図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2014年10月6日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (6)

課題・解決手段

シスチングルタミン酸アンチポーターを介して細胞中に導入することが可能な標識基質を含むイメージング剤が記載される。かかる基質は、シスチン/グルタミン酸アンチポーターを介して標識イメージング剤を細胞中に導入し、続いて検出することにより、細胞中の酸化ストレスイメージング又は検出するために使用できる。

概要

背景

分子イメージング概念は、病理学的状態分子シグナチュアの特異的コントラスト増強約束すると共に、特定の病理学適応症において特異的に調節される標的化可能なバイオマーカーを要求する。かかる特異的分子コントラスト剤は疾患のイメージング及び診断のため大いに有用であり得るものの、真に特異的なバイオマーカーの確認は非常に困難であることが判明している。かかる特異的バイオマーカーに対するコントラスト剤が創製されても、かかるコントラスト剤の市場はこの適応症の罹患率によって限定される。したがって、各種の病理学的適応症をイメージ化するために利用できる分子コントラスト剤を開発することに大きな関心が集まっている。大抵のイメージング剤は特定の組織又は細胞タイプ或いは特定の療法を標的化し、さもなければ時間と共に急速に分解する。広範な用途に向けられるイメージング剤の一例は、グルコース輸送体を利用する18F−フルオロデオキシグルコースFDG)である。18F−FDGは、グルコース要求量の増加した細胞によって優先的に取り込まれ、次いで細胞内に捕捉される。FDGは、多くの癌の診断、ステージング及びモニタリング並びに心臓及び脳における代謝のモニタリングのため臨床的に使用できる。18F−FDGは、腎細管中に見出されるナトリウム依存性グルコース輸送体の基質ではなく、このことがその再吸収を防止してクリアランスを促進する。

インビボ酸化ストレスは、細胞ストレス指標として認められている。このストレスをイメージ化しようという努力には、電子常磁性共鳴EPR)を用いて動物のイメージングを行うことが含まれていた。EPRは、酸化ストレスにおいてフリーラジカルの生成と共に生じる不対電子を検出するための技法である。本質的に、酸化ストレスの尺度としての臓器抗酸化活性に対して感受性を有するEPRプローブと見なされる薬剤が使用される。

他の研究者達はまた、13−C−グリシン化学シフトMRIを用いて、インビボでの腫瘍化学療法治療動物モデルにおいてグリシンの取込み及びグルタチオンへの転化を検出することに目を向けた。さらに他の研究者達は、化学療法治療をモニターするためにインビボでアポトーシス細胞を検出するためのイメージング剤を開発した。かかるイメージング剤には、例えば、やや大きいタンパク質である標識アネキシンV、及びアポトーシス細胞中にのみ特異的に侵入することが報告されている1群の小分子であるNeurosurvival Technologies社製のAposenseがある。

また、細胞酸化ストレスの条件下で活性化される細胞アミノ酸輸送体シスチングルタミン酸アンチポーター、Xc-)を利用するイメージング剤も報告されている。これは、2009年4月27日に提出された、「標識分子イメージング剤、製造方法及び使用方法」と称する米国特許出願第12/430573号(その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす)に記載されている。

この輸送機構を利用する他の基質を用いてシスチン/グルタミン酸アンチポーター輸送機構を活用することも有利であり得る。それ故、取込みに関してシスチンと競合する小分子はイメージング剤用の良好な候補となり得る。さらに、競合機構はその代謝に関係した細胞又はその組織の状態に関する情報を提供し得る。したがって、シスチンと競合する標識分子の使用は、有効な治療療法を設計するために使用される腫瘍タイプを同定するための貴重なツールを提供し得る。

概要

シスチン/グルタミン酸アンチポーターを介して細胞中に導入することが可能な標識基質を含むイメージング剤が記載される。かかる基質は、シスチン/グルタミン酸アンチポーターを介して標識イメージング剤を細胞中に導入し、続いて検出することにより、細胞中の酸化ストレスをイメージング又は検出するために使用できる。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

次の式Iの18F又は3H標識誘導体を含んでなるイメージング剤。式中、Xは各々独立にH、−(CH2)mH又は−O−(CH2)mHであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数である。

請求項2

標識誘導体が次の式IIの化合物を含む、請求項1記載のイメージング剤。式中、R2は各々独立にH、18F、3H、−(CH2)mR3又は−O−(CH2)mR3であり、R3は18F又は3Hであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数である。

