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技術 上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、その発癌性変異体およびErbB/HERファミリーの他のメンバーに依存する癌の処置用の、単独またはデシプラミンと組み合わせたD−プロプラノロールおよびその類似体を含むホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ(PAP)の阻害剤

出願人 ポンティフィシア・ウニベルシダッド・カトリカ・デ・チレ
発明者 アルフォンソ・ゴンサレスアンドレア・ソーサクラウディア・メッツ
出願日 2012年2月6日 (8年0ヶ月経過) 出願番号 2013-552810
公開日 2014年2月27日 (6年0ヶ月経過) 公開番号 2014-505078
状態 不明
技術分野
  • -
主要キーワード 充足性 表面分布 多胞体 転移段階 唯一無二 表面レベル 飽和条件 ダービー
関連する未来課題
重要な関連分野

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図面 (7)

課題・解決手段

本発明は、癌を処置するために使用できる医薬を製造するための、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ酵素PAP)を阻害する化合物およびそれらの組み合わせの使用に関する;PAP阻害剤は、エンドサイトーシス誘導し、かくしてそれらが癌の生存および進行を促進する刺激に接近できないようにすることにより、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、その発癌性変異体およびErbBファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を阻止するために使用される;本発明の一部であるPAP阻害剤は、他の臨床目的で現在使用されている、陽イオン性両親媒性分子であること以外は無関係である薬物を含む;これらには、他の臨床目的で使用される薬物である、プロプラノロールデシプラミンおよびクロルプロマジンが含まれる;本発明は、スフィンゴシンおよびブロモエノールラクトン、並びに、将来的に発見され得る新たな阻害剤も含む、すべてのPAP阻害剤を包含する。

概要

背景

概要

本発明は、癌を処置するために使用できる医薬を製造するための、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ酵素PAP)を阻害する化合物およびそれらの組み合わせの使用に関する;PAP阻害剤は、エンドサイトーシス誘導し、かくしてそれらが癌の生存および進行を促進する刺激に接近できないようにすることにより、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、その発癌性変異体およびErbBファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を阻止するために使用される;本発明の一部であるPAP阻害剤は、他の臨床目的で現在使用されている、陽イオン性両親媒性分子であること以外は無関係である薬物を含む;これらには、他の臨床目的で使用される薬物である、プロプラノロールデシプラミンおよびクロルプロマジンが含まれる;本発明は、スフィンゴシンおよびブロモエノールラクトン、並びに、将来的に発見され得る新たな阻害剤も含む、すべてのPAP阻害剤を包含する。

目的

他の利点は、PAP阻害の能力共有する既知の構造のいくつかの分子を利用できることであり、かくして、癌細胞戦うのに有用な可能性のあるPAP阻害剤の新規ファミリーを設計するための構造情報を提供する

効果

実績

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請求項1

癌の処置に有用な医薬を製造するためのそれらの有用性を特徴とする、酵素ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼPAP)の阻害剤の使用。

請求項2

癌が、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)に依存することを特徴とする、請求項1に記載のPAP阻害剤の使用。

請求項3

EGFRが、すべての発癌性変異体および他のErbBファミリーメンバーHERを含むことを特徴とする、請求項1に記載のPAP阻害剤の使用。

請求項4

PAP阻害剤が、プロプラノロールデシプラミンクロルプロマジンスフィンゴシンおよびブロモエノールラクトンから選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項5

PAP阻害剤がプロプラノロールであることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項6

PAP阻害剤がプロプラノロールのラセミ混合物から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項7

PAP阻害剤がD−プロプラノロールであることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項8

PAP阻害剤が単独で、または、他のPAP阻害剤と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項9

PAP阻害剤のプロプラノロールがデシプラミンと組み合わせて選択されることを特徴とする、請求項8に記載の使用。

請求項10

PAP阻害剤が、デシプラミンと組み合わせたD−プロプラノロールから選択されることを特徴とする、請求項9に記載の使用。

請求項11

上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)に依存する癌が、頭頸部結腸卵巣乳房前立腺肝臓の癌および/または神経膠芽腫から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項12

PAP阻害剤が単独で、または、PAPの阻害とは異なる経路を介してEGFRを阻害する他の薬物と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

請求項13

PAP阻害剤が単独で、または、放射線療法または外科手術などの他の処置と組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項1に記載の使用。

技術分野

0001

本発明は、単独の化合物またはそれらの組合せとしてのホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼPAP酵素リピンズ(Lipins)1−3およびLPP1−3)(1)の阻害剤の、癌の処置に有用な医薬製剤のための使用に関する。

0002

本発明は、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、その発癌性変異体およびチロシンキナーゼ受容体のErbB/HERファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を妨害するために、PAP阻害剤を利用し、それらのエンドサイトーシス誘導し、かくして癌の進行を促進する刺激にそれらが接近できないようにすることを提唱する。

0003

本発明のPAP阻害剤には、陽イオン性両親媒性分子である(7−10)ことを除き、それらの間には関連のない他の臨床目的で以前に使用された薬物が含まれる。本発明は、全ての既知のPAP阻害剤および全ての将来発見されるものを包含する。

0004

本発明のある具体例は、単独で、または、デシプラミンと組み合わせて使用されるD−プロプラノロールに相当し、これらは、両者ともPAP阻害剤として記載されたものである(9)。ラセミ混合物中でそのエナンチオマーのL−プロプラノロールと組み合わされたD−プロプラノロールは、プロプラノロール(11,12)として知られている薬物を構成し、それは、高血圧および他の心血管障害の処置に使用される一般的なベータブロッカーである(13)。しかしながら、L−プロプラノロールのみが、ベータ−アドレナリン受容体のブロッカー(ベータ−ブロッカー)として有用であり、それは、抗高血圧効果を担う活性である。D−プロプラノロールは、L−プロプラノロールよりも60−100倍活性が低いので、プロプラノロールの臨床的用量ではベータ−ブロッカー活性を欠く(11,12)。高用量のD−プロプラノロールは、ヒトにおけるベータ−アドレナリン遮断から独立した不整脈の処置のために、過去に実験的に使用された(14)。デシプラミンもPAP阻害活性を有するが(7,15)、現在、ノルエピネフリン再取り込み阻害し、それより低い程度でセロトニンの再取り込みも阻害する三環系抗うつ剤として、医院で使用されている(16)。

0005

本発明は、両方ともPAP活性のブロッカーとして使用されるD−プロプラノロールとデシプラミンの組合せが、EGFRまたはその発癌性変異体、例えば、肺癌で抗EGFR薬に耐性のものとして同定された発癌性突然変異EGFRL858R/T790M(17)、および、神経膠芽腫において悪性度の高い癌遺伝子として最初に記載された切断型EGFRvIII変異体(18)に依存する癌細胞の進行を阻害し、その死滅を引き起こすのに有用であることを立証する。

0006

従って、本発明は、D−プロプラノロールと組み合わせて使用されてもよい、以前に他の臨床目的で使用された既知の薬物の第二の用途に相当する。本発明は、また、ベータ−ブロッカー活性を欠くプロプラノロールの類似体などの、将来的に発見または合成され得る任意の他の種類のPAP阻害剤も含む。単独の薬物としての、または、現在知られているPAP阻害剤並びに新しく生じるPAP阻害剤と組み合わせたD−プロプラノロールは、単独で、または、それらの間で、もしくは、ホルモン、抗体および化学療法で使用される薬物を含む、別個作用メカニズムを有する抗腫瘍薬と組み合わせて、使用できる。

0007

本発明のPAP阻害剤は、また、他のEGFRまたはErbB2/HER2の機能に干渉する薬物(19,20)と同様に、外科手術および放射線療法を含む他の種類の処置と、同時にまたは後で組み合わせて使用できる。PAP阻害剤は、化学療法またはEGFRおよびその発癌性変異体の機能の遮断を対象とする薬物を補足するものとして作用するのみならず(4,21)、癌の処置にありがちな問題である、癌細胞がEGFRに対して現在使用されている薬物に対する耐性を発達させた場合に、唯一利用できる治療でもあり得る(17,22)。

0008

本発明は、頻繁なEGFR(過剰発現または突然変異)またはそのファミリーのメンバーであるErbB2/Neuの発癌性変化を示すことが多い、頭頸部結腸乳房前立腺肝臓由来のものおよび神経膠芽腫などの癌の処置に、新しい可能性を開く。

