図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2014年12月8日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (20)

課題・解決手段

複数のリソソーム酵素活性を同時にアッセイするための多重酵素アッセイ法および組成物

概要

背景

概要

複数のリソソーム酵素活性を同時にアッセイするための多重酵素アッセイ法および組成物

目的

本発明は、1種以上のリソソーム酵素の酵素活性をアッセイするための方法を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
2件
牽制数
3件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

1種以上のリソソーム酵素酵素活性アッセイするための方法であって、(a)試料を第1の溶液に接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を準備することと、(b)前記酵素を含む前記溶液に、分析すべき各リソソーム酵素に対する酵素基質を添加し、前記試料中に存在している各リソソーム酵素に対する酵素生成物を含む溶液をもたらすのに十分な時間、酵素反応溶液中で前記酵素と共に前記基質インキュベートすることであって、前記酵素反応溶液が、(i)硫酸イオン沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、(ii)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、(iii)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤、(iv)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および(v)1種以上の界面活性剤を含むことと、(c)任意に、前記酵素反応クエンチすることと、(d)前記酵素生成物の量を決定することとを含む方法。

請求項2

基質添加前に、基質添加後に、または基質添加と同時に、分析すべき各リソソーム酵素に対する内部標準を添加することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項3

前記試料が、血液または組織試料である、請求項1に記載の方法。

請求項4

前記試料が、乾燥血液スポットである、請求項1に記載の方法。

請求項5

前記酵素生成物の量を決定することが、質量分析により各生成物対その内部標準の比を決定することを含む、請求項2に記載の方法。

請求項6

前記質量分析が、タンデム質量分析である、請求項5に記載の方法。

請求項7

前記生成物の量を決定することが、タンデム質量分析を含み、ここで、前記生成物およびそれらの内部標準の親イオンが生成され、分離され、衝突誘起解離に供されて、生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンがもたらされる、請求項6に記載の方法。

請求項8

前記生成物の量を決定することが、前記生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンのピーク強度を比較して、前記生成物の量を算出することを含む、請求項7に記載の方法。

請求項9

前記生成物の量を使用して、乾燥血液試料が1つ以上のリソソーム酵素欠損に伴う状態を処置するための候補に由来するかどうかを決定することをさらに含む、請求項1に記載の方法。

請求項10

前記1種以上のリソソーム酵素が、(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、(e)β−ガラクトレブシダーゼ(GALC)、(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)からなる群から選択される酵素を含む、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。

請求項11

前記1種以上のリソソーム酵素が、(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、(e)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)を含む、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。

請求項12

前記酵素生成物の量を決定することが、前記酵素生成物を含む前記溶液を、液体クロマトグラフィーによって質量分析計に導くことを含む、請求項5に記載の方法。

請求項13

前記酵素生成物の量を決定することが、前記酵素生成物を含む前記溶液を、フローインジェクションによって質量分析計に導くことを含む、請求項5に記載の方法。

請求項12

前記酵素反応溶液が緩衝剤をさらに含む、請求項1〜8の何れか一項に記載の方法。

請求項13

(a)硫酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、(b)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、(c)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤、(d)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および(e)1種以上の界面活性剤を含む水性組成物

請求項14

緩衝剤をさらに含む、請求項13に記載の組成物

請求項15

前記緩衝剤が、リン酸塩カルボン酸塩硫酸塩、スルホン酸塩、および硫酸モノエステルの緩衝剤からなる群から選択される、請求項14に記載の組成物。

請求項16

前記1種以上の界面活性剤が、陽イオン性陰イオン性中性、および非イオン性界面活性剤からなる群から選択される、請求項13に記載の組成物。

請求項17

硫酸イオンを結合するのに有効な前記金属陽イオンが、Ba2+、Ce3+、Hg+、Pb2+、Ra2+、Sr2+、Bi3+、Cd2+、Ca2+、およびMg2+からなる群から選択される、請求項13に記載の組成物。

請求項18

リン酸イオンを結合するのに有効な前記金属陽イオンが、Ba2+、Ce3+、Hg+、Pb2+、Ra2+、Sr2+、Bi3+、Cd2+、Ca2+、およびMg2+である、請求項13に記載の組成物。

請求項19

前記マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤が、アカルボースである、請求項13に記載の組成物。

請求項20

前記ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤が、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトンである、請求項13に記載の組成物。

請求項21

約2〜約9のpHを有する、請求項13に記載の組成物。

請求項22

リソソーム酵素に対する1種以上の基質をさらに含む、請求項13に記載の組成物。

請求項23

前記基質が、(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、(e)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)からなる群から選択されるリソソーム酵素に対する基質である、請求項22に記載の組成物。

請求項24

リソソーム酵素に対する1種以上の内部標準をさらに含む、請求項22に記載の組成物。

請求項25

前記内部標準が、(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、(e)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)からなる群から選択されるリソソーム酵素に対する内部標準である、請求項24に記載の組成物。

関連出願の相互参照

0001

本出願は、2011年11月8日出願の米国特許出願第61/557,210号の利益を主張する。この特許出願全体が参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。

政府の認可権利の陳述

0002

本発明は、国立健康研究所により授与されたDK67859の下、政府支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

発明の背景

0003

リソソーム貯蔵障害LSD)のサブセットに関する処置利用可能になっており、多くの場合、治療の早期開始により、臨床的改善がもたらされる。これらの有望な結果は、LSDの新生児スクリーニングにおける広範な関心を引き起こしてきた。

0004

新生児スクリーニングプログラムは、これらの処置可能な疾患に関連する代謝物のレベルを定量するよう確立されている。ニューヨーク州では、現在、クラッベ病スクリーニングを提供しており、他のいくつかの州では、LSDにまで拡張した新生児スクリーニングに関する最近の法案が通過しており、また、台湾では、ポンペ病およびファブリ病に関して新生児スクリーニングが行われている。

0005

ムコ多糖症(MPS IからVII)は、グリコサミノグリカンである、ヘパラン硫酸デルマタン硫酸ケラタン硫酸、またはコンドロイチン硫酸を分解するリソソーム酵素の1種が欠損していることにより引き起こされる、代謝疾患症候群グループである。関連酵素には、5種のスルファターゼ、4種のエキソグリコシダーゼ、および1種の非加水分解性アセチル−N−トランスフェラーゼが含まれる。これらの症候群は、非分解性または部分分解性のグリコサミノグリカンのリソソームへの蓄積をもたらし、非可逆性多重全身性臓器損傷に帰着する。

0006

MPS症候群の一部に関する処置が、最近、利用可能になっているが、これらの処置からの最適な利益には、非可逆性症状の発症前に処置を開始する必要があると思われる。MPS症候群の早期発見により、処置の潜在的な有益性最大化し、したがって、早期診断に適切な試験を開発する必要がある。同様に、試料源として、例えば新生児スクリーニング試験室提出されるものとして、乾燥血液スポット(DBS)を利用する、迅速、安価、かつ信頼性の高い診断手順の開発が必要とされている。

0007

したがって、リソソーム酵素活性の新生児スクリーニングのための方法および試薬、特に多重酵素分析が可能な方法および試薬の必要性が存在している。本発明は、この必要性を満たし、さらなる関連する利点を提供する。

0008

一側面では、本発明は、1種以上のリソソーム酵素の酵素活性アッセイするための方法を提供する。一態様では、本方法は、
(a)試料を第1の溶液に接触させて、1種以上のリソソーム酵素を含む溶液を準備することと、
(b)前記酵素を含む前記溶液に、分析すべき各リソソーム酵素に対する酵素基質を添加し、前記試料中に存在している各リソソーム酵素に対する酵素生成物を含む溶液をもたらすのに十分な時間、酵素反応溶液中で前記酵素と共に前記基質インキュベートすることであって、前記酵素反応溶液が、
(i)硫酸イオン沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン
(ii)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(iii)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤
(iv)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および
(v)1種以上の界面活性剤
を含むことと、
(c)任意に、前記酵素反応クエンチすることと、
(d)前記酵素生成物の量を決定することと
を含む。

0009

ある種の態様では、本方法は、1種以上の基質の添加前、その添加後、またはその添加と同時に、分析すべき各リソソーム酵素に対する内部標準を添加することをさらに含む。

0010

本発明の方法に有用な適切な試料には、血液および組織試料が含まれる。一態様では、試料は、乾燥血液スポット、例えば、新生児スクリーニングカード由来の乾燥血液スポットである。

0011

ある種の態様では、酵素生成物の量の決定は、質量分析により各生成物対その内部標準の比を決定することを含む。代表的な質量分析には、タンデム質量分析が含まれる。タンデム質量分析の場合、生成物の量の決定は、生成物およびそれらの内部標準の親イオンを発生させ、分離し、衝突誘起解離に供して、生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンをもたらすタンデム質量分析を含む。ある種の態様では、生成物の量の決定は、生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンのピーク強度を比較して、生成物の量を算出することを含む。本発明の態様では、前記生成物の量を使用して、乾燥血液試料が1つ以上のリソソーム酵素欠損に伴う状態を処置するための候補に由来するかどうかを決定することができる。

0012

ある種の態様では、本発明の方法は、以下から選択される1種以上のリソソーム酵素の酵素活性をアッセイする:
(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、
(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、
(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、
(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、
(e)β−ガラクトレブシダーゼ(GALC)、
(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、
(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、
(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および
(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)。

0013

上記リソソーム酵素のいかなる組合せも、本方法によりアッセイすることができる。一態様では、上記リソソーム酵素の各々は、同時にアッセイされる。

0014

ある種の態様では、酵素生成物の量の決定は、酵素生成物を含む溶液を、液体クロマトグラフィーによって質量分析計に導くことを含む。別の態様では、酵素生成物の量の決定は、酵素生成物を含む溶液を、フローインジェクションによって質量分析計に導くことを含む。

0015

本発明の別の側面では、1種以上のリソソーム酵素をアッセイするための水性組成物が提供される。一態様では、本組成物は、
(a)硫酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(b)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(c)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤、
(d)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および
(e)1種以上の界面活性剤
を含む。

0016

ある種の態様では、本組成物は緩衝剤をさらに含む。適切な緩衝剤には、リン酸塩カルボン酸塩硫酸塩、スルホン酸塩、および硫酸モノエステルの緩衝剤が含まれる。

0017

本組成物において有用な適切な界面活性剤は、陽イオン性陰イオン性中性、および非イオン性界面活性剤が含まれる。

0018

硫酸イオンを結合するのに有効な代表的な金属陽イオンには、Ba2+、Ce3+、Hg+、Pb2+、Ra2+、Sr2+、Bi3+、Cd2+、Ca2+、およびMg2+が含まれる。

0019

リン酸イオンを結合するのに有効な代表的な金属陽イオンには、Ba2+、Ce3+、Hg+、Pb2+、Ra2+、Sr2+、Bi3+、Cd2+、Ca2+、およびMg2+が含まれる。

0020

一態様では、マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤は、アカルボースである。

0021

一態様では、ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤は、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトンである。

0022

ある種の態様では、本組成物は、リソソーム酵素に対する1種以上の基質をさらに含む。代表的な基質は、以下から選択されるリソソーム酵素に対する基質を含む:
(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、
(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、
(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、
(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、
(e)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、
(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、
(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、
(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および
(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)。

0023

ある種の態様では、本組成物は、上記の各酵素に対する基質を含む。

0024

ある種の態様では、本発明の組成物は、リソソーム酵素に対する1種以上の内部標準をさらに含む。代表的な内部標準は、以下から選択されるリソソーム酵素に対する内部標準を含む:
(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、
(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、
(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、
(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、
(e)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、
(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、
(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、
(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および
(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)。

