479〜17482および米国特許第5,225,347号(これらは参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい。

0086

「アデノ随伴ウイルス逆方向末端反復配列」または「AAV ITR」とは、DNA複製起点およびウイルスに対するパッケージングシグナルとしてシス的に協同作用する、AAVゲノムの両端に存在する当技術分野で認知されているパリンドローム領域を意味する。本発明に用いるためには、選択した1つまたは複数の異種ヌクレオチド配列の5'および3'側にフランキングAAV ITRを配置し、これをrepコード領域またはRep発現産物と併用することにより、選択した配列の標的細胞ゲノム中への組み込みが得られる。

0087

AAV ITR領域のヌクレオチド配列は(例えば、AAV-2配列に関しては、Kotin、Human Gene Therapy 5:793〜801[1994];Berns, K.I. Parvoviridae and their replication、Fundamental Virology、第2版(B.N. FieldsおよびD.M. Knipe編)を参照されたい)。本明細書において用いられるように「AAV ITR」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えばヌクレオチドの挿入、除去または置換によって改変してもよい。さらに、AAV ITRは、AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAVX7などを含むが、これらに限定されない複数のAAV血清型のいずれに由来してもよい。選択した異種ヌクレオチド配列に隣接する5'および3' ITRは、意図した通りに機能する限り、すなわちrep遺伝子が(同じまたは異なるベクター上に)存在する場合またはRep発現産物が標的細胞内に存在する場合に、付随する異種配列の標的細胞ゲノム中への組み込みを行える限り、必ずしも同一である必要はなく、同じAAV血清型または分離株に由来する必要もない。

0088

本明細書において用いられるように「インビトロ」という用語は、人工的環境、および人工的環境で起こるプロセスまたは反応のことを指す。インビトロ環境は、試験管および細胞培養物から非制限的に構成される。「インビボ」という用語は、自然環境(例えば、動物または細胞)、および自然環境内で起こるプロセスまたは反応のことを指す。

0089

本明細書において用いられるように「クローン由来である」という用語は、単一細胞に由来する細胞系のことを指す。

0090

本明細書において用いられるように「クローン的に選択する」という用語は、単一の細胞に由来する細胞系を選択する(例えば、組み込まれたベクターの存在について選択する)ことを指す。

0091

本明細書において用いられるように「非クローン由来である」とは、複数の細胞に由来する細胞系のことを指す。

0092

本明細書において用いられるように「継代」という用語は、特定の密度または集密度(例えば、70%または80%の集密度)まで増殖した細胞の培養物希釈し、希釈した細胞を再び望ましい特定の密度または集密度へと増殖させるプロセスのことを指す(例えば、細胞の再プレーティング、または細胞を用いて新たな回転瓶培養物を樹立することによる)。

0093

本明細書において用いられるように「安定な」という用語は、ゲノムに言及して用いる場合、ゲノムの情報内容が1つの世代から次の世代に、または細胞系という特定の場合には、1つの継代物から次の継代物へと安定的に維持されることを指す。したがって、ゲノムに大きな変化(例えば、遺伝子の欠失または染色体転座)が起こっていなければゲノムは安定であるとみなす。「安定な」という用語は、ゲノムに点変異などのわずかな変化が起こっている可能性を否定するものではない。

0094

本明細書において用いられるように「反応」という用語は、アッセイに言及して用いる場合、検出可能なシグナル(例えば、レポータータンパク質蓄積イオン濃度の上昇、検出可能な化学生成物の蓄積)の発生のことを指す。

0095

本明細書において用いられるように「膜受容体タンパク質」という用語は、リガンド(例えば、ホルモンまたは神経伝達物質)が結合する膜貫通タンパク質のことを指す。当技術分野において公知のように、タンパク質のリン酸化は、調節シグナル細胞外から核へと運ぶタンパク質を選択的に修飾するために細胞が用いる一般的な調節機構である。これらの生化学的修飾を遂行するタンパク質は、プロテインキナーゼとして公知の一群酵素である。それらはさらに、リン酸化の標的とする基質残基によっても定義しうる。プロテインキナーゼの1つの群に、標的タンパク質チロシン残基を選択的にリン酸化するチロシンキナーゼ(TK)がある。チロシンキナーゼの一部は膜結合型受容体(RTK)であり、これらはリガンドによって活性化されると基質の修飾に加えて自己リン酸化も行いうる。リガンド刺激による連続的リン酸化の開始は、例えば上皮増殖因子(EGF)、インスリン、血小板由来増殖因子(PDGF)および線維芽細胞増殖因子(FGF)などの、この種のエフェクターの作用の基盤を成すパラダイムである。これらのリガンドに対する受容体はチロシンキナーゼであり、これらはリガンド(ホルモン、増殖因子)の標的細胞との結合、および1つまたは複数の生化学的経路の活性化によるシグナルの細胞内への伝達のインターフェースとなる。受容体チロシンキナーゼに対するリガンドの結合により、その固有の酵素活性が活性化される(例えば、UllrichおよびSchlessinger、Cell 61:203〜212[1990]を参照されたい)。チロシンキナーゼは細胞質の非受容体型酵素のこともあり、これはシグナル伝達経路の下流成分として作用する。

0096

本明細書において用いられるように「シグナル伝達タンパク質」という用語は、膜受容体タンパク質に対するリガンド結合または何らかの他の刺激により、活性化または別の様式の影響を受けるタンパク質のことを指す。シグナル伝達タンパク質の例には、アデニルシクラーゼホスホリパーゼCおよびGタンパク質が含まれる。多くの膜受容体タンパク質はGタンパク質と共役している(すなわち、Gタンパク質共役受容体(GPCR);総説については、Neer、1995、Cell 80:249〜257[1995]を参照されたい)。一般に、GPCRは7つの膜貫通ドメインを含む。公知のGPCRとの配列相同性に基づいて、GPCRと推定されるものを同定することが可能である。

0097

GPCRは、GPCRの細胞外部分に対するリガンドの結合によって生じる、細胞膜を介したシグナル伝達を媒介する。GPCRの細胞内部分はGタンパク質と相互作用し、細胞の外側から内側へのシグナル伝達の調節を行う。このため、GPCRはGタンパク質と「共役している」という。Gタンパク質は、GTPと結合してそれを加水分解するαサブユニットおよび二量体のβγサブユニットという3つのポリペプチドサブユニットから構成される。活性化されていない基底状態では、Gタンパク質はαおよびβγサブユニットのヘテロ三量体として存在する。Gタンパク質が活性化されると、グアノシン二リン酸GDP)がGタンパク質のαサブユニットと会合する。GPCRがリガンドと結合して活性化されると、GPCRはGタンパク質ヘテロ三量体と結合し、GαサブユニットのGDPに対する親和性を低下させる。活性化状態では、GサブユニットはGDPをグアニン三リン酸(GTP)と交換し、活性型Gaサブユニットが受容体および二量体βγサブユニットの両方から解離する。解離した活性型Gαサブユニットは、細胞内のGタンパク質シグナル伝達経路の「下流」にあるエフェクターにシグナルを伝達する。最終的に、Gタンパク質の内因性GTPアーゼ活性により、活性型GサブユニットはGDPおよび二量体βγサブユニットと会合した不活性状態復帰する。

