図面 (/)

この項目の情報は公開日時点(2014年9月22日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (9)

課題・解決手段

本明細書において、i)ポリペプチドを含む溶液イオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、およびii)変性剤を含む溶液を用いてポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを精製する段階を含む、ポリペプチドを精製するための方法が報告されており、ここて、イオン交換クロマトグラフィー材料が、イオン性リガンドが結合された架橋ポリスチレンジビニルベンゼン)のマトリックスを含み、そしてここで、イオン交換クロマトグラフィー材料に適用されるポリペプチドを含む溶液は、変性剤を有さず、イオン交換クロマトグラフィー材料に吸着されたポリペプチドは、変性剤を含む溶液を用いて一定の伝導率で回収される。

概要

背景

概要

本明細書において、i)ポリペプチドを含む溶液イオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、およびii)変性剤を含む溶液を用いてポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを精製する段階を含む、ポリペプチドを精製するための方法が報告されており、ここて、イオン交換クロマトグラフィー材料が、イオン性リガンドが結合された架橋ポリスチレンジビニルベンゼン)のマトリックスを含み、そしてここで、イオン交換クロマトグラフィー材料に適用されるポリペプチドを含む溶液は、変性剤を有さず、イオン交換クロマトグラフィー材料に吸着されたポリペプチドは、変性剤を含む溶液を用いて一定の伝導率で回収される。

目的

典型的には、リフォールディングの目的は、リフォールディング工程なしに産生された場合にタンパク質が有するよりも高い活性レベルを有するタンパク質を産生することである

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

ポリペプチドを精製するための方法であって、以下の工程:−変性剤を含む溶液を用いて一定の伝導率でイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを精製する工程、ここで、イオン交換クロマトグラフィー材料が、イオン性リガンドが結合された架橋ポリスチレンジビニルベンゼン)のマトリックスを含むを含む、方法。

請求項2

ポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程:−ポリペプチドをコードする核酸を含む原核または真核細胞を培養する工程、−細胞または/および培養培地からポリペプチドを回収する工程、−以下の工程を含むイオン交換クロマトグラフィー法でポリペプチドを精製する工程:−変性剤を含む溶液でイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを産生する工程、ここで、イオン交換クロマトグラフィー材料が、イオン性リガンドが結合された架橋ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)のマトリックスを含むを含む、方法。

請求項3

変性剤が、1種の変性剤であって、尿素グアニジン尿素誘導体、およびグアニジン誘導体を含む群より選択されることを特徴とする、請求項1〜2のいずれか一項記載の方法。

請求項4

イオン交換クロマトグラフィー材料が、陽イオン交換クロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。

請求項5

イオン性リガンドが、スルホプロピルリガンドまたはカルボキシメチルリガンドであることを特徴とする、請求項4記載の方法。

請求項6

イオン交換クロマトグラフィー材料が、陰イオン交換クロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。

請求項7

イオン性リガンドが、エチレンイミンリガンドまたは四級化リガンドであることを特徴とする、請求項6記載の方法。

請求項8

請求項1〜7のいずれか一項記載の方法であって、以下の工程:−変性剤を含む溶液を適用することによって、第1のイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収する工程、−回収されたポリペプチドを第2のイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、および−変性剤を含む溶液を適用することによって、第2のイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを得るまたは精製する工程を含むことを特徴とする、方法。

請求項9

第1のイオン交換クロマトグラフィー材料が陰イオン交換クロマトグラフィー材料であり、かつ第2のイオン交換クロマトグラフィー材料が陽イオン交換クロマトグラフィー材料であるか、または第1のイオン交換クロマトグラフィー材料が陽イオン交換クロマトグラフィー材料であり、かつ第2のイオン交換クロマトグラフィー材料が陰イオン交換クロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項8記載の方法。

請求項10

回収されたポリペプチドが、第2のイオン交換クロマトグラフィー材料への適用前にリフォールディングされることを特徴とする、請求項8〜9のいずれか一項記載の方法。

請求項11

請求項1〜10のいずれか一項記載の方法であって、精製工程が、以下の工程:−第1の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、−ポリペプチドを含む第2の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、および−変性剤を含む第4の溶液でポリペプチドを回収し、それによって産生または精製する工程を含み、その際、第1の溶液が第1の緩衝物質を含み、第2の溶液が第2の緩衝物質を含み、第4の溶液が第4の緩衝物質を含み、ここで、第4の緩衝物質が変性剤を含む、方法。

請求項12

請求項11記載の方法であって、第2の溶液の適用後および第4の溶液の適用前に、以下の工程:−第3の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、ここで、第3の溶液が、第3の緩衝物質を含むを含むことを特徴とする、方法。

請求項13

ポリペプチドが、配列番号01、配列番号02、配列番号03、および配列番号04のアミノ酸配列の群より選択されるアミノ酸配列を有することを特徴とする、請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。

請求項14

架橋ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)のマトリックスを含むイオン交換クロマトグラフィー材料から一定の伝導率値でポリペプチドを回収することへの尿素または尿素誘導体の使用。

技術分野

0001

本明細書において、変性剤を含む溶液を用いてイオンクロマトグラフィー材料からポリペプチド溶離することによる、ポリペプチドの精製のためのイオン交換クロマトグラフィー法報告されている。

