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技術 インフルエンザ血球凝集素の受容体結合ポケットを認識する広域中和ヒト抗体

出願人 ザチルドレンズメディカルセンターコーポレーションデュークユニバーシティー
発明者 ホイットル,ジェイムズハリソン,スティーヴンシー.ヘインズ,バートンエフ.リヤオ,フア−シンムーディ,エム.アンソニーケプラー,トマスビー.シュミット,アーロンジー.
出願日 2012年8月3日 (6年11ヶ月経過) 出願番号 2014-524118
公開日 2014年9月25日 (4年9ヶ月経過) 公開番号 2014-524750
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 蛋白脂質酵素含有:その他の医薬 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 他の有機化合物及び無機化合物含有医薬 化合物または医薬の治療活性 ペプチド又は蛋白質
主要キーワード インフルエンス 確率質量関数 位置合わせプログラム 通常部位 電気密度 弾性ネット 貯蔵槽内 全接合
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (20)

課題・解決手段

本発明は、インフルエンザ血球凝集素と特異的に結合して、血球凝集素シアル酸と結合することを減少又は阻害する新規インフルエンザ抗体を特徴としている。本発明は、新規抗体及びそのインフルエンザ感染の予防又は治療における使用を特徴としている方法、組成物、及びキットも提供する。

概要

背景

インフルエンザウイルス季節性抗原ドリフトはよく知られており、既に感染した個人長期免疫防御がないことを説明している。ウイルス受容体に結合して融合及び低pHエンドソームからの浸透を促進する三量体表面タンパク質である、血球凝集素HA)はインフルエンザウイルス粒子上の主要な表面抗原である。HAは可変エピトープと同様に保存されたエピトープも提示するが、可変エピトープに対する中和抗体免疫付与及び感染への応答を支配する。

従って、インフルエンザの抗原ドリフトした株を効率的に治療又は予防できる広く中和する治療薬の開発が必要である。

概要

本発明は、インフルエンザ血球凝集素と特異的に結合して、血球凝集素がシアル酸と結合することを減少又は阻害する新規なインフルエンザ抗体を特徴としている。本発明は、新規抗体及びそのインフルエンザ感染の予防又は治療における使用を特徴としている方法、組成物、及びキットも提供する。B

目的

本発明は、インフルエンザ血球凝集素(HA)のエピトープと特異的に結合する単離された抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
2件

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請求項1

インフルエンザ血球凝集素HA)のエピトープに特異的に結合し、それによってインフルエンザ血球凝集素がシアル酸と結合することを減少又は阻害する、単離された抗インフルエンザ抗体又は抗体断片

請求項2

インフルエンザHA上のエピトープがシアル酸結合ドメインを含む、請求項1に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項3

HAが、H1 HA、H2 HA、H3 HA又はH5 HAである、請求項1又は2に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項4

エピトープが:i.CDRH1残基158;CDR H2残基158〜160;CDR H3残基135〜136、190〜195、及び226;CDR L1残基222、225、及び227;並びにCDR L3残基187及び189に対応している、A/Solomon Islnds/3/2006由来アミノ酸;ii.配列番号17〜44の何れか1つに示されているアミノ酸;又はiii.配列番号17〜44の何れか1つにあるCH65〜CH67結合残基:を含む、請求項3に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項5

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、可変重鎖(VH鎖)を含み、ここでVH鎖は配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項1〜4の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項6

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、可変軽鎖VL鎖)を含み、そしてここでVL鎖は配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16に記載されているアミノ酸配列を含む、請求項1〜5の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項7

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12の可変重鎖(VH鎖)アミノ酸配列内に存在している1つ又はそれ以上の重鎖CDR領域を含む、請求項1〜6の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項8

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16の可変軽鎖(VL鎖)アミノ酸配列内に存在している1つ又はそれ以上の軽鎖CDR領域を含む、請求項1〜7の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項9

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、i)配列番号10に示されているアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖(VH鎖)、及びii)配列番号14に示されている可変軽鎖(VL)を含む、請求項1〜8の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項10

1つ又はそれ以上の重鎖CDR領域が、配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12の可変重鎖(VH鎖)アミノ酸配列内に存在しているCDR3領域を含む、請求項7に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項11

1つ又はそれ以上の重鎖CDR領域が、配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16の可変軽鎖(VL鎖)アミノ酸配列内に存在しているCDR3領域を含む、請求項10に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項12

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が可変重鎖(VH鎖)を含み、VH鎖のCDR3領域がArg104、Ser105、Val106、Asp107、Tyr109、Tyr110、Tyr112、又はこれらの組み合わせを含む、請求項1〜4の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項13

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、モノクローナル抗体又はその抗体断片である、請求項1〜12の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項14

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片が、ヒト化抗体又は抗体断片である、請求項1〜13の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項15

抗体断片が、Fab断片Fab'断片、Fd断片、Fv断片、dAb断片、F(ab')2断片、一本鎖断片、二重特異性抗体、又は線状抗体である、請求項1〜14の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項16

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片に結合している薬剤を更に含んでいる、請求項1〜15の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項17

抗インフルエンザ抗体又は抗体断片に結合している薬剤が、治療薬又は検出可能な標識である、請求項16に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項18

治療薬が、小分子ナノ粒子ポリペプチド放射性同位元素、又は抑制性核酸である、請求項17に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項19

治療薬が抗ウイルス剤又は毒素である、請求項18に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項20

治療薬が、インフルエンザウイルス産生を減少するsiRNA、shRNA、又はアンチセンス核酸分子である、請求項18に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項21

検出可能な標識が、分光学光化学生物化学免疫化学物理学、又は化学手段で検出される、請求項17に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項22

検出可能な標識が、酵素蛍光分子粒子標識電子密度の高い物質放射性標識微小気泡ビオチンジゴキシゲニン、又は検出可能に作られたハプテン又はタンパク質である、請求項17又は21に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項23

インフルエンザが、H1N1、H2N2、H3N2、又はヒト適合H5株である、請求項1〜22の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片。

請求項24

請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を含んでいる、医薬組成物

請求項25

医薬組成物が、薬学的に許容される担体希釈剤、又は賦形剤を含む、請求項24に記載の医薬組成物。

請求項26

請求項1〜15の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片をコードする、単離されたポリヌクレオチド

請求項27

クレーム26に記載の単離されたポリヌクレオチドを含んでいる、発現ベクター

請求項28

クレーム27に記載の発現ベクターを含んでいる、宿主細胞

請求項29

方法が、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルス感染治療又は予防することを含む、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する方法。

請求項30

方法が、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルスを中和することを含む、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルスを中和する方法。

請求項31

方法が、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルス感染の確立を阻害することを含む、それを必要としている対象におけるインフルエンザ感染の確立を阻害する方法。

請求項32

方法が、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによって対象におけるインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害することを含む、対象におけるインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害する方法。

請求項33

方法が、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を対象に投与すること、それによってインフルエンスウイルスが対象の細胞への侵入を阻害することを含む、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害する方法。

請求項34

インフルエンザが、H1N1、H2N2、H3N2、又はヒト適合H5株である、請求項29〜33の何れか一項に記載の方法。

請求項35

対象が、インフルエンザに感染しているか又はインフルエンザに感染する危険性がある、請求項29〜34の何れか一項に記載の方法。

請求項36

対象が哺乳動物である、請求項35に記載の方法。

請求項37

対象がヒトである、請求項36に記載の方法。

請求項38

対象がウイルスに感染しやすい、請求項35又は36に記載の方法。

請求項39

対象が妊婦である、請求項38に記載の方法。

請求項40

対象が若年者又は乳幼児である、請求項38に記載の方法。

請求項41

対象が高齢者である、請求項38に記載の方法。

請求項42

i)抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)医薬組成物を、筋肉内注射静脈内注射皮下注射、又は吸入によって投与する、請求項29〜41の何れか一項に記載の方法。

請求項43

方法が、インフルエンザに感染しているか又はインフルエンザに感染する危険性がある細胞を、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物と接触させること、それによってインフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害することを含む、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害する方法。

請求項44

インフルエンザが、H1N1、H2N2、H3N2、又はヒト適合H5株である、請求項43に記載の方法。

請求項45

キットが、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するためのキット。

請求項46

キットが、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルスを中和するためのキット。

請求項47

キットが、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルス感染の確立を阻害するためのキット。

請求項48

キットが、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルス感染の伝播を阻害するためのキット。

請求項49

キットが、i)請求項1〜23の何れか一項に記載の抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、又はii)請求項24又は25に記載の医薬組成物の有効量を含む、インフルエンザウイルスの細胞への侵入を阻害するためのキット。

請求項50

キットが治療薬を更に含む、請求項45〜49の何れか一項に記載のキット。

請求項51

治療薬がインフルエンザ感染を阻害する、請求項50に記載のキット。

請求項52

請求項29〜52の何れか一項に記載の方法でのキットの使用説明書を更に含んでいる、請求項45〜51の何れか一項に記載のキット。

請求項53

インフルエンザが、H1N1、H2N2、H3N2、又はヒト適合H5株である、請求項45〜52の何れか一項に記載のキット。

技術分野

0001

(関連出願の相互参照
本出願は2011年8月3日に出願した、米国仮特許出願第61/514,662号の優先権を主張する。この内容はその全てが参照により本明細書に取り込まれている。

0002

連邦政府支援研究のもとでなされた発明に対する権利の主張)
本研究は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)の認可番号U19AI067854及びP01GM62580によって支援された。政府は本発明にある特定の権利を有している。

背景技術

0003

インフルエンザウイルス季節性抗原ドリフトはよく知られており、既に感染した個人長期免疫防御がないことを説明している。ウイルス受容体に結合して融合及び低pHエンドソームからの浸透を促進する三量体表面タンパク質である、血球凝集素HA)はインフルエンザウイルス粒子上の主要な表面抗原である。HAは可変エピトープと同様に保存されたエピトープも提示するが、可変エピトープに対する中和抗体免疫付与及び感染への応答を支配する。

0004

従って、インフルエンザの抗原ドリフトした株を効率的に治療又は予防できる広く中和する治療薬の開発が必要である。

0005

以下に記載するように、本発明はインフルエンザ抗原変異体を広く中和する新規な抗体の発見に基づいている。本発明は新規な抗体を含有している組成物及びキットを、更にインフルエンザウイルス感染を治療又は予防するためのこれら新規な治療薬の使用方法も特徴としている。

0006

態様では、本発明は、インフルエンザ血球凝集素(HA)のエピトープと特異的に結合する単離された抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を提供する。抗体又は抗体断片のインフルエンザエピトープとの結合はシアル酸へのインフルエンザHA結合を減少又は阻害する。

0007

実施態様では、インフルエンザHAのエピトープはシアル酸結合ドメインを含む。

0008

実施態様では、HAは、H1HA、H2HA、H3HA、又はH5HA(ヒト適合H5株由来のHA)である。

0009

関連する実施態様では、インフルエンザHAエピトープは、A/Solomon Island/3/2006に由来し、CDRH1残基158;CDR H2残基158〜160;CDR H3残基135〜136、190〜195、及び226;CDR L1残基222、225、及び227;並びにCDR L3残基187及び189に対応するアミノ酸残基を含む。

0010

関連する実施態様では、インフルエンザHAエピトープは、配列番号17〜44の何れかに記載されているアミノ酸を含む。

0011

関連する実施態様では、インフルエンザHAエピトープは、配列番号17〜44の何れかにあるCH65−CH67結合残基(例えば、図15識別されるCH65−CH67結合残基)を含む。

0012

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖(VH鎖)を含んでいて、VH鎖は配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12に記載されているアミノ酸配列を含む。

0013

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12の可変重鎖(VH鎖)アミノ酸は配列中に存在している1つ又はそれ以上の重鎖CDR配列を含む。関連する実施態様では、1つ又はそれ以上の重鎖CDR領域は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12の可変重鎖(VH鎖)アミノ酸配列中に存在しているCDR3領域を含む。

0014

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変軽鎖VL鎖)を含んでいて、VL鎖は配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16に記載されているアミノ酸配列を含む。

0015

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16の可変軽鎖(VL鎖)アミノ酸配列中に存在している1つ又はそれ以上の軽鎖CDR領域を含む。関連する実施態様では、1つ又はそれ以上の軽鎖CDR領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16の可変軽鎖(VL鎖)アミノ酸配列中に存在しているCDR3領域を含む。

0016

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、i)配列番号10に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖(VH鎖)、及びii)配列番号14に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変軽鎖(VL鎖)を含む。

0017

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖(VH鎖)を含んでいて、VH鎖のCDR3領域はArg104、Ser105、Val106、Asp107、Try109、Try110、Try112、又はこれらの組み合わせを含む。

0018

実施態様では、抗インフルエンザ抗体はモノクローナル抗体又はその抗体断片である。

0019

実施態様では、抗インフルエンザ抗体はヒト化抗体である。

0020

実施態様では、抗体断片は、Fab断片Fab'断片、Fd断片、Fd'断片、Fv断片、dAb断片、F(ab')2断片、単鎖断片、二重特異性抗体、又は直鎖抗体である。

0021

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、抗インフルエンザ抗体又はその抗体断片に接合している薬剤を更に含む。関連する実施態様では、抗体又はその抗体断片に接合している薬剤は治療薬又は検出可能な標識である。

0022

治療薬は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の治療薬であってよい。このような薬剤は当該技術分野で周知であって、小分子ナノ粒子ポリペプチド放射性同位元素抑制性核酸などを包含する。実施態様では、治療薬は抗ウイルス剤又は毒素である。実施態様では、治療薬はsiRNA、shRNA、又はインフルエンザウイルス産生を減少するアンチセンス核酸分子である。