0025

ある種の態様では、本組成物は、上記の各酵素に対する内部標準を含む。

図面の簡単な説明

0026

前記側面および本発明の付随する利点の多くは、添付の図面と組み合わせて以下の詳細説明を参照することにより、よりよく理解されるので、一層容易に理解されるようになる。
図1A〜1Iは、9種のリソソーム酵素をアッセイするために使用される、9種の基質(S)、生成物(P)、および内部標準(IS)の化学構造を例示している。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図1Aの説明参照。
図2は、健常な対照の3−plex(2A)および6−plex(2B)アッセイのHPLC−MS/MSのクロマトグラムである(各SRMチャンネルは、S、生成物または内部標準を表わす)。下向きの黒および白三角は、それぞれ、生成物(P)および基質(S)のクロマトグラフィーピークを示しており、上向きの黒三角は、内部標準(IS)のピークを示している。
図3は、健常な個体の、組合せ9−plexアッセイのHPLC−MS/MSのクロマトグラムである。
図4は、健常な個体の、組合せ9−plexアッセイのUHPLC−MS/MSのクロマトグラムである。
図5A〜5Cは、9−plexアッセイ(合計n=80)を使用する、n=58の無作為に選択された新生児DBS、およびn=22の罹患患者アッセイ結果を例示している。3種のLSD(5A、GLA;5B、GAA、および5C、IDUA)に関するヒストグラムが示されており、他の6種は図_中で例示されている。22名の罹患者の試料は、GAL4S欠損(n=1)を除く各疾患に関して3名の患者からなる。
図5Aの説明参照。
図5Aの説明参照。
図6A〜6Iは、CDC:6A、IDUA;6B、GLA;6C、GAA;6D、ASM;6E、GALC;6F、ABG;6G、GAL4S;6H、GAL6S;6I、ID2Sによって提供される品質管理基準により測定した9種のリソソーム酵素の比活性を比較している。比活性は、DBS3mmの各々が、3.1μLの血液を有すると仮定して計算する。円は6+3−plexであり、四角は9−plexである。CDC試料は、蓄えておいた未処理の臍帯血を様々な量で混合した、白血球除去血液から調製する(De Jesus、V.R.ら、Development and evaluation of quality control dried blood spot materials in newborn screening for lysosomal storage disorders.Clin.Chem.55、158〜164(2009))。誤差バーは、品質管理用DBSの2つの離れたパンチ(punch)を使用して測定した標準偏差である。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図6Aの説明参照。
図7A〜7Fは、図5A〜5Cにおけるもの(9−plexアッセイ)と類似の、図示したLSDのプロットを示している。Y軸は、試料数である。ASM罹患個体からの試料は試験しなかった。図5A〜5C、および図7A〜7Fは、80名の試料、58名の非罹患患者、および22名の罹患患者に基づく。22名の罹患者の試料は、GAL4S欠損(n=1)を除く各疾患に関する3名の患者からなる。
図7Aの説明参照。
図7Aの説明参照。
図7Aの説明参照。
図7Aの説明参照。
図7Aの説明参照。
図8A〜8Iは、9−plexではなく、6+3−plexで得られたことを除き、図5A〜5Cにおけるものと類似の、図示したLSDのプロットを示している。Y軸は、比活性である(μmol hr-1(L 血液)-1)。ASM罹患個体のためのデータは作製しなかった。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図8Aの説明参照。
図9Aは、ニーマン−ピック病A/B型(左)、クラッベ病(中央)、およびゴーシェ病(右)に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)を例示している。これらの基質からの酵素生成物(P)、および定量化に有用な代表的な内部標準(IS)も示している。質量分析計中の親イオンの衝突誘起解離に起因するフラグメントイオンも示している。
図9Bは、ファブリ病(左)およびポンペ病(右)に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)および内部標準(IS)を例示している。質量分析計中の親イオンの衝突誘起解離に起因するフラグメントイオンも示している。
図10は、ムコ多糖症I型に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)および内部標準(IS)を例示している。酵素生成物(P)、および質量分析計中の親イオンの衝突誘起解離に起因するフラグメントイオンも示されている。
図11は、ムコ多糖症VI型に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)および内部標準(IS)を例示している。酵素生成物(P)、および質量分析計中の親イオンの衝突誘起解離に起因するフラグメントイオンも示している。
図12は、ムコ多糖症IVA型に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)および内部標準(IS)を例示している。酵素生成物(P)、および質量分析計中の親イオンの衝突誘起解離に起因するフラグメントイオンも示している。
図13は、ムコ多糖症II型に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)および内部標準(IS)を例示している。酵素生成物(P)、および質量分析計中の親イオンの衝突誘起解離に起因するフラグメントイオンも示している。
図14は、6種のリソソーム酵素:ABG(ゴーシェ病)、GALC(クラッベ病)、ASM(ニーマン−ピック病A/B型)、GLA(ファブリ病)、GAA(ポンペ病)、およびIDUA(ムコ多糖症I型)に関する、基質、生成物、および内部標準の超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)分離を比較している。ムコ多糖症IVA型、ムコ多糖症II型、およびムコ多糖症VI型(図示せず)に対する、基質、生成物、および内部標準も同様に分離することができる。図示したイオンピークは、タンデム質量分析法によって検出した。健常な個体に属する、処理済み6重アッセイ試料を注入(10μL)した後に得られたLC−MS/MSクロマトグラム(各SRMチャンネルは、1種の基質、1種の生成物、または1種の内部標準を表す。詳細は表6を参照されたい)。

発明の詳細な説明

0027

一側面では、本発明は、リソソームの酵素活性をアッセイする方法を提供する。本方法の態様では、酵素生成物の量は、酵素生成物由来のシグナル既知量の内部標準由来のシグナルとを比較することにより決定される。酵素生成物の量は、アッセイする試料に加えられる基質に対する、酵素の酵素活性により決定され、酵素生成物の定量化は、試料中における酵素活性の尺度を提供する。本方法は、個体(例えば、新生児)がリソソーム酵素活性の欠損症を患い、したがって処置の候補であるかを評価するために、個体におけるリソソーム酵素活性をアッセイするのに有用である。

0028

本発明の方法では、複数のリソソーム酵素の酵素活性が、多重アッセイにおいて同時に決定される。本方法の態様では、1種以上または9種すべてのリソソーム酵素が、1種または2種の酵素反応緩衝液ステムのどちらかを使用してアッセイされる(例えば、6種は、第1の酵素反応緩衝液中でアッセイされ、また3種は第2の酵素反応緩衝液中でアッセイされる)。酵素反応緩衝液により、本発明の多重アッセイが可能になり、これにより、リソソーム酵素アッセイが有利なことに単純化される。

0029

別の側面では、本発明は、本方法に従ってリソソームの酵素活性をアッセイするための試薬(例えば、酵素基質、内部標準、および反応緩衝剤)を提供する。

0030

酵素活性をアッセイするための方法
一側面では、本発明は、複数のリソソーム酵素の酵素活性をアッセイする方法を提供する。本方法の態様では、酵素生成物の量は、各酵素生成物由来のシグナルと既知量の酵素内部標準由来のシグナルとを比較することにより決定される。生成物の量は、アッセイする試料に加えられるそれらの個々の基質に対する、酵素の酵素活性により決定され、酵素生成物の定量化は、試料中における酵素活性の尺度を提供する。本方法は、個体(例えば、新生児)が酵素活性の欠損症を患い、したがってリソソーム酵素欠損に伴う1つ以上の疾患または症候群の処置の候補であるかを評価するために、個体における酵素活性をアッセイするのに有用である。

0031

本方法の一態様では、酵素生成物および内部標準は質量が異なり、質量分析法によって生成物の量が決定される。

0032

本方法のある種の態様では、生成物および内部標準は、有機溶媒を使用する液−液抽出により、酵素、過剰の基質、生成物、および内部標準を含有する水性酵素反応混合物から抽出される。別の態様では、上記の水性酵素反応混合物は適切な固相に適用され、その固相から生成物および内部標準が溶出される。ある種の態様では、基質は、同等の溶解度を有するため、生成物および内部標準と共に抽出されることになることが理解されよう。質量分析計に試料を導入するために液体クロマトグラフィーを使用する態様の関しては、水性酵素反応混合物は、液体クロマトグラフに直接導入することができ、クロマトグラフは、抽出ステップを必要とせず、基質、生成物、および内部標準を分離する。これらの態様では、水性酵素反応溶液は、液体クロマトグラフ上への充填を妨げるタンパク質を沈殿させるために、適切な有機溶媒(例えば、アセトニトリル)によりクエンチすることができる。質量分析計に試料を導入するためのフローインジェクションを使用する態様に関しては、フローインジェクション前に液−液抽出または固相抽出を利用することができる。フローインジェクションを利用するある種の態様では、基質(例えば、MPS−IVAおよびMPS−VI)は、イオン交換樹脂により捕捉され、フローインジェクション前に試料から実質的に除去することができる。

0033

各方法において、生成物の定量化は、内部標準を定量することにより容易になる。

0034

一態様では、酵素活性をアッセイするための方法は、
(a)乾燥血液試料を第1の緩衝溶液に接触させて、複数のリソソーム酵素を含む溶液を準備するステップと、
(b)酵素を含む溶液に分析すべき各リソソーム酵素に対する酵素基質を添加し、試料中に存在している各リソソーム酵素に対する酵素生成物を含む溶液をもたらすよう、所定の時間、酵素と共に基質をインキュベートするステップ(分析すべき各リソソーム酵素に対する内部標準を、基質の添加と同時にまたはその後に溶液に添加して、生成物および内部標準を含む溶液を最終的にもたらすことができる)と、
(c)任意に、例えば、酵素生成物を含む溶液に、第2の緩衝剤を添加することにより、酵素反応をクエンチするステップと、
(d)酵素生成物の量を決定するステップと
を含む。

0035

本発明の方法では、酵素反応は、さらなる処理の前に、任意でクエンチされる。ここで使用される場合、用語「クエンチした」とは、例えば、反応溶液のpHを変更することにより、または反応溶液からタンパク質(例えば、酵素)を沈殿させる溶媒を加えることにより、酵素反応を停止させることを指す。

0036

上記の通り、生成物および内部標準は、様々な技法(例えば、液−液抽出、固−液抽出、ペレット化による上澄み液の生成)のいずれか1つによる分析のために、酵素から分離することができる。

0037

一態様では、乾燥血液試料は、個体(例えば、乾燥血液スポットが新生児スクリーニングカード由来である、新生児)からの乾燥血液スポットである。しかし、本方法は、ヒト、動物、および非生体源からの検体(例えば血漿血清組織)を含む、リソソーム酵素を含有する任意の試料で行うことができる。乾燥血液以外の血液試料も、本方法によるアッセイに適切である。

0038

本方法では、1種以上の酵素を含む試料を、第1の緩衝溶液と接触させて、1種以上の酵素を含む溶液を準備する。このステップは、抽出または水和ステップと見なすことができ、この場合、試料(例えば、乾燥血液スポット)中の酵素の少なくとも一部は、水性液体の相に抽出され、その結果、酵素反応を行うことができる。この溶液は均一である必要はなく、酵素と基質との間の酵素反応に十分な水性液体相を用意さえすれば足りる。

0039

一態様では、第1の緩衝液は、試料から酵素を抽出して溶解させるのに、必要な場合、酵素の基質とのインキュベートにより酵素生成物をもたらす酵素反応混合物を供給するのに十分なpHを有する水性緩衝液である。ある種の態様では、試料は基質を含むアッセイ緩衝液に直接加えることができることが理解されよう。

0040

酵素活性をアッセイするために、基質は酵素と共にインキュベートされて、生成物がもたらされる。一態様では、基質が酵素溶液に加えられ、生成物を含む溶液をもたらすのに十分な時間(例えば、所定の時間)インキュベートされる。この時間は変えることができ、また、試料の酵素活性の量、ならびに酵素生成物および内部標準を定量するための分析法感度に依存することになる。一態様では、十分な時間のインキュベートには、基質を酵素と共に37℃で20時間インキュベートすることが含まれる。所定のインキュベート時間は、試料に応じて1時間未満〜20時間超まで変動し得る。一態様では、基質はアッセイ緩衝溶液に含まれる。所定の時間の後、第2の緩衝液(例えば0.1mol/Lの酢酸ナトリウムpH5.4)の添加により、酵素反応物が任意でクエンチされる(すなわち停止される)。クエンチ用緩衝液は、酵素反応を停止するのに十分なpHを有する。酵素反応混合物のpHは、酵素と、生成物および内部標準との分離が達成されるものである。

0041

本発明のある種の態様では、内部標準に関連するシグナルと生成物に関連するシグナルとを比較することにより、酵素生成物の量が決定される。本方法の一態様では、酵素によるインキュベート前に(例えば、基質添加前に、基質添加後にまたは基質添加と同時に)、内部標準が添加される。別の態様では、内部標準は、酵素反応をクエンチするために使用される緩衝液の成分として加えられる。さらなる態様では、内部標準は、クエンチした、生成物を含む酵素反応混合物に加えられる。別の態様では、内部標準は、試料のワークアップ後および質量分析前に、添加することができる。

0042

本方法では、さらなる分析のために、水性酵素反応混合物から生成物および内部標準が分離される(例えば、酵素およびある種の過剰基質から分離される)。一態様では、水性酵素反応混合物を有機溶媒により抽出し、酵素生成物と内部標準とを含む有機相が得られる。適切な有機溶媒は、水とは実質的に混和せず、酵素または酵素基質を溶解するには有効ではない。適切な有機溶媒は、生成物および内部標準を選択的かつ効率的に抽出し、かつ各々を実質的に等しく抽出する(すなわち、酵素産物および内部標準は、所与の溶媒に対し、実質的に同じ分配係数を有する)。適切な溶媒には、酢酸エチルジエチルエーテルクロロホルム塩化メチレン、およびブタノールが含まれる。一態様では、有機溶媒は、酢酸エチルである。ある程度の基質は、生成物および内部標準の抽出のために使用される有機溶媒に溶解することが理解されよう。これらの場合、ならびに生成物および内部標準が、質量分析法により定量される場合、質量分析計は、エレクトロスプレーイオン化法から形成する生成物よりも、酵素反応から形成する生成物にのみ選択するよう照準をあわせることができる。さらに、液体クロマトグラフィーを使用して試料を質量分析計に導入する場合、基質はクロマトグラフィーの間に生成物から分離され、これにより生成物の定量が容易になる。さらに、フローインジェクションを使用して試料を質量分析計に導入する場合、ある種の基質(例えば、MPS−IVAおよびMPS−VI)は、イオン交換樹脂により捕捉することができ、フローインジェクションの前に試料から実質的に除去することができる。

