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課題・解決手段

ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体アジュバント及び/又は賦形剤とを有する生又は不活化組換えワクチンであって、ウイルスベクターは、α及び/又はγインターフェロンの産生増加に起因して細胞免疫応答を発生させることができ、また急速に複製することができ、PRRSにおけるORF5及びORF6のヌクレオチド配列を挿入したウイルスであることを特徴とする、該ウイルスベクターについて記載する。

概要

背景

ブタ繁殖呼吸障害症候群ウイルス(vPRRS:porcine reproductive and respiratory Syndrome virus)は、RNAグループアルテリウイルス科アルテリウイルス属に属するエンベロープを持ったウイルスである。そのサイズは約460nmであり、そのウイルスゲノムはRNAらせん構造に確実に含まれ、この結果7個のオープンリーディングフレーム(ORF:open reading frame)、すなわち、ORF1a,ORF1b,ORF2〜ORF7があり、この結果7個の構造タンパク質(gp2a,2b〜5,M及びN)及び少なくとも13個の非構造タンパク質(nsp1a,nsp1b〜nsp12)の組合せとなり、それぞれがvPRRSを形成する特異的機能を有する。このウイルスは免疫調節作用を示し、とくに、免疫応答を開始し、また免疫応答の方向に参加する役割を担う単球マクロファージに選択的に影響を及ぼす。このウイルスには、γインターフェロン(IFNγ)の産生を減少させ、無力化しようとする抗体の産生を遅らせ、また免疫学的おとりを産生することによって、免疫応答を変化させる能力があることが分かっている(Yoo et al., 2009; Patel et al., 2009; Chen et al., 2009; Lalit, 2009)。vPRRSは高い抗原変容性を有するため、それに戦うためのワクチン接種戦略に基づく従来方法を使用するのは困難であった。このため、感染拡散及び感染による結果と闘う生物学的能力を開発する世界的な努力が行われており、またこのことを達成する最良選択肢として、ウイルスの遺伝子操作生成物が挙げられる(Lara, 2010)。この意味で、何らかの保護を付与することができるウイルスサブユニットも研究が続けられており、ORF5及びORF6が、少なくとも部分的にウイルスの毒性の原因になっていることから、その使用に期待が持てることが分かってきた(Kim et al., 2009; Zuckerman et al., 2007)。ただし、免疫が生の(複製し続けている)生成物で得られ、生の生成物が接種抗原投与)による保護を与える唯一のものであり、この保護は接種後におけるウイルス血症の減少によって測定される。2005年にORF5のグリコシル化糖化)の改変によってORF5ミュータント突然変異体)が開発され、これらはイムノゲン免疫原)として検査され、GP5の低グリコシル化がvPRRSの能力を増大させ、活発な抗体無力化を誘発することが分かった(Ansari et al., 2005)。

ORF5に特異的なケースにおいて、アミノ酸残基1〜25間の領域は、アメリカ分離株ヨーロッパ産分離株との間で高い多様性を有するとともに、各大陸産における株領域の超可変領域アミノ酸末端配列近傍のアミノ酸26と39との間でグループ分けされる。

ORF5配列における変化は、ブタ流産大量死症候群(SAMS:swine abortion and mortality syndrome)、又は中国で見られた「高熱」症候群のような疾患の特異な大発生を招く結果となりうる(Ferrari et al, 2003; Martelli, 2003)。

現在市販されているPRRSに対するワクチン弱毒化ウイルスを含むが、ブタに感染する可能性があり、病気発症及び免疫学的タメージが、とくに投薬を受けていない動物(以前に被曝されていないと高度に罹患し易い)に現れるという欠点がある。さらに、このワクチンウイルス突然変異し、それ自身が血中の現存ウイルスと組換えを起こし、これにより、ウイルスの新たな遺伝的変異を生ずるおそれがあることが分かってきた。同様に、研究によれば、弱毒化ワクチンは病気を予防するには不十分であることが分かってきており、さらに、抗vPRRSの抗体は、抗体依存増強(ADE:antibodies dependent enhancement)の増強メカニズム及び/又はvPRRSによる免疫学的作用に含まれることが予め分かっており(Thanawongnuwech and Suradhat, 2010)、このことは、期待に反して、ワクチン接種した動物はPRRS疾患の影響をより受け易くなるおそれがある。

上述のことから、この病気に対する組換えワクチンに関する特許がいくつかある。

米国特許第7,722,878号は、抗PRRS組換えワクチンについて記載しており、この場合、vPRRSのORF1部分を単独で又は他のORFと組合せて有するベクターにより構成する。これらのワクチンは、動物に免疫応答を誘発し、またvPRRS感染によって生ずる重症度及び病状を防止及び軽減するのに有用である。これらのワクチンの効率を決定するため、病斑個数、vPRRSの特徴を測定したところ、肺病の47%もの減少を達成したことが分かった。