0023

検出可能な標識は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の検出可能な標識であってよい。このような標識は当該技術分野で周知であって、分光学光化学生物化学免疫化学物理学、又は化学手段で検出される標識を包含する。実施態様では、検出可能な標識は、酵素蛍光分子粒子標識電子密度の高い試薬放射標識微小気泡ビオチンジゴキシゲニン、又はハプテン或いは検出できるように作製されたタンパク質である。

0024

態様では、本発明は、本明細書に記載されている少なくとも1つの抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物を提供する。実施態様では、医薬組成物は薬学的に許容される担体希釈剤、又は賦形剤を含む。

0025

態様では、本発明は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。関連する態様では、本発明は、そのような単離されたポリヌクレオチドを含んでいる発現ベクターを提供する。更なる関連する態様では、本発明は、このような発現ベクターを含んでいる宿主細胞を提供する。

0026

態様では、本発明は、それを必要としている対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は、感染に関連する症状を減少又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。

0027

態様では、方法は、それを必要としている対象のインフルエンザウイルスを中和する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルスを調和し、それによって感染に関連する症状を減少又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。

0028

態様では、本発明は、それを必要としている対象においてインフルエンザウイルス感染を確立する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象におけるインフルエンザウイルス感染の確率を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防する。

0029

態様では、本発明は、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルス感染の広がりを抑制する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は、対象におけるインフルエンザウイルス感染の広がりを抑制しそれによって感染に関連する症状を減少又は緩和する。

0030

態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法は、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法はインフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防するか、或いは感染に関連する症状を減少又は緩和する。

0031

態様では、本発明は、インフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法は、ウイルス感染発症しているか又はその危険性がある細胞を、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含んでいる医薬組成物と接触させることを含んでいる。方法は、インフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する。

0032

上記態様の何れかにおいて、対象はウイルス感染を発症しているか又はその危険性がある。関連する実施態様では、対象は哺乳動物(例えば、ヒト)である。関連する実施態様では、対象はウイルス感染に罹りやすい(例えば、妊婦若者又は乳児高齢者)。

0033

上記態様及び実施態様の何れかにおいて、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは医薬組成物は、筋肉内注射静脈内注射皮下注射、又は吸入によって投与される。

0034

態様では、本発明は、インフルエンザウイルス感染を治療又は予防するキット;インフルエンザウイルスを中和するキット;インフルエンザウイルス感染の確立を阻害するキット;インフルエンザウイルス感染の広がりを阻害するキット;及びインフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害するキットを提供する。

0035

実施態様では、キットは、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片を含む。

0036

実施態様では、キットは、治療薬も含む。関連する実施態様では、治療薬はインフルエンザ感染を阻害する。

0037

実施態様では、キットは、本明細書に記載されている何れかの方法にいてキットを用いるための説明書も含む。

0038

上記実施態様の何れかにおいて、インフルエンザは、H1N1、H2N2、H3N2、又はヒト適合H5インフルエンザ株(すなわち、ヒト受容体特異性を獲得したH5インフルエンザ;例示株として図14Dを参照されたい)であってよい。

0039

本発明の更なる目的及び利点は以下の詳細な説明にある程度述べられていて、部分的に記載から明瞭であるか、或いは発明の実施によって獲得できるだろう。本発明の目的及び利点は、添付されている特許請求の範囲で指摘されているものを含んでいる、本明細書に記載されている要素及びその組み合わせの手段によって理解並びに獲得できるだろう。前記の一般的な記載及び以下の詳細な説明は、例示及び説明のみであって、特許請求されている発明の限定ではないことを理解すべきである。本明細書に取り込まれて明細書の1部を構成している、添付した図面は本発明の幾つかの実施態様を説明して、記載と共に本発明の本質を説明する働きをしている。

0040

(定義)
本発明の理解を容易にするために、多くの用語及び語句を以下に定義する。

0041

本明細書で用いられる、単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈が明確に示していない限り、複数形を含む。従って、例えば、「an influenza antibody」への参照は、1つ又はそれ以上のインフルエンザ抗体への参照を包含する。

0042

具体的に述べていないか又は文脈から明瞭でないならば、「又は」は包括的であると理解される。

0043

本明細書用いられる用語「含む(comprise)」、「含んでいる(comprising)」、「含んでいる(containing)」、「有している(having)」などは、米国特許法がそれらに帰している意味を有することができて、「包含する(includes)、及び「包含している(including)」を意味することができる;「本質的に〜から成っている(consiting essentially of)」又は「本質的に〜から成る(consists essentially)」などは、米国特許法がそれらに帰している意味を有することができて、この用語は、列挙されている基本的或いは新規な特性が列挙されているものより多くのものの存在によって変更されない限り、列挙されているものより多くのものの存在を可能にするように、制限がないが、先行技術の実施態様を除外する。

0044

用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域にある少なくとも1つの抗原認識部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質又は前述のものの組み合わせのような、標的を認識して特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、完全なポリクローナル抗体、完全なモノクローナル抗体、抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片など)単鎖Fv(scFv)変異体、少なくとも2つの完全抗体から作製された二重特異性抗体のような多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原認識部位を含んでいる融合タンパク質、及び抗体が望ましい生物活性を示す限り、抗原認識部位を含んでいるその他の改変免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファデルタイプシロンガンマ、及びミューと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメイン同一性に基づいて、免疫グロブリンの5つの主なクラス:IgAIgDIgEIgG、及びIgM、又はそれらのサブクラスアイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)の何れかにある。異なったクラスの免疫グロブリンは異なった周知のサブユニット構造及び三次元配置を有している。抗体はそのままか或いはトキシン、放射性同位元素のような他の分子と結合していてもよい。

0045

基本的な4本鎖抗体ユニットは2本の同一軽(L)鎖及び2本の同一重(H)鎖からなるヘテロ四量体糖タンパク質である。IgM抗体は、J鎖と呼ばれる更なるポリペプチドと共に5つの基本四量体ユニットから成っているので、10個の抗原結合部位を含んでいるのに対して、分泌されたIgA抗体重合して、J鎖と共に2〜5つの基本4本鎖ユニットから成る多価集団を形成する。IgGの場合は、4本鎖ユニットは一般に約150,000ダルトンである。それぞれのL鎖共有ジスルフィド結合によってH鎖に結合しているのに対して、2本のH鎖はH鎖のアイソタイプに応じて1つ又はそれ以上のジスルフィド結合で互いに結合している。それぞれのH鎖及びL鎖も規則的に間隔を空けた鎖内のジスルフィド架橋を有している。それぞれのH鎖はN−末端に、可変ドメイン(VH)、それに続いて3つの定常ドメイン(CH)をそれぞれのアルファ及びガンマ鎖のために、そして4つのCHドメインをミュー及びイプシロンアイソタイプのために有している。それぞれのL鎖はN−末端に、可変ドメイン(VL)を、それに続いて定常ドメイン(CL)をその末端に有している。VLはVHと直線になり、CLは重鎖(CH1)の第1定常ドメインと直線になる。特定のアミノ酸残基は軽鎖と重鎖可変ドメインの間に接合部分を形成すると考えられている。VHとVLの対合は共に単一の抗原結合部位を形成する。異なったクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Basic and Clinical Immunology, 8th edition, Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, page 71, and Chapter 6 を参照されたい。

0046

「単離された抗体」は、その自然環境の成分から分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の混入成分は、抗体の診断上及び治療上の使用を妨げて、酵素、ホルモン、及びその他のタンパク性又は非タンパク性溶質を包含する。実施態様では、抗体は(1)ローリー法で測定して抗体の80%、85%、90%、95%或いははそれ以上まで;(2)スピンニングカップ配列決定基を用いてN−末端又は内部アミノ酸配列の少なくとも15残基得るのに十分な程度まで;又は(3)クムシブルー銀染色、等を用いる還元又は非還元条件下でのSDS−PAGEによって均質になるまで精製されている。抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在していないかもしれないので、単離された抗体は組み換え細胞内に抗体自体を含んでいる。実施態様では、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程で調製される。

0047

用語「抗体断片」は、完全抗体の部分を示して、完全抗体の抗原決定可変領域を示す。抗体断片の例は、これに限定されないが、Fab、Fab'、F(ab')2、及びFv断片、線形抗体、単鎖抗体、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を包含する。

0048

抗体のパパイン消化は、「Fab」断片と呼ばれる、2つの同じ抗原結合断片、及び命名が容易に結晶化可能なことを反映している、残余の「Fc」を生成する。Fab断片はH鎖(VH)の可変領域ドメインと共に全長L鎖、及び1本の重鎖(CH1)の第1定常領域から成っている。それぞれのFab断片は抗原結合に対して1価である。すなわち、これは1つの抗原結合部位を有している。抗体のペプシン処理は、2価の抗原結合活性を有していて未だ抗原を架橋できる2つのジスルフィド結合Fab断片とほぼ対応する1つの大きいF(ab')2断片を生じる。Fab'断片は、抗体ヒンジ領域由来の1つ又はそれ以上のシステインを含んでいるCH1のカルボキシ末端に僅かの追加残基を有している点でFab断片と異なっている。Fab'−SHは本明細書ではFab'の名称であって、定常ドメインのシステイン残基遊離チオール基を有している。F(ab')2抗体断片はもともと、2つの間にヒンジシステインを有している1つのFab'断片として生成された。抗体断片のその他の化学結合も知られている。

0049

「Fc」断片はジスルフィドで結合している2つのH鎖カルボキシ末端を含んでいる。抗体のエフェクター機能Fc領域の配列によって決定され、この領域は細胞のある特定の型で見出されるFc受容体(FcR)によって認識される部分でもある。

0050

「Fv抗体」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含んでいる最小の抗原断片を示す。この部位は、1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域非共有結合二量体を形成している2本鎖として、又は1つの重鎖可変領域と1つの軽鎖可変領域が、2本の鎖が同一の二量体構造に関わるように柔軟なペプチドリンカーによって共有結合している1本鎖(svFv又はsFv)としての部位である。この配置では、それぞれの可変ドメインの相補性決定領域(CDRs)は、Fv二量体の抗原結合特異性を限定するのに影響する。また、1本鎖可変ドメイン(又はFvの半分)は抗原を認識及び結合するために用いることができるが、一般に親和性が低い。

0051

用語「二重特異性抗体」は、2価断片、すなわち、2つの抗原結合部位を有する断片をもたらす、Vドメインの鎖内ではなく鎖間結合が得られるように、VH及びVLドメインの間の短いリンカー(約5〜10残基)を用いてsFv断片(前の項を参照されたい)を構築して製造される、小抗体を示す。二重特異性抗体は、2つの抗体のVH及びVLドメインが異なったポリペプチド鎖上に存在している、「交差」sFv断片のヘテロ二量体である。二重特異性抗体は、例えば、ヨーロッパ特許第EP404,097号;国際特許出願公開第WO93/11161号;及び Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) により完全に記載されている。

0052

「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基、又はエピトープの特異性の高い認識及び結合に関与する均質抗体群を示す。これは、通常、異なった抗原決定基に対する異なった抗体を含んでいるポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は完全及び全長モノクローナル抗体、並びに抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなど)、1本鎖(scFv)変異体、抗体タンパク質を含んでいる融合タンパク質、及び抗原認識部位を含んでいるその他の改変免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、これに限定されないが、ハイブリドーマファージ選択、組み換え発現、及び形質転換動物によって作製されたような抗体を示す。

0053

用語「ヒト化抗体」は、最小の非ヒト(例えば、ネズミ)配列を含んでいる特異的免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、又はこれらの断片である非ヒト(例えば、ネズミ)抗体の形態を示す。一般に、ヒト化抗体は相補性決定領域(CDR)由来の残基が望ましい特異性、親和性、及び機能を有している非ヒト種(例えば、マウスラットハムスターなど)のCDR由来の残基で置き換えられている(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536)。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域が、望ましい特異性、親和性、及び機能を有している非ヒト種由来抗体の対応する残基で置き換わっている。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性、及び/又は機能を改善及び最適化するために、Fvネットワーク領域内の及び/又は置き換えた非ヒト残基内の何れかの更なる残基の置換によって改変することができる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応している全ての又は実質的に全てのCDR領域を含んでいる、実質的に全ての、又は少なくとも1つの、そして通常は2つ又は3つの可変ドメインから成るのに対して、全ての又は実質的に全てのFR領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のようなものである。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Fc)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも1部分も含むことができる。ヒト化抗体を作製するために用いる方法の例は、米国特許第5,225,539語に記載されている。

0054

用語「ヒト抗体」はヒトによって生成された抗体、又は当該技術分野で公知の任意の技術を用いて人為的に生成された抗体に対応しているアミノ酸配列を有している抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、完全又は全長抗体、それらの断片、及び/又は、例えば、ネズミ軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドから成る抗体のような、少なくとも1つのヒト重鎖及び/又は軽鎖ポリペプチドからなる抗体を包含する。

0055

ハイブリッド抗体は、異なった抗原決定領域を有する抗体由来の重鎖と軽鎖の対が、2つの異なったエピトープ又は2つの異なった抗原が得られる四量体によって認識及び結合できるように一緒に構築されている免疫グロブリン分子である。

0056

用語「キメラ抗体」は、免疫グロブリン分子のアミノ酸配列が2つ又はそれ以上の種に由来している抗体を示す。一般的に、軽鎖及び重鎖両方の可変領域は望ましい特異性、親和性、及び機能を有している哺乳動物の1種(例えば、マウス、ラット、ウサギ等)由来抗体の可変領域に対応しているが、定常領域は、その種において免疫応答を誘発するのを避けるために、別の種(通常はヒト)に由来する抗体内の配列と一致している。

