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課題・解決手段

キャリアペプチドコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド類似体を提供する。本開示の化合物は、種々の疾患、例えば、タンパク質発現阻害または異常mRNAスプライシング生成物修正によって有益な治療効果を生じる疾患の処置に有用である。例えば、(a)アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド;および、(b)実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用ターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体;を含むコンジュゲートであって、ここで、該アミノ酸サブユニットのうちの2個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、該キャリアペプチドが、該キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸サブユニットを含み、7個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンであり、該キャリアペプチドが、該核酸類似体に共有結合している、コンジュゲートが提供される。

概要

背景

関連出願の説明
潜在的に有用な生物学的活性を有する多くの薬剤における実用性は、多くの場合、このような薬剤のそれらの標的への送達の困難性により妨害される。細胞内に送達される化合物は、一般的には、大部分は水性細胞外環境から送達され、次いで、細胞に入り込むために、脂溶性細胞膜浸透しなければならない。物質が特定の輸送メカニズムにより能動的に輸送されない限り、多くの分子、特に大きな分子は、実際の可溶化には脂溶性であり過ぎるか、または、前記膜を浸透するには親水性であり過ぎるかのいずれかである。

アミノ酸残基49〜57からなるHIVTatタンパク質の断片(配列RKKRRRRRを有する、Tat49 57)が、生物学的に活性ペプチドおよびタンパク質を、細胞に送達するのに使用されてきた(例えば、Barsoumら、1994,国際公開第94/04686号)。Tat(49 60)が、ホスホチオアートオリゴヌクレオチドの送達を向上するのに使用されてきた(Astriab−Fisher,Sergueevら、2000;Astriab−Fisher,Sergueevら、2002)。リバースTatまたはrTat(57〜49)(RRRQRRKKR)が、Tat(49 57)と比較して、フルオレセインを細胞内に、向上された有効性で送達することが報告されてきた(Wender,Mitchellら、2000;Rothbard,Kreiderら、2002)。RothbardおよびWenderは、他のアルギニンリッチ輸送ポリマーも開示してきた(特許文献1(国際公開第01/62297号);特許文献2(米国特許第6,306,993号明細書);特許文献3(米国特許出願公開第2003/0032593号明細書))。

オリゴヌクレオチドは、治療的使用に対して多くの場合、送達が妨害される、潜在的に有用な薬剤化合物の一分類である。ホスホロジアミダート結合モルホリノオリゴマー(PMO;例えば、Summerton and Weller,1997を参照のこと)が、荷電したオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオアートより、この点で有望であることが見出されてきた。前記PMOは、水溶性であり、荷電していない、もしくは、実質的に荷電していない、スプライシング進展、または、翻訳機構成分の結合を妨害することにより、遺伝子発現阻害するアンチセンス分子である。PMOが、ウイルス複製を阻害または妨害することも示されてきた(Stein,Skillingら、2001;McCaffrey,Meuseら、2003)。それらは、酵素消化に対して非常に抵抗性である(Hudziak,Barofskyら、1996)。PMOは、無細胞および細胞培養モデルでの、in vitroにおいて(Stein,Fosterら、1997;Summerton and Weller 1997)、および、ゼブラフィッシュカエルおよびウニでの、in vivoにおいて(Heasman,Kofronら、2000;Nasevicius and Ekker 2000)、ならびに、成体動物モデル、例えば、ラットマウスウサギイヌおよびブタにおいて(例えば、Arora and Iversen 2000;Qin,Taylorら、2000;Iversen 2001;Kipshidze,Keaneら、2001;Devi 2002;Devi,Oldenkampら、2002;Kipshidze,Kimら、2002;Ricker,Mataら、2002を参照のこと)、高いアンチセンス特異性および有効性を示してきた。

アンチセンスPMOオリゴマーが、細胞内に取り込まれ、他の幅広く使用されているアンチセンスオリゴヌクレオチドより、in vivoにおいて一貫して効果的であり、ほとんど非特異的な効能を示さないことが示されてきた(例えば、P.Iversen,“Phosphoramidite Morpholino Oligomers”,in Antisense Drug Technology,S.T.Crooke,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,2001を参照のこと)。アルギニンリッチペプチドへの前記PMOの接合は、それらの細胞内への取り込みを向上することが示されてきた(例えば、特許文献4(米国特許第7,468,418号明細書)を参照のこと)。しかしながら、前記コンジュゲートの毒性が、有望な薬剤候補としての開発を遅らせてきた。

顕著な進展がなされてきたが、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートについての、当該分野における必要性が残っている。このような改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能としては、配列選択性を損なうことのない、より低い毒性、DNAおよびRNAに対するより強力な親和性;改善された薬物動態および組織分布;改善された細胞送達および信頼性、ならびに、in vivoにおける分布の制御可能性があげられる。

概要

キャリアペプチドにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド類似体を提供する。本開示の化合物は、種々の疾患、例えば、タンパク質発現の阻害または異常mRNAスプライシング生成物修正によって有益な治療効果を生じる疾患の処置に有用である。例えば、(a)アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド;および、(b)実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用ターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体;を含むコンジュゲートであって、ここで、該アミノ酸サブユニットのうちの2個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、該キャリアペプチドが、該キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸サブユニットを含み、7個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンであり、該キャリアペプチドが、該核酸類似体に共有結合している、コンジュゲートが提供される。

目的

本発明の化合物は、これらの課題を解決し、当該分野における既存のアンチセンス分子についての改善を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
3件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

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請求項1

(a)アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド;および、(b)実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用ターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体;を含むコンジュゲートであって、ここで、該アミノ酸サブユニットのうちの2個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、該キャリアペプチドが、該キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸サブユニットを含み、7個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンであり、該キャリアペプチドが、該核酸類似体に共有結合している、コンジュゲート。

請求項2

前記キャリアペプチドが、前記カルボキシ末端に、グリシンアミノ酸を含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項3

前記キャリアペプチドが、前記カルボキシ末端に、プロリンアミノ酸を含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項4

前記キャリアペプチドが、4から40個のアミノ酸サブユニットを含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項5

前記キャリアペプチドが、6から20個のアミノ酸サブユニットを含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項6

前記正電荷を有するアミノ酸が、ヒスチジン(H)、リジン(K)、アルギニン(R)またはそれらの組み合わせである、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項7

前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも1個が、アルギニンである、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項8

前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の前記アミノ酸サブユニットの各々が、正電荷を有するアミノ酸である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項9

前記正電荷を有するアミノ酸の各々が、アルギニンである、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項10

前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも1個が、アルギニン類似体であり、前記アルギニン類似体が、構造RaN=C(NH2)Rbの側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、ここで、RaがHまたはRcであり;RbがRc、NH2、NHRまたはN(Rc)2であり、Rcが低級アルキルまたは低級アルケニルであり、および、場合により、酸素または窒素を含み、または、RaおよびRbが、共に環を形成してもよく;前記側鎖が、RaまたはRbを介して、前記アミノ酸に結合される、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項11

前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくとも20%が、正電荷を有するアミノ酸である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項12

前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくとも50%が、正電荷を有するアミノ酸である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項13

前記アミノ酸サブユニットのうちの少なくとも80%が、正電荷を有するアミノ酸である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項14

前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の全ての前記アミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項15

前記キャリアペプチドが、配列(Rd)mを含み、Rdが、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、mが、2から12の範囲の整数である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項16

Rdが、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである、請求項15記載のコンジュゲート。

請求項17

各Rdが、アルギニンである、請求項15記載のコンジュゲート。

請求項18

前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の各アミノ酸サブユニットが、アルギニンである、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項19

前記キャリアペプチドが、少なくとも1つの疎水性アミノ酸を含み、該疎水性アミノ酸が、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニルアリールまたはアラルキルの側鎖を含み、該アルキル、アルケニルおよびアルキニルの側鎖が、6つの炭素原子毎に、多くても1つのヘテロ原子を含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項20

前記キャリアペプチドが、2つ以上の疎水性アミノ酸を含む、請求項19記載のコンジュゲート。

請求項21

前記キャリアペプチドが、2つ以上連続した疎水性アミノ酸を含む、請求項19記載のコンジュゲート。

請求項22

前記疎水性アミノ酸のうちの少なくとも1つが、フェニルアラニンである、請求項19記載のコンジュゲート。

請求項23

前記疎水性アミノ酸の各々が、フェニルアラニンである、請求項19記載のコンジュゲート。

請求項24

前記キャリアペプチドが、下記構造(Yb):を有する、少なくとも1つの中性アミノ酸を含み、式中、nが、2から7であり、各Reが各出現箇所で独立して、水素またはメチルである、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項25

前記キャリアペプチドが、配列[(RdYbRd)x(RdRdYb)y]zを含み、Rdが、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、xおよびyが、各出現箇所で独立して、0または1であり、但し、x+yが1または2であり、zが、1から6の範囲の整数である、請求項24記載のコンジュゲート。

請求項26

Rdが、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである、請求項25記載のコンジュゲート。

請求項27

各Rdが、アルギニンである、請求項25記載のコンジュゲート。

請求項28

少なくとも1つのYbが、6−アミノヘキサン酸またはβ−アラニンである、請求項25記載のコンジュゲート。

請求項29

前記キャリアペプチドが、配列ILFQYを含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項30

前記キャリアペプチドが、配列ILFQ、IWFQまたはILIQを含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項31

前記キャリアペプチドが、配列PPMWS、PPMWT、PPMFSまたはPPMYSを含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項32

前記キャリアペプチドが、アラニンアスパラギンシステイングルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニンセリンまたはスレオニンのうちの少なくとも1つを含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項33

前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのアミノ末端に、アセチルベンゾイルまたはステアロイル部分を含む、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項34

前記アミノ酸サブユニットの各々が、天然アミノ酸である、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項35

前記荷電していない骨格が、サブユニット間リンケージにより結合されたモルホリノ環構造の配列を含み、前記サブユニット間リンケージが、1つのモルホリノ環構造の3’端を、隣接するモルホリノ環構造の5’端に結合し、前記オリゴマーが前記標的核酸に、配列特異的な方法で結合し得るように、各モルホリノ環構造が、塩基対合部分に結合され、前記サブユニット間リンケージが、下記一般構造(I):または、その塩もしくはその異性体を有し、該サブユニット間リンケージ(I)の各々が、独立して、リンケージ(A)またはリンケージ(B)であり:リンケージ(A)に関して:Wが各出現箇所で独立して、SまたはOであり;Xが各出現箇所で独立して、−N(CH3)2、−NR1R2、−OR3または;であり;Yが各出現箇所で独立して、Oまたは−NR2であり;R1が各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり;R2が各出現箇所で独立して、水素または−LNR4R5R7であり;R3が各出現箇所で独立して、水素またはC1−C6アルキルであり;R4が各出現箇所で独立して、水素、メチル、−C(=NH)NH2、−Z−L−NHC(=NH)NH2または−[C(O)CHR’NH]mHであり、Zが、カルボニル(C(O))または直接結合であり、R’が、天然に存在するアミノ酸の側鎖またはその1つもしくは2つの炭素同族体であり、mが、1から6であり;R5が各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対であり;R6が各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり;R7が各出現箇所で独立して、水素、C1−C6アルキルまたはC1−C6アルコキシアルキルであり;Lが、アルキル、アルコキシもしくはアルキルアミノの基またはそれらの組み合わせを含む、長さ18原子以下の必要に応じたリンカーであり、ならびに、リンケージ(B)に関して:Wが各出現箇所で独立して、SまたはOであり;Xが各出現箇所で独立して、−NR8R9または−OR3であり;および、Yが各出現箇所で独立して、Oまたは−NR10であり、R8が各出現箇所で独立して、水素またはC2−C12アルキルであり;R9が各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アラルキルまたはアリールであり;R10が各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキルまたは−LNR4R5R7であり;R8およびR9が結合して、5〜18員の単環複素環もしくは二環複素環を形成してもよく、または、R8、R9またはR3がR10と結合して、5〜7員の複素環を形成し、Xが4−ピペラジノである場合、Xが下記構造(III):を有し、式中:R11が各出現箇所で独立して、C2−C12アルキル、C1−C12アミノアルキル、C1−C12アルキルカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり;および、Rが各出現箇所で独立して、電子対、水素またはC1−C12アルキルであり;および、R12が各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アミノアルキル、−NH2、−CONH2、−NR13R14、−NR13R14R15、C1−C12アルキルカルボニル、オキソ、−CN、トリフルオロメチルアミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニルグアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラートデオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−SR13またはC1−C12アルコキシであり、R13、R14およびR15が、各出現箇所で独立して、C1−C12アルキルである、請求項1記載のコンジュゲート。

請求項36

前記モルホリノ環構造のうちの少なくとも1つが、下記構造(i):を有し、式中、Piが、各出現箇所で独立して、塩基対合部分である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項37

前記サブユニット間リンケージのうちの少なくとも1つが、リンケージ(A)である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項38

前記サブユニット間リンケージの各々が、リンケージ(A)である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項39

各リンケージ(A)が、各出現箇所で同じ構造を有する、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項40

リンケージ(A)の少なくとも1つ出現箇所に関して、Xが、−N(CH3)2である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項41

リンケージ(A)の各出現箇所で、Xが、−N(CH3)2である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項42

各リンケージが、リンケージ(A)であり、Xが、−N(CH3)2である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項43

リンケージ(A)の少なくとも1つの出現箇所に関して、Xが、下記構造:有する、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項44

リンケージ(B)の少なくとも1つの出現箇所に関して、Xが、下記構造:有する、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項45

リンケージ(B)の少なくとも1つの出現箇所に関して、Xが、下記構造:有する、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項46

WおよびYが、各出現箇所でOである、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項47

前記サブユニット間リンケージのうちの少なくとも5%が、リンケージ(B)である、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項48

各リンケージ(B)が、各出現箇所で同じ構造を有する、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項49

前記核酸類似体が、下記構造(XVII):または、その塩もしくは異性体を有し、式中:R17が各出現箇所で独立して、存在しないか、水素またはC1−C6アルキルであり;R18およびR19が各出現箇所で独立して、存在しないか、水素、前記キャリアペプチド、C2−C30アルキルカルボニル、−C(=O)OR21またはR20であり;R20が各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、C1−C30アルキル、C3−C8シクロアルキル;C6−C30アリール、C7−C30アラルキル、C3−C30アルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニル、C7−C30アリールカルボニル、C7−C30アラルキルカルボニル、C2−C30アルキルオキシカルボニル、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニル、C7−C30アリールオキシカルボニル、C8−C30アラルキルオキシカルボニルまたは−P(=O)(R22)2であり;R21が、1つ以上のエーテル結合ヒドロキシル部分またはそれらの組み合わせを含むC1−C30アルキルであり;各R22が独立して、C6−C12アリールオキシであり;Piが、塩基対合部分であり;L1およびL2がそれぞれ、直接結合または、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノ、アミドエステル、カルボニル、カルバマートホスホロジアミダートホスホロアミダート、ホスホロチオアートおよびホスホジエステルから選択される結合を含む、長さ18原子以下のリンカーであり;xが、0またはそれより大きい整数であり;および、R17およびR18が両方とも存在し、R18またはR19のうちの少なくとも1つが、前記キャリアペプチドである、請求項35記載のコンジュゲート。

請求項50

R18が、前記キャリアペプチドである、請求項49記載のコンジュゲート。

請求項51

R19が、前記キャリアペプチドである、請求項49記載のコンジュゲート。

請求項52

R18またはR19のうちの少なくとも1つが、R20である、請求項49記載のコンジュゲート。

請求項53

R19が、−C(=O)OR21である、請求項49記載のコンジュゲート。

請求項54

R19が、である、請求項53記載のコンジュゲート。

請求項55

L1が、ホスホロジアミダートおよびピペラジン結合を含む、請求項49記載のコンジュゲート。

請求項56

L1が、下記構造(XXIX):を有し、式中、R24が存在しないか、HまたはC1−C6アルキルである、請求項55記載のコンジュゲート。

請求項57

R24が、存在しない、請求項56記載のコンジュゲート。

請求項58

R18が、前記キャリアペプチドであり、L2が、直接結合であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端と前記核酸類似体の3’末端窒素との間の結合を形成する、請求項49記載のコンジュゲート。

請求項59

請求項1記載のコンジュゲートと、薬学的に許容され得る媒体とを含む、組成物

請求項60

被験体における疾患を処置する方法であって、治療的に有効量の請求項1記載のコンジュゲートを、前記被験体に投与する工程を含む、方法。

請求項61

前記疾患が、ウイルス感染神経筋疾患細菌感染、炎症または多発性嚢胞腎である、請求項60記載の方法。

請求項62

前記ウイルス感染が、インフルエンザである、請求項61記載の方法。

請求項63

前記神経筋疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項61記載の方法。

請求項64

細胞内への核酸類似体の輸送を向上するための方法であって、請求項1記載のキャリアペプチドを、核酸類似体にコンジュゲートする工程を含み、該細胞内への該核酸類似体の輸送が、非コンジュゲート型の該核酸類似体と比較して向上される、方法。

請求項65

前記核酸類似体が、モルホリノオリゴマーである、請求項64記載の方法。

技術分野

0001

関連出願の引用
本願は、2011年5月5日に出願された米国特許出願第13/101,942号および2011年5月13日に出願された米国特許出願第13/107,528号に対する米国特許法第120条の下での利益を主張する。これらの出願は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。

0002

背景
技術分野
本発明は、一般的に、アンチセンス化合物として有用なオリゴヌクレオチド化合物オリゴマー)に関し、より詳細には、細胞浸透性ペプチドコンジュゲートされたオリゴマー化合物、および、アンチセンス用途におけるこのようなオリゴマー化合物の使用に関する。