米国特許第5,888,513号においては、スペインで分離されたvPRRSのORF2〜ORF7に対応する組換えタンパク質が記載されており、この組換えタンパク質はバキュロウイルス発現系で産生され、またワクチン製剤に使用することができるものである。

中国特許出願公開第1554766号及び中国特許出願公開第1800375号は、抗PRRS組換えワクチンについて記載しており、この場合、ベクターとしてアデノウィルスを使用する。中国特許出願公開第1778926号はvPRRSのORF5改変遺伝子について記載しており、これはこの病気に対するワクチン調製に使用することができる。

米国特許第7,041,443号においては、ヨーロッパ型PRRSウイルスポリヌクレオチド及びポリペプチドについて記載しており、これらを使用して免疫遺伝子組成を調製するもので、またこれらは、数個の配列から選択したポリヌクレオチドを含む弱毒化した又は不活化したvPRRSを構成する。

他方、米国特許第6,207,165号は、生殖器及び/又は呼吸器病理に含まれ、それらのうちの1つがPRRSである病原体作用因子対抗するブタワクチン接種用多価ワクチン製剤について記載している。このワクチンは、少なくとも3種のワクチンを含み、各ワクチンはそれぞれ、プラスミド及びブタの病原体結合価を有する遺伝子を含み、PRRSの場合、この遺伝子はE遺伝子、ORF3遺伝子又はM遺伝子とすることができる。

最後に、米国特許第5,998,601号は、vPRRSのVR−2332株のヌクレオチド配列について記載しており、この場合、このヌクレオチド配列におけるORF又はフラグメントに対してコーディングすることができ、またこのヌクレオチド配列から派生したワクチンについても記載している。

上述のように、従来技術に記載されたワクチンは病気の影響を抑制するのに供されてきたが、現在に至るまで、病気を十分有効に抑制するvPRRS予防レベルには達していない。

概要

ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体アジュバント及び/又は賦形剤とを有する生又は不活化の組換えワクチンであって、ウイルスベクターは、α及び/又はγインターフェロンの産生増加に起因して細胞免疫応答を発生させることができ、また急速に複製することができ、PRRSにおけるORF5及びORF6のヌクレオチド配列を挿入したウイルスであることを特徴とする、該ウイルスベクターについて記載する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

α及び/又はγインターフェロンの産生増加により細胞免疫応答を発生することができ、また急速複製を行うことができるウイルスベクターであって、PRRSウイルスに対して抗原活性を有するタンパク質コーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、ことを特徴とするウイルスベクター。

請求項2

前記ウイルスベクターは、パラミクソウイルスである、請求項1に記載のウイルスベクター。

請求項3

前記パラミクソウイルスは、あらゆる血清型遺伝子型のパラミクソウイルスから選択され、前記パラミクソウイルスは、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含み、逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する117位置からフェニルアラニンを除去し、またQ114位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去することが可能なパラミクソウイルス、又はトリ感染アブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスから選択される、請求項2に記載のウイルスベクター。

請求項4

前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスから選択される、請求項3に記載のウイルスベクター。

請求項5

前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項4に記載のパラミクソウイルスベクター

請求項6

前記ニューカッスル病ウイルスは、LaSota株、B1株、QV4株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択される、請求項5に記載のウイルスベクター。

請求項7

外因性ヌクレオチド配列は、ORF5、ORF6及びその組合せから選択される、請求項1に記載のウイルスベクター。

請求項8

前記ORF5は配列(SEQ)ID番号(NO):1の配列を有し、前記ORF6は配列(SEQ)ID番号(NO):2の配列を有する、請求項7に記載のウイルスベクター。

請求項9

α及び/又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができ、また急速複製を行うことができるウイルスベクターであって、PRRSウイルスに対して抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、該ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体アジュバント及び/又は賦形剤とを含む、ことを特徴とする組換えワクチン

請求項10

前記ウイルスベクターのウイルスは、パラミクソウイルスである、請求項9に記載の組換えワクチン。

請求項11

前記パラミクソウイルスは、生又は不活化のウイルスである、請求項10に記載の組換えワクチン。

請求項12

前記パラミクソウイルスは、あらゆる血清型、遺伝子型のパラミクソウイルスから選択され、前記パラミクソウイルスは、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含み、逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する117位置からフェニルアラニンを除去し、またQ114位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去することが可能なパラミクソウイルス、又はトリ感染アブラウイルス属に含まれるパラミクソウイルスから選択される、請求項11に記載の組換えワクチン。

請求項13

前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルス又はセンダイウイルスから選択される、請求項12に記載の組換えワクチン。

請求項14

前記パラミクソウイルスは、ニューカッスル病ウイルスである、請求項13に記載の組換えワクチン。

請求項15

前記ニューカッスル病ウイルスは、LaSota株、B1株、QV4株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択される、請求項14に記載の組換えワクチン。