0098

ヘテロ三量体Gタンパク質ファミリーのメンバーは数多くクローニングされており、これには種々のGαサブユニットをコードする20種を上回る遺伝子が含まれる。これらの種々のGサブユニットは、アミノ酸配列および機能的相同性に基づいて4つのファミリーに分類されている。これらの4つのファミリーはGαs、Gαi、GαqおよびGα12と命名されている。機能的には、これらの4つのファミリーは、活性化する細胞内シグナル伝達経路および共役するGPCRの点で異なる。

0099

例えば、ある種のGPCRは通常Gαsと共役しており、これらのGPCRはGαsを介してアデニリルシクラーゼ活性を刺激する。他のGPCRは通常GGαqと共役しており、これらのGPCRはGGαqを介して、ホスホリパーゼCのβアイソフォーム(すなわちPLCβ、StermweisおよびSmrcka、Trendsin Biochem. Sci. 17:502〜506[1992])などのホスホリパーゼC(PLC)を活性化することができる。

0100

本明細書において用いられるように「核酸結合タンパク質」という用語は、核酸と結合するタンパク質のことを指し、特に、遺伝子からの転写を増加させる(すなわち、活性化物質または転写因子)または減少させる(すなわち、阻害物質)タンパク質のことを指す。

0101

本明細書において用いられるように「イオンチャネルタンパク質」という用語は、細胞膜を介したイオンの流入または流出を制御するタンパク質のことを指す。イオンチャネルタンパク質の例には、Na+-K+ATPアーゼポンプ、Ca2+ポンプおよびK+漏洩チャネルが含まれるが、これらに限定されない。

0102

本明細書において用いられるように「プロテインキナーゼ」という用語は、ヌクレオシド三リン酸に由来するリン酸基のタンパク質のアミノ酸側鎖への付加を触媒するタンパク質のことを指す。キナーゼは公知の酵素スーパーファミリーのうち最大のものであり、その標的タンパク質は極めて広範囲にわたる。キナーゼは、チロシン残基をリン酸化するタンパク質チロシンキナーゼ(PTK)、ならびにセリンおよび/またはトレオニン残基をリン酸化するタンパク質セリン/トレオニンキナーゼ(STK)に分類しうる。一部のキナーゼは、セリン/トレオニンおよびチロシン残基に対する二重特異性を有する。ほとんどすべてのキナーゼは、保存的な250〜300アミノ酸の触媒ドメインを含む。このドメインはさらに11種のサブドメインに分けることができる。N末端サブドメインI〜IVはフォールディングにより、ATPドナー分子と結合してそれを正しい方向に配置させる二葉状構造を生じ、サブドメインVはこの二葉部分にまたがる。C末端サブドメインVI〜XIはタンパク質の基質と結合し、γリン酸をセリン、トレオニンまたはチロシン残基のヒドロキシル基転移させる。11種のサブドメインはそれぞれ、そのサブドメインに特徴的な特定の触媒残基またはアミノ酸モチーフを含む。例えば、サブドメインIは8アミノ酸のグリシン富むATP結合コンセンサスモチーフを含み、サブドメインIIは最大限触媒活性のために必要な決定的に重要なリジン残基を含み、サブドメインVI〜IXは高度に保存された触媒コアを含む。STKおよびPTKは、サブドメインVIおよびVIIIにヒドロキシアミノ酸特異性を付与すると思われる独特配列モチーフも含んでいる。一部のSTKおよびPTKは双方のファミリーの構造的特徴共有している。さらに、キナーゼを、キナーゼドメインに隣接して、またはその内部に存在する、一般に5〜100残基の付加的なアミノ酸配列によって分類することもできる。

0103

膜貫通型PTKは、原形質膜受容体の細胞質ドメインとシグナル伝達複合体を形成する。非膜貫通型PTKを通じてシグナルを伝達する受容体には、サイトカイン受容体ホルモン受容体および抗原特異的リンパ球受容体が含まれる。多くのPTKは最初、PTK活性化が正常な細胞制御を受けていない癌細胞における癌遺伝子の産物として同定された。実際に、公知の癌遺伝子の3分の1はPTKをコードしている。さらに、細胞形質転換発癌)はしばしばチロシンリン酸化活性の上昇を伴う(例えば、Carbonneau、H.およびTonks、Annu. Rev. Cell Biol. 8:463〜93[1992]を参照されたい)。このため、PTK活性の調節は、ある種の癌を抑制する上で重要な戦略であると考えられる。

0104

プロテインキナーゼの例には、cAMP依存性プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼCおよびサイクリン依存性プロテインキナーゼが含まれるが、これらに限定されない(例えば、米国特許第6,034,228号;第6,030,822号;第6,030,788号;第6,020,306号;第6,013,455号;第6,013,464号;および第6,015,807号を参照されたい。これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。

0105

本明細書において用いられるように「プロテインホスファターゼ」という用語は、タンパク質からリン酸基を除去するタンパク質のことを指す。プロテインホスファターゼは一般に、受容体型および非受容体型のタンパク質という2つの群に分けられる。ほとんどの受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、それぞれ240アミノ酸残基の区域を含む、2つの保存的な触媒ドメインを含む(例えば、Saitoら、Cell Growth and Diff. 2:59〜65[1991]を参照されたい)。受容体型プロテインチロシンホスファターゼは、細胞外ドメインのアミノ酸配列の多様性に基づいてさらに細分することができる(例えば、Kruegerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7417〜7421[1992]を参照されたい)。プロテインホスファターゼの例には、cdc25 a、bおよびc、PTP20、PTP1DおよびPTPλが含まれるが、これらに限定されない(例えば、米国特許第5,976,853号;第5,994,074号;第6,004,791号;第5,981,251号;第5,976,852号;第5,958,719号;第5,955,592号;および第5,952,212号を参照されたい。これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。

0106

本明細書において用いられるように「癌遺伝子によってコードされるタンパク質」という用語は、直接的または間接的に、宿主細胞の悪性形質転換を引き起こすタンパク質のことを指す。癌遺伝子の例には以下の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない:src、fps、fes、fgr、ros、H-ras、abl、ski、erbA、erbB、fms、fos、mos、sis、myc、myb、rel、kit、raf、K-rasおよびets。

0107

本明細書において用いられるように「免疫グロブリン」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。免疫グロブリンには、ポリクローナル抗体モノクローナル抗体キメラ抗体およびヒト化抗体Fab断片、F(ab')2断片が含まれるが、これらに限定されず、以下のクラスの免疫グロブリンが含まれる:IgG、IgA、IgM、IgD、IbEおよび分泌型免疫グロブリン(sIg)。免疫グロブリンは一般に、2つの同一な重鎖(γ、α、μ、δまたはε)および2つの軽鎖(κまたはλ)を含む。