背景技術

0003

関連出願の説明
潜在的に有用な生物学的活性を有する多くの薬剤における実用性は、多くの場合、このような薬剤のそれらの標的への送達の困難性により妨害される。細胞内に送達される化合物は、一般的には、大部分は水性細胞外環境から送達され、次いで、細胞に入り込むために、脂溶性細胞膜浸透しなければならない。物質が特定の輸送メカニズムにより能動的に輸送されない限り、多くの分子、特に大きな分子は、実際の可溶化には脂溶性であり過ぎるか、または、前記膜を浸透するには親水性であり過ぎるかのいずれかである。

0004

アミノ酸残基49〜57からなるHIVTatタンパク質の断片(配列RKKRRRRRを有する、Tat49 57)が、生物学的に活性なペプチドおよびタンパク質を、細胞に送達するのに使用されてきた(例えば、Barsoumら、1994,国際公開第94/04686号)。Tat(49 60)が、ホスホチオアートオリゴヌクレオチドの送達を向上するのに使用されてきた(Astriab−Fisher,Sergueevら、2000;Astriab−Fisher,Sergueevら、2002)。リバースTatまたはrTat(57〜49)(RRRQRRKKR)が、Tat(49 57)と比較して、フルオレセインを細胞内に、向上された有効性で送達することが報告されてきた(Wender,Mitchellら、2000;Rothbard,Kreiderら、2002)。RothbardおよびWenderは、他のアルギニンリッチ輸送ポリマーも開示してきた(特許文献1(国際公開第01/62297号);特許文献2(米国特許第6,306,993号明細書);特許文献3(米国特許出願公開第2003/0032593号明細書))。

0005

オリゴヌクレオチドは、治療的使用に対して多くの場合、送達が妨害される、潜在的に有用な薬剤化合物の一分類である。ホスホロジアミダート結合モルホリノオリゴマー(PMO;例えば、Summerton and Weller,1997を参照のこと)が、荷電したオリゴヌクレオチド類似体、例えば、ホスホロチオアートより、この点で有望であることが見出されてきた。前記PMOは、水溶性であり、荷電していない、もしくは、実質的に荷電していない、スプライシング進展、または、翻訳機構成分の結合を妨害することにより、遺伝子発現阻害するアンチセンス分子である。PMOが、ウイルス複製を阻害または妨害することも示されてきた(Stein,Skillingら、2001;McCaffrey,Meuseら、2003)。それらは、酵素消化に対して非常に抵抗性である(Hudziak,Barofskyら、1996)。PMOは、無細胞および細胞培養モデルでの、in vitroにおいて(Stein,Fosterら、1997;Summerton and Weller 1997)、および、ゼブラフィッシュカエルおよびウニでの、in vivoにおいて(Heasman,Kofronら、2000;Nasevicius and Ekker 2000)、ならびに、成体動物モデル、例えば、ラットマウスウサギイヌおよびブタにおいて(例えば、Arora and Iversen 2000;Qin,Taylorら、2000;Iversen 2001;Kipshidze,Keaneら、2001;Devi 2002;Devi,Oldenkampら、2002;Kipshidze,Kimら、2002;Ricker,Mataら、2002を参照のこと)、高いアンチセンス特異性および有効性を示してきた。

0006

アンチセンスPMOオリゴマーが、細胞内に取り込まれ、他の幅広く使用されているアンチセンスオリゴヌクレオチドより、in vivoにおいて一貫して効果的であり、ほとんど非特異的な効能を示さないことが示されてきた(例えば、P.Iversen,“Phosphoramidite Morpholino Oligomers”,in Antisense Drug Technology,S.T.Crooke,ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,2001を参照のこと)。アルギニンリッチペプチドへの前記PMOの接合は、それらの細胞内への取り込みを向上することが示されてきた(例えば、特許文献4(米国特許第7,468,418号明細書)を参照のこと)。しかしながら、前記コンジュゲートの毒性が、有望な薬剤候補としての開発を遅らせてきた。

0007

顕著な進展がなされてきたが、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するオリゴヌクレオチドコンジュゲートについての、当該分野における必要性が残っている。このような改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能としては、配列選択性を損なうことのない、より低い毒性、DNAおよびRNAに対するより強力な親和性;改善された薬物動態および組織分布;改善された細胞送達および信頼性、ならびに、in vivoにおける分布の制御可能性があげられる。

先行技術

0008

国際公開第01/62297号
米国特許第6,306,993号明細書
米国特許出願公開第2003/0032593号明細書
米国特許第7,468,418号明細書

課題を解決するための手段

0009

簡単な概要
本発明の化合物は、これらの課題を解決し、当該分野における既存のアンチセンス分子についての改善を提供する。細胞浸透性ペプチドを、実質的に荷電していない核酸類似体に、グリシンまたはプロリンアミノ酸を介して結合することにより、本発明者らは、他のペプチドオリゴマーコンジュゲートに関連する毒性の課題を解決した。さらに、サブユニット間リンケージの修飾、ならびに/または、オリゴヌクレオチド類似体、例えば、モルホリノオリゴヌクレオチドの5’末端および/もしくは3’末端への末端部分の接合も、前記コンジュゲートの特性を改善し得る。例えば、ある実施形態では、本開示のコンジュゲートは、他のオリゴヌクレオチド類似体と比較して、毒性を低下させ、ならびに/または、細胞送達、有効性および/もしくは組織分布を向上し、ならびに/または、標的器官に、より効果的に送達され得る。これらの優れた特性は、好ましい治療的指標臨床用量の減少ならびに、物品費用低下をもたらす。

0010

したがって、本開示の一実施形態では、
(a)アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド;および、
(b)実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用ターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体;を含み、
前記アミノ酸サブユニットのうちの2個以上が、正電荷を有するアミノ酸であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸を含み、前記キャリアペプチドが、前記核酸類似体に共有結合している、コンジュゲートを提供する。上記コンジュゲートと、薬学的に許容され得る媒体とを含む組成物も、提供する。

0011

もう1つの実施形態では、本開示は、タンパク質の生成を阻害する方法であって、前記タンパク質をコードする核酸を、本開示のコンジュゲートに曝す工程を含む方法を提供する。

0012

本開示のもう1つの態様は、細胞内への核酸類似体の輸送を向上するための方法であって、請求項1記載のキャリアペプチドを、核酸類似体にコンジュゲートする工程を含み、前記細胞内への前記核酸類似体の輸送が、非コンジュゲート型の前記核酸類似体と比較して向上される、方法を含む。

0013

もう1つの実施形態では、本開示は、被験体における疾患を処置する方法であって、治療的に有効量の開示されたコンジュゲートを、前記被験体に投与する工程を含む、方法に関する。前記コンジュゲートを製造する方法、それを使用するための方法、および、核酸類似体にコンジュゲートするのに有用なキャリアペプチドも提供する。

0014

本発明のこれらの態様および他の態様は、下記の詳細な説明を参照することにより明らかであろう。この目的を達成するために、本願明細書において、特定の背景情報、手順、化合物および/または組成物を、より詳細に記載する、種々の参考文献が説明され、それらの全体が参照により、それぞれ本願明細書に取り込まれる。

図面の簡単な説明

0015

図1Aは、ホスホロジアミダートリンケージを含む、典型的なモルホリノオリゴマー構造を示す。
図1Bは、キャリアペプチドに、5’端でコンジュゲートされたモルホリノオリゴマーを示す。
図1Cは、キャリアペプチドに、3’端でコンジュゲートされたモルホリノオリゴマーを示す。
図1D〜Gは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された1Dから1Gの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
図1D〜Gは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された1Dから1Gの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
図1D〜Gは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された1Dから1Gの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
図1D〜Gは、典型的なモルホリノオリゴヌクレオチドである、指定された1Dから1Gの繰り返しサブユニットセグメントを示す。
図2は、モルホリノ−T部分に結合される、典型的なサブユニット間リンケージを示す。
図3は、固相合成用リンカーの調製を示す反応スキームである。
図4は、オリゴマー合成用固体支持体の調製を示す。
図5A、5Bおよび5Cは、マウスの大腿四頭筋横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータを示す。
図5A、5Bおよび5Cは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータを示す。
図5A、5Bおよび5Cは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータを示す。
図6A、6Bおよび6Cは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータの別の表現である。
図6A、6Bおよび6Cは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータの別の表現である。
図6A、6Bおよび6Cは、マウスの大腿四頭筋、横隔膜および心臓のそれぞれにおいて、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートについての、エクソンスキッピングデータの別の表現である。
図7Aおよび7Bは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスにおける、血中尿素窒素(BUN)レベルおよび生存率を示すグラフである。
図7Aおよび7Bは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスにおける、血中尿素窒素(BUN)レベルおよび生存率を示すグラフである。
図8Aおよび8Bは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスについての、腎傷害マーカーKIM)データおよびクラステリン(Clu)データを示す。
図8Aおよび8Bは、種々のペプチド−オリゴマーコンジュゲートそれぞれで処置されたマウスについての、腎傷害マーカー(KIM)データおよびクラステリン(Clu)データを示す。
図9A、9B、9Cおよび9Dは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、BUNレベル、パーセント生存およびKIMレベルのそれぞれを比較するグラフである。
図9A、9B、9Cおよび9Dは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、BUNレベル、パーセント生存およびKIMレベルのそれぞれを比較するグラフである。
図9A、9B、9Cおよび9Dは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、BUNレベル、パーセント生存およびKIMレベルのそれぞれを比較するグラフである。
図9A、9B、9Cおよび9Dは、既知のコンジュゲートと比較した、典型的なコンジュゲートで処置されたマウスにおける、エクソンスキッピング、BUNレベル、パーセント生存およびKIMレベルのそれぞれを比較するグラフである。
図10は、種々のコンジュゲートで処置されたマウスについての、KIMデータを示す。
図11は、種々のコンジュゲートで処置されたマウスの、BUN分析の結果を示す。
図12は、マウス腎臓組織における種々のオリゴマーの濃度を示すグラフである。

0016

詳細な説明
I.定義
下記の記載では、ある特定の詳細は、種々の実施形態についての理解を通じて提供されるために、説明される。ただし、当業者であれば、本発明が、これらの詳細なしに実施され得ることを理解するであろう。他の例では、周知の構成は、その実施形態の記載が不要に曖昧になるのを避けるために、詳細には示しておらず、記載していない。特に断らない限り、下記の明細書および特許請求の範囲全体を通して、「含む(comprise)」の語ならびに、その変形、例えば、「comprises」および「comprising」は、オープン包含的な意味、すなわち、「含むが、限定されない(including,but not limited to)」として解釈される。さらに、本願明細書で提供された見出しは、便宜上のみであり、特許請求の範囲の発明のスコープまたは意味を説明するものではない。

0017

本明細書全体を参照して、「一実施形態(one embodiment)」または「実施形態(an embodiment)」は、その実施形態に関連して記載される特定の特性、構造または特徴が、少なくとも1つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の各所における「一実施形態では(in one embodiment)」または「実施形態では(in an embodiment)」の出現は、同じ実施形態の全てを言及する必要がない。さらに、前記特定の特性、構造または特徴は、1つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられてもよい。また、本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形である「a」、「an」および「the」は、特に断らない限り、複数の指示対象を含む。特に断らない限り、「または(or)」の用語は、一般的に、「および/または(and/or)」を含む意味において使用されることに、留意すべきである。

0018

本願明細書で使用する場合、以下の用語は、特に断らない限り、下記の意味を有する。

0019

アミノ」は、−NH2基を意味する。

0020

シアノ」または「ニトリル」は、−CN基を意味する。

0021

ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−OH基を意味する。

0022

イミノ」は、=NH置換基を意味する。

0023

グアニジニル」は、−NHC(=NH)NH2置換基を意味する。

0024

アミジニル」は、−C(=NH)NH2置換基を意味する。

0025

ニトロ」は、−NO2基を意味する。

0026

オキソ」は、=O置換基を意味する。

0027

チオキソ」は、=S置換基を意味する。

0028

コラート」は、下記構造:




を意味する。

0029

デオキシコラート」は、下記構造:




を意味する。

0030

アルキル」は、1から30個の炭素原子を有し、単結合により分子の残部に付着される、飽和または不飽和(すなわち、1つ以上の二重結合および/または三重結合を含む)の、直鎖状または分岐鎖状の炭化水素鎖基を意味する。1から30の任意の数の炭素原子を含むアルキルが含まれる。30個以下の炭素原子を含むアルキルは、C1−C30アルキル、同様に例えば、12個以下の炭素原子を含むアルキルは、C1−C12アルキルである。他の数の炭素原子を含むアルキル(および本願明細書で規定される他の部分)は、同様に表される。アルキル基としては、制限されず、C1−C30アルキル、C1−C20アルキル、C1−C15アルキル、C1−C10アルキル、C1−C8アルキル、C1−C6アルキル、C1−C4アルキル、C1−C3アルキル、C1−C2アルキル、C2−C8アルキル、C3−C8アルキルおよびC4−C8アルキルがあげられる。典型的なアルキル基としては、制限されず、メチルエチル、n−プロピル、1−メチルエチル(iso−プロピル)、n−ブチル、i−ブチル、s−ブチル、n−ペンチル、1,1−ジメチルエチル(t−ブチル)、3−メチルヘキシル、2−メチルヘキシル、エテニルプロプ−1−エニルブト−1−エニル、ペント−1−エニル、ペンタ−1,4−ジエニルエチニルプロピニル、ブト−2−イニル、ブト−3−イニル、ペンチニルヘキシニル等があげられる。本明細書において特に断らない限り、アルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0031

アルキレン」または「アルキレン鎖」は、前記分子の残部をラジカル基に結合する、直鎖状または分岐鎖状の二価の炭化水素鎖を意味する。アルキレンは、飽和でもよいし、または不飽和でもよい(すなわち、1つ以上の二重結合および/または三重結合を含む)。典型的なアルキレンとしては、制限されず、C1−C12アルキレン、C1−C8アルキレン、C1−C6アルキレン、C1−C4アルキレン、C1−C3アルキレン、C1−C2アルキレン、C1アルキレンがあげられる。典型的なアルキレン基としては、制限されず、メチレンエチレンプロピレン、n−ブチレンエテニレン、プロペニレン、n−ブテニレンプロピニレン、n−ブチニレン等があげられる。前記アルキレン鎖は、単結合または二重結合により、前記分子の残部に付着され、単結合または二重結合により、ラジカル基に付着される。前記分子の残部および前記ラジカル基への前記アルキレン鎖の付着点は、前記鎖内における1つの炭素または任意の2つの炭素を介し得る。本明細書において特に断らない限り、アルキレン鎖は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0032

アルコキシ」は、式−ORaの基を意味し、式中、Raは、定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルコキシ基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0033

アルコキシアルキル」は、式−RbORaの基を意味し、式中、Raは、定義のように、アルキル基であり、Rbは、定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、アルコキシアルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0034

アルキルカルボニル」は、式−C(=O)Raの基を意味し、式中、Raは、定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルキルカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0035

アルキルオキシカルボニル」は、式−C(=O)ORaの基を意味し、式中、Raは、定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルキルオキシカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0036

アルキルアミノ」は、式−NHRaまたは−NRaRaの基を意味し、式中、各Raは、独立して、上記定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、アルキルアミノ基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0037

「アミジル」は、式−N(H)C(=O)Raの基を意味し、式中、Raは、本願明細書で定義するように、アルキル基またはアリール基である。本明細書において特に断らない限り、アミジル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0038

「アミジニルアルキル」は、式−Rb−C(=NH)NH2の基を意味し、式中、Rbは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、アミジニルアルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0039

「アミジニルアルキルカルボニル」は、式−C(=O)Rb−C(=NH)NH2の基を意味し、式中、Rbは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、アミジニルアルキルカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0040

アミノアルキル」は、式−Rb−NRaRaの基を意味し、式中、Rbは、上記定義のように、アルキレン基であり、各Raは、独立して、水素またはアルキル基である。

0041

チオアルキル」は、式−SRaの基を意味し、式中、Raは、上記定義のように、アルキル基である。本明細書において特に断らない限り、チオアルキル基は、場合により置換されてもよい。

0042

アリール」は、水素、6から30個の炭素原子および少なくとも1つの芳香環を含む、炭化水素環由来の基を意味する。前記アリール基は、単環、二環三環または四環の系でもよく、縮合環系または架橋環系を含んでもよい。アリール基としては、制限されず、アセアントリレンアセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセンアズレンベンゼンクリセンフロランテンフルオレン、as−インダセン、s−インダセン、インダンインデンナフタレンフェナレンフェナンスレンプレイアデン、ピレンおよびトリフェニレンの炭化水素環系由来のアリール基があげられる。本明細書において特に断らない限り、「アリール」の用語または「ar−」の接頭辞(例えば、「アラルキル(aralkyl)」)は、場合により、置換されたアリール基を含むことを意味する。

0043

「アラルキル」は、式−Rb−Rcの基を意味し、Rbは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Rcは、上記定義のように、1つ以上のアリール基、例えば、ベンジルジフェニルメチルトリチル等である。本明細書において特に断らない限り、アラルキル基は、場合により置換されてもよい。

0044

アリールカルボニル」は、式−C(=O)Rcの基を意味し、Rcは、上記定義のように、1つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アリールカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0045

アリールオキシカルボニル」は、式−C(=O)ORcの基を意味し、Rcは、上記定義のように、1つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アリールオキシカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0046

「アラルキルカルボニル」は、式−C(=O)Rb−Rcの基を意味し、Rbは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Rcは、上記定義のように、1つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アラルキルカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0047

アラルキルオキシカルボニル」は、式−C(=O)ORb−Rcの基を意味し、Rbは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Rcは、上記定義のように、1つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アラルキルオキシカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0048

アリールオキシ」は、式−ORcの基を意味し、Rcは、上記定義のように、1つ以上のアリール基、例えば、フェニルである。本明細書において特に断らない限り、アリールカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0049