0057

抗体の可変領域は、抗体軽鎖の可変領域又は抗体重鎖の可変領域の単独又は組み合わせを示す。重鎖及び軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変基としても知られている、3つの相補性決定基(CDRs)で結ばれた4つのフレームワーク領域(FR)で構成されている。それぞれの鎖のCDRsはごく近接してFRによって結合して、別の鎖由来のCDRと共に、抗体の抗原結合部位の形成に役立っている。CDRを決定するために少なくとも2つの技術がある:(1)種間配列変化に基づく方法(Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (5thed., 1991, National Institute of Health, Bethesda Md を参照されたい);及び(2)抗原抗体複合体結晶学的研究に基づく方法(Al-lazikani et al., J. Mol. Biol. 273:957-948 (1977) を参照されたい)。更に、これら2つの方法の組み合わせがCDR決定の技術において時々用いられている。

0058

「投与すること」は、薬物又は薬物を含んでいる組成物を、薬物が対象の体内にあるようにする方法で、対象に与える手段であると本明細書で定義する。このような投与は、限定されないが、経口、経皮(例えば、直腸口腔粘膜)、注射(例えば、皮下、静脈内、非経口腹腔内、髄腔内)、又は吸入(例えば、経口又は経鼻)を含む何れかの経路で行うことができる。医薬製剤は、もちろん、それぞれの投与経路に適している形態で与えられる。

0059

「薬剤」とは、任意の小分子、化学化合物、抗体、核酸分子、又はポリペプチド、或いはこれらの組み合わせを意味する。

0060

類縁体」とは、同一ではないが、類似の機能又は構造特性を有している分子を意味する。例えば、インフルエンザ抗体のアミドエステルカルバミン酸炭酸ウレイド、又はリン酸類縁体は、1)インフルエンザ抗体の生物活性を損なわずに、インビボにおけるインフルエンザの有利な特性、例えば、吸収、作用の持続、又は作用の発現などを与えるか;又は2)自体は生物不活性であるがインビボで生物活性化合物に変換するか何れかの分子である。類縁体はインフルエンザ抗体のプロドラッグ形態を包含する。このようなプロドラッグは生体系に投与すると、自然化学反応(複数を含む)、酵素触媒化学反応(複数を含む)、及び/又は代謝化学反応(複数を含む)の結果としてインフルエンザ抗体を生成する。

0061

「対照」とは、標準又は標準状態を意味する。

0062

用語「誘導体」は、所定の薬物(例えば、インフルエンザ抗体)と同等の又はほぼ同等の生理学的機能性を有する医薬活性化合物を意味する。本明細書で用いられる用語「誘導体は、薬学的に許容される塩、エーテル、エステル、プロドラッグ、溶媒和物エナンチオマージアステレオマー、又は立体異性的強化した、或いはラセミ体の混合物、及び被投与者に投与するとこのような化合物又はそれらの抗ウイルス活性代謝物或いは残基をもたらす(直接又は間接的に)任意のその他の化合物を包含する。

0063

病気」とは、細胞、組織、又は臓器の正常機能に損傷を与える化合物又はこれを妨げる疾患又は障害を意味する。

0064

用語「エピトープ」又は「抗原決定基」は本明細書では区別無しで用いられて、特定の抗体によって認識されて特異的に結合されることが可能な抗原の部分を示す。抗原がポリペプチドの場合は、エピトープは連続アミノ酸及びタンパク質の3回畳み込みによって並べられた及び非連続アミノ酸の両方から形成できる。連続アミノ酸から形成されたエピトープは通常タンパク変成によって保持されるが、3回畳み込みによって形成されたエピトープはタンパク変成すると失われる。エピトープは一般的に少なくとも8個の、そしてより一般的に少なくとも5個又は8〜10個のアミノ酸を独特空間配置内に包含している。

0065

抗体間の競合は、参照抗体の一般的な抗原との特異的結合を被検免疫グロブリンが阻害するアッセイによって判断する。多くの種類の競合結合アッセイ、例えば、固相の直接又は間接ラジオイムノアッセイRIA)、固相の直接又は間接酵素免疫アッセイEIA)、サンドイッチ競合アッセイ(Stahli et al., Methodsin Enzymology 9:242-253 (1983) を参照されたい);固相直接ビオチン−アビジンEIA(Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614-3619 (1986) を参照されたい);固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ(Harlow and Lane, “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Press (1988) を参照されたい);I−125標識を用いる固相直接標識RIA(Morel et al., Molec. Immnol. 25(1):7-15 (1988) を参照されたい);固相直接ビオチン−アビジンEIA(Cheung et al., Virology 176:546-552 (1990));及び直接標識RIA(Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990))が知られている。一般に、このようなアッセイは固体表面に結合した精製抗原又はこれらの何れかを有している細胞、標識化していない試験免疫グロブリン、及び標識化した参照の免疫グロブリンの使用を含んでいる。競合阻害は、試験免疫グロブリンの存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を測定して比較する。通常、試験免疫グロブリンは過剰に存在している。競合アッセイで確認された抗体(競合抗体)は、参照抗体と同じエピトープに結合する抗体、及び生じる立体障害のために参照抗体による結合に対して十分近位にある隣接エピトープに結合する抗体を包含する。競合抗体が過剰に存在している場合は、参照抗体の一般的な抗原との特異的結合を少なくとも25%、50%、75%又はそれ以上阻害する。

0066

「増強する」又は「増大する」とは、参照と比べて、少なくとも10%、25%、50%、75%、又は100%の正の変化を意味する。

0067

「断片」とは、ポリペプチド又は核酸分子の部分を意味する。この部分は参照核酸分子又はポリペプチドの全長の少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、又は90%を含んでいる。断片は10、20、30、40、50、60、70、80、90、又は100、200、300、400、500、600、700、800、900、又は1000個のヌクレオチド又はアミノ酸を含んでいる。

0068

ハイブリダイゼーション」は、水素結合を意味して、それは相補的核酸塩基間のワトソンクリック、フーグスティーン、又は逆フーグスティーン水素結合であってよい。例えば、アデニンチミンは水素結合の形成を介して対合する相補的核酸塩基である。

0069

「単離されたポリヌクレオチド」とは、本発明の核酸分子が誘導される有機体天然由来ゲノム中で遺伝子の側面を守る遺伝子を含んでいない核酸(例えば、DNA)を意味する。従って、この用語は、例えば、ベクターに;自己複製プラスミド又はウイルスに;
又は原核生物又は真核生物のゲノムDNAに取り込まれているか、或いは他の配列から独立している別の分子(例えば、PCR又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって作られるcDNA又はゲノム又はcDNA断片)として存在する組み換えDNAを包含する。更に、この用語はDNA分子から転写されるRNA分子、並びに追加のポリペプチド配列をコードするハブリッド遺伝子の部分である組み換えDNAを包含する。

0070

「単離されたポリペプチド」とは、天然にそれに付随している成分から分離されている本発明のポリペプチドを意味する。一般に、ポリペプチドは、タンパク質及びそれが天然に会合している天然に存在する有機分子を少なくとも60重量%含まないときに単離されている。実施態様では、調製品は少なくとも75重量%、少なくとも90重量%、又は99重量%が本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然物から抽出して、このようなポリペプチドをコードする組み換えた核酸の発現によって;又はタンパク質を化学合成してえることができる。純度は任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィーポリアクリルアミドゲル電気泳動HPLC分析などによって測定できる。

0071

2つ又はそれ以上の核酸又はポリペプチドに関連している用語「同一」又は「同一性パーセント」は、配列相同性の一部として同類置換を何れも考慮せずに、最大対応のために対比して位置合わせしたときの、同一であるか或いは同一であるヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定パーセントを有している2つ又はそれ以上の配列又は部分配列を示す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア又はアルゴリズムを用いてあるいは目視検査で測定できる。アミノ酸又はヌクレオチド配列の位置合わせに用いることができる多くのアルゴリズム及びソフトウェアは当該技術分野において公知である。このような配列位置合わせアルゴリズムの限定されない例は、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873-5877(1993) で修正され、そして NBLASTand XBLAST program (Altschul et al., Nucleic AcidsRes., 25:3389-3402 (1991) に組み込まれた、Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:2264-2268 (1990) に記載されているアルゴリズムである。ある特定の実施態様では、Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) に記載されているようにGaped BLASTを使用できる。BLAST−2、WU−BLAST−2(Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996))、ALIGN、ALIGN−2(Genentech, South San Francisco California)又はMegalign(DNASTAR)は、配列を位置合わせするために用いることができる更なる公的に入手可能なソフトウェアプログラムである。ある特定の実施態様では、2つのヌクレオチド配列間の同一性パーセントはGCGソフトウェア内のGAPプログラムを用いて(例えば、NWSgapdna.CMPマトリックス及びギャップ重量40、50、60、70、又は90並びに長さ重量1、2、3、4、5、又は6を用いる)決定できる。ある特定の実施態様では、Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453(1970))のアルゴリズムに取り込まれている、GCGソフトウェアパッケージ内のGAPプログラムを2つのアミノ酸配列間の同一性パーセントを決定するために用いることができる(例えば、Blossum62マトリクス又はPAM250マトリックスの何れか、及びギャップ重量16、14、12、10、8、6、又は4並びに長さ重量1、2、3、4、5を用いる)。ある特定の実施態様では、ヌクレオチド又はアミノ酸配列の同一性パーセントは、Myers and Miller (CABIOS, 4:11-17 (1989)) のアルゴリズムを用いて決定できる。例えば、同一性パーセントはALIGNプログラムバージョン2.0)を用いて、そして残基表ギャップ長ペナルティ12及びギャップペナルティー4を有するPAM120を用いて決定できる。特定の位置合わせソフトウェアによる最大位置合わせのための適切なパラメータは当業者が決定できる。ある特定の実施態様では、位置合わせソフトウェアの初期設定パラメータが用いられる。ある特定の実施態様では、第2アミノ酸配列に対する第1アミノ酸配列の同一性パーセント「X」は、100×(Y/Z)として算出する。ここで、Yは第1及び第2配列の位置合わせ(目視測定又は特定の位置合わせプログラムによる位置合わせ)における完全な一致として記録したアミノ酸残基の数であり、そしてZは第2配列の残基の総数である。第1配列の長さが第2配列より長い場合は、第2配列に対する第1配列の同一性パーセントは第1配列に対する第2配列の同一性パーセントより長い。

0072

限定されない例として、特定のポリヌクレオチドが参照配列に対してある特定の配列同一性パーセント(例えば、少なくとも80%同一、少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、そしてある実施態様では、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一)を有しているか否かは、ある特定の実施態様では、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)を用いて決定できる。Betfitは、Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics 2:482 489 (1981) の局所相同性アルゴリズムを用いて、2つの配列の間の相同性のベストセグメント見出す。本発明に従って特定の配列が、例えば、参照配列に対して95%同一であるか否かを決定するためにBestfit又はその他の位置合わせプログラムを用いるときは、同一性のパーセントを参照ヌクレオチド配列の全長に渡って算出できるように、そして参照配列の核酸の総数の最大5%の相同性ギャップが許容されるようにパラメータを設定する。

0073

ある実施態様では、本発明の2つの核酸又はポリペプチドが実質的に同一であるということは、最大対応のために比較及び位置合わせしたときに、配列比較アルゴリズムを用いて測定して或いは目視測定して、これらが少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、そしてある実施態様では、少なくとも95%、96%、97%、98%、99%のヌクレオチド又はアミノ酸同一性を有していることを意味している。同一性は、長さが少なくとも5、少なくとも10、約20、約40〜60残基又はそれらの間の任意の整数値である配列の領域に渡って、又は60〜80残基、少なくとも90〜100残基より長い残基に渡って存在するか、或いは配列は比較している配列の全長に渡って同一である。

0074

「同類アミノ酸置換」は、1個のアミノ酸残基を類似の側鎖を有している別のアミノ酸残基で置き換えることである。塩基性側鎖(例えば、リジンアルギニンヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシンアスパラギングルタミンセリンスレオニンチロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニンバリンロイシンイソロイシンプロリンフェニルアラニンメチオニントリプトファン)、β−分岐側鎖(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)及び芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)を含む、類似の側鎖を有しているアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。例えば、チロシンをフェニルアラニンで置換することは同類置換である。好ましくは、本発明のポリペプチド及び抗体の配列における同類置換はポリペプチド又は、アミノ酸配列を含んでいる抗体の抗原(複数を含む)との結合を抑制しない。抗原結合を消去しないヌクレオチド及びアミノ酸同類置換を識別する方法は当該技術分野において周知である(例えば、Brummel et al., BIochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi et al. Protein Eng. 12(10):879-884 (1999) 及び Burks et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:412-417 (1997) を参照されたい)。

0075

「薬学的に許容される」は、ヒトを含む動物における使用について、連邦政府又は州政府の規制によって承認された又は承認されうること、或いは米国薬局方又はその他の一般に認められている薬局方に収載されていることを示す。

0076

「薬学的に許容される賦形剤、担体又は希釈剤」は、薬剤と共に対象に投与できて、薬剤の治療量送達するのに十分な用量を投与したときに、その薬理活性を損なわず、そして無害である賦形剤、担体又は希釈剤を示す。