0043

別の態様では、酵素生成物は、固相抽出により水性酵素反応混合物(内部標準を含む)から分離される。この態様では、水性酵素反応混合物は、適切な固相に適用される。適切な固相は、酵素生成物および内部標準を、実質的等しく、選択的に保持するおよび放出するのに有効である。代表的な固相には、シリカゲル逆相シリカ(例えば、C18−シリカ)、およびイオン交換樹脂、例えば、陰イオン交換樹脂が含まれる。次に、酵素生成物および内部標準は、1種以上の適切な有機溶媒により、逐次または同時のいずれかで固相から溶出することができ、得られる溶液(複数可)は、ここで記載した通り分析される。適切な有機溶媒により、固相から実質的に完全に、酵素生成物および内部標準が溶出される。生成物および内部標準は、固相から個別または一緒のいずれかで溶出され得る。一態様では、生成物および内部標準を共に溶出される。

0044

酵素生成物および内部基質(internal substrate)が単離されると、酵素生成物が定量される。本方法のある種の態様では、酵素生成物の量の決定は、内部標準によって容易にされる。各内部標準の量は既知であるため、内部標準に関連するシグナルを測定し、そのシグナルを各酵素生成物に関連するシグナルと比較することにより、酵素生成物の量の測定が可能になる。上記の通り、酵素生成物および内部標準に関連するシグナルは、質量分析法(例えばタンデム質量分析法)により測定することができる。

0045

一態様では、タンデム質量分析により生成物対内部標準の比を決定することにより、酵素生成物の量が決定される。MSMS法において、生成物および内部標準の親イオンを発生させ、分離し、衝突誘起解離に供して、生成物のフラグメントイオン、および内部標準のフラグメントイオンがそれぞれもたらされる。生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンのピーク強度を比較することにより、生成物の量の算出が可能になる。

0046

本発明の方法では、既知量の各内部標準が上記の通り、酵素反応系に加えられ、これにより、酵素の存在下で生成物が最終的に生じる。本発明のタンデム質量分析法では、酵素生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンのピーク面積積分値が測定され、酵素生成物のピーク面積対内部標準のピーク面積の比を、添加した内部標準のモル数乗算し、酵素生成物のモル数が与えられ、これにより、元の試料中の酵素により生成した酵素生成物が定量される。

0047

本発明のタンデム質量分光法は、生成物を効果的に定量する。本方法は、生成物および内部標準の親質量が同じであり、かつそれらのフラグメントが異なるか、または、生成物および内部標準の親質量が異なり、かつフラグメントが両方同じであるかまたは両方異なる場合に有効である。

0048

酵素活性をアッセイするための本発明の方法は、生成物および内部標準からのシグナルの測定に依存する。酵素生成物および内部標準は、いくつかの方法で関連づけられる。水性酵素反応混合物から酵素生成物を単離するために液−液抽出に依存する本発明の方法の場合、各々は抽出有機溶媒に実質的に等しく抽出可能である(理想的には同じである)。質量分析に依存する本発明の方法の場合、各々は、異なる質量を有しており、かつ他方から分離することができるフラグメントイオンを生成し、また生成物および内部フラグメントイオンは、実質的に同じ(理想的には同じ)イオン化効率を有する各フラグメントから生成する。

0049

一態様では、本発明は、(a)酵素と共に基質をインキュベートし、生成物を含有している酵素反応混合物を得ることと、(b)酵素反応を任意にクエンチすることと、(c)内部標準をこの酵素反応混合物に添加することと、(d)酵素反応混合物から生成物および内部標準を分離することと、(e)生成物を定量することとを含む、酵素活性をアッセイするための方法を提供する。

0050

別の態様では、本発明は、(a)酵素と共に基質をインキュベートし、生成物を含有している酵素反応混合物を得ることと、(b)酵素反応を、内部標準を含む緩衝溶液により任意にクエンチすることと、(c)酵素反応混合物から生成物および内部標準を分離することと、(d)生成物を定量することとを含む、酵素活性をアッセイするための方法を提供する。

0051

さらなる態様では、本発明は、(a)内部標準の存在下で、酵素と共に基質をインキュベートし、生成物を含有している酵素反応混合物を得ることと、(b)酵素反応を任意にクエンチすることと、(c)酵素反応混合物から生成物および内部標準を分離することと、(d)生成物を定量することとを含む、酵素活性をアッセイするための方法を提供する。

0052

ある種の態様では、本発明の方法では、酵素生成物の量の決定は、質量分析により各生成物対その内部標準の比を決定することを含む。適切な質量分析には、タンデム質量分析計を使用するタンデム質量分析(すなわち、MSMS)が含まれる。MSMSを利用する態様に関しては、生成物の量の決定は、生成物およびそれらの内部標準の親イオンを発生させ、分離し、衝突誘起解離に供して、生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンを生じる、タンデム質量分析を含む。生成物の量の決定は、生成物のフラグメントイオンおよび内部標準のフラグメントイオンのピーク強度を比較して、生成物の量を算出することを含む。

0053

一態様では、本発明の方法は、乾燥血液試料が1つ以上のリソソーム酵素欠損に伴う状態を処置する候補に由来するかどうかを決定する量の生成物を使用することをさらに含む。

0054

質量分析を利用する本発明の方法では、分析される試料(例えば、酵素生成物および内部標準を含有している溶液)は当技術分野で公知の方法により、質量分析計に導入することができる。一態様では、酵素生成物の量の決定は、液体クロマトグラフィー(LC)によって質量分析計に酵素生成物を含む溶液を導くことを含む。別の態様では、酵素生成物の量の決定は、フローインジェクション(FI)によって質量分析計へ酵素生成物を含む溶液を導くことを含む。そうした方法に対するLCおよびFI法ならびにそれらの結果は、以下に記載されている。

0055

新規な酵素反応緩衝液の使用により、一態様では、本発明は、9種のリソソーム酵素の多重酵素アッセイを提供する。別の態様では、本発明は、6種のリソソーム酵素の多重酵素アッセイを提供する。さらなる態様では、本発明は、3種のリソソーム酵素の多重酵素アッセイを提供する。

0056

基質および内部標準
本発明において有用なリソソーム酵素をアッセイするための、代表的な酵素基質、内部標準、および質量分光法は、2010年2月17日出願の米国特許出願第12/706,794号(米国特許出願公開第U.S.2010/0209951A1号)、および2011年8月25日出願のPCT/US2011/049224に記載されており、その各々は、その全体が参照により本明細書中に明示的に組み込まれる。

0057

図1A〜1Iは、9種のリソソーム酵素をアッセイするための、9種の基質(S)、生成物(P)、および内部標準(IS)の化学構造を例示している。ニーマン−ピック病A/B型(左)、クラッベ病(中央)、およびゴーシェ病(右)に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)を図9Aに例示している。図9Bは、ファブリ病(左)およびポンペ病(右)に関連する酵素を検出するための、本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質(S)および内部標準(IS)を例示している。ムコ多糖症I型、ムコ多糖症VI型、ムコ多糖症IVA型、およびムコ多糖症II型に関連する酵素を検出するための本発明のアッセイにおいて有用な代表的な基質および内部標準を、それぞれ図10〜13に例示している。

0058

酵素反応溶液の組成
本発明の方法では、酵素反応は、多重酵素反応の一助となる溶液中で実施される。一態様では、酵素反応溶液は、
(a)硫酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(b)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(c)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤、
(d)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および
(e)1種以上の界面活性剤
を含む。

0059

溶液の1種以上の金属陽イオンが、血液中に存在しており、かつリソソームのスルファターゼのアッセイを妨害すると思われる硫酸イオンおよびリン酸イオンを結合するのに、またはこれらを沈殿させるのに有効である。硫酸イオンおよびリン酸イオンは、スルファターゼ活性阻害する恐れがある。適切な金属陽イオンには、硫酸イオンおよびリン酸イオンを沈殿させるのに、またはこれらに結合するのに、そうでなければ、スルファターゼ活性のアッセイの妨害にこれらのイオンを利用できないようにするのに有効な任意の金属イオンが含まれる。代表的な金属イオンには、Ba2+、Ce3+、Hg+、Pb2+、Ra2+、Sr2+、Bi3+、Cd2+、Ca2+、およびMg2+が含まれる。金属イオンの混合物を使用することができる。代表的な適切な対イオンには、塩化物イオン臭化物イオンヨウ化物イオン、およびフッ化物イオン有機カルボン酸イオン、例えばギ酸イオンおよび酢酸イオン硝酸イオンシアン化物イオン硫化物イオン水酸化物イオン酸化物イオンチオシアン酸イオンチオレートイオン(RS-、例えば、Rは、C1〜C20アルキルまたはC6〜C20アリールである)、およびアルコレート(RO-、例えば、Rは、C1〜C20アルキルまたはC6〜C20アリールである)を含む。一態様では、硫酸イオンおよびリン酸イオンを沈殿させるのに、またはそうでなければ、これらのイオンに結合するのに、およびこれらのイオンを除去するのに有効な1種以上の金属イオンは、硫酸イオンの沈殿に関してはBa2+(例えば、酢酸塩)であり、リン酸イオンの除去に関してはCe3+(例えば、酢酸塩)である。ある種の態様では、硫酸イオンおよびリン酸イオンの沈殿に有効な金属陽イオンは、約0.01〜約20mMの濃度で存在する。ある種の態様では、金属陽イオンは、約5〜約10mMの濃度で存在する。一態様では、硫酸イオンの沈殿に有効な金属陽イオン(例えば、Ba2+)は、7.5mMの濃度で存在する。一態様では、リン酸イオンの沈殿に有効な金属陽イオン(例えば、Ce3+)は、5.5mMの濃度で存在する。

0060

溶液には、マルターゼグルコアミラーゼ(EC3.2.1.3)の阻害剤が含まれる。マルターゼグルコアミラーゼは、乾燥血液スポット中の一部の血液細胞上に存在しており、ポンペ(GAA)基質を加水分解することができる。適切なマルターゼグルコアミラーゼ阻害剤には、当技術分野で公知のものが含まれる。代表的なマルターゼグルコアミラーゼ阻害剤は、アカルボースである。アカルボース誘導体および類似体、ならびにマルターゼグルコアミラーゼの活性を遮断するのに有効な他の作用剤が、酵素反応溶液のためのマルターゼグルコアミラーゼの阻害剤であることが理解されよう。ある種の態様では、マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤は、約1〜約50μMの濃度で存在する。別の態様では、阻害剤は、約5〜約20μM存在している。一態様では、阻害剤(例えば、アカルボース)は、約8μMの濃度で存在する。

0061

溶液には、ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ(EC3.2.1.52)の阻害剤も含まれる。ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼは、乾燥血液スポット中の一部の血液細胞上に存在しており、MPS−VIA生成物および内部標準を加水分解することができる。適切なベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤には、当技術分野で公知のものが含まれる。代表的なベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤は、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトンである。ある種の態様では、ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤は、約10〜約500μMの濃度で存在する。別の態様では、阻害剤は、約50〜約200μMの濃度で存在している。一態様では、阻害剤(例えば、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトン)は、約150μMの濃度で存在する。