請求項3

R2が18F又は3Hであり、nが5に等しい、請求項2記載のイメージング剤。

請求項4

R2が単独で存在する18Fである、請求項3記載のイメージング剤。

請求項5

18F又は3Hが単独で存在している、請求項2記載のイメージング剤。

請求項6

シスチングルタミン酸輸送体を有する標的のイメージング方法であって、次の式Iの18F又は3H標識誘導体を含むイメージング剤を標的中に導入する段階、及び標的中の標識誘導体を検出する段階を含んでなる方法。式中、Xは各々独立にH、−(CH2)mH又は−O−(CH2)mHであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数でである。

請求項7

標識誘導体が次の式IIの化合物を含む、請求項6記載の方法。式中、R2は各々独立にH、18F、3H、−(CH2)mR3又は−O−(CH2)mR3であり、R3は18F又は3Hであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数である。

請求項8

細胞中酸化ストレスを検出する方法であって、次の式Iの18F又は3H標識誘導体を含むイメージング剤を導入する段階、及び細胞中の標識誘導体を検出する段階を含んでなる方法。式中、Xは各々独立にH、−(CH2)mH又は−O−(CH2)mHであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数である。

請求項9

標識誘導体が次の式IIの化合物を含む、請求項8記載の方法。式中、R2は各々独立にH、18F、3H、−(CH2)mR3又は−O−(CH2)mR3であり、R3は18F又は3Hであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数でである。

請求項10

R2が18F又は3Hであり、nが5に等しい、請求項9記載の方法。

技術分野

0001

本発明は一般的には標識分子イメージング剤に関し、さらに詳しくはシスチングルタミン酸輸送体を介して細胞に取り込まれるイメージング剤に関する。

背景技術

0002

分子イメージング概念は、病理学的状態分子シグナチュアの特異的コントラスト増強約束すると共に、特定の病理学適応症において特異的に調節される標的化可能なバイオマーカーを要求する。かかる特異的分子コントラスト剤は疾患のイメージング及び診断のため大いに有用であり得るものの、真に特異的なバイオマーカーの確認は非常に困難であることが判明している。かかる特異的バイオマーカーに対するコントラスト剤が創製されても、かかるコントラスト剤の市場はこの適応症の罹患率によって限定される。したがって、各種の病理学的適応症をイメージ化するために利用できる分子コントラスト剤を開発することに大きな関心が集まっている。大抵のイメージング剤は特定の組織又は細胞タイプ或いは特定の療法を標的化し、さもなければ時間と共に急速に分解する。広範な用途に向けられるイメージング剤の一例は、グルコース輸送体を利用する18F−フルオロデオキシグルコースFDG)である。18F−FDGは、グルコース要求量の増加した細胞によって優先的に取り込まれ、次いで細胞内に捕捉される。FDGは、多くの癌の診断、ステージング及びモニタリング並びに心臓及び脳における代謝のモニタリングのため臨床的に使用できる。18F−FDGは、腎細管中に見出されるナトリウム依存性グルコース輸送体の基質ではなく、このことがその再吸収を防止してクリアランスを促進する。

0003

インビボ酸化ストレスは、細胞ストレス指標として認められている。このストレスをイメージ化しようという努力には、電子常磁性共鳴EPR)を用いて動物のイメージングを行うことが含まれていた。EPRは、酸化ストレスにおいてフリーラジカルの生成と共に生じる不対電子を検出するための技法である。本質的に、酸化ストレスの尺度としての臓器抗酸化活性に対して感受性を有するEPRプローブと見なされる薬剤が使用される。

0004

他の研究者達はまた、13−C−グリシン化学シフトMRIを用いて、インビボでの腫瘍化学療法治療動物モデルにおいてグリシンの取込み及びグルタチオンへの転化を検出することに目を向けた。さらに他の研究者達は、化学療法治療をモニターするためにインビボでアポトーシス細胞を検出するためのイメージング剤を開発した。かかるイメージング剤には、例えば、やや大きいタンパク質である標識アネキシンV、及びアポトーシス細胞中にのみ特異的に侵入することが報告されている1群の小分子であるNeurosurvival Technologies社製のAposenseがある。

0005

また、細胞酸化ストレスの条件下で活性化される細胞アミノ酸輸送体(シスチン/グルタミン酸アンチポーター、Xc-)を利用するイメージング剤も報告されている。これは、2009年4月27日に提出された、「標識分子イメージング剤、製造方法及び使用方法」と称する米国特許出願第12/430573号(その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす)に記載されている。