0077

本明細書で列挙されているインフルエンザ抗体の「薬学的に許容される塩」は、過剰な毒性、刺激アレルギー反応、又はその他の障害或いは合併症なしにヒト又は動物の組織に接触させて用いるのに適していると当該技術分野で一般に考えられている酸又は塩基の塩である。このような塩はアミンのような塩基性残基鉱酸又は有機酸の塩、並びにカルボン酸のような酸性残基のアルカリ又は有機塩を包含する。具体的な医薬塩は、これに限定されないが、塩酸リン酸臭化水素酸リンゴ酸グリコール酸フマル酸硫酸スルファミン酸スルファニル酸ギ酸トルエンスルホン酸メタンスルホン酸ベンゼンスルホン酸エタンジスルホン酸、2−ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸安息香酸、2−アセトキシ安息香酸クエン酸酒石酸乳酸ステアリン酸サリチル酸、グルタミン酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸プロピオン酸ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸フェニル酢酸酢酸のようなアルカン酸、HOOC−(CH2)n−COOH(nは0〜4である)などのような酸の塩を包含する。同様に、薬学的に許容されるカチオンは、これに限定されないが、ナトリウムカリウムカルシウムアルミニウムリチウム及びアンモニウムを包含する。当業者は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 17th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, p. 1418 (1985) によってリストアップされているものを包含している、本明細書で提供されている抗体の更なる薬学的に許容される塩を認識するだろう。一般に、薬学的に許容される酸又は塩基の塩は塩基性又は酸性部分を含んでいる親化合物から従来の化学的方法の何れかによって合成できる。つまり、このような塩はこれらの化合物の遊離酸又は遊離塩基形態を適切な溶媒中で、適切な塩基又は酸の化学量論的な量と反応させて製造できる。

0078

用語「患者」又は「対象」は、治療、観察、又は実験の対象である動物を示す。ほんの一例として、対象は、これに限定されないが、ヒト又は、非ヒト霊長類ウシウマイヌヒツジ、若しくはネコのような非ヒト哺乳動物を包含するが、これに限定されない、哺乳動物を包含する。

0079

本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」などは、病気又は疾患はないが病気又は疾患を発症する危険性があるか又は発症しやすい対象において病気又は疾患を発症する可能性を減少することを示す。

0080

「減少する」とは、参照と比べて少なくとも10%、25%、50%、75%、又は100%の負の変化を意味する。

0081

「参照」とは、標準又は対照の条件を意味する。

0082

「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、サンプル、例えば、本発明のポリペプチドを天然に含んでいる、生体サンプル中の他の分子を実質的に認識して結合しない、化合物又は抗体を意味する。

0083

抗体がエピトープ又はタンパク質に「特異的に結合する」ということは、抗体が、関係のないタンパク質を含む、別の物質に比べて、より高い頻度で、より速く、より長時間持続して、より高い親和性で、又はこれらを幾つか組み合わせでエピトープ又はタンパク質と反応又は結合することを意味する。ある特定の実施態様では、「特異的に結合する」は、例えば、薬学的に許容される0.1mM以下だが、より一般的には約1μM未満のKDで、抗体がタンパク質に結合することを意味する。異なった種における相同タンパク質間の配列同一性のために、特異的結合は、1つ以上の種の特定タンパク質を認識する抗体を包含する。第1の標的に結合する抗体又は結合部位は第2の標的と特異的に結合するかどうかは分からないということは理解されている。このように、「特異的な結合」は排他的な結合、すなわち、単一標的との結合を必ずしも必要としない(これは含むことができるが)。一般に、しかし必要ないが、結合への参照は特異的結合を意味する。

0084

本明細書で用いられる「実質的に純粋」は、少なくとも50%純粋(すなわち、混入物質を含まない)、より好ましくは少なくとも90%純粋、より好ましくは95%純粋、より好ましくは98%純粋、より好ましくは99%純粋である物質を示す。

0085

本明細書で用いられる用語「治療する」、「治療すること」、「治療」などは、疾患及び/又はそれに伴う症状を減少すること又は緩和することを示す。「緩和する」とは病気の発症又は進行を減少し、抑制し、軽減し、停止し、又は安定化することを意味する。当然のことながら、妨げはしないが、病気又は疾患を治療することは病気、疾患又はそれらに伴う症状を完全が取り除かれることを必要としていない。

0086

用語「治療効果」は疾患の症状又はその関連する病状の1つ又はそれ以上の軽減の程度を示す。この用語は、治療療法及び予防(prophylactic 又は preventive)対策の両方を示し、この目的は、標的とする病状又は障害を抑えるか又は遅らせる(減少する)ことである。治療を必要としているものは、既に病気に罹っているもの、並びに病気に罹りやすいもの又は病気を予防しなければならないものを包含する。本発明の方法に従って抗体の治療量を投与された後に、患者が以下のものの1つ又はそれ以上に観察可能な及び/又は測定可能な減少又は欠如を示したら、対象又は哺乳動物は感染を成功裏に「治療される」:感染された細胞数の減少又は非存在;感染している総細胞のパーセントの減少;特定の感染に関連している1つ又はそれ以上の症状(例えば、インフルエンザ感染に関連している症状)のある程度の軽減;減少した罹患率及び死亡率、及び生活の質の改善。成功的治療及び疾患の改善を評価するための上記パラメータは医師によく知られている日常の手段によって容易に測定できる。

0087

「治療的有効量」は、治療効果を達成するのに必要な量を制限することを意図している。当該技術分野における通常の技術を有している医師又は獣医は必要とされる医薬組成物の「治療的有効量」(例えば、ED50)を容易に決定して処方できる。例えば、医師又は獣医は医薬組成物中で用いられる本発明の化合物の用量を所望の治療効果を達成するために必要なものより低い濃度で始めて、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増大することができる。

0088

語句「併用療法」は、2つの治療薬の相互作用による有益な効果をもたらすことを意図している特定治療計画の一端としてインフルエンザ抗体と第2治療薬投与を含んでいる。併用の有益な効果は、これに限定されないが、治療薬の併用からもたらされる薬物動態的又は薬力学的相互作用を包含する。これらの治療薬の併用での投与は一般に、決められた時間周期(通常、選択された組み合わせに従って、分、時間、日、又は週)に渡って実施される。「併用療法」は一般に、偶然にそして任意に本発明の併用をもたらす別個単剤両方の一端としての2つ又はそれ以上のこれら治療薬の投与を包含するように意図されていない。「併用療法」は、これらの治療薬の逐次的方法での投与、すなわち、それぞれの治療薬を異なった時間に投与すること、並びにこれらの治療薬、又はこれらの薬剤の少なくとも2つの実質上同時投与を含むように意図されている。実質上同時投与は、例えば、一定比率の各治療薬を有している単一カプセル、又はそれぞれの治療薬を含有している単一カプセルを複数対象に投与することによって達成できる。例えば、本発明の1つの併用はインフルエンザ抗体及び少なくとも1つの追加治療薬(例えば、抗インフルエンザ薬を包含している、抗ウイルス薬)を同時に又は異なった時間に含んでいるか、又はこれらを2つの化合物を含んでいる単一の、同時製剤化した医薬組成物としてこれらを製剤化できる。別の例として、本発明の併用(例えば、インフルエンザ抗体と、抗ウイルス剤のような少なくとも1つの追加の治療薬)は同時に又は異なる時間に投与できる個別の医薬組成物として製剤化される。各治療薬の連続投与又は実質上同時投与は、これに限定されないが、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、及び粘膜組織(例えば、、口、膣、及び直腸)を介する直接吸収を含む、適切な経路の何れかによって達成される。治療薬は同じ経路で又は異なった経路で投与できる。例えば、特定の併用の1つの成分を静脈内注射によって投与できるのに対して、併用の他の成分を経口で投与できる。成分は治療上有効な順番で投与できる。

0089

語句「併用」は、化合物の群又は併用療法の一部として有用な非薬物療法を包含する。

0090

用語「ベクター」は、1つ又はそれ以上の目的の遺伝子(複数を含む)又は配列(複数を含む)を宿主細胞内へ送達して発現することができる構築物を意味する。ベクターの例は、これに限定されないが、ウイルスベクター無傷のDNA又はRNA発現ベクター、プラスミド、コスミド又はファージベクター陽イオン性縮合剤と結合しているDNA又はRNA発現ベクター、リポソーム封入されているDNA又はRNA発現ベクター、及び産生細胞のような、ある特定の真核細胞を包含する。

0091

具体的に記述されてなく、或いは文脈から明瞭でない限り、本明細書で用いられる用語「約」は、当該技術分野における通常の許容範囲、例えば、平均値の2標準偏差以内であると理解される。約は、表示した値の10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%、又は0.01%以内と理解できる。文脈から明確でない限り、本明細書に示されている数値は用語約によって修飾されている。

0092

本明細書に示されている範囲は、範囲内の全ての値の省略であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、又は50からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は部分範囲を含んでいると理解される。

0093

本明細書の可変基の定義の何れかにおける化学基の列挙の記載は列挙された基の任意の単一基又は組み合わせとしての可変基の定義を包含している。可変基に関する実施態様又は本明細書の態様の記載は、任意の単一実施態様又は他の任意の実施態様又はその1部との組み合わせとしての実施態様を包含している。

0094

本明細書に提供されている組成物又は方法は、本明細書に提供されている他の組成物及び方法の1つ又はそれ以上と組み合わせることができる。

図面の簡単な説明

0095

(A)はクローン860の推定系統である。左は3つの抗体(それらの番号で示した、右)の未変異共通祖先(UCA)である。(B)は系統内の重鎖(上)及び軽鎖(下)配列の配列比較である。(C)はCH65由来FabのHA1との接触である。重鎖は濃青色で;軽鎖を淡青色で;CDRはBで標識した色で;HAは赤で;分子表面は部分的に透け見える透明に示した。UCAから変異した残基は緑の細い枝で表されている。
(A)はCH65Fabを有しているHA三量体である。1本のHA鎖は赤色に(HA1)と緑色に(HA2);他の2本の鎖を灰色に;グリカンを黄色に表した。着色したHA鎖に結合したFabを濃青色(重鎖)と淡青色(軽鎖)に表して、接触しているCDRを図1Bで示したように着色した。(B)はFv領域とそのHA1との接触の引き伸ばし図である。図1のような色にした。重鎖CDR3(赤紫色)はHA1上の受容体結合ポケットに突き出ているのに対して、残りのCDRはより限定された表面接触を有していることに注目されたい。(C)及び(D)は、矢印で示したように開いた、Fab CH65とHA1の間の接触の表面を説明した図である。1つのHAサブユニット上のシアル酸ポケットを濃紅色に;他のサブユニットを暗赤色に;残りの2つのサブユニットを灰色に;グリカンを黄色に表した。
図3は、CH65(A)とα−2,6−シアリルラクトンからの相互作用の比較である。
図4は、H1及びH3インフルエンザ株に対するCH65−CH67系統株の活性の酵素免疫吸着測定(ELISA)である。293T細胞をX31株由来の全長HAで(上のパネル、A〜C)、又はA/Solomon Islands/3/2006[H1]由来の細胞表面発現球状頭部で(下のパネル、E〜G)でトランスフェクトした。細胞をホルムアルデヒドで固定してCH65 Fab(b及びf)又はCH66全長抗体(C及びG)で、続いてヒトFabに特異的なFITC結合二次抗体プローブした。細胞をFITC発光(532nm)によって撮像した。対照として、トランスフェクトした細胞を第二次抗体のみでプローブした(A及びE)。
図5は、CH65のVDJ組み換え部位の配列である。keyは断片をコードする重鎖(V、D、J及びn−ヌクレオチド)の起源を示す。
図6は、CH65−CH67 HA抗体の重鎖DNA配列である。
図7は、CH65−CH67 HA抗体の軽鎖DNA配列である。
図8は、CH65−CH67 HA抗体の重鎖アミノ酸配列である。
図9は、CH65−CH67 HA抗体の軽鎖アミノ酸配列である。
図10は、CL860UCA、CH65、CH66及びCH67のVH DNA配列の配列比較である。
図11は、CL860UCA、CH65、CH66及びCH67のVL DNA配列の配列比較である。
図12は、CL860UCA、CH65、CH66及びCH67のVHアミノ酸配列の配列比較である。
図13は、CL860UCA、CH65、CH66及びCH67のVLHアミノ酸配列の配列比較である。
図14は、H1(A)、H2(B)、H3(C)、及びH5(D)血球凝集素由来の代表的な受容体結合ドメインである。
図15は、H1、H2、H3、及びH5血球凝集素由来の代表的な受容体結合ドメインの配列比較である。CH65−CH67抗体と相互作用するアミノ酸残基に下線を付した。

0096

本発明は、インフルエンザ抗原変異体を広く中和する新規な抗体を特徴としている。本発明は、新規な抗体を含んでいる組成物及びキット、並びにインフルエンザ感染を治療又は予防(例えば、ワクチン接種)するためのこれら新規な治療分子を用いる方法も提供する。

0097

インフルエンザウイルス受容体は、末端α−2,3又はα−2,6連鎖によって糖タンパク質又は糖脂質上のグリカンに結合している、シアル酸である(Wiley, D.C. and Skehel, J.J. Annu. Rev. Biochem. 56:365-394 (1987) に概説されている)。殆どの中和抗体は、それらのフットプリント受容体結合部位と重なり合うことにより、或いはそれらがHA表面のどこかに結合すると立体障害を与えることにより、細胞接着を阻害する(Knossow, M. and Skehel, J.J. Immunology 119:1-7 (2006))。Fab:HA複合体の構造が確認されている、2つのマウスモノクローナル中和抗体は、HA上のシアル酸結合ポケットに突き出て、ほぼシアル酸カルボキシレートと思われるところにアスパラギン酸側鎖を提示する(Fleury D. et al., Nat. Struct. Biol. 5:119-123 (1998); 及び Barbey-Martin, C. et al., Virology 194:70-74 (2002))。しかし、これら2つの抗体は、受容体部位に比べてより容易にエスケープ変異が起こる、他の表面領域との広い接触も有している。