0108

本明細書において用いられるように「抗原結合タンパク質」という用語は、特異的抗原と結合するタンパク質のことを指す。「抗原結合タンパク質」には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を含む免疫グロブリン;Fab断片、F(ab')2断片およびFab発現ライブラリー;ならびに一本鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。当技術分野において公知のさまざまな手順がポリクローナル抗体の作製のために用いられる。抗体の作製のためには、望ましいエピトープに対応するペプチドの注射による免疫処置を、ウサギマウスラットヒツジ、ヤギなどを含むが、これらに限定されない種々の宿主動物に行うとよい。1つの好ましい態様では、ペプチドを免疫原性担体(例えば、ジフテリアトキソイドウシ血清アルブミン(BSA)またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH))と結合させる。免疫応答を高めるために、フロイントアジュバント(完全および不完全)、水酸化アルミニウムなどの無機質ゲル、リゾレシチンプルロニックポリオールポリアニオン、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールなどの表面活性物質、ならびにBCGカルメット-ゲラン菌)およびコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)などの有用と考えられるヒトアジュバントを含むが、これらに限定されない種々のアジュバントを宿主種に応じて用いる。

0109

モノクローナル抗体の調製のためには、培養下にある連続継代細胞系による抗体分子の作製を用いうる(例えば、HarlowおよびLane、Antibody:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NYを参照されたい)。これらには、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ法(KohlerおよびMilstein、Nature 256:495〜497[1975])のほか、トリオーマ(trioma)法、ヒトB細胞ハイブリドーマ法(例えば、Kozborら、Immunol. Today 4:72[1983]を参照されたい)、ならびにヒトモノクローナル抗体の作製を目的とするEBV-ハイブリドーマ法(Coleら、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.、pp.77〜96[1985])が含まれるが、これらに限定されない。

0110

本発明によれば、一本鎖抗体の作製を目的として記載された技法(米国特許第4,946,778号;参照により本明細書に組み入れられる)を、必要な特異的一本鎖抗体を作製するために適合化することができる。本発明のもう1つの態様では、望ましい特異性を備えたモノクローン性Fab断片の迅速かつ容易な同定が可能となるように、Fab発現ライブラリーの構築を目的とする当技術分野において公知の技法を用いる(Huseら、Science 246:1275〜1281[1989])。

0111

抗体分子のイディオタイプ抗原結合領域)を含む抗体断片は、公知の技法によって作製することができる。例えば、このような断片には以下のものが含まれるが、これらに限定されない:抗体分子のペプシン消化によって作製しうるF(ab')2断片;F(ab')2断片のジスルフィド結合還元によって作製しうるFab'断片、ならびに抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって作製しうるFab断片。

0112

抗原結合タンパク質をコードする遺伝子は、当技術分野において公知の方法によって単離することができる。抗体の作製に際しては、当技術分野において公知の技法により、望ましい抗体に関するスクリーニングを実施しうる(例えば、ラジオイムノアッセイ、ELISA(固相酵素免疫アッセイ)、「サンドイッチイムノアッセイ、免疫放射定量アッセイ、ゲル拡散沈降反応免疫拡散アッセイ、インサイチューイムノアッセイ(例えば、コロイド金酵素標識または放射性同位体標識を用いる)、ウエスタンブロット法沈殿反応凝集アッセイ(例えば、ゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイなど)、補体結合アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインAアッセイおよび免疫電気泳動アッセイなど)。

0113

本明細書において用いられるように「レポーター遺伝子」という用語は、アッセイしうるタンパク質をコードする遺伝子のことを指す。レポーター遺伝子の例には、ルシフェラーゼ(例えば、deWetら、Mol. Cell. Biol. 7:725[1987]ならびに米国特許第6,074,859号;第5,976,796号;第5,674,713号;および第5,618,682号;これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)、緑色蛍光タンパク質(例えば、GenBankアクセッション番号U43284;さまざまなGFP変種がCLONTECH Laboratories、Palo Alto、CAから販売されている)、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼおよび西ワサビペルオキシダーゼが含まれるが、これらに限定されない。

0114

本明細書において用いられるように「精製された」という用語は、自然環境から採取、単離または分離された、核酸配列またはアミノ酸配列のいずれかである分子のことを指す。このため、「単離された核酸配列」は精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、自然条件下で付随する他の成分を少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも90%含まない。

0115

被験化合物」という用語は、疾患、疾病、病もしくは身体機能障害の治療および/もしくは予防に有用と考えられる、または試料生理的状態もしくは細胞状態を別の様式で変化させると考えられる、任意の化学的実体、医薬品、薬剤などを指す。被験化合物には、公知の治療的化合物およびその可能性のあるものの両方が含まれる。本発明のスクリーニング法を用いるスクリーニングにより、被験化合物が治療的であることを判定することができる。「公知の治療的化合物」とは、このような治療または予防に有効なことが示されている(例えば、動物試験、またはヒトに対する過去の投与の経験により)、治療的化合物のことを指す。

0116

発明の詳細な説明
本発明は、宿主細胞におけるタンパク質の産生に関し、より詳細には、組み込みベクターの複数の組み込まれたコピーを含む宿主細胞に関する。本発明は、関心対象の遺伝子をコードする核酸を高コピー数含む細胞系を作製するために、組み込みベクター(すなわち、インテグラーゼまたはトランスポザーゼによって組み込みを行うベクター)を利用する。高コピー数細胞のトランスフェクトされたゲノムは、反復継代(例えば、少なくとも10回の継代、好ましくは少なくとも50回の継代、最も好ましくは少なくとも100回の継代)に対して安定である。さらに、本発明の宿主細胞は、高レベルのタンパク質を産生することができる(例えば、1pg/細胞/日を上回る、好ましくは10pg/細胞/日を上回る、より好ましくは50pg/細胞/日を上回る、最も好ましくは100pg/細胞/日を上回る)。

0117

本発明の宿主細胞のゲノム安定性および高い発現レベルは、以前に記載された細胞培養の方法を上回る明確な利点をもたらす。例えば、遺伝子の複数のコピーを含む哺乳類細胞系は本質的に不安定であることが当技術分野において公知である。実際に、この不安定性は、高速スクリーニングアッセイを含むさまざまな目的に哺乳類細胞系を用いたいと考えている研究者が直面する、認知された問題である(例えば、Sittampalamら、Curr. Opin. Chem. Biol. 1(3):384〜91[1997]を参照されたい)。

0118

本発明は特定の作用機序には限定されないものとする。実際には、機序の理解は本発明の構成および使用に必要ではない。しかし、本発明の宿主細胞のゲノム安定性およびタンパク質発現レベルの高さは、組み込みベクター(例えば、レトロウイルスベクター)に特有の特性に起因すると考えられる。例えば、レトロウイルスは多くの生物の生殖系列における遺伝性因子であることが知られている。実際に、哺乳類ゲノムの5〜10%もの割合は逆転写に起因する因子からなると考えられており、このことは高度の安定性を意味する。同様に、これらの種類のベクターの多くは、ゲノム中の活性のある(例えば、DNA分解酵素I高感受性部位転写部位を標的とする。