シクロアルキル」は、安定的な非芳香族性の、単環または多環炭素環式環を意味し、縮合環系または架橋環系を含んでもよく、飽和でもよいし、または、不飽和でもよく、単結合により前記分子の残部に付着される。典型的なシクロアルキルとしては、制限されず、3から15個の炭素原子、および、3から8個の炭素原子を有するシクロアルキルがあげられる。単環のシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピルシクロブチルシクロペンチルシクロヘキシルシクロヘプチルおよびシクロオクチルがあげられる。多環基としては、例えば、アダマンチルノルボルニルデカニルおよび、7,7−ジメチルビシクロ[2.2.1]ヘプタニルがあげられる。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキル基は、場合により置換されてもよい。

0050

シクロアルキルアルキル」は、式−RbRdの基を意味し、Rbは、上記定義のように、アルキレン鎖であり、Rdは、上記定義のように、シクロアルキル基である。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキルアルキル基は、場合により置換されてもよい。

0051

シクロアルキルカルボニル」は、式−C(=O)Rdの基を意味し、Rdは、上記定義のように、シクロアルキル基である。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキルカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0052

シクロアルキルオキシカルボニル」は、式−C(=O)ORdの基を意味し、Rdは、上記定義のように、シクロアルキル基である。本明細書において特に断らない限り、シクロアルキルオキシカルボニル基は、場合により置換されてもよい。

0053

縮合」は、既存の環構造に縮合された、本願明細書に記載の任意の環構造である。前記縮合環ヘテロシクリル環またはヘテロアリール環である場合、前記縮合ヘテロシクリル環または縮合ヘテロアリール環の部分となる、既存の環構造上の任意の炭素原子が、窒素原子に置換されてもよい。

0054

「グアニジニルアルキル」は、式−Rb−NHC(=NH)NH2の基を意味し、Rbは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、グアニジニルアルキル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0055

「グアニジニルアルキルカルボニル」は、式−C(=O)Rb−NHC(=NH)NH2の基を意味し、Rbは、上記定義のように、アルキレン基である。本明細書において特に断らない限り、グアニジニルアルキルカルボニル基は、場合により、以下に記載のように、置換されてもよい。

0056

ハロ」または「ハロゲン」は、ブロモクロロ、フルオロまたはヨードを意味する。

0057

ハロアルキル」は、1つ以上のハロ基、上記定義のように、例えば、トリフルオロメチルジフルオロメチルフルオロメチルトリクロロメチル、2,2,2−トリフルオロエチル、1,2−ジフロオロエチル、3−ブロモ−2−フロオロプロピル、1,2−ジブロモエチル等により置換された、上記定義のようなアルキル基を意味する。本明細書において特に断らない限り、ハロアルキル基は、場合により置換されてもよい。

0058

パーハロ」または「パーフロオロ」は、各水素原子それぞれが、ハロ原子またはフッ素原子により置換されている部分を意味する。

0059

ヘテロシクリル」「ヘテロサイクル」または「複素環」は、2から23個の炭素原子ならびに、窒素酸素リンおよび硫黄からなる群から選択される、1から8個のヘテロ原子を含む、安定的な3員から24員の非芳香族環の基を意味する。本明細書において特に断らない限り、前記ヘテロシクリル基は、単環、二環、三環または四環系でもよく、縮合環系または架橋環系を含んでもよい。前記ヘテロシクリル基における、窒素、炭素または硫黄原子は、場合により酸化されてもよく、窒素原子は、場合により四級化されてもよい。前記ヘテロシクリル基は、部分的または完全に飽和でもよい。このようなヘテロシクリル基の例としては、制限されず、ジオキソラニル、チエニル[1,3]ジチアニル、デカヒドロイソキノリルイミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニルオクタヒドロインドリル、オクタヒドロイソインドリル、2−オキソピペラジニル、2−オキソピペリジニル、2−オキソピロリジニルオキサゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、4−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジニル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリルトリチアニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、1−オキソ−チオモルホリニル、1,1−ジオキソ−チオモルホリニル、12−クラウン−4、15−クラウン−5、18−クラウン−6、21−クラウン−7、アザ−18−クラウン−6、ジアザ−18−クラウン−6、アザ−21−クラウン−7およびジアザ−21−クラウン−7があげられる。本明細書において特に断らない限り、ヘテロシクリル基は、場合により置換されてもよい。

0060

ヘテロアリール」は、水素原子、1から13個の炭素原子、窒素、酸素、リンおよび硫黄からなる群から選択される、1から6個のヘテロ原子、ならびに、少なくとも1つの芳香族環を含む、5員から14員の環系基を意味する。本発明の目的のために、前記ヘテロアリール基は、単環、二環、三環または四環系でもよく、縮合環系または架橋環系を含んでもよい。前記ヘテロアリール基における、窒素、炭素または硫黄原子は、場合により酸化されてもよく、窒素原子は、場合により四級化されてもよい。例としては、制限さずれ、アゼピニル、アクリジニル、ベンズイミダゾリルベンゾチアゾリルベンズインドリル、ベンゾジオキソリルベンゾフラニルベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ[b][1,4]ジオキセピニル、1,4−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル(ベンゾチオフェニル)、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ[4,6]イミダゾ[1,2−a]ピリジニルカルバゾリルシンノリニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、イソチアゾリルイミダゾリルインダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソキサゾリルナフチリジニルオキサジアゾリル、2−オキソアゼピニル、オキサゾリルオキシラニル、1−オキシドピリジニル、1−オキシドピリミジニル、1−オキシドピラジニル、1−オキシドピリダジニル、1−フェニル−1H−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニルプリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、キナゾリニルキノキサリニルキノリニル、キヌクリジニル、イソキノリニルテトラヒドロキノリニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリルトリアジニルおよびチオフェニル(すなわち、チエニル)があげられる。本明細書において特に断らない限り、ヘテロアリール基は、場合により置換されてもよい。

0061

上記全ての基は、置換されてもよいし、または非置換のいずれでもよい。本願明細書で使用する場合、「置換された」の用語は、さらに官能化され得る、上記基のいずれか(すなわち、アルキル、アルキレン、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アルキルアミノ、アミジル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル、アミノアルキル、アリール、アラルキル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルカルボニル、シクロアルキルアルキルカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、ハロアルキル、ヘテロシクリルおよび/またはヘテロアリール)を意味する。少なくとも1つの水素原子が、非水素原子置換基への結合により置換される。本明細書において特に断らない限り、置換基は、オキソ、−CO2H、ニトリル、ニトロ、−CONH2、ヒドロキシル、チオオキシ、アルキル、アルキレン、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルキルカルボニル、アルキルオキシカルボニル、アリール、アラルキル、アリールカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルキルカルボニル、アラルキルオキシカルボニル、アリールオキシ、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、シクロアルキルカルボニル、シクロアルキルアルキルカルボニル、シクロアルキルオキシカルボニル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、ジアルキルアミンアリールアミンアルキルアリールアミンジアリールアミン、N−オキシド、イミドおよびエナミン;例えば、トリアルキルシリル基ジアルキルアリールシリル基、アルキルジアリールシリル基トリアリールシリル基の基におけるケイ素原子パーフルオロアルキルもしくはパーフルオロアルコキシ、例えば、トリフルオロメチルもしくはトリフルオロメトキシから選択される、1つ以上の置換基を含んでもよい。「置換された」は、1つ以上の水素原子が、より高い順の結合(例えば、二重結合または三重結合)により、ヘテロ原子、例えば、オキソ、カルボニル、カルボキシルおよびエステルの基における酸素;ならびに、例えば、イミンオキシムヒドラゾンおよびニトリルの基における窒素に置換される、上記基のいずれかも意味する。例えば、「置換された」は、1つ以上の水素原子が、−NRgC(=O)NRgRh、−NRgC(=O)ORh、−NRgSO2Rh、−OC(=O)NRgRh、−ORg、−SRg、−SORg、−SO2Rg、−OSO2Rg、−SO2ORg、=NSO2Rgおよび−SO2NRgRhで置換される、上記基のいずれかを含む。「置換された」は、1つ以上の水素原子が、−C(=O)Rg、−C(=O)ORg、−CH2SO2Rg、−CH2SO2NRgRh、−SH、−SRgまたは−SSRgで置換される、上記基のいずれかも意味する。前述において、RgおよびRhは、同一でも異なってもよく、独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルキルアミノ、チオアルキル、アリール、アラルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、ハロアルキル、ヘテロシクリル、N−ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、N−ヘテロアリールおよび/またはヘテロアリールアルキルである。さらに、前述の各置換基は、場合により、1つ以上の上記置換基で置換されてもよい。さらに、上記基のいずれかは、置換されて、1つ以上の内部酸素原子または硫黄原子を含んでもよい。例えば、アルキル基は、1つ以上の内部酸素原子で置換されて、エーテルまたはポリエーテル基を形成してもよい。同様に、アルキル基は、1つ以上の内部硫黄原子で置換されて、チオエーテルジスルフィド等を形成してもよい。アミジル部分は、2つ以下のハロ原子で置換されてもよく、一方、上記他の基は、1つ以上のハロ原子で置換されてもよい。上記基のいずれかは、アミノ、モノアルキルアミノ、グアニジニルまたはアミジニルで置換されてもよい。上記基のいずれかについての任意の置換基は、アリールホスホリル、例えば、−RaP(Ar)3も含み、Raは、アルキレンであり、Arは、アリール部分、例えば、フェニルである。

0062

アンチセンスオリゴマー」または「アンチセンス化合物」の用語は、互換的に使用され、リボースもしくは他のペントース糖またはモルホリノ基で構成される骨格サブユニットに保有される塩基をそれぞれ有する、サブユニットの配列を意味する。前記骨格基は、前記化合物における塩基を、ワトソンクリック塩基対合により、核酸(典型的にRNA)における標的配列ハイブリダイズさせて、核酸:オリゴマーヘテロ二本鎖を、標的配列内に形成させる、サブユニット間リンケージにより結合される。前記オリゴマーは、前記標的配列に対する正確な配列相補性、または、近い相補性を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、前記標的配列を含むmRNA翻訳を妨害または阻害し、それがハイブリダイズする配列に「向けられる」と言われ得る。

0063

「モルホリノオリゴマー」または「PMO」は、典型的なポリヌクレオチド水素結合可能な塩基を支持する骨格を有するポリマー分子を意味する。前記ポリマーは、ペントース糖骨格部分、より具体的には、ヌクレオチドおよびヌクレオシド特有の、ホスホジエステル結合により結合されたリボース骨格を欠いているが、代わりに環窒素により連結する環窒素を含む。典型的な「モルホリノ」オリゴマーは、1つのサブユニットのモルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの5’環外炭素に結合する、(チオ)ホスホロアミダートまたは(チオ)ホスホロジアミダートのリンケージにより、互いに結合されるモルホリノサブユニット構造を有する。各サブユニットが、塩基特異的水素結合により、ポリヌクレオチドにおける塩基に結合するのに有効な、プリンまたはピリミジン塩基対合部分を含む。モルホリノオリゴマー(アンチセンスオリゴマーを含む)は、例えば、米国特許第5,698,685;5,217,866;5,142,047;5,034,506;5,166,315;5,185,444;5,521,063;5,506,337号明細書、および、係属中の米国特許出願特願12/271,036;12/271,040号;ならびに、国際公開第2009/064471号に詳述され、それらすべては、それらの全体が、参照により本願明細書に取り込まれる。典型的なPMOとしては、前記サブユニット間リンケージがリンケージ(A1)であるPMOがあげられる。

0064

「PMO+」は、以前に記載されている(例えば、その全体が参照により本願明細書に取り込まれる、国際公開第2008/036127号を参照のこと)任意の数の、(1−ピペラジノ)ホスフィニリデンオキシ、(1−(4−(ω−グアニジノアルカノイル))−ピペラジノ)ホスフィニリデンオキシのリンケージ(A2およびA3)を含む、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを意味する。

0065

「PMO−X」は、少なくとも1つのリンケージ(B)または少なくとも1つの開示された末端修飾を含む、本願明細書に開示されたホスホロジアミダートモルホリノオリゴマーを意味する。

0066

「ホスホロアミダート」基は、3つの付着された酸素原子および1つの付着された窒素原子を有するリンを含む。一方、「ホスホロジアミダート」基(例えば、図1D〜Eを参照のこと)は、2つの付着された酸素原子および2つの付着された窒素原子を有するリンを含む。本願明細書、および、同時係属の米国特許出願特願61/349,783および11/801,885号に記載されている、前記オリゴマーの、荷電していないサブユニット間リンケージ、または、修飾されたサブユニット間リンケージにおいて、1つの窒素が、常に骨格鎖にぶら下がっている。ホスホロジアミダートリンケージにおける2番目の窒素は、典型的には、モルホリノ環構造における前記環窒素である。

0067

「チオホスホロアミダート」または「チオホスホロジアミダート」のリンケージは、1つの酸素原子、典型的には、骨格にぶら下がった酸素が硫黄に置換されている、それぞれ、ホスホロアミダートまたはホスホロジアミダートのリンケージである。

0068

「サブユニット間リンケージ」は、2つのモルホリノサブユニットを連結するリンケージ、例えば、構造(I)を意味する。

0069

本願明細書で使用する場合、「荷電した」、「荷電していない」、「カチオン性」および「アニオン性」は、中性pH付近、例えば、約6から8において、化学部分の主な状態を意味する。例えば、前記用語は、生理学的pH、すなわち、約7.4における化学部分の主な状態を意味してもよい。

0070

「低級アルキル」は、1から6個の炭素原子のアルキル基、例えば、メチル、エチル、n−ブチル、i−ブチル、t−ブチル、イソアミル、n−ペンチルおよびイソペンチルを意味する。ある実施形態では、「低級アルキル」基は、1から4個の炭素原子を有する。他の実施形態では、「低級アルキル」基は、1から2個の炭素原子、すなわち、メチルまたはエチルを有する。同様に、「低級アルケニル」は、2から6個のアルケニル基を意味し、好ましくは、3または4個の炭素原子、例えば、アリルおよびブテニルを意味する。

0071

「非干渉」置換基は、目的の標的に結合するための本願明細書に記載のアンチセンスオリゴマーの能力に悪影響を及ぼさないものである。このような置換基としては、小さくて、および/または、比較的に非極性の基、例えば、メチル、エチル、メトキシエトキシまたはフルオロがあげられる。

0072

オリゴヌクレオチドまたはアンチセンスオリゴマーは、前記オリゴマーが生理学的条件下において、Tmが37℃より高く、45℃より高く、好ましくは、少なくとも50℃、および典型的には、60℃〜80℃以上で、標的にハイブリダイズする場合、標的ポリヌクレオチドに、「特異的にハイブリダイズする」。前記オリゴマーにおける「Tm」は、相補的なポリヌクレオチドに、50%がハイブリダイズする温度である。Tmは、例えば、Miyadaら、MethodsEnzymol.154:94−107(1987)に記載のように、生理食塩水における標準的な条件下において決定される。このようなハイブリダイゼーションは、前記標的配列に対する、前記アンチセンスオリゴマーの「近似する」または「実質的な」相補、ならびに、正確な相補により起こり得る。

0073

ポリヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションが、2本の一本鎖ポリヌクレオチド間で逆平衡の構成で起こる場合、互いに「相補的」であると記載される。相補性(1つのポリヌクレオチドがもう1つと相補的である度合い)は、一般的に認められた塩基対合規則に基づいて、互いに水素結合を形成することが予期される、反対鎖における塩基の割合の観点から定量化可能である。

0074

第1の配列が第2のポリヌクレオチド配列と、生理学的条件下において特異的に結合する、または、特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列である場合、第1の配列は、第2の配列に対する「アンチセンス配列」である。

0075

「ターゲッティング配列」の用語は、RNAゲノムにおける前記標的配列に相補的である(さらに、実質的に相補的であることを意味する)、前記オリゴヌクレオチド類似体における配列である。前記類似体化合物の配列全体または一部のみが、前記標的配列に相補的でもよい。例えば、20塩基を有する類似体において、12〜14個のみが、ターゲッティング配列でもよい。典型的に、前記ターゲッティング配列は、前記類似体において、連続した塩基で形成されるが、あるいは、前記標的配列に及ぶ構成配列が、例えば、前記類似体の反対側から位置する場合、非連続的な配列で形成されてもよい。

0076

オリゴヌクレオチド類似体(例えば、荷電していないオリゴヌクレオチド類似体)の「骨格」は、前記塩基対合部分;例えば、本願明細書に記載のように、モルホリノオリゴマーを支持する構造を意味する。前記「骨格」は、サブユニット間リンケージ(例えば、リン含有リンケージ)により連結されるモルホリノ環構造を含む。「実質的に荷電していない骨格」は、50%未満のサブユニット間リンケージが、中性付近のpHで荷電している、オリゴヌクレオチド類似体の骨格を意味する。例えば、実質的に荷電していない骨格は、50%未満、40%未満、30%未満、20%未満、10%未満、5%未満またはさらに0%の、中性付近のpHで荷電しているサブユニット間リンケージを含んでもよい。一部の実施形態では、前記実質的に荷電していない骨格は、4つの(生理学的pHで)荷電していないリンケージ毎に、多くても1つの(生理学的pHで)荷電したサブユニット間リンケージ、8つの荷電していないリンケージ毎に多くても1つ、または、16個の荷電していないリンケージ毎に多くても1つを含む。一部の実施形態では、本願明細書に記載の核酸類似体は、完全に荷電していない。

0077

標的とターゲッティング配列は、ハイブリダイゼーションが逆平行の構成において起こる場合、互いに「相補的」であると記載される。ターゲティング配列は、前記標的配列に対して、「近似する」または「実質的な」相補性、および、目下記載された方法の目的の機能を有してもよく、すなわち「相補的」である。好ましくは、目下記載された方法に使用される前記オリゴヌクレオチド類似体化合物は、10個のヌクレオチド毎に標的配列に対する多くても1つのミスマッチを有し、好ましくは、20個から多くても1つのミスマッチを有する。または、使用される前記アンチセンスオリゴマーは、本願明細書で指定されるように、典型的なターゲッティング配列についての、少なくとも80%、少なくとも90%の配列相同性、または、少なくとも95%の配列相同性を有する。RNA標的に対する相補的結合の目的に関して、以下に記載のように、グアニン塩基は、シトシンまたはウラシルRNA塩基のいずれかに相補的でもよい。