0098

本発明は少なくともその一部が受容体ポケット内に主要な接触を有している新規な抗体の発見に基づいている。CH65と命名された、そのような抗体の1つは、2007三価ワクチンを投与された対象から得られた、選別された形質細胞から再配列された重鎖及び軽鎖遺伝子を単離して見出された。CH65は、30年以上にわたるシーズン分離株H1の極めて広い範囲を中和する。その19残基の重鎖相補性決定領域3(CDR−H3)は受容体ポケットに挿入して、シアル酸が行う多くの相互作用を模倣する。重鎖と軽鎖の両方のCDRはHA1の外部接面とより制限された、更なる接触に関与する。CH65の予測される非変異祖先は、重鎖変異可変ドメインの12位、及び軽鎖可変ドメインの6位にある親和性成熟抗体とは異なっている。従って、ヒトB細胞レパートリーは、主に結合部位に対する抗体を作製する能力を含んでいる。抗体CH65によって中和される多数の季節性H1ウイルスは、このような応答は通常耐性を選択するにはあまりにもまれであること、又は潜在的なエスケープ変異が受容体結合を危うくするような場合のように、耐性は適応コストを非常に大きくすることを示唆している。従って、インフルエンザウイルスの広範囲中和が受容体のそれを模倣した接触を有する抗体によって達成できるということを本発明者が発見したことは驚くべきことである。従って、本発明はインフルエンザHAとシアル酸受容体の間の接触を模倣した新規な抗体を提供する。これらの新規な抗体はインフルエンザの抗原ドリフトした株による感染を効果的に治療及び/又は予防できる。このように、本発明は新規な抗体を含んでいる組成物及びキット、並びにインフルエンザ感染を治療及び/又は予防するためにこれらの治療分子を用いる方法を提供する。本発明は新規な抗体を含んでいる併用治療にも関している。

0099

(CH65−CH67血球凝集素抗体)
本発明は、インフルエンザ血球凝集素(HA)のエピトープに特異的に結合する新規な抗インフルエンザ抗体を提供する。抗体のHAとの結合はシアル酸へのインフルエンザ血球凝集素結合を減少又は阻害する。

0100

実施態様では、インフルエンザHAのエピトープはシアル酸結合ドメインを含む。

0101

実施態様では、HAは、H1 HA、H2 HA、H3 HA、又はH5 HA(ヒト適合化H5株由来のHA)である。

0102

関連する実施態様では、インフルエンザHAエピトープは、A/Solomon Islands/3/2006に由来する、CDRH1残基158、CDR H2残基158〜160、CDR H3残基135〜136、190〜195、及び226、CDR L1残基222、225、及び227、並びにCDR L3残基187及び189に対応するアミノ酸を含む。

0103

関連する実施態様では、インフルエンザHAエピトープは、配列番号17〜44の何れか1つに記載されているアミノ酸を含む。

0104

関連する実施態様では、インフルエンザHAエピトープは、配列番号17〜44の何れかにあるCH65−CH67結合残基(例えば、図15で識別されるCH65−CH67結合残基)を含む。

0105

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖(VH鎖)を含んでいて、VH鎖は配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12に記載されているアミノ酸配列を含む。

0106

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12の可変重鎖(VH鎖)アミノ酸は配列中に存在している1つ又はそれ以上の重鎖CDR配列を含む。関連する実施態様では、1つ又はそれ以上の重鎖CDR領域は、配列番号9、配列番号10、配列番号11、又は配列番号12の可変重鎖(VH鎖)アミノ酸配列中に存在しているCDR3領域を含む。

0107

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変軽鎖(VL鎖)を含んでいて、VL鎖は配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16に記載されているアミノ酸配列を含む。

0108

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16の可変軽鎖(VL鎖)アミノ酸配列中に存在している1つ又はそれ以上の軽鎖CDR領域を含む。関連する実施態様では、1つ又はそれ以上の軽鎖CDR領域は、配列番号13、配列番号14、配列番号15、又は配列番号16の可変軽鎖(VL鎖)アミノ酸配列中に存在しているCDR3領域を含む。

0109

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、i)配列番号10に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変重鎖(VH鎖)、及びii)配列番号14に記載されているアミノ酸配列を含んでいる可変軽鎖(VL鎖)を含む。

0110

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、可変重鎖(VH鎖)を含んでいて、VH鎖のCDR3領域はArg104、Ser105、Val106、Asp107、Try109、Try110、Try112、又はこれらの組み合わせを含む。

0111

実施態様では、抗インフルエンザ抗体はモノクローナル抗体又はその抗体断片である。

0112

実施態様では、抗インフルエンザ抗体はヒト化抗体である。

0113

実施態様では、抗体断片は、Fab断片、Fab'断片、Fd断片、Fd'断片、Fv断片、dAb断片、F(ab')2断片、単鎖断片、二重特異性抗体、又は直鎖抗体である。

0114

実施態様では、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片は、抗インフルエンザ抗体又はその抗体断片に接合している薬剤を更に含む。関連する実施態様では、抗体又はその抗体断片に接合している薬剤は治療薬又は検出可能な標識である。

0115

治療薬は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の治療薬であってよい。このような薬剤は当該技術分野で周知であって、小分子、ナノ粒子、ポリペプチド、放射性同位元素、抑制性核酸などを包含する。実施態様では、治療薬は抗ウイルス剤又は毒素である。実施態様では、治療薬はsiRNA、shRNA、又はインフルエンザウイルス産生を減少するアンチセンス核酸分子である。

0116

検出可能な標識は、新規な抗体と一緒に使用するのに適している任意の検出可能な標識であってよい。このような標識は当該技術分野で周知であって、分光学、光化学、生物化学、免疫化学、物理学、又は化学手段で検出される標識を包含する。実施態様では、検出可能な標識は、酵素、蛍光分子、粒子標識、電子密度の高い試薬、放射標識、微小気泡、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテン或いは検出できるように作製されたタンパク質である。

0117

上記実施態様の何れかでは、インフルエンザはH1N1、H2N2、H3N2、又はヒト適合化H5株であってよい。

0118

本発明の抗体は当該技術分野で公知の従来方法の何れかによって作製できる。例えば、ポリクローナル抗体は、動物を(例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバヤギ、ハムスター、モルモット、ヒツジ、有蹄動物、ウシ、ラクダ家禽ニワトリなど)を適切なハプテン(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミンなど)と任意に結合している関連抗原(例えば、精製したペプチド断片、全長組み換えタンパク質、融合タンパク質等)の複数回の皮下又は腹腔内注射によって免疫することによって作製できる。抗原を適切な溶媒(例えば滅菌した食塩水)で希釈してアジュバント(例えば、コンプリート又はインコンプリートフロインドアジュバント)と混合して安定な乳濁液を形成することができる。次いで、ポリクローナル抗体をこのように免疫した動物の血液、腹水などから回収する。採取した血液を凝固して、血清デカンテーションし、遠心分離清澄にして抗体価を測定する。ポリクローナル抗体は血清又は腹水から、アフィニティークロマトグラフィーイオン交換クロマトグラフィーゲル電気泳動透析などを含む当該技術分野における標準的な方法に従って精製することができる。

0119

モノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature 256:495(1975) によって記載されているような、ハイブリドーマ方法を用いて作製できる。ハイブリドーマ法を用い、免疫抗原に特異的に結合できる抗体のリンパ球による産生を引き起こすために上記のように適切な宿主動物を免疫する。リンパ球もインビボで免疫できる。免疫に続いて、リンパ球を単離して、例えばポリエチレングリコールを用い適切な骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを形成し、融合しなかったリンパ球と骨髄腫細胞を除いてハイブリドーマを選択する。次いで、免疫沈降法、免疫ブロッティング法により、又はインビトロ結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素免疫吸着測定(ELISA)など)によって確認されるように選択された抗原に対して特異的なモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを標準的方法を用いるインビトロの培養(Goding, Monoclonal Antibodies; Principles and Practice, Academic Press 1986 を参照されたい)で、或いは動物における腹水腫瘍としてインビボの何れかで増殖する。次いで、モノクローナル抗体を、ポリクローナル抗体について上に記載したように、培養培地又は腹水から精製できる。

0120

また、モノクローナル抗体は、米国特許第4,816,567号に記載されているように、組み換えDNA法を用いても作製できる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いる例えばRT−PCRなどによって、成熟B細胞又はハイブリドーマ細胞から単離して、通常の方法を用いてそれらの配列を決定する。次いで、重鎖及び軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチド(本明細書に記載されている単離されたポリヌクレオチドを包含する)を適切な発現ベクター内にクローン化し、これはE.coli細胞、サルOS細胞チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、又は他の免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞内にトランスフェクトすると、モノクローナル抗体が宿主細胞によって産生される。また、所望種の組み換えモノクローナル抗体又はその断片は記載されているような所望種のCDRを発現するファージ提示ライブラリーから単離できる(MacCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 356:624-628; 及び Marks et al., 1991, J. Mo;. Biol., 222:581-597 を参照されたい)。

0121

モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド(複数を含む)は、代替抗体を作製するために組み換えDNA技術を用いる多くの異なった手段で更に修正できる。いくつかの実施態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖及び重鎖の定常ドメインは、1)例えば、キメラ抗体を作製するヒト抗体の領域で、又は2)融合抗体を作製する非免疫グロブリンポリペプチドで置換することができる。いくつかの実施態様では、定常領域をトランケート又は除去してモノクローナル抗体の所望抗体断片を作製する。可変領域の部位特異的又は高密度突然変異生成をモノクローナル抗体の特異性親和性等を最適化するために用いることができる。

0122

本発明のいくつかの実施態様では、モノクローナル抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、それぞれの抗体鎖内に3つの相補性決定基(CDR)を含んでいる抗原決定又は超可変領域内の非ヒト(例えば、ネズミ)抗体由来最小配列を含んでいる抗体である。このような抗体は、ヒト対象に投与したときに抗原性及びHAMA(ヒト抗マウス抗体)応答を減少するために治療に用いられる。実際には、ヒト化抗体は、非ヒト配列が最小から殆ど無い典型的にヒトの抗体である。ヒト抗体はヒトによって産生された抗体又はヒトによって産生された抗体に対応しているアミノ酸配列を有している抗体である。

0123

ヒト化抗体は当該技術分野で公知の多くの技術を用いて産生できる。抗体は、ヒト抗体のCDRを所望の特異性、親和性、及び機能を有している非ヒト抗体(例えばマウス、ラット、ウサギ、ハムスターなど)と置き換えることによってヒト化できる(例えば、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); 及び Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988) の記載を参照されたい)。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性及び/又は機能を改善又は最適化するために、可変ヒトフレームワークの領域内の及び/又は置き換えられた非ヒト残基内の更なる残基の置換によって更に修正することができる。

0124

ヒト化抗体の作製に利用するためのヒト重鎖及び/又は軽鎖可変ドメインの選択は抗原性を減少するために重要であろう。「best−fit」法に従って、非ヒト抗体の可変ドメインの配列を公知ヒト可変ドメインアミノ酸配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。従って、ある特定の実施態様では、そこからCDRを採取する非ヒト抗体のそれと最も相同性があるヒトアミノ酸配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域(FR)として用いる(Sims et al., J. Immunol. 151:2296 (1993): Chothia at al., J. Mol. Biol. 196:901 (1987) を参照されたい)。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定サブグループの全ヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定FRを用いていくつかの異なったヒト化抗体に用いることができる(Carter et al., PNAS 89; 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993) を参照されたい)。実施態様では、方法の組み合わせが、ヒト化抗体の作製に用いるヒト可変FRを採取するために用いられる。

0125

ヒト化する抗体は抗原に対する高い親和性、並びにその他の好ましい生物特性を保持していなければならないということも当然のことである。目的を達成するために、ヒト化する非ヒト抗体及び多種の候補ヒト化配列由来の親配列解析プロセスによってヒト化抗体を作製できる。三次元の免疫グロブリンモデルは当業者に入手可能であってよく知られている。選択された候補抗体配列の推定三次元立体配座構造を説明して表示するためにコンピュータプログラムを用いることができる。このようなモデルの使用は、ヒト化する抗体の機能における残基の可能性のある役割解析、すなわち、その抗原に結合させる候補抗体の能力に影響を与える残基の解析を可能にする。この方法で、所望の抗体特性が得られるように、親抗体からFR残基を選択してレシピエントヒト化抗体と結合させることができる。一般に、抗原決定領域(又は超可変領域)のCDRにある残基は抗原結合について親抗体(例えば、望ましい抗原結合特性を有する非ヒト抗体)からヒト化抗体に保持している。ある特定の実施態様では、可変FR内の少なくとも1つの追加残基は親抗体からヒト化抗体内に保持されている。ある特定の実施態様では、可変FR内の最大6個までの追加残基が親抗体からヒト化抗体内に保持されている。