0009

本発明の分野
本発明は、以下の分野を包含する:
1)癌の病原性決定要因である、EGFRおよびそのチロシンキナーゼ受容体のファミリーのメンバー(ErbB/HER)の発癌性シグナル伝達機能を伴うことが多い癌細胞の生物学。そのような変化は、腫瘍細胞攻撃性および悪性度を増強し、また、それらの増殖、生存および転移段階への進行に決定的であり、従って、本発明により提唱されるように、新規抗癌戦略の設計に有効な標的をもたらす;
2)EGFRおよびそのErbB/HER1−4ファミリーの他のメンバーの正常および病的機能において決定的な役割を果たす、細胞内輸送
3)本発明における立証は、EGFRのエンドサイトーシスの挙動の調節に関与し、本発明の基礎のひとつを構成するので、ほぼ未知であったPA/PKA(ホスファチジン酸/タンパク質キナーゼA)シグナル伝達経路の機能。
4)癌の処置のためのPAP阻害剤の使用。これは、以前に提唱されていない。
5)既知であり、PAP阻害とは別個の作用メカニズムに基づいて他の臨床目的で使用されてきた薬物の第二の用途。例えば、D−プロプラノロールは、不整脈の処置に実験的に使用されてきて、一方、デシプラミンの現在の用途は、ノルアドレナリン捕捉のブロッカーとしての抗うつ的処置である。

0010

本発明の基礎は、PA/PKAシグナル伝達経路について発見された新規の機能およびEGFRの細胞表面レベルを決定する新規の調節メカニズムと絡み合う、すべてのこれらの分野を含む。これらの調節メカニズムは、エンドサイトーシスによるEGFRの細胞表面からの除去を誘導し、かくして、様々な外的刺激による活性化へのその利用可能性を低下させることを目的する薬理的操作の影響を受けやすい。

0011

本発明は、エンドサイトーシスによる細胞表面からのEGFRの除去の誘導、並びに、活性化されたEGFR(EGFRとヘテロ二量体を形成する他のErbB/HERファミリーのメンバーも含む)の細胞内輸送/シグナル伝達の撹乱に基づく新規の抗癌治療を設計するための、D−プロプラノロールおよびデシプラミンなどのPAP阻害剤および元々は他の目的で使用された他の薬物の使用にある。この戦略は、低分子薬で以前に使用されていない。

0012

本発明の利点
本発明は、EGFRに依存するか、または、ErbB/HERに依存する癌の進行を低減するために現在使用されているものとは別個の戦略を提唱する。癌におけるこれらのチロシンキナーゼ受容体の発癌性の役割に干渉するために、既に臨床使用されている薬物および研究中の薬物は、受容体またはそのリガンド分子に対して向けられている。これらの薬物は、外部のリガンド(EGF、EGF−HBなど)との受容体相互作用を妨害し、受容体のエンドサイトーシスを増やし、免疫エフェクター細胞による認識を促進するヒト化モノクローナル抗体(例えばセツキシマブおよびパニツブマブ)、または、細胞内チロシン−キナーゼ活性を妨害する低分子薬(例えばエルロチニブおよびゲフィチニブ)のからなる(2−5)。両戦略は、活性化されたEGFRからの発癌性シグナルの生成を減少させる。対照的に、本発明で提唱される化合物は、直接的な標的として、EGFRの分子ではなく、代わりに、エンドサイトーシスの機構を介して、その細胞表面到達性およびシグナル伝達の場所の制御に関与する分子を有する。

0013

本発明は、エンドサイトーシスを介するEGFRの細胞表面からの除去を誘導し、活性化EGFRのシグナル伝達に決定的に関与する細胞内輸送を撹乱するための戦略として、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ(PAP)活性の妨害を提唱する(56−60)。そのような戦略は、癌細胞で変化したシグナル伝達経路に主に対抗することに向けて処置を標的化し、かくして正常な細胞における有害な作用を最小にするという現在の傾向に適合する(4,61)。

0014

他の利点は、PAP阻害の能力共有する既知の構造のいくつかの分子を利用できることであり、かくして、癌細胞と戦うのに有用な可能性のあるPAP阻害剤の新規ファミリーを設計するための構造情報を提供する。

0015

同時に、本発明は、EGFRおよびそれがヘテロ二量体を形成する他のErbB/HERのメンバーの発癌機能に対抗するために、以前には知られていなかったメカニズムを導入し、悪性度がそれらの発癌機能に依存する癌の処置に有用であり、従って、既に使用されている処置を補足するものであるか、または、これらの処置がもはや有効ではない場合の唯一の代替物である。

0016

付加的かつ重要な利点は、EGFRおよびErbB/HERのメンバーの発癌機能を含むアプローチ選択性であり、従って、既知の分子マーカー並びにこの特定の処置のために将来発見され得る他のものによる処置を個人化する機会を与え、これは、各場合で分析でき、応答する可能性が高い癌に対して薬物の使用を最適化できる(17,25,62)。EGFRおよび他のErbB/HERのメンバーの発癌性の変化(過剰発現または突然変異)を示す癌に限定されたPAP阻害剤の適用は、明確な経済的利点を有する。

0017

最後に、発癌に直接関与しないPAP酵素活性に対して作用する化合物の使用は、その変化が細胞の形質転換および悪性の癌の表現型への進行を直接的に促進できるEGFRおよびErbB/HERのメンバーと対照的に、EGFRのチロシン−キナーゼを含む発癌性キナーゼを標的とする薬物の主な問題である処置に対する耐性の発生を遅延させるか、最終的に回避させ得る(17,22,63)。

図面の簡単な説明

0018

図面の簡単な説明
図1:プロプラノロールおよびデシプラミンは、培養された腫瘍細胞においてEGFRのエンドサイトーシスを誘導する。画像は、75μMプロプラノロール、75μMデシプラミン、50μMメトプロロールまたは50μMチモロールの存在下または非存在下でインキュベートされたHeLa細胞におけるEGFRの免疫蛍光パターンを例示する。プロプラノロールおよびデシプラミンのみがEGFRの分布を細胞表面から細胞内の斑点状の局在に変え、ベータブロッカーであるメトプロロールまたはチモロールはこれを変えない。
図2:エナンチオマーのL−およびD−プロプラノロール並びにデシプラミンは、放射性リガンド結合により評価されるEGFRの細胞表面の利用可能性を低下させる。A. L−およびD−プロプラノロール;B. デシプラミン;C. 様々な濃度のD−プロプラノロール(上の目盛り)とデシプラミン(下の目盛り)の組合せ;D. D−プロプラノロールとデシプラミンのEC50の組合せ。
図3:異なる増殖速度腫瘍モデルとして、神経膠芽腫細胞U87および発癌性突然変異EGFRvIIIを過剰発現するように形質転換されたU87(U87−EGFRvIII)。
図4:神経膠芽腫細胞U87およびU87−EGFRvIII並びに非腫瘍性上皮細胞MDCKの生存能に対する、非継続的処置として添加されたD−プロプラノロールおよびデシプラミンの効果。
図5低濃度のD−プロプラノロール(Prop)およびデシプラミン(Des)による継続的処置は、単独でも組み合わせても、U87−EGFRvIIIおよびEGFRを過剰発現する神経膠芽腫の患者由来初代培養の腫瘍細胞(GBM1)において、増殖の増強を選択的に阻害する。
図6:不整脈のために処置される患者の血液に見いだされるものに近い2種の濃度(10および30μM)のD−プロプラノロールによる継続的処置は、単独で、または、1mMデシプラミンとの併用で、いくつかの腫瘍細胞株およびEGFRを過剰発現する神経膠芽腫の患者由来の初代培養の腫瘍細胞(GBM1)の増殖を選択的に阻害する。
図7:D−プロプラノロールおよびデシプラミンの効果を基礎とする、EGFRに依存する癌の新規処置戦略。

0019

本発明の背景
健康問題としての癌
癌は、異常細胞の制御されない浸潤性の増殖により生じる疾患の群を包含し、それは、有効な処置がなければ、短期間(<12ヶ月、または、最も悪性の場合では5−9ヶ月でも)で患者の死亡をもたらし得る。これらの数は、人口の増大、老化をもたらす長い余命およびリスク因子への高い暴露のために、将来的に増加するであろう。次の20年間に新しい症例は50%増加し得、2020年に向けて1500万人に達すると推計される。工業化された国々では、4人に1人が癌で死亡する(65)(66)。従って、頻度死亡率により、癌は世界中で公衆衛生の深刻な問題を構成している。

0020

女性に最も多い癌は、乳房、子宮頸結腸直腸および肺の癌であり、男性では、肺、前立腺、胃および結腸直腸の癌である(66,67)。死因として、癌は心血管疾患および感染症に次いで第三位を占めるが、先進国のみでは、一般的に心血管疾患に次ぐ第二の死因である(66,67)。2002年の統計は、この年に何らかの癌に苦しむ2460万人の罹患者のうち、1090万人の新症例および670万人(男性3.796.000人および女性2.928.000人)の死亡例を示している(67)。癌のうち、最多の死亡を引き起こしたのは肺(1.179.000人の死亡者)、胃(700.000人)、肝臓(598.000人)および結腸直腸(528.000人)のものであり、5年後の生存率が20%未満である最も悪性のものは、肺、食道、胃、肝臓のものおよび神経膠芽腫であった(66−68)。