請求項16

外因性ヌクレオチド配列は、ORF5、ORF6及びその組合せから選択される、請求項9に記載の組換えワクチン。

請求項17

前記ORF5は配列(SEQ)ID番号(NO):1の配列を有し、前記ORF6は配列(SEQ)ID番号(NO):2の配列を有する、請求項16に記載の組換えワクチン。

請求項18

前記薬学的に許容可能な担体は、好適には、含水溶液又はエマルションとした、請求項9に記載の組換えワクチン。

請求項19

前記薬学的に許容可能な担体は、水−油、油−水、又は水−油−水型のエマルションから選択される、請求項18に記載の組換えワクチン。

請求項20

前記薬学的に許容可能な担体は、水−油−水型のエマルションである、請求項19に記載の組換えワクチン。

請求項21

抗原反応を得るのに必要なウイルス濃度は、106.0〜1010.0DIEP50%/mLである、請求項9に記載の組換えワクチン。

請求項22

抗原反応を得るのに必要なウイルス濃度は、108.0〜109.5DIEP50%/mLである、請求項21に記載の組換えワクチン。

請求項23

組換えワクチンは、筋肉内、鼻腔内、又は皮下を経由するにより散布噴霧又は飲料水内で投与する、請求項9に記載の組換えワクチン。

請求項24

組換えワクチンは、筋肉内経由で投与する、請求項23に記載の組換えワクチン。

請求項25

請求項9記載の組換えワクチンを使用する方法であって、前記組換えワクチンをPRRS制御に使用する、使用方法

請求項26

請求項9記載の組換えワクチンをPRRS制御に使用する方法であって、前記組換えワクチンを2回投与した後に、免疫付与された動物肺病変部位が12%未満となるようにする、使用方法。

技術分野

0001

本発明は、ブタ繁殖呼吸障害症候群PRRS:porcine reproductive and respiratory Syndrome)を予防及び制御するのに使用する技術、より具体的には、PRRSウイルスに対する抗原活性を有するタンパク質コーディングする外因性ヌクレオチド配列インサートしたウイルスベクター組換えワクチン、並びに薬学的に許容可能な担体アジュバント及び/又は賦形剤に関する。

背景技術

0002

ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス(vPRRS:porcine reproductive and respiratory Syndrome virus)は、RNAグループアルテリウイルス科アルテリウイルス属に属するエンベロープを持ったウイルスである。そのサイズは約460nmであり、そのウイルスゲノムはRNAらせん構造に確実に含まれ、この結果7個のオープンリーディングフレーム(ORF:open reading frame)、すなわち、ORF1a,ORF1b,ORF2〜ORF7があり、この結果7個の構造タンパク質(gp2a,2b〜5,M及びN)及び少なくとも13個の非構造タンパク質(nsp1a,nsp1b〜nsp12)の組合せとなり、それぞれがvPRRSを形成する特異的機能を有する。このウイルスは免疫調節作用を示し、とくに、免疫応答を開始し、また免疫応答の方向に参加する役割を担う単球マクロファージに選択的に影響を及ぼす。このウイルスには、γインターフェロン(IFNγ)の産生を減少させ、無力化しようとする抗体の産生を遅らせ、また免疫学的おとりを産生することによって、免疫応答を変化させる能力があることが分かっている(Yoo et al., 2009; Patel et al., 2009; Chen et al., 2009; Lalit, 2009)。vPRRSは高い抗原変容性を有するため、それに戦うためのワクチン接種戦略に基づく従来方法を使用するのは困難であった。このため、感染拡散及び感染による結果と闘う生物学的能力を開発する世界的な努力が行われており、またこのことを達成する最良選択肢として、ウイルスの遺伝子操作生成物が挙げられる(Lara, 2010)。この意味で、何らかの保護を付与することができるウイルスサブユニットも研究が続けられており、ORF5及びORF6が、少なくとも部分的にウイルスの毒性の原因になっていることから、その使用に期待が持てることが分かってきた(Kim et al., 2009; Zuckerman et al., 2007)。ただし、免疫が生の(複製し続けている)生成物で得られ、生の生成物が接種抗原投与)による保護を与える唯一のものであり、この保護は接種後におけるウイルス血症の減少によって測定される。2005年にORF5のグリコシル化糖化)の改変によってORF5ミュータント突然変異体)が開発され、これらはイムノゲン免疫原)として検査され、GP5の低グリコシル化がvPRRSの能力を増大させ、活発な抗体無力化を誘発することが分かった(Ansari et al., 2005)。

0003

ORF5に特異的なケースにおいて、アミノ酸残基1〜25間の領域は、アメリカ分離株ヨーロッパ産分離株との間で高い多様性を有するとともに、各大陸産における株領域の超可変領域アミノ酸末端配列近傍のアミノ酸26と39との間でグループ分けされる。

