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課題・解決手段

本発明は、胎児骨端組織、胎児のアキレス腱組織および胎児の皮膚組織からなり、創傷および組織の修復方法に用いられる、細胞型の迅速な機械的な初代細胞培養選択を用いた胎児の組織からの親細胞バンク(PCB)のインビトロでの調製方法に関する。

概要

背景

細胞療法は、組織の機能を修復回復または改善するための薬物療法、特に伝統的な外科技術との薬物治療の組み合わせへの興味深い補助となっている。いくつかの細胞選択は、患者細胞治療により順応性がある。成長中の全年齢動物およびヒトからの組織選択は、それぞれの最終的な細胞型への利点と欠点を評価され得る。ヒト細胞に基づく治療のための最新の制限は、細胞増殖能力(単純な培養条件)、初代ヒト細胞培養の分化表現型の維持、伝染病の感染およびそれらの分離手順に基づく細胞選抜集団一貫性および安定性に関する技術的な限界に関している。1つの臓器提供から培養された初代胎児細胞は、治療薬の開発の緊急かつ厳しい技術態様を満たす。1つの胎児の臓器提供からのオリジナルで実用的な細胞バンクは、短期間で開発され得、安全試験は細胞バンク化の全段階で達成され得る。

細胞療法は、特定の組織の外科的処置および再生医療についての低侵襲性代替療法または併用療法として提案されている。種々の細胞型は、調査されており細胞療法において用いられる:脂肪組織血小板胎盤および羊水細胞と共に、胚性幹細胞ES)、へその緒細胞、(骨髄血瘤幹細胞またはHSCsおよび幹細胞またはMSCからの)胎児の細胞および大人の幹細胞。再生医療における任意の利用に関しては、細胞発生および細胞型は、必須の態様である。各細胞型は、種々の利点および欠点を有する具体的な治療のための分化自己再生能力を操作するための異なる方法を必要とする。

胎児の細胞は、とりわけ、必要なワクチンの開発において、重要性はあまり公知にされることなく、長年、生物学および薬において広く用いられている。胎児の細胞は、高度に増殖し、再生し、低免疫原性の特性を有する分化細胞である。それらは発生の9週間後の胚形成期が起こる胎児の組織から分離され得る。胎児の皮膚細胞は、以下を包含するいくつかの理由のために効果的で安全な細胞療法および再生医療のための理想的な解決策を提供するだろう;a)1つの臓器提供から細胞の増殖能力;b)最少の細胞成長の条件;c)デリバリーのための生体材料への適応化;およびd)酸化的ストレスへの耐性。胎児の皮膚細胞は、十分に凍結した細胞を作製するために1つの臓器提供(1〜4cm2の組織)のみを必要とするので、広範囲の拡大が可能であり、何十万もの治療をすることができるバンクを製造することができる(すなわち、皮膚に関して9×12cmを構成する350億超の胎児の皮膚は1つの専用の細胞バンクから製造され得る。)。細胞培養の要求または幹細胞と間葉系細胞の型と比べて最小限である。胎児の皮膚細胞はすでに分化され、直接または代替で必要とされないので、通常必要である膨大な数の追加成因子は、細胞培養および細胞増殖には必要ではない。細胞バンク用に、遺伝性ウイルス性真菌性または細菌性疾患を避けるためにドナーの厳選とドナーおよび培養細胞の両方の広範囲のスクリーニングは、治療用途への胎児細胞の安全性の高い利用を提供する。加えて、新生児若者または大人の細胞のものとは異なる胎児の細胞は、患者への効率的かつ簡単な送達を可能とする生体材料の特に十分に適応する。ドナー(新生児から大人)からの細胞は、種々の生体材料へ効率的に統合することができず、いくつかの生体材料は、実際、細胞に対して毒性があることが示されている。足場は再生医療に非常に重要であるが、細胞型はほぼ確実に限定要因である。臨床デリバリーのための最終生成物の処理のため、最終生成物の均一な分配や開発の迅速性は、かなり重要な利点である。これまでのように長い培養期間が、自己移植または購入可能な製品に関して必要であるとき、不純物の増加する危険性を無視できない。一貫性があり、容易に再現されるプロセスを有することも重要である。胎児の細胞を備える一貫性のある細胞バンクを開発することにより、多くの危険因子は除外され、安全で効果的なヒト細胞に基づく治療を身近なものとしてもたらすことができる。

同一性純度無菌性、安定性、安全性および有効性を包含している重要な要素は、細胞に基づく生産物に勧められている。すべてにおいて、新たな法令は、臨床試験および処置に用いられる細胞に基づく生産物や生産環境に厳しい基準を課している。ヒト細胞に基づく治療の最新の制限事項は、細胞増殖能力(単純な培養条件)、初代ヒト細胞培養の分化表現型の維持、伝染病の感染およびそれらの分離手順に基づく細胞の選抜集団の一貫性および安定性に関する技術的な限界に関連している。1つの臓器提供から培養された初代胎児細胞は、治療製品の開発のための過酷で厳しい技術態様を満たす。胎児の1つの臓器提供からのオリジナルでかつ実用的な細胞バンクは、短期間で開発され得、安全試験は細胞バンクの全段階で実施され得る。治療用途のため、胎児の細胞は、アウトスケーリングプロセスにけるそれらの寿命の最大2/3に用いられ、様々な生物学的特性の一貫性は、タンパク質濃度遺伝子発現を包含し、そして生物活性が確保される。

収集培養増殖および貯蔵に関する胎児細胞の比較的単純な操作は、胎児の細胞を細胞療法の魅力的選択物にしている。ES細胞とは違って、胎児細胞は、移植されたときに腫瘍を形成せず、免疫原性を欠乏すると思われる。今まで間葉系幹細胞とは対照的に、胎児の細胞は、成長のための支持細胞層または分化のための特異的成長因子のためにを必要としない。1つの臓器提供は、何十万もの患者の処置に用いられるであろう一貫性のあるマスター細胞バンク(MCB)を製造することができる。十分に定義された一貫した細胞バンクは、血清学および病理学が達成されるオリジナルの臓器提供と並行して、可能性のあるウイルスおよび病原体に関する安全性をより容易に評価され得る。

軟骨細胞軟骨前駆細胞)、皮膚線維芽細胞前駆細胞、および前駆細胞を包含する特定の細胞源を生成できる軟骨、腱および皮膚のような特定の組織からの胎児の分化細胞の初代培養により、開発される臨床細胞バンクの質が決定される。組織の初期の処置は、後に製造される細胞の生理的特性に主に重要なものであること十分認識されている。初代培養における慣用の最新技術は、組織の小片酵素的消化して、細胞培養のために全ての生細胞遊離させることである。このことは、特に「硬」組織に用いられているが、軟組織にも用いられており、複数の消化ステップ日常的に用いられている。これをすることにより、完全に異なる細胞集団解放され、初代細胞培養および次代細胞培養において培養される(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4)。

しかしながら、酵素による治療は、異なる形態、生理的特性、安定性、および効用を有する細胞集団の一貫性のない発生の原因となることも知られている(非特許文献5)。

関節軟骨の無血管、無神経(aneural)および無リンパ球(alymphatic)の性質により、外科手術と再生医療の両方に関してこの組織の修復を困難なものにしている。骨軟骨の治療戦略、とりわけ中心および物議を醸す問題のままである細胞源の選択のための至適の基準は、決定から程遠い。大人の間葉ストロマ細胞(MSC)は、表現型均一性信頼性および安定性の問題にもかかわらず、これまで、最も用いられた細胞源である。

骨関節炎欠陥の治療は、これまで満足のいく治療の解決策が存在しなかったので改善される必要がある。軟骨の早期の変性を避ける新たな解決方法を開発して、全関節置換を避けるのがきわめて重要である。新たな細胞により補助される外科技術の開発は、厳しい治療薬の調製の要求を満たすことができる、明確な細胞バンクの生成物に基づく。

概要

本発明は、胎児の骨端組織、胎児のアキレス腱組織および胎児の皮膚組織からなり、創傷および組織の修復方法に用いられる、細胞型の迅速な機械的な初代細胞培養選択を用いた胎児の組織からの親細胞バンク(PCB)のインビトロでの調製方法に関する。なし

目的

胎児の皮膚細胞は、以下を包含するいくつかの理由のために効果的で安全な細胞療法および再生医療のための理想的な解決策を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

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請求項1

胎児骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞からなる群から選択される胎児細胞の単離、増殖および発生のためのインビトロの非酵素方法であって、以下の段階を含む:a)胎児の骨端軟骨細胞を含む尺骨の胎児の軟骨;胎児のアキレス腱細胞を含む胎児のアキレス腱;または胎児の皮膚線維芽細胞を含む胎児の腹部の皮膚;から選択される、胎児のサンプルを使用する工程、b)前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し分散させる工程、c)前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを、前記胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の腹部の皮膚の線維芽細胞を増殖する条件下で、インビトロで培養する工程、d)第一の接着性の胎児の骨端軟骨細胞の細胞集団、第一の接着性の胎児のアキレス腱の細胞集団、および第一の接着性の胎児の皮膚線維芽細胞集団を前記培養から選択し、単離する工程。