0021

特異的分子標的を使用する癌の処置
細胞および分子レベルでの癌の知識の増加は、発癌部位に応じて、特異的分子標的を対象とし、アプローチを個人化する、新しい処置への期待を開いた。
癌細胞は、新しい特性の獲得を決定する遺伝子の損傷に由来し、正常な挙動から逸脱する(69−71)。一般に、3種類の遺伝子が腫瘍形成を導き得る:(i)癌遺伝子、(ii)腫瘍抑制遺伝子癌抑制遺伝子);および(iii)遺伝子の安定性に関与する遺伝子。これらの遺伝子の変化は、以下の異常な特性を特徴とする悪性形質の獲得をもたらす:1)増殖シグナルの自己充足性;2)抗増殖シグナルに対する非感受性;3)アポトーシスの回避;4)無限複製可能性;5)持続する血管形成;6)組織侵襲および転移

0022

あらゆるこれらの異常な特性にも拘わらず、癌細胞は、特定の内部シグナルのネットワーク活動亢進に対して、文字通り「中毒」になる。この特性は、現在、対応する活動亢進ネットワークを阻害するように特別に設計された薬物を用いて、それらの悪性度に対抗するために使用されている(61,72)。従って、活動亢進したシグナル伝達ネットワークを持続させる遺伝子の変化が各腫瘍で同定され得るなら、最小の二次的作用で、最大の恩恵を得ることが可能である(17,62,73)。遺伝子の病変の同定は、EGFRのものを含むいくつかの決定的なシグナル伝達経路について比較的進んでおり、従って、薬物の使用を、第一選択として、または、化学療法と組み合わせて、特定の標的に対して個人化することが可能である。今や、決定的な遺伝子の病変、並びに、癌細胞を正常な細胞と区別する、頻繁に変更される分子的および生化学過程の知識に基づいて、癌の処置を個人化することに対する傾向と広範な合意がある(61,69−72)。

0023

EGFRファミリー
EGFRは、悪性腫瘍の表現型の発生および維持に決定的な細胞の過程を制御するチロシン−キナーゼのパラダイムである。EGFRは、HER1/EGFR/ErbB1、ErbB2/HER2/Neu、ErbB3/HER3およびErbB4/HER4を含む受容体チロシン−キナーゼファミリーのメンバーである(3)。EGFRは、リガンドと相互作用する細胞外ドメインおよびチロシン−キナーゼドメインを有する細胞内ドメインを示す。それは、主に細胞膜に局在し、そこで特異的リガンドの刺激による相互作用で活性化され、最初にその二量体化に至り、続いてその細胞内チロシン−キナーゼが活性化される。EGFRキナーゼ活性は、EGFR自体およびいくつかの他の細胞内基質のチロシンをリン酸化し、かくして、すべて腫瘍形成に関与する、細胞増殖、生存および遊走の過程を調節するシグナル伝達経路を開始させる。EGFRは、最も広範に分布する受容体の1つであり、これらの過程の調節因子であり、腫瘍細胞により頻繁に分泌されるEGF、HB−EGFおよび腫瘍増殖因子アルファ(TGF−α)を含む様々なリガンドにより活性化され得る(74)。EGFRは、また、様々な他の受容体、特にGTPase(GPCR)と共役する受容体の刺激によりトランス活性化される(75)。興味深い例は、より広範に分布するGPCRの1つであるP2Y1受容体と相互作用するATPなどの細胞外ヌクレオチドによるEGFRのトランス活性化である(64)。

0024

癌に関連するEGFRの変化
EGFRの機能の変化は、様々な癌に関連して頻繁に見いだされ、これらの変化の発癌作用は、好ましい抗癌剤の標的を構成する(4,21,76)。固形腫瘍のほぼ40−50%が、遺伝子の変化に決定されるEGFRチロシン−キナーゼの活性の増悪に依存する。

0025

EGFRの遺伝子の変化の詳細な列挙には、以下が含まれる:(i)タンパク質の過剰発現を導く、EGFR遺伝子対の数の増加。神経膠腫および肺腫瘍は、頻繁にそのような遺伝子の増幅を示す(77,78)。しかしながら、胃癌に見られるように、遺伝子の増幅を伴わない、他の未だ不明のEGFR過剰発現のメカニズムが存在する(79,80)。

0026

EGFRの過剰発現は、通常、高い悪性度と関連する;(ii)活動亢進したEGFRをもたらす突然変異;a)神経膠芽腫において最も重要である、リガンド結合のドメインに一致する細胞外領域欠失により欠くEGFRvIII突然変異(81);b)ロイシン858がアルギニン置換されているEGFRL858R突然変異および保存配列LREAを除去するエクソン19の欠失を伴うEGFRDelE746−A750、両突然変異は、受容体のチロシン−キナーゼドメインに影響し(EGFRTKDmut)、非小細胞肺癌(NSCLC)の10−15%に見られる(82,83)。

0027

ある種の癌の処置のためにEGFRに対して現在使用されている薬物
EGFRの遺伝子の変化を有する細胞は、受容体から生じる悪化した(発癌性)シグナルに「中毒」になる。EGFRの悪化した活性の阻害は、正常な細胞よりも癌細胞に損傷を与える。従って、EGFR機能の阻害剤は、現在、各腫瘍におけるFGERの変化の同定後に個人化でき、かくして処置への応答を最適化する、標的化された癌治療を開発するためのパラダイムを構成している(72,84)。

0028

現在、EGFRに対する2種類の薬物が、ある種の癌を処置するために臨床使用されている(4):(i)リガンド結合を阻害する、EGFRの細胞外領域に対するモノクローナル抗体(セツキシマブおよびパニツムマブ)。セツキシマブ(アービタクス;Merk KGaA, Darmstad, Germany;WO2009099649)は、EGFRに高い親和性で結合し、リガンド結合を競合的に妨害するモノクローナルヒト化抗体である。それは、また、EGFRのエンドサイトーシスおよび負の調節も誘導する。それは、主に、EGFRを発現する進行した結腸直腸癌の処置に使用される(85,86);(ii)エルロチニブおよびゲフィチニブなどの、EGFRのチロシン−キナーゼを阻害する低分子(4)(WO03103676およびWO2005117887)。これらの薬物は、チロシンキナーゼドメインへの結合についてATPと競合し、かくして、増殖の悪化を促進するシグナル伝達カスケードを開始するのに決定的な、EGFR基質のリン酸化を阻害する。チロシンキナーゼ阻害剤は、転移NSCLCおよび結腸、頭頸部および膵臓の癌の処置に使用できる(4,87)。他のEGFR機能を阻害する抗腫瘍剤の特許には、WO03097855、US5795898が含まれる。

0029

個人化された治療の標的としてのEGFR
EGFRは、個人化された癌治療のために最も研究され、好まれている標的の一つである(3,61)(4)。2つの注目に値する例は、NSCLCおよび結腸癌であり、これらでは、EGFR発癌性突然変異の分析が、チロシンキナーゼ阻害剤を好都合に使用できるか否かを決定するのを助ける(88−90)。NSCLCでは、患者の10−20%のみが、エルロチニブまたはゲフィチニブに応答する(91,92)。セツキシマブはあまり有効ではない(93)。応答性の患者は、チロシンキナーゼドメインに上述の突然変異のいずれかを有するEGFRTKDmut受容体を発現し、それは、発癌性をもたらすのみならず、受容体を薬物に対して感受性にする(83,94,95)。これらの突然変異の同定は、80−90%に迫る応答と生存の改善を達成できる、処置の個人化を可能にする(17,89,96−98)。

0030

利用可能な抗EGFR薬の制限
EGFRの発癌機能に対抗する現在の薬物の主な制限は、大部分が応答せず、最初は感受性の腫瘍に耐性が発生するために、比較的低い効力である(17,73,87)。例えば、症例のほぼ85−90%を占める、エルロチニブまたはゲフィチニブに感受性のEGFR突然変異に依存しないNSCLCに罹患している患者には、与えるものは多くない。これは、これらの種類の阻害剤に応答しない他の癌にも該当する。さらに、最初はエルロチニブまたはゲフィチニブに応答する感受性の患者でさえ、腫瘍の増殖が6ヶ月ないし2年の間に回復することが頻繁に観察される。これらの耐性腫瘍のほぼ50%が、チロシンキナーゼドメインのメチオニン790をスレオニンに置換する第二の突然変異を示し、これが、薬物とATP結合部位の相互作用を妨害する(17)。最近の研究は、今度はEGFR T790M突然変異を阻害する新しい薬物を報告している(99)。しかしながら、キナーゼ阻害剤に共通の問題であるように、新しい薬物に対する耐性発生の可能性は依然として存続している(100)。一方、耐性を発生するがT790M突然変異を持たない、さらに別の50%の症例があり、そのメカニズムは不明のままである(17,101−103)。

