図面 (/)

技術 抗CD277抗体およびその使用

出願人 アンスティチュナショナルドゥラサンテエドゥラルシェルシュメディカルユニヴェルシテ・ドゥ・ナントサントル・ナショナル・ドゥ・ラ・ルシェルシュ・シャンティフィクユニヴェルシテデクス−マルセイユアンスティテュ・ジャン・パオリ・エ・イレーヌ・カルメッテス
発明者 オリーヴ,ダニエルボンヌヴィル,マルクスコテット,エマニュエルアルリー,クリステルギローム,イヴ
出願日 2011年12月14日 (7年7ヶ月経過) 出願番号 2013-543767
公開日 2014年2月13日 (5年5ヶ月経過) 公開番号 2014-503522
状態 特許登録済
技術分野 ペプチド又は蛋白質 突然変異または遺伝子工学 微生物による化合物の製造 微生物、その培養処理 抗原、抗体含有医薬:生体内診断剤 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード エクスパンション 物理的性 節約法 正規化パラメータ 痕跡レベル Cr比 I領域 予備コーティング
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2014年2月13日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (13)

課題・解決手段

本発明は:Vγ9/Vδ2T細胞細胞溶解機能を活性化もしくは阻害し、かつ/またはCD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激し、かつ/またはCD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激し、かつ/または単球および樹状細胞の活性および/もしくは生存を増加させる、抗CD277抗体に関する。本発明は、また、治療における前記抗体の使用に関する。

概要

背景

概要

本発明は:Vγ9/Vδ2T細胞細胞溶解機能を活性化もしくは阻害し、かつ/またはCD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激し、かつ/またはCD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激し、かつ/または単球および樹状細胞の活性および/もしくは生存を増加させる、抗CD277抗体に関する。本発明は、また、治療における前記抗体の使用に関する。

目的

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

この技術が所属する分野

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ライセンス契約や譲渡などの可能性がある特許掲載中! 開放特許随時追加・更新中 詳しくはこちら

請求項1

−Vγ9/Vδ2T細胞細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化し、かつ/または−CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激し、かつ/または−CD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激し、かつ/または−単球および樹状細胞の活性および/または生存を増加させる、抗CD277抗体。

請求項2

−Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化し、かつ−CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激し、かつ−CD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激し、かつ−単球および樹状細胞の活性および/または生存を増加させる、抗CD277抗体。

請求項3

CNC寄託番号I−4401またはI−4402として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、抗CD277抗体。

請求項4

請求項3記載の抗CD277抗体のCDRを含む、抗CD277抗体。

請求項5

治療に使用するための、請求項1〜4のいずれか一項記載の抗CD277抗体。

請求項6

ガンまたは慢性感染の処置に使用するための、請求項5記載の抗CD277抗体。

請求項7

請求項1〜4のいずれか一項記載の抗CD277抗体を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン

請求項8

a)請求項1〜4のいずれか一項記載の抗CD277抗体;およびb)ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンを含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのキット

請求項9

CNCM I−4401、CNCM I−4402およびCNCM I−4403から成る群より選択されるハイブリドーマ細胞系

請求項10

Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する、抗CD277抗体。

請求項11

CNCM寄託番号I−4403として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、抗CD277抗体。

請求項12

請求項11記載の抗CD277抗体のCDRを含む、抗CD277抗体。

請求項13

治療に使用するための、請求項10〜12のいずれか一項記載の抗CD277抗体。

請求項14

自己免疫病移植拒絶反応または移植片対宿主病の処置に使用するための、請求項13記載の抗CD277抗体。

技術分野

0001

発明の分野
本発明は、抗CD277抗体およびその使用に関する。

0002

発明の背景
白血球は、病原体からの身体防御関与する免疫系細胞である。これらの細胞の中から、リンパ球単球、および樹状細胞を挙げることができる。単球は、血流から他の組織に移動して組織常在マクロファージまたは樹状細胞に分化することができる。樹状細胞は、リンパ球を活性化する抗原提示細胞APC)としての役割を果たす。リンパ球のうち、T細胞はγδT細胞およびαβT細胞に分類することができる。