請求項2

尺骨の胎児の軟骨サンプルが胎児の近位尺骨骨端のサンプルである、請求項1に記載の非酵素方法。

請求項3

指定番号FE002−Cartを有し、受入番号ECACC12070303−FE002−Cartで供託されている、請求項1に記載の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞(FEC)細胞株

請求項4

指定番号FE002−Tenを有し、受入番号ECACC12070302−FE002−Tenで供託されている、請求項1の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞細胞株。

請求項5

指定番号FE002−SK2を有し、受入番号ECACC12070301−SK2で供託されている、請求項1の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞株。

請求項6

新しい軟骨組織および/または3次元構造物を製造するための請求項3に記載の胎児の骨端軟骨細胞(FEC)の使用方法

請求項7

新しい腱組織および/または3次元構造物を製造するための請求項4に記載の胎児のアキレス腱細胞の使用方法。

請求項8

新しい皮膚組織および/または3次元構造物を製造するための請求項5に記載の胎児の皮膚線維芽細胞の使用方法。

請求項9

治療薬として使用する請求項3に記載の胎児の骨端軟骨細胞(FEC)。

請求項10

治療薬として使用する請求項4に記載の胎児のアキレス腱細胞。

請求項11

治療薬として使用する請求項5に記載の胎児の皮膚線維芽細胞。

請求項12

骨軟骨組織および筋骨格組織修復および再生方法において使用する、請求項3に記載の胎児の骨端軟骨細胞(FEC)。

請求項13

腱組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用する、請求項4に記載の胎児のアキレス腱細胞。

請求項14

皮膚組織の修復および再生方法ならびに熱傷創傷および線維症状態の処置のために使用する、請求項5に記載の胎児の皮膚線維芽細胞。

請求項15

軟骨疾患または欠損関節炎および筋骨格疾患処置方法において使用する、請求項3に記載の胎児の骨端軟骨細胞(FEC)。

請求項16

筋骨格疾患および腱障害の処置方法において使用する、請求項4に記載の胎児のアキレス腱細胞。

請求項17

皮膚疾患の処置方法において使用するための、請求項5に記載の胎児の皮膚線維芽細胞。

請求項18

請求項3の胎児の骨端軟骨細胞(FEC)、請求項4の胎児のアキレス腱細胞、または請求項5の胎児の皮膚線維芽細胞の使用を含む、関節炎、骨軟骨欠損軟骨修復修復、筋骨格組織修復および皮膚修復の処置のための治療薬および/または医療装置の開発のためのスクリーニング方法

技術分野

0001

本発明は、胎児骨端組織、胎児のアキレス腱組織および胎児の皮膚組織からなり、創傷および組織の修復方法に用いられる細胞型の迅速な機械的な初代細胞培養選択を用いた胎児の組織からの親細胞バンク(PCB)のインビトロでの調製方法に関する。

背景技術

0002

細胞療法は、組織の機能を修復回復または改善するための薬物療法、特に伝統的な外科技術との薬物治療の組み合わせへの興味深い補助となっている。いくつかの細胞選択は、患者細胞治療により順応性がある。成長中の全年齢動物およびヒトからの組織選択は、それぞれの最終的な細胞型への利点と欠点を評価され得る。ヒト細胞に基づく治療のための最新の制限は、細胞増殖能力(単純な培養条件)、初代ヒト細胞培養の分化表現型の維持、伝染病の感染およびそれらの分離手順に基づく細胞選抜集団一貫性および安定性に関する技術的な限界に関している。1つの臓器提供から培養された初代胎児細胞は、治療薬の開発の緊急かつ厳しい技術態様を満たす。1つの胎児の臓器提供からのオリジナルで実用的な細胞バンクは、短期間で開発され得、安全試験は細胞バンク化の全段階で達成され得る。

0003

細胞療法は、特定の組織の外科的処置および再生医療についての低侵襲性代替療法または併用療法として提案されている。種々の細胞型は、調査されており細胞療法において用いられる:脂肪組織血小板胎盤および羊水細胞と共に、胚性幹細胞ES)、へその緒細胞、(骨髄血瘤幹細胞またはHSCsおよび幹細胞またはMSCからの)胎児の細胞および大人の幹細胞。再生医療における任意の利用に関しては、細胞発生および細胞型は、必須の態様である。各細胞型は、種々の利点および欠点を有する具体的な治療のための分化自己再生能力を操作するための異なる方法を必要とする。

0004

胎児の細胞は、とりわけ、必要なワクチンの開発において、重要性はあまり公知にされることなく、長年、生物学および薬において広く用いられている。胎児の細胞は、高度に増殖し、再生し、低免疫原性の特性を有する分化細胞である。それらは発生の9週間後の胚形成期が起こる胎児の組織から分離され得る。胎児の皮膚細胞は、以下を包含するいくつかの理由のために効果的で安全な細胞療法および再生医療のための理想的な解決策を提供するだろう;a)1つの臓器提供から細胞の増殖能力;b)最少の細胞成長の条件;c)デリバリーのための生体材料への適応化;およびd)酸化的ストレスへの耐性。胎児の皮膚細胞は、十分に凍結した細胞を作製するために1つの臓器提供(1〜4cm2の組織)のみを必要とするので、広範囲の拡大が可能であり、何十万もの治療をすることができるバンクを製造することができる(すなわち、皮膚に関して9×12cmを構成する350億超の胎児の皮膚は1つの専用の細胞バンクから製造され得る。)。細胞培養の要求または幹細胞と間葉系細胞の型と比べて最小限である。胎児の皮膚細胞はすでに分化され、直接または代替で必要とされないので、通常必要である膨大な数の追加成因子は、細胞培養および細胞増殖には必要ではない。細胞バンク用に、遺伝性ウイルス性真菌性または細菌性疾患を避けるためにドナーの厳選とドナーおよび培養細胞の両方の広範囲のスクリーニングは、治療用途への胎児細胞の安全性の高い利用を提供する。加えて、新生児若者または大人の細胞のものとは異なる胎児の細胞は、患者への効率的かつ簡単な送達を可能とする生体材料の特に十分に適応する。ドナー(新生児から大人)からの細胞は、種々の生体材料へ効率的に統合することができず、いくつかの生体材料は、実際、細胞に対して毒性があることが示されている。足場は再生医療に非常に重要であるが、細胞型はほぼ確実に限定要因である。臨床デリバリーのための最終生成物の処理のため、最終生成物の均一な分配や開発の迅速性は、かなり重要な利点である。これまでのように長い培養期間が、自己移植または購入可能な製品に関して必要であるとき、不純物の増加する危険性を無視できない。一貫性があり、容易に再現されるプロセスを有することも重要である。胎児の細胞を備える一貫性のある細胞バンクを開発することにより、多くの危険因子は除外され、安全で効果的なヒト細胞に基づく治療を身近なものとしてもたらすことができる。

0005

同一性純度無菌性、安定性、安全性および有効性を包含している重要な要素は、細胞に基づく生産物に勧められている。すべてにおいて、新たな法令は、臨床試験および処置に用いられる細胞に基づく生産物や生産環境に厳しい基準を課している。ヒト細胞に基づく治療の最新の制限事項は、細胞増殖能力(単純な培養条件)、初代ヒト細胞培養の分化表現型の維持、伝染病の感染およびそれらの分離手順に基づく細胞の選抜集団の一貫性および安定性に関する技術的な限界に関連している。1つの臓器提供から培養された初代胎児細胞は、治療製品の開発のための過酷で厳しい技術態様を満たす。胎児の1つの臓器提供からのオリジナルでかつ実用的な細胞バンクは、短期間で開発され得、安全試験は細胞バンクの全段階で実施され得る。治療用途のため、胎児の細胞は、アウトスケーリングプロセスにけるそれらの寿命の最大2/3に用いられ、様々な生物学的特性の一貫性は、タンパク質濃度遺伝子発現を包含し、そして生物活性が確保される。

0006

収集培養増殖および貯蔵に関する胎児細胞の比較的単純な操作は、胎児の細胞を細胞療法の魅力的選択物にしている。ES細胞とは違って、胎児細胞は、移植されたときに腫瘍を形成せず、免疫原性を欠乏すると思われる。今まで間葉系幹細胞とは対照的に、胎児の細胞は、成長のための支持細胞層または分化のための特異的成長因子のためにを必要としない。1つの臓器提供は、何十万もの患者の処置に用いられるであろう一貫性のあるマスター細胞バンク(MCB)を製造することができる。十分に定義された一貫した細胞バンクは、血清学および病理学が達成されるオリジナルの臓器提供と並行して、可能性のあるウイルスおよび病原体に関する安全性をより容易に評価され得る。