0062

溶液には、1種以上界活性剤を含む。ここで使用する場合、用語「界面活性剤」は、用語「洗剤」と相互変換的に使用される。適切な界面活性剤には、陽イオン性、陰イオン性、中性(例えば、両性イオン、および混合電荷)、および非イオン性(すなわち、電荷基がない)界面活性剤が含まれる。代表的な界面活性剤には、以下の物質が含まれる:1−オクタンスルホン酸ナトリウム塩、2−シクロヘキシルエチル−4−O−(アルファ−D−グルコピラノシル)−b−D−グルコピラノシド、4−n−オクチルベンゾイルアミドプロピルジメチルアンモニオスルホベタイン、4−オキソ−3−(テトラヒドロフラン−2−イルメチル)−10−オキサ−3−アザトリシクロ[5.2.1.0*1,5*]デカ−8−エン−6−カルボン酸、6−シクロヘキシルヘキシル−4−O−(アルファ−D−グルコピラノシル)−ベータ−D−グルコピラノシド、ASB−16、ASB−C7BzO、水酸化ベンゼトニウム、BigCHAP、Brij35、Bt3(1,3,5)IP3/AM、C12E8、CHAPSO、ケノデオキシコール酸ナトリウム塩)、p−トルエンスルホン酸コリン塩、シクロヘキシル−n−ヘキシル−D−マルトシドシクロヘキシルメチル−4−O−(a−D−グルコピラノシル)−b−D−グルコピラノシド、DDMAB、デシルベータ−D−マルトピラノシド、デシルベータ−D−チオグルコピラノシド、デシル−ベータ−D−1−チオマルトピラノシド、ジエチレングリコールモノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノペンチルエーテルジギトニンジギトキシゲニンジメチルエチルアンモニウムプロパンスルホネート、臭化エイコシルトリエチルアンモニウム、ELUGENTエチレングリコールモノデシルエーテル、エチレングリコールモノドデシルエーテル、エチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル臭化エチルヘキサデシルジメチルアンモニウム、GENAPOL X−080、GENAPOL X−100、Glucopone 600、グリココール酸(ナトリウム塩)、グリコデオキシコール酸(ナトリウム塩)、p−トルエンスルホン酸ヘキサデシルトリメチルアンモニウムヘキサエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、IGEPAL CA−630、塩化ラウロイル−DL−カルニチンラウロイルサルコシン(ナトリウム塩)、LPD−12、MEGA−8、MEGA−9、メトキシポリエチレングリコール350、塩化メチルベンゼトニウム、N−デカノイルN−メチルグルカミン、n−ドデシルアルファ−D−マルトシド、n−ドデシル−ベータ−D−マルトシド、n−ドデシル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−ヘプチル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−ヘキサデシル−ベータ−D−マルトシド、n−ヘキシル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−ノニル−ベータ−D−グルコピラノシド、N−オクタノイル−ベータ−D−グルコシルアミン、n−オクタノイルスクロース、n−オクチル−ベータ−D−グルコピラノシド、n−オクチル−オリゴオキシエチレン、n−オクチル−ベータ−D−マルトピラノシド、n−オクチル−ベータ−D−チオグルコピラノシド、n−オクチルグルコシド、n−ウンデシルベータ−D−グルコピラノシド、N,N−ジメチルオクタデシルアミンN−オキシド、NDSB−195、NDSB−211、NDSB−221、NDSB−256、テトラデシル硫酸ナトリウム、NDSB−256−4T、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Nonidet(登録商標)P40、ノニル−ベータ−D−1−チオマルトシド、酢酸ノニルフェニルポリエチレングリコールオクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクチルチオガラクトシド臭化オキシフェノニウムペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテルPLURONIC F−127、ポリオキシエチレン(25)プロピレングリコールステアレート、モノパルミチン酸ポリオキシエチレンソルビタンポリソルベート60、ポリソルベート80サポニン、1−ヘプタンスルホン酸ナトリウムタウデオキシコール酸ナトリウム水和物、タウロヒオデオキシコール酸ナトリウム水和物モノラウリン酸ソルビタンモノステアリン酸ソルビタンモノオレイン酸ソルビタントリオレイン酸ソルビタン、モノカプリン酸スクロース、モノラウリン酸スクロース、タウロケノデオキシコール酸(saurochenodeoxycholic acid)(ナトリウム塩)、タウロデオキシコール酸(ナトリウム塩)、タウロウルソデオキシコール酸(ナトリウム塩)、Tergitol(登録商標)、Tergitol(登録商標)NP−10、テトラエチレングリコールモノドデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、テトラエチレングリコールモノオクチルエーテル、NP−40、Triton X−100、Triton X−113、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、CHAPS、Tween 85、Zwittergent 3−08、Zwittergent 3−10、Zwittergent 3−12、Zwittergent 3−14、Zwittergent 3−16、トリスドデシルスルフェートトリエチレングリコールモノオクチルエーテル、トリエチレングリコールモノデシルエーテル、臭化トンゾニウム、APO−10、APO−12、APO−14、APO−16、ASB−14、およびASB−16。一態様では、界面活性剤は、タウロコール酸ナトリウムである。ある種の態様では、界面活性剤は、約2〜約20g/Lの濃度で存在する。別の態様では、界面活性剤は、約5〜約15g/L存在する。一態様では、界面活性剤(例えば、タウロコール酸ナトリウム)は、約10g/Lの濃度で存在する。

0063

酵素反応溶液は、緩衝溶液である。適切な緩衝剤には、対イオンとして適切な陽イオン(例えば、Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+、Be2+、Ba2+、Mg2+、Sr2+、NH4+、NR4+、NHR3+、NH2R2+、NH3R+(Rは、MW1000以下の任意の炭素含有部位化合物である)、ピリジニウムおよび上記の1つ以上の追加のR基を有する任意のピリジニウム、イミダゾリウムおよび上記の1つ以上のR基を有するイミダゾリウム、ヒドロキシルアンモニウム(NH3OH+)、ならびにNH2ROH+、NHR2OH+、ならびにNR3OH+、ホスホニウム(R4P+)、ならびにピリミジニウムおよび上記の1つ以上のR基を有するピリミジニウム)とのリン酸塩が含まれる。他の適切な緩衝剤には、上に記載した通り、対イオンとして適切な陽イオンを有するカルボン酸塩が含まれる。適切なカルボン酸塩には、1つ以上のカルボン酸基を含有する、MW1000以下のあらゆる炭素含有化合物(例えば、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩酪酸塩イソ酪酸塩クエン酸塩コハク酸塩マロン酸塩シュウ酸塩、およびカコジル酸塩)が含まれる。リン酸塩およびカルボン酸塩に加えて、他の適切な緩衝剤には、上に記載した通り、対イオンとして適切な陽イオンを有する硫酸塩、スルホン酸塩(RSO3-、Rは上で定義されている)、硫酸モノエステル塩(ROSO3-、Rは上で定義されている)が含まれる。他の適切な対イオンには、フッ化物イオン、チオシアン酸イオン、亜硫酸イオン、および亜硝酸イオンが含まれる。一態様では、緩衝液は、揮発性緩衝液である。一態様では、緩衝液は、ギ酸アンモニウムの緩衝液である。

0064

ある種の態様では、緩衝剤は、約0.05〜約1.0Mの濃度で存在する。一態様では、緩衝剤(例えば、ギ酸アンモニウム)は、約0.1〜約0.5Mの濃度で存在する。酵素反応溶液は、pH約2〜約9を一般に有する。ある種の態様では、溶液はpH約3〜約7を有する。別の態様では、溶液はpH約4〜約5を有する。

0065

特定の一態様では、9−plex酵素反応溶液は、酢酸バリウム(II)(7.5mM)、酢酸セリウム(III)(5.0mM)、アカルボース(8μM)、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトン(150μM)、およびタウロコール酸ナトリウム(10g/L)を含む、ギ酸アンモニウム緩衝溶液(0.5M、pH5.0)である。

0066

特定の一態様では、6−plex酵素反応溶液は、アカルボース(8μM)およびタウロコール酸ナトリウム(10g/L)を含む、ギ酸アンモニウム緩衝溶液(0.1M、pH4.4)である。

0067

特定の態様では、3−plex酵素反応溶液は、酢酸バリウム(II)(7.5mM)、酢酸セリウム(III)(5.0mM)、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトン(150μM)、およびタウロコール酸ナトリウム(10g/L)を含む、ギ酸アンモニウム緩衝溶液(0.5M、pH5.0)である。

0068

ある種の態様では、上記の酵素反応溶液は、リソソーム酵素に対する1種以上の基質をさらに含む。代表的な基質は、以下の酵素に対するリソソーム酵素の基質が含まれる:
(a)α−グルコシダーゼ(GAA)、
(b)α−ガラクトシダーゼ(GLA)、
(c)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、
(d)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、
(e)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、
(f)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)、
(g)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、
(h)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、および
(i)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)。

0069

ある種の態様では、酵素反応溶液は、上記基質の各々を含んでいる。代表的な基質は、ここに記載したものを含んでいる。

0070

別の態様では、上記の酵素反応溶液は、リソソーム酵素に対する1種以上の内部標準を含む。代表的な内部標準には、上記の酵素に対するリソソーム酵素の内部標準が含まれる。代表的な内部標準には、ここに記載したものが含まれる。

0071

9−plexアッセイ(ASM、GAA、GLA、ABG、GALC、IDUA、ID2S、GAL6S、GAL4S)
一態様では、本発明は、第1の酵素反応緩衝液を使用する、9種のリソソーム酵素の多重酵素アッセイを提供する。9種のリソソーム酵素が、9−plexアッセイでアッセイされる:
(1)酸性スフィンゴミエリナーゼ(ASM、ニーマン−ピック病−A/B)、
(2)α−酸性グルコシダーゼ(GAA、ポンペ病)、
(3)α−ガラクトシダーゼA(GLA、ファブリ病)、
(4)酸性α−グルコセレブロシダーゼ(ABG、ゴーシェ病)、
(5)ガラクトセレブロシダーゼ(GALC、クラッベ病)、
(6)α−イズロニダーゼ(IDUA、ムコ多糖症−I)、
(7)イズロン酸−2−スルファターゼ(ID2S、ムコ多糖症−II)、
(8)N−アセチル−ガラクトサミン−6−スルファターゼ(GAL6S、ムコ多糖症−IVA、モルキオA症候群)、および
(9)N−アセチル−ガラクトサミン−4−スルファターゼ(GAL4S、ムコ多糖症−VI、マロトーラミー症候群)。

0072

9−plex酵素反応緩衝液には、以下のものが含まれる:
(a)硫酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(b)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(c)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤、
(d)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および
(e)1種以上の界面活性剤。

0073

リソソーム酵素の多重分析法のための本発明の代表的な方法は、以下の通り要約することができる。DBSパンチを、合成基質(S)を含有しているアッセイ緩衝液中でインキュベートする。並列インキュベート数を減じるために、最小数のアッセイ緩衝剤を使用する。インキュベートにより基質の生成物への転化を可能にした後、生成物(P)をタンデム質量分析により定量する。内部標準(IS)は生成物と化学的に同一であるが重同位元素を有するか、または非同位体性であるが、構造が緊密に関係しているかのいずれかである。タンデム四重極質量分析計を使用して、前駆体イオンの衝突誘起解離に由来するリポーターイオンを検出する(MS/MS)。これにより、非常に複雑な全血の混合物を使用した場合でさえも、分析的選択性を確実なものとする。生成物と内部標準のリポーターイオンの両方が、9つのP/IS組の各々についてMS/MSにより検出される。内部標準の使用は、手順全体の中で酵素により産生される生成物のいかなる損失にも(例えば、生成物の酵素による分解、表面への結合による生成物の損失による)説明がつく。MS/MSは一度に1種のリポーターイオンを検出するが、迅速な負荷サイクルを使用して、短時間のスケール(約100msec)をかけて、18種の分析物(9つのP/IS組)をすべて対象とする。

0074

基質の共通の構造上の特徴は、酵素により特異的に認識される基、酵素により産生される生成物の部分としての疎水性炭素鎖逆相LCカラムとの相互作用のより、クロマトグラフィー分離を可能にする)、および質量分析計における主なフラグメント化経路に沿ってイオン衝突誘起解離に向かわせる、フラグメント化が容易にできる官能基(これはアッセイ感度を改善する)である(図1A〜1Iを参照されたい)。t−ブチル含有カルバメートは、GLA、GAA、IDUA、ID2S、GAL6S、およびGAL4S生成物の場合、容易にフラグメント化可能な基(CO2およびイソブチレンを失う)を提供する。ABG、ASMおよびGALCに関しては、セラミドは容易にフラグメントを生成し、スフィンゴシン部位を含有している共通のイミニウムイオンを与える。GAL6S基質は、非重水素型がIDUA基質と同重性であるので、d9−t−ブチル基を有する点で独特である。リンカーの炭素鎖を5個を超えて増加させる代替的な手法により、アッセイ混合物中の水溶解度が低下する。重水素化試薬の余計なコストが、試薬合成の総コストに著しく上乗せすることはない。

0075

多大な努力により、本発明のアッセイ緩衝液に至った。LC−MS/MSアッセイは、一部の酵素がその最適pHからシフトしたpHでアッセイすることができるよう、十分感度が高く、こうして、必要な緩衝剤数が最小限になる。洗剤は、セラミド含有基質を溶解させるために必要であり、洗剤は、水溶性基質に作用する他のリソソーム酵素により、よく耐容された。アカルボースは、酸性pH領域でα−グルコシダーゼ活性を有する、血液中の酵素であるマルターゼグルコアミラーゼを阻害することが報告されており、このため、GAAの分析を妨害する。スルファターゼID2S、GAL6SおよびGAL4Sは、血液中で比較的高濃度遊離硫酸塩およびリン酸塩により阻害され、またこの緩衝剤は、非スルファターゼ活性を低下させることなく、これらの陰イオンの沈殿を引き起こす金属陽イオンを含有している。このように、本発明は、2種の緩衝液(3−plex+6−plex)中、または単一緩衝液(9−plex)中のいずれかで、9種のリソソーム酵素のアッセイを提供する。前者は、2つのDBSパンチを利用するのに対して、後者は、単一パンチしか必要としない。