0119

多くの研究が、レトロウイルスおよびトランスポゾンによる組み込みの有害な影響を対象としている。ゲノムの活性領域を標的とする性質があるため、レトロウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターはプロモータートラップ法および飽和変異誘発法に用いられている(例えば、米国特許第5,627,058号および第5,922,601号を参照されたい。これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。プロモータートラップ法では、細胞を、プロモーターを含まないレポーターベクターに感染させる。プロモーターを含まないベクターがプロモーターの下流(すなわち、遺伝子内)に組み込みを行うと、ベクターによってコードされるレポーター遺伝子が活性化される。続いて、プロモーターのクローニングを行い、さらに特徴分析を行うことができる。

0120

理解されるであろうが、これらの方法は内因性遺伝子破壊に依拠している。このため、通常であれば遺伝子の破壊を招くと考えられる、組み込みベクターを高い感染多重度で用いる本発明の方法により、関心対象のタンパク質を大量に発現する安定な細胞系が開発されたことは驚くべきことである。これらの細胞系の開発について以下にさらに詳細に述べる。説明は以下のセクションに分かれる:I)宿主細胞;II)ベクターおよびトランスフェクションの方法;ならびにIII)トランスフェクトされた宿主細胞の使用。

0121

I.宿主細胞
本発明は、組み込みベクターによる種々の宿主細胞のトランスフェクションを考えている。当技術分野において数多くの哺乳類宿主細胞系が公知である。一般に、これらの宿主細胞は、以下により詳細に述べる適切な栄養素および増殖因子を含む培地中での単層培養または懸濁培養下においた場合に生育および生存が可能である。典型的な場合、細胞は関心対象の特定のタンパク質を大量に発現し、培地中に分泌する。適した哺乳類宿主細胞の例には、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO-K1、ATCCCC1-61);ウシ乳腺上皮細胞(ATCC CRL 10274;ウシ乳腺上皮細胞);SV40により形質転換されたサル腎臓CV1系(COS-7、ATCC CRL 1651);ヒト胚腎細胞系(293細胞または懸濁培養下での生育用にサブクローニングされた293細胞;例えば、Grahamら、J. Gen Virol.、36:59[1977]を参照されたい);ベビーハムスター腎細胞(BHK、ATCC CCL 10);マウスセルトリ細胞(TM4、Mather、Biol. Reprod. 23:243〜251[1980]);サル腎細胞(CV1 ATCC CCL 70);アフリカミドリザル腎細胞(VERO-76、ATCC CRL-1587);ヒト子宮頸癌細胞(HELA、ATCC CCL 2);イヌ腎細胞(MDCK、ATCC CCL 34);バッファローラット肝細胞BRL3A、ATCC CRL 1442);ヒト肺細胞(W138、ATCC CCL 75);ヒト肝細胞(Hep G2、HB 8065);マウス乳腺腫瘍(MMT060562、ATCC CCL51);TRI細胞(Matherら、Annals N.Y. Acad. Sci.、383:44〜68[1982]);MRC 5細胞;FS4細胞;ラット線維芽細胞(208F細胞);MDBK細胞(ウシ腎細胞);およびヒト肝細胞癌株(Hep G2)が含まれるが、これらに限定されない。

0122

哺乳類細胞系に加えて、本発明は、組み込みベクターによる低いまたは高い感染多重度での植物プロトプラストのトランスフェクションも考えている。例えば、本発明は、少なくとも1つの組み込みベクター、好ましくはレトロウイルスベクター、最も好ましくは偽型のレトロウイルスベクターが組み込まれた植物細胞または全植物体を考えている。プロトプラストからの再生による作製が可能な植物はすべて、本発明によるプロセスを用いてトランスフェクトすることができる(例えば、ナス属、タバコ属アブラナ属トウジシャ属、エンドウ属インゲンマメ属ダイズ属、ヒマワリ属ネギ属カラスムギ属オオムギ属イネ属、エノコログサ属、ライムギ属、モロコシ属コムギ属トウモロコシ属、バショウ属ヤシ属、マルメロ属、ナシ属、リンゴ属ナツメヤシ属、アブラヤシ属、クサイチゴ属、ヘビイチゴ属、サクラ属ラッカセイ属、キビ属、サトウキビ属、コーヒー属ツバキ属、アナナス属、ブドウ属またはカンキツ属の栽培植物)。一般に、プロトプラストは従来の方法に従って作製する(例えば、米国特許第4,743,548号;第4,677,066号、第5,149,645号;および第5,508,184号;これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。植物組織を適切な浸透ポテンシャル(例えば、3〜8重量%の糖ポリオール)および1つまたは複数の多糖ヒドロラーゼ(例えば、ペクチナーゼセルラーゼなど)を有する適切な培地中に分散させ、プロトプラストが得られるのに十分な時間をかけて細胞壁を分解させてもよい。濾過後にプロトプラストを遠心処理によって分離し、続いて以降の処理または使用のために再懸濁してもよい。培養下に保ったプロトプラストの全植物体への再生は、当技術分野において公知の方法によって行われる(例えば、Evansら、Handbook of Plant Cell Culture、1:124〜176、MacMillan Publishing Co.、New York[1983];Binding、Plant Protoplasts、p.21〜37、CRCPress、Boca Raton[1985])ならびにPotrykusおよびShillito、Methodsin Enzymology、第118巻、Plant Molecular Biology、A.およびH. Weissbach編、Academic Press、Orlando[1986]を参照)。

0123

本発明は、両生類宿主細胞系および昆虫宿主細胞系の使用も考えている。適した昆虫宿主細胞系の例には、細胞系(例えば、ATCCCRL-1660)が含まれるが、これらに限定されない。適した両生類宿主細胞系の例には、ヒキガエル細胞系(例えば、ATCC CCL-102)が含まれるが、これらに限定されない。

0124

II.トランスフェクションのためのベクターおよび方法
本発明によれば、上記のものなどの宿主細胞に対して、組み込みベクターによる形質導入またはトランスフェクションを行う。組み込みベクターの例には、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターおよびトランスポゾンベクターが含まれるが、これらに限定されない。本発明におけるこれらのベクターの設計、作製および使用については以下に述べる。

0125

A.レトロウイルスベクター
レトロウイルス(レトロウイルス科)は一般に、以下の3つの群に分けられる:スプマウイルス(例えば、ヒト泡沫状ウイルス);レンチウイルス(例えば、ヒト免疫不全ウイルスおよびヒツジビスナウイルス)およびオンコウイルス(例えば、MLV、ラウス肉腫ウイルス)。

0126

レトロウイルスは、動物細胞を感染させる、外被を有する(すなわち、宿主細胞由来脂質二重層膜に囲まれた)一本鎖RNAウイルスである。レトロウイルスに細胞が感染すると、そのRNAゲノムは線状二本鎖DNA形態に変換される(すなわち、逆転写される)。次に、DNA形態のウイルスはプロウイルスとして宿主細胞ゲノムに組み込まれる。プロウイルスはさらにウイルスゲノムおよびウイルスmRNAを作製するためのテンプレート役割を果たす。ゲノムRNAの2つのコピーを含む成熟ウイルス粒子が感染細胞の表面から出芽する。ウイルス粒子は、ゲノムRNA、逆転写酵素および他のpol遺伝子産物ウイルスキャプシド(ウイルスgag遺伝子産物を含む)の内部に含み、これがさらにウイルス外被糖タンパク質(膜関連タンパク質とも呼ばれる)を含む宿主細胞由来の脂質二重層膜によって囲まれている。