0003

Vγ9/Vδ2T細胞は、免疫防御の重要なエフェクターである。それらは、病原体に感染した細胞または異常細胞を直接溶解する。加えて、それらは、樹状細胞(DC)の成熟誘導することにより免疫応答レギュレーションし、ならびにアイソタイプスイッチおよび免疫グロブリン産生をレギュレーションする。免疫系のこの重要な細胞プラットフォームは、表面レセプターケモカインおよびサイトカインにより厳密にレギュレーションされる。

0004

T細胞のプライミングは、専門化された細胞の関与および走化性サイトカインの分泌によりモデュレーションされる。今日では、T細胞活性化が二つの相乗的事象の結果であることが分かっている。第一の事象は、T細胞レセプター(TCR)と、プロセシングされた抗原に抗原提示細胞(APC)表面で結合した主要組織適合複合体MHC)との相互作用である。第二の事象は、B7分子を含む共刺激性抗原非依存的シグナルである。共刺激性シグナルの欠如は、アネルギーを、すなわちT細胞増殖サイトカイン分泌および細胞傷害活性阻害を誘導する。これらの経路の研究は、自己免疫障害またはリンパ増殖性障害などの病的事象のトリガーについて洞察を与えることができる。

0005

B7ファミリーは、共刺激分子広大一グループである(Coyle et al., 2001)。リガンドB7−1(CD80)およびB7−2(CD86)は、B7ファミリーに属し、それらのレセプターは、T細胞活性化を導くCD28(Linsley and Ledbetter, 1993, June, et al., 1994, Lenschow et al., 1996)およびCD28と競合して阻害シグナルを伝達するCTLA−4(CD152)である(Waterhouse et al., 1996)。T細胞活性化の負のレギュレーターとしてのCD152の重大な役割は、CTLA−4欠損マウスにリンパ増殖性障害が発生することによって実証されている(Waterhouse et al., 1995)。CD152により発揮される阻害機能に関する大部分のデータは、T細胞プライミング時のナイーブTリンパ球による増殖またはサイトカイン産生の研究から集められている(Linsley et al., 1992, Walunas et al., 1995, Walunas and Bluestone, 1998)。特にCD152は、Tリンパ球活性化後に発現され、PHA刺激またはAg選択後に得られたCTLクローン細胞溶解機能を阻害する(Saverino et al., 1998)。

0006

そのレセプターがPD−1(CD279)であるB7−H1(PD−L1、CD274)およびB7−DC(PD−L2、CD273)は、T細胞増殖およびサイトカイン分泌を阻害することが実証されている(Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001)。その他の場合、PD−L1およびPD−L2の結合(engagement)がT細胞増殖およびIL−10またはIFN−γの産生を増加させることが種々の研究から示された(Dong et al., 1999, Freeman et al., 2000, Latchman et al., 2001, Chapoval et al., 2001, Tseng et al., 2001)。T細胞表面上に発現される他のファミリーB7関連分子は、B7−H2(ICOS−L)、B7−H3、B7−H4であるが、それらの役割は完全には理解されていない(Hutloff et al., 1999, Sun et al., 2002)。

0007

Henryら(1999)は、ブチフィリンBT)をコードする領域がヒト第6染色体上のMHCクラスI領域由来テロメア位置に局在することを見出した。特に彼らは、Igスーパーファミリー(IgSF)に属する新規群の共刺激分子(BT2.1、BT2.2、BT2.3、BT3.1、BT3.2およびBT3.3)をコードする二つの遺伝子Bt2およびBt3について記載し(Williams and Barclay, 1988)、配列類似性解析によりB7ファミリーと関連づけた。特にそれは、CD80およびCD86のIg−V様細胞ドメイン類似性を示す(Linsley et al., 1992)。