0006

この輸送機構を利用する他の基質を用いてシスチン/グルタミン酸アンチポーター輸送機構を活用することも有利であり得る。それ故、取込みに関してシスチンと競合する小分子はイメージング剤用の良好な候補となり得る。さらに、競合機構はその代謝に関係した細胞又はその組織の状態に関する情報を提供し得る。したがって、シスチンと競合する標識分子の使用は、有効な治療療法を設計するために使用される腫瘍タイプを同定するための貴重なツールを提供し得る。

先行技術

0007

国際公開第2011/057986号

0008

本発明のイメージング剤及び方法は、細胞酸化ストレスの条件下で活性化される細胞アミノ酸輸送体(シスチン/グルタミン酸アンチポーター、xc-)を利用する。さらに、シスチン/グルタミン酸輸送体のアップレギュレーションは、ある種の腫瘍における化学療法耐性にも関連している。したがって、高いシスチン取込みを有する腫瘍の非侵襲的イメージングは特定の療法に対して耐性を有する可能性がある腫瘍を同定することができ、これは治療計画の有効な変更を可能にするであろう。

0009

本発明の一実施形態は、次の式Iの18F又は3H標識誘導体を含んでなるイメージング剤からなる。

0010

式中、Xは各々独立にH、−(CH2)mH又は−O−(CH2)mHであり、nは3〜7の整数であり、mは1〜3の整数である。

0011

本発明の別の実施形態は、式Iの18F又は3H標識誘導体を用いて細胞をイメージングする方法からなる。本方法の一例は、一般に、シスチン/グルタミン酸輸送体を介して式Iの18F又は3H標識誘導体を含むイメージング剤を標的中に導入する段階、及び陽電子放出断層撮影法(PET)、オートラジオグラフィーシンチレーション検出又はこれらの組合せの1以上を用いてイメージング剤を検出する段階を含んでなる。

0012

本発明のさらに別の実施形態は、シスチン/グルタミン酸輸送体を介して式Iの18F又は3H標識誘導体を含むイメージング剤を導入することにより、細胞中の酸化ストレスを検出する方法からなる。

図面の簡単な説明

0013

本発明の上記その他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読んだ場合に一層よく理解されよう。添付の図面中では、図面全体を通じて類似の部分は同一の符号で表されている。
図1は、DEM処理によって酸化ストレスに暴露された細胞において3H−L−Asu(3H−L−アミノスベリン酸)の取込みが増加することを示している。
図2は、試料当たりの適用用量パーセントで表した各標識化合物の取込み、及びシスチン/グルタミン酸輸送体阻害剤であるスルファサラジンSSZ)の存在下での取込みを示している。
図3は、シスチン/グルタミン酸輸送体を介しての取込みに対する競合を評価するための追加化合物選別を示している。
図4は、DEM処理EL4細胞における3H−L−GLU取込みに関するL−グルタミン酸(L−Glu)、L−Asu、L−アミノアジピン酸(L−AAA)及びD−Asuの用量依存阻害応答を示している。
図5は、エクスビボのEL4異種移植腫瘍組織における3H−L−Asu及び3H−2−デオキシ−2−フルオログルコース(3H−FDG)の取込みの比較を示している。

実施例

0014

特許請求される発明の主題を一層明確で簡潔に記載しかつ指摘するため、以下の説明及び添付の特許請求の範囲中で使用される特定の用語に関して以下に定義を示す。

0015

明細書中で使用される「シスチン/グルタミン酸輸送体」という用語は、シスチン/グルタミン酸アンチポーター、シスチン/グルタミン酸交換体、シスチン輸送体、xc-、xc(−)、Xc(−)、系xc(−)及びアミノ酸輸送系Xc(−)という用語と互換的に使用されかつこれらを包含する。この輸送系は2種のタンパク質の二量体を含み、特に限定されないが、タンパク質xCT(SLC7A11)及びタンパク質CD98(4F2hc、4F2表面抗原H鎖、SLC3A2)、xc(−)系に対して特異的なサブユニットであるタンパク質xCT、様々な基質に関する複数の輸送体に共通するサブユニットであるタンパク質CD98、並びに複数の輸送体に共通する別のサブユニットであるrBATと二量体化することもできるタンパク質xCTを包含する。また、L−ASU及びL−Asuという表記は、いずれもL−アミノスベリン酸に対応する。