0031

まとめると、これらの証拠により、EGFRは抗腫瘍薬を設計するのに良好な標的であるが、その発癌機能を妨害するために、既に使用されているものを超える、リガンド結合またはチロシン−キナーゼ活性のブロッカーを継ぐ、代替的なメカニズムを見いだす必要があると結論付けることができる(4)。

0032

本発明は、低分子薬を使用するEGFRのエンドサイトーシスおよびEGFRの細胞内輸送の撹乱の薬理的誘導に基づく新規の戦略を提唱し、それは、EGFRに依存する癌細胞に有害であり得る、外部のリガンドにより活性化されるための利用可能性の低下およびシグナル伝達の場所の変更を導く(104)。

0033

抗腫瘍薬の標的としてのEGFRエンドサイトーシス
エンドサイトーシスは、EGFRの機能を制御する様々な過程の中で重要性が高く(56−60)、新しい抗腫瘍の可能性を与える(104,105)。EGFRシグナル伝達を制御するメカニズムは、細胞内輸送を調節するものと密接に絡み合っており、癌細胞は、そのような機能的関連を利用して、EGFRの発癌性を高めることができる(60,106−111)。リガンド結合は、EGFRの二量体化および細胞内チロシンキナーゼ活性の活性化を導き、それは、次いで、下流のシグナル伝達要素を補充するモチーフとして働くいくつかのチロシンでトランスリン酸化を受ける(112)。チロシンリン酸化EGFRは、また、E3ユビキチンリガーゼCblによりユビキチン化される(113−115)。リガンドに誘導されるエンドサイトーシスの複雑なメカニズムは未だ完全に理解されていないが、クラスリンアダプターAP2−相互作用モチーフ、受容体のユビキチン化およびアセチル化を含む冗長な機構に繋がると考えられる(116)。これらの構造的/生化学的修飾は、活性なEGFRの細胞内輸送を規定する(114,116−118)。エンドサイトーシスは、後にリソソームと融合する多胞体の腔内小胞への、ユビキチン依存性およびESCRT介在性のEGFRの分別を含む、下方調節経路を提供する(117,119,120)。しかしながら、リガンド濃度(121)および受容体発現レベル(104)を含む様々な要因に応じて、活性化EGFRは、分解の前に様々な期間にわたりシグナル伝達能力を保持でき、様々な応答結果を指定する。高い悪性度に関連する一般的な条件である、EGFRを過剰発現する細胞では、EGF刺激は、分解経路への分別の遅延および結果的な活性化EGFRのエンドソーム蓄積の増加を含むメカニズムを介して、アポトーシスを導く(104,105)。従って、細胞内輸送は、リガンドに誘導されるEGFRシグナル伝達の強度、場所および期間を変更する複数の機会を提供し、それは、EGFR依存性腫瘍細胞において、治療的可能性を有し得る。

0034

しかしながら、腫瘍内の癌細胞への接近に制限を有することが多い抗体の代わりに、低分子薬について、細胞表面からの除去に至るEGFRエンドサイトーシスの薬理的誘導は、抗腫瘍戦略として使用されてこなかった。

0035

我々は、最近、タンパク質キナーゼAの下方調節に向かうホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ(PAP)の酵素活性のシグナル伝達経路(PA/PKA経路)を含む、EGFRエンドサイトーシスの制御の新しいメカニズムを記載した(122)。このメカニズムは、PAPの薬理的阻害により開始させることができ、PAレベルの上昇、4型ホスホジエステラーゼ(PDE4)の活性化およびcAMPレベルおよびPKA活性の低下を導き、EGFRエンドサイトーシスの誘導を決定する。

0036

シグナル伝達のホスファチジン酸(PA)
PAは、構造およびシグナル伝達の要素として作用し、様々な細胞の機能を媒介する(123)。シグナル伝達のPAは、主に、EGFを含む多種多様な細胞外刺激(124−126)により活性化される酵素であるホスホリパーゼDPLD)(123)によるホスファチジルコリン加水分解から生じる(127−129)。複数の癌が、PLD活性または発現の上昇を示し、それは、アポトーシスの抑制およびファゴサイトーシスの主要な調節因子である(131)mTORの阻害剤による癌処置への耐性(126,130)と関連付けられてきた。PAのレベルは、ジアシルグリセロール(DAG)を産生するホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ(PAP)により下方調節される(123)。

0037

ホスファチジン酸ホスファターゼ活性(PAP)および既知の阻害剤
2種類の異なる種類の酵素が、ホスファチジン酸をジアシルグリセロールに変換するPAP活性を有する。PAP1は、細胞質および小胞体膜に分布する酵素であり、そこでトリアシルグリセロール(TAG)、ホスファチジルコリン(PC)およびホスファチジルエタノールアミン(PE)の合成に必要なDAGを産生する。PAP1活性は、PAに特異的であり、Mg2+依存性であり、N−エチルマレイミドによる阻害に感受性であり、3つの成分のファミリーを含む:Lipin1、Lipin2およびLipin3(1)。PAP2は、主に細胞膜およびエンドソーム膜に局在する膜貫通タンパク質であり、Mg2+を必要とせず、N−エチルマレイミドにより阻害されない。PAP2のLPPは、PAに特異的ではなく、すべてシグナル伝達に関与する、リゾホスファチジン酸(LPA)、セラミド1−ホスフェート(C1P)、スフィンゴシン1ホスフェート(S1P)およびDAGピロホスフェートを含む幅広い範囲の他の脂質リン酸を加水分解する。従って、PAP2は、脂質リン酸ホスファターゼ(LPP)とも呼ばれ、LPP1、LPP2およびLPP3と名付けられた3種の関連タンパク質を含む(1)。

0038

様々な疾患の臨床実務で現在使用されているいくつかの陽イオン性両親媒性化合物は、副作用としてPAPを阻害する能力を有し、これには、プロプラノロール、デシプラミン、クロルプロマジンデスメチルイミプラミンおよびトリオフルオロペラジンが含まれる(7−10)。

0039

PAP阻害剤で処置され得る、様々なEGFR発癌性変化を有する癌の例
肺癌
癌による全死亡の約30%が肺癌によるものであり、世界中で癌による死亡の主原因である(132)。肺癌の約90%は、世界中で約13億人を冒している喫煙によるものであり、一年に約5百万人の30以上の人々を殺している(133)。非小細胞肺癌(NSCLC)の癌は、大きい死亡のリスクを伴う進行した悪性腫瘍の1つである。処置しなければ、NSCLCおよび転移の患者では、生存期間中央値は4−5ヶ月である。患者の10%しか、その年に生き残らない。進行または転移NSCLCの標準的な第一選択の治療は、プラチナダブレットと組み合わせた化学療法を基礎とし、それは、生存期間中央値を8−11ヶ月に延ばし、生存率を1年で約30%、2年で14−20%に高める(134)。

0040

胃癌
胃癌は、最も一般的な上皮由来の癌の1つである(135)。その発生率は過去50年間で減少してきたが、依然として、頻度で第4位であり、死因としては肺癌に次いで第2位であり、性別および人種の群で有意差がある。毎年、約100万件の新しい症例が診断され、この原因で約800,000件の死亡がある。局在した癌の患者の5年目の生存率は60%に登り、一方、転移がある患者では、わずか2%である(136)。進行した疾患の場合、処置しなければ、生存期間中央値は12ヶ月未満である(しばしば、わずか5.4ヶ月)。新しい化学療法の様式は、生存期間中央値を下げるのに失敗し、過去10−20年にわたり概して変わらないままである。この癌について、確立された化学療法は存在しない(79,80,137)。

0041

神経膠芽腫
「神経膠腫」は、膠細胞起源があると考えられるすべての腫瘍を含み、中枢神経系の最も一般的な腫瘍である。グレードIII(未分化星状細胞腫)およびグレードIV(神経膠芽腫)は、悪性神経膠腫とみなされる(68)。神経膠芽腫は、毎年3/100,000人の発生頻度であり、すべてのヒトの癌の中で最も致死的な腫瘍の1つである。神経膠芽腫の生存期間中央値は、数十年間にわたり、約9−12ヶ月で維持されてきた。65歳以上の患者の2%のみ、45歳未満の患者の30%が、2年間生存し、一方、約75%が診断の18ヶ月後には死亡する(138,139)。浸潤性の特徴と、放射線療法および化学療法を含む標準的処置への応答の乏しさが、予後不良に寄与している(139−141)。放射線療法および同時のテモゾロミドと、後続補助的なテモゾロミドの投与という現在の処置は、12.1ヶ月の生存期間中央値を14.6ヶ月に延ばす(140)。