0127

さまざまなレトロウイルスのゲノム構成が当技術分野において周知であり、これにより、レトロウイルスベクターの作製を目的とするレトロウイルスゲノムの適合化が可能となった。関心対象の遺伝子を有する組換えレトロウイルスベクターの作製は一般に、2つの段階で行われる。

0128

第1に、関心対象の遺伝子を、関心対象の遺伝子の効率的な発現のために必要な配列(プロモーターおよび/またはエンハンサー因子を含む。これはウイルス末端反復配列(LTR)、または内部プロモーター/エンハンサーおよび適切なスプライシングシグナルによって提供してもよい)、ウイルスRNAの感染性ビリオンへの効率的なパッケージングに必要な配列(例えば、パッケージングシグナル(Psi)、tRNAプライマー結合部位(-PBS)、逆転写のために必要な3'調節配列(+PBS))およびウイルスLTRを含むレトロウイルスベクター中に挿入する。LTRは、ウイルスゲノムRNAの会合、逆転写酵素およびインテグラーゼの機能に必要な配列、ならびにウイルス粒子へのパッケージングを行おうとするゲノムRNAの発現の指令に関与する配列を含む。安全面の理由から、多くの組換えレトロウイルスベクターはウイルス複製に必須な遺伝子の機能的コピーを持たない(これらの必須遺伝子は除去または無効化されている);このため、この結果得られるウイルスは複製能欠損性と呼ばれる。

0129

第2に、組換えベクターを構築した後に、ベクターDNAをパッケージング細胞系に導入する。パッケージング細胞系は、望ましい宿主範囲を有するウイルス粒子へのウイルスゲノムRNAのパッケージングのためにトランス的に必要なウイルスタンパク質を提供する(すなわち、ウイルスにコードされたgag、polおよびenvタンパク質)。宿主範囲は一部には、ウイルス粒子の表面に発現される外被遺伝子産物の種類によって調節される。パッケージング細胞系が同種指向性、両種指向性または異種指向性の外被遺伝子産物を発現してもよい。または、パッケージング細胞にウイルス外被(env)タンパク質をコードする配列がなくてもよい。この場合には、パッケージング細胞系は膜関連タンパク質(例えば、envタンパク質)を含まない粒子中へのウイルスゲノムのパッケージングを行うと考えられる。ウイルスの細胞内への侵入を可能にすると考えられる膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を作製するためには、レトロウイルス配列を含むパッケージング細胞系に、膜関連タンパク質(例えば、水疱性口内炎ウイルス(VSV)のGタンパク質)をコードする配列をトランスフェクトすることが一般的である。トランスフェクトされたパッケージング細胞は、トランスフェクトされたパッケージング細胞系によって発現された膜関連タンパク質を含むウイルス粒子を作製すると考えられる;別のウイルスの外被タンパク質によるキャプシド形成がなされたウイルスに由来するウイルスゲノムRNAを含むこのようなウイルス粒子を偽型ウイルス粒子という。

0130

本発明のレトロウイルスベクターを、追加的な調節配列を含むようにさらに改変することができる。上記の通り、本発明のレトロウイルスベクターは機能的に結び付いた以下の因子を含む:a)5'LTR;b)パッケージングシグナル;c)3' LTR;ならびにd)5'および3' LTRの間に位置する、関心対象のタンパク質をコードする核酸。本発明のいくつかの態様において、内部プロモーターからの転写が望ましい場合には、関心対象の核酸を5' LTRに対して反対の向きに配置してもよい。適した内部プロモーターには、α-ラクトアルブミンプロモーター、CMVプロモーター(ヒトまたはサルのもの)およびチミジンキナーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

0131

本発明の他の態様において、関心対象のタンパク質の分泌が望ましい場合には、関心対象のタンパク質と機能的に結び付いたシグナルペプチド配列を含めることにより、ベクターを改変する。組織プラスミノーゲンアクチベーター、ヒト成長ホルモン、ラクトフェリン、α-カゼインおよびα-ラクトアルブミンに由来するものを含むが、これらに限定されない、いくつかの適したシグナルペプチドの配列が当業者に公知である。

0132

本発明の他の態様では、RNA移行因子を、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列の3'側または5'側に組み入れることによってベクターを改変する(例えば、米国特許第5,914,267号;第6,136,597号;および第5,686,120号;ならびに国際公開公報第99/14310号を参照されたい。これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。RNA移行因子の使用により、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列にスプライスシグナルまたはイントロンを組み入れなくても、関心対象のタンパク質の高レベルの発現を得ることが可能になると考えられる。

0133

さらに他の態様において、ベクターは、少なくとも1つのリボソーム内部進入部位(IRES)配列をさらに含む。口蹄疫ウイルス(FDV)、脳心筋炎ウイルスおよびポリオウイルスに由来するものを含むが、これらに限定されない、いくつかの適したIRESの配列が入手可能である。IRES配列を2つの転写単位(例えば、異なる関心対象のタンパク質、または抗体などの多サブユニットタンパク質の複数のサブユニットをコードする核酸)の間に介在させることにより、2つの転写単位が同一のプロモーターから転写される多シストロン性配列を形成することができる。

0134

本発明のレトロウイルスベクターに、形質転換細胞の選択を容易にする選択マーカーをさらに含めてもよい。薬剤G418に対する耐性を哺乳類細胞に付与する細菌アミノグリコシド3'ホスホトランスフェラーゼ遺伝子(neo遺伝子とも呼ばれる)、抗生物質ハイグロマイシンに対する耐性を付与する細菌ハイグロマイシンGホスホトランスフェラーゼ(hyg)遺伝子、およびミコフェノール酸の存在下における増殖能を付与する細菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(gpt遺伝子とも呼ばれる)を含むが、これらに限定されない、さまざまな選択マーカーを本発明に用いうる。いくつかの態様において、選択マーカー遺伝子は、関心対象のタンパク質をもコードする多シストロン性配列の一部として提供される。

0135

いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは増幅可能なマーカーをさらに含む。適切な増幅可能なマーカーはジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)およびグルタミン合成酵素(GS)をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。これらの遺伝子は、すべて参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,770,359号;第5,827,739号;第4,399,216号;第4,634,665号;第5,149,636号;および第6,455,275号に記載される。いくつかの態様において、これらの遺伝子は、本明細書において、実施例および図に開示されるベクター中のneoまたはhyg遺伝子と入れ替わる(DHFR(SEQID NO:40)およびGS(SEQ ID NO:41)選択マーカーを含むベクターの配列は、それぞれ図24および25を参照されたい)。増幅可能なマーカーが利用される態様において、形質導入された宿主細胞の培養物は、遺伝子の阻害剤を含む培地中にあることが意図される。適切な阻害剤は、DHFRの阻害のためのメトトレキセート、およびGSの阻害のためのメチオニンサルフォキシム(Msx)またはホスフィノトリシンを含むが、これらに限定されない。細胞培養系においてこれらの阻害剤の濃度が増加されるにつれ、増幅可能なマーカー(および従って、遺伝子または関心対象の遺伝子)のコピー数をより多く有する細胞が選択されることが意図される。従って、遺伝子が増幅される。