0008

BT3ファミリーのメンバーは、異なる名称で文献に登場する:BT3.1は、BTF5(Rhodes et al., 2001)、またはBTN3A1(Ruddy et al., 1997)、またはもっと最近にはCD277(Bensussan and Olive, 2005)とも呼ばれ;BT3.2は、BTF4(Rhodes et al., 2001)、またはBTN3A2(Ruddy et al., 1997)とも呼ばれ;最後にBT3.3は、BTF3(Rhodes et al., 2001)またはBTN3A3(Ruddy et al., 1997)としても出現する。BT3は、IgSFの特徴となる2個のIg様細胞外ドメインを有する。

0009

b7遺伝子ならびにMHCクラスI遺伝子およびクラスII遺伝子は、共通の祖先遺伝子を有する可能性があり、T細胞活性化などの類似の機能に関与するタンパク質をコードしうると提案されている(Rhodes et al., 2001)。BT3分子は、T細胞、B細胞NK細胞、単球および樹状細胞などの免疫細胞、ならびに造血前駆細胞およびいくつかの腫瘍細胞系上から見出された(Compte et al., 2004)。他の共刺激分子に関して、それらの構造は、三つのドメイン、すなわちリガンドと結合するための細胞外ドメイン膜貫通ドメイン、および細胞内スーパーオキシド濃度のレギュレーションに関与すると推定されるB30.2という名称の細胞内ドメインによって特徴づけられる(Henry et al., 1998)。これまでのところ、CD277のリガンドはまだ分かっていない。

0010

今日まで、特にガン患者において、ワクチンに対して強力な免疫応答を誘導する、満足のいくアプローチは実証されていない。ガン患者において観察される、および慢性感染時に観察される、免疫抑制メカニズムを克服する方法をなお考案しなければならない。

0011

自己免疫病処置および移植片対宿主病(GVHD)での移植拒絶反応の予防は、免疫抑制剤に依存しているが、免疫抑制剤は重篤副作用を有するか、または必ずしも有効ではない。新規な免疫抑制剤が望まれている。

0012

発明の概要
本発明は、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化または阻害する抗CD277抗体に関する。本発明は、また、CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激し、かつ/またはCD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激する抗CD277抗体に関する。本発明は、また、単球および樹状細胞の活性および/または生存を増加させる抗CD277抗体に関する。

0013

好ましくは、本発明の抗体は:
− Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能を活性化し、かつ
− CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激し、かつ
− CD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激し、かつ
−単球および樹状細胞の活性および/または生存を増加させる
抗CD277抗体である。

0014

特に本発明は、CNC寄託番号I−4401、I−4402およびI−4403として利用可能なハイブリドーマの一つから入手可能な抗CD277抗体(mAb20.1、7.2および103.2から選択される)に関する。

0015

本発明は、また、mAb20.1のCDRを含む抗CD277抗体に関する。本発明は、また、mAb7.2のCDRを含む抗CD277抗体に関する。本発明は、また、mAb103.2のCDRを含む抗CD277抗体に関する。

0016

本発明は、また、治療に使用するための、mAb20.1、7.2および103.2の一つまたはその誘導体に関する。

0017

本発明は、ガンまたは慢性感染の処置に使用するための、mAb20.1および7.2の一つまたはその誘導体に関する。

0018

本発明は、mAb20.1および7.2の一つまたはその誘導体を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンに関する。本発明は:
a)mAb20.1もしくは7.2またはその誘導体;および
b)ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン
を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのキットに関する。

0019

本発明は、治療に使用するための上記と同義の抗CD277抗体に関する。

0020

本発明は、最終的に、特に自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病の処置に使用するための、Vγ9/Vδ2T細胞の機能を阻害する抗CD277抗体に関する。

0021

発明の詳細な説明
定義
本発明によると、「抗体」または「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用される。本明細書に使用するような「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の、すなわち抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子の、免疫学的活性部分を表す。このように、抗体という用語は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントまたは抗体誘導体包含する。抗体フラグメントには、非限定的にFv、Fab、F(ab’)2、Fab’、dsFv、scFv、Sc(Fv)2および二重特異性抗体が含まれる。