0004

ORF5配列における変化は、ブタ流産大量死症候群(SAMS:swine abortion and mortality syndrome)、又は中国で見られた「高熱」症候群のような疾患の特異な大発生を招く結果となりうる(Ferrari et al, 2003; Martelli, 2003)。

0005

現在市販されているPRRSに対するワクチン弱毒化ウイルスを含むが、ブタに感染する可能性があり、病気発症及び免疫学的タメージが、とくに投薬を受けていない動物(以前に被曝されていないと高度に罹患し易い)に現れるという欠点がある。さらに、このワクチンウイルス突然変異し、それ自身が血中の現存ウイルスと組換えを起こし、これにより、ウイルスの新たな遺伝的変異を生ずるおそれがあることが分かってきた。同様に、研究によれば、弱毒化ワクチンは病気を予防するには不十分であることが分かってきており、さらに、抗vPRRSの抗体は、抗体依存増強(ADE:antibodies dependent enhancement)の増強メカニズム及び/又はvPRRSによる免疫学的作用に含まれることが予め分かっており(Thanawongnuwech and Suradhat, 2010)、このことは、期待に反して、ワクチン接種した動物はPRRS疾患の影響をより受け易くなるおそれがある。

0006

上述のことから、この病気に対する組換えワクチンに関する特許がいくつかある。

0007

米国特許第7,722,878号は、抗PRRS組換えワクチンについて記載しており、この場合、vPRRSのORF1部分を単独で又は他のORFと組合せて有するベクターにより構成する。これらのワクチンは、動物に免疫応答を誘発し、またvPRRS感染によって生ずる重症度及び病状を防止及び軽減するのに有用である。これらのワクチンの効率を決定するため、病斑個数、vPRRSの特徴を測定したところ、肺病の47%もの減少を達成したことが分かった。

0008

米国特許第5,888,513号においては、スペインで分離されたvPRRSのORF2〜ORF7に対応する組換えタンパク質が記載されており、この組換えタンパク質はバキュロウイルス発現系で産生され、またワクチン製剤に使用することができるものである。

0009

中国特許出願公開第1554766号及び中国特許出願公開第1800375号は、抗PRRS組換えワクチンについて記載しており、この場合、ベクターとしてアデノウィルスを使用する。中国特許出願公開第1778926号はvPRRSのORF5改変遺伝子について記載しており、これはこの病気に対するワクチン調製に使用することができる。

0010

米国特許第7,041,443号においては、ヨーロッパ型PRRSウイルスポリヌクレオチド及びポリペプチドについて記載しており、これらを使用して免疫遺伝子組成を調製するもので、またこれらは、数個の配列から選択したポリヌクレオチドを含む弱毒化した又は不活化したvPRRSを構成する。

0011

他方、米国特許第6,207,165号は、生殖器及び/又は呼吸器病理に含まれ、それらのうちの1つがPRRSである病原体作用因子対抗するブタワクチン接種用多価ワクチン製剤について記載している。このワクチンは、少なくとも3種のワクチンを含み、各ワクチンはそれぞれ、プラスミド及びブタの病原体結合価を有する遺伝子を含み、PRRSの場合、この遺伝子はE遺伝子、ORF3遺伝子又はM遺伝子とすることができる。

0012

最後に、米国特許第5,998,601号は、vPRRSのVR−2332株のヌクレオチド配列について記載しており、この場合、このヌクレオチド配列におけるORF又はフラグメントに対してコーディングすることができ、またこのヌクレオチド配列から派生したワクチンについても記載している。

0013

上述のように、従来技術に記載されたワクチンは病気の影響を抑制するのに供されてきたが、現在に至るまで、病気を十分有効に抑制するvPRRS予防レベルには達していない。

先行技術

0014

米国特許第7,722,878号明細書
米国特許第5,888,513号明細書
中国特許出願公開第1554766号明細書
中国特許出願公開第1800375号明細書
中国特許出願公開第1778926号明細書
米国特許第7,041,443号明細書
米国特許第6,207,165号明細書
米国特許第5,998,601号明細書

発明が解決しようとする課題

0015

従来技術の欠点に鑑み、本発明の目的は、ブタ繁殖・呼吸障害症候群(PRRS)に対抗する有効なウイルスベクター組換えワクチンを得ることにある。

0016

本発明の他の目的は、全PRRSウイルスに基づくワクチンよりも迅速な免疫応答を発生する抗PRRSのウイルスベクター組換えワクチンを得ることにある。

0017

本発明のさらに他の目的は、PRRSを抑制するウイルスベクター組換えワクチンの使用法を得ることにある。

0018

本発明の別の目的は、PRRSウイルスに対する抗原活性を有するタンパク質をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入したウイルスベクターを得ることにある。