0078

「ヘテロ二本鎖」は、オリゴヌクレオチド類似体と標的RNAの相補的部分との間の二本鎖を意味する。「ヌクレアーゼ耐性ヘテロ二本鎖」は、前記ヘテロ二本鎖が、二本鎖RNA/RNAまたはRNA/DNAの複合体を切断可能な、細胞内および細胞外ヌクレアーゼ、例えば、RNAseHによる、in vivoでの分解に対して、実質的に耐性であるように、アンチセンスオリゴマーをその相補的な標的に結合することにより形成されるヘテロ二本鎖を意味する。

0079

薬剤が、細胞膜を通した受動拡散以外のメカニズムにより細胞に入り得る場合、「哺乳類の細胞により能動的に取り込まれる」。前記薬剤は、例えば、ATP依存性輸送メカニズムにより、哺乳類の細胞膜を通して薬剤を輸送することを意味する「能動輸送」、または、輸送タンパク質への前記薬剤の結合を必要とし、次いで、前記膜を通して結合された薬剤の通過を促進する輸送メカニズムにより、前記細胞膜を通してアンチセンス剤を輸送することを意味する「促進輸送」により、薬剤が輸送されてもよい。

0080

発現を調節する」および/または「アンチセンス活性」の用語は、RNAの発現または翻訳を妨害することにより、所定のタンパク質の発現を向上または、より典型的には、低下させるかのいずれかのアンチセンスオリゴマーの能力を意味する。タンパク質の発現を低下させる場合では、前記アンチセンスオリゴマーは、所定の遺伝子の発現を直接妨害してもよいし、その遺伝子から転写されたRNAの加速された分解に寄与してもよい。本願明細書で記載する時、モルホリノオリゴマーは、前者(立体妨害)のメカニズムを介して機能すると考えられる。好ましいアンチセンスは、ATG開始コドン領域、スプライス部位、スプライス部位にごく近接する領域および、mRNAの5’−非翻訳領域を含む立体妨害するオリゴマーを標的とするが、他の領域は、モルホリノオリゴマーを使用して、うまく標的にされている。

0081

「アミノ酸サブユニット」は、一般的に、α−アミノ酸残基(−CO−CHR−NH−)であるが、β−または他のアミノ酸残基(例えば、−CO−CH2CHR−NH−)でもよく、Rは、アミノ酸側鎖である。

0082

天然に存在するアミノ酸」の用語は、天然に見出されるタンパク質に存在するアミノ酸を意味する。「非天然アミノ酸」の用語は、天然に見出されるタンパク質に存在しないそれらのアミノ酸を意味し、例えば、ベータアラニン(β−Ala)および6−アミノヘキサン酸(Ahx)があげられる。

0083

「有効量」または「治療的に有効量」は、単回投与、または、一連の投与の一部のいずれかとして、哺乳類の被験体に投与され、典型的には、選択された標的核酸配列の翻訳を阻害することによる所望の治療効果を生じるのに有効な、アンチセンスオリゴマーの量を意味する。

0084

個体(例えば、ヒト等の哺乳類)または細胞の「処置」は、前記個体または細胞の自然経過を変えるための試みに使用される、任意の種類の治療介入である。処置としては、制限されず、薬学的組成物の投与があげられ、予防的にまたは、病的な事象の始まりもしくは病原体との接触後のいずれかで行われてもよい。

0085

II.キャリアペプチド
A.前記キャリアペプチドの特性
前述のように、本開示は、キャリアペプチドと核酸類似体とのコンジュゲートに関する。前記キャリアペプチドは、一般的に、前記核酸類似体の細胞浸透を向上するのに効果的である。さらに、本願出願人は、驚くべきことに、前記核酸類似体と前記キャリアペプチドの(例えば、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端またはアミノ末端における)残部との間に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸サブユニットを含むことが、前記キャリアペプチドと核酸類似体との間に、異なるリンケージを有するコンジュゲートと比較して、前記有効性が同等か、または向上されながら、前記コンジュゲートの毒性を低下させることを発見した。このため、本開示のコンジュゲートは、他のペプチド−オリゴマーコンジュゲートより、良好な治療的手段を有し、薬剤候補としての見込みがある。

0086

毒性低減に加えて、前記核酸類似体と前記キャリアペプチドとの間のグリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットの存在が、更なる利点を提供するものと考えられる。例えば、グリシンは、安価であり、ラセミ化の可能性なしに、前記核酸類似体(または、必要に応じたリンカー)に容易に連結される。同様に、プロリンは、ラセミ化なしに容易に連結され、へリックス形成剤でないキャリアペプチドも提供する。プロリンの疎水性は、前記キャリアペプチドと細胞の脂質二重層との相互作用についての、特定の利点を有してもよく、(例えば、ある実施形態では、)複数のプロリンを含むキャリアペプチドは、G四重体形成に抵抗してもよい。最後に、ある実施形態では、前記プロリン部分が、アルギニンアミノ酸サブユニットに隣接する場合、前記プロリン部分は、アルギニン−プロリンのアミド結合が、一般的なエンドペプチダーゼにより切断できないため、前記コンジュゲートに代謝性を付与する。

0087

前述のように、グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットを介して核酸類似体に結合されたキャリアペプチドを含むコンジュゲートは、他の既知のコンジュゲートと比較して、より低い毒性と同等の有効性を有する。本出願のサポートにおいて行われた実験は、他のコンジュゲートと比較して、本開示のコンジュゲートにより、腎毒性マーカーが非常に低いことを示す(例えば、実施例30に記載される、腎傷害マーカー(KIM)および血中尿素窒素(BUN)のデータを参照のこと)。理論に拘束される訳ではないが、本発明者は、本開示のコンジュゲートの低減された毒性は、前記核酸類似体に付着されるペプチドの部分(例えば、カルボキシ末端)に、非天然のアミノ酸、例えば、アミノヘキサン酸またはβ−アラニンが存在しないことに関連すると考えている。これらの非天然のアミノ酸は、in vivoで切断されないため、切断されないペプチドの毒性濃度が蓄積し、毒性を引き起こし得ると考えられる。

0088

前記グリシンまたはプロリン部分は、前記キャリアペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれでもよく、一部の例では、前記キャリアペプチドは、前記グリシンまたはプロリンサブユニットを介して、前記核酸類似体に直接結合されてもよいし、または、前記キャリアペプチドは、必要に応じたリンカーを介して前記核酸類似体に結合されてもよい。

0089

一実施形態では、本開示は、
(a)アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド;および、
(b)実質的に荷電していない骨格および、標的核酸に対する配列特異的結合用のターゲッティング塩基配列を含む核酸類似体;を含み、
2つ以上の前記アミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸サブユニットを含み、前記キャリアペプチドが、前記核酸類似体に共有結合している、コンジュゲートに関する。一部の実施形態では、7個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンであり、例えば、6個以下連続したアミノ酸サブユニットが、アルギニンである。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端に、グリシンアミノ酸サブユニットを含む。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端に、プロリンアミノ酸サブユニットを含む。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端に、単一のグリシンまたはプロリンを含む(すなわち、前記カルボキシ末端に、グリシンまたはプロリンの二量体または三量体等を含まない)。

0090

ある実施形態では、(i)前記アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、前記コードされるタンパク質用の翻訳開始コドンを妨害するのに有効な場合に、コンジュゲートされていないオリゴマーにより提供されたそれと比較して、コードされたタンパク質の発現における減少、または、
(ii)前記アンチセンスオリゴマーのその標的配列への結合が、正確にスプライシングされた、前記タンパク質をコードするプレ−mRNAにおける異常なスプライス部位を妨害するのに有効な場合に、コンジュゲートされていないオリゴマーにより提供されたそれと比較して、コードされたタンパク質の発現における増加、からも明らかなように、実質的に荷電していない骨格を有するアンチセンスオリゴマーにコンジュゲートされた場合、前記キャリアペプチドは、コンジュゲートされていない状態でのアンチセンスオリゴマーと比較して、その標的配列へのアンチセンスオリゴマーの結合を向上するのに有効である。これらの効果の測定に適したアッセイは、以下にさらに記載される。一実施形態では、前記ペプチドの接合は、本願明細書で記載する時、無細胞翻訳アッセイにおけるこの活性を提供する。一部の実施形態では、活性は、少なくとも2つの因子、少なくとも5つの因子または少なくとも10個の因子により向上される。

0091

もう1つの方法として、またはさらに、前記キャリアペプチドは、コンジュゲートされていない状態の類似体と比較して、細胞内への前記核酸類似体の輸送を向上するのに効果的である。ある実施形態では、輸送は、少なくとも2つの因子、少なくとも2つの因子、少なくとも5つの因子または少なくとも10個の因子により向上される。

0092

他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、末端グリシンまたはプロリンアミノサブユニットを欠いたキャリアペプチドを含むコンジュゲートと比較して、前記コンジュゲートの毒性を低減する(すなわち、最大耐性用量が増加する)のに有効である。ある実施形態では、毒性は、少なくとも2つの因子、少なくとも2つの因子、少なくとも5つの因子または少なくとも10個の因子により低減される。

0093

前記ペプチド輸送部分の更なる利点は、アンチセンスオリゴマーとその標的核酸配列との間の二本鎖を安定化するための、その予期された能力である。理論に拘束される訳ではないが、二本鎖を安定化するこの能力は、正電荷を有する輸送部分と負電荷を有する核酸との間の静電相互作用に起因し得る。

0094

前記キャリアペプチドの長さは、特に制限されず、種々の実施形態で変化する。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、4から40個のアミノ酸サブユニットを含む。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、6から30個、6から20個、8から25個または10から20個のアミノ酸サブユニットを含む。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、直鎖状であり、一方、他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、分岐鎖状である。

0095

一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、正電荷を有するアミノ酸サブユニット、例えば、アルギニンアミノ酸サブユニットリッチである。少なくとも10%のアミノ酸サブユニットが正電荷を有する場合、キャリアペプチドは、正電荷を有するアミノ酸「リッチ」である。例えば、一部の実施形態では、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、または少なくとも90%のアミノ酸サブユニットが、正電荷を有する。さらに他の実施形態では、グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットを除くすべてのアミノ酸サブユニットが、正電荷を有する。さらに他の実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸サブユニットの全てが、アルギニンである。

0096

他の実施形態では、前記キャリアペプチドにおける正電荷を有するアミノ酸サブユニットの数は、1から20個、例えば、1から10個または1から6個の範囲である。ある実施形態では、前記キャリアペプチドにおける正電荷を有するアミノ酸サブユニットの数は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個である。

0097

前記正電荷を有するアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、合成アミノ酸修飾アミノ酸または天然アミノ酸の類似体であり得る。例えば、正味の正電荷を有する修飾アミノ酸は、以下により詳細に記載するように、本発明に使用するために特別に設計されてもよい。アミノ酸に対する、多くの種々の種類の修飾が、当該分野において周知である。ある実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸は、ヒスチジン(H)、リジン(K)またはアルギニン(R)である。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、天然のアミノ酸サブユニットのみを含む(すなわち、非天然のアミノ酸を含まない)。他の実施形態では、前記末端アミノ酸は、例えば、アセチルベンゾイルステアリル部分により、例えば、N末端キャップされてもよい。

0098

任意の数、組み合わせおよび/または配列の、H、Kおよび/またはRが、前記キャリアペプチドに存在し得る。一部の実施形態では、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン以外の、全てのアミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸である。他の実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも1個が、アルギニンである。例えば、一部の実施形態では、正電荷を有するアミノ酸の全てが、アルギニンであり、さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、アルギニンと前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンとからなる。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、7つ以下連続したアルギニン、例えば、6個以下連続したアルギニンを含む。

0099

他の種類の正電荷を有するアミノ酸も、想定される。例えば、ある実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸のうちの少なくとも1個は、アルギニン類似体である。例えば、前記アルギニン類似体は、構造RaN=C(NH2)Rb(ここで、RaがHまたはRcであり;RbがRc、NH2、NHRまたはN(Rc)2であり、Rcが低級アルキルまたは低級アルケニルであり、および、場合により、酸素または窒素を含み、または、RaおよびRbが、共に環を形成する)の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸でもよく、前記側鎖は、RaまたはRbを介して前記アミノ酸に結合される。前記キャリアペプチドは、任意の数のこれらのアルギニン類似体を含んでもよい。

0100

前記正電荷を有するアミノ酸は、前記キャリアペプチド内の任意の配列に生じてもよい。例えば、一部の実施形態では、前記正電荷を有するアミノ酸は、交互でもよいし、または、連続でもよい。例えば、前記キャリアペプチドは、配列(Rd)mを含んでもよく、Rdは、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、mが、2から12、2から10、2から8または2から6の範囲の整数である。例えば、ある実施形態では、Rdは、アルギニンであり、前記キャリアペプチドは、(R)4、(R)5、(R)6、(R)7および(R)8から選択され、または、(R)4、(R)5、(R)6および(R)7から選択される配列を含む。例えば、特定の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列(R)6、例えば、(R)6Gまたは(R)6Pを含む。

0101

他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列(Rd)mと、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンとからなり、Rdは、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、mが、2から12、2から10、2から8または2から6の範囲の整数である。ある実施形態では、Rdは、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである。例えば、ある実施形態では、Rdは、アルギニンであり、前記キャリアペプチドは、(R)4、(R)5、(R)6、(R)7および(R)8から選択される配列と、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンとからなる。例えば、特定の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列(R)6Gまたは(R)6Pからなる。

0102

一部の他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、1つ以上の疎水性アミノ酸サブユニットを含んでもよい。前記疎水性アミノ酸サブユニットは、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールまたはアラルキルの側鎖を含み、前記アルキル、アルケニルおよびアルキニルの側鎖は、6つの炭素原子酸毎に、多くても1つのヘテロ原子を含む。一部の実施形態では、前記疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン(F)である。例えば、前記キャリアペプチドは、2個以上連続した疎水性アミノ酸、例えば、フェニルアラニン(F)、例えば、2個連続したフェニルアラニン部分を含んでもよい。前記疎水性アミノ酸は、前記キャリアペプチド配列における任意の箇所に存在し得る。

0103

他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列[(RdYbRd)x(RdRdYb)y]zまたは[(RdRdYb)y(RdYbRd)x]zを含み、Rdは、各出現箇所で独立して、正電荷を有するアミノ酸であり、xおよびyは、各出現箇所で独立して、0または1であり、x+yは、1または2であることが提供され、zは、1、2、3、4、5または6であり、および、Ybは、



であり、
式中、nは、2から7であり、各Reは、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。一部のこれらの実施形態では、Rdは、各出現箇所で独立して、アルギニン、ヒスチジンまたはリジンである。他の実施形態では、各Rdは、アルギニンである。他の実施形態では、nは5であり、Ybは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、nは2であり、Ybは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Reは、水素である。

0104

前述のある実施形態では、xは1であり、yは0であり、前記キャリアペプチドは、配列(RdYbRd)zを含む。他の実施形態では、nは5であり、Ybは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、nは2であり、Ybは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Reは、水素である。

0105

前述のさらに他の実施形態では、xは0であり、yは1であり、前記キャリアペプチドは、配列(RdRdYb)zを含む。他の実施形態では、nは5であり、Ybは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、nは2であり、Ybは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Reは、水素である。

0106

他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列(RdYb)pを含む。RdおよびYbは、上記定義のとおりであり、pは、2から8の範囲の整数である。他の実施形態では、各Rdは、アルギニンである。他の実施形態では、nは5であり、Ybは、アミノヘキサン酸部分である。他の実施形態では、nは2であり、Ybは、β−アラニン部分である。さらに他の実施形態では、Reは、水素である。

0107

他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列ILFQYを含む。前記ペプチドは、ILFQY配列に加えて、本願明細書に開示の任意の他の配列を含んでもよい。例えば、前記キャリアペプチドは、ILFQYおよび、[(RdYbRd)x(RdRdYb)y]z、[(RdRdYb)y(RdYbRd)x]z、(RdYb)pまたはそれらの組み合わせを含んでもよく、Rd、x、yおよびYbは、上記定義のとおりである。前記[(RdYbRd)x(RdRdYb)y]z、[(RdRdYb)y(RdYbRd)x]zまたは(RdYb)pの配列は、前記ILFQY配列のアミノ末端、カルボキシ末端または両方に存在してもよい。ある実施形態では、xは1であり、yは0であり、前記キャリアペプチドは、任意のZリンカーを介して、前記ILFQY配列に結合される(RdYbRd)zを含む。

0108

他の関連する実施形態では、前記キャリアペプチドは、配列ILFQ、IWFQまたはILIQを含む。他の実施形態は、配列PPMWS、PPMWT、PPMFSまたはPPMYSを含むキャリアペプチドを含む。前記キャリアペプチドは、これらの配列に加えて、本願明細書に記載の任意の他の配列、例えば、さらに、配列[(RdYbRd)x(RdRdYb)y]z、[(RdRdYb)y(RdYbRd)x]z、または(RdYb)pを含んでもよく、Rd、x、yおよびYbは、上記定義のとおりである。

0109

前記キャリアペプチドの一部の実施形態では、天然に存在するアミノ酸サブユニットに対する修飾を有し、例えば、前記アミノ末端またはカルボキシ末端のアミノ酸サブユニットが、修飾され得る。このような修飾としては、結合していないアミノまたは結合していないカルボキシを、疎水性基でキャップすることを含む。例えば、前記アミノ末端は、アセチル、ベンゾイルまたはステアロイル部分によりキャップされてもよい。例えば、表1における任意のペプチド配列が、前記表において特別に示されていなくても、このような修飾を有し得る。これらの実施形態では、前記キャリアペプチドのアミノ末端は、下記のように示され得る。