0002

発明の背景
タンパク質は、今日の医学ポートフォリオにおいて重要な役割を果たしている。リコンビナントポリペプチドの産生のための発現系は、技術の現状において周知である。薬学的適用に使用するためのポリペプチドは、主として、E.coliなどの原核細胞、およびCHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞HEK細胞BHK細胞、PER.C6(登録商標)細胞などの哺乳動物細胞で産生される。

0003

ヒトへの適用のために、あらゆる薬学的物質が明確な基準を満たさなければならない。ヒトへの生物学的製剤の安全性を確保するために、例えば、重大な危害を及ぼすおそれのある核酸ウイルス、およびホスト細胞タンパク質を除去しなければならない。規制上の規格を満たすために、一つまたは複数の精製工程が製造プロセスに続かなければならない。とりわけ、純度処理量、および収率が、適切な精製プロセスを決定する際に重要な役割を果たす。

0004

微生物タンパク質(例えばプロテインAまたはプロテインアフィニティークロマトグラフィー)を用いたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー(例えば陽イオン交換スルホプロピルまたはカルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換アミノエチル樹脂)および混合モードイオン交換)、チオフィリック(thiophilic)吸着(例えば、β−メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いたもの)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニルセファロースアザ−アレノフィリック(aza-arenophilic)樹脂、またはm−アミノフェニルボロン酸を用いたもの)、金属キレートアフィニティークロマトグラフィー(例えば、Ni(II)−およびびCu(II)−アフィニティー材料を用いたもの)、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法など(ゲル電気泳動キャピラリー電気泳動など)の様々な方法が十分に確立されており、タンパク質の精製のために広く使用されている(例えばVijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102参照)。

0005

Necina, R.ら(Biotechnol. Bioeng. 60 (1998) 689-698)は、高電荷密度を示すイオン交換媒体による細胞培養上清からの直接的なヒトモノクローナル抗体捕捉を報告した。国際公開公報第89/05157号では、細胞培養培地陽イオン交換処理に直接供することによる、産物免疫グロブリンを精製するための方法が報告されている。マウス腹水からのモノクローナルIgG抗体一段階精製が、Danielsson, A., et al., J. Immun. Meth. 115 (1988) 79-88によって記載されている。イオン交換クロマトグラフィーによってポリペプチドを精製するための方法が、国際公開公報第2004/024866号に報告されており、その方法では、一つまたは複数の混入物質から関心が持たれるポリペプチドを分割するために勾配洗浄が使用される。EP 0 530 447では、三つのクロマトグラフィー段階の組み合わせによりIgGモノクローナル抗体を精製するための工程が報告されている。Wangら(Wang, H., et al., Peptides 26 (2005) 1213-1218)は、二段階陽イオン交換クロマトグラフィーによる、E.coliに発現されたhTFF3の精製を報告している。

0006

国際公開公報第2010/063717号では、ポリペプチドの精製が報告されている。タンパク質の精製および同定が国際公開公報第2008/002235号に報告されている。Cole, D.R.は、尿素含有緩衝液でのインスリンクロマトグラフィーを報告している(J. Biol. Chem. 235 (1960) 2294-2299。米国特許第4,129,560号では、非イオン洗剤を用いた高分子量ペプチドの精製工程が報告されている。より低レベルアイソフォーム不純物を有する成長ホルモンおよびそのアンタゴニスト調製方法が、国際公開公報第2004/031213号に報告されている。米国特許第6,451,987号では、タンパク質およびペプチドのイオン交換クロマトグラフィーが報告されている。インスリンを精製するための工程およびそのように調製されたインスリンが、EP 0 013 826に報告されている。

0007

発明の概要
ポリペプチドを、イオン交換クロマトグラフィー材料(陽イオンおよび/または陰イオン交換クロマトグラフィー材料)から、変性剤/カオトロピック剤を含む溶液を用いて、その際、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収する間、適用された溶液の伝導率は一定に維持され、すなわち、伝導率は一定に保たれて、回収できることが見出された。

0008

本明細書報告の一局面は、イオン交換クロマトグラフィーによって、結合および溶離モードでポリペプチドを得るまたは精製するための方法であって、以下の工程:
−変性剤を含む溶液を適用することによって、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収する工程、およびそれによってポリペプチドを得るまたは精製する工程、ここで、イオン交換クロマトグラフィー材料が、イオン性リガンドが結合された架橋ポリスチレンジビニルベンゼン)のマトリックスを含む
を含む、方法である。

0009

一態様では、その方法は、以下の工程:
−変性剤を含む溶液を適用することによって、第1のイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収する工程、
− 回収されたポリペプチドを第2のイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、および
− 変性剤を含む溶液を適用することによって、第2のイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを得るまたは精製する工程
を含む。

0010

一態様では、第1のイオン交換クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料であり、第2のイオン交換クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。

0011

一態様では、第1のイオン交換クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料であり、第2のイオン交換クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。

0012

一態様では、変性剤は尿素または尿素誘導体である。

0013

一態様では、変性剤は、2または3種の変性剤の混合物である。

0014

一態様では、回収に適用される溶液は、一定の伝導率を有する。

0015

一態様では、洗浄段階に適用される溶液は、一定の伝導率を有する。

0016

一態様では、回収に適用される溶液は、一定のpH値を有する。

0017

一態様では、洗浄工程に適用される溶液は、一定のpH値を有する。

0018

一態様では、その方法は、以下の工程:
ネイティブな形態のポリペプチドを含む溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、および
−変性剤を含む溶液を適用することによってイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを得るまたは精製する工程
を含む。