0076

アッセイは、最小数の液体の移注を必要とする。マルチチャンネルピペットを使用して、全アッセイカクテルを各ウェルに加えて、DBSパンチを覆う。プレートは、プラスチック製フィルムにより密閉し、所望のインキュベート時間、オービタルシェーカー/インキュベーター内に入れる。アセトニトリルを加えてタンパク質を沈殿させ、プレートを卓上遠心分離器中で回転し、タンパク質をペレットにする。上澄み液のほとんどをピペットにより新しいマイクロタイタープレートに移注し、水を加えて溶媒強度希釈し、このプレートをアルミニウム箔により密封してLC−MS/MS機器オートサンプラーに入れた。このように、アッセイは合計4回の液体の移注を必要とし、すべては、8−または96−チャンネルの携帯型ピペットにより容易に行われる(数枚のプレートを超えて処理する必要がある場合、自動化も可能である)。

0077

UHPLCにより、試料を処理するための自動化された迅速な方法が実現され、こうして発明者らが以前のアッセイにおいて使用した液−液および固相抽出ステップの必要性がなくなる。2本のUHPLCカラムおよび切り替え弁の使用により、1本目のカラムは分析物の分離を行うために使用され、もう一方のカラムは、次の試料注入用溶媒により平衡化される。このプロトコルは、処理能力を2倍にする。

0078

こうして、3種のスルファターゼが単一緩衝液中でインキュベートされ(3−plex)、かつ6種の他の酵素を異なる緩衝液中でアッセイ(6−plex)する(したがって2つの3mmDBSパンチを必要とする)多重アッセイの1つの型が、評価された。図2Aおよび2Bは、3−plexおよび6−plexのHPLCイオントレースをそれぞれ示している。3−plexに関しては、生成物および内部標準は、対応する基質よりも先によく溶出する。基質および生成物のクロマトグラフィー分離は、質量分析計の源において、基質は生成物にある程度の分解を受けるので、スルファターゼにとって重要である。生成物のUHPLC保持時間に生じるイオン反応に相当する、酵素により産生される生成物だけを定量することが望ましい。ID2S生成物および内部標準の保持時間は、内部標準が生成物の重水素化類似体であるので、同じである。GAL4SおよびGAL6Sの場合、リンカーアーム中のメチレン数が1つだけ異なるので、内部標準と比較して生成物には保持時間のわずかなシフトがある(図1Hおよび1Iを比較されたい)。図2Bは、6−plexに関するイオントレースを比較している。インソースフラグメント化による基質の生成物への少量の転化が、ABG、GALC、GLA、およびGAAについて観察される。3−plexおよび6−plex反応に関するアッセイインキュベーション由来の生成物および内部標準を組み合わせて、シングルHPLC−MS/MS分析図3)に供する、多重アッセイを評価した。基質および生成物のクロマトグラフィー分離は、9つの例すべてで達成される。これらのHPLC運転は、最大4分必要とする。

0079

分離速度の実質的な改善は、UHPLCによって実現され、その結果を図4に示している。基質の生成物へのインソースフラグメント化は、ABG、GALC、GAL4S、GAL6Sの場合に観察され、GLAおよびGAAに関してはその程度はより小さい。分析物は、たった1.4分で良好に分離され、基質と生成物の間の分離は、すべての分析物に関して、HPLCにおいて得られる分離よりも優れていた。UHPLCを使用するこの強力な分離により、基質のインソースフラグメント化由来の生成物ピーク汚染がないことが確実となる。切り替え弁を備えたデュアルカラムの使用により、わずか1.8分の注入間時間が達成される。

0080

6+3−plexおよび9−plexアッセイを、品質管理試料に対して評価した。疾病管理予防センター(CDC)は、様々な量の未処理臍帯血(多数のドナーから蓄えられている)と混合した白血球除去血液(基本プール(base pool))から作製した血液スポットを配っている。図6A〜6Iに示される通り、9種の酵素すべてについて、非常に直線的な応答(CDC品質管理DBS中の全血のフラクションに対する各酵素の比活性(μmol生成物hr-1(L血液)-1対))が得られ、これは、アッセイ応答がDBS中の酵素量に比例することを示している。

0081

図5A〜5Cはそれぞれ、無作為新生児由来の80名のDBSおよび数名のLSD罹患個体(新生児ではなく、老齢患者)により測定した、GLA、GAA、およびIDUA酵素に対する比活性の分布を示している(他の6種のLSDに関するプロットは、図7A〜7Fに提示されている)。9名のLSDすべてについて、診断患者由来の試料は、無作為新生児からのものより酵素活性が低いことを示した。

0082

6+3−plexアッセイについて得られた図5A〜5Cおよび図7A〜7Fに相当するプロットは、図8A〜8Iに示している。すべての場合で、罹患個体は、58名の無作為新生児のものよりもはるかに低い比活性を有する。

0083

上記(LC−MSMS)の9−plex(上段)または6−plex+3−plex(下段)アッセイに関する酵素比活性(μモルhr-1(L血液)-1)(平均値±標準偏差)を表1にまとめている。表1において、「単一DBS」とは、6回のパンチをされた1名の健常な新生児由来のDBSを指す;「正常なDBS」とは、58名の無作為に選択された新生児を指し、各新生児は、1回のパンチをされており;また、ブランクは、乾燥血液を含んだものの代わりに、血液不含ろ紙パンチによるアッセイを指す。6−plexには、酵素IDUA(アルファ−L−イズロニダーゼ、ムコ多糖症−I)、GLA(アルファ−ガラクトシダーゼA、ファブリ)、GAA(酸性アルファ−グルコシダーゼ、ポンペ)、ASM(酸性スフィンゴミエリナーゼ、ニーマンピックA/B型)、GALC(ガラクトセレブロシダーゼ、クラッベ)、およびABG(酸性ベータ−D−グルコシダーゼ、ゴーシェ)が含まれる。3−plexには、酵素GAL4S(N−アセチルガラクトサミン−4−サルフェートスルファターゼ、ムコ多糖症−VI)、GAL6S(N−アセチルガラクトサミン−6−スルフェートスルファターゼ、ムコ多糖症−IVA)、およびID2S(イズロン酸スルファターゼ、ムコ多糖症−II)が含まれる。9−plexには、6−plexにおける酵素、および3−plexにおける酵素が含まれる。

0084

表1は、ある場合において、6−plexおよび3−plexと比較すると、9−plexアッセイに関して測定された酵素の絶対比活性の差異を明らかにしている;これは、アッセイ緩衝液が、インキュベートに使用したpH、添加剤、および体積に差異があるからである。したがって、健常な検体の絶対酵素活性は、罹患個体の酵素活性と常に比較しなければならず、これにより、酵素アッセイの分析的な分離が決まる。結果は、分析的に十分な分離が、9−plexまたは6+3−plexの酵素アッセイのいずれかに実現可能であることを示している(図5A〜5C、7A〜7F、および8A〜8Iを参照されたい)。6−+3−plexアッセイは、9−plexと比較して、ID2Sに対してやや高い分離を実現する一方、平均的な正常のDBS酵素比活性は、それぞれ、0.98±0.298および0.23±0.069ミリモルhr-1(L血液)-1である。

0085

分析システムの高い再現性は、システム適合性試験(例1の表5を参照されたい)からの結果により文書化し、これにより、すべての生成物および内部標準について、保持時間およびピーク面積に対する係数変動は、それぞれ<1%および<15%であることを実証している。単一DBS(n=6)に関して測定された総合的な酵素活性分散は、通常、<12%(表1)であった。LC−MS/MSプラットフォームは、市販の機器から容易に移動可能である。後の記述を支持するために、類似の最適パラメーターを実証した(例えば、例1の表3および4における、様々なトリプル四重極質量分析計に関するエネルギー衝突)。

0086

ほとんどの新生児スクリーニング試験室は、LC−MS/MSよりもフローインジェクション(FI)MS/MSを使用している。LC−MS/MSが、新生児スクリーニング試験室において実施されていることもある。第1に、LC−MS/MSは、新生児スクリーニング試験室において良好に機能することが示されている。第2に、UHPLC−MS/MSは、医薬産業において、主として薬物動態および品質管理分析のために、日々何千もの試料に使用されている。第3に、実験結果により、LC分離およびカラム背圧は、少なくとも3,000回のアッセイ実施後に安定していることが示されている。したがって、UHPLCのカラムコストが、新生児スクリーニングのコストに実質的に加わることはなく、またカラムは、<10分に変更することができる。第4に、イオン性および極性血液由来成分のほとんどが存在する、LCカラムからの空隙体積は、質量分析計よりも廃液に向かい、こうして、エレクトロスプレー源の汚染が最小限になる。MS/MSプラットフォームにLCを追加すると、次の数年間にわたり、新生児スクリーニング試験室における増強が期待される。MS/MSは、従来の蛍光定量アッセイよりもずいぶん多くの情報を提供する。例えば、GALC酵素活性が低いことと重症表現型とに関連性がない場合において、LC−MS/MSによるサイコシンレベルのモニタリングは、DBSにおいて、潜在的なクラッベ患者を階層化するのにより優れた方法を潜在的に提供することが最近示されている。

0087

DBSにおける酵素安定性の問題が、問題となり得る。環境因子の不十分な管理により、酵素比活性が低下することがある。本発明の多重アッセイの有利な特徴の1つは、いくつかの酵素の比活性の低下が、DBSの不十分な処置を示すと思われることである。多重アッセイにおいて測定される3種のスルファターゼの活性低下は、多重スルファターゼ欠損症の可能性を示唆していると思われる。

0088

LCプラットフォームの方がフローインジェクションよりも有利な点の1つは、前者に関しては事前質量分析法ステップが最小限に低減されるのに対して、後者に関しては、基質および緩衝剤の塩を除去するために、有機溶媒によるアッセイ混合物の液−液抽出、またはシリカゲルまたはイオン交換樹脂を使用する追加の固相抽出のいずれかを必要とすることである。生成物および内部標準と比較すると比較的多量の基質がLCカラム上に注入されて、適切なLC分解が得られない場合、基質による生成物および内部標準のイオン化の深刻な抑制が起こることになる。一方、ほとんどの基質は、フローインジェクションを含むある種の方法において、事前質量分析用試料の処理により除去される。フローインジェクションでは、均一な組成物の単一溶液が質量分析計に注入され、生成物および内部標準は、比較的長い時間をかけて定量される(通常、数十秒)。LC−MS/MSでは、生成物および内部標準は、数秒という比較的短時間で溶出し、質量分析計源に入る溶出物の組成は、経時的に変化する。

0089

上に記載される通り、一態様では、酵素アッセイ試料は、液体クロマトグラフィー(LC−MSMS)による質量分析に導入される。別の態様では、酵素生成物の試料は、フローインジェクション(FI−MSMS)による質量分析に導入される。この態様では、酵素アッセイ試料は、フローインジェクションによるMSMS機器に導入され、この場合、液流は、LCには必要のない、インジェクターシステムからMSMSイオン化源に直接向かう。この場合、基質が生成物を与えるインソース分解量を最少化する一方、同時に生成物および内部標準のイオン化効率をかなり低下させないよう、エレクトロスプレーイオン化パラメーターを調節することが重要である。MSMSを使用する当業者であれば、こうした調節を実現するための技術に習熟している。MSMSに試料をフローインジェクションするための適切な溶媒は、ギ酸もしくはギ酸アンモニウムを含有する、または含有しないメタノール/水の混合物であるが、他の注入溶媒も有用である。

0090

フローインジェクションは、酵素試料(6−plex)をMSMS機器に導入するために使用した。6−plexは、上記の6種の同一酵素であった。それに関する結果は、表1に示されている。本方法により決定した、6−plexのFI−MSMSアッセイに関する酵素比活性(μモルhr-1(L血液)-1)(平均値±標準偏差)を表2にまとめている。この表では、「単一DBS」は、1名の健常な新生児からのDBSを指す。ブランクは、乾燥血液を含有しているものの代わりに、血液不含ろ紙パンチによるアッセイを指す。

0091

上に記載される通り、本発明は、新生児スクリーニングに適した1種または2種のアッセイカクテルのいずれかで、1つまたは2つのDBSパンチのいずれかを利用する、9種のリソソーム酵素のアッセイの単純化を提供する。9種の酵素のアッセイは、酵素源としての新生児スクリーニングカードに対して、基質および内部標準ならびに1つまたは2つの乾燥血液スポット(DBS)パンチのカセットを含む1種の緩衝液中または2種の緩衝液中のいずれかで実施される。この態様では、HPLC−MS/MS試料の予備調製には、分離およびカラム平衡化に流れを向かわせるための切り替え弁を装備したデュアルカラムHPLCに注入する前に、たった4回の液移送しか必要としない。生成物および内部標準の特異的なイオンフラグメント化が、選択反応モード(SRM)におけるMS/MSの定量化に使用される。以下に詳細に説明される通り、58名の無作為新生児由来、およびリソソーム蓄積症罹患患者由来の血液スポットの分析により、本アッセイが罹患個体と非罹患個体を容易に区別することが示された。9−plex分析あたりの時間(1.8分)は十分に短く、新生児スクリーニング試験室の作業流れに適合することができる。この態様では、(HPLC−MS/MS)は、リソソーム酵素活性の定量化について、フローインジェクションMS/MSの実現可能な代替法を提供する。本方法は、1種または2種の反応緩衝液を使用する、9種のリソソーム酵素のアッセイを可能にし、これにより、実施に必要な分離インキュベート数を最小限にする。