0007

軟骨細胞軟骨前駆細胞)、皮膚線維芽細胞前駆細胞、および前駆細胞を包含する特定の細胞源を生成できる軟骨、腱および皮膚のような特定の組織からの胎児の分化細胞の初代培養により、開発される臨床細胞バンクの質が決定される。組織の初期の処置は、後に製造される細胞の生理的特性に主に重要なものであること十分認識されている。初代培養における慣用の最新技術は、組織の小片酵素的消化して、細胞培養のために全ての生細胞遊離させることである。このことは、特に「硬」組織に用いられているが、軟組織にも用いられており、複数の消化ステップ日常的に用いられている。これをすることにより、完全に異なる細胞集団解放され、初代細胞培養および次代細胞培養において培養される(非特許文献1;非特許文献2;非特許文献3;非特許文献4)。

0008

しかしながら、酵素による治療は、異なる形態、生理的特性、安定性、および効用を有する細胞集団の一貫性のない発生の原因となることも知られている(非特許文献5)。

0009

関節軟骨の無血管、無神経(aneural)および無リンパ球(alymphatic)の性質により、外科手術と再生医療の両方に関してこの組織の修復を困難なものにしている。骨軟骨の治療戦略、とりわけ中心および物議を醸す問題のままである細胞源の選択のための至適の基準は、決定から程遠い。大人の間葉ストロマ細胞(MSC)は、表現型均一性信頼性および安定性の問題にもかかわらず、これまで、最も用いられた細胞源である。

0010

骨関節炎欠陥の治療は、これまで満足のいく治療の解決策が存在しなかったので改善される必要がある。軟骨の早期の変性を避ける新たな解決方法を開発して、全関節置換を避けるのがきわめて重要である。新たな細胞により補助される外科技術の開発は、厳しい治療薬の調製の要求を満たすことができる、明確な細胞バンクの生成物に基づく。

先行技術

0011

Carrascosa A,Audi L,Ballabriga A Pediatric Research,1985年,第19巻,p.720〜727
Roche S. et al,Biomaterials,2001年,第22巻,p.9〜18
Bae H. et al,The Spine Journal,2008年,第8巻,第5号,p.92S〜93S
Reginato A.M. et al,Arthritis and Rheumatism,1994年,第37巻,第9号
Diaz−Romero J,Gaillard J−P,Grogan P,Nesic,Trub T,Varlet P−M J Cellular Physiol,2005年,第202巻,p.731〜742

発明が解決しようとする課題

0012

したがって、治療戦略において使用するための新しい組織(腱、軟骨、他の筋骨格組織、および皮膚など)を製造する方法を開発する需要がまだある。より具体的には、より安定かつ均一な細胞集団を提供する細胞バンクを開発し、免疫応答の危険なきっかけとならず、感染病原体を運ばない、適切な細胞源を見出すことの需要がある。

課題を解決するための手段

0013

上述の確認された問題を解決するため、出願人らは、親細胞バンク(PCB)の構築の特徴を定義する初期に付着する細胞集団を、機械的に、および、迅速に遊離させる非酵素方法を構築している。いくつかの実施形態において、主要な分化細胞は、特定の軟骨組織、特定の腱組織および特定の皮膚組織に由来する。当業者による、他の実施形態には、皮膚および筋骨格組織(腱、骨、筋肉および椎間板など)からの主要な分化細胞を包含してもよい。PCBの開発は、着実で、安定なさらなる細胞バンクが構築されることを可能とする。

0014

具体的に、一実施形態において、本発明は、胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞からなる群から選択される胎児細胞の単離、増殖および発生のためのインビトロの非酵素方法であって、以下の段階を提供する:
a)胎児の骨端軟骨細胞を含む尺骨の胎児の軟骨;胎児のアキレス腱細胞を含む胎児のアキレス腱;または胎児の皮膚線維芽細胞を含む胎児の腹部の皮膚;から選択される、胎児のサンプルを使用する工程、
b)前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し分散させる工程、
c)前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを、前記胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の腹部の皮膚の線維芽細胞を増殖する条件下で、インビトロで培養する工程、
d)第一の接着性の胎児の骨端軟骨細胞の細胞集団、第一の接着性の胎児のアキレス腱の細胞集団、および第一の接着性の胎児の皮膚線維芽細胞集団を前記培養から選択し、単離する工程。

0015

別の実施形態において、本発明は、本発明の非酵素方法により得られ、指定番号FE002−Tenを有する胎児のアキレス腱細胞の細胞株受入番号ECACC12070303−FE002−Cartで供託され、指定番号FE002−SK2を有する受入番号ECACC12070302−FE002−Tenおよび胎児の皮膚線維芽細胞株で供託され、ならびに受入番号ECACC12070301−SK2で供託されている、胎児の細胞(指定番号FE002−Cartを有する胎児の骨端軟骨細胞の細胞株など)を提供する。

0016

別の実施形態において、本発明は、種々のマトリックスに統合された分化された軟骨、腱または皮膚細胞を用いることにより、新しい軟骨組織および/または3次元構造、新しい腱組織および/または3次元構造、新しい皮膚組織および/または3次元構造の製造のため、本発明の方法により得られる胎児細胞の使用を提供する。

0017

別の実施形態において、本発明は、治療薬として用いられる本発明の方法により得られる胎児の細胞を提供する。

0018

別の実施形態において、本発明は、骨軟骨組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための、腱組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための、ならびに皮膚組織の修復用および再生用の方法において使用するためのならびに熱傷、創傷および線維症状態を治療するための本発明の方法により得られる胎児の細胞を提供する。

0019

別の実施形態において、本発明は、骨軟骨疾患または欠損関節炎および筋骨格疾患処置方法において使用するため;筋骨格疾患および腱障害の処置方法において使用するための;皮膚疾患の処置方法において使用するため、本発明の方法により得られる胎児にお細胞を提供する。

0020

本発明のさらなる実施形態において、本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞(FEC)、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞の使用を含む、関節炎、骨軟骨欠損軟骨修復、腱修復、筋骨格組織修復および皮膚修復の処置のための治療薬および/または医療装置の開発のためのスクリーニング方法が提供される。

図面の簡単な説明

0021

胎児の皮膚前駆細胞用の親細胞バンクの製造を始める組織生検および一貫性を示す4日目の細胞選択を示す図である。
低密度播種(約2000細胞/cm2)の後の胎児の皮膚前駆細胞の細胞増殖と、高い安定性、一貫性および維持される機能を示す6日目および12日目の凍結細胞ストックの回復を示す図である。
組織を酵素的に消化し、親細胞バンクと非一貫性の細胞集団を調製する場合、細胞集団選択の形態学的かつ増殖の差異を示す図である。
胎児の腱前駆細胞(アキレス腱細胞)について親細胞バンクの製造を始めるための組織生検および一貫性を示す4日目の細胞選択を示す図である。
低密度播種(約2000細胞/cm2)の後の胎児の腱前駆細胞の細胞増殖と、高い安定性、一貫性および維持される機能を示す0日目、3日目、7日目および10日目の凍結細胞ストックの回復を示す図である。
胎児の腱前駆細胞を特徴付けFA分析および3Dマトリクス堆積を示す図である。
胎児の軟骨前駆細胞(胎児の骨端軟骨細胞)のための親細胞バンクの製造を始める近位尺骨の骨端の組織の処理および6日目の一貫性を示す細胞選択を示す図である。
低密度播種(約2000細胞/cm2)の後の胎児の軟骨前駆細胞(胎児の骨端軟骨細胞)の細胞増殖と、高い安定性、一貫性および維持される機能を示す6日目および12日目の凍結細胞ストックの回復を示す図である。
胎児の軟骨前駆細胞(胎児の骨端軟骨細胞)の特徴であるFAC分析および3Dマトリクスの堆積を示す図である。
機械的に切断してプレートに沿って配置された組織培養プラスチック上での胎児の細胞の前駆細胞の増殖を示す図である。
組織の非酵素調製を用いる臨床の親細胞バンクの迅速な開発を示す図である。

0022

本願明細書に記載されるのと同様または等価の方法および材料が本発明の研究または試験において用いられうるが、好適な方法および材料は以下に記載されている。すべての出版物、特許出願、特許および本願明細書で述べられる他の参考文献を参照によりその全体を援用したものとする。本願明細書で論じられる出版物および出願は本願の出願日の前の開示を単に提供する。本願明細書において、本発明は、先行発明に基づいたこのような出版物に先行して権利を与えられないことを認めるものと解決されるべきではない。加えて、物質、方法、および実施例は、例示目的のみであり、限定することを意図しない。

0023

矛盾する場合、定義を包含している本願明細書が優先されるだろう。特段の記載がない限り、本願明細書で使用される全技術用語および科学用語は、本願の属する技術分野で一般的に理解されているような意味と同じ意味を有する。本願明細書で使用する場合、以下の定義は本発明の理解を容易にするために提供される。