0016

シスチン/グルタミン酸輸送体は、大抵の組織で通例は発現されないか又は極めて低い発現を示すが、酸化ストレスに暴露された細胞ではアップレギュレートされる。2つのジスルフィド結合システインアミノ酸からなるシスチンは、この輸送体に対する天然の基質である。輸送体のアップレギュレーション効果はシスチン取込みの増加であり、次いでこれは細胞内でシステインに還元される。細胞内システインは、グルタチオン合成のための律速基質である。グルタチオンは、酸化ストレスから細胞を守るための主たる酸化防止剤である。細胞内システインは、2つの経路の一方(即ち、グルタチオン合成又はタンパク質合成)に取り込まれる。

0017

一般に、本発明のイメージング剤は、シスチン/グルタミン酸アンチポーターの基質となるために必要な属性を維持するアミノ置換C6〜C10ジカルボン酸標識類似体を含んでいる。かかる類似体は、次の式Iの放射性同位体標識誘導体によって表される。

0018

式中、
Xは各々独立にH、−(CH2)mH又は−O−(CH2)mHであり、
nは3〜7の整数であり、
mは1〜3の整数である。

0019

若干の実施形態では、式Iはアミノスベリン酸からなる。

0020

イメージング剤は、イメージング剤の自己蛍光放出又は光学的性質のようなその放出信号によって検出できる。化合物検出方法には、必ずしも限定されないが、意図される用途及び医学又は研究職員にとってイメージング方法論に応じて核シンチグラフィー、陽電子放出断層撮影法(「PET」)、単光子放出コンピューター断層撮影法(「SPECT」)、磁気共鳴イメージング磁気共鳴分光法、コンピューター断層撮影法又はこれらの組合せが挙げられる。

0021

シスチン/グルタミン酸輸送体に対する本発明の標識基質はまた、治療目的のため、標識化合物(例えば、特に限定されないが、18F又は3Hで標識された式Iの薬剤)を標的中に導入するためにも使用できる。本明細書中で使用される標的は、生きている被験体の細胞又は組織(インビボ)或いは単離された細胞又は組織(エクスビボ)を意味し得る。

0022

若干の実施形態では、18F又は3Hラベルは、次の式IIで表されるように、炭素鎖アルキル基上に位置している。

0023

式中、
R2は各々独立にH、18F、3H、−(CH2)mR3又は−O−(CH2)mR3であり、
R3は18F又は3Hであり、
nは3〜7の整数であり、
mは1〜3の整数である。

0024

若干の実施形態では、式IIの化合物は、アルキル主鎖に沿って単一の放射性同位体ラベルが配置された単一標識化合物である。放射性同位体ラベルの位置が炭素鎖に沿った任意の位置にあり得ることは言うまでもない。若干の他の実施形態では、化合物はアルキル鎖に沿った複数の位置で標識されていてもよい。

0025

表1は、標識化合物の非限定的な代表例を示している。

0026

記載された化合物の多くは1以上の非対称中心を含むことがあり、したがって鏡像異性体ジアステレオマー及び他の立体異性形態を生じることがある。これらは絶対立化学の観点から(R)−又は(S)−として定義できる。本発明は、全てのかかる可能な異性体並びにこれらのラセミ体及び光学的に純粋な形態を包含するものとする。光学的に活性の(R)−及び(S)−異性体は、キラルシントン又はキラル試薬を用いて製造でき、或いは通常の技法を用いて分割できる。

0027

他のシスチンと異なり、標識化合物が細胞中に輸送された場合、これらはタンパク質合成又はグルタチオン合成経路中に組み込まれないことがある。同じ輸送体を介して化合物が細胞外に輸送されることもあり得るものの、L−グルタミン酸の細胞内濃度は極めて高く、したがって細胞エクスポートにとって有利な基質であり、結果として化合物の大部分は細胞内に捕捉される。

0028

検査した多種多様ヒト組織及び細胞のうち、xc-輸送体は主として脳において発現されるが、また膵臓及び培養細胞株においても発現される。xc-輸送体の発現は大抵の組織において非常に低いが、酸化ストレスの条件下及び培養中の細胞が増殖する場合にアップレギュレートされることがある。xc-輸送体は、アポトーシス刺激、酸化ストレス、炎症、シスチン欠乏及び化学療法耐性を含む複数の条件下で誘発される。例えば、18FはインビボPETイメージング並びに細胞酸化ストレスのインビトロ検出のために使用できる。