0092

6重(6−Plex)アッセイ(GAA、GLA、IDUA、ABG、GALC、ASM)
一態様では、本発明は、第2の酵素反応緩衝液を使用する、6種のリソソーム酵素の多重酵素アッセイを提供する。6種のリソソーム酵素が、6重アッセイにおいてアッセイされる:
(1)α−グルコシダーゼ(GAA)(ポンペ病)、
(2)α−ガラクトシダーゼ(GLA)(ファブリ病)、
(3)α−L−イズロニダーゼ(IDUA)(ムコ多糖症I型)、
(4)β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)(ゴーシェ病)、
(5)β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)(クラッベ病)、および
(6)スフィンゴミエリナーゼ(ASM)(ニーマン−ピック病A/B型)。

0093

6種のリソソーム酵素(ABG(ゴーシェ病)、GALC(クラッベ病)、ASM(ニーマン−ピック病A/B型)、GLA(ファブリ病)、GAA(ポンペ病)、およびIDUA(ムコ多糖症I型))に対する、基質、生成物、および内部標準の超高速液体クロマトグラフィー(UHPLC)分離を図14に比較している。ムコ多糖症IVA型、ムコ多糖症II型、およびムコ多糖症VI型(図示せず)に対する、基質、生成物、および内部標準も同様に分離することができる。図示したイオンピークは、タンデム質量分析法によって検出された。健常な個体に属する、処理済み6重アッセイ試料を注入(10μL)した後に得られたLC−MS/MSクロマトグラム(各SRMチャンネルは、1種の基質、1種の生成物、または1種の内部標準を表す。詳細は表7を参照されたい)。

0094

6−plex酵素反応緩衝液は、
(a)マルターゼグルコアミラーゼ阻害剤、および
(b)1種以上の界面活性剤
を含む。

0095

6−plex酵素反応緩衝液の適切な成分は、酵素反応溶液について上に記載された通りである。一態様では、6−plexアッセイにおいて有用な酵素反応緩衝液には、ギ酸アンモニウム(ギ酸および水酸化アンモニウムから調製される)、タウロコール酸ナトリウム、およびアカルボースが含まれる。6重アッセイにおける代表的な酵素反応緩衝液の調製およびその使用は、例2および4において記載されている。

0096

3重(3−Plex)アッセイ(ID2S、GAL6S、GAL4S)。別の態様では、本発明は、第3の酵素反応緩衝液を使用する、3種のリソソーム酵素の多重酵素アッセイを提供する。3種のリソソーム酵素が、3重アッセイにおいてアッセイされる:
(1)イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)(ムコ多糖症II型)、
(2)N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)(モルキオA症候群)、および
(3)N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)(マロトーラミー症候群)。

0097

3−plex酵素反応緩衝液は、
(a)硫酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(b)リン酸イオンの沈殿に有効な1種以上の金属陽イオン、
(c)ベータ−N−アセチルヘキソサミニダーゼ阻害剤、および
(d)1種以上の界面活性剤
を含む。

0098

3−plex酵素反応緩衝液の適切な成分は、酵素反応溶液について上に記載された通りである。一態様では、3重アッセイにおいて有用な酵素反応緩衝液には、ギ酸アンモニウム(ギ酸および水酸化アンモニウムから調製する)、酢酸バリウム、酢酸セリウムおよび2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトン(2A2D−GlcLactone)が含まれる。3重アッセイにおける代表的な酵素反応緩衝液の調製およびその使用は、例3および4において記載されている。

0099

以下の例は、例示目的であり、本発明を限定するために提供されるものではない。

0100

例1
代表的な9−Plexおよび6+3−Plexリソソーム酵素アッセイ法
材料。α−グルコシダーゼ(GAA)、α−ガラクトシダーゼ(GLA)、α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、およびスフィンゴミエリナーゼ(ASM)の酵素アッセイおよびCDC品質管理用DBS試料のための基質(S)および内部標準(IS)は、Dr.H.Zhou(CDC、Atlanta、GA)より受け取った。イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、およびN−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ(GAL4S)に特異的な試薬は、Duffey,T.A.、Khaliq,T.、Scott,C.R.、Turecek,F.、Gelb,M.H.(2010)「Design and synthesis of substrates for newborn screening of Maroteaux−Lamy and Morquio A syndromes」Bioorg.Med.Chem.Lett.、20(20):5994〜5996;およびBlanchard,S.、Turecek,F.、Gelb,M.H.(2009)「Short synthetic sequence for 2−sulfation of alpha−L−iduronate glycosides」Carbohydrate Research、344:1032〜1033に記載されている通り調製した。合成法は、新生児スクリーニングを世界的に支援するのに適切な処理スケールで最適化した。アセトニトリル≧99.9%(カタログ番号34967)およびメタノール≧99.9%(カタログ番号34860)は、SigmaAldrich社(St.Louis、MO)から購入した。

0101

品質管理(QC)用の乾燥血液スポット(DBS)試料(ロット番号3−2010)は、CDCから取得し、固体乾燥剤無水CaSO4、例えばDriedriteまたはその等価物)を備えた密封プラスチック製箱に入れたzip−lockプラスチック製袋中、−20℃で保管した。健常な個体のDBSは、WA州新生児スクリーニング試験室から受け取った。これらは、乾燥(dessication)なしで周囲温度で保管した約30日齢のDBSである。DBS試料はすべて、3mm(1/8”)径の穿孔器により手動でパンチした。

0102

9−plexアッセイカクテルの調製。CDCからのS/ISバイアルを、メタノール;GLA(10mL);GAAおよびIDUA(6mL);ABG、GALCおよびASM(4mL)に溶解し、溶液は元のバイアル中、−20℃で保管した。ID2SおよびGAL6SのS/IS物質は、個々のガラス製バイアル(4mL、Fisher Scientific社、カタログ番号22−022−944)に正確に取し、メタノールを加えて、SおよびISのそれぞれ10mMおよび1mM原液にした。溶液はバイアル中、−20℃で保管した。GAL4S Sは、メタノール中、1mMに溶解し、またGAL4S IS原液は他のものと同様に調製した。ID2S−S(0.5mL)、GAL4S−S(10mL)、GAL6S−S(2mL)、およびID2S−IS、GAL6S−IS、GAL4S−IS(各、50μL)の原液を、各CDCのバイアルのアリコート(1mL)と一緒に、新しいバイアル中に混合し、溶媒を真空濃縮器(Savant SpeedVac;Thermo Scientific社、San Jose、CA、カタログ番号SC210A−115)中、中程度の温度(43℃)設定で除去した。バイアル中の残さは−20℃で保管することができ、以下に記載される通り、必要に応じて再構成することができる。9−Plexアッセイ緩衝液(10mL、上に記載されるように調製した)を残さに加え、この混合物を水道水(<40℃)下で簡単に温めながら、内容物が完全に溶解するまで、短時間、ボルテックスした。得られた溶液は、アッセイ緩衝液中、200μMのGAA−S、2.0μMのGAA−IS、600μMのGLA−S、1.2μMのGLA−IS、500μMのIDUA−S、3.5μMのIDUA−IS、150μMのASM−S、2.7μMのASM−IS、450μMのGALC−S、2.8μMのGALC−IS、300μMのABG−S、5.9μMのABG−IS、500μMのID2S−S、5μMのID2S−IS、2mMのGAL6S−S、5μMのGAL6S−IS、1mMのGAL4S−S、5μMのGAL4S−ISを含有した。アッセイカクテルは保管しなかった。

0103

追加の実験詳細。すべての溶液の保管条件は、上に記載されている。試薬をすべて溶解する場合、それらは微粒子が残らないことを確実とするよう、目視検査すべきである。これは、脂質の試薬(ゴーシェ病、ニーマン−ピック−A/B型、およびクラッベ病)にとってとりわけ重要であり、この試薬は洗剤含有緩衝液にゆっくり分散する。

0104

QC用のDBSは、未処理臍帯血および白血球除去血液から調製して、酵素活性に差異を持たせ、基準(0%)(B)、低値(5%)(L)、中値(50%)(M)、および高値(100%)(H)として表示する(De Jesus,V.R.ら、Development and evaluation of quality control dried blood spot materials in newborn screening for lysosomal storage disorders.Clin.Chem.55、158〜164(2009))。基準試料は、白血球除去血液を含有し、微量のリソソーム酵素を依然として含んでいてもよく、低値(5%)は基準試料+5%の未処理臍帯血であり、中値は基準+50%の未処理臍帯血であり、高値は100%の未処理臍帯血である。したがって、CDCのDBS対照試料中における、酵素活性測定値対酵素量のプロットに関しては、X軸の値は、B、L、MおよびHのCDCのDBSに関して、それぞれ0、0.05、0.5および1.0である。基本プール中の酵素活性は、恐らく基準試料がリソソーム酵素を全く含んでいないので、3mmの非血液DBSパンチ(ろ紙のみ)を有するアッセイにおいて測定されるものよりも通常高いことが分かった。3mmのDBSのろ紙のみのパンチは、酵素活性測定のための真の分析上のブランクを得るために使用した。

0105

6+3−plex。6−plexアッセイカクテルを作製するため、CDCからのS/ISバイアルをメタノールに溶解した;GLA(10mL);GAAおよびIDUA(6mL);ABG、GALCおよびASM(4mL)、および溶液は元々のバイアル中、−20℃で保管した。各バイアルのアリコート(1mL)を新しいバイアル中に混合し、この溶媒を窒素アルゴンまたはオイルレス空気の気流により蒸発させ、温度は最大40℃まで調節することができる。残さは、フタ付きガラス製バイアル中、−20℃で少なくとも6か月間保管して、必要に応じて再構成することができる。このバイアルは、6−plexアッセイ緩衝液(上に記載されるように調製した)10mL中で再構成した。試料は、内容物が完全に溶解するまで(目視検査)まで、短時間、ボルテックスまたは超音波処理し、水道水(<40℃)下で温めた。得られた混合物は、アッセイ緩衝液中、200μMのGAA−S、2.0μMのGAA−IS、600μMのGLA−S、1.2μMのGLA−IS、500μMのIDUA−S、3.5μMのIDUA−IS、150μMのASM−S、2.7μMのASM−IS、450μMのGALC−S、2.8μMのGALC−IS、300μMのABG−S、5.9μMのABG−ISを含有している。余分の6−plexアッセイカクテルは、フタ付きガラス製バイアル(4mL、Fisher Scientific社、カタログ番号22−022−944)中、−20℃で最大1か月間、保管した。冷凍庫から取り出した際に、内容物が完全に溶解するまで(目視で確認)まで、バイアルを短時間、ボルテックスまたは超音波処理し、水道水(<40℃)下で温めた。

0106

3−plexアッセイカクテルを作製するために、ID2S、GAL6SおよびGAL4SのS/IS物質を、個々のガラス製バイアル(4mL、Fisher Scientific社、カタログ番号22−022−944)に各々正確に秤取した。GAL4S S以外のすべてに関して、メタノールを各バイアルに加えて10mMおよび1mMの基質および内部標準物の原液をそれぞれ得て、これらの溶液をバイアル中、−20℃で保管した(メタノールは冷凍庫中で蒸発することができるので、これらのバイアルにしっかりフタをした)。GAL4S Sに関しては、固体をメタノールに溶解し、1mM原液を得た。ID2S−S(0.5mL)、GAL4S−S(10mL)、GAL6S−S(2mL)、およびID2S−IS、GAL6S−IS、およびGAL4S−IS(各、50μL)の原液を、新しいバイアル中に混合し、溶媒を真空濃縮器(Savant SpeedVac;Thermo Scientific社、San Jose、CA、カタログ番号SC210A−115)中、中程度の温度(43℃)設定で除去した。メタノールは、6−plexアッセイ用に、上に記載されるガス流により除去することもできる。バイアル中の残さを−10〜−20℃で保管することができ、以下に記載される通り、必要に応じて再構成することができる。3−Plexアッセイ緩衝液(10mL)(上に記載される通り調製した)をバイアル中の残さに加え、この混合物を、短時間ボルテックスした。得られた溶液は、3−plexアッセイ緩衝液中、0.5mMのID2S−S、5μMのID2S−IS、2mMのGAL6S−S、5μMのGAL6S−IS、1mMのGAL4S−S、5μMのGAL4S−ISを含んだ。余分の3−plexアッセイカクテルは、−20℃で最大1か月間、保管した。