0024

本願明細書において用いられる、[a]または「an」は、「少なくとも1つ」または「1以上」を意味する。

0025

用語「含む」は、一般的に包含するという意味で用いられ、つまり、1以上の特徴部または成分の存在を可能とする。

0026

用語「生体材料」は、細胞または生物組織と接触して、有害な効果を有しない金属、セラミックおよびポリマーを包含している天然または合成材料を意味する。通常、生体材料支持物は、オレフィンポリマーフッ素ポリマーポリスチレンポリアクリルポリマー、ポリエステルポリマーポリウレタンポリマーケイ素ポリマーセルロースポリマーエポキシポリマーシリコーンベースポリマー合成ヒドロゲルポリカーボネートを含むポリマー支持物;チタンおよびチタン合金、ニチロール、ジルコニアステンレス鋼およびコバルトクロムアルミナ−ジルコニア複合材料を含む生体適合性金属支持物;および/またはポセレンヒドロキシアパタイト;およびこれらの混合物を含む生体適合性セラミックからなる群から選択される。

0027

用語「胎児の軟骨細胞または軟骨前駆細胞」、「胎児のアキレス腱細胞または胎児の腱前駆細胞」、または「胎児の線維芽細胞または胎児の皮膚前駆細胞」は、分化されていない胎児の細胞と比較される分化細胞を意味する。本発明に反して、用語「分化されていない」は、未熟または原子細胞を説明するために用いられる。例えば、分化されていない胎児の皮膚細胞は、皮膚線維芽細胞と表皮角化細胞または関係のない組織の他の特定の細胞型にさえも分化しうるものを包含する。分化細胞は、別の細胞型に特異的な分化培地に配置されたときまたは異なる微小環境に配置されたとき、異なる細胞系統脱分化しないだろう。例えば、胎児の皮膚線維芽細胞が骨原性の分化培地に配置される場合、その皮膚線維芽細胞は骨芽細胞の全集団にならないであろうし、またはその皮膚線維芽細胞が脂質形成培地に配置され場合、その皮膚線維芽細胞は含脂肪細胞の全集団にならないであろうし、そして同じ細胞が骨と共に3Dマトリクスに配置される場合、その皮膚線維芽細胞は環境の変化のせいで骨芽細胞の全集団に脱分化しないであろう。したがって、これらの定義された分化細胞は、人間医学および獣医学の両方の治療薬としての有望な使用への大きな利点である。

0028

用語「適切な培養条件」または「胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、胎児の腱前駆細胞または胎児の皮膚前駆細胞が増殖する条件」は、増殖を促進する栄養素を含有する細胞を培養するための培地である。栄養分の培地は、適切な組み合わせかつ適切な濃度で、以下を任意に含有してよい:等張食塩水緩衝液アミノ酸血清または血清代替物、および他の外から添加された要素。当業者は、任意の共通に用いられる培養条件が用いられうることを理解するだろう。最も適切な培地、培地調製、および細胞培養技術の選抜方法は当該技術分野で周知であり、Doyleら,(編),1995,Cell & Tissue Culture:Laboratory Procedures,John Wiley & Sons,Chichester;およびHoおよびWang(eds.),1991,Animal Cell Bioreactors,Butterworth−Heinemann,Boston(参照により本願明細書に援用したものとする)を包含している様々な発信源に記載されている。例えば、任意の適切な型の培地は、本発明の胎児の骨端軟骨細胞を単離するために使用することができ、これらに限定されないが、DMEM、マッコイ5A培地(Gibco)、イーグル基礎培地、CMRL培地、グラスゴー最小必須培地ハムF−12培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、リーボビッツL−15培地、およびRPMI1640などであり、とりわけ無血清の培地である。培地は、例えば、ウシ胎仔血清(FBS)、定義された成長因子血清代替物、ウマ科の血清(ES)、ヒト血清(HS)、定義された細胞培養成長因子および1以上の抗生物質および/または微生物混入を制御する抗真菌薬(例えば、ペニシリンG硫酸ストレプトマイシンアンホテリシンBゲンタマイシン、およびニスタチン)、とりわけ、単独または組み合わせを包含する1以上の成分を補添されていてよい。

0029

用語「細胞株」は、無制限に継代数を限られた適切な新鮮培地と十分な空間が与えられたならば増加するであろう永久的に樹立される細胞培養物を言及する。用語初代細胞株は樹立細胞培養を言及する。

0030

用語「細胞バンク」は、ドナーの胎児の組織(尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の皮膚など)から生検を採取すること;適切な培養条件下で、胎児の組織を成長させ、胎児の細胞を高濃度まで増殖させること;酵素または非酵素による処置(すなわち、トリプシン)を用いて、得られた培養物の組織および細胞を懸濁液とすること;懸濁した細胞のプールを作り、培養物から細胞のほぼ均一な懸濁液を作製すること;凍結保護物質と穏やかに混合すること;アンプルに細胞の懸濁液の一定分量封入すること;一定分量を冷凍すること;を意味する。最適な冷凍速度は、実験的に決定されてよい。例えば、−80℃まで、1℃/minでアンプルの温度を低下させ、次いで約24時間後、−160℃に移し、または校正された、Nano−Freezer中で、自動的にプログラムサイクルで、−165℃まで全サイクル冷凍する。この極低温バンクは、細胞が老化を停止するように保存し、これにより、それらの細胞が集められた日の機能および活性を保つことを可能とする。

0031

本発明の凍結保存した細胞は、細胞バンク(1〜107/ml)を構成し、その一部を解凍することによって引き出すことができ、次いで必要に応じて新しい軟骨細胞および組織を製造するために用いられる。解凍は、一般的に迅速に行われるべきであり、例えば、アンプルを液体窒素から37℃の水浴に移すことで行われる。アンプルの解凍された内容物は、滅菌状態で、10%のFBSで調整されたDMEMなどの適切な培地を含有する培養容器にすぐに移される。培地中の細胞は、約1〜6X103〜4細胞/mlの初期密度に調節されるのが望ましい。培養下で、細胞は毎日試験されてよく、例えば、細胞増殖を見出すために倒立顕微鏡を用いて試験され、それらが適切な密度に達するとすぐに継代培養され、または品質管理のため走査顕微鏡法を用いてリアルタイム観測される。

0032

本発明の細胞は、必要に応じて上記バンクから採用されてよく、そして、新しい軟骨、腱または皮膚組織または細胞の製造のため、インビトロ(例えば、本願明細書に記載されるような3次元の軟骨、腱または皮膚培養として)またはインビボ(例えば、新しい軟骨、新しい腱もしくは新しい皮膚組織または細胞が必要とされる対象者の部位の細胞の直接投与により)のいずれかで用いられてよい。

0033

用語「対象者」(「対象者」の処置においてみられるような)または「患者」は、病態、欠陥、障害または疾患(ここでは具体的なものとして)に罹患し、なりやすく、または苦しんでいる個々の哺乳類を言及することを意図する。その用語は、年齢または性別を示さない。したがって、大人および新生児の対象者は、男性または女性に関わらず、それらが含まれることを意図する。この用語は、ヒトと動物の両方も包含する。例えば、対象者は、例えば、ヒト、人間以外の霊長類野生生物イヌネコウマウシブタヒツジヤギウサギラット、またはマウスでありうる。好ましくは、対象は、ヒトとウマである。本願明細書で使用する場合、用語「野生生物」は、家畜化されていない任意の哺乳動物トリ両性類またはサカナを包含する。そのような野生生物の例は、これらに限定されないが、アナグマビーバーライオントラベアタカおよびシカを包含する。

0034

次元マトリクスは、例えば、HAヒアルロン酸)、シリコーン、キトサンまたはそれらの混合物を包含しているコラーゲンマトリクスまたはPLA、PLGA、PEG、キトサン、エラスチンヒドロゲルから選択される任意のマトリクスを意味する。マトリクスは、3次元空間を提供し、胎児細胞(胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、胎児の腱前駆細胞、胎児の皮膚前駆細胞、または胎児からの生成物)の適切な被覆および胎児細胞の送達を確保するか、または追加のインプラント材料との結合を確保する。一実施形態において、本発明の方法は、種々のマトリックスに組み込まれた分化された軟骨、腱または皮膚細胞を用いる3次元構造の調製を可能とする。マトリクスを用いた分化した軟骨、腱または皮膚細胞の統合は、マトリクス内への細胞の混合、組み込み、ピペット操作、播種、プレート化または配置により起こりうる。

0035

用語「コラーゲン」は、ポリペプチド化合物を言及し、それは、細胞外の酵素により分解を受けやすい天然で親水性化合物を言及する。この物質は、十分に研究されているので、多くのキーパラメータが制御され得る。コラーゲンは、弱い抗原であり、これにより、結果的に最少限の拒絶反応の可能性となる。本発明の方法および使用において用いられる好ましいコラーゲンは、ウマのコラーゲンまたはブタのコラーゲンである。