0022

天然抗体では、2本の重鎖ジスルフィド結合により相互に結合し、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に結合している。2種類の軽鎖、すなわちラムダ(λ)およびカッパκ)がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な5種類の重鎖クラス(またはアイソタイプ)、すなわちIgMIgDIgGIgAおよびIgEがある。各鎖は、別個の配列ドメインを含有する。

0023

軽鎖は、2個のドメイン、すなわち可変ドメイン(VL)および定常ドメイン(CL)を含む。重鎖は、4個のドメイン、すなわち1個の可変ドメイン(VH)および3個の定常ドメイン(CH1、CH2およびCH3、まとめてCHと呼ぶ)を含む。軽鎖および重鎖の可変領域(それぞれVLおよびVH)は、抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖および重鎖の定常領域ドメイン(それぞれCLおよびCH)は、抗体鎖の結合、分泌、経胎盤移動、補体結合およびFcレセプター(FcR)への結合などの重要な生物的性質を付与する。Fvフラグメントは、免疫グロブリンのFabフラグメントN末端部分であって、軽鎖1本および重鎖1本の可変部分から成る。抗体の特異性は、抗体側の結合部位抗原決定基の間の構造相補性にある。抗体側の結合部位は、主に超可変領域または相補性決定領域(CDR)由来の残基から構成される。場合によっては、非超可変領域またはフレームワーク領域(FR)由来の残基は、ドメイン構造全体に、したがって結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域またはCDRは、一緒になって、ネイティブな免疫グロブリン結合部位の天然Fv領域の結合親和性および特異性を定義するアミノ酸配列を表す。免疫グロブリンの各軽鎖および重鎖は、それぞれL−CDRl、L−CDR2、L−CDR3およびH−CDRl、H−CDR2、H−CDR3と呼ばれる3個のCDRを有する。したがって、抗原結合部位は、重鎖および軽鎖V領域のそれぞれからのCDRセットを含む6個のCDRを含む。フレームワーク領域(FR)は、CDRの間に挟まったアミノ酸配列を表す。

0024

キメラ抗体」という用語は、動物抗体、典型的にはマウス抗体の部分とヒト抗体の部分との遺伝子操作融合体を表す。一般にキメラ抗体は、約33%のマウスタンパク質および67%のヒトタンパク質を含有する。動物抗体により誘発されるヒト抗動物抗体応答を軽減するために開発されたので、キメラ抗体は、動物抗体の特異性と、ヒト抗体の効率的なヒト免疫系相互作用とを兼ね備える。

0025

本発明によると、「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体由来可変領域フレームワークおよび定常領域を有するが、動物抗体のCDRを保持する抗体を表す。

0026

「Fab」という用語は、分子量約50,000および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、プロテアーゼであるパパインでIgGを処理することにより得られるフラグメントの間でH鎖N末端側の約半分およびL鎖全体がジスルフィド結合により一緒に結合しているフラグメントを意味する。

0027

「F(ab’)2」という用語は、分子量約100,000および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、プロテアーゼであるペプシンでIgGを処理することにより得られる、Fabよりもやや大きなフラグメントの間でヒンジ領域のジスルフィド結合を介して結合している抗体フラグメントを表す。

0028

「Fab’」という用語は、分子量約50,000および抗原結合活性を有する抗体フラグメントであって、F(ab’)2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる抗体フラグメントを表す。

0029

単鎖Fv(「scFv」)ポリペプチドは、ペプチドをコードするリンカーによって連結されたVHコード遺伝子およびVLコード遺伝子を含む遺伝子融合体から通常発現される共有結合型VH::VLヘテロ二量体である。

0030

「dsFv」は、ジスルフィド結合により安定化されたVH::VLヘテロ二量体である。二価および多価抗体フラグメントは、一価scFvの結合によって自然に形成することができるか、または二価sc(Fv)2のように一価scFvをペプチドリンカーによりカップリングすることにより作製することができる。