0126

免疫グロブリンの成熟重鎖及び軽鎖の可変領域由来のアミノ酸を、それぞれHX及びLXと指定し、ここで、xはKabat(Sequence of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1987, 1991)のスキームに従うアミノ酸の位置を指定している数である。Kabatは抗体に関してそれぞれのサブグループについて多くのアミノ酸配列を記載して、そのサブグループ内のそれぞれの残基について最も普通に存在するアミノ酸を記載してコンセンサス配列を作り出す。Kabatは、記載されている配列内の各アミノ酸に残基ナンバー割り当てる方法を用いていて、残基ナンバーを割り当てるこの方法はこの分野で標準となった。Kabatのスキームは、問題の抗体をKabat内の1つのコンセンサス配列と、同類アミノ酸を参照して、配列比較することによってこの一覧表に含まれていない別の抗体まで拡張可能である。Kabatの番号付与ステムの使用は、異なった抗体における同等の位置にあるアミノ酸を容易に確認する。例えば、ヒト抗体のL50位にあるアミノ酸は、マウス抗体アミノ酸位L50に相当する位置を占めている。更に、例えば、1つの抗体配列内の各アミノ酸を同じKabatナンバーを有している他の配列内のアミノ酸と配列比較できるように、Kabat番号付与システムを用いて同一性パーセントを確認するために、任意の2つの抗体配列を一意的に配列比較できる。配列比較の後に、対象抗体領域(例えば、重鎖又は軽鎖の全成熟可変領域)を参照抗体の同じ領域と比較したら、対象抗体領域と参照抗体領域の間の配列同一性パーセントは、ギャップを考慮せずに、2つの領域の比較した位置の総数で割った、対象抗体領域と参照抗体領域の両方の同じアミノ酸で占められた位置の数を100倍してパーセントに変換した数である。

0127

ヒト化抗体に加えて、完全ヒト抗体を当該技術分野で公知の多くの技術を用いて直接作製できる。インビトロで免疫したか、又は標的抗原に対して抗体を産生する免疫した個人から単離した不死化ヒトBリンパ球を作製できる(例えば、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., J. Immunol. 147:86-95 (1991); 及び米国特許第5,750,373号を参照されたい)。また、ヒト抗体をファージライブラリーから選択でき、ここでファージライブラリーはヒト抗体を発現する(Vaughan et al., Nat. Biotech. 14:309-314 (1996); Sheets et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227:381 (1991); 及び Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581 (1991) を参照されたい)。ヒト抗体は、免疫すると内因性免疫グロブリン産生なしでヒト抗体の全範囲を産生できるヒト免疫グロブリン遺伝子座を包含している組み換えマウスにおいても作製できる。このデュ法は米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、及び同第5,661,016号に記載されている。

0128

本発明は二重特異性抗体も包含している。二重特異性抗体は少なくとも2つの異なったエピトープを特異的に認識して結合できる抗体である。異なったエピトープは同じ分子(例えば、インフルエンザHA)内にあるか、或いは二重特異性抗体が目的の抗体(例えば、インフルエンザHA)並びに、例えば、別のウイルスタンパク質(例えば、Neuraminidase、M2など)内にあるエピトープを特異的に認識して結合するように異なった分子上にあり得る。二重特異性抗体を作製する技術は当該技術分野でよく見られる(Millstein et al., Nature 305:537-539 (1983); Brrnnan et al., Science 229:81 (1985); Suresh et al., Methodsin Enzymol. 121:120 (1986); Traunecker et al.,EMBO J. 10:3655-3659 (1991); Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992); Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992); Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994); 及び米国特許第5,731,168号を参照されたい)。二価以上を有する抗体も目論まれている。例えば、三重特異性抗体を作製できる(Tutt et al., J. immunol. 147:60(1991) を参照されたい)。

0129

実施態様では、本発明の抗体は抗体断片である。抗体断片の作製に関して多くの技術が知られている。従来から、これらの断片は無傷抗体のタンパク分解消化を用いて生成された(例えば、Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods24:107-117 (1993); 及び Brennan et al., Science 229:81 (1985) を参照されたい)。抗体断片は組み換え技術によっても産生できる。Fab、Fv、及びscFv抗体断片は、E.coli又はその他の宿主細胞内で発現されそこから分泌されるので、これらの断片の大量生産が可能となる。このような抗体断片は上記のように抗体ファージライブラリーから単離することもできる。抗体断片は、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されているように線形の抗体であってよく、そして単一特異性又は二重特異性であってもよい。抗体断片の産生のためのその他の技術は当業者が容易に見出せるだろう。

0130

本発明によると、本発明のポリペプチドに特異的な単鎖抗体の産生に技術を適用することができる(米国特許第4,946,778号を参照されたい)。更に、インフルエンザHAに対する望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速且つ効果的な同定が可能なFab発現ライブラリー(Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989) を参照されたい)の構築のために方法を適用できる。本発明のポリペプチドに対するイディオタイプを含む抗体断片を、これに限定されないが、(a)抗体分子ペプシン消化によって産生されるF(ab')2断片;(b)F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元して作製されたFab断片、(c)抗体分子をパパイン及び還元剤で処理して作製されたFab断片、及び(d)Fv断片を包含する当該技術分野の技術によって産生できる。

0131

特に抗体断片の場合において、血清半減期を増大するために抗体を修飾することが更に望ましい。例えば、抗体断片内の適切な領域を突然変異することによって、再利用(サルベージ)受容体結合エピトープを抗体断片内に取り込むことで、或いはエピトープをペプチドのタグに取り込み、次いで末端に又は中央にある抗体と融合して(例えば、DNA又はペプチド合成で)これを達成できる。

0132

ヘテロ結合抗体も本発明の範囲内である。ヘテロ結合抗体は2つの共有結合した抗体から成っている。このような抗体は、例えば、標的の免疫細胞を不要な細胞にするように企図されている(米国特許第4,676,980号)。架橋剤に関連しているものを包含している、合成タンパク質化学において公知の方法を用いて抗体をインビトロで作製することが目論まれている。例えば、ジスルフィド交換反応を用いるか或いはチオエーテル結合を形成して免疫毒素を構築できる。この目的に適している試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−4−メルカプトブチルイミデートを包含する。

0133

本発明で目論まれている別の修正は、重鎖及び軽鎖の両方の可変ドメインを1つ又はそれ以上のCDRの少なくとも部分置換によって、所望により、部分ネットワーク領域置換及び配列変更によって修正することである。CDRはフレームワークが由来している抗体として同じクラスの或いは同等のサブクラスの抗体に由来していても、CDRは異なったクラスの抗体に、好ましくは異なった種由来の抗体に、由来していると推測される。CDRの全てをドナー可変領域由来の完全CDRで置き換えて1つの可変ドメインの抗原結合能力を他方へ移す必要はない。むしろ、抗原結合部位の活性を保持するのに必要なこれらの残基を移すことだけが必要である。米国特許第5,585,089号、同第5,693,761号、及び同第5,693,762号に述べられている説明を考えると、通常の実験を行って、或いは試行錯誤の試験によって、減少した免疫原性を有する機能的な抗体を得ることは、十分当業者の能力の範囲内である。

0134

可変領域の変更にもかかわらず、当業者は、本発明の改変された抗体は、少なくとも1つ又はそれ以上の定常領域ドメインが欠失しているか、或いはその反対に天然の又は未処理の定常領域から成るほぼ同じ免疫原性の抗体と比較したときに増大した腫瘍局在化又は減少した血清半減期のような望ましい生物化学特性をもたらすように変更した、抗体、又はその免疫反応性断片を包含できることを理解できるだろう。ある実施態様では、改変した抗体の定常領域はヒト定常領域を包含している。本発明に適合する定常領域の修正は、1つ又はそれ以上のドメインにある1つ又はそれ以上のアミノ酸の付加、欠失又は置換から成っている。すなわち、本明細書に開示されている改変された抗体は3つの重鎖定常ドメイン(CH1、CH2又はCH3)及び/又は軽鎖定常ドメイン(CL)の修正又は改変を含んでいる。本発明のある実施態様では、1つ又はそれ以上のドメインが部分的に又は完全に欠失している改変された定常領域が目論まれている。ある実施態様では、全てのCH2ドメインが除去されたドメイン欠失構築物又は変異体(ΔCH2構築物)を包含する。ある実施態様では、除かれた定常領域ドメインは、通常は欠失した定常領域によって与えられる分子柔軟性の一部をもたらす、短いアミノ酸スペーサー(例えば、10残基)で置き換えられる。

0135

本発明は更に、本明細書に説明されたキメラ、ヒト化及びヒト抗体、或いはそれらの断片と実質的に類似している変異体及び等価物を包含する。これらは、例えば、同類置換突然変異、すなわち、1つ又はそれ以上のアミノ酸を類似のアミノ酸による置換を含んでいる。例えば、同類置換は、例えば、1つの酸性アミノ酸を別の酸性アミノ酸で、1つの塩基性アミノ酸を別の塩基性アミノ酸で、又は1つの中性アミノ酸を別のアミノ酸でのように、1つのアミノ酸の同一の一般的分類内の別のものによる置換を示す。同類アミノ酸置換によって意図されていることは当該技術分野において周知である。

0136

本発明の抗体は当該技術分野で公知の方法で、免疫特異的結合についてアッセイできる。用いることができる免疫アッセイは、これに限定されないが、BIAcore分析FACS分析、免疫蛍光測定、細胞免疫化学、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA、「サンドイッチ」免疫アッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル沈降反応免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量アッセイ、蛍光免疫測定プロテインA免疫アッセイなどのような技術を用いる、競合及び非競合アッセイ系を包含する。このようなアッセイは日常的なもので当該技術分野でよく知られている(例えば、その全てが参照により本明細書に取り込まれている、Ausbel et al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York を参照されたい)。

0137

実施態様では、抗体のインフルエンザHAに対する免疫特異性はELISAによって確認される。ELISAアッセイは、抗原を作製すること、マイクロタイタープレートウェルを抗原でコーティングすること、酵素物質(例えば、西ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ)のような検出可能な化合物に結合している抗体をウェルに添加すること、一定時間培養すること及び抗原の存在を検出することから成っている。ある実施態様では、抗体を検出可能な化合物と結合してはいないが、その代わりに、インフルエンザHA抗原に対する抗体を認識する第2結合抗体をウェルに添加する。ある実施態様では、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体がウェルにコーティングされて検出可能な化合物に結合している第2抗体を抗原の添加に続いて、コーティングされたウェウルに添加できる。当業者は検出された信号を増幅するために修正できるパラメータ、並びに当該技術分野で公知のELISAのその他のバリーションに関して精通しているだろう(例えば、Ausbel et al., eds. 1994, Current Protocols in Molecular biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York の 11.2.1 を参照されたい)。

0138

インフルエンザHAに対する抗体の結合親和性及び抗体−抗原相互作用のオフ速度は競合的結合アッセイによって確認できる。競合的結合アッセイの1つの例は標識化抗原(例えば、3H又は125I)、或いはその断片又は変異体を、所定の抗体と、量を増大させている非標識化抗原の存在下で培養すること、それに続く標識化抗原への抗体結合の検出を含んでいる。抗原に対する抗体の親和性及び結合オフ速度はスキャッチャードプロット分析によるデータから確認できる。ある実施態様では、BIAcore動力学的分析は、癌幹細胞マーカーに対する抗体の結合オン及びオフ速度を確認するために用いられる。BIAcore動力学的分析は、その表面に癌幹細胞マーカー抗原を固定したチップから抗体の結合及び解離を分析することから成っている。

0139

(インフルエンザ血球凝集素抗体ポリペプチド及びポリヌクレオチド)
本発明は、インフルエンザ血球凝集素(HA)抗体又はその断片を含んでいるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドも包含する。

0140

用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、ポリペプチドをコードする配列のみを含んでいるポリヌクレオチド、並びに更なるコード配列及び/又は非コード配列を含んでいるポリヌクレオチドを包含している。本発明のポリヌクレオチドはRNAの形状又はDNAの形状であってよい。DNAはcDNA、ゲノムDNA、及び合成DNAを含み;そして二本鎖又は一本鎖であってよく、そして一本鎖はコード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であってよい。

0141

本発明は更に、ポリヌクレオチドの変異体、例えば、断片、類縁体、及び誘導体に関する。ポリヌクレオチドの変異体はポリヌクレオチドの天然の対立遺伝子変異体、又はポリヌクレオチドの非天然変異体であってよい。ある特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、開示したポリペプチドのコード配列の天然の対立遺伝子変異体であるコード配列を有していてもよい。当該技術分野で知られているように、対立遺伝子変異体は、例えば、ポリペプチドをコードする機能を実質的に変えない、1つ又はそれ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を有しているポリヌクレオチド配列代替形態である。

0142

実施態様では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、宿主細胞からの発現及び分泌に役立つポリペプチド(例えば、細胞からポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列)と融合した成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでいてよい。リーダー配列を有しているポリペプチドはタンパク質前駆体であって、宿主細胞によって切断されてポリペプチドの成熟形態を形成するリーダー配列を有することができる。ポリヌクレオチドは、成熟タンパク質に追加の5'アミノ酸残基を加えたタンパク質前駆体をコードすることもできる。プロ配列を有している成熟タンパク質はタンパク質前駆体であって、タンパク質の不活性形態である。タンパク質前駆体が切断されると、活性な成熟タンパク質が残存する。

0143

実施態様では、ポリヌクレオチドは、同じリーディングフレーム内で、例えば、コードされたポリペプチドを純化する効果があるマーカー配列と融合した成熟ポリペプチドをコードする配列を含んでいてよい。例えば、マーカー配列は、細菌宿主の場合に、マーカーに融合している成熟ポリペプチドの純化をもたらすpQE−9ベクターによって供給されるヘキサヒスチジン標識であってよく、或いはマーカー配列は、哺乳動物の宿主(例えば、COS−7細胞)を用いるときにインフルエンザ血球凝集素から誘導される血球凝集素(HA)標識であってもよい。更なる標識は、これに限定されないが、カルモジュリン(Calmodulin)標識、FLG標識、Myc標識、S標識、SBP標識、Softag1、Softag3、V5標識、Xpress標識、Isopeptag、Spy標識、ビオチンカルボキシル担体タンパク質(Biotin Carboxyl Carrier Protein; BCP)標識、GST標識、蛍光タンパク質標識(例えば、緑色蛍光タンパク質標識)、マルトース結合タンパク質標識、Nus標識、Strep−標識、チオレドキシン(thioredoxin)標識、Tc標識、Ty標識などを包含する。