0107

アッセイインキュベーション。新生児由来の分析済みDBSをパンチして複製し、同一の96−ウェルプレート(0.5mL、Axygen Scientific、VWR International社、カタログ番号47743−982)に設定した(以下で、プレート1および2と呼ぶ)。所望のチャンネル数を有する標準ピペット(すなわち、1−、6−、12−または96−チャンネル)、およびポリプロピレン製ピペットチップを使用して、プレート1の各ウェル中に6−plexアッセイカクテルのアリコート(30μL)、およびプレート2の各ウェル中に3−plexアッセイカクテルのアリコート(15μL)をピペットで移した。その後、プレートを密封フィルム(AxySeal、VWR International社、カタログ番号10011−117)により密封し、オービタルシェーカーにより37℃で一晩(16時間)インキュベートした(250RPM)。本発明者らは、スルファターゼ基質は作製により費用がかかるので、3−plexに関しては30μLの代わりに15μLを使用したこと、およびアッセイは15μLで再現性があることに留意されたい。

0108

試料ワークアッププロトコル。プレート1および2を16時間インキュベートした後(それぞれ、6−plexおよび3−plexアッセイを示す)、アセトニトリルを手動のマルチチャンネルピペットにより加えて反応をクエンチし、タンパク質を沈殿させた。6−plexおよび3−plexアッセイは、ウェルあたりそれぞれ、アセトニトリル180μLおよび90μLによりクエンチした。プレートをポリエステルベースとする密封フィルム(AxySeal、VWR International社、カタログ番号10011−117)により覆い、3000rpm、室温で5分間遠心分離し、沈殿物をペレット化した。アセトニトリルへの長期暴露は、アクリル接着剤軟化するので、密封フィルムを直ちに取り除いた。ペレットの移動(dislodgement)を避けるために、上澄み液のアリコート(100μLおよび80μL)をプレート1および2からそれぞれ取り出した。この時点で、6−plexおよび3−plexアッセイは、個々に(1)、または単一の9−plexアッセイにおいて同時に(2)分析することができる。(1)の場合、プレート1および2からの上澄み液のアリコートを一組の新しい96−ウェルプレート(0.5mL、Axygen Scientific、VWR International社、カタログ番号47743−982)に移注し、150μLまたは120μLの脱イオン水(Milli−Q、18.2MΩ)を各ウェルにそれぞれ加え、試料溶媒強度を初期HPLC移動相条件に適合させた。このプレートをアルミニウム箔により慎重に密封し、6−plex(プレート1)および3−plex(プレート2)のLC−MS/MS分析に直接かけた。(2)の場合、プレート1とプレート2の両方の上澄み液のアリコートを単一の新しい96−ウェルプレート中で混合し、脱イオン水270μLを各ウェルに加えた。混合試料のプレートをアルミニウム箔で慎重に密封し、9−plexのLC−MS/MS分析に直接かけた。

0109

HPLC分離法。個々に処理した6−plexおよび3−plexの96−ウェルプレートを、Spacil,Z.らのComparative triplex tandem mass spectrometry assays of lysosomal enzyme activities in dried blood spots using fast liquid chromatography: application to newborn screening of Pompe,Fabry,and Hurler diseases.Anal.Chem.83、4822〜4828(2011)に記載の通り、並列のカラム再生が可能なHPLCシステムで分析した。このシステムは最大4000psiまでの背圧に耐え、並列フローチャンネルを使用し、一組のバイナリーHPLCポンプ(1525 Micro、Waters社、Milford、MA)、サンプルマネージャー(2777C、Waters社、Milford、MA)、および流れを方向付けるために使用する2ポジションポート切り替え弁(MXP 7900、Western Analytical Products社、Wildomar、CA)を含んでいる。プレカラムマイクロフィルターアセンブリ(カタログ番号M550)、フリットマイクロフィルター(038インチ×0.31インチ、0.5um、カタログ番号C−425x)およびナロボアPEEKチュービング(0.005インチ×1/16”)は、Idex Health&Science社(Oak Harbor、WA)から注文した。3−plexアッセイ、または組合せ9−plexアッセイ分離は、Waters Corp.社(Milford、MA)製の保護カラム(XSelect CSH;10mm×2.1mm、3.5μm;カタログ番号186005252)およびカートリッジホルダー(Universal Sentry Guard Holder;カタログ番号WAT097928)を装備した分析用C18カラム(XSelect CSH;50mm×2.1mm、3.5μm;カタログ番号186005255)上であった。6−plexアッセイ分離は、Thermo Scientific社(San Jose、CA)製のドロップイン保護カラムカートリッジ(Hypersil GOLD C18;10mm;2.1mm、3μm;カタログ番号25003−012101)およびカートリッジホルダー(Uniguard;カタログ番号852−00)を装備した分析用C18カラム(Hypersil GOLD;50mm×2.1mm、3μm;カタログ番号25003−052130)上で行った。分析用カラムは、周囲温度(約20℃)に維持し、試料は10μLのアリコートで注入した。溶媒A(95%水、5%アセトニトリル、0.1%ギ酸(v/v/v))および溶媒B(50%アセトニトリル、50%メタノール、0.1%ギ酸(v/v/v))から作製した移動相を直線勾配モードで溶出した。以下の溶出プログラムを使用した:(1)3−plexアッセイ分離、流量0.6mL/分、開始B60%;0.59分にB100%;0.99分にB100%;1.00分にB60%;2.00分にB60%;(2)6−plexアッセイ分離、流量0.6mL/分、開始B40%;0.59分にB100%;2.99分にB100%;3.00分にB40%;5.00分にB40%;および(3)組合せ9−plexアッセイ分離、流量0.6mL/分、開始B60%;0.59分にB100%;3.99分にB100%;4.00分にB60%;5.00分にB60%。上記の直線勾配溶出プログラムはすべて、分析部(それぞれ、開始〜1.00、開始〜3.00分、および開始〜4.00)、続いてカラムの再平衡化(それぞれ、1.00〜2.00、3.00〜5.00、および4.00〜5.00)から構成され、こうして、サンプルあたり、それぞれ1.00;3.00および4.00分となった。

0110

UHPLC分離法。分析用カラムおよびを保護カラム(それぞれ、Acquity CSH C18;2.1×50mm、1.7μm;カタログ番号186005296およびAcquity CSH C18 VanGuardプレカラム、2.1×5mm、1.7μm;カタログ番号186005303、上記両方ともWaters社(Milford、MA)製)を装着した、2D技術によるUHPLC system Acquity UPLC(Waters社、Milford、MA)を使用して、9−plexアッセイを分析した。先に紹介したHPLCシステム(Spacil,Z.ら、Comparative triplex tandem mass spectrometry assays of lysosomal enzyme activities in dried blood spots using fast liquid chromatography: application to newborn screening of Pompe,Fabry,and Hurler diseases.Anal.Chem.83、4822〜4828(2011))と同様に、UHPLCシステムは並列カラム再生能力を有しているが、LC分離は超高圧(最大15000psi)で実施することができる。こうして、2ミクロン以下の粒子吸着剤を利用して分離効率および分析処理能力を向上することができる。UHPLCカラムを40℃で維持し試料の、アリコート(10μL)を注入した。溶媒A(水、0.1%ギ酸(v/v))および溶媒B(50%アセトニトリル、50%メタノール、0.1%ギ酸(v/v/v))からの移動相を、直線勾配溶出プログラムに従って0.8mL/分の流量で混合した:開始B50%;0.69分にB100%;1.49分にB100%;1.50分にB50%;2.50分にB50%。UHPLC直線勾配には、カラム再平衡ステップ(1.5〜2.5分)を伴う分析部分(開始〜1.5分)を含んでいた。こうして、並列カラム再生を使用して試料あたり1.5分が実現する。

0111

ESI−MS/MS選択反応モニタリング。3−plex、6−plex、および組合せ9−plexアッセイ成分のSRMに基づくタンデム質量分光検出は、Mass Lynxソフトウェアバージョン4.1によるトリプル四重極質量分析計Quattro MicroおよびXevo TQ MS(Waters社、Milford、MA)上、ポジティブイオンモードで実施した。予備実験は、LCMS−8030トリプル四重極質量分析計(株式会社島津製作所、京都、日本)上で行った。各基質、生成物および内部標準に対する化合物の特定のSRMイオントランジションを表3に列挙している。

0112

Quattro Microトリプル四重極機器をHPLCシステムに連結し、SRMトランジションを50msのドウェルタイム、10msのチャンネル間タイム、および100msのスキャン間遅延モニターし、3−plexアッセイについて0.63秒(9個のSRMチャンネルをモニターした);6−plexアッセイについて1.17秒(18個のSRMチャンネルをモニターした)、および9−plexアッセイについて1.71秒(27個のSRMチャンネルをモニターした)の負荷サイクルになった。一般に、サイクルタイム>1秒は、最新LC分離法とは適合しない。したがって、UHPLC実験は、Xevo TQ MSおよびLCMS−8030トリプル四重極質量分析計(両方ともSRMチャンネルあたり5msのドウェルタイム、ならびにそれぞれ5および3msのチャンネル間遅延タイムが可能である)により実施し、9−plexアッセイ(27個のSRMチャンネルをモニターした)について、それぞれ負荷サイクル0.285および0.216秒となった。基質に対応するSRMチャンネルは、研究目的のためだけにモニターした。これらは、酵素活性を算出するためには必要ないので、必要に応じて、負荷サイクルを減じるために、省略することができる。Xevo TQ MS、Quattro MicroおよびLCMS−8030トリプル四重極質量分析計に関する最適イオン源および質量解析パラメーターを表4に記載する。

0113

基質、生成物および内部標準の単一同位体分子量に相当する前駆体および生成物のイオンの質量対電荷比(m/z)+プロトンまたはナトリウム陽イオン(ID2S−SおよびGAL6S−Sのみ)を表3に記載している。生成物および内部標準の化学種のみがリソソーム酵素の活性を測定するために定量されるので、プロトン化とナトリウム化(sodiated)イオンの両方がID2S−SおよびGAL6S−Sに対して観測されるという事実は重要ではない。質量分析計における基質モニタリングは、クロマトグラフィーの性能解析中にしか行われない。生成物および内部標準のイオン種だけをモニターしている、決まった手順のアッセイの間、基質のチャンネルは電源オフにすることができる。

0114

酵素活性計算。酵素反応の間に形成される生成物の量は、生成物対内部標準のピークの面積比(P/IS)を用いて定量された。続いて、マイクロモルh-1L-1の単位中の酵素活性(Ae)は、3mm(1/8”)DBSのパンチが血液3.1μLを含有していると仮定して、生成物量から算出した。その算出は、以下の式に基づいた:
Ae=((P/IS)×[IS]×VIS)/(3.1×ti)
(式中、[IS]は、アッセイ混合物中の、マイクロモル濃度単位での内部標準濃度であり、tiはアッセイインキュベーションの時間(時)である)。

0115

試薬の合成。GALC−S、GALC−IS、GAA−S、GAA−IS、GLA−S、GLA−IS、ABG−S、ABG−IS、ASM−S、ASM−IS、IDUA−S、およびIDUA−ISは、主文に記載している疾病管理予防センターから得た。ID2S−SおよびID2S−ISは、Wolfe,B.J.ら、Tandem mass spectrometry for the direct assay of lysosomal enzymes in dried blood spots:application to screening newborns for mucopolysaccharidosis II(Hunter Syndrome).Anal.Chem.83、1152〜1156(2011)に記載されている通りに調製した。GAL6S−S、GAL6S−IS、GAL4S−S、およびGAL4S−ISは、GAL6S−Sの場合にBOC基をd9−BOC基により置きかえたことを除いて、Duffey,T.A.、Khaliq,T.、Scott,C.R.、Turecek,F.およびGelb,M.H. Design and synthesis of substrates for newborn screening of Maroteaux−Lamy and Morquio A syndromes.Bioorg.Med.Chem.Lett.20、5994〜5996(2010)に記載されている通り調製した。これは、適切なd9−BOC−NH−(CH2)5−NH2の使用により作製した。後者は、1,5−ジアミノペンタン(Sigma−Aldrich社)をd9−BOC−ON(Sigma−Aldrich社のISOTEC部門)で処理することにより作製した。

0116

システム適合性試験(SST)。システム適合性試験は、並列カラム再生の能力を有するUHPLC−Xevo TQ MS機器上で行った。表5は、酵素アッセイと類似の濃度レベルでS、PおよびISを含有している標準溶液を10回連続で注入した場合の変動係数CV%)を示している。このデータは、分析用カラム1、2および並列カラム再生モードに関して列挙している。保持時間と積分ピーク面積の両方が、それぞれ通常CV%<1%および<15%と優れた再現性があることを示している。

0117

例2
6重アッセイ試薬
この例では、本発明の代表的な6重アッセイ試薬の調製を記載する。

0118

材料。α−グルコシダーゼ(GAA)、α−ガラクトシダーゼ(GLA)、α−L−イズロニダーゼ(IDUA)、β−グルコセレブロシダーゼ(ABG)、β−ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)、およびスフィンゴミエリナーゼ(ASM)の酵素アッセイ用の基質(S)および内部標準(IS)は、Dr.H.Zhou(疾病管理予防センター、Atlanta、GA)から受け取った。