0019

一態様では、イオン交換クロマトグラフィー材料は陽イオン交換クロマトグラフィー材料である。一態様では、リガンドは、スルホプロピルまたはカルボキシメチルである。

0020

一態様では、イオン交換クロマトグラフィー材料は陰イオン交換クロマトグラフィー材料である。一態様では、リガンドはポリエチレンイミンまたは四級エチレンイミンである。

0021

一態様では、ポリペプチドは、抗体、または抗体フラグメント、または少なくとも1個の抗体ドメインを含む融合ポリペプチドである。

0022

一態様では、ポリペプチドは、テトラネクチン(tetranectin)−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質である。一態様では、テトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質は、配列番号01、または配列番号02、または配列番号03、または配列番号04のアミノ酸配列を有する。

0023

本明細書報告の一局面は、ポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程:
− ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する工程、
−細胞および/または培養培地からポリペプチドを回収する工程、
− ポリペプチドが封入体の形態で回収されたならば、ポリペプチドを可溶化および/またはリフォールディングする工程、
− 本明細書報告のイオン交換クロマトグラフィー法でポリペプチドを精製し、それによってポリペプチドを産生する工程
を含む、方法である。

0024

発明の詳細な説明
本明細書において、イオン交換クロマトグラフィー材料からのポリペプチドの回収に、変性剤を含む溶液が用いられ、回収工程に使用される溶液の伝導率が一定に維持される、ポリペプチドを精製するための結合および溶離モードで実施されたスケーラブルイオン交換クロマトグラフィー法が報告されている。

0025

用語「適用する」およびその文法同義語は、関心が持たれる被精製物質を含有する溶液が固定相と接触される、精製法の一部分工程を意味する。これは、a)固定相が位置しているクロマトグラフィー装置に溶液が添加されること、またはb)関心が持たれる物質を含む溶液に固定相が添加されることを意味する。a)の場合、関心が持たれる被精製物質を含有する溶液が、固定相を通過し、固定相と溶液中の物質との間の相互作用が可能になる。例えばpH、伝導率、塩濃度、温度、および/または流速などの条件に応じて、溶液の一部の物質が固定相に結合され、それゆえに溶液から除去される。他の物質は溶液中に残る。溶液中に残っている物質は、通過画分中に見出すことができる。「通過画分」は、その起源に関係なく、クロマトグラフィー装置通過後に得られた溶液を意味する。通過画分は、関心が持たれる物質を含有する、適用された溶液、あるいはカラムフラッシュするために使用される、または固定相に結合した1種もしくは複数の物質の溶離を引き起こすために使用される緩衝液のいずれかでありうる。一態様では、クロマトグラフィー装置は、カラムまたはカセットである。関心が持たれる物質を、精製された形態またはさらには実質的に均一な形態で得るために、精製工程の後に、関心が持たれる物質を例えば沈殿塩析限外濾過ダイアフィルトレーション凍結乾燥、アフィニティークロマトグラフィー、または溶媒体積減少などの当業者によく知られた方法によって溶液から回収することができる。b)の場合、固定相が、例えば固体として、関心が持たれる被精製物質を含有する溶液に添加され、固定相と溶液中の物質との間の相互作用が可能になる。相互作用の後に、固定相が例えば濾過によって除去され、関心が持たれる物質は、固定相に結合して固定相と共に溶液から除去されるか、または関心が持たれる物質は、固定相に結合せず、溶液中に残るかのいずれかである。

0026

本出願内で使用される用語「緩衝」は、酸性または塩基性物質の添加または有利によるpH変化が緩衝物質によってならされている溶液を意味する。そのような効果を招く任意の緩衝物質を使用することができる。一態様では、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、2−(N−モルホリノエタンスルホン酸もしくはその塩、イミダゾールもしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、またはトリス(ヒドロキシメチルアミノメタン(TRIS)もしくはその塩より選択される。一態様では、緩衝物質は、イミダゾールもしくはその塩またはヒスチジンもしくはその塩より選択される。場合により、緩衝溶液は、追加的な無機塩も含みうる。一態様では、無機塩は、塩化ナトリウム硫酸ナトリウム塩化カリウム硫酸カリウムクエン酸ナトリウム、およびクエン酸カリウムより選択される。

0027

「ポリペプチド」は、天然に産生されたものであろうと合成的に産生されたものであろうと、ペプチド結合によって結合したアミノ酸から成るポリマーである。約20個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは、「ペプチド」と呼ぶことができ、一方で、2個以上のポリペプチドから成る分子または100個を超えるアミノ酸残基のポリペプチドを1個含む分子は、「タンパク質」と呼ぶことができる。ポリペプチドは、また、糖質基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含みうる。非アミノ酸成分は、ポリペプチドが発現される細胞によって付加される場合があり、細胞の種類に応じて変動しうる。ポリペプチドは、本明細書において、そのアミノ酸主鎖構造またはそれをコードする核酸に関して定義される。糖質基などの付加は、一般に明記されないが、それでもなお存在しうる。