0144

実施態様では、本発明は、本発明のインフルエンザHA抗体又は抗体断片を含んでいるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、或いは少なくとも96%、97%、98%又は99%同一であるヌクレオチド配列を有している単離された核酸分子を提供する。

0145

ポリヌクレオチド配列は参照ヌクレオチド配列のそれぞれ100ヌクレオチド当り5つの点突然変異を包含できるということを除いて、少なくとも、例えば、参照ヌクレオチド配列と95%「同一」であるヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドによって、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であることを表す。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一のヌクレオチド配列を有しているポリヌクレオチドを得るために、参照配列内の最大5%のヌクレオチドを欠失又は他のヌクレオチドで置換でき、或いは参照配列内の総ヌクレオチドの最大5%の数のヌクレオチドを参照配列に挿入できる。参照配列のこれらの突然変異は、参照ヌクレオチド配列のアミノ−又はカルボキシ末端部分に、又はこれら末端の間のどこかに、参照配列内のヌクレオチド間に個々に、又は参照配列内の1つ又はそれ以上の連続基内に組み入れて起こり得る。

0146

実際に、ある特定の核酸分子が参照配列と少なくとも85%同一、少なくとも90%同一、そしてある実施態様では、少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一であるか否かは、Bestfitプログラム(Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, WI 53711)のような公知のコンピュータプログラムを用いて従来通り確認できる。Bestfitは、2つの配列間の最大の相同断片を見出すために、Smith and Waterman, Advances in applied Mathematics 2: 482 489 )1981) のローカルホモロジーアルゴリズムを用いる。特定の配列が本発明による参照配列と、例えば、95%同一であるか否かを確認するためにBestfit又はその他の配列比較プログラムを用いるときは、同一性パーセントを参照ヌクレオチド配列の全長に渡って計算できるように、そして参照配列内のヌクレオチドの総数の最大5%の相同性におけるギャップが許容されるようにパラメータを設定する。

0147

ポリヌクレオチド変異体はコード領域、非コード領域、又は両方に改変を含んでいる。ある実施態様では、ポリヌクレオチド変異体はサイレント置換、付加、又は欠失を生じる改変を含んでいるが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変えない。ある実施態様では、ヌクレオチド変異体は、遺伝コード重縮に起因するサイレント置換によって産生する。ポリヌクレオチド変異体多種の理由、例えば、特定宿主のためにコドン発現を最適化するため(ヒトmRNA内のコドンをE.coliのような細菌性宿主が好むものに変える)によって産生する。

0148

本発明のポリペプチドは、インフルエンザHAに対する抗体又はその断片を含んでいる組み換えポリペプチド、天然のポリペプチド、又は合成ポリペプチドであってよい。本発明のいくつかのアミノ酸配列はタンパク質の構造又は機能に大きな影響を与えずに変異できることは当該技術分野で認識されている。従って、本発明は更に、十分な活性を示し、或いはインフルエンザHAに対するヒト化抗体、又はその断片の領域を包含しているポリペプチドの変異を包含している。このような突然変異体は欠失、挿入、逆位、反復、及び類型置換(type substitution)を包含する。

0149

ポリペプチド及び類縁体はタンパク質の通常部位ではない追加の化学部分を含むように更に修正できる。これらの誘導体化された部分は、タンパク質の溶解度、生物学的半減期又は吸収を改善できる。この部分はタンパク質の望ましい副作用などを減少又は取り除くこともできる。これらの部分の概説は Remington’s Pharmaceutical Science, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000) に見出すことができる。

0150

本明細書に記載されている単離されたポリペプチドは当該技術分野で公知の適切な方法の何れかによって作製できる。このような方法は直接タンパク質合成方法から、単離されたポリペプチドをコードするDNA配列を構築すること及び適切な形質変換宿主内でこれらの配列を発現することまで及ぶ。ある実施態様では、DNA配列は、目的の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離又は合成する組み換え技術を用いて構築する。任意で、配列に部位特異的突然変異によって突然変異を起こしてそれらの機能的類縁体をもたらしてもよい。例えば、Zoeller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984) を参照されたい。

0151

実施態様では、目的のポリペプチドをコードするDNA配列はオリゴヌクレオチドシンセサイザーを用いる化学合成によって構築することができる。このようなオリゴヌクレオチドは所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計して、そこで目的の組み換えポリペプチドが産生される宿主細胞が好むコドンを選択できる。単離された目的のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために標準的な方法を適用できる。例えば、全アミノ酸配列を逆翻訳された遺伝子を構築するために用いることができる。更に、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有しているDNAオリゴマーを合成できる。例えば、所望ポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さいオリゴヌクレオチドを合成した後ライゲートできる。個々のオリゴヌクレオチドは一般に、相補的構築のために5'又は3'突出部を含んでいる。

0152

構築されると(例えば、合成、部位特異的突然変異誘発、又は他の方法で)、特定の単離された目的のポリペプチドは発現ベクター内に挿入されて、任意で所望の宿主の発現に適している発現制御配列と操作可能に結合される。適切な構築は、ヌクレオチド配列、制限酵素地図、及び適切な宿主における生物活性ポリペプチドの発現によって確認できる。当該技術分野で周知のように、宿主内の形質転換遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子を、選択された発現宿主において機能する転写及び翻訳発現制御配列と操作可能に結合できる。

0153

インフルエンザHA抗体をコードするDNAを増幅して発現するために組み換え発現ベクターが用いられる。組み換え発現ベクターは、インフルエンザHA抗体をコードする合成の又はcDNA由来のDNA断片を有している複製可能なDNA構築物、又は哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫遺伝子由来の適切な転写又は翻訳調節エレメントに操作可能に結合している生物学的に等価の類縁体である。転写ユニットは一般に、(1)遺伝エレメント又は遺伝子発現に調節の役割を有しているエレメント(例えば、転写プロモーター又はエンハンサー)、(2)mRNA内に転写されてタンパク質に翻訳される構造又はコード配列、及び(3)以下に詳述するような、適切な転写及び翻訳開始又は終止配列の構築物から成っている。このような調節エレメントは転写を制御するオペレーター配列を包含できる。宿主における複製する能力は、一般に複製の起点によってもたらされ、そして形質転換細胞の認識を促進するための選択遺伝子を更に組み込むことができる。DNA領域を、これらが互いに機能的に関連したときに操作可能に結合される。例えば、シグナルペプチド分泌リーダー)に関するDNAは、それがポリペプチドの発現に関与する前駆体として発現されるならポリペプチドに関するDNAに操作可能に結合し;プロモーターは、それが配列の転写を制御するならコード配列に操作可能に結合し;或いはリボソーム結合部位は、それが複写を可能にするように位置付けられているならコード配列に操作可能に結合している。一般に、操作可能な結合は、隣接していることを意味して、分泌リーダーの場合は、隣接して解読フレーム内にあることを意味する。酵母発現系で用いるように意図されている構造エレメントは、宿主細胞による翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を許容するリーダー配列を含んでいる。また、リーダー又は輸送配列なしで組み換えタンパク質が発現される場合には、N−末端メチオニン残基を含むことができる。この残基は任意に、発現された組み換えタンパク質から次に切断されて最終産物をもたらす。

0154

発現制御配列及び発現ベクターの選択は宿主の選択次第である。多種多様の発現宿主/ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主のために有用な発現ベクターは、例えば、SV40、ウシパピローマウイルスアデノウイルス及びサイトメガロウイルス由来の発現制御配列から成るベクターを包含する。細菌性宿主のために有用な発現ベクターは、pCR1、pBR322、pMB9及びこれらの誘導体を含んでいる、大腸菌由来のプラスミド、M13及びフィラメント状一本鎖DNAファージのような、広い宿主域プラスミドのような、公知の細菌性プラスミドを包含する。

0155

ポリペプチドの発現のために適切な宿主細胞は、プロモーターの制御下における原核生物、酵母、昆虫、又は適切な高等真核生物を包含する。原核生物は、グラム陰性又はグラム陽性細菌、例えば、大腸菌又はバチルスを包含する。高等真核生物細胞は、哺乳動物起源の確立した細胞株を包含する。無細胞翻訳システムも利用できる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主と用いるための適切なクローニング及び発現ベクターは当該技術分野で周知である(Pouwels et al., Cloning Vectors: A Laboratory Mannual Elsvier, N.Y., 1985 を参照されたい)。

0156

多種の哺乳動物又は昆虫細胞培養系も組み換えタンパク質を発現するために有利に利用される。哺乳動物細胞における組み換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質は一般に正確に折り畳まれており、適切に改変されおり、そして完全に機能的であるので実施し得る。適切な哺乳動物宿主細胞株の例は、Gluzman (Cell 23:175, 1981)によって記載された、サル肝臓細胞のCOS−7株、及び、例えば、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLa及びBHK細胞株を包含する、適切なベクターを発現できるその他の細胞株を包含する。哺乳動物の発現ベクターは、複製起点、発現される遺伝子に結合した適切なプロモーターとエンハンサー、及び必須リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位、及び転写終止配列のような、その他の5'又は3'隣接非転写領域、及び5'又は3'隣接非翻訳領域のような非転写エレメントから成っていてもよい。昆虫細胞内で異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) によって総括されている。

0157

形質転換した宿主によって産生されたタンパク質は適切な方法で精製できる。このような標準的な方法は、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性及び粒度カラムクロマトグラフィーなど)、遠心分離、溶解度差、又はタンパク質精製のためのその他の標準技術の何れかを包含する。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、グルタチオン−S−トランスフェラーゼなどのような親和性標識をタンパク質に付加して、適切な親和性カラムを通過させることによって精製が容易に行われる。単離されたタンパク質は、タンパク質分解核磁気共鳴及びX線結晶学のような技術を用いて物理学的に特性化もできる。

0158

例えば、組み換えタンパク質を培養培地内に分泌するシステム由来の上澄液を、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、アミコン又はミリポアペリコン限外濾過ユニットを用いて最初に濃縮できる。濃縮工程に続いて、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用できる。また、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチルDEAE)基を有しているマトリックス又は基質を用いることができる。マトリックスはアクリルアミドアガロースデキストランセルロース、又はタンパク質の精製に通常用いられている別の種類であってよい。また、陽イオン交換工程を利用できる。適切な陽イオン交換体スルホプロピル又はカルボキシメチル基を含有している多種の不溶性マトリックスを包含する。最終的に、疎水性HP—LP媒体、例えば、ペンダントメチル又は別の炭化水素基を有しているシリカゲルを用いる、逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HLPC)を癌幹細胞タンパク質−Fc組成物を更に精製するために用いることができる。前記精製工程の幾つか又は全てを、様々な組み合わせで、均質な組み換えタンパク質を提供するために用いることもできる。

0159

細菌培養物中に産生される組み換えタンパク質は、例えば、細胞ペレットから最初の抽出、それに続く1回又はそれ以上の濃縮、脱塩水性イオン交換又はサイズ排除クロマトグラフィーによって単離できる。高速液体クロマトグラフィーHPLC)を最終精製工程に用いることができる。組み換えタンパク質の発現に用いた微生物細胞を、凍結融解サイクル超音波処理機械破砕又は細胞溶解剤の使用を含む、任意の従来法によって破砕できる。

0160

治療方法
本発明はインフルエンザ感染を治療又は予防する方法を提供する。

0161

態様では、本発明は、それを必要としている対象のインフルエンザ感染を治療又は予防する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は、感染と関連する症状を減少すること又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。

0162

態様では、本発明は、それを必要としている対象のインフルエンザウイルスを中和する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルスを調和し、それによって感染と関連する症状を減少すること又は緩和することを含んでいる、対象のインフルエンザウイルス感染を治療又は予防する。

0163

態様では、本発明はそれを必要としている対象のインフルエンザウイルス感染の確立方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルス感染の確立を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防する。

0164

態様では、本発明はそれを必要としている対象のインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法は対象のインフルエンザウイルス感染の伝播を阻害し、それによって感染に関連する症状を減少又は緩和する。

0165

態様では、本発明はインフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法は本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物の有効量を対象に投与することを含んでいる。方法はインフルエンザウイルスの対象の細胞内への侵入を阻害し、それによって感染に関連する症状を予防するか、或いは感染に関連する症状を減少又は緩和する。

0166

態様では、本発明はインフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する方法を提供する。方法はインフルエンザ感染を有しているか、又は進展の危険性がある細胞を、本明細書に記載されている抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは抗体又は抗体断片を含有している医薬組成物と接触させることを含んでいる。方法はインフルエンザウイルスの細胞内への侵入を阻害する。

0167

上記態様の何れかにおいて、インフルエンザはH1N1、H2N2、又はヒト適合H5株であってよい。

0168

上記態様の何れかにおいて、対象はインフルエンザ感染症に罹っているか又は発症する危険性がある。関連する実施態様では、対象は哺乳動物(例えば、ヒト)である。関連する実施態様では、対象はウイルス感染症に罹りやすい(例えば、妊婦、若年者乳幼児、高齢者)。