課題を解決するための手段

0019

この目的を達成するため組換えワクチンを発明したもので、本発明の組換えワクチンは、α及び/又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができ、また急速に複製を行うことができるウイルスベクターであって、好適には、ニューカッスル病ウイルスベースとし、ORF5、ORF6及びこれらの組合せから選択してPRRSのヌクレオチド配列を挿入した、該ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び/又は賦形剤とを含む。

0020

新規な態様を考慮した本発明の特徴は、特許請求の範囲に特別に定義した。しかし、その若干の実施形態、特徴並びに若干の目的及び利点は、添付図面とともに以下の詳細な説明を読むことによって、よりよく理解できるであろう。

図面の簡単な説明

0021

本発明による抗PRRS不活化ワクチンで免疫されたブタにおける体重増加を、市販のワクチンと比較して示すグラフである。
本発明による抗PRRS生ワクチンで免疫されたブタにおける体重増加を、市販のワクチンと比較して示すグラフである。

0022

本発明を開発する間に、驚くべきことに、α及び/又はγインターフェロンの産生増加により細胞の免疫応答を発生することができるウイルスベクターであって、急速複製を行うことができ、PRRSウイルス(vPRRS)の抗原部位をコーディングする外因性ヌクレオチド配列を挿入した、該ウイルスベクターと、薬学的に許容可能な担体、アジュバント及び/又は賦形剤とを含む組換えワクチンによれば、ブタ繁殖・呼吸障害症候群に対抗する適切な保護を行えることが分かった。

0023

ウイルスベクターとしては、生(活動している)又は不活化(死んでいる)の状態のもとを使用することができる。不活化によって、ウイルスベクターとして作用し、またvPRRSの抗原部位をコーディングするヌクレオチド配列を有する組換えウイルスは、複製能力を失うと理解される。不活化は既知物理的又は化学的処理手順によって、好適には、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトンでの化学的不活化によって行う(動物間流行病学会のオフィスインターナシナル、2008年、ニューカッスル病陸生動物診断検査及びワクチンのOIEマニュアル、動物間流行病学会のオフィス・インターナショナル、フランス、第576〜589頁参照)。逆に活性又は生ウイルスは、複製能力を保持していると理解される。

0024

好適には、使用するウイルスベクターは、任意のパラミクソウイルスから選択したパラミクソウイルスとすることができ、あらゆる血清型遺伝子型のパラミクソウイルスから選択でき、レントジェニック型、メソジェニック型及びベロジェニック型ウイルスを含むパラミクソウイルスから選択できる。同様に、逆遺伝学的技術を実施して、パラミクソウイルスに病原性を付与する117位置からフェニルアラニンを除去し、またQ114位置に近接する位置から塩基性アミノ酸を除去したパラミクソウイルス、又はトリ感染アブラウイルス、例えば、ニューカッスル病ウイルス若しくはセンダイウイルスに含まれるパラミクソウイルスを使用することができる。より好適には、ウイルスベクターは、ニューカッスル病ウイルスであり、このウイルスベクターはレントジェニック株又はメソジェニック株から選択し、例えば、LaSota株、B1株、QV4株、ウルスター株、ローキン株、コマロフ株から選択すると好適である。好適には、LaSota株から組換えウイルスを選択する。

0025

vPRRSの抗原部位をコーディングするヌクレオチド配列に関しては、従来幾つかの
ORF配列が記載されており、ORF5及びORF6の配列は、米国特許第5,888,513号明細書及び米国特許第7,041,443号明細書、並びに中国特許出願公開第1778926号明細書に記載されているように、抗PRRSワクチンを産生するのに使用することができる。本発明の場合、使用するヌクレオチド配列は、配列(SEQ)ID番号(NO):1(ORF5)、配列(SEQ)ID番号(NO):2(ORF6)及びこれらの組合せから選択する。

0026

本発明によるワクチンのウイルスベクターは、パラミクソウイルスによるウイルスベクターに挿入し、予め増幅してある関心のあるヌクレオチド配列をPCRで増幅することによって調製することができる。挿入は分子生物学クローニングクローン作成)技術を使用して実施することができる。このようにして得られた感染性クローンは、細胞培養核酸導入され、組換えウイルスを発生させる。

0027

成長に適切な任意の系、例えば、SPFニワトリ、市販の細胞株、又はウイルス成長用にとくに設計した細胞株で、抗原反応を達成するのに必要なウイルス濃度、好適には、106.0〜1010.0DIEP50%/mL、より好適には108.0〜109.5DIEP50%/mLに達するまでウイルスは複製する。生ワクチンの実施形態では、自然にレントジェニック型ワクチンとなる活性ウイルス、又は従来既知の手順で不活化したウイルスを使用する。他方、ワクチンが不活化したものであるとき、抗原反応を達成するのに必要なウイルス濃度に達した後、ウイルスを不活化する。好適には、不活化は、従来既知の物理的又は化学的手順によって行い、好適には、ホルムアルデヒド又はβ−プロピオラクトン又はバイナリエチレンアミン(B.E.I.)で化学的不活化する。