0029

同様に、シスチン/グルタミン酸輸送体のアップレギュレーションは、ある種の腫瘍における化学療法耐性にも関連している。したがって、高いシスチン取込みを有する腫瘍の非侵襲的イメージングは特定の療法に対して耐性を有する可能性がある腫瘍を同定することができ、これは治療計画の有効な変更を可能にするであろう。

0030

以下、イメージング剤及び使用方法の様々な実施形態を例示するために使用される非限定的な例を示す。

0031

実験手順
スキーム1:

0032

実験手順:

0033

(S)−1−tert−ブチル5−エチル2−(tert−ブトキシカルボニルアミノペンタンジオエート(2):
無水CH2Cl2(15mL)中の(S)−5−tert−ブトキシ−4−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)−5−オキソペンタン酸(1.0g、3.3mmol)の溶液トリエチルアミン(0.69mL、4.95mmol)を添加し、外部のメタノール冷浴で混合物を0℃に冷却した。同じ温度で、4−ジメチルアミノピリジン(0.04g、0.33mmol)、続いてクロギ酸エチル(0.38mL、3.96mmol)を順次に添加し、混合物を1時間撹拌した。反応の完了後、反応混合物をCH2Cl2(150mL)及び飽和NaHCO3水溶液(150mL)で希釈した。層を分離し、水性相を追加のCH2Cl2(100mL)で抽出した。合わせた有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、濾液減圧下で濃縮した。得られた残留物を40gシリカゲルカラム溶離剤ヘキサン〜ヘキサン中30%酢酸エチル)上で精製することで、(S)−1−tert−ブチル 5−エチル 2−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ペンタンジオエート(0.80g、73%収率)を濃厚油状物として得た。1H NMR(CDCl3)δppm:5.10(d,J=7.8Hz,1H),4.16(m,3H),2.39(m,2H),2.16(m,1H),1.94(m,1H),1.49(s,9H),1.46(s,9H),1.28(t,J=7.2Hz,3H)。MS(ESI+):354(M+Na)+。

0034

(S)−1−tert−ブチル5−エチル2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタンジオエート(3):
アセトニトリル(45mL)中の(S)−1−tert−ブチル 5−エチル 2−(tert−ブトキシカルボニルアミノ)ペンタンジオエート(1.5g、4.52mmol)及び4−ジメチルアミノピリジン(DMAP、0.11g、0.90mmol)の混合物に、過剰のジ−tert−ブチルジカーボネート(3.0g、13.75mmol)を室温で添加した。混合物を同じ温度で一晩撹拌した。次いで、(出発原料が完全には消費されなかったので)さらに1.0gのジ−tert−ブチルジカーボネートを添加し、さらに6時間撹拌することで生成物の生成に向けて反応を推進した。反応の完了後、減圧下で溶媒を除去し、粗生成物を40gシリカゲルカラム(溶離剤:ヘキサン〜ヘキサン中20%酢酸エチル)上で精製することで、(S)−1−tert−ブチル 5−エチル 2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタンジオエート(1.76g、90.2%収率)を無色の濃厚油状物として得た。1H NMR(CDCl3)δppm:4.81(dd,J=5.2,4.8Hz,1H),4.15(q,J=7.2Hz,2H),2.41(m,3H),2.16(m,1H),1.52(s,18H),1.47(s,9H),1.27(t,J=7.2Hz,3H)。13C NMR(CDCl3)δppm:172.8,169.3,152.3,82.9,81.3,60.4,58.1,31.02,28.0,27.9,24.6及び14.2。MS(ESI+):454(M+Na)+。

0035

(S)−tert−ブチル2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−オキソペンタノエート(4):
乾燥テトラヒドロフラン(30mL)中の(S)−1−tert−ブチル 5−エチル2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)ペンタンジオエート(1.7g、3.93mmol)の溶液をアセトンドライアイス浴で−78℃に冷却し、水素化ジイソブチルアルミニウム(ヘキサン中1.0M、5.9mL、5.90mmol)を5分間かけて滴下した。反応は4時間撹拌した後に完了し、次いで水(1.5mL)でクエンチし、外部の冷浴を取り除くことで室温まで放温した。得られた白色の濃厚溶液セライト粉末で濾過し、ジエチルエーテル(200mL)で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮し、40gシリカゲルカラム(溶離剤:ヘキサン〜ヘキサン中30%酢酸エチル)上で精製することで、(S)−tert−ブチル 2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−オキソペンタノエート(0.90g、59.1%収率)を濃厚油状物として得た。1H NMR(CDCl3)δppm:9.79(s,1H),4.77(dd,J=9.3,5.2Hz,1H),2.52(m,3H),2.16(m,1H),1.52(s,18H),1.47(s,9H)。13C NMR(CDCl3)δppm:201.2,169.2,152.4,83.1,81.5,58.11,40.7,28.0,27.9及び21.9。MS(ESI+):410(M+Na)+。