0028

用語「抗体」は、少なくとも2本のポリペプチド軽鎖および2本のポリペプチド重鎖を含むタンパク質を意味する。各ポリペプチド重鎖および軽鎖は、抗原と相互作用するための結合ドメインを含む可変領域(一般にポリペプチド鎖アミノ末端部分)を含む。各ポリペプチド重鎖および軽鎖は、また、多様な免疫系細胞、いくつかの食細胞および古典的補体系の第1成分(C1q)を含めたホスト組織または因子への抗体の結合を媒介しうる定常領域(一般にカルボキシル末端部分)を含む。典型的には、ポリペプチド軽鎖および重鎖は、それぞれ、本質的に可変領域、すなわちVLまたはVH、ならびに完全定常領域、すなわちポリペプチド軽鎖の場合はCL、またはポリペプチド重鎖の場合はCH1、CH2、CH3、および場合によりCH4から成る完全鎖である。本発明による抗体の可変領域は、他のアイソタイプの定常領域と接ぎ合わせることができる。例えば、あるアイソタイプの重鎖の可変領域をコードするポリヌクレオチドは、別の重鎖クラス(またはサブクラス)の定常領域をコードするポリヌクレオチドと接ぎ合わせることができる。

0029

抗体は、例えばFv、Fab、およびF(ab)2ならびに1本鎖を含めた多様な形態で存在しうる(例えばHuston, J.S., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988) 5879-5883; Bird, R.E., et al., Science 242 (1988) 423-426;ならびに一般に、Hood, et al., Immunology, Benjamin N.Y., 2nd edition, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. (1984)、およびHunkapiller, T. and Hood, L., Nature 323 (1986) 15-16)。一態様では、抗体は、モノクローナル抗体、単離された重鎖もしくは軽鎖、または定常領域のみから成る重鎖もしくは軽鎖ばかりでなく、そのフラグメントより選択される。

0030

用語「一定」は、ある値が最大で10%の相対変化を有するレベルに維持されることを意味する。一態様では、回収工程における溶液の伝導率は、最大で±10%の変化で一定に維持される。一態様では、回収工程における溶液の伝導率は、最大で±5%の変化で一定に維持される。一態様では、回収工程における溶液の伝導率は、最大で±2%の変化で一定に維持される。

0031

用語「結合および溶離モード」は、クロマトグラフィー精製法を行う一方法を意味する。本明細書において、関心が持たれる被精製ポリペプチドを含有する溶液は、固定相、特に固相に適用され、その際、関心が持たれるポリペプチドは、固定相と相互作用し、その上に保持される。関心が持たれない物質は、それぞれ通過画分または上清と共に除去される。その後、関心が持たれるポリペプチドは、第2段階で溶離溶液を適用することによって固定相から回収される。

0032

用語「封入体」は、原核細胞の全ての細胞成分を含めた総細胞タンパク質のかなりの部分を構成する、関心が持たれる凝集ポリペプチドの密な細胞内塊を意味する。

0033

用語「変性」は、ネイティブな構造ではない二次、三次、および/または四次構造を有するポリペプチドの形態を意味する。この非ネイティブ形態のポリペプチドは、可溶性でありうるが、同時に生物学的に不活性コンフォメーションでありうる。または、ポリペプチドは、不溶性であって、例えばミスマッチまたは未形成のジスルフィド結合を有する生物学的に不活性なコンフォメーションでありうる。この不溶性ポリペプチドは、封入体内に包含される場合があるが、その必要はない。

0034

用語「リフォールディングされた」は、変性形態から得られたポリペプチドを表す。典型的には、リフォールディングの目的は、リフォールディング工程なしに産生された場合にタンパク質が有するよりも高い活性レベルを有するタンパク質を産生することである。フォールディングされたタンパク質分子は、最小の自由エネルギーを有するコンフォメーションで最も安定である。大部分の水溶性タンパク質は、大部分の疎水性アミノ酸が水から離れて分子内部に入るようにフォールディングする。タンパク質を一緒に保持している弱い結合は、ポリペプチドをアンフォールディングさせる、すなわち変性させるいくつかの処理によって破壊することができる。フォールディングされたタンパク質は、アミノ酸自体とそれらの環境との間の、イオン結合ファンデルワールス相互作用、水素結合、ジスルフィド結合および共有結合を含めた数種の相互作用の産物である。

0035

本明細書に使用される用語「変性(denaturedまたはdenaturized)」は、ネイティブな状態またはリフォールディングした状態の分子において存在するイオン結合および共有結合ならびにファンデルワールス相互作用が破壊されたポリペプチドを表す。ポリペプチドの変性は、例えば、8M尿素、メルカプトエタノールなどの還元剤、熱、pH、温度および他の化学物質を用いた処理によって達成することができる。8M尿素などの試薬は、水素結合と疎水性結合との両方を破壊し、そしてメルカプトエタノールも添加された場合、システイン同士の間で形成されたジスルフィド架橋(S−S)は、2個の−S−H基に還元される。同様に、ネイティブな状態またはリフォールディングした状態でジスルフィド結合を含むポリペプチドのリフォールディングは、タンパク質がジスルフィド結合を再形成するために、システイン残基上に存在する−S−H基の酸化を要しうる。

0036

互換的に使用できる用語「カオトロピック剤」または「変性剤」は、ポリペプチドの三次元構造を歪める化合物を意味する。この工程も変性と呼ばれる。カオトロピック剤は、水素結合またはファンデルワールス力などの非共有結合力によって相互作用を歪める/破壊する。一態様では、カオトロピック剤は、ブタノールエタノール、1−および2−プロパノール塩化グアニジニウム塩化マグネシウムドデシル硫酸ナトリウムラウリル硫酸ナトリウム、尿素、およびチオ尿素を含む群より選択される。