0031

「二重特異性抗体」という用語は、2個の抗原結合部位を有する小型抗体フラグメントであって、重鎖可変ドメイン(VH)が軽鎖可変ドメイン(VL)と結合して同じポリペプチド鎖(VH−VL)になったものを表す。同じ鎖上の2個のドメインの間で対形成できるには短すぎるリンカーを使用することで、それらのドメインはもう1本の鎖の相補性ドメインと対形成せざるを得ず、2個の抗原結合部位が生まれる。

0032

ポリペプチド(すなわち本発明による抗体)またはヌクレオチド配列のことを言う場合、「精製」および「単離」は、表示された分子が、同種の他の生体高分子の実質的な不在下で存在することを意味する。

0033

本明細書に使用するような「精製」という用語は、好ましくは少なくとも75重量%、より好ましくは少なくとも85重量%、さらにより好ましくは少なくとも95重量%、最も好ましくは少なくとも98重量%の同じ種類の生体高分子が存在することを意味する。

0034

特定のポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子は、そのポリペプチドをコードしない他の核酸分子を実質的に有さない核酸分子を表すが;その分子は、組成物の基本的性質に有害に影響しないいくつかの追加的な塩基または部分を含みうる。

0035

本発明に関連して、本明細書に使用するような「処置する」または「処置」という用語は、そのような用語が適用される障害もしくは状態の、またはそのような障害もしくは状態の一つもしくは複数の症状の、進行を後退緩和、阻害すること、またはそれを予防することを意味する。

0036

「治療上有効な量」は、対象に治療効果を与えるために必要な最小量の活性薬剤のことである。例えば、哺乳類への「治療上有効な量」は、病状、疾患の進行、または障害に屈することに関連する生理的状態もしくはそれに対する抵抗性における向上を誘導、改善またはその他の点で引き起こす量である。

0037

本明細書に使用するような「予防」という用語は、疾患または状態を有するとまだ診断されたことのない対象においてその疾患または状態が起こることを予防することを表す。本明細書に使用するような「対象」という用語は、げっ歯類ネコイヌ、および霊長類などの哺乳類を意味する。好ましくは、本発明による対象はヒトである。

0038

本明細書に使用するような「ガン」、「過剰増殖」および「腫瘍性」という用語は、自律成長する能力、すなわち急速増殖している細胞成長によって特徴づけられる異常状態または異常状況の能力を有する細胞を表す。過剰増殖疾患状態および腫瘍性疾患状態は、病的として、すなわち疾患状態を特徴とするもしくは構成するとして、または非病的として、すなわち正常から逸脱しているが疾患状態に関連しないとして分類することができる。この用語には、侵襲病理組織学的タイプまたはステージとは無関係に、全ての種類のガン成長または発ガン過程転移組織または悪性トランスフォーメーションされた細胞、組織、もしくは器官が含まれることを表すつもりである。

0039

「ガン」または「新生物」という用語には、乳房甲状腺リンパ系消化管および泌尿生殖器などの様々な器官系悪性腫瘍、ならびに大部分の結腸ガン、腎細胞ガン前立腺ガンおよび/または精巣腫瘍非小細胞肺ガン小腸ガンおよび食道ガンなどの悪性腫瘍が含まれる腺癌が含まれる。

0040

本発明者らは、ブダペスト条約の条項に基づき、2010年11月24日にマウス抗CD277抗体(mAb20.1)産生ハイブリドーマをCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM、Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)に寄託した。

0041

寄託された、mAb20.1に関するハイブリドーマは、CNCM寄託番号I−4402を有する。

0042

「mAb20.1」は、CNCM寄託番号I−4402として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗CD277抗体を表す。「mAb20.1の誘導体」という表現は、mAb20.1の6個のCDRを含む抗CD277抗体を表す。