0036

インプラント」は、欠乏した生物学的構造置換し、損傷した損傷した生物学的構造を保護し、または存在する生物学的構造を強化するための医療装置として考えられうる。インプラントは、人工または天然の物質から作製され得る。医療用インプラントは、人工装置であり、チタン、シリコーン、ポリマー、アパタイトバイオフォームおよびバイオゲルなどの生体材料から作製されてよい体に接するインプラントの表面である。いくつかのインプラントは、すでに付随している生理活性溶出薬品(埋め込み型カプセルまたは薬品溶出ステントなど)を有しうる。インプラント材料は、特定の組織の種類(抗繊維応答のための分化された胎児の細胞)と結合できる。

0037

用語「送達システム」は、任意の金属または通常用いられる整形外科外傷顎顔面の天然または合成インプラント材料、ヒドロゲル、シリコーンまたはグラフトを意味し、胎児の細胞もしくは胎児の細胞の生成物のみを移動させる手段または組織を処置するためにインプラントと結合する手段またはインプラントを与える手段を提供する。

0038

用語「軟骨組織」は、当該技術分野で一般的に理解される言語として本願明細書で使用され、ECMに組み込まれた細胞を含む密性結合組織の特定の型を言及する(例えば、Cormack,1987,Ham’s Histology,第9版,J.B. Lippincott Co.,pp.266〜272参照)。軟骨の生化学組成は、種類より異なり、しかしながら、一般的な軟骨組成物は、コラーゲン、プロテオグリカンおよび水からなる密生ECMによって取り囲まれている軟骨細胞を含む。種々の軟骨の型は、例えば、硝子軟骨、関節軟骨、肋軟骨線維軟骨半月板の軟骨、弾性軟骨耳介軟骨、および黄色の軟骨を包含していると、当該技術分野で理解されている。軟骨の任意の型の生産物は、本発明の範囲に含まれる。一実施形態によれば、本発明は、好ましくはヒトに用いられる新しい軟骨組織の生産物の組成物および方法に向けられている。しかしながら、本発明は、とりわけ、新しい軟骨組織を必要とする任意の哺乳動物(ウマ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタを包含している)において使用するための新しい軟骨組織を製造するために実施されてもよい。そのような動物の処置は、本発明の範囲に含まれることを意図される。

0039

用語「腱組織」は、その用語が当該技術分野で一般的に理解されているように本願明細書で使用され、主にコラーゲン、プロテオグリカンおよび水を含む線維性結合組織の特定の種類を言及する。

0040

用語「皮膚組織」は、当該技術分野で一般的に理解される言語として本願明細書で使用され、コラーゲン、エラシチン、およびプロテオグリカンも含む特定の繊維製組織を言及する。

0041

本発明の一実施形態において、親細胞バンク(PCB)の構築の特徴を定義する初期に付着する細胞集団を機械的に、迅速に遊離させる非酵素方法が開示されている。いくつかの実施形態において、主要な分化細胞は、特定の軟骨組織、特定の腱組織および特定の皮膚組織からもたらされる。PCBの開発は、一定して安定なさらなる細胞バンクが完成するのを可能とする。

0042

したがって、本発明の一実施形態によれば、胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞からなる群から選択される胎児細胞の単離、増殖および発生のためのインビトロの非酵素方法であって、以下の段階が提供される;
a)胎児の骨端軟骨細胞を含む尺骨の胎児の軟骨;胎児のアキレス腱細胞を含む胎児のアキレス腱;または胎児の皮膚線維芽細胞を含む胎児の腹部の皮膚;から選択される、胎児のサンプルを使用する工程、
b)前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し分散させる工程、
c)前記尺骨の胎児の軟骨、胎児のアキレス腱または胎児の腹部の皮膚のサンプルを、前記胎児の骨端軟骨細胞、胎児のアキレス腱細胞または胎児の腹部の皮膚の線維芽細胞を増殖する条件下で、インビトロで培養する工程、
d)第一の接着性の胎児の骨端軟骨細胞の細胞集団、第一の接着性の胎児のアキレス腱の細胞集団、および第一の接着性の胎児の皮膚線維芽細胞集団を前記培養から選択し、単離する工程。

0043

好ましくは尺骨の胎児の軟骨サンプルは胎児の近位尺骨の骨端のサンプルである。

0044

具体的な実施態様において、本発明は、1つの組織の提供(たった0.2〜2cmの組織)から、胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞(FEC)、胎児のアキレス腱の前駆細胞、および胎児の皮膚前駆細胞の親細胞バンクの単離、増殖および発生のための方法に関する。軟骨、腱および皮膚の源は、一定した細胞バンクを構築するのに重要である。出願人らは、尺骨の胎児の軟骨が脛骨大腿骨または肋軟骨からの源より優れていること、胎児のアキレス腱が優れ、および腹部からの胎児の皮膚が優れていることを見出した。胎児の軟骨、腱および皮膚は、著しい修復能力を有し、そして胎児の細胞は、免疫調節活性および重要な創傷治療能力を示す。軟骨に関して、FECの骨端および細胞特性化後の天然の骨軟骨形成能力と組み合わせて、本発明の非酵素の方法において単離された細胞集団を、骨軟骨および/または軟骨組織修復および再生のための非常に興味深い細胞選抜にする。

0045

選択された細胞集団の遊離用の消化の伝統的な初代培養方法は、本発明の方法において用いられていない。消化は、自動的に解離しない組織から一般的になされる(すなわち、血液細胞成分、いくつかの胎盤組織部分、いくつかの臍帯部分)。組織培養プレートへの切開部に誘導された組織/細胞増殖と合わされている組織の機械的解離により、数日における成長のみの第一接着細胞集団が選択され、この集団は非常に一定であり、均一である。これらの細胞集団はより迅速に成長し、すでに酵素により消化されている他の細胞集団とは異なる形態学的かつ生理プロファイルを有する。出願人は、表面への細胞アラインメントを伴った機械的処理と比較して酵素により消化された胎児の皮膚組織について、2Dにおいて成長の差異を示した。

0046

重要なことに、組織の消化なしで初代培養が行われる場合、胎児の間接軟骨細胞、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞は、他の細胞系統へ容易に脱分化できない。細胞バンク手順において酵素による消化なしで成長された軟骨細胞または軟骨前駆細胞、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞は、それらの初代細胞培養のために酵素により処理されているまたはプラスチック培養ティッシュに付着させるための固体組織成分を有しない骨髄または胎児の間接軟骨細胞由来の間葉系幹細胞などの神経、脂質生成および完全な骨原性細胞に分化しない。別の重要な態様は、非酵素細胞初代細胞培養からの開発された細胞バンクが結果的にインビトロで継代よりもさらに安定な細胞となることである。形態および染色体の安定性は、ヒトの治療薬のためにこれらのバンク細胞を用いるための重要な因子である。

0047

非酵素の方法を用い、培養物中のこのFEC集団、腱前駆細胞集団および皮膚前駆細胞集団の観測された均一性および安定性と共に処理される完全なcGMP単離の安定性は、インビトロでのFEC、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞の確実な培養およびこの開示されている方法のPCB集団から広範なマスター細胞バンクの開発を可能とする。何十万もの患者の臨床応用のために各組織の同じ細胞バンクを用いることが可能となり、新規な骨軟骨、筋骨格および皮膚の再生治療を可能とする。

0048

筋骨格組織(腱、骨、筋肉、椎間板および軟骨ならびに皮膚組織など)は、10〜16 週の胎児の組織に由来するとき、臨床用途のために親細胞バンクを迅速に開発するための理想的な源である。組織が酵素により消化されないとき、および細胞アラインメントがギザギザな表面に沿って向いているときに得られる細胞は、素早く(組織が酵素により消化されるときの数週間〜数か月に対して12〜14日間以内で)調製され、集団中で均一になり、生物指標に関連する特定の組織から細胞型の特徴を維持する。

0049

本発明の非酵素の方法は、公知の酵素による方法により得られた細胞と異なる細胞を提供する。したがって、実施形態において、本発明は、本発明の非酵素方法により得られ、指定番号FE002−Cartを有し、受入番号ECACC12070303−FE002−Cart(2012年7月3日)で供託されている胎児の骨端軟骨細胞細胞株を提供する。別の実施形態において、本発明は、指定番号FE002−Tenを有し、受入番号ECACC12070302−FE002−Ten(2012年7月3日)で供託されている本発明の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞細胞株(本願明細書に胎児のアキレス腱前駆細胞株として示されてもいる)を提供する。さらなる実施形態において、本発明は、指定番号FE002−SK2を有し、受入番号ECACC12070301−FE002−SK2(2012年7月3日)で供託されている本発明の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞株(胎児の皮膚前駆細胞細胞株として本願明細書に示されてもいる)を提供する。