0037

用語「ネイティブな形態」は、ポリペプチドの形態であって、ポリペプチドがその生物学的活性を有する二次、三次、および/または四次構造を有する形態を意味する。

0038

用語「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、共有結合した荷電置換基を有する、固定された(immobile)高分子量マトリックスを意味する。全体的な電荷中性のために、共有結合していない対イオンが、イオン相互作用によって荷電置換基と結合している。「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、その共有結合していない対イオンを、周囲の溶液の同様に荷電した結合パートナーまたはイオン交換する能力を有する。その交換可能な対イオンの電荷に応じて、「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、「陽イオン交換クロマトグラフィー材料」または「陰イオン交換クロマトグラフィー材料」と呼ばれる。荷電基(置換基)の性質に応じて、「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、例えば陽イオン交換材料の場合、スルホン酸もしくはスルホプロピル樹脂(S)、またはカルボキシメチル樹脂(CM)と呼ばれる。荷電基/置換基の化学的性質に応じて、「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、追加的に、共有結合した荷電置換基の強度に応じて強または弱イオン交換材料として分類することができる。例えば、強陽イオン交換材料は、荷電置換基としてスルホプロピル基などのスルホン酸基を有し、弱陽イオン交換材料は、荷電置換基としてカルボキシメチル基などのカルボン酸基を有する。強陰イオン交換材料は、第四級アンモニウム基を有し、弱陰イオン交換材料は、荷電置換基としてジエチルアミノエチル基を有する。

0039

一般に、イオン交換クロマトグラフィー工程の位置は、ポリペプチドの多工程精製シーケンスの中で可変である。

0040

ポリペプチドを精製するための方法は、十分に確立されており、広く使用されている。それらの方法は、単独で、または組み合わせて採用される。そのような方法は、例えば、錯体化した金属イオンを有するチオールリガンド(例えばNi(II)−およびCu(II)−アフィニティー材料を用いたもの)または微生物由来タンパク質(例えばプロテインAまたはプロテインGアフィニティークロマトグラフィー)を用いたアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー(例えば陽イオン交換(カルボキシメチル樹脂)、陰イオン交換(アミノエチル樹脂)および混合モード交換クロマトグラフィー)、チオフィリック吸着(例えば、β−メルカプトエタノールおよび他のSHリガンドを用いたもの)、疎水性相互作用または芳香族吸着クロマトグラフィー(例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック樹脂、またはm−アミノフェニルボロン酸を用いたもの)、サイズ排除クロマトグラフィー、および分取用電気泳動法(ゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動など)である。

0041

免疫グロブリンの精製プロセスは、一般に、多工程クロマトグラフィー部分を含む。第一工程では、非免疫グロブリン性のポリペプチドおよびタンパク質が、アフィニティークロマトグラフィーによって、例えばプロテインAを用いて免疫グロブリン画分から分離される。その後、イオン交換クロマトグラフィーを行うことができる。最終的に、第3のクロマトグラフィー工程を行って、免疫グロブリンモノマーを同クラスのマルチマーおよびフラグメントから分離することができる。時に、凝集物の量が高いので(5%以上)、第3の精製工程でそれらを効率的に分離することが不可能であり、さらなる精製工程が必要になる。

0042

ポリペプチドを、イオン性リガンドが結合された架橋ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)のマトリックスを含むイオン交換クロマトグラフィー材料から、変性剤を含む溶液を用いて、その際、回収の間、溶液の伝導率は一定に保たれて、回収できることが見出された。一般に、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収するために、イオン強度の増加が用いられるので、この発見は非常に意外であった。同時に、このクロマトグラフィー材料は、工業生産規模の分離のために十分な結合能を有する。

0043

したがって、本明細書報告の一局面は、ポリペプチドを得るまたは精製するための方法であって、以下の工程:
−変性剤を含む溶液を適用することによってイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによってポリペプチドを得るまたは精製する工程、
ここで、イオン交換クロマトグラフィー材料が、イオン性リガンドが結合された架橋ポリ(スチレン−ジビニルベンゼン)のマトリックスを含む
を含む、方法である。

0044

変性剤は、結合しているポリペプチドを回収するために使用されるので、イオン交換クロマトグラフィー材料に適用される、ポリペプチドを含む溶液は、変性剤を有さない。イオン交換クロマトグラフィー材料上に保持されるポリペプチドは、尿素または尿素誘導体などの変性剤を含む溶液を用いて一定の伝導率で回収される。

0045

それゆえに、本明細書報告の方法は、結合および溶離モードで実施され、すなわち、ポリペプチドは、最初にイオン交換クロマトグラフィー材料に結合され、その後、さらなる一工程でイオン交換クロマトグラフィー材料から回収される。間欠的な洗浄工程を本明細書報告の方法に含めることができる。これらの洗浄工程で、適用される溶液(1種または複数)は、実質的に変性剤を有さない。用語「実質的に変性剤を有さない」は、変性剤が、適用された(洗浄)溶液中に存在しうるが、イオン交換材料からポリペプチドを回収するために必要な濃度未満の濃度で存在しうることを意味する。

0046

本明細書報告の方法において、全ての溶液は、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収するための溶液を除き、変性剤を有さない、すなわち含有しない。一態様では、変性剤を含む溶液は水溶液である。さらなる一態様では、変性剤を含む溶液は、有機溶媒および/または脂肪族アルコールを含まない、すなわち有さない。さらなる一態様では、変性剤を含む溶液は、水、変性剤、緩衝物質、および場合により1種または2種または3種の無機塩から成る。