0043

本発明者らは、ブダペスト条約の条項に基づき、2010年11月24日にマウス抗CD277抗体(mAb7.2)産生ハイブリドーマをCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM、Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)に寄託した。

0044

寄託された、mAb7.2に関するハイブリドーマは、CNCM寄託番号I−4401を有する。

0045

「mAb7.2」は、CNCM寄託番号I−4401として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗CD277抗体を表す。「mAb7.2の誘導体」という表現は、mAb7.2の6個のCDRを含む抗CD277抗体を表す。

0046

本発明者らは、ブダペスト条約の条項に基づき、2010年11月24日にマウス抗CD277抗体(mAb103.2)産生ハイブリドーマをCollection Nationale de Cultures de Microorganismes(CNCM、Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, France)に寄託した。

0047

寄託された、mAb103.2に関するハイブリドーマは、CNCM寄託番号I−4403を有する。

0048

「mAb103.2」は、CNCM寄託番号I−4403として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗CD277抗体を表す。「mAb103.2の誘導体」という表現は、mAb103.2の6個のCDRを含む抗CD277抗体を表す。

0049

本発明の抗体およびそれをコードする核酸
本発明は、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化する、単離された抗CD277抗体に関する。

0050

Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能を活性化することは、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞傷害性の顕著な増加、すなわちVγ9/Vδ2T細胞によるターゲット細胞特異的溶解の顕著な増加が観察されることを意味する。

0051

Vγ9/Vδ2T細胞によるサイトカイン産生を増加させることは、対照のVγ9/Vδ2T細胞(すなわち無刺激および無処理)に比べてVγ9/Vδ2T細胞によるサイトカイン産生の有意な増加が観察されることを意味する。

0052

Vγ9/Vδ2T細胞の増殖を増加させることは、対照のVγ9/Vδ2T細胞(すなわち無刺激および無処理)に比べてVγ9/Vδ2T細胞の増殖の有意な増加が観察されることを意味する。

0053

典型的には、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能の活性化は、実施例3に記載された方法(すなわち「直接細胞傷害性アッセイによるVγ9Vδ2T細胞応答分析」および例えば結果「CD277はVγ9Vδ2T細胞により仲介される抗腫瘍細胞溶解作用強化する」)により測定することができる。Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化する、単離された抗CD277抗体の例は、mAb20.1もしくはmAb7.2、またはその誘導体である。

0054

本発明は、また、CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激する抗CD277抗体に関する。CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激することは、CD3とTCRとの結合後反応カスケードが活性化されることを意味する。典型的には、CD3−TCRと一緒のT細胞の共刺激は、実施例2に記載された方法(特に、「CD277はCD3シグナルを共刺激する」)により測定することができる。CD3−TCRと一緒にT細胞を共刺激する単離された抗CD277抗体の例は、mAb20.1もしくはmAb7.2、またはその誘導体である。

0055

本発明は、また、CD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激する抗CD277抗体に関する。CD28−B7と一緒になってT細胞を共刺激することは、CD28とB7との結合後に反応カスケードが活性化することを意味する。典型的には、CD28−B7と一緒になったT細胞の共刺激は、実施例2に記載された方法(特に、「CD277はCD3シグナルを共刺激する」)により測定することができる。CD28−B7と一緒になってT細胞を共刺激する、単離された抗CD277抗体の例は、mAb20.1もしくは7.2、またはその誘導体である。

0056

本発明は、また、単球および樹状細胞の活性および/または生存を増加させる抗CD277抗体に関する。単球および樹状細胞の活性を増加させることは、前記抗CD277抗体が単球および樹状細胞の表面上での共刺激分子(CD86m、CD80およびHLA−DRなど)の発現を増加させ、これらの細胞においてTLRリガンドにより誘導される炎症促進応答を増加させることを意味する。典型的には、単球および樹状細胞の活性および/または生存の増加は、実施例1に記載された方法(特に「アポトーシスの検出」および「サイトカイン産生」)により測定することができる。単球および樹状細胞の活性および/または生存を増大させる単離された抗CD277抗体の例は、mAb20.1またはその誘導体である。