0136

いくつかの態様において、増幅可能なマーカー系は、高い感染多重度での形質導入を通じての、および/または連続的な形質導入による、複数のレトロウイルスベクターの形質導入とともに用いられる。これらの態様のうちいくつかにおいて、形質導入された細胞は、組み込まれた複数のレトロウイルスベクターを有する細胞の選択を可能にする量の阻害剤中で培養される。従って、本発明は、プロウイルスを含む染色体領域重複による、組み込まれたプロウイルスの増幅の実質的な非存在下での、ベクターの複数のコピーが組み込まれた細胞の選択を行うための方法を提供する。他の態様において、組み込まれたプロウイルスは濃度が増加される阻害剤中での選択により増幅される。本発明はいかなる特定の作用機序にも限定されない。実際には、作用機序の理解は本発明の実施のために必要ではない。しかしながら、以前記載されたように、プラスミドのようなベクターを用いて細胞系が作製された場合、それらはしばしば一続きの頭-尾反復として染色体に挿入される。この複数反復セグメントは本質的に不安定であると信じられ、かつ、この領域が増幅された場合(例えば、DHFRまたはGS選択系において)、その結果生じた増幅されたセグメントは本質的に不安定であると信じられている。本発明は、宿主細胞に増幅可能な遺伝子を導入するためにレトロウイルスベクターを用いることにより、この問題を解決する。この導入が高い感染多重度で、および/または連続的な様式で実施される場合、レトロウイルスベクターの複数のコピーが、安定的な様式で複数の染色体に導入される。従って、これらの安定な領域が増幅される場合、結果として生じる細胞系は安定である。

0137

本発明のさらに他の態様において、レトロウイルスベクターは組換え系によって認識される組換え因子を含んでもよい(例えば、cre/loxPまたはflpリコンビナーゼ系:例えば、Hoessら、Nucleic AcidsRes.、14:2287-2300[1986]、O'Gormanら、Science 251:1351-55[1991]、van Deursenら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7376-80[1995]および米国特許第6,025,192号を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み入れられる)。宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みの後に、組み込まれたベクター中に関心対象の核酸配列が挿入されるように、リコンビナーゼ酵素(例えば、Creリコンビナーゼ)、またはリコンビナーゼ酵素をコードする核酸配列、および組換え酵素によって認識される配列が隣接した関心対象のタンパク質をコードする1つもしくは複数の核酸配列を、宿主細胞に一時的にトランスフェクトすることができる(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクションによる)。

0138

組換えレトロウイルスベクターを含むウイルスベクターは、リン酸カルシウム-DNA共沈DEAE-デキストランによるトランスフェクション、エレクトロポレーションまたは核酸のマイクロインジェクションなどの他の技法に比べて、遺伝子を細胞内に導入するより効率的な手段となる。ウイルス導入の効率は一部には、核酸の移行が受容体を介するプロセスである(すなわち、ウイルスは標的細胞の表面にある特異的な受容体タンパク質と結合する)という事実によると考えられている。さらに、ひとたび細胞内に入った後も、ウイルスにより導入された核酸は制御の下で組み込まれるが、これは非ウイルス的に導入されたものとは対照的である;リン酸カルシウム-DNA共沈などの他の手段によって導入された核酸は再配列および分解を被る

0139

最もよく用いられる組換えレトロウイルスベクターは、両種指向性であるモロニーマウス白血病ウイルス(MoMLV)である(例えば、MillerおよびBaltimore、Mol. Cell. Biol. 6:2895[1986]を参照されたい)。MoMLV系にはいくつか利点がある:1)この特定のレトロウイルスは多くの異なる細胞種を感染させることができる、2)樹立されたパッケージング細胞系を組換えMoMLVウイルス粒子の作製に用いうる、および3)導入した遺伝子が宿主細胞の染色体に永続的に組み込まれる。確立されているMoMLVベクター系は、レトロウイルス配列の一部(例えば、ウイルス末端反復配列または「LTR」、およびパッケージングシグナルまたは「psi」シグナル)を含むDNAベクター、およびパッケージング細胞系を含む。導入しようとする遺伝子をDNAベクター中に挿入する。DNAベクターに存在するウイルス配列は、ベクターRNAのウイルス粒子中への挿入またはパッケージング、および挿入された遺伝子の発現のために必要なシグナルを提供する。パッケージング細胞系は、粒子の集合に必要なタンパク質を提供する(Markowitzら、J. Virol. 62:1120[1988])。

0140

これらの利点にもかかわらず、MoMLVをベースとする既存のレトロウイルスベクターは、いくつかの本質的な問題によって制限されている:1)非分裂細胞を感染させない(Millerら、Mol. Cell. Biol. 10:4239[1990])、ただし、おそらく卵母細胞は例外と思われる;2)作製される組換えウイルス力価が低い(MillerおよびRosman、BioTechniques 7:980[1980]およびMiller、Nature 357:455[1990]);および3)ある種の細胞種(例えば、ヒトリンパ球)に対する感染効率が低い(Adamsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8981[1992])。MoMLVをベースとするベクターの力価が低いことは、少なくとも一部には、ウイルスによってコードされる外被タンパク質の不安定性に起因するとされている。レトロウイルスのストック物理的手段に(例えば、超遠心および限外濾過)によって濃縮すると、感染性ウイルスの重大な喪失を招く。

0141

MoMLVをベースとするベクターの力価の低さおよびある種の細胞種に対する感染効率の低さは、VSVのGタンパク質を膜関連タンパク質として含む偽型のレトロウイルスベクターを用いることによって克服されてきた。特異的な表面タンパク質受容体と結合して細胞内に侵入するレトロウイルス外被タンパク質とは異なり、VSV Gタンパク質は原形質膜のリン脂質成分と相互作用する(Mastromarinoら、J. Gen. Virol. 68:2359[1977])。VSVの細胞内への侵入は特異的なタンパク質受容体の存在に依存しないため、VSVの宿主範囲は極めて広範囲にわたる。VSV Gタンパク質を有する偽型のレトロウイルスベクターは、VSVに特徴的な変化した宿主範囲を有する(すなわち、それらは脊椎動物無脊椎動物および昆虫細胞のほぼすべての種を感染させうる)。重要なこととして、VSV G-偽型のレトロウイルスベクターは、感染性を明らかに低下させずに超遠心による2000倍またはそれ以上に濃縮することができる(Burnsら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033[1993])。