0042

発明の詳細な説明
本発明は、EGFRまたはその発癌性変異に依存する癌細胞の増殖を妨害するための、エンドサイトーシスの誘導に基づく新戦略としての、単独またはデシプラミンと組み合わせたD−プロプラノロールによるPAPの阻害に関する。

0043

プロプラノロール(これは、DおよびLプロプラノロールのラセミ混合物を表す)は、ベータ−アドレナリン受容体を発現する癌細胞の腫瘍増殖および転移の実験的弱化のために、ベータ−ブロッカーとして使用されたことがあり、従ってそのような使用は、D−プロプラノロールではなく、その活性の本質であるL−プロプラノロールに集中している。これらの実験では、プロプラノロールは、ストレス条件による腫瘍形成を促進すると考えられるベータ−アドレナリンの刺激を防止するのみであり、強い交感神経緊張により促進される悪性の特性に対抗すると期待される(142−144)。実際に、プロプラノロールは、現在、その悪性度がEGFRまたは他のErbB/HERファミリーのメンバーの発癌性に依存する癌に対して承認されている処置に含まれない。D−プロプラノロールは、癌細胞の増殖に対抗するために、いかなる刊行物においても、以前に使用されていない。

0044

より効果的な抗癌作用のためにD−プロプラノロールと組み合わせることができるPAP阻害剤の例として本発明で使用されるデシプラミンに関して、国際公開WO2006/017185において、いくつかの他の化合物と共に、インビトロ抗増殖作用を示すことが言及された。しかしながら、この刊行物は、デシプラミンが細胞増殖の減少を引き起こし得るメカニズムに言及せず、そのような効果が選択的であるのか、正常細胞も冒すのかを分析していない。この刊行物は、抗腫瘍治療における効果的な使用または効果の最適化の可能性を認識させない。国際公開WO2008/112297は、酵素酸スフィンゴミエリナーゼの阻害剤を記載し、その中で、デシプラミンを類似の化合物として挙げ、それが抗癌作用を有し得ると予測しているが、具体的な結果は報告されていない。

0045

ノルエピネフリンおよびセロトニンの再取り込みを阻害する三環系抗うつ剤として使用されるデシプラミン(16)は、培養中の癌細胞の増殖および生存を低減すると報告された(145−149)。報告された用量は比較的高く、本発明で使用されるものよりも40−100倍高い。そのような高濃度で、デシプラミンは、腫瘍細胞および正常細胞の両方のほとんどの種類の細胞にとって、むしろ毒性である。さらに、これらの研究のいずれも、EGFR依存性またはPAP阻害を介して作用する可能性を考慮していない。本発明では、デシプラミンは、患者で報告されたものに近い濃度で作用するD−プロプラノロールの抗癌特性を改善できるPAP阻害剤の例である。不整脈(14)またはうつ病(150,151)を各々処置された患者により血中で達成されるものに近い濃度で、D−プロプラノロール(10−30マイクロモル濃度)とデシプラミン(1マイクロモル濃度)の組合せは、EGFRまたはその突然変異の発癌性に依存する腫瘍細胞に選択的である(図2および3参照)。

0046

本発明の発明者らは、ラセミ混合物としてのプロプラノロールまたはL−およびD−プロプラノロールがEGFRのエンドサイトーシスを誘導することを発表し、そのメカニズムがPAP阻害、PAの増加および結果的な4型ホスホジエステラーゼの活性の増加を含み、cAMPレベルの低下およびPKA活性の低下(122)をもたらすことを示した。この新規制御システムは、EGFRエンドサイトーシスを誘導し、その悪性度が発癌性のEGFRの機能に依存する腫瘍の増殖を低下させる新しい標的として、PAPを含むPA/PKA経路の様々な酵素を使用する可能性をもたらす。

0047

本発明の発明者らは、以前に、EGFの非存在下で基底PKA活性を阻害することが、空の/不活性のEGFRの内在化を導き、一方、EGFの存在下では、リソソームの分解経路への分別の遅延により、リガンドで活性化されたEGFRの分解速度を遅らせることを示した(152)。

0048

次いで、PAP阻害剤により開始されるPA/PDE4/cAMP/PKA経路を介するPKA活性の低下により、薬理学的にEGFRの内在化を誘導し、それらの刺激への到達性を低下させるのみならず、EGFRの細胞内輸送およびシグナル伝達を撹乱することが可能である。このPA/PDE4/cAMP/PKAシグナル伝達経路は、以前に記載されたが、その機能は未知のままであった(15)。研究者の結果は、このPA/PDE4/cAMP/PKAシグナル伝達経路が、エンドサイトーシスとリサイクリングの機構に作用して、EGFRの細胞表面レベルおよび細胞内輸送を調節することを示す(122)。

0049

本発明は、また、以下のさらなる観察に基づく:1)L−プロプラノロールのベータ−ブロッカー活性を欠くエナンチオマーのD−プロプラノロールおよびデシプラミンは、両方ともPAPの阻害剤として使用され、EGFRのエンドサイトーシスを誘導する;2)D−プロプラノロールおよびデシプラミンは、EGFR過剰発現およびEGFRvIII突然変異を含む、EGFRの発癌性の変化を発現する癌細胞の増殖を阻害する。これらの薬物の効果は悪性細胞に選択的であり、非腫瘍細胞は比較的影響されないか、または、弱く影響される。それらの組合せは、単独の各薬物より明らかに良好である。

0050

PAP阻害剤(15)として使用されるD−プロプラノロールおよびデシプラミンは、EGFRのエンドサイトーシスおよび細胞内蓄積を誘導するPA/PDE4/cAMP/PKAシグナル伝達経路を活性化する(122)。D−プロプラノロールを単独またはデシプラミンと組み合わせて使用する本発明は、臨床的処置におけるそれらの以前の使用とは完全に異なる。それは、混合物の中でL−プロプラノロールのみにより提供され、D−プロプラノロールによっては提供されないベータ−ブロッカー活性を必要とする高血圧および他の血管障害を処置するための、ラセミ混合物のプロプラノロールの使用とも異なる。D−プロプラノロールは、ベータ−アドレナリンの遮断を欠く抗不整脈薬としてヒトで実験的に使用されたが(14)、一方、デシプラミンは、ノルエピネフリンの再取り込みを阻害し、それより低い程度でセロトニンの再取り込みも阻害する三環系抗うつ剤である(16)。

0051

細胞生物学では、プロプラノロールは、現在、シグナル伝達、タンパク質輸送および細胞骨格の機能などの様々な細胞の過程におけるPAおよびジアシルグリセロールの機能を研究するために、PAP阻害剤として使用されている(123)。

0052

PAが関与する様々なシグナル伝達経路の中で、PDE4の活性化はあまり研究されてこなかった。PAによるPDE4の活性化は、cAMPレベルの低下を、結果的にPKA活性の低下を導き、これが、そのベータ−ブロッカーの作用とは独立してプロプラノロールにより、そして、そのノルアドレナリン再取り込みへの作用とは独立して、デシプラミンにより誘起される効果である(15,153)。

0053

D−プロプラノロールおよびベータ−ブロッカー活性を欠く類似体は、単独で、または、デシプラミンと組み合わせて、化学療法またはEGFR阻害剤(例えばセツキシマブ、エルロチニブおよびゲフィチニブ)をベースとする処置を補足するPAP阻害剤として、また、現在の処置への耐性が既に発生している場合に単独の治療として、使用され得る。

0054

本発明は、結腸、肺、乳房、前立腺、胃、頭頸部、肝臓の癌および神経膠芽腫を含む、悪性度が頻繁にEGFRまたはErbB2の発癌性変化に依存する癌の処置に、新しい可能性を開く。

0055

実施例
実施例1:125I−EGF結合により測定され、免疫蛍光により可視化される、L−、D−プロプラノロールおよびデシプラミンのEGFR内在化に対する効果の比較評価
本願発明者らは、LおよびDプロプラノロールのラセミ混合物が、125I−EGF結合の低下により反映される通り、わずか30分間で細胞表面のEGFRのレベルを低下させ、最高用量(300μM)で80%に達し、有効濃度50%(EC50)は約75−100μMであることを記載した(122)。