0057

本発明は、また、CNCM寄託番号I−4402として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗CD277抗体(mAb20.1)に関する。

0058

本発明は、CNCM寄託番号I−4402として利用可能なハイブリドーマに関する。

0059

本発明は、mAb20.1の6個のCDRを含む抗体に関する。

0060

別の態様では、本発明は、mAb20.1のVL鎖およびVH鎖を含むmAb20.1誘導体に関する。

0061

別の態様では、本発明は、mAb20.1の可変ドメインを含むキメラ抗体であるmAb20.1誘導体に関する。

0062

本発明は、また、CNCM寄託番号I−4401として利用可能なハイブリドーマから入手可能な、単離された抗CD277抗体(mAb7.2)に関する。

0063

本発明は、CNCM寄託番号I−4401として利用可能なハイブリドーマに関する。

0064

本発明は、mAb7.2の6個のCDRを含む抗体に関する。

0065

別の態様では、本発明は、mAb7.2のVL鎖およびVH鎖を含むmAb7.2誘導体に関する。

0066

別の態様では、本発明は、mAb7.2の可変ドメインを含むキメラ抗体であるmAb7.2誘導体に関する。

0067

本発明は、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する、単離された抗CD277抗体に関する。

0068

Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能を阻害することは、対照Vγ9/Vδ2T細胞(すなわち無刺激および無処理)に比べてVγ9/Vδ2T細胞の細胞傷害作用の有意な減少、すなわちVγ9/Vδ2T細胞によるターゲット細胞の特異的溶解の有意な減少が観察されることを意味する。

0069

Vγ9/Vδ2T細胞によるサイトカイン産生を阻害することは、対照Vγ9/Vδ2T細胞(すなわち無刺激および無処理)に比べて、Vγ9/Vδ2T細胞によるサイトカイン産生の有意な減少が観察されることを意味する。

0070

Vγ9/Vδ2T細胞の増殖を阻害することは、対照Vγ9/Vδ2T細胞(すなわち無刺激および無処理)に比べて、Vγ9/Vδ2T細胞による増殖の有意な減少が観察されることを意味する。

0071

典型的には、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能の阻害は、実施例3に記載された方法(すなわち「直接細胞傷害性アッセイによるVγ9Vδ2T細胞応答の分析」)により測定することができる。Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する、単離された抗CD277抗体の一例は、mAb103.2またはその誘導体である。

0072

本発明は、また、CNCM寄託番号I−4403として利用可能なハイブリドーマから入手可能な単離された抗CD277抗体(mAb103.2)に関する。

0073

本発明は、CNCM寄託番号I−4403として利用可能なハイブリドーマに関する。

0074

本発明は、mAb103.2の6個のCDRを含む抗体に関する。

0075

別の態様では、本発明は、mAb103.2のVL鎖およびVH鎖を含むmAb103.2誘導体に関する。

0076

別の態様では、本発明は、mAb103.2の可変ドメインを含むキメラ抗体であるmAb103.2誘導体に関する。

0077

一態様では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。

0078

一態様では、本発明の抗体はキメラ抗体である。

0079

一態様では、本発明の抗体はヒト化抗体である。

0080

本発明のさらなる一態様は、本発明の抗体をコードする核酸配列に関する。

0081

特定の一態様では、本発明は、本発明の抗体のVHドメインまたはVLドメインをコードする核酸配列に関する。典型的には、前記核酸はDNAまたはRNA分子であり、それをプラスミドコスミドエピソーム人工染色体ファージまたはウイルスベクターなどの任意の適切なベクター中に組込むことができる。

0082

「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」という用語は、ホストをトランスフォーメーションして導入配列の発現(例えば転写および翻訳)を促進するように、DNAまたはRNA配列(例えば外来遺伝子)をホスト細胞に導入することができる媒体を意味する。したがって、本発明のさらなる目的は本発明の核酸を含むベクターに関する。