0119

品質管理(QC)用DBS試料(ロット番号3−2010)はCDCから得て、zip−lockプラスチック製袋中、−20℃で保管した。QC用DBSは、予備処理血液から調製し、酵素活性に差異を持たせ、基準、低値、中値、高値、および成人のDBSとして示す。DBSは出産センターから受け取り、出荷の間(<10日間)、周囲温度で維持した。DBS試料はすべて、3mm(1/8”)径の穿孔器により手動でパンチした。実験はすべて、施設内審査委員会(IRB)ガイドラインに則って行った。

0120

6重(GAA、GLA、IDUA、ABG、GALC、ASM)アッセイ試薬。アセトニトリル≧99.9%(カタログ番号34967)、メタノール≧99.9%(カタログ番号34860)、ギ酸アンモニウム≧99.9%(カタログ番号14266)、ギ酸約98%p.a.(カタログ番号06440)、水酸化アンモニウム溶液28%(カタログ番号338818)、タウロコール酸ナトリウム水和物≧97%(カタログ番号86339)、アカルボース≧95%(カタログ番号A8980)は、SigmaAldrich社(St.Louis、MO)から注文した。

0121

ギ酸アンモニウムアッセイ緩衝液(0.1M、pH4.4)は、以下の通り調製した:(1)ギ酸アンモニウム1.24gを脱イオン水(Milli−Q社、18.2MΩ)(約200mL)に溶解し、(2)ギ酸(200μL)を加え、(3)pHを、水酸化アンモニウムまたはギ酸で4.4に調節した。最後に、(4)体積を脱イオン水により250mLに調節した。ろ過をした無菌緩衝液は2〜8℃で最大6か月間保管することができる。

0122

タウロコール酸ナトリウム(100g/L)の原液をメタノール中で調製し、−20℃で1か月間保管した。GAAアッセイにアカルボースを使用し、非リソソーム酵素である、グリコゲン加水分解を触媒するマルターゼグルコアミラーゼを選択的に阻害させた。水中のアカルボース0.8mM原液を調製し、−20℃で1か月間保管した。

0123

6重アッセイカクテル。CDCからの基質/内部標準バイアルをメタノールに溶解した;GLA(10mL);GAAおよびIDUA(6mL);ABG、GALCおよびASM(4mL)。各バイアルのアリコート(1mL)を新しいバイアル中で混合し、次に、タウロコール酸ナトリウム原液(1mL;100g/L)およびアカルボース(0.1mL;800μM)の原液を加えた。中程度の温度設定(43℃)で、溶媒を真空濃縮器(Savant SpeedVac;Thermo Scientific社、San Jose、CA、カタログ番号SC210A−115)で蒸発させた。バイアル中の残さをギ酸アンモニウムアッセイ緩衝液(10mL;0.1M、pH4.4)中で再構成し、内容物が完全に溶解するまで、短時間、ボルテックスし、水道水を使用して温めた(<40℃)。得られたものは、200μMのGAA−S、2.0μMのGAA−IS、600μMのGLA−S、1.2μMのGLA−IS、500μMのIDUA−S、3.5μMのIDUA−IS、150μMのASM−S、2.7μMのASM−IS、450μMのGALC−S、2.8μMのGALC−IS、300μMのABG−S、5.9μMのABG−IS;8.0μMのアカルボース、および10g/Lのタウロコール酸ナトリウムを含有した。余分の6重アッセイカクテルは、−20℃で最大1か月、活性を失うことなく保管した。混合して乾燥した試薬を2〜8℃で最大6か月間保管し、上記の通り、必要に応じて再構成した。

0124

例3
3重アッセイ試薬
この例では、本発明の3重アッセイ試薬の調製を記載する。

0125

材料。イズロン酸2−スルファターゼ(ID2S)、N−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL6S)、およびN−アセチルガラクトサミン6−スルファターゼ(GAL4S)に特異的な試薬は、Duffey,T.A.、Khaliq,T.、Scott,C.R.、Turecek,F.、Gelb,M.H.(2010)「Design and synthesis of substrates for newborn screening of Maroteaux−Lamy and Morquio A syndromes」Bioorg.Med.Chem.Lett.、20(20):5994−5996;およびBlanchard,S.、Turecek,F.、Gelb,M.H.(2009)「Short synthetic sequence for 2−sulfation of alpha−L−iduronate glycosides」Carbohydrate Research、344:1032〜1033に記載されている通り合成した。

0126

品質管理(QC)用DBS試料(ロット番号3−2010)はCDCから得て、zip−lockプラスチック製袋中、−20℃で保管した。QC用DBSは、予備処理血液から調製し、酵素活性に差異を持たせ、基準、低値、中値、高値、および成人のDBSとして示す。DBSは出産センターから受け取り、出荷の間(<10日間)、周囲温度で維持した。DBS試料はすべて、3mm(1/8”)径の穿孔器により手動でパンチした。実験はすべて、施設内審査委員会(IRB)ガイドラインに則って行った。

0127

3重(ID2S、GAL6S、GAL4S)アッセイ試薬。酢酸バリウム≧99%p.a.(カタログ番号32305)、酢酸セリウム(III)水和物99.99%(カタログ番号529559)は、SigmaAldrich社(St.Louis、MO)から得た。2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトン(カタログ番号sc−220684)は、Santa Cruz Biotechnology社(Santa Cruz、CA)から得た。ギ酸アンモニウムアッセイ緩衝液(0.1M、pH4.4)は、上記の通り調製して保管した。アッセイ緩衝液中、酢酸バリウム;300mMおよび酢酸セリウム(III)水和物;200mMを調製し、−20℃で3か月間保管した。水中、2−アセトアミド−2−デオキシ−D−グルコノ−1,5−ラクトン(2A2D−GlcLactone);15mMを調製し、−20℃で1か月間保管した。

0128

3重アッセイカクテル。ID2S、GAL6SおよびGAL4Sの基質/内部標準物質を6個の個々のバイアル(4mL、Fisher Scientific社、カタログ番号22−022−944)に正確に秤取した:ID2S−S、27.84mg、ID2S−IS、1.21mg;GAL6S−S、26.20mg、GAL6S−IS、1.16mg;GAL4S−S、28.04mg、GAL4S−IS、1.21mg。メタノール≧99.9%(カタログ番号34860)4mLの容量を基質および内部標準の各秤量部分に加えて、基質10mMおよび内部標準500μMの原液にした。ID2S−SおよびGAL4S−Sのアリコート(1mL);2mLのGAL6S−S、ならびに0.1mLのID2S−IS、GAL6S−ISおよびGAL4S−IS原液バイアルを新しいバイアルに入れて混合し、中程度の温度(43℃)設定で、溶媒を真空濃縮器(Savant SpeedVac;Thermo Scientific社、San Jose、CA、カタログ番号SC210A−115)で蒸発させた。バイアル中の残さを、酢酸バリウム(1mL;300mM)、酢酸セリウム(III)(1mL;200mM)、2A2D−GlcLactone(0.1mL;15mM)およびギ酸アンモニウムのアッセイ緩衝液(7.9mL;0.1M、pH4.4)中で再構成し、短時間ボルテックスした。得られたものは、1mMのID2S−S、5μMのID2S−IS;2mMのGAL6S−S、5μMのGAL6S−IS;1mMのGAL4S−S、5μMのGAL4S−IS;150μMの2A2D−GlcLactone、30mMの酢酸バリウムおよび20mMの酢酸セリウム(III)を含有した。余分の3重アッセイカクテルは、−20℃で最大1か月間保管した。混合して乾燥した試薬を2〜8℃で最大6か月間保管し、上記の通り、必要に応じて再構成した。

0129

例4
代表的な多重酵素アッセイ
この例では、代表的な多重酵素アッセイを記載する。

0130

アッセイインキュベーション。アッセイカクテルのアリコート(30μL)を96−ウェルプレート(0.5mL、Axygen Scientific、VWR International社、カタログ番号47743−982)にピペットで移し、密封フィルム(AxySeal、VWR International社、カタログ番号10011−117)で密封して、オービタル震とうしながら、37℃で一晩(16時間)インキュベートした。

0131

試料ワークアッププロトコル。DBSを16時間インキュベートした後に使用したプロトコルは、(1)手動のマルチチャンネルピペットにより加えたアセトニトリル(200μL)による、クエンチ/タンパク質沈殿からなった。このプレートは密封フィルム(AxySeal、VWR International社、カタログ番号10011−117)で覆い、(2)3000rpmで5分間、遠心分離して沈殿物を沈ませた。アセトニトリルへの長期暴露は接着剤を溶解させることになるので、密封フィルムを取り除いた直後に、(3)ペレットの妨害を回避するため、新しい96−ウェルプレート(0.5mL、Axygen Scientific、VWR International社、カタログ番号47743−982)に上澄み液100μLを移注して、(4)脱イオン水(Milli−Q、18.2MΩ)100μLを加えた。処理済み試料のプレートをアルミニウム箔で密封し、LC−MS/MS分析に直接かけた。

0132

HPLC分離法。処理済み試料を、並列カラム再生が可能なHPLCシステム上で分析した。並列フローチャンネルは、1525Micro Binary HPLC Pumps(Waters社、Milford、MA)およびMXP7900 2−ポジション6−ポート弁(Western Analytical Products社、Wildomar、CA)により維持した。50mmおよび100mmのHPLC分析用カラム(Hypersil GOLD C18;2.1mm、3μm;それぞれカタログ番号25003−052130および25003−102130)、ドロップインカートリッジ(Hypersil GOLD C18;10mm;2.1mm、3μm;カタログ番号25003−012101)、およびカートリッジホルダー(Uniguard;カタログ番号852−00)は、Thermo Scientific社(San Jose、CA)製であった。プレカラムマイクロフィルターアセンブリ(カタログ番号M550)、フリットマイクロフィルター(038インチ×0.31インチ、0.5um、カタログ番号C−425x)およびナローボアPEEKチュービング(0.005インチ×1/16”)は、Idex Health&Science社(Oak Harbor、WA)から注文した。2777Cサンプルマネージャー(Waters社、Milford、MA)を使用し、試料の10μLのアリコートを注入した。溶媒A(95%水、5%アセトニトリル、0.1%ギ酸、v/v/v)および溶媒B(50%アセトニトリル、50%メタノール;0.1%ギ酸、v/v/v)からの高圧混合により、勾配溶出用移動相を作製した。6重アッセイの分離は、以下の直線勾配溶出プログラムに従い0.6mL/分の流量で50mm分析用カラム上で行った:開始B40%;0.59分でB100%;2.99分でB100%;3.00分でB40%;6.00分でB40%。

0133

ESI−MS/MS選択反応モニタリング。質量分析は、Waters Quattro Microタンデム四重極質量分析計(Waters社、Milford、MA)上、ポジティブイオンモードで行った。データは、Mass Lynxソフトウェアバージョン4.1を使用して取得し、評価した。各基質、生成物および内部標準に関して、以下の特定のイオントランジションを選択し、18個の選択反応モニタリング(SRM)イオンチャンネル、具体的には、GAA−S、GAA−P、およびGAA−ISについてそれぞれ、m/z660.35→m/z560.30、m/z498.30→m/z398.24、およびm/z503.33→m/z403.28;GLA−S、GLA−P、およびGLA−ISについてそれぞれ、m/z646.33→m/z546.28、m/z484.28→m/z384.23、およびm/z489.31→m/z389.26;IdA−S、IdA−P、およびIdA−ISについてそれぞれ、m/z567.26→m/z467.20、m/z391.19→m/z291.13、およびm/z377.17→m/z277.12;ABG−S、ABG−P、およびABG−ISについてそれぞれ、m/z644.50→m/z264.20、m/z482.40→m/z264.20、およびm/z510.50→m/z264.20;ASM−S、ASM−P、およびAMS−ISについてそれぞれ、m/z563.40→m/z184.00、m/z398.25→m/z264.2、およびm/z370.30→m/z264.2;GALC−S、GALC−P、およびGALC−ISについてそれぞれ、m/z588.50→m/z264.20、m/z426.30→m/z264.2、およびm/z454.40→m/z264.2の同時記録となった。機器設定は、表1および2に記載した通りとした。分析物およびトランジションは表6に記載されている。

0134

トランジションはすべて、ドウェルタイム0.05秒、チャンネル間タイム0.01秒、およびスキャン間遅延0.10秒によりモニターし、1.17秒のサイクル時間となった。

0135

酵素活性計算。酵素反応の間に形成される生成物の量は、生成物対内部標準のピーク面積比を用いて定量される。続いて、μmol.h-1L-1の単位中の酵素活性は、3mm(1/8”)DBSのパンチが血液3.1μLを含有していると仮定して、生成物量から算出した。

0136

例示的な態様が例示され、かつ記載されるが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更がここではなされ得ることが理解されよう。独占的所有権または権利を主張する本発明の態様は、以下の通り定義される。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

関連する公募課題一覧

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