0028

本発明によるワクチンの薬学的に許容可能な担体は、好適には、含水溶液又はエマルションである。より好適には、使用する担体は、水−油、油−水、又は水−油−水(WOW)型のエマルションであり、好適には、水−油−水型エマルションである。ワクチン投与に関しては、筋肉内、鼻腔内、又は皮下に、散布噴霧又は飲料水内で行うことができ、各場合において、ブタにとって適切な、また生ワクチンか不活化ワクチンかに基づいて適切な手段及び形式を使用し、また好適には、筋肉内又は鼻腔内経由で、より好適には筋肉内経由で投与する。

0029

本発明は、以下に説明する実施例からよりよく理解できるであろうが、これら実施例は本発明の好適な実施形態をよりよく理解させることができる単なる例示的なものであり、他の説明しない既存の実施形態が上述の説明に基づいて実施できることを意味するものではない。

0030

実施例1
ニューカッスル病LaSotaベクターの産生
ニューカッスル病ウイルスにおける株LaSotaのゲノム(全遺伝情報)のクローンを作成し、これにより、ウイルスベクターを発生させるために、先ず、中間ベクター、いわゆる「pSL1180NDV/LS」を生成した。この目的のため、ニューカッスル病ウイルスにおける株LaSotaの全ウイルスRNA抽出をトリアゾール方法で実施した。精製RNAからウイルスゲノムのcDNA(complementary DNA)の合成を、テンプレート鋳型)として前もって精製した全RNAを使用して行った。ニューカッスル病ウイルスのゲノムからすべての遺伝子のクローンを作成する目的で(15,183塩基対(bp))、「オーバーラップ」する端部を有し、また凝集性のある制限部位を有する7個のフラグメント(断片)をPCRによって増幅した。フラグメント1(F1)はヌクレオチド(nt)1〜1755をカバーし、F2はnt1〜3321にわたり、F3はnt1755〜6580を有し、F4は6151〜10210にわたり、F5はnt7381〜11351を含み、F6は11351〜14995にわたり、F7はnt14701〜15186を有する。7個のフラグメントのアセンブリは、結鎖標準技術を使用してpGEM−pSL1180と称されるクローン化ベクター内で行ったが、このことはニューカッスル病LaSotaゲノムの再構築を可能にし、クローン作成後にP遺伝子とM遺伝子との間に単独制限部位Sacllを有し、このベクターウイルス領域における関心のある任意の遺伝子のクローン作成(クローニング)に有用である。

0031

実施例2
vPRRSからのORF5及びORF6遺伝子のクローニング
vPRRSからORF5及びORF6遺伝子のクローンを作成するため、全ウイルスRNA抽出をトリアゾール方法で実施した。つぎに、この精製した全RNAを使用してcDNAを合成し、またPCR技術によってPRRSウイルスからのこの遺伝子を、特定のオリゴヌクレオチドを使用して増幅した。ORF5及びORF6遺伝子を、後にフェルメンタス社製のpJETベクター内にクローニング標準技術を使用して挿入し、プラスミド:pJETORF5/ORF6を得た。

0032

実施例3
プラスミドpNDV-LS(wt)Orf5/6を産生するpSL1180NDV/LSベクターのSacll部位内におけるvPRRSからのORF5及びORF6遺伝子のクローニング
A:plntNhe中間ベクターの産生
ニューカッスル病と称されるORF5及びORF6遺伝子の5′末端におけるGE/GSから転写配列を導入する目的で、新しい中間ベクター、いわゆるplntNheを形成し、この形成は、GE/GS配列のPCR初期増幅によって、ニューカッスル病ゲノムを鋳型として使用し、またこれら配列をpGEM−T内に後で挿入することによって行った。

0033

B:ベクターplntNheに対するORF5及びORF6遺伝子のサブクローニング
plntNheプラスミドをSpel−Hpalで消化し、つぎにplntNhe内にクローンを形成し、plntNhe56プラスミドを得た。

0034

C:ベクターpSL1180NDV/LSに対するGE/GS-ORF5/6のサブクローニング
plntNhe56プラスミドをNhel酵素で消化し、pSL1180NDV/LSプラスミドをSacllで消化した。消化生成物削り取り、相溶性結合部位を残し、またGE/GS-ORF5/6領域を精製し、pNDV/LSのSacll部位に挿入し、pNDV-LS(wt)Orf5/6と称される感染クローンを得た。