0036

(7S)−ジ−tert−ブチル7−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−ヒドロキシオクト−2−インジオエート(5):
乾燥THF(1.5mL)中のtert−ブチルプロピオレート(42.7mg、0.34mmol)の溶液に、リチウムジイソプロピルアミド(THF/エチルベンゼン中2.0M、0.15mL、0.29mmol)を窒素雰囲気下において−78℃でゆっくりと添加した。得られた反応混合物を同じ温度で1.0時間撹拌し続け(リチウムプロピオレート陰イオンを生成させるため)、次いで(S)−tert−ブチル 2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−オキソペンタノエート(0.075g、0.193mmol)の1.0mL THF溶液をゆっくりと添加した。混合物を同じ温度で(TLCによって完了するまで)90分間撹拌した。次いで、反応物飽和NH4Cl水溶液(0.5mL)でクエンチし、外部のアセトン/ドライアイス浴を取り除くことで室温まで温めた。反応溶液酢酸エチル(20mL)で希釈し、NH4Clの飽和水溶液(15mL)を撹拌しながら添加した。水性相を酢酸エチル(50mL)で抽出し、合わせた有機層を乾燥し、減圧下で濃縮した。得られた残留物を12gシリカゲルカラム(溶離剤:ヘキサン〜ヘキサン中40%酢酸エチル)上で精製することで、(7S)−ジ−tert−ブチル 7−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−ヒドロキシオクト−2−インジオエート(ジアステレオマー混合物、40mg、40.3%収率)を油状物として得た。1H NMR(CDCl3)δppm:4.76(dt,J=9.2,5.2Hz,1H),4.53(m,1H),2.27(m,1H),2.04(m,1H),1.83(m,2H),1.52(s,18H),1.50(s,9H),1.46(s,9H)。13C NMR(CDCl3)δppm:169.63,169.52,152.47,152.40,152.34,84.96,84.94,83.63,83.09,83.04,81.48,81.46,77.89,77.84,61.90,61.37,58.47,58.31,33.75,33.70,28.02,27.96,27.93,25.13及び24.72。MS(ESI+):536(M+Na)+。

0037

(2S)−ジ−tert−ブチル2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−ヒドロキシオクタンジオエート(6):
25mL丸底(RB)フラスコ窒素パージし、(7S)−ジ−tert−ブチル 7−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−4−ヒドロキシオクト−2−インジオエート(0.04g、0.08mmol)、酢酸エチル(5mL)及び炭素上5%パラジウム(約2.0mg乾燥重量)を仕込んだ。RBフラスコを排気し、バルーン中の水素ガスを(13psi又は約1.0気圧の圧力に)充填し、室温で一晩撹拌した。この時間後、水素を排出し、窒素をRBフラスコ内に充填した。触媒をこの時間後、水素を排出し、窒素をRBフラスコ内に充填した。触媒をCelite 545のパッドによる濾過で除去し、フィルターケーキをメタノール(10mL)及び水(2.0mL)で洗浄した。545のパッドによる濾過で除去し、フィルターケーキを酢酸エチル(10mL)で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮することで、(2S)−ジ−tert−ブチル 2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−ヒドロキシオクタンジオエート(ジアステレオマー混合物、0.04g、99.3%収率)を油状物として得た。1H NMR(CDCl3)δppm:4.73(m,1H),3.63(m,1H),2.37(m,2H),2.27−1.56(m,6H),1.51(s,18H),1.45(2s,18H)。13C NMR(CDCl3)δppm:173.60,173.58,170.01,169.75,152.58,152.48,82.86,82.82,81.28,81.25,80.42,80.40,71.19,70.65,58.92,58.68,34.37,34.15,32.30,32.22,32.15,32.05,28.07,28.02,27.94,25.69及び25.55。MS(ESI+):540(M+Na)+。