0056

本発明によりEGFRの発癌作用の妨害のために提唱される、PAPの阻害剤としてのプロプラノロールの効果は、インビトロで、ベータ−アドレナリンブロッカーとしてのものより、高い濃度を必要とする(143,144)。L−プロプラノロールは、D−プロプラノロールよりもほぼ100倍強いベータ−アドレナリンブロッカーである。しかしながら、本願発明者らの結果は、L−プロプラノロールとD−プロプラノロールは細胞表面のEGFRを減らす能力において同等であり(図1,A)、ラセミ混合物について報告されたのと同様に(122)、両方とも約75−100μMのEC50であった。

0057

デシプラミンも、約20μMのEC50で、125I−EGF結合の減少を誘導するのに有効である(図1B)。デシプラミン(20μM)とプロプラノロール(75μM)のEC50の組合せは、125I−EGF結合アッセイで評価される通り(図2CおよびD)、75−80%のEGFRを細胞表面から減らす。

0058

図1Eの間接的免疫蛍光は、75μMのD−またはL−プロプラノロールが、細胞表面から細胞内の主に核周囲の場所(それは、この種のエンドソームのマーカーであるトランスフェリンとの共局在により、リサイクリングエンドソームと定義された)へのEGFRの再分布を誘導することを示す(122)。D−プロプラノロールは、L−プロプラノロールよりもベータ−ブロッカーとして60−100倍活性が弱く、一方、図1Aに示される通り、D−およびL−プロプラノロールは両方ともPA/PKA経路(15)並びにEGFRエンドサイトーシスの誘導において同等であるので、この効果は、ベータ−遮断活性によるものではない。同様にPAP活性に対する阻害作用を有するデシプラミン(15,153)は、プロプラノロールの細胞内の効果を模倣する。

0059

本発明は、プロプラノロールと組み合わせて使用できる任意の既知のPAP阻害剤、または、さらに高い効力を有し得る単独で使用できる新しいPAP阻害剤に有効である。ここに示した結果は、例示にすぎず、本発明の分野を限定または制限しない。

0060

実施例2:EGFRおよびその発癌性変異体EGFRvIIIに依存する様々な増殖速度の腫瘍細胞モデル
EGFRに依存する腫瘍細胞の増殖および生存能の阻害剤としてのD−プロプラノロールおよびデシプラミンの有効性を、培養中の神経膠芽腫細胞で立証する。ヒト神経膠芽腫由来の細胞株U87は、低レベルのEGFR(データは示さない)を発現し、突然変異のEGFRvIIIを過剰発現するように形質移入されると、増殖速度が非常に高まる(図2)。これらの細胞は、薬物を試験するのに適当な実験モデルを提供する。使用した他のモデル系は、高レベルのEGFRを発現するがEGFRvIIIを発現しない、患者から直接得られた神経膠芽腫多形細胞(GBM1)であった。D−プロプラノロールとデシプラミンの組合せに対する感受性は、U87細胞と比較して、U87−EGFRvIII細胞およびGMB1細胞で高い。2μMという低濃度のD−プロプラノロール(プロプラノロールによる高血圧の処置中の患者の血漿で報告されたものの2倍にすぎない)と0.6μMデシプラミン(血漿において記載されたものの半分)は、この発癌性突然変異を発現しない細胞に大きく影響を与えずに、U87−EGFRvIII細胞で顕著な効果を達成する(図2A)。

0061

D−プロプラノロールの濃度10μMは、最終投与から12時間後に測定した不整脈の処置中の患者の血液で報告された(14)。不整脈の患者で臨床使用中に生じるものに近い濃度範囲を反映すると見込まれる10−30μMのD−プロプラノロールの効果を、単独で、または、1μMのデシプラミン(この薬物について報告された有効血中濃度)と組み合わせて使用した。10−30μMというこれらの高用量のD−プロプラノロールは、単独で、または、1μMデシプラミンと組み合わせて、同様の選択的効果を有した(図2B)。

0062

これらの結果は、EGFRまたはその欠失変異体EGFRvIIIを過剰発現する細胞における発癌的寄与に依存する腫瘍増殖に対する、デシプラミンと組み合わせたD−プロプラノロールの有効性を立証する。両薬物の組合せの驚異的な結果は、EGFRvIIIを発現する癌のために、臨床的に受け入れられている用量を使用することを可能にする。

0063

実施例3:いくつかの癌細胞株に対するD−プロプラノロールおよびデシプラミンの抗癌効果
選択性の対照として、この実験は、低レベルのEGFRを発現し、悪性ではないイヌ腎臓上皮性細胞株であるMDCK細胞(64)が、これらの薬物により影響を受けないことを示す。その代わり、EGFRおよびErbB3に依存すると報告され、抗EGFR薬の研究に幅広く使用されている黒色腫細胞B16の系統に属する悪性度の高いマウス黒色腫細胞B16F10(154−156)、および、発癌性二重突然変異EGFRL858R/T790Mを発現するヒト肺癌細胞H1975(101)は、最も感受性が高い。注目すべきことに、EGFRL858R/T790Mは、臨床使用において、チロシン−キナーゼ阻害剤エルロチニブまたはゲフィチニブに耐性である(157)。これらの薬物は、また、同様にEGFRを発現すると報告された卵巣癌細胞CI101(158)に対しても有効である。

0064

まとめると、D−プロプラノロール(および、ベータ−ブロッカー活性を欠く類似体)およびデシプラミンは、単独で、または組み合わせて、過剰発現(BMB1など)または突然変異(例えばEGFRvIII)により与えられるEGFRの発癌性の変化に悪性度が依存する癌の処置に有用である。

0065

本発明の範囲は、肺癌で記載されたものなどの他の発癌性EGFR変異体、または、他のファミリーのメンバー(例えば、ErbB2/Neu、ErbB3/HER3およびErbB4/HER4)を発現する癌に、そして、D−プロプラノロールと組み合わせられる既知のPAP阻害剤である他の阻害剤(スフィンゴシンおよびクロルプロマジン)に、または、単独で使用されて高い有効性を示し得る新しいPAP阻害剤に及ぶ。

0066

D−プロプラノロールは報告されたPAP阻害剤(153)であり、高血圧および他の血管障害の処置に現在使用されているベータ−ブロッカーのラセミ混合物であるプロプラノロールよりも高い用量で、ヒトにおいて使用できる。不整脈を制御するためにD−プロプラノロールで処置された患者で報告されたような主要な付帯的問題を伴わずに(14)、ラセミ混合物よりも少なくとも10倍高い濃度のD−プロプラノロールに血中で到達することができる。これらの患者では、最終投与の12時間後に評価した血中濃度は、10μMに近い(14)。循環中のプロプラノロールの濃度は約4−6時間の半減期で低下し、従って臨床的に意味のある血中濃度を達成するために、患者は1日に4回処置されなければならないので、ここで使用された30μMの濃度は、良好に耐容されると期待される。

0067

さらに、D−プロプラノロールとデシプラミンの組合せは、EGFRまたはその発癌性突然変異の発癌性刺激に依存する癌の処置に、各々の薬物単独よりも有効であり得る。

0068

図面の詳細な説明
図1:エナンチオマーのL−およびD−プロプラノロール並びにデシプラミンは、放射性リガンド結合により測定される細胞表面のEGFRの利用可能性を低下させ、この作用は、エンドサイトーシスに起因するものである:事前に4時間にわたり血清を除いたHeLa細胞を、示した用量の様々な薬物で30分間処理し、次いで、細胞を20ng/ml125I−EGFと共に4℃で1時間インキュベートして放射性リガンド結合アッセイを実施し、細胞表面のEGFRを検出した。A. L−およびD−プロプラノロールは、75μM(EC50)の濃度で約50%、250μMで80%の細胞表面のEGFRの減少を反映して、125I−EGF結合の低下を引き起こした。L−およびD−プロプラノロールの作用は、区別がつかない;B. デシプラミンも、EC50約20−25μMで、放射性リガンド結合レベルの低下を誘導した;C. 様々な濃度のD−プロプラノロール(上の目盛り)とデシプラミン(下の目盛り)の組合せ;D. 各々のEC50で使用されたD−プロプラノロール(75μM)およびデシプラミン(25μM)の組合せは、125I−EGF結合の約75%の減少を引き起こした。E.カバーガラス上で増殖させ、100μMD−またはL−プロプラノロールおよび20μMデシプラミンで30分間処理したHeLa細胞の、抗EGFRモノクローナル抗体HB8506(ATCCハイブリドーマ)による間接免疫蛍光。対照細胞は、細胞表面分布を示す境界で殆どのEGFR染色を示し、一方、すべての薬物で、パターンは細胞内局在、主に核周囲領域に変化した。