0035

実施例4
細胞培養内での組換えウイルスrNDV-LS(wt)Orf5/6の産生
Hep-2及びA-549細胞をMAV-7ウイルスに感染多重度1で感染させた。37゜C、5%CO2大気中で1時間の培養後、細胞にpNDV-LS(wt)Orf5/6クローンからのDNAを1マイクログラム(μg)導入し、これとともに双方の細胞タイプにおける組換えの産生に必要なウイルスタンパク質P,NP及びLのコーディングを行う発現プラスミドpNP,pP及びpLからのDNAを0.2μg導入した。核酸導入後44時間して、双方の細胞タイプで得られた組換えウイルスを回収(集菌)し、生後10日目のSPFニワトリ胚に注入し、産生ウイルスを増殖させた。回収したアラントイド(allantoid)液体プレートアッセイによってベロ細胞内で滴定し、ワクチンを調製するのに使用する最終組換えウイルスを生じた。

0036

実施例5
vPRRSからのORF5及びORF6インサートを持つニューカッスル病LaSota組換えウイルスを有するワクチン:pNDV-LS(wt)Orf5/6vacの製造方法
種の産生から開始し、ニワトリの特定病原体未感染(SPF:free of specific pathogens)の孵化(胚含有)に予め決定した感染ドーズを接種した。胚を37゜Cで72時間にわたり培養し、生死を毎日モニタリングした。この時間経過後、生きている胚を1日から翌日にかけて、好適には24時間冷凍し、アミノアラントイド(aminoallantoid)液体(FAA)を無菌条件の下で回収し、遠心分離によって浄化した。FAAを検査にかけてその純度、無菌度及びDIEP力価を決定した。

0037

生ワクチン及び不活化ワクチンを水−油−水型エマルション内で調製した。油相を調製するため、Span80及びTween80タイプの鉱油及び界面活性剤を使用した。水相を調製するため、FAAを防腐作用のある溶液チメロサール)に混合した。エマルションを調製するため、水相をゆっくりと油相に一定の撹拌をしながら添加した。ホモジナイザ又はコロイド化ミルを使用して特定粒度にした。

0038

上述のワクチンを、最小の108.0DIEP50%0.5mLとなるよう調剤し、ブタ1頭につき2.0mLの投与量で使用できるようにした。

0039

上述の手順に従って、ORF5及びORF6の遺伝子を有するベクター(pSL1180NDV/LS)内で実験的組換えワクチン、いわゆるpNDV-LS(wt)Orf5/6vacを産生し、アジュバントなしの生形態(実施例5A)、水−油水型アジュバントを有する生形態(実施例5B)、及び水−油水型アジュバントを有する不活化形態(実施例5C)で検査し、すべてのケースで2回の投与で適用した。

0040

実施例6
組換えワクチンpNDV-LS(wt)Orf5/6vacの効能生体内評価
本発明によるワクチンの有効性を決定するため、またこれらワクチンが市販のワクチンよりも効果的であることを実証するため(1投与で適用)、その有効性を検査した。

0041

PRRSの病原体活性ウイルスを45分あたり106.0DICC50%mLの投与量で使用し、異なる実験で抗原投与し、ワクチンの有効性を測定した。

0042

この目的のため、104頭の生後3〜5週間のSPFブタを使用し、これらブタは、個別番号を重複させて耳タグに付し、計量し、また表1に従って9つの処置グループランダム割り当てた。

0043

0044

ブタを負圧の隔離室内に収容し、治療前に3日間順応させた。すべてのグループに対して、動物に市販の飼料給餌し、生活用飲み水を自由に与え、飼料及び飲み水は添加物及び/又は抗生物質がないものとした。同様に、空気濾過システム及び気密シールを各部屋に配置した。ブタは、実施例5A〜5Cによって得られた本発明によるワクチン(pNDV-LS(wt)Orf5/6 vac)を、1回のブタ投与につき2.0mLを使用し、0日目及び14日目に接種して免疫付与した。比較目的のため、他のグループには、PRRSに対して一般的に使用されている市販のワクチン(Ingelvac(登録商標)PRRS MLV)をブタ1頭につき2.0mLの1回投与で接種して免疫付与した。

0045

ワクチン接種日は「接種日後ゼロ」(DPV0)と指定した。同様に血液サンプルをすべてのグループにおける動物から大静脈穿刺によって、以下の日取りで採取した。すなわち、DPV0,DPV7,DPV14,DPV21,DPV28,DPV35,DPV42及びDPV49(殺処分)。

0046

陰性対照グループを除くすべてのグループにおけるすべてのブタにおける抗原投与は、DPV35(DPDF0)に行った。攻撃ウイルスは、ブタに割り当てられた室内に噴霧によって投与した。DPV49すなわちDPDF14に、すべてのグループにおけるすべてのブタを殺処分し、検視を受けた。ワクチンの有効性を検認するため、免疫付与したブタにおける成長能力及び肺の病変割合を評価した。