0110

0111

さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、アラニン、アスパラギンシステイングルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニンセリンまたはスレオニンのうちの少なくとも1つを含む。

0112

本願明細書に開示の一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、上記の配列と、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットとからなる。

0113

一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、下記の配列(アミノ末端からカルボキシ末端):R6G、R7G、R8G、R5GR4G、R5F2R4G、Tat−G、rTat−G、(RXR2G2)2または(RXR3X)2Gを構成しない。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、R8G、R9GまたはR9F2Gを構成しない。さらに他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、下記の配列:Tat−G、rTat−G、R9F2G、R5F2R4、R4G、R5G、R6G、R7G、R8G、R9G、(RXR)4G、(RXR)5G、(RXRRBR)2G、(RAR)4F2または(RGR)4F2を構成しない。他の実施形態では、前記キャリアペプチドは、「ペネトラチン」または「R6Pen」を構成しない。
もう1つの態様では、本開示は、
実質的に荷電していない骨格およびターゲッティング塩基配列を有する核酸類似体、および、
前記核酸類似体に共有結合され、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンのアミノ酸サブユニットを含み、Rdサブユニット、Yサブユニットおよび任意のZサブユニットから選択される、8から16個の更なる他のサブユニットからなり、少なくとも8つのRdサブユニット、少なくとも2つのYサブユニットおよび、多くても3つのZサブユニットを含み、前記サブユニットの>50%が、Rdサブユニットである、ペプチドを含み、
(a)各Rdサブユニットは、独立して、アルギニンまたはアルギニン類似体で表わされ、前記アルギニン類似体が、構造RaN=C(NH2)Rb(ここで、RaがHまたはRcであり;RbがRc、NH2、NHRまたはN(Rc)2であり、Rcが低級アルキルまたは低級アルケニルであり、および、場合により、酸素または窒素を含み、または、RaおよびRbが、共に環を形成する)の側鎖を含むカチオン性α−アミノ酸であり、前記側鎖は、RaまたはRbを介してアミノ酸に結合され、
(b)前記少なくとも2つのYサブユニットは、YaまたはYbであり、
(i)各Yaは、独立して、置換または非置換のアルキル、アルケニル、アルキニル、アリールおよびアラルキルから独立して選択される側鎖を有する、中性のα−アミノ酸サブユニットであり、置換されたアルキル、アルケニルおよびアルキニルから選択された場合、前記側鎖は、2つ毎、好ましくは4つ毎、およびより好ましくは、6つの炭素原子毎に多くても1つのヘテロ原子を含み、前記サブユニットは、連続的であるか、または、リンカー部分に隣接しており、および、
(ii)Ybは、




であり、式中、nは、2から7であり、各Reは、各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり、
(c)Zは、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、メチオニン、セリン、スレオニンおよび、生理学的pHで負に荷電している側鎖(例えば、カルボキシレート側鎖)を除く、天然に存在する側鎖の1つまたは2つの炭素同族体である側鎖を有するアミノ酸から選択されるアミノ酸サブユニットを表わす、ペプチド−核酸類似体コンジュゲートを提供する。一部の実施形態では、前記側鎖は、中性である。他の実施形態では、前記Z側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。一部の実施形態では、前記任意のZサブユニットは、アラニン、グリシン、メチオニン、セリンおよびスレオニンから選択される。前記キャリアペプチドは、0、1、2または3つのZサブユニットを含んでもよく、一部の実施形態では、多くても2つのZサブユニットを含む。

0114

選択された実施形態では、前記キャリアペプチドは、Ya型のYサブユニットを、正確に2つ有する。前記Yサブユニットは、連続しているか、または、システインサブユニットに隣接している。一部の実施形態では、前記2つのYaサブユニットは、連続している。他の実施形態では、Yaサブユニットについての側鎖は、生理学的pHで荷電している側鎖を除く、天然に存在するアミノ酸の側鎖、および、それらの1つまたは2つの炭素同族体を含む。他の可能性のある側鎖は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。更なる実施形態では、前記側鎖は、アリールまたはアラルキルの側鎖であり、例えば、各Yaは、独立して、フェニルアラニン、チロシントリプトファンロイシンイソロイシンおよびバリンから選択されてもよい。

0115

選択された実施形態では、各Yaは、独立して、フェニルアラニンおよびチロシンから選択される。更なる実施形態では、各Yaは、フェニルアラニンである。これにより、例えば、アルギニンサブユニット、フェニルアラニンサブユニット、前記グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニット、必要に応じたリンカー部分および核酸類似体からなるコンジュゲートが含まれる。1つのこのようなコンジュゲートは、式Arg9Phe2aaを有するペプチドを含み、aaは、グリシンまたはプロリンである。

0116

前述のキャリアペプチドは、ILFQY、ILFQ、IWFQまたはILIQを含んでもよい。他の実施形態は、前記配列PPMWS、PPMWT、PPMFSまたはPPMYSを含む、前述のキャリアペプチドを含む

0117

本発明のペプチド−オリゴマーコンジュゲートは、コンジュゲートしていないオリゴマーより、無細胞翻訳系を含むタンパク質発現系における標的のmRNAの発現阻害;標的のプレ−mRNAのスプライシング阻害;および、ウイルスの核酸複製またはmRNA転写を制御するシス作用性要素を標的とすることにより、ウイルスの複製を阻害することを含む、種々の機能において効果的である。

0118

他の薬物(すなわち、核酸類似体でない)と、前記キャリアペプチドとのコンジュゲートも、本発明のスコープ内に含まれる。具体的には、一部の実施形態は、
(a)アミノ酸サブユニットを含むキャリアペプチド;および
(b)薬物;を含み、
2つ以上の前記アミノ酸サブユニットが、正電荷を有するアミノ酸であり、前記キャリアペプチドが、前記キャリアペプチドのカルボキシ末端に、グリシン(G)またはプロリン(P)アミノ酸サブユニットを含み、前記キャリアペプチドが、前記薬物に共有結合しているコンジュゲートを提供する。これらの実施形態における前記キャリアペプチドは、本願明細書に記載の任意のキャリアペプチドでもよい。前記薬物を前記キャリアペプチドにコンジュゲートすることにより、前記薬物を送達するための方法も提供される。

0119

送達される前記薬物は、生物学的に活性な薬剤、例えば、治療剤または診断剤でもよく、前記薬物は、検出に使用される化合物、例えば、蛍光化合物でもよい。生物学的に活性な薬剤としては、生体分子、例えば、ペプチド、タンパク質、糖類または核酸、特にアンチセンスオリゴヌクレオチド、または、「小分子」の有機もしくは無機の化合物から選択される原薬があげられる。「小分子」化合物は、前述の生体分子ではない、有機、無機または有機金属の化合物として、幅広く規定されてもよい。典型的には、このような化合物は、1000未満、一実施形態では、500未満の分子量を有する。

0120

一実施形態では、送達される前記薬物は、単一のアミノ酸、ジペプチドまたはトリペプチドを含まないと考えられる。別の実施形態では、送達される前記薬物は、短いオリゴペプチド;すなわち、6つ以下のアミノ酸サブユニットを有するオリゴペプチドを含まない。更なる実施形態では、送達される前記薬物は、より長いオリゴペプチド;すなわち、7個と20個との間のアミノ酸サブユニットを有するオリゴペプチドを含まない。更なる実施形態では、送達される前記薬物は、20個より多いアミノ酸サブユニットを有するポリペプチドまたはタンパク質を含まない。

0121

前記キャリアペプチドは、コンジュゲートされていない状態での前記薬物と比較して、細胞内への前記薬物の輸送を向上するのに効果的であり、および/または、グリシンまたはプロリンサブユニットを欠いている相当するペプチドにコンジュゲートされた前記薬物と比較して、より低い毒性を有する。一部の実施形態では、輸送は、少なくとも2つ、少なくとも5つまたは少なくとも10個の因子により向上される。他の実施形態では、毒性は、少なくとも2つ、少なくとも5つまたは少なくとも10個の因子により低減される(すなわち、最大耐性用量が増加される)。

0122

B.ペプチドリンカー
前記キャリアペプチドは、当業者に利用可能な各種の方法により、送達される前記薬剤(例えば、核酸類似体、薬物等)に結合され得る。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、介在リンカーなしに、前記核酸類似体に直接結合される。この点で、末端アミノ酸と、前記核酸類似体上の結合していないカルボキシルの結合していないアミンとの間のアミド結合の形成は、前記コンジュゲートの形成に有用であり得る。ある実施形態では、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリンサブユニットは、前記核酸類似体の3’端に、直接結合される。例えば、前記キャリアペプチドは、前記カルボキシ末端のグリシンまたはプロリン部分と、3’モルホリノ環窒素との間にアミド結合を形成することにより、結合されてもよい(例えば、図1Cを参照のこと)。

0123

一部の実施形態では、前記核酸類似体は、YaまたはYbサブユニット、システインサブユニットおよび、荷電していない非アミノ酸リンカー部分から選択されるリンカー部分を介して、前記キャリアペプチドにコンジュゲートされる。他の実施形態では、前記核酸類似体は、前記キャリアペプチドに、前記グリシンまたはプロリン部分を介して、前記核酸類似体の5’端または3’端のいずれかに直接結合される。一部の実施形態では、前記キャリアペプチドは、前記グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニットを介して、前記核酸類似体の3’に、直接結合され、例えば、アミド結合を介して、3’モルホリノ窒素に直接結合される。

0124

他の実施形態では、前記コンジュゲートは、前記末端グリシンまたはプロリンアミノ酸サブユニット間に、結合部分を含む。一部の実施形態では、前記リンカーは、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノ、アミド、エステル、カルボニル、カルバマート、ホスホロジアミダート、ホスホロアミダート、ホスホロチオアートおよびホスホジエステルから選択される結合を含む、長さ18原子以下である。ある実施形態では、前記リンカーは、ホスホロジアミダートおよびピペラジン結合を含む。例えば、一部の実施形態では、前記リンカーは、下記構造(XXIX):




を有し、ここで、R24は存在しないか、HまたはC1−C6アルキルである。ある実施形態では、R24は存在せず、他の実施形態では、構造(XXIX)は、核酸類似体(例えば、モルホリノオリゴマー)の5’端を、前記キャリアペプチドに結合する(例えば、図1Bを参照のこと)。

0125

一部の実施形態では、前記Rdサブユニットの側鎖部分は、独立して、グアニジル(HN=C(NH2)NH−)、アミジニル(HN=C(NH2)C<)、2−アミノジヒドロピリミジル、2−アミノテトラヒドロピリミジル、2−アミノピリジルおよび2−アミノピリミジルから選択される。

0126

複数のキャリアペプチドは、必要に応じて、単一の化合物に付着され得る。または、複数の化合物は、単一の輸送体にコンジュゲートされ得る。前記キャリアペプチドと前記核酸類似体との間の前記リンカーは、天然のアミノ酸または非天然のアミノ酸(例えば、6−アミノヘキサン酸またはβ−アラニン)から構成されてもよい。前記リンカーは、前記輸送体ペプチドのカルボキシ末端と、前記核酸類似体のアミンまたはヒドロキシ基(例えば、3’モルホリノ窒素または5’OH)との間に、例えば、カルボジイミドにより促進された縮合により形成された、直接結合を含んでもよい。

0127

一般的に、前記リンカーは、前記コンジュゲートの輸送または機能を妨害しない、任意の非反応性部分を含んでもよい。リンカーは、例えば、エーテル、チオエーテル、アミドまたはカルバマート結合を含む、通常の使用条件下において、非開裂性であるものから選択され得る。他の実施形態では、前記リンカーは、in vivoにおいて開裂可能な、前記キャリアペプチドと化合物(例えば、オリゴヌクレオチド類似体、薬物等)との間のリンケージを含むことが望まれる。in vivoにおいて開裂可能な結合は、当該分野において公知であり、例えば、酵素的加水分解されるカルボン酸エステル、および、グルタチオンの存在下において開裂されるジスルフィドがあげられる。適切な波長放射の適用により、in vivoにおいて、光分解で開裂可能なリンケージ、例えば、オルトニトロフェニルエーテルを、開裂するのに適していてもよい。開裂性のジスルフィド基をさらに含む、典型的なヘテロ二機能性結合剤としては、N−ヒドロキシスクシンイミジル3−[(4−アジドフェニル)ジチオプロピオネートおよび、Vanin,E.F.and Ji,T.H.,Biochemistry 20:6754−6760(1981)に記載の他のものがあげられる。

0128

C.典型的なキャリアペプチド
典型的なキャリアペプチドの配列およびオリゴヌクレオチド配列の表が、以下の表1に提供される。一部の実施形態では、本開示は、ペプチドオリゴマーコンジュゲートを提供し、前記ペプチドは、表1における前記ペプチド配列のいずれか1つを含むか、または、前記いずれか1つからなる。もう1つの実施形態では、前記核酸類似体は、表1における前記オリゴヌクレオチド配列のいずれかを含むか、または、前記いずれかからなる。さらに他の実施形態では、本開示は、ペプチドオリゴマーコンジュゲートを提供し、前記ペプチドは、表1における前記ペプチド配列のいずれか1つを含むか、または、前記いずれか1つからなり、前記核酸類似体は、表1における前記オリゴヌクレオチド配列のいずれかを含むか、または、前記いずれかからなる。他の実施形態では、本開示は、表1における前記配列のいずれか1つを含むか、または、前記いずれか1つからなるペプチドを提供する。

0129

0130

aa=グリシンまたはプロリン;B=β−アラニン;X=6−アミノヘキサン酸;tg=非修飾アミノ末端または、アセチル、ベンゾイルもしくはステアロイルの基によりキャップされたアミノ末端(すなわち、アセチルアミド、ベンゾイルアミドまたはステアロイルアミド)、ならびに、Ybは、−C(O)−(CHRe)n−NH−であり、nは、2から7であり、各Reは、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。分かりやすくするために、全ての配列が、末端tg基を有することに言及しているわけではない。ただし、上記各配列は、非修飾アミノ末端または、アセチル、ベンゾイルもしくはステアロイルの基によりキャップされたアミノ末端を含んでもよい。

0131

III.アンチセンスオリゴマー
本発明のコンジュゲートに含まれる核酸類似体は、ポリヌクレオチドの標的配列に、塩基特異的に結合可能な、実質的に荷電していない合成オリゴマー、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド類似体である。このような類似体としては、例えば、メチルホスホネートペプチド核酸、実質的に荷電していないN3’→P5’ホスホロアミダートおよびモルホリノオリゴマーがあげられる。

0132

類似体骨格により支持された塩基対合基により提供される、前記核酸類似体の塩基配列は、任意の配列とすることができ、前記支持された塩基対合基としては、標準もしくは修飾されたA、T、C、GおよびUの塩基、または、非標準的なイノシン(I)および7−デアザG塩基があげられる。

0133

一部の実施形態では、前記核酸類似体は、モルホリノオリゴマー、すなわち、図1に示される型のモルホリノサブユニット構造で構成されるオリゴヌクレオチド類似体である。(i)前記構造は、長さ1〜3原子、好ましくは長さ2原子のリン含有リンケージが、1つのサブユニットの前記モルホリノ窒素を、隣接するサブユニットの5’環外炭素に結合することにより、互いに結合される。(ii)PiおよびPjは、塩基特異的な水素結合により、ポリヌクレオチドにおける塩基に結合するのに効果的な、プリンまたはピリミジンの塩基対合部分である。前記プリンまたはピリミジンの塩基対合部分は、典型的に、アデニン、シトシン、グアニン、ウラシルまたはチミンである。前記モルホリノオリゴマーの合成、構造および結合特性は、以下でさらに記載され、米国特許第5,698,685、5,217,866、5,142,047、5,034,506、5,166,315、5,521,063および5,506,337号明細書に詳述されており、それらの全てが参照により本願明細書に取り込まれる。

0134

前記モルホリノベースのオリゴマーの所望の化学的特性としては、8〜14塩基の短さのオリゴマーでさえ高いTmを有する標的RNAを含む、相補的塩基標的核酸と選択的にハイブリダイズする能力、哺乳類の細胞内に能動的に輸送される能力、および、RNAse分解に耐性を有するオリゴマー:RNAヘテロ二本鎖の能力があげられる。

0135

好ましい実施形態では、前記モルホリノオリゴマーは、長さが約8〜40個のサブユニットである。より典型的には、前記オリゴマーは、長さが約8〜20個、約8〜16個、約10〜30個または約12〜25個のサブユニットである。一部の用途、例えば、抗菌に関して、例えば、長さが約8〜12個のサブユニットの短いオリゴマーが、本願明細書に開示のように、ペプチド輸送体に付着される場合、特に有利であり得る。

0136

A.修飾されたサブユニット間リンケージを有するオリゴマー
本開示の一実施形態は、修飾されたサブユニット間リンケージを含む核酸類似体(例えば、モルホリノオリゴマー)を含む、ペプチド−オリゴマーコンジュゲートに関する。一部の実施形態では、前記コンジュゲートは、対応する非修飾オリゴマーが有するより高い、DNAおよびRNAに対する親和性を有し、他のサブユニット間リンケージを有するオリゴマーと比較して、改善された細胞送達、有効性および/または組織分布特性を示す。一実施形態では、前記コンジュゲートは、以下に定義されるように、1つ以上の(A)型のサブユニット間リンケージを含む。他の実施形態では、前記コンジュゲートは、以下に定義されるように、少なくとも1つの(B)型のサブユニット間リンケージを含む。さらに他の実施形態では、前記コンジュゲートは、(A)型および(B)型のサブユニット間リンケージを含む。さらに他の実施形態では、前記コンジュゲートは、以下により詳細に記載するように、モルホリノオリゴマーを含む。種々のリンケージ型およびオリゴマーの構造的特徴および特性は、下記記載においてより詳細に記載される。