0047

本出願内で互換的に使用できる用語「変性剤」または「カオトロピック剤」は、ポリペプチドをそのネイティブな形態から非ネイティブな形態、すなわち変性形態に変える化合物を意味する。変性剤は、一般にカオトロピック剤である。例示的な変性剤は、尿素および尿素誘導体、グアニジンおよびグアニジン誘導体テトラアルキルアンモニウム塩長鎖スルホン酸エステル、および過塩素酸リチウムである。

0048

尿素の添加は、より正確には尿素の濃度変化は、溶液の伝導率に影響せず、すなわち、溶液の伝導率は、尿素の添加または濃度変化を受けても一定のままである。

0049

一態様では、変性剤は尿素または尿素誘導体である。

0050

一態様では、変性剤は尿素である。一態様では、尿素は濃度4mol/l〜9mol/lを有する。

0051

一態様では、変性剤はチオ尿素である。一態様では、チオ尿素は濃度1.5mol/l〜3mol/lを有する。

0052

一態様では、変性剤は、2または3種の変性剤の混合物である。一態様では、変性剤は、尿素とチオ尿素との混合物である。一態様では、変性剤は尿素とグアニジニウム塩との混合物である。

0053

本明細書報告の局面の一態様では、ポリペプチドを精製または得るための方法は、
− 第1の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用して、コンディショニングされたイオン交換クロマトグラフィー材料を産生する工程、
− ポリペプチドを含む第2の溶液を、コンディショニングされたイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
− 場合により、第3の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
−変性剤を含む第4の溶液を用いて、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによって精製または得る工程
を含む。

0054

第1および第2の溶液は、実質的に変性剤を有さない。第3の溶液は、実質的に変性剤を有さない。

0055

ポリペプチドは、CHO細胞、HEK細胞およびE.coliなどの真核および原核細胞でリコンビナント産生することができる。ポリペプチドが原核細胞で産生される場合、そのポリペプチドは、一般に不溶性封入体の形態で得られる。封入体は、原核細胞および培養培地から容易に回収することができる。封入体内に不溶性形態で得られたポリペプチドは、精製および/またはリフォールディング手順を実施できる前に可溶化しなければならない。

0056

それゆえに、本明細書報告の第2の局面は、ポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程:
− ポリペプチドをコードする核酸を含む原核または真核細胞を培養する工程、
− 原核もしくは真核細胞または/および培養培地からポリペプチドを回収する工程、
− 場合により、ポリペプチドが封入体の形態で回収されるならば、ポリペプチドを可溶化および/またはリフォールディングする工程、
− 本明細書報告のイオン交換クロマトグラフィー法でポリペプチドを精製し、それによってポリペプチドを産生する工程
を含む、方法である。

0057

一態様では、イオン交換クロマトグラフィー法は、以下の工程:
− 第1の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用して、コンディショニングされたイオン交換クロマトグラフィー材料を産生する工程、
−ポリペプチドを含む第2の溶液を、コンディショニングされたイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程、
− 場合により、第3の溶液をイオン交換クロマトグラフィー材料に適用する工程(洗浄工程)、
− 1種または複数の変性剤を含む第4の溶液を用いてイオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収し、それによって産生する工程
を含み、その際、第1〜第3の溶液が、変性剤を有さない。

0058

以下に、前に報告されたような全局面の種々の態様を提示する。

0059

一態様では、第1の溶液は、第1の緩衝物質を含み、第2の溶液は、第2の緩衝物質を含み、第3の溶液は、第3の緩衝物質を含み、第4の溶液は、第4の緩衝物質を含み、その際、第4の緩衝物質は、1種または複数の変性剤を含む。

0060

一態様では、第2の緩衝物質および第3の緩衝物質および第4の緩衝物質は、全て異なる緩衝物質である。

0061

一態様では、第1の溶液および/または第2の溶液および/または第3の溶液は、変性剤を有さない。一態様では、第3の溶液は、実質的に変性剤を有さない。

0062

一態様では、第1の溶液の適用は、3〜20カラム体積にわたる。一態様では、第1の溶液の適用は、3〜10カラム体積にわたる。

0063

一態様では、第2の溶液の適用は、1〜10カラム体積にわたる。

0064

一態様では、第3の溶液の適用は、1〜10カラム体積にわたる。

0065

イオン交換クロマトグラフィー材料は、第1段階において緩衝溶液でコンディショニングされる。この溶液は、変性剤を有さず、すなわち変性剤を含まない。コンディショニングの緩衝物質、すなわち第1の緩衝溶液は、ポリペプチドを含む第2の溶液の緩衝物質と同一であるか、または異なりうる。

0066

その後、ポリペプチドを含む第2の溶液が、コンディショニングされたイオン交換クロマトグラフィー材料に適用される。この工程において、ポリペプチドは、イオン交換クロマトグラフィー材料上に保持される。この溶液は変性剤を含まない。ローディングの緩衝物質、すなわち第2の緩衝溶液は、第3の溶液の緩衝物質と同一であるか、または異なりうる。

0067

イオン交換クロマトグラフィー材料にポリペプチドをロード後に、場合により、洗浄溶液、すなわち第3の溶液を、ロードされたイオン交換クロマトグラフィー材料に適用することができる。この溶液は、実質的に変性剤を有さない。

0068

最終的に、イオン交換クロマトグラフィー材料からポリペプチドを回収するために、回収溶液、すなわち第4の、1種または複数の変性剤を含む溶液がクロマトグラフィー材料に適用される。