0047

肺の病変割合
異なるグループからのブタをDPDF14に電気ショック及び血抜きによって殺処分し、次いで検視した。依然として気管に取り付いていた状態で送気した肺を切除した。左右の肺葉肺尖部、左右の肺葉の心臓寄り部、左肺上葉端縁右肺葉の横隔膜寄り下葉部及び中葉部に対して評価した。損傷の有無に基づいて、組織サンプルを罹患臓器から収集した。vPRRSによる感染を示唆する顕微鏡的損傷部は、面積測定法(Ciprian et al., 1988, Lara et al., 2008)で決定し、この結果を下記の表に示す。

0048

0049

表から分かるように、異なった変数(生、アジュバントを含む生、及びアジュバントを含む不活化)のワクチンpNDV-LS(wt)/Orf5/6投与によれば、陽性対照に比べると肺病変減少率を67%にも達する割合にするすることができるとともに、市販のワクチンを使用した陽性対照では、肺病変の割合が30%も増えている。このことは、従来技術で知らされていることと一致している(Thanawongnuwech and Suradhat, 2010)。

0050

血清学
すべてのグループにおける動物から採取した血液サンプルを使用して血清学的検査を行い、基礎サンプル、抗原投与前日サンプル、及び殺処分当日サンプルに対応するものを選択した。セロコンバージョン検査を、製造業者指示書に従って、IDEXXのELISAHerd CheckPRRS 2XRを使用して行った。得られた結果は以下の表に示す。

0051

0052

上述の結果は、予想通り、すべてのSPFブタの基礎サンプリング陰性であった。抗原投与の時点でセロコンバージョンした唯一のグループはIngelvacPRRS MLVで免疫付与されたものであり、一方、セロコンバージョンのないものは本発明ワクチンで免疫付与されたあらゆるグループで検出された。この結果は、市販で入手可能なELISAキットのみが、実施例5A〜5Cのワクチンのいずれにも存在しないORF7によってコーディングされたヌクレオカプシドタンパク質に対する抗体応答を検出するからである。

0053

殺処分当日に関しては、市販のワクチンを投与されたグループが血清反応陽性のままであり、残りのグループは血清反応陰性であることが分かり、このことは、抗原投与と殺処分との間の経過時間が短く、使用した抗原ウイルスのセロコンバージョン時間が不十分であったことに起因する。しかし、抗原投与グループにおけるウイルスの存在は、PCR検査によって確認された。

0054

同様に、pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vacに対するセロコンバージョンを検出する目的で、上述の血清サンプルを使用する場合、HI検査は、従来既知の方法を使用して行った。得られた結果を以下の表で示す。

0055

0056

表から分かるように、検査を開始する時点でSPFブタは、異なった実施例(E:5A〜5C)におけるpNDV-LS(wt)/Orf5/6 vacワクチンに対して完全に陰性であった。しかし、抗原投与前日の時点で本発明ワクチンを接種したグループでは完全なセロコンバージョンが見られ、ワクチン接種した動物の100%が、使用した処置に従う異なる抗体力価で血清反応陽性を示すとともに、陰性対照、陽性対照及び市販のワクチンで免疫付与されたグループ血清反応陰性のままであった。殺処分当日では、pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vacのワクチン接種したグループが動物100%において100%のセロコンバージョンを維持し、残りのグループは陰性のままであった。

0057

上述のことから、増大したインターフェロンα及び/又はγに起因する細胞免疫応答を発生することができ、また急速複製を可能にするウイルスベクターを選択することの効能が効果的なワクチン生成の解決法であることを示している。

0058

成長能力
目標到達した発育を生ずる目的で、ブタは、殺処分検視の研究における開始時、研究中、及び終了時に個別に軽量した。図1から分かるように、市販ワクチンに比べて、アジュバントを含む不活化した実施例5Cのワクチン(pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vac)を使用するとき、ブタの体重増加(w)に僅かな増加が見られた。

0059

一方、生ワクチンで免疫を付与されたブタに関しては(図2参照)、アジュバントの有無に係わらず、(pNDV-LS(wt)/Orf5/6 vac)をワクチン接種した動物の体重増加は、市販ワクチンのものと比べて相当大きいことが分かる。

0060

これら実験によれば、本発明の成功裏付けるものであり、なぜなら、本発明のワクチンは市販ワクチンよりもセロコンバージョンする時間に明らかな優位性を示し、したがって、ブタの肺病変の大幅な減少から見てよりよい保護レベルを達成していることを示しているからである。このことから、産生パラメータにおける改善がワクチン非接種動物に比べてなされた。同様に、現場病原体ウイルス又は既存の市販活性ワクチンによって生ずるのとは異なった、測定可能血清学的応答を誘発し、このことは、本発明による組換えワクチンがDIVA(Differentiation of infected from vaccinated Animals)のパラメータに合致することを意味する。

実施例

0061

本発明の特定の実施形態を示しまた説明したが、ウイルスベクターとして使用するウイルス及び使用するエマルション又は担体のタイプに多くの変更を加えることができることを強調しなければならない。したがって、本発明は、従来技術及び特許請求の範囲を除いて限定されるべきものではない。

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