0137

1.リンケージ(A)
本願出願人は、アンチセンス活性、生体内分布および/または他の所望の特性の向上が、種々のサブユニット間リンケージを有するオリゴマーを調製することにより最適化され得ることを見出した。例えば、前記オリゴマーは、場合により、1つ以上の(A)型のサブユニット間リンケージを含んでもよい。ある実施形態では、前記オリゴマーは、少なくとも1つの(A)型のリンケージを含み、例えば、各リンケージが、(A)型でもよい。一部の他の実施形態では、各(A)型リンケージは、同じ構造を有する。(A)型のリンケージは、その全体が参照により本願明細書に取り込まれる、共所有の米国特許第7,943,762号明細書に開示されたリンケージを含んでもよい。リンケージ(A)は、3’および5’が、それぞれ、前記モルホリノ環(すなわち、以下に記載される構造(i))の3’端および5’端に対する付着点を示す下記構造(I)




または、その塩もしくはその異性体を有し、式中、
Wは、各出現箇所で独立して、SまたはOであり;
Xは、各出現箇所で独立して、−N(CH3)2、−NR1R2、−OR3または




であり;
Yは、各出現箇所で独立して、Oまたは−NR2であり;
R1は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり;
R2は、各出現箇所で独立して、水素または−LNR4R5R7であり;
R3は、各出現箇所で独立して、水素またはC1−C6アルキルであり;
R4は、各出現箇所で独立して、水素、メチル、−C(=NH)NH2、−Z−L−NHC(=NH)NH2または−[C(O)CHR’NH]mHであり、Zは、−C(=O)−または直接結合であり、R’は、天然に存在するアミノ酸または1つもしくは2つのその炭素同族体の側鎖であり、mは、1から6であり;
R5は、各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対であり;
R6は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルであり;
R7は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C6アルキルまたはC1−C6アルコキシアルキルであり;
Lは、アルキル、アルコキシもしくはアルキルアミノの基またはそれらの組み合わせを含む、長さ18個原子以下の必要に応じたリンカーである。

0138

一部の例では、前記オリゴマーは、少なくとも1つの(A)型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、少なくとも2個連続した(A)型リンケージを含む。更なる実施形態では、前記オリゴマーにおける少なくとも5%のリンケージが、(A)型である。例えば、一部の実施形態では、5%−95%、10%から90%、10%から50%または10%から35%の前記リンケージが、(A)型リンケージでもよい。一部の特定の実施形態では、少なくとも1つの(A)型リンケージは、−N(CH3)2である。他の実施形態では、各(A)型リンケージは、−N(CH3)2である。さらに他の実施形態では、前記オリゴマーにおける各リンケージは、−N(CH3)2である。他の実施形態では、少なくとも1つの(A)型リンケージは、ピペリジン−1−イル、例えば、非置換のピペラジン−1−イル(例えば、A2またはA3)である。他の実施形態では、各(A)型リンケージは、ピペリジン−1−イル、例えば、非置換のピペラジン−1−イルである。

0139

一部の実施形態では、Wは、各出現箇所で独立して、SまたはOであり、ある実施形態では、Wは、Oである。

0140

一部の実施形態では、Xは、各出現箇所で独立して、−N(CH3)2、−NR1R2、−OR3である。一部の実施形態では、Xは、−N(CH3)2である。他の態様では、Xは、−NR1R2であり、他の例では、Xは、−OR3である。

0141

一部の実施形態では、R1は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。一部の実施形態では、R1は、水素である。他の実施形態では、Xは、メチルである。

0142

一部の実施形態では、R2は、各出現箇所で水素である。他の実施形態では、R2は、各出現箇所で−LNR4R5R7である。一部の実施形態では、R3は、各出現箇所で独立して、水素またはC1−C6アルキルである。他の実施形態では、R3は、メチルである。さらに他の実施形態では、R3は、エチルである。一部の他の実施形態では、R3は、n−プロピルまたはイソプロピルである。一部の他の実施形態では、R3は、C4アルキルである。他の実施形態では、R3は、C5アルキルである。一部の他の実施形態では、R3は、C6アルキルである。

0143

ある実施形態では、R4は、各出現箇所で独立して、水素である。他の実施形態では、R4は、メチルである。さらに他の実施形態では、R4は、−C(=NH)NH2である。他の実施形態では、R4は、−Z−L−NHC(=NH)NH2である。さらに他の実施形態では、R4は、−[C(=O)CHR’NH]mHである。一実施形態では、Zは、−C(=O)−であり、もう1つの実施形態では、Zは、直接結合である。R’は、天然に存在するアミノ酸の側鎖である。一部の実施形態では、R’は、1つまたは2つの、天然に存在するアミノ酸の側鎖の炭素同族体である。

0144

mは、1から6の整数である。mは、1でもよい。mは、2でもよい。mは、3でもよい。mは、4でもよい。mは、5でもよい。mは、6でもよい。

0145

一部の実施形態では、R5は、各出現箇所で独立して、水素、メチルまたは電子対である。一部の実施形態では、R5は、水素である。他の実施形態では、R5は、メチルである。さらに他の実施形態では、R5は、電子対である。

0146

一部の実施形態では、R6は、各出現箇所で独立して、水素またはメチルである。一部の実施形態では、R6は、水素である。他の実施形態では、R6は、メチルである。

0147

他の実施形態では、R7は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C6アルキルまたはC2−C6アルコキシアルキルである。一部の実施形態では、R7は、水素である。他の実施形態では、R7は、C1−C6アルキルである。さらに他の実施形態では、R7は、C2−C6アルコキシアルキルである。一部の実施形態では、R7は、メチルである。他の実施形態では、R7は、エチルである。さらに他の実施形態では、R7は、n−プロピルまたはイソプロピルである。一部の他の実施形態では、R7は、C4アルキルである。一部の実施形態では、R7は、C5アルキルである。一部の実施形態では、R7は、C6アルキルである。さらに他の実施形態では、R7は、C2アルコキシアルキルである。一部の他の実施形態では、R7は、C3アルコキシアルキルである。さらに他の実施形態では、R7は、C4アルコキシアルキルである。一部の実施形態では、R7は、C5アルコキシアルキルである。他の実施形態では、R7は、C6アルコキシアルキルである。

0148

前述のように、リンカー基Lは、Lにおける末端原子(例えば、カルボニルまたは窒素に隣接するもの)が炭素原子であるという条件で、アルキル(例えば、−CH2−CH2−)、アルコキシ(例えば、−C−O−C−)およびアルキルアミノ(例えば、−CH2−NH−)から選択されるその骨格における結合を含む。分岐鎖状のリンケージ(例えば、−CH2−CHCH3−)が可能であるが、前記リンカーは、一般的に非分岐鎖状である。一実施形態では、前記リンカーは、炭化水素リンカーである。このようなリンカーは、構造(CH2)n−を有してもよく、nは、1−12、好ましくは2−8、および、より好ましくは2−6である。

0149

任意の数の(A)型リンケージを有するオリゴマーが、提供される。一部の実施形態では、前記オリゴマーは、(A)型リンケージを含まない。ある実施形態では、5、10、20、30、40、50、60、70、80または90パーセントの前記リンケージが、(A)型リンケージである。選択された実施形態では、10から80、20から80、20から60、20から50、20から40または20から35パーセントの前記リンケージが、(A)型リンケージである。さらに他の実施形態では、各リンケージが、(A)型である。

0150

2.リンケージ(B)
一部の実施形態では、前記オリゴマーは、少なくとも1つの(B)型リンケージを含む。例えば、前記オリゴマーは、1、2、3、4、5、6個以上の(B)型リンケージを含んでもよい。前記(B)型リンケージは、隣接してもよいし、または、前記オリゴマー全体に分散されてもよい。(B)型リンケージは、下記化合構造(I):




または、その塩もしくはその異性体を有する。式中、
Wは、各出現箇所で独立して、SまたはOであり;
Xは、各出現箇所で独立して、−NR8R9または−OR3であり;および、
Yは、各出現箇所で独立して、Oまたは−NR10であり、
R3は、各出現箇所で独立して、水素またはC1−C6アルキルであり;
R8は、各出現箇所で独立して、水素またはC2−C12アルキルであり;
R9は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アラルキルまたはアリールであり;
R10は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキルまたは−LNR4R5R7であり;
R8およびR9が結合して、5〜18員の単環もしくは二環複素環、または、R8、R9またはR3がR10と結合して、5〜7員の複素環を形成する。Xが4−ピペラジノである場合、Xは、下記構造(III):




を有する。式中、
R11は、各出現箇所で独立して、C2−C12アルキル、C1−C12アミノアルキル、C1−C12アルキルカルボニル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルであり;
Rは、各出現箇所で独立して、電子対、水素またはC1−C12アルキルであり;および、
R12は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アミノアルキル、−NH2、−CONH2、−NR13R14、−NR13R14R15、C1−C12アルキルカルボニル、オキソ、−CN、トリフルオロメチル、アミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニル、グアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラート、デオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−SR13またはC1−C12アルコキシであり、R13、R14およびR15は、各出現箇所で独立して、C1−C12アルキルである。

0151

一部の実施例では、前記オリゴマーは、1つの(B)型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、2つの(B)型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、3つの(B)型リンケージを含む。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーは、4つの(B)型リンケージを含む。さらに他の実施形態では、前記(B)型リンケージは、連続的である(すなわち、前記(B)型リンケージは、互いに隣接する)。更なる実施形態では、前記オリゴマーにおける少なくとも5%の前記リンケージは、(B)型である。例えば、一部の実施形態では、5%−95%、10%から90%、10%から50%または10%から35%の前記リンケージが、(B)型リンケージでもよい。

0152

他の実施形態では、R3は、各出現箇所で独立して、水素またはC1−C6アルキルである。さらに他の実施形態では、R3は、メチルでもよい。一部の実施形態では、R3は、エチルでもよい。一部の他の実施形態では、R3は、n−プロピルまたはイソプロピルでもよい。さらに他の実施形態では、R3は、C4アルキルでもよい。一部の実施形態では、R3は、C5アルキルでもよい。一部の実施形態では、R3は、C6アルキルでもよい。

0153

一部の実施形態では、R8は、各出現箇所で独立して、水素またはC2−C12アルキルである。一部の実施形態では、R8は、水素である。さらに他の実施形態では、R8は、エチルである。一部の他の実施形態では、R8は、n−プロピルまたはイソプロピルである。一部の実施形態では、R8は、C4アルキルである。さらに他の実施形態では、R8は、C5アルキルである。他の実施形態では、R8は、C6アルキルである。一部の実施形態では、R8は、C7アルキルである。さらに他の実施形態では、R8は、C8アルキルである。他の実施形態では、R8は、C9アルキルである。さらに他の実施形態では、R8は、C10アルキルである。一部の他の実施形態では、R8は、C11アルキルである。さらに他の実施形態では、R8は、C12アルキルである。一部の他の実施形態では、R8は、C2−C12アルキルであり、前記C2−C12アルキルは、1つ以上の二重結合(例えば、アルケン)、三重結合(例えば、アルキン)または両方を含む。一部の実施形態では、R8は、非置換のC2−C12アルキルである。

0154

一部の実施形態では、R9は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アラルキルまたはアリールである。一部の実施形態では、R9は、水素である。さらに他の実施形態では、R9は、C1−C12アルキルである。他の実施形態では、R9は、メチルである。さらに他の実施形態では、R9は、エチルである。一部の他の実施形態では、R9は、n−プロピルまたはイソプロピルである。一部の実施形態では、R9は、C4アルキルである。一部の実施形態では、R9は、C5アルキルである。さらに他の実施形態では、R9は、C6アルキルである。一部の他の実施形態では、R9は、C7アルキルである。一部の実施形態では、R9は、C8アルキルである。一部の実施形態では、R9は、C9アルキルである。一部の他の実施形態では、R9は、C10アルキルである。一部の他の実施形態では、R9は、C11アルキルである。さらに他の実施形態では、R9は、C12アルキルである。

0155

一部の他の実施形態では、R9は、C1−C12アラルキルである。例えば、一部の実施形態では、R9は、ベンジルであり、前記ベンジルは、場合により、フェニル環またはベンジル炭素のいずれかにおいて置換されてもよい。この点で、置換基としては、アルキルおよびアルコキシの基、例えば、メチルまたはメトキシがあげられる。一部の実施形態では、前記ベンジル基は、前記ベンジル炭素において、メチルで置換される。例えば、一部の実施形態では、R9は、下記構造(XIV):




を有する。

0156

他の実施形態では、R9は、アリールである。例えば、一部の実施形態では、R9は、フェニルであり、前記フェニルは、場合により置換されてもよい。この点で、置換基としては、アルキルおよびアルコキシの基、例えば、メチルまたはメトキシがあげられる。他の実施形態では、R9は、フェニルであり、前記フェニルは、クラウンエーテル部分、例えば、12〜18員のクラウンエーテルを含む。一実施形態では、前記クラウンエーテルは、18員環であり、なお更なるフェニル部分を含んでもよい。例えば、一実施形態では、R9は、下記構造(XV)または(XVI):




の1つを有する。

0157

一部の実施形態では、R10は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキルまたは−LNR4R5R7であり、R4、R5およびR7は、リンケージ(A)に関して上記定義のとおりである。他の実施形態では、R10は、水素である。他の実施形態では、R10は、C1−C12アルキルである。他の実施形態では、R10は、−LNR4R5R7である。一部の実施形態では、R10は、メチルである。さらに他の実施形態では、R10は、エチルである。一部の実施形態では、R10は、C3アルキルである。一部の実施形態では、R10は、C4アルキルである。さらに他の実施形態では、R10は、C5アルキルである。一部の他の実施形態では、R10は、C6アルキルである。他の実施形態では、R10は、C7アルキルである。さらに他の実施形態では、R10は、C8アルキルである。一部の実施形態では、R10は、C9アルキルである。他の実施形態では、R10は、C10アルキルである。さらに他の実施形態では、R10は、C11アルキルである。一部の他の実施形態では、R10は、C12アルキルである。

0158

一部の実施形態では、R8およびR9が結合して、5〜18員の単環もしくは二環複素環を形成する。一部の実施形態では、前記複素環は、5または6員の単環複素環である。例えば、一部の実施形態では、リンケージ(B)は、下記構造(IV):




を有する。式中、Zは、5または6員の単環複素環を表わす。

0159

他の実施形態では、複素環は、二環、例えば、12員の二環複素環である。前記複素環は、ピペリジンでもよい。前記複素環は、モルホリノでもよい。前記複素環は、ピペリジニルでもよい。前記複素環は、デカヒドロイソキノリンでもよい。典型的な複素環としては、下記:




が挙げられる。

0160

一部の実施形態では、R11は、各出現箇所で独立して、C2−C12アルキル、C1−C12アミノアルキル、アリール、ヘテロアリールまたはヘテロシクリルである。

0161

一部の実施形態では、R11は、C2−C12アルキルである。一部の実施形態では、R11は、エチルである。他の実施形態では、R11は、C3アルキルである。さらに他の実施形態では、R11は、イソプロピルである。一部の他の実施形態では、R11は、C4アルキルである。他の実施形態では、R11は、C5アルキルである。一部の実施形態では、R11は、C6アルキルである。他の実施形態では、R11は、C7アルキルである。一部の実施形態では、R11は、C8アルキルである。他の実施形態では、R11は、C9アルキルである。さらに他の実施形態では、R11は、C10アルキルである。一部の他の実施形態では、R11は、C11アルキルである。一部の実施形態では、R11は、C12アルキルである。

0162

他の実施形態では、R11は、C1−C12アミノアルキルである。一部の実施形態では、R11は、メチルアミノである。一部の実施形態では、R11は、エチルアミノである。他の実施形態では、R11は、C3アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、R11は、C4アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、R11は、C5アミノアルキルである。他の実施形態では、R11は、C6アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、R11は、C7アミノアルキルである。一部の実施形態では、R11は、C8アミノアルキルである。他の実施形態では、R11は、C9アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、R11は、C10アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、R11は、C11アミノアルキルである。他の実施形態では、R11は、C12アミノアルキルである。

0163

他の実施形態では、R11は、C1−C12アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R11は、C1アルキルカルボニルである。他の実施形態では、R11は、C2アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R11は、C3アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R11は、C4アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R11は、C5アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、R11は、C6アルキルカルボニルである。他の実施形態では、R11は、C7アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R11は、C8アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R11は、C9アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R11は、C10アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、R11は、C11アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R11は、C12アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R11は、−C(=O)(CH2)nCO2Hであり、nは、1から6である。例えば、一部の実施形態では、nは、1である。他の実施形態では、nは、2である。さらに他の実施形態では、nは、3である。一部の他の実施形態では、nは、4である。さらに他の実施形態では、nは、5である。他の実施形態では、nは、6である。

0164

他の実施形態では、R11は、アリールである。例えば、一部の実施形態では、R11は、フェニルである。一部の実施形態では、前記フェニルは、例えば、ニトロ基により置換される。

0165

他の実施形態では、R11は、ヘテロアリールである。例えば、一部の実施形態では、R11は、ピリジニルである。他の実施形態では、R11は、ピリミジニルである。

0166

他の実施形態では、R11は、ヘテロシクリルである。例えば、一部の実施形態では、R11は、ピペリジニル、例えば、ピペリジン−4−イルである。

0167

一部の実施形態では、R11は、エチル、イソプロピル、ピペリジニル、ピリミジニル、コラート、デオキシコラートまたは−C(=O)(CH2)nCO2Hであり、nは、1から6である。

0168

一部の実施形態では、Rは、電子対である。他の実施形態では、Rは、水素である。他の実施形態では、Rは、C1−C12アルキルである。一部の実施形態では、Rは、メチルである。一部の実施形態では、Rは、エチルである。他の実施形態では、Rは、C3アルキルである。さらに他の実施形態では、Rは、イソプロピルである。一部の他の実施形態では、Rは、C4アルキルである。さらに他の実施形態では、Rは、C5アルキルである。一部の実施形態では、Rは、C6アルキルである。他の実施形態では、Rは、C7アルキルである。さらに他の実施形態では、Rは、C8アルキルである。他の実施形態では、Rは、C9アルキルである。一部の実施形態では、Rは、C10アルキルである。さらに他の実施形態では、Rは、C11アルキルである。一部の実施形態では、Rは、C12アルキルである。