0050

一度構築されれば、胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞の培地は、新しい軟骨細胞および組織を製造することができる軟骨細胞を製造するために用いられてよい。胎児の骨端軟骨細胞の軟骨細胞への分化、その後の軟骨組織の産生は、特定の外因性の成長因子(例えば、アスコルビン酸塩などを用いたまたは用いないBMP(BMP−13などまたはTGF−β)など)の使用と共にまたは使用なしで、培地に添加することにより引き起こされ得る。構築された胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞から同様の手順が利用されうる。

0051

本発明は、さらに、軟骨細胞の培養物と胎児の骨端軟骨細胞および軟骨細胞の両方を含む混合培養物の構築および維持を企図する。胎児の骨端軟骨細胞と同様に、軟骨細胞の培養物または胎児の骨端軟骨細胞および軟骨細胞の混合培養物が構築されると、軟骨を形成せずに細胞増殖をもたらす条件下、例えばTGF−βまたは他の成長因子を欠く培地中などで、細胞密度を指定した新鮮な培地への継代により細胞集団はインビトロで分裂して増殖する。プレ軟骨細胞の培養物と同様に、軟骨細胞の培養物と胎児の骨端軟骨細胞および軟骨細胞の混合された培養物とは、十分な細胞密度に達するときに新鮮な培地に移されるべきである。したがって、細胞の単層の形成は、例えば、新しい培養容器の新鮮な培地に細胞の一部を移すことにより妨げられ、または最小化されるべきである。そのような除去または移動は、約25%培養密度を超える細胞単層を有する任意の培養容器中で行われるべきである。あるいは、培養系は撹拌され細胞の接着を妨げうる。同じ方法は、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に同様に用いられうる。

0052

本発明のさらなる実施形態において、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞の集団は、分裂して膨張し、インビトロで増殖され、治療用途用の軟骨組織および細胞を製造しうる軟骨細胞を生じる。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等しく用いられうる。したがって、実施形態において、本発明は、治療薬としての使用のための本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞(FEC)、胎児のアキレス腱細胞および胎児の皮膚線維芽細胞に関する。

0053

本発明の別の実施形態において、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、低温保存され、「バンク」に凍結して貯蔵され、その「バンク」からそれらの細胞が、必要な場合に軟骨組織および細胞を製造するために、解凍されて、使用できる。そこから回収されまたは製造される胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、数年間、「バンク」に冷凍保存され得る。細胞は、解凍され、必要に応じてバンクから取り出され、その解凍された細胞は、軟骨、他の間葉系の組織(骨、腱または靭帯)の修復、置換および増強のためにいつでも新しい組織および細胞を製造するために使用されうる。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に同等に用いられうる。

0054

尺骨の胎児の軟骨サンプルから単離された細胞の胎児の性質の結果として、本発明の移植された胎児の骨端軟骨細胞またはそこから製造された軟骨組織の免疫拒絶は最小化されるかもしれない。したがって、本発明の別の実施形態において、そのような細胞は、その細胞を必要とする対象者に使用するための「偏在ドナー細胞」として有用である。同じ特質は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞にも同等に見られうる。

0055

本発明の別の実施形態において、胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、胎児のアキレス腱前駆細胞または胎児の皮膚前駆細胞は、ヒドロゲル溶液に懸濁され、患者に注射または移植され得る。あるいは、細胞はまずヒドロゲルに播種され、次いで移植前に培養される。好ましくは、細胞は、ヒドロゲル中で培養され、移植前に分裂して増殖する。

0056

本発明のさらに別の実施形態において、新しい軟骨組織および細胞集団は、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞から調製され、当該技術分野で公知のまたは将来開発される修復、置換または増強の任意の技術を用い対象者における軟骨組織の修復、置換または増強に用いられる。例えば、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、軟骨細胞で埋めることができる間質腔、開口部または細孔を有する生体適合性非生物物質からなる3次元のフレームワークまたは足場に播種できる。適切なインビトロの培養条件下で、播種された細胞は、実質的に3次元の骨格包み込み、細胞外マトリクスを隠し、インビボで移植されうる新たな生きた軟骨組織を形成する。あるいは、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、3次元のフレームワークに播種され、すぐに対象者の部位に移植される。播種された細胞は、インビボで新しい軟骨組織を形成し続け、またはレシピエントの軟骨の修復および再建を促進する。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に同じ手段で等しく利用され得、レシピエントの腱または皮膚の新しい腱組織または新しい皮膚組織の修復および再建を形成または促進する。

0057

さらに別の実施形態において、本発明の細胞が播種された3次元のフレームワークは、抗炎症剤、成長因子、免疫抑制剤、などからなる群から選択される1以上の生物活性剤または他の化合物で被覆される。

0058

本発明のさらに別の実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、接種され、3次元のフレームワーク上で成長し、間欠的な圧力変化を可能とするように操作され得る容器、またはバイオリアクターが増殖中チャンバー与圧との対流により軟骨細胞へ栄養の十分な提供を可能とする、インビトロでの軟骨組織構成の製造のために設計された特定のバイオリアクターシステムに配置される。同じ方法は、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に適用され得る。

0059

足場に基づく細胞療法は、治療組織生成因子、この場合は細胞が簡単に局在化され、それゆえ足場に沿って関節鏡的に移植されうるという明白な利点を与える(Iwasaら、2009年)。これは大部分の侵襲性外科手術(全関節置換)を回避し、可能な限りそのままの組織を保存し、これにより、治療の結果に悪影響を非常に十分及ぼす炎症の発生を有意に低下させる(van Oschら、2009年)。3D組織成長周り鋳型を提供するため、足場構造および組成物を注意深く調整しなければならない。合成物質ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ乳酸(PLA)およびポリグリコール酸PGA)など)と天然物質ヒアルロナンコンドロイチン硫酸塩およびキトサンなど)はさらなる化学修飾を用いてまたは用いずに、ならびに骨および軟骨を形成するために側基の添加を用いてまたは用いずに使用されている。(Ahmedら、2010年;Chungら、2008年;Khanら、2008年)。

0060

生体材料足場は、細胞を保護し、組織成長を誘導する物理的構造を与える細胞外マトリクスとして機能する。マトリクスへの組み込みは、注目の手術部位配送するための3次元システムを有することが必須である。大人の間葉系細胞と異なる胎児の細胞は、それらの本来の接着性および遊走性に起因する種々の生体材料を浸透することが示されている。このことは、個々の生体材料および移植前のインプラントの少ない操作に細胞の迅速な播種を可能とする。異なる材料および制作技術は、軟骨の再生医療に適しうる明らかな特性を有する生体材料足場を形成しうる。多くの生分解性生体材料およびヒドロゲルは、他の手術目的止血スポンジおよび組織充填剤(Mastら、1993年;Patinoら、2002年;DruryおよびMoony、2003年)など)のために既に開発されている。これらの生体材料は、生体適合性が試験され、臨床等級物質(医療機器として分類される)が与えられ、生体材料送達システムおよび細胞生産物会合により生成されるラジカル誘導体生成物がないことが確認されている。

0061

さらなる実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、インビボの部位に、例えば、注射によって3次元フレームワークへの接触なしに直接投与され、その部位に新しい軟骨組織および細胞集団を生み出す。同じ方法は等価に胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に用いられる。したがって、実施形態において、本発明は、新しい軟骨組織および/または3次元構造の製造のため本発明の非酵素方法によって得られた胎児の骨端軟骨細胞(FEC)の使用:新しい腱組織および/または3次元構造の製造のため本発明の非酵素方法によって得られた胎児のアキレス腱細胞の使用および新しい皮膚組織および/または3次元構造物を製造するための本発明の非酵素方法によって得られた胎児の皮膚線維芽細胞の使用に関する。

0062

本発明のさらなる実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、外因的に供給される成長因子(例えば、TGF−βまたはBMP類(BMP−2、BMP−12およびBMP−13など)を用いて軟骨の製造を促進させる。

0063

本発明のさらに別の実施形態において、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、例えば、インプラントに伴う拒絶リスクや炎症を低下させることにより、生産される軟骨の量を増加させるか、または移植の成功を向上させる機能をする、特定の種類の成長因子、ペプチドタンパク質または他の分子を生産するか、またはそれらの生産を増加させるように遺伝子改変されてもよい。同じ方法は等価に胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に適用され得る。

0064

本発明は、上述の方法の生産物にも関し、これらに限定されないが、本発明の胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞、分裂して増殖したものまたは他のもの;それらから製造された新しい軟骨組織;それらから抽出された細胞外マトリクス;および3次元の軟骨/骨組みの構築物を包含する。本発明は、インビボでこれらの細胞、構築物および組織を使用して軟骨の修復、置換または増強への使用に関し、またはインビトロで、新しい軟骨組織または生物活性剤を製造、または有望な治療薬の細胞毒性の試験のために有望な3次元の軟骨培養物を形成することにも関する。同じ方法は、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に用いられ得る。