0069

一態様では、ポリペプチドを精製または得るための方法は、カラムクロマトグラフィー法である。

0070

一態様では、回収工程における溶液の伝導率は一定である。

0071

一態様では、回収工程における溶液のpH値は一定である。

0072

異なる工程でイオン交換クロマトグラフィー材料に適用される体積は、相互に独立して3〜20カラム体積、一態様では4〜10カラム体積である。

0073

一態様では、イオン交換クロマトグラフィー材料は、官能基誘導体化されたポリスチレンジビニルベンゼン製である。一態様では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、四級化ポリエチレンイミン官能基で誘導体化されたポリスチレンジビニルベンゼンである。一態様では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、スルホプロピル官能基で誘導体化されたポリスチレンジビニルベンゼンである。

0074

本明細書報告の方法は、以下に、国際公開公報第2012/028526号報告のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質および国際公開公報第2012/007495号報告の抗TSLPレセプター抗体を用いて例示される。

0075

以下の実施例および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示されている。本発明の精神から逸脱することなしに、示された手順に改変を加えることができることが理解されている。

図面の簡単な説明

0076

塩化ナトリウム伝導率勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号02のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
尿素洗浄、イソプロパノール洗浄および塩酸グアニジニウム勾配溶離を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
尿素洗浄、塩酸グアニジニウム洗浄および塩化ナトリウム勾配溶離を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
尿素洗浄、塩酸グアニジニウム洗浄および塩化ナトリウム勾配溶離を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号02のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陽イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製のクロマトグラムである。
トリス緩衝液洗浄および尿素勾配溶離を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの抗TSLPレセプター抗体の精製のクロマトグラムである。

0077

実施例1
材料および方法:
特に明記しない限り、種々のクロマトグラフィー法は、クロマトグラフィー材料の製造業者マニュアル準拠して行った。

0078

リコンビナントDNA技法
DNAを操作するために、Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1989)記載の標準法を用いた。分子生物学的試薬は、製造業者の説明書に準拠して使用した。

0079

タンパク質の決定:
アミノ酸配列に基づき計算されたモル吸光係数を用いて、参照波長320nmで280nmの吸光度OD)を決定することによって、タンパク質濃度を決定した。

0080

サイズ排除HPLC
クロマトグラフィーは、Tosoh Haas TSK3000 SWXLカラムを用いてASI-100 HPLCシステムで行った(Dionex, Idstein, Germany)。溶離ピークは、UVダイオードアレイ検出器(Dionex)によって280nmでモニターした。濃縮試料を1mg/mlに溶解後、安定なベースラインが達成されるまで、200mMリン酸二水素カリウムおよび250mM塩化カリウムから成る緩衝液(pH7.0)でカラムを洗浄した。分析実施は、均一濃度条件で流速0.5ml/minを用いて室温で30分間行った。クロマトグラムは、Chromeleon(Dionex, Idstein, Germany)を用いて手作業で積分した。

0081

逆相HPLC(RP−HPLC):
純度はRP−HPLCによって分析する。アッセイは、Phenomenex C18カラムでアセトニトリル水性FA勾配を用いて行う。溶離プロファイルは、215nmのUV吸光度としてモニターする。溶離した物質のパーセンテージは、溶離したタンパク質の合計ピーク面積に基づき計算する。

0082

DNA閾値システム:
例えばMerrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照されたい。

0083

ホスト細胞タンパク質の決定:
血清アルブミンストレプトアビジンとの混合物を、マイクロタイタープレートウェルの壁にコーティングする。HCPに対するヤギ由来ポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄工程の後に、マイクロタイタープレートの異なるウェルを、異なる濃度のHCP較正シークエンスおよび試料溶液と共にインキュベーションする。インキュベーション後に、結合していない試料物質を、緩衝溶液で洗浄することによって除去する。検出のために、ウェルを、抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベーションし、結合したホスト細胞タンパク質を検出する。固定されたペルオキシダーゼ活性を、ABTSと共のインキュベーションおよび405nmでの検出によって検出する。

0084

DNAの決定:
ビオチンを、マイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、1本鎖DNAおよびビオチン化本鎖DNA結合タンパク質反応混合物を添加した。結合タンパク質は、DNAと結合することができ、ビオチン化された。このようにして、DNAを試料混合物から特異的に除去することが可能であった。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチン、および1本鎖DNA結合タンパク質とカップリングしたビオチンと結合した。ウレアーゼとカップリングしたDNA特異的抗体を、この複合体全体に添加した。尿素の添加は、尿素の加水分解を招き、それがpHの局所変化を引き起こした。この変化は、表面電位の変化として検出することができた。表面電位の変化は、結合したDNAの量に比例した。1本鎖DNAは、プロテイナーゼ消化およびSDSを用いた変性によって得られた。

0085

封入体からのポリペプチドを単離、可溶化およびリフォールディングするための一般法
引用文献で行われた方法に加えて、封入体の調製は、例えば、Rudolphらによる方法(Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99)にしたがって行うことができる。封入体は−70℃で保存した。封入体の可溶化も同様に、Rudolphらによる方法(Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99)にしたがって行うことができる。

0086

実施例2(比較実施例)
塩化ナトリウム伝導率勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:POROS(登録商標)HQ
ロード:ポリペプチド443mg
カラムのロード:30mg/ml
溶離法:0M〜1M塩化ナトリウムの直線勾配