0142

本発明は、ウイルスGタンパク質をウイルス粒子内部の異種膜関連タンパク質として用いる場合に、VSVGタンパク質の使用には限定されない(例えば、米国特許第5,512,421号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる)。ピリウイルスおよびチャンディプラウイルスなどのVSV以外のベシクロウイルス属のウイルスのGタンパク質はVSV Gタンパク質と非常に相同性が高く、共有結合したパルミチン酸を含む(Brunら、Intervirol. 38:274[1995]およびMastersら、Virol. 171:285(1990])。このため、ウイルス粒子の偽型化のために、VSV Gタンパク質の代わりにピリウイルスおよびチャンディプラウイルスのGタンパク質を用いることができる。さらに、狂犬病ウイルスおよびモコラウイルスなどのリサウイルス属に属するウイルスのVSV Gタンパク質にもVSV Gタンパク質との高度の保存性(アミノ酸配列ならびに機能面での保存)が認められる。例えば、モコラウイルスのGタンパク質はVSV Gタンパク質と同様の様式で作用することが示されており(すなわち、膜融合を媒介する)、このためウイルス粒子の偽型化のためにVSV Gタンパク質の代わりに用いうると考えられる(Mebatsionら、J. Virol. 69:1444[1995])。実施例2に述べるように、ピリ、チャンディプラまたはモコラウイルスのGタンパク質を用いてウイルス粒子を偽型化しうるが、その際には例外として、適したプロモーター因子(例えば、CMV最初期プロモーター;pcDNA3.1ベクター(Invitrogen)などの、CMVIEプロモーターを含むさまざまな発現ベクターが入手可能である)の転写制御下にあるピリ、チャンディプラまたはモコラウイルスのGタンパク質をコードする配列を含むプラスミドを、pHCMV-Gの代わりに用いる。ラブドウイルス科の他のメンバーに由来する他のGタンパク質をコードする配列を用いてもよい;種々のラブドウイルスGタンパク質をコードする配列がGenBankデータベースから入手可能である。

0143

レトロウイルスの大半は、レシピエント細胞が感染時に細胞周期を進行させている(すなわち、分裂している)場合にのみ、二本鎖線状ウイルス(プロウイルス)をレシピエント細胞のゲノムに導入または組み込むことができる。分裂細胞のみを感染させる、またはそれらをより効率的に感染させることが示されているレトロウイルスには、MLV、脾臓壊死ウイルス、ラウス肉腫ウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス(HIV;HIVは分裂細胞をより効率的に感染させるが、HIVは非分裂細胞も感染させうる)。

0144

MLVウイルスDNAの組み込みは宿主細胞の有糸分裂の進行に依存することが示されており、この有糸分裂に対する依存性は、ウイルス組み込み複合体が核内に侵入するためには核膜の破壊が必要なことを反映している(Roeら、EMBO J. 12:2099[1993])。しかし、分裂中期で停止した細胞では組み込みは起こらないため、核膜の破壊だけではウイルス組み込みが起こるには不十分であると思われる;ゲノムDNAの凝縮状態などの別の必要条件があると考えられる(Roeら、前記)。

0145

B.レンチウイルスベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたレンチウイルスベクターの使用も考えている。レンチウイルス(例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス)はレトロウイルスの亜科であり、非分裂細胞への組み込みを行うことができる。レンチウイルスゲノムおよびプロウイルスDNAは、すべてのレトロウイルスに認められる3つの遺伝子、すなわちgag、polおよびenvを含み、これらは2つのLTR配列によって隣接している。gag遺伝子は内部構造タンパク質(例えば、マトリックスキャプシドおよびヌクレオキャプシドタンパク質)をコードする;pol遺伝子は逆転写酵素、プロテアーゼおよびインテグラーゼタンパク質をコードする;ならびにpol遺伝子はウイルス外被糖タンパク質をコードする。5'および3' LTRはウイルスRNAの転写およびポリアデニル化を制御する。レンチウイルスゲノム中のこのほかの遺伝子には、vif、vpr、tat、rev、vpu、nefおよびvpx遺伝子が含まれる。

0146

種々のレンチウイルスベクターおよびパッケージング細胞系が当技術分野で知られており、本発明に用いることができる(例えば、米国特許第5,994,136号および第6,013,516号を参照されたい。これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる)。さらに、VSVGタンパク質も、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)をベースとするレトロウイルスベクターの偽型化のために用いられている(Naldiniら、Science 272:263[1996])。このため、VSV Gタンパク質はさまざまな偽型のレトロウイルスベクターの作製に用いることができ、MoMLVをベースとするベクターには限定されない。レンチウイルスベクターを、種々の調節配列(例えば、シグナルペプチド配列、RNA移行因子およびIRESのもの)を含むように上記の通りに改変してもよい。レンチウイルスベクターを作製した後には、それらを、レトロウイルスベクターに関して上に述べたように宿主細胞のトランスフェクションに用いてもよい。

0147

C.アデノ随伴ウイルスベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの使用も考えている。AAVは、デペンドウイルス属に属するヒトDNAパルボウイルスである。AAVゲノムは、約4680塩基を含む線状の一本鎖DNA分子から構成される。本ゲノムは、DNA複製起点およびウイルスのパッケージングシグナルとしてシス性に作用する逆方向末端反復配列(ITR)を両端に含む。ゲノムの内部非反復部分は、それぞれAAV repおよびcap領域として知られる2つの大きなオープンリーディングフレームを含む。これらの領域は、ビリオンの複製およびパッケージングに関与するウイルスタンパク質をコードする。AAV rep領域からは、見かけの分子量に従って命名されたRep 78、Rep 68、Rep 52およびRep 40という、少なくとも4つのウイルスタンパク質からなるファミリーが合成されている。AAV cap領域は、VP1、VP2およびVP3という少なくとも3つのタンパク質をコードする(AAVゲノムの詳細な説明については、例えば、Muzyczka、Current Topics Microbiol. Immunol. 158:97〜129[1992];Kotin、Human Gene Therapy 5:793〜801[1994]を参照されたい)。

0148

AAVがウイルス産生性感染を引き起こすためには、アデノウイルスヘルペスウイルスまたはワクシニアウイルスなどの近縁関係にないヘルパーウイルスとの重複感染を必要とする。このような重複感染がなければ、AAVはゲノムを宿主細胞染色体に挿入することによって潜伏状態を引き起こす。その後のヘルパーウイルス感染により、組み込まれたコピーが復旧し、複製して感染性ウイルスの子孫を産生できるようになる。非偽型のレトロウイルスとは異なり、AAVは宿主範囲が広く、任意の種に由来する細胞において、その種で同じく増殖すると思われるヘルパーウイルスとの重複感染が存在する限り、複製可能である。したがって、例えば、ヒトAAVは、イヌアデノウイルスに重複感染したイヌ細胞で複製すると考えられる。さらに、レトロウイルスとは異なり、AAVにはヒトまたは動物疾患とのつながりがなく、組み込み後に宿主細胞の生物特性を変化させないと思われるほか、非分裂細胞にも組み込みが可能である。また、AAVが宿主細胞ゲノムへの部位特異的組み込みを行えることも最近明らかになっている。

0149

上記の特性を考慮して、数多くの組換えAAVベクターが遺伝子送達を目的として開発されている(例えば、米国特許第5,173,414号;第5,139,941号;国際公開公報第92/01070号および国際公開公報第93/03769号、これらはどちらも参照により本明細書に組み入れられる;Lebkowskiら、Molec. Cell. Biol. 8:3988〜3996[1988];Carter, B.J.、Current Opinion in Biotechnology 3:533〜539[1992];Muzyczka、Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97〜129[1992];Kotin, R.M.(1994)Human Gene Therapy 5:793〜801;ShellingおよびSmith、Gene Therapy 1:165〜169[1994];ならびにZhouら、J. Exp. Med. 179:1867〜1875[1994]を参照されたい)。