0069

図2:D−プロプラノロールおよびデシプラミンは、EGFR(GBM1)またはEGFRvIII(U87−EGFRvIII)に依存する腫瘍の神経膠芽腫細胞の増殖を低下させる。
A. 異なる増殖速度の腫瘍細胞のモデルとしての、U87および発癌性突然変異EGFRvIIIを過剰発現するように形質移入されたU87(U87−EGFRvIII)。10%FBSおよび抗生物質ペニシリン100U/mlおよびストレプトマイシン100mg/ml)を添加したMEM培地を有する24ウェルプレートに、10,000個の細胞を播いた。プラスミドcDNA3−EGFRvIII−mycで永続的に形質移入されたU87細胞(U87−EGFRvIII)は、U87細胞よりも高い増殖を示す。

0070

B. U87−EGFRvIIIおよび、EGFRを過剰発現するがEGFRvIIIはしない神経膠芽腫の患者由来のGBM1細胞は、D−プロプラノロールおよびデシプラミンに選択的に感受性である。ウェル当たり10,000個の細胞(U87、U87−EGFRvIIIおよびGBM1)を播き、18時間培養した後、培養培地を、示した薬物、即ち、10μM D−プロプラノロール(D−Prop)および1μMデシプラミン(Des)を単独または両者の組合せで含むか、または含まない(対照)培地で置き換え、培地を4日間にわたり24時間ごとに交換した。U87細胞はこれらの薬物に感受性ではないが、U87−EGGFRvIIIおよびGBM1の両方とも、これらの薬物の存在下で、薬物の組合せの高い効果で増殖を低下させた。

0071

図3:D−プロプラノロールおよびデシプラミンは、選択的に腫瘍細胞の増殖を損なう
ウェル当たり10,000個の細胞を播き、18時間培養した後、培養培地を、示した薬物、即ち、10または30μM D−プロプラノロール(D−Prop)および1μMデシプラミン(Des)を単独または両者の組合せで含むか、または含まない(対照)培地で置き換え、培地を4日間にわたり24時間ごとに交換した。生体染色トリパンブルーとインキュベートした後、自動細胞計測器計数した生存細胞を、非処理対照に対する生存細胞の%として表す。腫瘍卵巣細胞(UCI101)、黒色腫(B16F10)および非小細胞肺癌細胞(NSCLC;H1975)は、すべてこれらの薬物感受性であったが、腫瘍性ではなく非常に低いレベルのEGFRを発現するメイディンダービー・イヌ腎臓細胞(MDCK)細胞は、D−プロプラノロールにもデシプラミンにも影響されなかった。

0072

図4:EGFRに依存する癌を処置するための、D−プロプラノロールおよびデシプラミンの作用に基づく新しい戦略:リガンド結合またはチロシンキナーゼ活性を阻害することを試みてEGFR分子を直接的に標的とする現在の戦略とは対照的に、本発明は、PAPを阻害し、PA/PKAシグナル伝達経路を活性化する薬物により媒介される受容体のエンドサイトーシスを誘導し、それにより、細胞表面からエンドソームへのEGFRの再局在化を誘導することを提唱する。

0073

技法の説明
試薬および抗体
組み換えヒトEGFは、Invitrogen (Carlsbad, CA) から、タンパク質A−セファロース、プロプラノロールおよび高グルコースDMEMは、Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) から、ウシ胎児血清は、Hyclone Laboratories (Logan,UT) から、細胞培養試薬は、Invitrogen および Sigma Aldrich から、組織培養用のプラスチックプレートは、Nalge Nunc (Naperville,IL) から購入した。アメリカ培養細胞系統保存機関(the American Type Culture Collection,ATCC, Manassas, VA)から購入したハイブリドーマHB8506の培養培地を、ヒトEGFRの細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体の供給源として使用した。EGFRのカルボキシル末端ドメインに対するウサギモノクローナル抗体は、Millipore から購入した。

0074

EGFRvIII癌遺伝子の発現用プラスミドの構築
(152)に記載のpBK−CMVベクターのHindIIIおよびSmaI部位の間にクローニングしたEGFRのcDNAを、発癌性変異体EGFRvIIIの発現ベクターの構築に使用した。最初に、エクソン1−2および7−28に相当するPCR断片を、第1の断片用にKpnIおよびEcoRVの、第2の断片用にEcoRVおよびXbaIの制限部位を含むプライマーを使用して得た。これらの断片を連結した後、エクソン2−7を欠くEGFRvIIIに相当するに相当する新しい断片を得、次いで、pcDNA3.1およびpcDNA3.1mycベクターのKpnIおよびXbaI部位の間にクローニングし、ベクターpcDNA3−EGFRvIIIおよびpcDNA3−EGFRvIII−mycを各々得た。両コンストラクトを、配列解読により分析した。

0075

細胞培養および形質移入
EGFRのエンドサイトーシスを研究するための放射性リガンド結合アッセイおよび免疫蛍光に使用するHeLa細胞は、我々の研究室で以前に特徴解析した(64,122,152)。この細胞を、約80%のコンフルエンスまで増殖させ、試験前に血清なしで4時間維持した。ATCCからのU87ヒトハイブリドーマ細胞を増殖させ、製造業者(Invitrogen)の指示に従いリポフェクタミン法を使用してpcDNA3.1−EGFRvIII−mycで形質移入した。100,000個のU87細胞を15mmプレートに播き、播いてから48時間後に、細胞を1μgのプラスミドpcDNA3−EGFRvIII−mycで形質移入した。形質移入の48時間後に、選択培地(DMEM、10%ウシ胎児血清(FBS)、抗生物質(100IU/mlペニシリン、100mg/mlストレプトマイシン)および0.8mg/mlジェネテシンを添加)を加えた(G418, Sigma)。選択培地中で2週間後、永続的に形質転換された細胞を得た(U87−EGFRvIII)。

0076

多形神経膠芽腫と診断された患者の生検組織からGBM1細胞を得た。腫瘍の生検組織は、約1cmであった。それをPBSで4回洗浄し、細かく切断し、継続的に撹拌しながら、0.125%トリプシン、5mMEDTAを含むPBS中、15分間、37℃でインキュベートした。パスツールピペットによる機械破砕後に、卓上遠心機で、1200rpmで10分間、細胞を遠心分離した。ペレットを、オボムコイド阻害剤(1mg/ml)およびDNaseI(1mg/ml)を含むPBS2mlで再懸濁し、10分間1200rpmで再度遠心分離した。細胞をNH4Cl/Tris pH7.2に再懸濁し、5分間37℃でインキュベートし(5000万個の細胞に5ml)、10分間、1200rpmでの遠心分離によりペレットにし、最終的に、10%FBSを含むDMEMに再懸濁し、培養した。これらの細胞を少なくとも10回の継代にわたり維持した。

0077

培養した腫瘍細胞のインビトロの増殖および生存能、並びに、D−プロプラノロールおよびデシプラミンによる処理の評価
細胞を、10.000個/ウェルの密度で、24ウェルプレートにトリプリケートで播き、10%FBSおよび抗生物質(ペニシリン100U/mlおよびストレプトマイシン100mg/ml)を添加したDMEM中で培養した。薬物を含む培地を、24時間毎に交換した。各対照は、培養培地のみを受容した。4日間の処理後に、生体染色のトリパンブルーとインキュベートした後で、生きている細胞を自動細胞計測器(Countess, Invitrogen)で計数し、非処理対照に対する生存細胞の%として表す。

0078

間接免疫蛍光および共局在分析
カバーガラス上で増殖させたHeLa細胞を、冷リン酸緩衝塩水(PBS)で3回洗浄し、EGFRを細胞表面に蓄積させるために、無血清DMEM−HEPES培地中、37℃で2時間インキュベートした。次いで、細胞をPBSで洗浄し、0.1mM CaCl2および1mM MgCl2を添加したPBS(PBS−CM)中の4%パラホルムアルデヒドで、30分間室温で固定した。PBSプラス0.2%ゼラチン(300 Bloom, Sigma Aldrich, PBS-CM-G)で各回5分間、3回洗浄した後、細胞を0.2%TritonX−100で、10分間、室温で透過処理し、抗EGFRモノクローナル抗体(mAb)HB8506と12時間、4℃でインキュベートした。PBS−CM−Gで少なくとも6回洗浄した後、細胞を、Alexa488 に結合させた二次抗体抗マウスIgG(1/1000希釈)と、30分間、37℃でインキュベートした。記載された通りに(159)、油浸レンズPlan-Apochromat 63X/1.4 および Zeiss Axiocamカメラを備えた Zeiss Axiophot顕微鏡蛍光デジタル画像を得、画像化ソフトウエアAxioVision (Zeiss, Thorn-wood, NY) を動かしているコンピューターワークステーションで14ビットに変換した。