0038

(2S)−ジ−tert−ブチル2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(トシルオキシオクタンジオエート(7):
(2S)−ジ−tert−ブチル 2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−ヒドロキシオクタンジオエート(0.03g0.06mmol)の溶液に、シセイプロピルエチルアミン(0.12mL、0.69mmol)及び触媒量の4−ジメチルアミノピリジン(約1.0mg)を室温で添加した。得られた反応混合物をさらに5分間撹拌し、次いで固体4−メチルベンゼンスルホン酸無水物(0.19g、0.58mmol)を一度に添加し、一晩撹拌し続けた。出発原料が消費されなかったので、4−メチルベンゼンスルホン酸無水物の第2の部分(0.095g、0.29mmol)を添加し、次いで反応物を室温でさらに12時間撹拌し続けた。最後に、反応混合物を酢酸エチル(20mL)及び飽和NaHCO3水溶液(10mL)で希釈し、10分間撹拌した。有機層を分離し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。粗生成物を4gシリカゲルカラム(溶離剤:ヘキサン〜ヘキサン中40%酢酸エチル)上で精製することで、(2S)−ジ−tert−ブチル 2−(ビス(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)−5−(トシルオキシ)オクタンジオエート(ジアステレオマー混合物、12mg、29%収率)を粘稠な油状物として得た。1H NMR(CDCl3)δppm:7.81(2d,2H),7.35(m,2H),4.60(m,2H),2.46(s,3H),2.35−1.55(m,8H),1.51(m,18H),1.44(m,18H)。13C NMR(CDCl3)δppm:171.84,171.82,169.28,169.26,152.32,144.57,134.27,129.84,129.82,127.75,127.72,82.91,82.88,82.17,82.0,81.35,81.30,80.50,58.57,58.28,31.25,30.68,30.58,28.29,28.92,28.50,28.08,28.05,28.02,28.00,27.93,24.57,24.30及び21.65。MS(ESI+):694(M+Na)+。

0040

(S)−2−アミノ4,5−3H−スベリン酸の製造:
50mL丸底(RB)フラスコを窒素でパージし、(S)−2−アミノ 4,5−デヒドロスベリン酸塩酸塩(5.0mg)、メタノール(4mL)及び炭素上5%パラジウム(約1.0mg乾燥重量)を仕込んだ。RBフラスコを排気し、トリチウムガスを(13psi又は約1.0気圧の圧力に)充填し、室温で一晩撹拌した。この時間後、水素を排出し、窒素をRBフラスコ内に充填した。触媒をCelite 545のパッドによる濾過で除去し、フィルターケーキをメタノール(10mL)及び水(2.0mL)で洗浄した。濾液を減圧下で濃縮することで、(S)−2−アミノ 4,5−3H−スベリン酸塩酸塩を白色固体として得た。

0041

実施例1
マウスリンパ腫細胞(EL4)を100μMマレイン酸ジエチルの存在下又は不存在下で24時間培養し、リン酸緩衝食塩水PBS)で洗浄し、5×106細胞のアリコートに分割し、シスチン/グルタミン酸輸送体の阻害剤の存在下又は不存在下で[3H]−L−2−アミノスベリン酸(3H−L−Asu)と共に15分間インキュベートした。次いで、細胞を3回洗浄し、1ml容量の1M HCl中に集め、シンチレーションバイアルに移した。各試料に12mlのReady Gelシンチレーション液を添加し、Perkin Elmer Tri−Carb Liquid Scintillation Analyzerを用い他シンチレーション計数によって細胞取込みを測定した。図1は、DEM処理によって酸化ストレスに暴露された細胞において3H−L−Asu取込みが増加することを示している。さらに、シスチン/グルタミン酸輸送体阻害剤であるスルファサラジン(SSZ、500μM)、グルタミン酸(L−GLU、2.5mM)及び過剰の非標識L−ASU(2.5mM)によって95%を超える取込みが阻害された。このデータは、これらの細胞における3H−Asu取込みがシスチン/グルタミン酸輸送体を介して起こり、酸化ストレスに対して敏感であることを示唆している。