0065

本発明の一実施形態において、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、それらから分化された軟骨細胞と同様、軟骨を修復または置換する新しい軟骨組織および細胞を製造するために使用することができる。同じ方法は、
新しい腱または皮膚組織を製造し、腱または皮膚を修復または置換するための細胞を製造するために使用されうる胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に利用され得る。

0066

本発明のさらなる実施形態において、本発明の方法に関する尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、それらから分化された軟骨細胞と同様、治療薬として用いられうる。好ましくは、本発明の方法に係る尺骨の胎児の軟骨から単離された、胎児の骨端軟骨細胞は、そこから分化された軟骨細胞と同様、骨軟骨の修復(軟骨修復および腱修復)および再生を包含している)、および骨軟骨の疾患または欠陥(骨軟骨の病変、損傷、外傷、分裂および骨折軟骨下骨壊死および骨軟骨炎を包含している)および/または関節炎を処置する方法において使用するためである。同じ方法は、腱および皮膚の特定の処置の胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に用いられうる。

0067

したがって、一実施形態において、本発明は、骨軟骨組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞(FEC);腱組織および筋骨格組織の修復用および再生用の方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞;皮膚組織の修復用および再生用の方法において使用するためおよび熱傷、創傷および線維症状態を処置するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞;に関する。

0068

本発明のさらなる実施形態において、骨軟骨疾患または欠損、関節炎および筋骨格疾患の処置方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞(FEC);筋骨格疾患および腱障害の処置方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児のアキレス腱細胞;皮膚疾患の処置方法において使用するための本発明の非酵素方法により得られる胎児の皮膚線維芽細胞が提供される。

0069

軟骨再生医療用の胎児の骨端軟骨細胞(FEC)または軟骨前駆細胞の使用は、とても有望である。実際、胎児の成長(foetal development)の全体にわたって、骨端は二次骨核(SOC)の主な部分になり、FEC縮合物を、関節の軟骨性の領域と血管浸潤後の骨端骨梁および骨髄になる領域の両方に変換する(Blumerら、2008;Onyekweluら、2009)。胎児の軟骨(胎児の皮膚で見られるもの)は、自己修復の著しい能力を有する。胎児のヤギモデルにおいて、欠陥は瘢痕または線維性組織形態なしで修復することが知られている(Nambaら、1998)。

0070

本発明の細胞(胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞および軟骨細胞)および軟骨組織は、医薬品、増殖調節因子消炎剤、などの有効性および細胞毒性のための実に様々な化合物をスクリーニングするためにインビトロで用いられてよい。この目的のために、本発明の細胞または上記の組織培養物はインビトロで維持され、そして化合物に暴露され、試験される。細胞毒性の化合物の活性は培養物中で細胞にダメージを与えまたは殺す能力によって測定され得る。これはすぐに生体染色技術により評価できる。増殖調節因子の効果はインビトロで生存している細胞の数を分析すること、例えば、全細胞数を計算することおよび分化細胞を計算することにより評価されてよい。これは標準細胞学および/または種特異的細胞抗原を定義する抗体を用いる免疫細胞化学的手法の使用を包含している組織学的な技術を用いてなされてよい。本発明の細胞においてかまたは懸濁液培養物もしくは上記の3次元系において種々の薬品の効果は評価されてよい。したがって、尺骨の胎児の軟骨から単離された胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞は、関節炎、骨軟骨欠損、軟骨修復、腱修復の治療用の高度治療薬および/または医療装置を開発するためにも使用され得る。同じ方法は、筋骨格組織の治療用の高度治療薬および/または医療装置を開発するためにも使用され得る胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に適用され得る。

0071

本発明の一実施形態において、本発明の非酵素方法により得られる胎児の骨端軟骨細胞(FEC)、胎児のアキレス腱細胞または胎児の皮膚線維芽細胞の使用を含む関節炎、骨軟骨欠損、軟骨修復、腱修復、筋骨格組織修復および皮膚修復の治療のための治療薬および/または医療装置の開発のためのスクリーニング方法が提供される。

0072

本発明の細胞(胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞および軟骨細胞)および軟骨組織は、生理学または病態の研究のためのモデル系として用いられてよい。例えば、固定された関節は、いくつかの観点において比較的すぐに不快になる。軟骨細胞の代謝活性は、プロテオグリカンの損失として影響を受けるようで、そして水分含量の増加がすぐ観測される。軟骨の正常、白くて、輝く外観は、光沢がなく青みがかった色に変化し、軟骨の厚さは減少する。しかしながら、ストレス依存性の代謝恒常性における不調に起因する量に対し、栄養素の不足に起因する変化の量はまだ明らかではない。本発明の細胞および軟骨組織は、異なる身体の条件下(例えば、断続的な加圧)が軟骨構築へのおよび軟骨構築からの培養液ポンプ作用により、軟骨の栄養の必要性を決定するために用いられてよい。これは、外傷性損傷に対して弱くなった軟骨を前もって処理する、例えば、における、関節軟骨の引張強さにおける、加齢に関連したまたは損傷に関連した疾患についての根本原因を研究するのに特に有用であり得る。同じ方法は、外傷性または加齢に関連した損傷に対する腱および皮膚の引張強さにおける加齢に関連したまたは損傷に関連した疾患についての根本原因を研究するのに有用な胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞へ等価に利用されうる。

0073

本発明の細胞(胎児の骨端軟骨細胞または軟骨前駆細胞および軟骨細胞)および軟骨組織は、リュウマチ性疾患の結果として骨液に放出されるサイトカインおよび他の炎症性メディエーター(例えば、IL−1、TNFおよびプロスタグランジン)の作用機序の研究に用いられてもよい。したがって、患者自身の骨液は、本発明の細胞の成長においてこれらの化合物の効果を研究するためインビトロで試験される。加えて、細胞毒性および/または医薬品は、軟骨の再吸収の削減または防止、他方で関節軟骨のバランスのとれた成長を増加するなど、特定の患者に最も有効であるものについてスクリーニングされてもよい。インビトロで有効であると証明されている試薬は、その後、患者を治療的に処置するために用いられうる。同じ方法は、成長因子、サイトカインおよび組織修復において不安定の原因となる他の炎症性のメディエーターの作用機序の研究において有効に胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等価に用いられうる。

0074

当業者は、明細書に開示されている本発明は、詳細に記載されている以外の変更や修正に影響を受けやすいということはわかるであろう。本発明は、そこの精神または本質的な特徴から逸脱せずに変化および修正などの全てを包含する。本発明は、本願明細書に、個別にまたは集合的に、そして任意のおよび上記段階または特徴部の任意の2以上の任意およびすべての組み合わせも包含する。本開示は、それゆえ、説明され、限定されていない全ての態様であり、添付する請求項に示される本発明の範囲として考えられ、そして意味に含まれるすべての変更および等価の範囲のものは本願明細書に受け入れられると考えられる。

0075

上述の事項は、以下の実施例を参照してより十分に理解されるだろう。しかしながら、そのような実施例は、本発明の方法を例示するものであり、本発明の範囲の制限を意図するものではない。

0076

近位尺骨の骨端、アキレス腱および腹部の皮膚は、厳格な移植の法律およびその付属法ならびに臓器提供のためのガイドラインならびに再生医療用途のためのFEC、腱および皮膚の親細胞バンク(CHUV Ethics Committee protocol 番号62/07)を作成するためのスクリーニングにしたがって処理した。組織生検(軟骨(約2mm3)、腱(約0.2mm3)、皮膚(約2cm2)を、外科用メスの切断面に機械的に接着させることにより、微小に切断し、分散させた。(軟骨、腱または皮膚の派生物のみの接着および細胞集団の一貫性:臨床用途のための必要な基準を確保するために酵素による処置は使用しなかった。FEC、腱および皮膚の派生物を、1〜2日〜1週間で観測し、増殖は1週間および2週間で完了した。親細胞バンクを5〜10x106細胞の50〜200バイアルを用いて構築し、液体窒素の気相中に貯蔵した。単離した細胞のインビトロでの特性評価は、重なる傾向のある目立った増殖能(3D培養)と同様、単層培養における顕著な均一性を示す。FEC、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞は、最初の6継代において、著しい表現型変異を示しそうにはない。FECおよび腱前駆細胞は、ペレット培養形態、堆積マトリクスに配置されたときに自発的に癒着でき、基本的な軟骨形成または腱細胞マーカーを表す。フローサイトメトリー分析は、均一な集団の単峰性分配を示した。大人の骨髄由来のMSCとの比較は、分化されていない前駆細胞の表現型よりむしろ軟骨形成または腱細胞と一致した、FECまたは腱の表面のマーカープロファイルを生み出す。