0079

リガンド結合アッセイおよびエンドサイトーシス速度定数
放射性リガンド125I−ヒトEGFを、クロラミンT法により、記載された(122,152,160)通りに調製し、比活性50000−70000cpm/ngを得た。記載された(122)通りに、20mMHEPESおよび0.2%ウシ血清アルブミン(BSA)を含むハンクス液中、1時間、4℃で、結合アッセイを実施した。4時間にわたり血清を除いたHeLa細胞を、30分間、指示された用量の様々な薬物で処理し、次いで、20ng/ml125I−EGFと、4℃で、結合培地(MEM−ハンクス、25mMHEPES、0.2%BSARIA等級)中、1時間撹拌しながら、インキュベートした。細胞を1N NaOHで2時間、室温で溶解させ、トリプリケートの各サンプルのカウント毎分ガンマカウンターで測定した。過剰(500倍)のコールドリガンドとのインキュベーションにより得られる非特異的結合ポイントを含めて測定し、その値を各サンプルから差し引いた。飽和条件での放射性リガンド結合は、細胞表面のEGFRの量の推定値を提供する。

0080

本発明の癌処置のための新規戦略の概要
上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)は、ErbB1−4またはHER1−4と呼ばれる4つのメンバーを含むチロシンキナーゼ受容体ファミリーErbB/HERに属する。EGFRは、いくつかの特異的リガンドにより活性化され、細胞の状況に応じて、各過程または細胞増殖、分化、生存、遊走およびアポトーシスを促進できる細胞内シグナルを広める。すべてのこれらの過程は、発癌の間に変化し、頻繁に、EGFR過剰発現または活動亢進性の突然変異により決定される、発癌性機能不全に関連する。腫瘍細胞は、正常細胞よりも高いEGFR阻害剤への感受性に反映される通り、そのような変化したEGFRから発せられる発癌性シグナルに文字通り中毒になる。同じことが、ヘテロ二量体の形成のために、EGFRの発癌作用に決定的でもある他のErbB/HERファミリーのメンバーにも確実である。従って、EGFRは、標的化および個人化された抗腫瘍療法の新しい薬物および戦略を開発するために、重要な標的である。処置は、感受性のバイオマーカーの腫瘍の分析により、個人化および最適化できる。今まで、戦略は、抗体によるリガンド結合または低分子による受容体チロシン−キナーゼ活性の阻害を試みて、薬物をEGFR分子自体に向けることに集中してきた。臨床使用されている薬物には、リガンド結合を妨害するヒト化モノクローナル抗体(例えばセツキシマブおよびパニツムマブ)、および、EGFRチロシンキナーゼの活性部位へのATP結合に競合し、その活性を阻害する薬物(ゲフィチニブおよびエルロチニブ)が含まれる。臨床データは、EGFRが抗腫瘍処置の標的化および個人化の良好な標的であるという概念を支持するが、これらの薬物の効力は限定されており、通常、感受性の患者の小さい下位群に限られる。加えて、キナーゼ阻害剤に一般的な問題は、処置への耐性を与える突然変異の比較的頻繁な出現である。現在使用されているものと異なり、それを補足する作用メカニズムの、新しい医薬を持つ必要がある。

0081

我々の発明は、EGFRの細胞内挙動の薬理学的撹乱のために低分子薬を使用する、革新的な戦略を提唱する。エンドサイトーシスによる内在化を介する細胞表面からのEGFR除去の誘導は、細胞外の活性化刺激へのその到達性を低下させ、一方で、活性化EGFRの細胞内輸送の変化は、そのシグナル拡散の細胞内局在を変化させる。両方の選択肢が、細胞表面での過剰なEGFRシグナル伝達活性を悪性度の基礎とする腫瘍細胞にとって有害であり得る。EGFRのエンドサイトーシスを誘導する低分子薬は、EGFRに依存する腫瘍悪性細胞の増殖および生存能を阻害できる。この戦略(図4に記載)は、新規かつ革新的である。これは、我々の研究室で得られた実験結果に基づくので、以前に使用されたことがない。我々は、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ(PAP)活性の阻害剤として使用されるプロプラノロール(LおよびDプロプラノロールのラセミ混合物)が、リガンドから独立して、EGFRのエンドサイトーシスおよび細胞内蓄積を誘導することを立証した(122)。我々は、また、この作用が、4型ホスホジエステラーゼを活性化するホスファチジン酸(PA)の増進を含むシグナル伝達経路に依存し、cAMPの減少および結果的なPKA活性の低下を導くことも示した。我々の以前の研究は、PKAの阻害が、リソソームへの分別を遅らせることにより、活性化EGFRの分解を遅らせることも示した。プロプラノロールは、その内容物のL−プロプラノロールエナンチオマーのためにベータ−ブロッカー活性を有するので、PAP阻害を誘起するのに必要とされる高い濃度では臨床使用できない。本発明では、我々は、EGFRのエンドサイトーシスはベータ−ブロッカー活性を欠くD−プロプラノロールによっても引き起こされ得ることを示した。うつ病を処置するために臨床使用される別の薬物であるデシプラミンは、副作用としてPAP阻害を有し、従って、本発明でD−プロプラノロールの効果を高めるために使用された。PAP阻害によるPA/PKAシグナル伝達経路の活性化後、EGFRは内在化し、かくして、外部の分裂促進的刺激に接近不可能になる。これらの観察は、過剰発現および活性化突然変異を含むEGFRの発癌性変化に依存する癌の大部分の悪性度に対抗する新しい医薬製剤を設計するために、このPA/PKAシグナル伝達経路を使用する可能性を開く。

0082

この戦略の実行可能性は、我々のさらなる結果により立証される。我々は、両方ともPAP阻害剤として使用されるD−プロプラノロール(事実上ベータ−ブロッカー活性を欠く)およびデシプラミンが、EGFRのエンドサイトーシスを誘導するのみならず、EGFR(患者由来の神経膠芽腫細胞GBM1)または発癌性変異体EGFRvIII(EGFRvIIIを形質移入されたU87細胞)を過剰発現する腫瘍の癌細胞の増殖を阻害し、生存能を低下させることを観察した。これらの薬物は、また、エルロチニブおよびゲフィチニブに対して耐性の、発癌性二重突然変異EGFRL858R/T790Mを発現する肺癌細胞に対しても有効である。これらの薬物に感受性である他の腫瘍細胞は、黒色腫および卵巣癌細胞であり、これらのすべては、EGFRまたは他のErbB/HERファミリーのメンバーの発癌的寄与に依存すると広範に記載されてきた。D−プロプラノロールとデシプラミンの組合せは、より有効な結果をもたらす。

0083

本発明は、EGFRの他の発癌性変異体またはErbB/HERファミリーの他のメンバー(例えばErbB2/Neu、ErbB3/HER3またはErbB4/HER4)を発現する癌に及ぶ。それは、また、既知の化合物(例えばスフィンゴシンおよびクロルプロマジン)でも、将来現れるかもしれない他の新化合物でも、PAPの阻害作用を有する他の化合物に拡張できる。本発明で提唱されるPAP阻害剤は、様々な癌の処置に使用できる。これは、肺、乳房、頭頸部および膵臓の癌など、抗ErbB/HER薬が臨床的処置に承認された癌を含む。それは、また、現在の抗ErbB/HER薬が無効であると示されたか、依然として研究中であるものであっても、EGFRまたはEGFRとヘテロ二量体を形成する他のErbB/HERファミリーのメンバーがそれらの悪性度に寄与すると報告された癌も含む。卵巣、胃および食道、肝臓、前立腺の癌、並びに黒色腫および神経膠芽腫は、このカテゴリーに含まれる。本発明により提唱される処置は、他の処置を補足できるか、または、化学療法またはEGFR阻害薬への耐性がすでに生じている場合、唯一無二のものであり得る。

0084

要旨
本発明は、癌処置において有用な医薬製剤のための、ホスファチジン酸ホスホヒドロラーゼ(PAP)の酵素活性を阻害する化合物およびそれらの組合せの使用に関する:PAPの阻害剤は、ここで、上皮細胞増殖因子受容体(EGFR)、その発癌性変異体およびそのErbBチロシンキナーゼ受容体ファミリーの他のメンバーに依存する癌の進行を、それらのエンドサイトーシスの誘導および細胞内輸送の撹乱を介して妨害するために使用され、かくして、それらが細胞外の刺激に接近できないようにし、癌の維持および進行を促進するシグナル伝達を変更する;本発明の一部であるPAP阻害剤は、L−プロプラノロールのベータ−ブロッカー活性を欠くD−プロプラノロールおよびデシプラミンであり、両方とも、以前に他の臨床目的で使用された;本発明は、すべての既知のPAP阻害剤および将来現れるかもしれないすべての新しいPAP阻害剤を包含する。

0085

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