0042

実施例2
5×106個のDEM処理細胞を(500μMのSSZの存在下又は不存在下で)
0.33μCiの[3H]−L−ASU、[3H]−L−GLU又は[3H]−L−シスチンのいずれかと共に15分間インキュベートした後、PBS中で3回洗浄し、液体シンチレーション計数によって取込みを分析した。図2は、試料当たりの適用用量のパーセントで表した各標識化合物の取込み、及びシスチン/グルタミン酸輸送体阻害剤の存在下での取込みを示している。このデータはL−ASU取込みがL−GLU取込みより約4.5倍効率的であることを示しており、これは標識L−Asu誘導体がL−Glu誘導体より有望なイメージング剤を生じ得ることを示唆している。さらに、L−ASU及びL−GLUの取込みはいずれもSSZによってほぼ完全に阻害され、この取込みは主としてシスチン−グルタミン酸輸送体の効果であることを示唆している。L−ASUは僅かに高いSSZ阻害を示した。L−シスチンは適用用量のパーセントとしてL−GLUより僅かに高い取込みを与えたが、SSZは取込みの2/3しか阻害しなかった。これは、検出された取込みの約1/3が別の輸送系又は非特異的結合によるものであることを示唆している。

0043

実施例3
3H−GLU又は3H−ASUの取込みに競合する能力に関して非標識化合物を分析することは、輸送体基質及びイメージング剤開発のための可能な手がかりとなり得る化合物の選択を可能にする。輸送体に対する良好な基質である化合物は、高い濃度(2.5mM)で90%以上の取込み阻害をもたらすと期待される。図3は、シスチン/グルタミン酸輸送体を介しての取込みに対する競合を評価するための追加化合物の選別を示している。L−GLU、L−アミノアジピン酸(L−AAA)、L−アミノピメリン酸(L−APA)、L−ASU、D−ASU及び3−メチル−L−GLUは90%を超える3H−L−ASU取込みの阻害を示し、これらの化合物がシスチン/グルタミン酸輸送体の適切な競合阻害剤であることを示唆している。N−エチル−L−Asu、スベリン酸、ジアミノピメリン酸(DiAPA)及びγ−グルタミルグリシンは45%より低い阻害を示し、これらがシスチン/グルタミン酸輸送体の良好な競合阻害剤でないことを示唆している。

0044

実施例4
阻害の用量応答を分析することにより、我々は3H−L−グルタミン酸又は3H−L−アミノスベリン酸取込みの阻害に関して化合物をランク付けすることができる。図4は、DEM処理EL4細胞における3H−L−GLU取込みに関するL−GLU、L−ASU及びL−AAAの用量依存性阻害応答を示している。L−ASUはL−GLU(IC50=4.7μM)より僅かに低い濃度(IC50=2.9μM)で取込みを阻害し、それがシスチン/グルタミン酸輸送体のより良好な競合阻害剤であることを示唆している。しかし、L−AAA(やはりグルタミン酸より長い炭素鎖を有する既知のシスチン/グルタミン酸輸送体基質)はより高い濃度(IC50=23.9μM)を必要とし、D−Asu(IC50=36.2μM)も同様である。

0045

実施例5
我々は、エクスビボの腫瘍組織における3H−ASUの取込みを3H−FDG(普通の18F−FDGイメージング剤のトリチウム化形態)の取込みと比較した。2種の薬剤は、比放射能及び放射能量に関してマッチしていた。0.333μCiの薬剤をEL4異種移植腫瘍組織スライスの同等なアリコートと共に30分間インキュベートした(腫瘍を500μmステップでMcIlwain組織チョッパーに3回通して処理し、新鮮緩衝液で洗浄した)。スライスを3回洗浄し、1M HClで溶解し、シンチレーション計数によって評価した。図5は、3H−L−Asuがこれらの組織スライスにおいて3H−FDGより70%高い取込みを与えたことを示している。

0046

細胞中に取り込まれたこれらの薬剤は、特に限定されないが細胞酸化ストレスを含む病態又は状態のイメージングを含め、インビボで細胞酸化ストレスをイメージングするために使用できる。これらの薬剤から恩恵を受けるイメージング用途には、特に限定されないが、化学療法治療モニタリング、虚血症/卒中、炎症、外傷性脳損傷及び臓器移植モニタリングがある。

0047

3Hや18Fのような放射性同位体ラベルは、インビボPET並びに細胞酸化ストレスのインビトロ検出のため特に有用であり得る。本明細書中には本発明の若干の特徴のみを例示し説明したが、当業者には数多くの修正及び変更が想起されるであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は本発明の真の技術思想の範囲内に含まれる全てのかかる修正及び変更を包含することを理解すべきである。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