0169

一部の実施形態では、R12は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アミノアルキル、−NH2、−CONH2、−NR13R14、−NR13R14R15、オキソ、−CN、トリフルオロメチル、アミジル、アミジニル、アミジニルアルキル、アミジニルアルキルカルボニルグアニジニル、グアニジニルアルキル、グアニジニルアルキルカルボニル、コラート、デオキシコラート、アリール、ヘテロアリール、複素環、−SR13またはC1−C12アルコキシであり、R13、R14およびR15は、各出現箇所で独立して、C1−C12アルキルである。

0170

一部の実施形態では、R12は、水素である。一部の実施形態では、R12は、C1−C12アルキルである。一部の実施形態では、R12は、C1−C12アミノアルキルである。一部の実施形態では、R12は、−NH2である。一部の実施形態では、R12は、−CONH2である。一部の実施形態では、R12は、−NR13R14である。一部の実施形態では、R12は、−NR13R14R15である。一部の実施形態では、R12は、C1−C12アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、オキソである。一部の実施形態では、R12は、−CNである。一部の実施形態では、R12は、トリフルオロメチルである。一部の実施形態では、R12は、アミジルである。一部の実施形態では、R12は、アミジニルである。一部の実施形態では、R12は、アミジニルアルキルである。一部の実施形態では、R12は、アミジニルアルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、グアニジニル、例えば、モノメチルグアニジニルまたはジメチルグアニジニルである。一部の実施形態では、R12は、グアニジニルアルキルである。一部の実施形態では、R12は、アミジニルアルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、コラートである。一部の実施形態では、R12は、デオキシコラートである。一部の実施形態では、R12は、アリールである。一部の実施形態では、R12は、ヘテロアリールである。一部の実施形態では、R12は、複素環である。一部の実施形態では、R12は、−SR13である。一部の実施形態では、R12は、C1−C12アルコキシである。一部の実施形態では、R12は、ジメチルアミンである。

0171

他の実施形態では、R12は、メチルである。さらに他の実施形態では、R12は、エチルである。一部の実施形態では、R12は、C3アルキルである。一部の実施形態では、R12は、イソプロピルである。一部の実施形態では、R12は、C4アルキルである。他の実施形態では、R12は、C5アルキルである。さらに他の実施形態では、R12は、C6アルキルである。一部の他の実施形態では、R12は、C7アルキルである。一部の実施形態では、R12は、C8アルキルである。さらに他の実施形態では、R12は、C9アルキルである。一部の実施形態では、R12は、C10アルキルである。さらに他の実施形態では、R12は、C11アルキルである。他の実施形態では、R12は、C12アルキルである。さらに他の実施形態では、前記アルキル部分は、1つ以上の酸素原子により置換されて、エーテル部分、例えば、メトキシメチル部分を形成する。

0172

一部の実施形態では、R12は、メチルアミノである。他の実施形態では、R12は、エチルアミノである。さらに他の実施形態では、R12は、C3アミノアルキルである。一部の実施形態では、R12は、C4アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、R12は、C5アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、R12は、C6アミノアルキルである。一部の実施形態では、R12は、C7アミノアルキルである。一部の実施形態では、R12は、C8アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、R12は、C9アミノアルキルである。一部の他の実施形態では、R12は、C10アミノアルキルである。さらに他の実施形態では、R12は、C11アミノアルキルである。他の実施形態では、R12は、C12アミノアルキルである。一部の実施形態では、前記アミノアルキルは、ジメキルアミノアルキルである。

0173

さらに他の実施形態では、R12は、アセチルである。一部の他の実施形態では、R12は、C2アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、C3アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R12は、C4アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、C5アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R12は、C6アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、R12は、C7アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、C8アルキルカルボニルである。さらに他の実施形態では、R12は、C9アルキルカルボニルである。一部の他の実施形態では、R12は、C10アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R12は、C11アルキルカルボニルである。他の実施形態では、R12は、C12アルキルカルボニルである。前記アルキルカルボニルは、カルボキシ部分により置換される。例えば、前記アルキルカルボニルは、置換されて、コハク酸部分(すなわち、3−カルボキシアルキルカルボニル)を形成する。他の実施形態では、前記アルキルカルボニルは、末端−SH基により置換される。

0174

一部の実施形態では、R12は、アミジルである。一部の実施形態では、前記アミジルは、例えば、−SH、カルバマートまたは、それらの組み合わせにより、さらに置換されたアルキル部分を含む。他の実施形態では、前記アミジルは、アリール部分、例えば、フェニルにより置換される。ある実施形態では、R12は、下記構造(IX):




を有してもよい。

0175

式中、R16は、各出現箇所で独立して、水素、C1−C12アルキル、C1−C12アルコキシ、−CN、アリールまたはヘテロアリールである。

0176

一部の実施形態では、R12は、メトキシである。他の実施形態では、R12は、エトキシである。さらに他の実施形態では、R12は、C3アルコキシである。一部の実施形態では、R12は、C4アルコキシである。一部の実施形態では、R12は、C5アルコキシである。一部の他の実施形態では、R12は、C6アルコキシである。他の実施形態では、R12は、C7アルコキシである。一部の他の実施形態では、R12は、C8アルコキシである。一部の実施形態では、R12は、C9アルコキシである。他の実施形態では、R12は、C10アルコキシである。一部の実施形態では、R12は、C11アルコキシである。さらに他の実施形態では、R12は、C12アルコキシである。

0177

ある実施形態では、R12は、ピロリジニル、例えば、ピロリジン−1−イルである。他の実施形態では、R12は、ピペリジニル、例えば、ピペリジン−1−イルまたはピペリジン−4−イルである。他の実施形態では、R12は、モルホリノ、例えば、モルホリン−4−イルである。他の実施形態では、R12は、フェニルであり、なお更なる実施形態では、前記フェニルは、例えば、ニトロ基により置換される。さらに他の実施形態では、R12は、ピリミジニル、例えば、ピリミジン−2−イルである。

0178

他の実施形態では、R13、R14およびR15は、各出現箇所で独立して、C1−C12アルキルである。一部の実施形態では、R13、R14またはR15は、メチルである。さらに他の実施形態では、R13、R14またはR15は、エチルである。他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C3アルキルである。さらに他の実施形態では、R13、R14またはR15は、イソプロピルである。他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C4アルキルである。一部の実施形態では、R13、R14またはR15は、C5アルキルである。一部の他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C6アルキルである。他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C7アルキルである。さらに他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C8アルキルである。他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C9アルキルである。一部の実施形態では、R13、R14またはR15は、C10アルキルである。一部の実施形態では、R13、R14またはR15は、C11アルキルである。さらに他の実施形態では、R13、R14またはR15は、C12アルキルである。

0179

上記のように、一部の実施形態では、R12は、アリール部分により置換されたアミジルである。この点で、各R16は、同じでも、異なってもよい。あるこれらの実施形態では、R16は、水素である。他の実施形態では、R16は、−CNである。他の実施形態では、R16は、ヘテロアリール、例えば、テトラゾリルである。ある他の実施形態では、R16は、メトキシである。他の実施形態では、R16は、アリールであり、前記アリールは、場合により置換される。この点で、任意の置換基としては、C1−C12アルキル、C1−C12アルコキシ、例えば、メトキシ;トリフルオロメトキシ;ハロ、例えば、クロロ;およびトリフルオロメチルがあげられる。

0180

他の実施形態では、R16は、メチルである。さらに他の実施形態では、R16は、エチルである。一部の実施形態では、R16は、C3アルキルである。一部の他の実施形態では、R16は、イソプロピルである。さらに他の実施形態では、R16は、C4アルキルである。他の実施形態では、R16は、C5アルキルである。さらに他の実施形態では、R16は、C6アルキルである。一部の他の実施形態では、R16は、C7アルキルである。一部の実施形態では、R16は、C8アルキルである。さらに他の実施形態では、R16は、C9アルキルである。一部の他の実施形態では、R16は、C10アルキルである。他の実施形態では、R16は、C11アルキルである。一部の他の実施形態では、R16は、C12アルキルである。

0181

一部の実施形態では、R16は、メトキシである。一部の実施形態では、R16は、エトキシである。さらに他の実施形態では、R16は、C3アルコキシである。一部の他の実施形態では、R16は、C4アルコキシである。他の実施形態では、R16は、C5アルコキシである。一部の他の実施形態では、R16は、C6アルコキシである。さらに他の実施形態では、R16は、C7アルコキシである。一部の他の実施形態では、R16は、C8アルコキシである。さらに他の実施形態では、R16は、C9アルコキシである。一部の他の実施形態では、R16は、C10アルコキシである。一部の実施形態では、R16は、C11アルコキシである。一部の他の実施形態では、R16は、C12アルコキシである。

0182

一部の他の実施形態では、R8およびR9が結合して、12〜18員のクラウンエーテルを形成する。例えば、一部の実施形態では、前記クラウンエーテルは、18員であり、他の実施形態では、前記クラウンエーテルは、15員である。ある実施形態では、R8およびR9が結合して、下記構造(X)または(XI):




の1つを有する複素環を形成する。

0183

一部の実施形態では、R8、R9またはR3がR10と結合して、5〜7員の複素環を形成する。例えば、一部の実施形態では、R3がR10と結合して、5〜7員の複素環を形成する。一部の実施形態では、前記複素環は、5員である。他の実施形態では、前記複素環は、6員である。他の実施形態では、前記複素環は、7員である。一部の実施形態では、前記複素環は、下記構造(XII):




で表わされる。式中、Z’は、5〜7員の複素環を表わす。構造(XI)のある実施形態では、R12は、各出現箇所で水素である。例えば、リンケージ(B)が、下記構造(B1)、(B2)または(B3):




の1つを有してもよい。

0184

ある他の実施形態では、R12は、C1−C12アルキルカルボニルまたは、アリールホスホリル部分、例えば、トリフェニルホスホリル部分により、さらに置換されたアミジルである。この構造を有するリンケージの例としては、B56およびB55があげられる。

0185

ある実施形態では、リンケージ(B)は、構造A1〜A5のいずれも有さない。
表2は、(A)型および(B)型の典型的なリンケージを示す。

0186

0187

以下の配列および記載において、前記リンケージについての上記名称が、多くの場合使用される。例えば、PMOapnリンケージを含む塩基は、apnBとして示される。Bは、塩基である。他のリンケージも、同様に指名される。さらに、略称が使用されてもよく、例えば、上記丸括弧内の略称が使用されてもよい(例えば、aBは、apnBを意味する)。他の直ちに識別可能な略称も使用され得る。

0188

B.修飾末端基を有するオリゴマー
前記キャリアペプチドに加えて、前記コンジュゲートは、修飾末端基を含むオリゴマーを含んでもよい。本願出願人は、種々の化学的部分による前記オリゴマーの3’端および/または5’端の修飾が、前記コンジュゲートに有利な治療特性(例えば、向上された細胞送達、有効性および/または組織分布等)を提供することを見出した。種々の実施形態において、前記修飾末端基は、疎水性部分を含む。一方、他の実施形態では、前記修飾末端基は、親水性部分を含む。前記修飾末端基は、前述のリンケージと共に、または、前述のリンケージなしに存在してもよい。例えば、一部の実施形態では、前記キャリアペプチドにコンジュゲートされた前記オリゴマーは、1つ以上の修飾末端基と、(A)型リンケージ、例えば、Xが−N(CH3)2であるリンケージとを含む。他の実施形態では、前記オリゴマーは、1つ以上の修飾末端基と、(B)型リンケージ、例えば、Xが4−アミノピペリジン−1−イル(すなわち、APN)であるリンケージとを含む。さらに他の実施形態では、前記オリゴマーは、1つ以上の修飾末端基と、リンケージ(A)および(B)の混合物とを含む。例えば、前記オリゴマーは、1つ以上の修飾末端基(例えば、トリチルまたはトリフェニルアセチル)と、Xが−N(CH3)2であるリンケージ、および、Xが4−アミノピペリジン−1−イルであるリンケージとを含んでもよい。修飾末端基と修飾リンケージとの他の組み合わせも、好ましい治療特性を前記オリゴマーに提供する。

0189

一実施形態では、修飾末端を含む前記オリゴマーは、下記構造(XVII):




または、その塩もしくはその異性体を有し、式中、X、WおよびYは、リンケージ(A)および(B)のいずれかについての上記定義の通りであり、
R17は、各出現箇所で独立して、存在しないか、水素またはC1−C6アルキルであり;
R18およびR19は、各出現箇所で独立して、存在しないか、水素、前記キャリアペプチド、天然もしくは非天然のアミノ酸、C2−C30アルキルカルボニル、−C(=O)OR21またはR20であり;
R20は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、C1−C30アルキル、C3−C8シクロアルキル;C6−C30アリール、C7−C30アラルキル、C3−C30アルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニル、C7−C30アリールカルボニル、C7−C30アラルキルカルボニル、C2−C30アルキルオキシカルボニル、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニル、C7−C30アリールオキシカルボニル、C8−C30アラルキルオキシカルボニルまたは−P(=O)(R22)2であり;
Piは、各出現箇所で独立して、塩基対合部分であり;
L1は、アルキル、ヒドロキシル、アルコキシ、アルキルアミノ、アミド、エステル、ジスルフィド、カルボニル、カルバマート、ホスホロジアミダート、ホスホロアミダート、ホスホロチオアート、ピペラジンおよびホスホジエステルから選択される結合を含む、長さ18個原子以下の必要に応じたリンカーであり;および、
xは、0またはそれより大きい整数であり;および、
R18またはR19の少なくとも1つが、R20であり;および、
R18またはR19の少なくとも1つが、R20であり、但し、R17およびR18は両方とも存在する。

0190

修飾末端基を有する前記オリゴマーは、任意の数の(A)型および(B)型リンケージを含み得る。例えば、前記オリゴマーは、(A)型リンケージのみを含んでもよい。例えば、各リンケージにおけるXは、−N(CH3)2でもよい。または、前記オリゴマーは、リンケージ(B)のみを含んでもよい。ある実施形態では、前記オリゴマーは、リンケージ(A)および(B)の混合物を含み、例えば、1から4個のリンケージが(B)型であり、残りのリンケージが(A)型である。この点で、リンケージとしては、制限されず、Xが、(B)型についてはアミノピペリジニル、および、(A)型についてはジメチルアミノであるリンケージがあげられる。

0191

一部の実施形態では、R17は、存在しない。一部の実施形態では、R17は、水素である。一部の実施形態では、R17は、C1−C6アルキルである。一部の実施形態では、R17は、メチルである。さらに他の実施形態では、R17は、エチルである。一部の実施形態では、R17は、C3アルキルである。一部の他の実施形態では、R17は、イソプロピルである。他の実施形態では、R17は、C4アルキルである。さらに他の実施形態では、R17は、C5アルキルである。一部の他の実施形態では、R17は、C6アルキルである。

0192

他の実施形態では、R18は、存在しない。一部の実施形態では、R18は、水素である。一部の実施形態では、R18は、前記キャリアペプチドである。一部の実施形態では、R18は、天然もしくは非天然のアミノ酸、例えば、トリメチルグリシンである。一部の実施形態では、R18は、R20はである。

0193

他の実施形態では、R19は、存在しない。一部の実施形態では、R19は、水素である。一部の実施形態では、R19は、前記キャリアペプチドである。一部の実施形態では、R19は、天然もしくは非天然のアミノ酸、例えば、トリメチルグリシンである。一部の実施形態では、R19は、−C(=O)OR17であり、例えば、R19は、下記構造:




を有してもよい。

0194

他の実施形態では、R18またはR19は、C2−C30アルキルカルボニル、例えば、−C(=O)(CH2)nCO2Hであり、nは、1から6、例えば、2である。他の例では、R18またはR19は、アセチルである。

0195

一部の実施形態では、R20は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、C1−C30アルキル、C3−C8シクロアルキル;C6−C30アリール、C7−C30アラルキル、C3−C30アルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニル、C6−C30アリールカルボニル、C7−C30アラルキルカルボニル、C2−C30アルキルオキシカルボニル、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニル、C7−C30アリールオキシカルボニル、C8−C30アラルキルオキシカルボニル、−C(=O)OR21または−P(=O)(R22)2である。R21は、1つ以上の酸素もしくはヒドロキシル部分またはそれらの組み合わせを含むC1−C30アルキルである。各R22は、C6−C12アリールオキシである。

0196

ある他の実施形態では、R19は、−C(=O)OR21であり、R18は、水素、グアニジニル、ヘテロシクリル、C1−C30アルキル、C3−C8シクロアルキル;C6−C30アリール、C3−C30アルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニル、C7−C30アリールカルボニル、C7−C30アラルキルカルボニル、C2−C30アルキルオキシカルボニル、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニル、C7−C30アリールオキシカルボニル、C8−C30アラルキルオキシカルボニルまたは−P(=O)(R22)2である。各R22は、C6−C12アリールオキシである。

0197

他の実施形態では、R20は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、C1−C30アルキル、C3−C8シクロアルキル;C6−C30アリール、C3−C30アルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニル、C7−C30アリールカルボニル、C7−C30アラルキルカルボニル、C2−C30アルキルオキシカルボニル、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニル、C7−C30アリールオキシカルボニル、C8−C30アラルキルオキシカルボニルまたは−P(=O)(R22)2である。一方、他の例では、R20は、各出現箇所で独立して、グアニジニル、ヘテロシクリル、C1−C30アルキル、C3−C8シクロアルキル;C6−C30アリール、C7−C30アラルキル、C3−C8シクロアルキルカルボニル、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニル、C7−C30アリールカルボニル、C7−C30アラルキルカルボニル、C2−C30アルキルオキシカルボニル、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニル、C7−C30アリールオキシカルボニル、C8−C30アラルキルオキシカルボニルまたは−P(=O)(R22)2である。