0150

組換えAAVビリオンは、AAVヘルパープラスミドおよびAAVベクターの両方をトランスフェクトした適した宿主細胞において作製が可能である。AAVヘルパープラスミドは一般にAAV repおよびcapコード領域を含むが、AAV ITRは含まない。したがって、ヘルパープラスミドは複製を行えず、自らのパッケージングも行えない。AAVベクターは一般に、選択した関心対象の遺伝子が、ウイルス複製およびパッケージング機能を提供するAAV ITRと結合したものを含む。ヘルパープラスミドおよび選択した遺伝子を有するAAVベクターの両方を、一時的トランスフェクションによって適した宿主細胞に導入する。続いて、トランスフェクト細胞を、ヘルパープラスミドに存在してAAV repおよびcap領域の転写および翻訳を指令するAAVプロモーターをトランス活性化する、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染させる。選択した遺伝子を有する組換えAAVビリオンが形成され、これを調製物から精製することができる。AAVベクターをひとたび作製すれば、高コピー数宿主細胞を作製する目的で、それらを宿主細胞に対して望ましい感染多重度でトランフェクトすることができる(例えば、米国特許第5,843,742号を参照されたい。これは参照により本明細書に組み入れられる)。当業者には理解されるであろうが、AAVベクターを、種々の調節配列(例えば、シグナルペプチド配列、RNA移行因子およびIRESのものなど)を含むように上記の通りに改変してもよい。

0151

D.トランスポゾンベクター
本発明は、高コピー数細胞系の作製を目的としたトランスポゾンベクターの使用も考えている。トランスポゾンは、ゲノム中の1つの位置から別の位置への移動または転位が可能な移動性遺伝因子である。ゲノム内部での転位は、トランスポゾンによってコードされる酵素トランスポザーゼによって制御される。トランスポゾンの例は当技術分野で数多く知られており、これには、Tn5(例えば、de la Cruzら、J. Bact. 175:6932〜38[1993]を参照されたい)、Tn7(例えば、Craig、Curr. Topics Microbiol. Immunol. 204:27〜48[1996]を参照されたい)およびTn10(例えば、MorisatoおよびKleckner、Cell 51:101〜111[1987]を参照されたい)が含まれるが、これらに限定されない。トランスポゾンがゲノム中に組み込みを行う能力は、トランスポゾンベクターの作製に利用されている(例えば、米国特許第5,719,055号;第5,968,785号;第5,958,775号;および第6,027,722号を参照されたい;これらはすべて参照により本明細書に組み入れられる)。トランスポゾンは感染性でないため、トランスポゾンベクターは当技術分野で知られた方法(例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはマイクロインジェクション)によって宿主細胞に導入される。このため、トランスポゾンベクターと宿主細胞との比を調整することにより、本発明の高コピー数宿主細胞を作製するのに望ましい感染多重度が得られる。

0152

本発明における使用に適したトランスポゾンベクターは一般に、関心対象のタンパク質をコードする核酸が、2つのトランスポゾン挿入配列の間に介在するものを含む。いくつかのベクターは、トランスポザーゼ酵素をコードする核酸配列も含む。これらのベクターでは、挿入配列の1つを、組換えの際に宿主細胞のゲノム中に組み入れられないように、トランスポザーゼ酵素と関心対象のタンパク質をコードする核酸との間に配置する。または、トランスポザーゼ酵素を適した方法によって提供してもよい(例えば、リポフェクションまたはマイクロインジェクション)。当業者には理解されるであろうが、トランスポゾンベクターを、種々の調節配列(例えば、シグナルペプチド配列、RNA移行因子およびIRESのもの)を含むように、上記の通りに改変してもよい。

0153

E.高い感染多重度でのトランスフェクション
関心対象のタンパク質をコードする組み込みベクター(例えば、レトロウイルスベクター)をひとたび作製すれば、それらを宿主細胞のトランスフェクションまたは形質導入に用いることができる(その例は上のセクションIに述べた)。好ましくは、宿主細胞に対して、少なくとも1つ、好ましくは少なくとも2つまたはそれ以上のレトロウイルスベクターの組み込みが生じるのに十分な感染多重度で、組み込みベクターによるトランスフェクションまたは形質導入を行う。いくつかの態様では、感染した宿主細胞のゲノムが組み込まれたベクターの2〜100個のコピー、好ましくは組み込まれたベクターの5〜50個のコピーを含むように、10〜1,000,000の感染多重度を用いうる。他の態様では、10〜10,000の感染多重度を用いる。非偽型のレトロウイルスベクターを感染用に用いる場合には、宿主細胞を、望ましい力価(すなわち、コロニー形成単位、CFU)の感染性ベクターを含むレトロウイルス産生細胞から得た培地とともにインキュベートする。偽型のレトロウイルスベクターを用いる場合には、ベクターを超遠心によって適切な力価に濃縮した後に宿主細胞培養物に添加する。または、濃縮したベクターを細胞種に適した培地中に希釈してもよい。さらに、宿主細胞による複数の関心対象のタンパク質の発現が望ましい場合には、宿主細胞に対して、異なる関心対象のタンパク質をコードする核酸をそれぞれが含む複数のベクターをトランスフェクトすることができる。

0154

いずれの場合も、宿主細胞は、感染およびそれに続くベクターの組み込みが起こるのに十分な期間にわたり、感染性レトロウイルスベクターを含む培地に曝露される。一般に、細胞を重ねるために用いる培地の量は、細胞1個当たりの組み込みイベントが最大量となるように、できるだけわずかな容積に保つ必要がある。一般的な指針としては、1ミリリットル当たりのコロニー形成単位(cfu)の数は、望ましい組み込みイベントの数に応じて、約105〜107cfu/mlである必要がある。

0155

本発明は何らかの特定の作用機序には限定されない。実際には、作用機序の理解は本発明の実施のために必要ではない。しかし、ベクターの拡散速度は極めて低いことが知られている(例えば、米国特許第5,866,400号、これは拡散速度の考察に関して参照により本明細書に組み入れられる)。このため、実際の組み込み率は感染多重度よりも低くなる(場合によってははるかに低くなる)と考えられる。米国特許第5,866,400号の式を適用すると、106cfu/mlの力価の場合の平均ベクター-ベクター間隔は1ミクロンである。MMLVベクターが100ミクロン動くのに要する拡散時間は約20分である。したがって、ベクターは1時間に約300ミクロン移動しうる。1000個の細胞をT25フラスコ内にプレーティングした場合、細胞間隔は平均2.5mmとなる。これらの値を用いると、1時間以内に任意の細胞と接触すると予想されるウイルス粒子は56個に過ぎない。以下の表は、特定のベクター力価に対して、T25フラスコ内の所定数の細胞に関して予想される接触率を示している。しかし、以下の実施例の項に示すように、実際に得られた組み込みの数はこれらの式によって予想されるよりもはるかに少ない。

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