0077

(胎児の軟骨細胞、腱前駆細胞および皮膚前駆細胞バンク、治療薬調製に関する特性評価)
(細胞バンク)
細胞バンクは、情報に基づき書面で同意し、そして1993年から、現地の医大倫理委員会(Medical School Ethics Committee)から、より具体的には2007年からの臨床細胞バンクのための承認を得た妊娠中絶後の12〜14 週の妊娠の胎児の生検から、University Hospital of Lausanne(ローザンヌ大学病院)で構築されている。臨床前関節軟骨の細胞バンクは、これまで2人の異なるドナーから成功裏に開発されている。これら(FE002−Cart(p.0)、FE−002−Ten(p.0)、FE−002−SK2(p.0))の1つを使用し、少ない継代での臨床前および臨床試験のために必要なすべての細胞を構築することが可能であるだろう(MCB(p.3)およびWCB(p.5))。

0078

前臨床の細胞バンクを、約0.3cm3の関節軟骨(半径)(図7参照)から、〜0.2mm3のアキレス腱からおよび約1cm2の腹部の皮膚から、継代0代および1代で調製した。組織を、可能な場合、<0.5mm3のフラグメントに切断し、そして10%FCSおよびグルタミン補完されたDMEM中で増殖し、その細胞は継代3代および6代または1代および9代で特性評価および実験に用いられた。それらの細胞は分離する前にコンフルエンスに増殖し、PBSで2回洗浄して数えた。

0079

(酵素工程なしでの詳細な手順)
組織を2つの10cmプレートに分け、1つのプレートにつき、約5の全組織フラグメント(<0.5mm3)にする。組織培養皿を、前もって、ラミナーフローフードの下、チェックボードパターンにおいて滅菌メスを用いて深くスコア付した。組織フラグメントを、静かに細かく切り、プラスチックインデント内にフラグメントを付着させてスコア付されたプラスチック領域に配置した。少量の栄養分を含む培地を、各フラグメントの周囲に配置し、最初の24時間、組織の流動を回避した。最初の24時間の後、8mLの培地を、各10cmのプレートに添加し、これを継代の前に週2回変更した。これらのフラグメントを10%ウシ胎児血清(Hyclone)だけで補添したDMEM中で増殖させ、一貫した細胞培養を確実にするのを補助した。細胞培養物を95%空気/10%CO2の加湿された雰囲気において37℃で成長させた。臨床試験用の細胞培養に必要な任意の栄養成分は、徹底した安全の必要性および追跡を有するべきであるということを言及するのは重要である。すべての動物由来の製品(ウシ胎児血清およびトリプシン、外来性物質のために試験されたトリプシンおよびガンマ線照射血清の臨床ロット)が用いられるべきである。細胞増殖は最初、1日後でさえ見られたが、5〜7日の間に細胞増殖が上昇した後、組織および細胞の培養皿トリプシン処理(0.25%のトリプシン−0.1%のエチレンジアミン四酢酸EDTA])することにより、またはEDTAのみを用いることによりプレートから除去して、複数の組織培養フラスコに継代するまたは細胞バンクのために冷凍した。この時点で、いくつかの胎児の軟骨、胎児の腱または胎児の皮膚細胞は、液体窒素中個々の単位に冷凍され、一方でPCBの製造のため1,000〜2,000細胞/cm2または10,000〜50,000細胞/cm2で継代した。2000gで細胞を15分間遠心分離し、DMEM(5ml)+FCS(4ml)+DMSO(1ml、Fluka製)の冷凍溶液再懸濁させ、1mlの一定分量(約500万〜1000万の細胞)を、Nalgene Cryoの1℃冷凍容器(Nalgene製Nalgene Cryo 1℃ Freezing Container)中、−80℃で凍結させ、−1℃/分の冷却速度冷却曲線を達成した。24時間後、細胞をより長期の貯蔵のため液体窒素に移動した。

0080

前臨床の胎児の関節軟骨、胎児の腱または胎児の皮膚の1〜2個のバイアルを特性評価のため一貫性のあるWorking Cell Bank(ワーキング細胞バンク)(WCB)を調製するために用いる。手順設計はcGMPの製造において用いられたものと同じである。要するに、細胞を15mlの栄養分を含む培地(DMEM+10%臨床等級血清、胎児のウシ、インビトロゲン)を伴う100細胞培養のフラスコ(T75、Nunc)に1,500細胞/cm2、または1,000〜100,000細胞/cm2で開始する。細胞の培地を2日毎に変更し、細胞の生成/増殖を10〜14日間、37℃、湿度10%で、または3〜6日間、より高密度の播種を行う。12〜14日目に、10 T75 フラスコのバッチをTrypLEに晒し、フラスコから細胞を分離し、遠心管に入れた。栄養分を含む培地の等量を遠心分離の前に各チューブに添加し、TrypLEの効果を緩衝する。すべてのフラスコから得られる細胞ペレットを200mlの冷凍培地溶液(DMEM、血清、DMSO、割合;5:4:1)に再懸濁し、10×106細胞/mlの希釈度で100Nunc(ヌンク)凍結バイアル(1.5ml)に分注した。

0081

細胞をNalgene Cryo 1℃ Freezing Container(Nalgene)中、−80℃で冷凍し、−1℃/分の冷却速度と冷却曲線を成し遂げる。24時間後、細胞を気相中の液体窒素に移動する。このWCBは継代2であり、細胞の特性評価のために用いられ、細胞は種々の継代(しかし、主に2〜8)で用いられる。

0082

(胎児の軟骨細胞の特性評価:同一性、安定性、一貫性、遺伝子安定性)
バンクされた胎児の軟骨細胞は、出願人らの研究の全体にわたって、出願人らの研究室の同じ技術条件下でバンクされたBM−MSC細胞と比較されている。MSCの細胞は、他の組織の中で軟骨再生のための前臨床および臨床実験において提案されかつ使用されている同種異系細胞および主な他の細胞型の1つである(しかしながら、間葉系細胞は組織特異的でなく、他の組織の種類を作製するように調製されなければならない)。さらに、MSCの細胞は、より不安定であり、継代4の下で用いられなければならない。同じ方法は胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等しく利用され得る。

0083

(BM−MSCと対比する胎児の軟骨の特性評価)
胎児の関節軟骨の細胞バンクは、BM−MSC細胞と比較されるマトリクスの供託用の機能アッセイFACS分析を用いて行われた表面マーカーにより特性評価されている。関節骨端組織から得られる胎児の軟骨細胞を単離し、親細胞バンクを冷凍している。

0084

予備実験において比較されているいくつかのマーカーは以下を包含する。
CD105:Endoglin.TGFベータ受容体コンプレックスの部分.MSCの陽性の選択のための主な基準.
CD90:Thy−1.MSCの陽性の選択のための主な基準.
CD44:PTPRC.白血球マーカー.BmMSCsの陰性の選択のための基準.
CD73:NT5E.MSCの陽性の選択のための主な基準.
CD166:ALCAM.

0085

図8および図9参照)
同じ方法が、胎児の腱前駆細胞および胎児の皮膚前駆細胞に等しくに用い得られうる。

0086

(生体適合性:ヒドロゲルおよびマトリクスとの胎児の軟骨の生体適合
医学的使用に用い得る異なるマトリクスを初めに生体適合性について試験した。種々の組成物のヒドロゲル、コラーゲンおよびいくつかの生分解性ポリマーを最初の実験に用いる。ヒドロゲルに関して、細胞を、前もって調製した寒天モールドに挿入されたゲル内で培養する。これは、チューブへの細胞の接着を回避し、3次元成長を可能とする必要があるためである。当該モールドを、0.5mlの無菌コニカルエッペンドルフ遠心分離チューブ液体の寒天に挿入されている、1.5mlの無菌コニカルエッペンドルフ遠心分離チューブ内に1mlの融解したアガロース(20%寒天、低温融解した寒天)をピペット操作により調製し、凝固でき、その後、コニカルをはめこんだままで0.5mlのチューブを取り出す。ゲルおよび細胞添加に続き、100μlの培地を各チューブの表面にピペットし、培地を週に2回変更した。細胞を95%相対湿度および10%C02で、37℃の培養器中、1、2、4週間成長させる。

実施例

0087

マトリクス調剤のため、細胞播種密度(103〜104細胞cm2)および増殖期間(1〜28日)を調査した予備実験は、胎児の細胞送達の最適条件を決定するために行われる。継代3または4(その後の不安定性に起因してMSCは最大4)における胎児の細胞およびBM−MSCの細胞は、10mlの培地(10%FBSを含有するDMEM)に配置され、マトリクス上で播種された。細胞を含有するマトリクスは、37℃の培養器に95%相対湿度および10%CO2で配置された。その1時間後、追加の30mlの培地を添加した。マトリクスは栄養分を含む培地を用いて週に2回変化させた。ヒドロゲルまたはマトリクスが最初に播種された組織培養プレート内で細胞を培養する接触アッセイによって、生体適合性も測定される。1、2、および4週間後、サンプルを染色し、写真を撮った(Sony CyberShotDSC−S70,Zeiss macro lens,Zoom 6x,3.3 megapixels)。

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