0169

上記態様又は実施態様の何れかにおいて、抗インフルエンザ抗体又は抗体断片、或いは医薬組成物は、筋肉内注射、静脈内注射、皮下注射、又は吸引によって投与される。

0170

(医薬組成物)
本発明は、本明細書に記載されている新規なインフルエンザHA抗体を含んでいる医薬組成物を提供する。実施態様では、医薬組成物は薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤を含んでいて、これは組成物を投与されている対象に有害な免疫応答の産生をそれ自体が誘発しない任意の医薬を含有し、そしてこれは過度の毒性なしで投与できる。本明細書で用いられる用語「薬学的に許容される」は、哺乳動物、そして特にヒトにおける使用について、連邦政府又は州政府の規制官庁によって承認された、或いは米国薬局方、欧州薬局方又はその他の一般に認められている薬局方に収載されていることを意味する。これらの組成物はインフルエンザ感染を治療及び/又は予防するために有用である。

0171

薬学的に許容される担体、希釈剤及びその他の賦形剤の詳細な考察は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (17th ed., Mack Publishing Company) 及び Remington: The Science and Practice of Pharmacy (21st ed., Lippincott Williams & Wilkins) にあり、これらは参照により本明細書に取り込まれている。医薬組成物の製剤は投与方法に適合していなければならい。実施態様では、医薬組成物はヒトへの投与に適していて、無菌、非粒子性そして/又は非発熱性にできる。

0172

薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤は、これに限定されないが、食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖、水、グリセロールエタノール、無菌等張水性緩衝液、及びこれらの組み合わせを包含する。

0173

湿潤剤乳化剤、及びラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムのような、滑沢剤、並びに着色剤放出剤コーティング剤甘味剤香味及び芳香剤保存剤、及び抗酸化剤も組成物に含ませることができる。

0174

薬学的に許容される抗酸化剤の例は、これに限定されないが:(1)アスコルビン酸、塩酸システイン重硫酸ナトリウムメタ重亜硫酸ナトリウム亜硫酸ナトリウムなどのような、水溶性抗酸化剤;(2)パルミチン酸アスコルビルブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没色子酸プロピル、α−コフロールなどのような、脂溶性抗酸化剤;及び(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような、金属キレート剤:を包含する。

0175

実施態様では、医薬組成物は、再構築に適している凍結乾燥粉末のような、固体形態液体溶液懸濁剤乳剤錠剤ピル、カプセル、徐放製剤、又は粉末として提供される。

0176

実施態様では、医薬組成物は、液体剤形、例えば、医薬組成物中の活性成分の量及び濃度を示している封入容器中で供給される。関連する実施態様では、医薬組成物の液体剤形は密封されている容器中で供給される。

0177

本発明の医薬組成物を製剤化する方法は従来の方法で当該技術分野において周知である(Remington and Remington’s を参照されたい)。当業者は所望の特性(例えば、投与経路、バイオセーフティー、及び放出プロフィール)を有している医薬組成物を容易に製剤化できる。

0178

医薬組成物を製造する方法は、活性成分を薬学的に許容される担体及び、任意に、1つ又はそれ以上の補助成分と一体化させる段階を含んでいる。医薬組成物は活性成分を液体担体、又は微粉化した固体担体、又は両方と均一にそして密に一体化させ、必要に応じて、その生成物成形することによって製造できる。多層剤形の製造を含む、医薬組成物を製造する更なる手法は、Ansel’s Pharmaceutical Dosage forms and Drug Delivery Systems (9th ed., Lippincott Williams and Wilkins) に記載されていて、これは参照により本明細書に取り込まれている。

0179

(送達方法)
本発明の医薬組成物は、経口及び非経口(例えば、局所、経皮、又は注射で)によって対象に投与できる。このような投与方法及びそこで用いるための適切な医薬組成物を製造する方法は、Gibaldi’s Drug Delivery Systems in Pharmaceutical Care (1st ed., American Society of Health-System Pharmacists) に記載されていて、これは参照により本明細書に取り込まれている。

0180

実施態様では、医薬組成物は固体製剤経口投与される。

0181

経口投与に適している医薬組成物は、カプセル、カシェー、ピル、錠剤、ロセンジ(通常は蔗糖及びアカシアガム又はトラガカントガムである風味付け基剤を用いる)、粉剤顆粒剤の形態で、或いは水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として、又は水中油型又は油中水型液体乳剤として、又はエリキシル剤又はシロップ剤として、又はトローチゼラチングリセリン、又は蔗糖とアカシアガムのような内部基剤を用いる)として、そして/又は洗口液などとして投与でき、それぞれは、活性成分として、所定量の本明細書に記載された化合物、その誘導体、又はその薬学的に許容される塩又はプロドラッグを含んでいる。活性成分はボーラス舐剤、又はペーストとしても投与できる。

0182

経口投与のための固体剤形(例えば、カプセル、錠剤、ピル、糖衣錠、粉剤、顆粒剤など)においては、活性成分を、クエン酸ナトリウム又はリン酸水素カルシウムのような、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤、及び/又は以下の何れか:(1)澱粉乳糖、蔗糖、ブドウ糖、マンニトール、及び/又はケイ酸のような、充填剤又は増量剤;(2)例えば、カルボキシメチルセルロースアルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、蔗糖及び/又はアカシアガムのような、結合剤;(3)グリセロールのような、保湿剤;(4)寒天炭酸カルシウム馬鈴薯又はタピオカ澱粉アルギン酸、ある特定のケイ酸塩、及び炭酸ナトリウムのような、崩壊剤;(5)パラフィンのような、溶液抑制剤;(6)四級アンモニウム化合物のような、吸収促進剤;(7)例えば、アセチルアルコール及びモノステアリン酸グリセロールのような湿潤剤;(8)カオリン及びベントナイト粘度のような、吸収剤;(9)タルクステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体のポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、及びこれらの混合物のような滑沢剤;及び(10)着色剤:と混合する。カプセル、錠剤、及びピルの場合は、医薬組成物は緩衝剤も含むことができる。ソフト及びハード充填ゼラチンカプセル内に増量剤を、そしてラクトース又は乳糖、並びに高分子量のポリエチレングリコールなどを用いて同じタイプの固体組成物も製造できる。

0183

錠剤は、任意に1つ又はそれ以上の補助成分とともに、圧縮又は成形によって作られる。圧縮錠は結合剤(例えば、ゼラチン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えば、デンプングリコール酸ナトリウム又は架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤、及び/又は分散剤を用いて製造できる。成形錠は不活性液体希釈剤で湿潤した粉末状の活性成分を適切な機械の中で成形することによって作製できる。

0184

錠剤及び、糖衣錠、カプセル、ピル、及び顆粒剤のような、その他の固体剤形は任意に、割線を入れるか或いは、腸溶コーティング及び当該技術分野で周知のその他のコーティングのような、コーティング又は外皮を用いて調製できる。

0185

医薬組成物は、例えば、所望の放出プロフィールをもたらす広い割合のヒドロキシメチルセルロース、その他の高分子物質、リポソーム及び/又はミクロスフェアを用いて、その活性成分の遅れた、延長された、又は制御された放出をもたらすようにも製剤化できる。医薬組成物は任意に乳白剤も含むことができて、活性成分を、任意に遅延的に、胃腸管のある特定の部分のみに、又は優先的に放出する組成物にできる。包埋組成物の例は、重合物質及びワックスを包含している。活性成分を、適切な場合は当該技術分野で周知の1つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤、又は希釈剤(例えば、Remington and Remington’s を参照されたい)と共に、マイクロカプセル化した剤形にもできる。

0186

医薬組成物は、例えば、細菌保持フィルター濾過することによって、或いは滅菌水、又は使用直前に滅菌注射用媒体に溶解できる固体組成物の形態の殺菌剤を取り込むことによって殺菌できる。

0187

実施態様では、医薬組成物は液体剤形で経口投与される。

0188

活性成分の経口投与用の液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ及びエリキシルを包含する。活性成分に加えて、液体剤形は、例えば、水又はその他の溶媒、可溶化剤のような、当該技術分野で通常用いられている不活性希釈剤及び、エチルアルコールイソプロピルアルコール炭酸エチル酢酸エチルベンジルアルコール安息香酸ベンジルプロピレングリコール、1,3−ブチレングリコール油類(特に、綿実落花生トウモロコシ胚芽オリーブ、ヒマシ及びゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール及びソルビタン脂肪酸エステル、並びにこれらの混合物のような、乳化剤を含有できる。不活性希釈剤に加えて、液体の医薬組成物は、湿潤剤、乳化及び懸濁化剤、香味、着色、芳香及び保存剤などのような、補助剤を含有できる。

0189

懸濁液は、活性成分に加えて、これに限定されないが、エトキシ化イソステアリルアルコールポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル類、微結晶セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天及びトラガカントガム、並びにこれらの混合物のような、懸濁化剤を含有できる。

0190

実施態様では、医薬組成物は、局所投与経皮投与、注射によるような、非経口方法で投与される。関連する実施態様では、医薬組成物は、注射、点滴又は移植(例えば、静脈内、筋肉内、関節内、皮下など)によって経口投与される。

0191

非経口用の組成物は単位剤形、例えば、アンプル又は数用量を含有していて、適切な保存剤を添加できる、バイアルで存在できる。このような組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、輸液用器具移植用送達用器具の形態であってよく、或いは使用前に水又はその他の適切な媒体と再構築する乾燥粉末として存在できる。エタノールのような、1つ又はそれ以上の補助賦形剤も使用できる。活性成分の他に、組成物は適切な非経口投与で許容される担体及び/又は賦形剤を含有できるか、或いは活性成分を制御放出のためにミクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに取り込むことができる。更に、組成物は懸濁化、可溶化、安定化、pH調節剤、及び/又は分散剤も含有することができる。

0192

医薬組成物は滅菌注射の形態にすることができる。このような組成物を製造するために、活性成分を非経口投与で許容される液体賦形剤に溶解又は懸濁する。例示的な賦形剤及び溶媒は、これに限定されないが、水、適量の塩酸、水酸化ナトリウム、又は適切な緩衝剤を加えて適切なpHに調節した水、1,3−ブタンジオールリンゲル液及び等張の塩化ナトリウム溶液を包含する。医薬組成物は1つ又はそれ以上の保存剤、例えば、p−ヒドロキシ安息香酸メチルエチル、n−プロピルも含有できる。溶解性を改善するために、溶解増強剤又は可溶化剤を加えることができ、或いは溶媒は10〜60w/w%のプロピレングリコールなどを含有することができる。

0193

医薬組成物は、1つ又はそれ以上の薬学的に許容される滅菌等張水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又は乳剤、或いは使用直前に滅菌注射用の溶液又は分散液に再構築できる滅菌粉末を含有できる。このような医薬組成物は抗酸化剤;緩衝剤;静菌剤;製剤を対象とする被投与者の血液と等張にする、溶質;懸濁化剤;増粘剤;保存剤などを含有することができる。

0194

本発明の医薬組成物で使用できる、適切な水性又は非水性単体の例は、水、エタノール、ポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのような)、及びこれらの適切な組み合わせ、オリーブ油のような、植物油、及びオレイン酸エチルのような、注射可能な有機エステルを包含する。例えば、レシチンのようなコーティング剤を用いて、分散液の場合は必須の粒子径を保持して、そして界面活性剤の使用によって、適切な流動性を保持できる。

0195

ある実施態様では、活性成分の効果を延長するために、皮下又は筋肉内注射から化合物の吸収を遅らせることが好ましい。これは、難水溶性の結晶又はアモルファスの液体懸濁液を用いることによって達成できる。活性成分の吸収は、結晶の大きさ及び結晶形によって決めることができる、その溶解速度によって決まる。あるいは、非経口投与される活性成分の遅延吸収は化合物を油性媒体に溶解又は懸濁することによって達成される。更に、注射用医薬形態の持続的吸収は、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような吸収を遅らせる物質の封入によってもたらすことができる。

0196

放出制御非経口化合物は、水性懸濁液、ミクロスフェア、マイクロカプセル、磁気ミクロスフェア、油性懸濁液、乳剤の形態にでき、或いは活性成分を生体適合性担体(複数を含む)、リポソーム、ナノ粒子、移植片又は輸液用容器に取り込むことができる。

0197

ミクロスフェア及び/又はマイクロカプセルの製造に用いる物質は、ポリグラクチン、ポリ−(シアノアクリルイソブチル)、ポリ(2−ヒドロキシエチル−L−グルタミン)及びポリ(乳酸)のような、生物分解性生体内分解性ポリマーを包含する。

0198

放出制御非経口製剤を製剤化するときに用いることができる生体適合性担体は、デキストランのような炭水化物、アルブミンのようなタンパク質、リポタンパク質又は抗体を包含する。

0199

移植片に用いるための物質は、非生物分解性、例えば、ポリジメチルシロキサン、又は例えば、ポリ(カプロラクトン)、ポリ(乳酸)、ポリ(グルコール酸)又はポリ(オルエステル)のような生物分解性であってよい。

0200

実施態様では、活性成分(複数を含む)はエアゾールで投与される。これは、化合物を含有している水性エアゾールリポソーム製剤、又は固体粒子を製造することによって達成される。非水性(例えば、フルオロカーボン噴霧剤)懸濁液を用いることができる。医薬化合物は、音波ネブライザーを用いて投与でき、これは化合物の分解をもたらす、せん断への暴露を最小にできる。

0201

通常、水性エアゾールは、通常の薬学的に許容される担体及び安定化剤と共に活性成分(複数を含む)の水性溶液又は懸濁液を処方することによって作られる。担体及び安定化剤は特定の化合物によって異なるが、一般に、非イオン性界面活性剤ツイーン類、プルロニック類、ポリエチレングリコール)、血清アルブミンのような無害のタンパク質、ソルビタンエステル類、オレイン酸レクチン、グリシンのようなアミノ酸、緩衝剤、糖又は糖アルコールを包含する。エアゾールは通常、等張溶液から製造される。

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