0198

一部の実施形態では、R20は、グアニジニル、例えば、モノメチルグアニジニルまたはジメチルグアニジニルである。他の実施形態では、R20は、ヘテロシクリルである。例えば、一部の実施形態では、R20は、ピペリジン−4−イルである。一部の実施形態では、ピペリジン−4−イルは、トリチルまたはBocの基により置換される。他の実施形態では、R20は、C3−C8シクロアルキルである。他の実施形態では、R20は、C6−C30アリールである。

0199

一部の実施形態では、R20は、C7−C30アリールカルボニルである。例えば、一部の実施形態では、R20は、下記構造(XVIII):




を有する。式中、R23は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、C1−C30アルキル、C1−C30アルコキシ、C1−C30アルキルオキシカルボニル、C7−C30アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル(heterocyclalkyl)である。1つのR23は、もう1つのR23と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。一部の実施形態では、少なくとも1つのR23は、水素であり、例えば、一部の実施形態では、各R23は、水素である。他の実施形態では、少なくとも1つのR23は、C1−C30アルコキシであり、例えば、一部の実施形態では、各R23は、メトキシである。他の実施形態では、少なくとも1つのR23は、ヘテロアリールであり、例えば、一部の実施形態では、少なくとも1つのR23は、下記構造(XVIIIa)または(of)(XVIIIb):




の1つを有する。

0200

さらに他の実施形態では、1つのR23は、もう1つのR23と結合して、ヘテロシクリル環を形成する。例えば、一実施形態では、R20は、5−カルボキシフルオレセインである。

0201

他の実施形態では、R20は、C7−C30アラルキルカルボニルである。例えば、種々の実施形態では、R20は、下記構造(XIX)、(XX)または(XXI):




の1つを有する。

0202

式中、R23は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、C1−C30アルキル、C1−C30アルコキシ、C1−C30アルキルオキシカルボニル、C7−C30アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル(heterocyclalkyl)である。1つのR23は、もう1つのR23と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。Xは、−OHまたはハロである。mは、0から6の整数である。一部の特定の実施形態では、mは、0である。他の実施形態では、mは、1である。一方、他の実施形態では、mは、2である。他の実施形態では、少なくとも1つのR23は、水素であり、例えば、一部の実施形態では、各R23は、水素である。一部の実施形態では、Xは、水素である。他の実施形態では、Xは、−OHである。他の実施形態では、Xは、Clである。他の実施形態では、少なくとも1つのR23は、C1−C30アルコキシであり、例えば、メトキシである。

0203

さらに他の実施形態では、R20は、C7−C30アラルキル、例えば、トリチルである。他の実施形態では、R20は、メトキシトリチルである。一部の実施形態では、R20は、下記構造(XXII):




を有する。ここで、R23は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、C1−C30アルキル、C1−C30アルコキシ、C1−C30アルキルオキシカルボニル、C7−C30アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル(heterocyclalkyl)である。1つのR23は、もう1つのR23と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。例えば、一部の実施形態では、各R23は、水素である。他の実施形態では、少なくとも1つのR23は、C1−C30アルコキシであり、例えば、メトキシである。

0204

さらに他の実施形態では、R20は、C7−C30アラルキルであり、R20は、下記構造(XXIII):




を有する。

0205

一部の実施形態では、少なくとも1つのR23は、ハロ、例えば、クロロである。一部の他の実施形態では、1つのR23は、パラ位におけるクロロである。

0206

他の実施形態では、R20は、C1−C30アルキルである。例えば、一部の実施形態では、R20は、C4−C20アルキルであり、場合により、1つ以上の二重結合を含む。例えば、一部の実施形態では、R20は、三重結合、例えば、末端三重結合を含むC4−C10アルキルである。一部の実施形態では、R20は、ヘキシン−6−イルである。一部の実施形態では、R20は、下記構造(XXIV)、(XXV)、(XXVI)または(XXVII):




の1つを有する。

0207

さらに他の実施形態では、R20は、C3−C30アルキルカルボニル、例えば、C3−C10アルキルカルボニルである。一部の実施形態では、R20は、−C(=O)(CH2)pSHまたは−C(=O)(CH2)pSSHetであり、pは、1から6の整数であり、Hetは、ヘテロアリールである。例えば、pは、1でもよいし、または、pは、2でもよい。他の例では、Hetは、ピリジニル、例えば、ピリジン−2−イルである。他の実施形態では、C3−C30アルキルカルボニルは、更なるオリゴマーにより置換される。例えば、一部の実施形態では、前記オリゴマーは、前記オリゴマーをもう1つのオリゴマーの3’位に結合する、C3−C30アルキルカルボニルを、3’位に含む。このような末端修飾は、本開示のスコープ内に含まれる。

0208

他の実施形態では、R20は、アリールホスホリル部分、例えば、トリフェニルホスホリルにより、さらに置換されたC3−C30アルキルカルボニルである。このようなR20基の例としては、表3における構造33があげられる。

0209

他の例では、R20は、C3−C8シクロアルキルカルボニル、例えば、C5−C7アルキルカルボニルである。これらの実施形態では、R20は、下記構造(XXVIII):




を有する。式中、R23は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、C1−C30アルキル、C1−C30アルコキシ、C1−C30アルキルオキシカルボニル、C7−C30アラルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル(heterocyclalkyl)である。1つのR23は、もう1つのR23と結合して、ヘテロシクリル環を形成してもよい。一部の実施形態では、R23は、ヘテロシクロアルキル(heterocyclalkyl)であり、例えば、一部の実施形態では、R23は、下記構造:




を有する。

0210

一部の他の実施形態では、R20は、C3−C8シクロアルキルアルキルカルボニルである。他の実施形態では、R20は、C2−C30アルキルオキシカルボニルである。他の実施形態では、R20は、C3−C8シクロアルキルオキシカルボニルである。他の実施形態では、R20は、C7−C30アリールオキシカルボニルである。他の実施形態では、R20は、C8−C30アラルキルオキシカルボニルである。他の実施形態では、R20は、−P(=O)(R22)2であり、各R22は、C6−C12アリールオキシである。例えば、一部の実施形態では、R20は、下記構造(C24):




を有する。

0211

他の実施形態では、R20は、1つ以上のハロ原子を含む。例えば、一部の実施形態では、R20は、上記R20部分のいずれかの、パーフルオロ類似体を含む。他の実施形態では、R20は、p−トリフルオロメチルフェニル、p−トリフルオロメチルトリチル、パーフルオロペンチルまたはペンタフルオロフェニルを含む。

0212

一部の実施形態では、3’末端が、修飾を含み、他の実施形態では、5’末端が、修飾を含む。他の実施形態では、3’末端および5’末端の両方が、修飾を含む。したがって、一部の実施形態では、R18は、存在せず、R19は、R20である。他の実施形態では、R19は、存在せず、R18は、R20である。さらに他の実施形態では、R18およびR19はそれぞれ、R20である。

0213

一部の実施形態では、前記オリゴマーは、3’または5’修飾に加えて、細胞浸透性ペプチドを含む。したがって、一部の実施形態では、R19は、細胞浸透性ペプチドであり、R18は、R20である。他の実施形態では、R18は、細胞浸透性ペプチドであり、R19は、R20である。前述の更なる実施形態では、前記細胞浸透性ペプチドは、アルギニンリッチのペプチドである。

0214

一部の実施形態では、5’末端基(すなわち、R19)を前記オリゴマーに結合するリンカーL1は、存在してもよいし、または、存在しなくてもよい。前記リンカーは、任意の数の官能基と、前記リンカーが、前記5’末端基を前記オリゴマーに結合するためのその能力を保持することが提供され、前記リンカーが、配列特異的に標的配列に結合するための前記オリゴマーの能力を妨害しないことが提供される、長さとを含む。一実施形態では、Lは、ホスホロジアミダートおよびピペラジン結合を含む。例えば、一部の実施形態では、Lは、下記構造(XXIX):




を有する。

0215

式中、R24は、存在しないか、水素またはC1−C6アルキルである。一部の実施形態では、R24は、存在しない。一部の実施形態では、R24は、水素である。一部の実施形態では、R24は、C1−C6アルキルである。一部の実施形態では、R24は、メチルである。他の実施形態では、R24は、エチルである。さらに他の実施形態では、R24は、C3アルキルである。一部の他の実施形態では、R24は、イソプロピルである。さらに他の実施形態では、R24は、C4アルキルである。一部の実施形態では、R24は、C5アルキルである。さらに他の実施形態では、R24は、C6アルキルである。

0216

さらに他の実施形態では、R20は、C3−C30アルキルカルボニルである。R20は、下記構造(XXX):




を有する。式中、R25は、水素または−SR26であり、R26は、水素、C1−C30アルキル、ヘテロシクリル、アリールまたはヘテロアリールである。qは、0から6の整数である。

0217

上記のいずれかの更なる実施形態では、R23は、各出現箇所で独立して、水素、ハロ、C1−C30アルキル、C1−C30アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリルまたはヘテロシクロアルキル(heterocyclalkyl)である。

0218

一部の他の実施形態では、前記オリゴマーの3’末端のみが、上記基の1つにコンジュゲートされる。一部の他の実施形態では、前記オリゴマーの5’末端のみが、上記基の1つにコンジュゲートされる。他の実施形態では、前記3’および5’末端の両方が、上記基の1つを含む。前記末端基は、上記基のいずれか1つ、または、表3に示される特定の基のいずれかから選択されてもよい。

0219

0220

C.コンジュゲートの特性
前述のように、本開示は、キャリアペプチドとオリゴヌクレオチド類似体(すなわち、オリゴマー)とのコンジュゲートに関する。前記オリゴマーは、前記オリゴマーに所望の特性(例えば、向上されたアンチセンス活性)を付与する、種々の修飾を含んでもよい。
ある実施形態では、前記オリゴマーは、サブユニット間リンケージにより結合されたモルホリノ環構造の配列を含む骨格を含む。前記サブユニット間リンケージは、1つのモルホリノ環構造の3’端を、隣接するモルホリノ環構造の5’端に結合する。各モルホリノ環構造は、前記オリゴマーが、配列特異的な方法で、標的核酸に結合し得るように、塩基対合部分に結合される。前記モルホリノ環構造は、下記構造(i):




を有してもよい。
式中、Piは、各出現箇所で独立して、塩基対合部分である。

0221

各モルホリノ環構造は、塩基対合部分(Pi)を支持して、細胞または処置被験体における選択されたアンチセンス標的にハイブリダイズするために、典型的に設計された塩基対合部分の配列を形成する。前記塩基対合部分は、天然のDNAまたはRNAにおいて見出される、プリンもしくはピリミジン(A、G、C、TまたはU)または、類似体、例えば、ヒポキサンチン(ヌクレオシドイノシンの塩基成分)もしくは5−メチルシトシンであり得る。前記オリゴマーに改善された結合親和性を付与する類似体塩基も、使用され得る。この点で、典型的な類似体としては、C5−プロピニル−修飾ピリミジン、9−(アミノエトキシフェノキサジン(G−クランプ)等があげられる。

0222

前述のように、前記オリゴマーは、本発明の態様に基づいて修飾されて、1つ以上のリンケージ(B)を、例えば、2〜5個の荷電していないリンケージ毎に約1個以下、典型的には、10個の荷電していないリンケージ毎に3〜5個含んでもよい。ある実施形態は、1つ以上の(B)型リンケージも含む。一部の実施形態では、アンチセンス活性における最適な改善は、約半分以下の骨格リンケージが(B)型である場合に見られる。おおよそ、最大向上は、典型的には、例えば、10〜20%の少量のリンケージ(B)でも見られる。

0223

一実施形態では、(A)型および(B)型リンケージは、前記骨格に沿ってちりばめられている。一部の実施形態では、前記オリゴマーは、その長さ全体に沿って、リンケージ(A)および(B)の代替パターンを厳密に有していない。前記キャリアペプチドに加えて、前記オリゴマーは、場合により、前述のように、5’および/または3’修飾を含み得る。

0224

オリゴマーは、リンケージ(A)のブロックとリンケージ(B)のブロックとを有するとも考えられる。例えば、リンケージ(A)の中央ブロックが、リンケージ(B)のブロックにより、側面に位置されてもよく、逆もまた同様である。一実施形態では、前記オリゴマーは、おおよそ等しい長さの、5’、3;および中央の領域を有する。前記中央領域におけるリンケージ(B)または(A)の割合は、約50%より高く、または(o)、約70%より高い。アンチセンス用途に使用するオリゴマーは、一般的に、長さが約10個から約40個のサブユニット、より好ましくは約15個から25個のサブユニットの範囲である。例えば、19〜20個のサブユニットを有し、アンチセンスオリゴマーとして有用な長さを有する本発明のオリゴマーは、理想的には、2から7個、例えば、4から6個または3から5個のリンケージ(B)および、残りのリンケージ(A)を有してもよい。14〜15個のサブユニットを有するオリゴマーは、理想的には、2から5個、例えば、3または4個のリンケージ(B)および、残りのリンケージ(A)を有してもよい。

0225

前記モルホリノサブユニットは、以下にさらに記載するように、非リンベースのサブユニット間リンケージにより結合されてもよい。

0226

その非修飾状態で荷電していないが、ペンダントアミン置換基も有し得る、他のオリゴヌクレオチド類似体リンケージも使用され得る。例えば、モルホリノ環上の5’窒素原子は、スルファミドリンケージ(または、リンが炭素または硫黄にそれぞれ置換された場合、尿素リンケージ)に使用され得る。

0227

アンチセンス用途についての一部の実施形態では、前記オリゴマーは、前記核酸標的配列に、100%相補的であってもよく、または、前記オリゴマーと核酸標的配列との間に形成されたヘテロ二本鎖が、細胞ヌクレアーゼの作用および、in vivoで起こり得る他の方式の分解に抵抗するのに十分安定している限りは、例えば、変異を調整するためのミスマッチを含んでもよい。ミスマッチが存在する場合、中央におけるより、ハイブリッド二本鎖の末端領域に向かって不安定になる。許容されるミスマッチの数は、二本鎖の安定性において十分理解された原理に基づいて、前記オリゴマーの長さ、前記二本鎖におけるG:C塩基対の割合、および、前記二本鎖におけるミスマッチの位置により決まるであろう。このようなアンチセンスオリゴマーは、核酸標的配列に対して、必ずしも100%相補的ではないが、前記核酸標的の生物学的活性、例えば、コードされたタンパク質の発現が調節されるように、前記標的配列に対する安定的で、特異的な結合に効果的である。

0228

オリゴマーと前記標的配列との間で形成された前記二本鎖の安定性は、結合Tmと、細胞酵素的開裂に対する前記二本鎖の感受性との作用である。相補的な配列RNAに対するアンチセンス化合物のTmは、従来の方法、例えば、Hamesら、Nucleic Acid Hybridization,IRL Press,1985,pp.107−108により記載されたものにより、または、Miyada C.G.and Wallace R.B.,1987,Oligonucleotide hybridization techniques,MethodsEnzymol.Vol.154 pp.94−107に記載のように、測定され得る。

0229

一部の実施形態では、各アンチセンスオリゴマーは、体温より高い、または、他の実施形態では、50℃より高い、相補的な配列RNAに対する結合Tmを有する。他の実施形態では、Tmは、60−80℃より高い範囲である。周知の原理に基づいて、相補性ベースのRNAハイブリッドに対するオリゴマー化合物のTmは、前記二本鎖におけるC:G対塩基の比率の増加により、および/または、前記ヘテロ二本鎖の(塩基対における)長さの増加により、向上され得る。同時に、細胞取り込みを最適化する目的のために、前記オリゴマーのサイズを制限するのが有効であり得る。この理由に関して、長さ20塩基以下で、高いTm(50℃より高い)を示す化合物は、高いTm値のために、20塩基より長いのを必要とするものに対して、一般的に好ましい。一部の用途に関して、より長い、例えば、20塩基より長いオリゴマーは、特定の利点を有し得る。例えば、ある実施形態では、より長いオリゴマーにより、エクソンスキッピングまたはスプライス調節に使用するための特定の有用性が見出され得る。

0230

前記ターゲッティング配列塩基は、通常のDNA塩基でもよいし、または、その類似体、例えば、標的配列RNA塩基にワトソン−クリック塩基対合が可能な、ウラシルおよびイノシンでもよい。

0231

前記オリゴマーは、標的ヌクレオチドがウラシル残基の場合、アデニンの代わりにグアニン塩基を包含してもよい。このことは、前記標的配列が、種々のウイルス種にわたって変化し、任意の所定のヌクレオチド残基での変異が、シトシンまたはウラシルのいずれかである場合、有用である。前記ターゲッティングオリゴマーにおいて、可変部分にグアニンを使用することにより、ウラシルとの塩基対(C/U:G塩基対と呼ばれる)に対するグアニンの周知の能力が、利用され得る。これらの位置にグアニンを包含することにより、単一のオリゴマーが、幅広い範囲のRNA標的可変性を、効果的に標的とし得る。

0232

前記化合物(例えば、オリゴマー、サブユニット間リンケージ、末端基)には、種々の異性体、例えば、構造異性体(例えば、互換異性体)が存在してもよい。立体異性体に関しては、前記化合物は、キラル中心を有してもよく、ラセミ化合物鏡像異性体的濃縮された混合物、個々の鏡像体ジアステレオマーの混合物または個々のジアステレオマーとして存在してもよい。全てのこのような異性体は、それらの混合物を含めて、本発明内に含まれる。前記化合物は、アトロプ異性体をもたらし得る軸性キラリティーを有してもよい。さらに、前記化合物における一部の結晶形は、多形体として存在してもよく、前記多形体は、本発明に含まれる。さらに、一部の化合物は、水との溶媒和物、または、他の有機溶媒和物を形成してもよい。このような溶媒和物は、同様に、本発明のスコープ内に含まれる。

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