0087

結果:
図1から分かるように、融合タンパク質は、明確なピークで得ることができない。分析結果を次表に示す。

0088

0089

実施例3
一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:POROS(登録商標)HQ
ロード:ポリペプチド366mg
カラムのロード:24.8mg/ml
溶離法:0M〜6M尿素の直線勾配

0090

結果:
図2から分かるように、融合タンパク質は、明確なピークで得ることができる。分析結果を次表に示す。

0091

0092

実施例4
一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号02のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:POROS(登録商標)HQ
溶離法:0M〜6M尿素の直線勾配

0093

結果:
図3から分かるように、融合タンパク質は明確なピークで得ることができる。分析結果を次表に示す。

0094

0095

実施例5(比較実施例)
尿素洗浄、イソプロパノール洗浄および塩酸グアニジニウム勾配溶離を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:Q−Sepharose(登録商標)FF(GE Healthcare)
ロード:ポリペプチド281mg
カラムのロード:15mg/ml
平衡化:30mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0);5.94mS/cm
尿素洗浄:6M尿素溶液(pH8.0);435μS/cm
2−プロパノール洗浄:20%(v/v)2−プロパノール
溶離溶液:6M塩酸グアニジニウム(pH8.0);LF=278mS/cm
洗浄工程:5カラム体積の6M尿素溶液で洗浄;
5カラム体積の20%2−プロパノールで洗浄
溶離法:10カラム体積の0M〜6M塩酸グアニジニウムの直線勾配

0096

結果:
図4から分かるように、融合タンパク質は、尿素溶液および2−プロパノール溶液を用いた洗浄工程の間に得ることができない。溶離は、塩酸グアニジニウム溶液を用いることでのみ成し遂げることができる。

0097

実施例6(比較実施例)
尿素洗浄、塩酸グアニジニウム洗浄および塩化ナトリウム勾配溶離を与えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:Q−Sepharose(登録商標)FF(GE Healthcare)
ロード:ポリペプチド280mg
カラムのロード:20mg/ml
平衡化:30mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0);5.9mS/cm
尿素洗浄:6M尿素溶液(pH8.0);435μS/cm
塩酸グアニジニウム溶液:0.1M塩酸グアニジニウム(pH8.0)
溶離溶液:50mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶かした1M塩化ナトリウム;91.7mS/cm
洗浄工程:5カラム体積の6M尿素溶液で洗浄;5カラム体積の0.1M塩酸グアニジニウム溶液で洗浄
溶離法:10カラム体積の0M〜1M塩化ナトリウムの直線勾配

0098

結果:
図5から分かるように、各洗浄工程で融合タンパク質の小画分だけを得ることができる。分析結果を次表に示す。

0099

0100

実施例7(比較実施例)
尿素洗浄、塩酸グアニジニウム洗浄および塩化ナトリウム勾配溶離を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号02のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:Q−Sepharose(登録商標)FF(GE Healthcare)
ロード:ポリペプチド239mg
カラムのロード:15mg/ml
平衡化:30mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0);5.9mS/cm
尿素洗浄:6M尿素溶液(pH8.0)
塩酸グアニジニウム溶液:0.1M塩酸グアニジニウム(pH8.0)
溶離溶液:20mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶かした0.35M塩化ナトリウム
洗浄工程:4カラム体積の6M尿素溶液で洗浄;4カラム体積の0.1M塩酸グアニジニウム溶液で洗浄
溶離法:0.35M塩化ナトリウムを用いて7カラム体積にわたり段階溶離

0101

結果:
図6から分かるように、各洗浄工程で融合タンパク質の小画分のみを得ることができる。3回の実施の分析結果を次表に示す。

0102

0103

実施例8a
一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陽イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:POROS(登録商標)HS
ロード:ポリペプチド5.58g
洗浄1:pH3.0に調整した50mMギ酸ナトリウム
洗浄2:pH8.0に調整した1M塩化ナトリウム、30mMリン酸カリウム緩衝液
洗浄3:pH8.0に調整した30mMリン酸カリウム緩衝液
溶離溶液:10mMリン酸カリウム緩衝液(pH8.0)に溶かした6M尿素
溶離法:3カラム体積にわたり洗浄1、
20カラム体積にわたり洗浄2、
5カラム体積にわたり洗浄3
10カラム体積の0M〜6M尿素の直線勾配

0104

結果:
図7から分かるように、融合タンパク質を明確なピークで得ることができる。分析結果を次表に示す。

0105

0106

実施例8b
陽イオン交換クロマトグラフィー材料に続く、一定の伝導率および一定のpH値で尿素勾配を加えた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの配列番号01のテトラネクチン−アポリポタンパク質A−I融合タンパク質の精製
樹脂:POROS(登録商標)HQ
ロード:実施例8aで得られたポリペプチド3.19g(上記参照)

0107

結果:
第2のクロマトグラフィー工程の分析結果を次表に示す。

0108

0109

実施例9
トリス緩衝液洗浄および尿素勾配溶離を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの抗TSLPレセプター抗体の精製
樹脂:POROS(登録商標)HQ
ロード:ポリペプチド189mg
トリス洗浄:10mM塩化ナトリウムを有する5mMトリス緩衝液(pH8.4);4mS/cm
溶離溶液:10mM塩化ナトリウムおよび6M尿素を有する5mMトリス緩衝液(pH8.4);4mS/cm
洗浄工程:3カラム体積のトリス緩衝溶液で洗浄
溶離法:30カラム体積で0M〜6M尿素の直線勾配

0110

結果:
図8から分かるように、抗体を得ることができる。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