0083

そのようなベクターは、対象に投与したときに前記抗体の発現を引き起こすまたは指令するために、プロモーターエンハンサーターミネーターなどの調節エレメントを含みうる。動物細胞用の発現ベクターに使用されるプロモーターおよびエンハンサーの例には、SV40初期プロモーターおよびエンハンサー、モロニーマウス白血病ウイルスLTRプロモーターおよびエンハンサー、免疫グロブリンH鎖のプロモーターおよびエンハンサーなどが挙げられる。

0084

ヒト抗体C領域をコードする遺伝子を挿入および発現できる限りは、動物細胞用の任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例には、pAGE107、pAGE103、pHSG274、pKCR、pSGlβd2−4−などが挙げられる。

0085

プラスミドの他の例には、複製起点を含む複製型プラスミド、または例えばpUC、pcDNA、pBRなどの組込み型プラスミドが挙げられる。ウイルスベクターの他の例には、アデノウイルスベクターレトロウイルスベクターヘルペスウイルスベクターおよびAAVベクターが挙げられる。そのようなリコンビナントウイルスは、パッケージング細胞トランスフェクションすることにより、またはヘルパープラスミドもしくはウイルス一過性トランスフェクションすることなどにより、当技術分野において公知の技法により、生成させることができる。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例には、PA317細胞、PsiCRIP細胞、GPenv+細胞、293細胞などが挙げられる。そのような複製欠損リコンビナントウイルスを生成させるための詳細なプロトコールは、例えば国際公開公報第95/14785号、国際公開公報第96/22378号、米国特許第5,882,877号、米国特許第6,013,516号、米国特許第4,861,719号、米国特許第5,278,056号および国際公開公報第94/19478号から見出すことができる。

0086

本発明のさらなる目的は、本発明による核酸および/またはベクターによりトランスフェクション、感染またはトランスフォーメーションされた細胞に関する。「トランスフォーメーション」という用語は、ホスト細胞が導入遺伝子または導入配列を発現して所望の物質、典型的には導入遺伝子または導入配列によりコードされるタンパク質または酵素を産生させるように、「外来」(すなわち外因性または細胞外)遺伝子、DNAまたはRNA配列をホスト細胞に導入することを意味する。導入されたDNAまたはRNAを受入れて発現するホスト細胞は、「トランスフォーメーション」されている。本発明の核酸は、適切な発現系で本発明の抗体を産生させるために使用することができる。「発現系」という用語は、例えばベクターによって担持され、ホスト細胞に導入された外来DNAによりコードされるタンパク質を発現させるための、適切な条件下のホスト細胞および適合性ベクターを意味する。

0087

一般的な発現系には、E. coliホスト細胞とプラスミドベクター昆虫ホスト細胞とバキュロウイルスベクター、および哺乳類ホスト細胞とベクターが挙げられる。ホスト細胞の他の例には、非限定的に、原核細胞(細菌など)および真核細胞(酵母細胞哺乳類細胞昆虫細胞植物細胞など)が挙げられる。具体例には、E. coli、KluyveromycesまたはSaccharomyces酵母、哺乳類細胞系(例えばVero細胞CHO細胞、3T3細胞、COS細胞など)および哺乳類細胞の初代培養物または樹立培養物(例えばリンパ芽球線維芽細胞胚性細胞上皮細胞神経細胞脂肪細胞などから生成したもの)が挙げられる。例には、また、マウスSP2/0−Agl4細胞(ATCCCRL1581)、マウスP3X63−Ag8.653細胞(ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子(本明細書下記においうて「DHFR遺伝子」と呼ぶ)が欠損しているCHO細胞、ラットYB2/3HL.P2.G11.16Ag.2O細胞(ATCC CRL1662、本明細書下記において「YB2/0細胞」と呼ぶ)などが挙げられる。

0088

本発明は、また、本発明による抗体を発現しているリコンビナントホスト細胞を生成させる方法であって:
(i)上記リコンビナント核酸またはベクターをコンピテントホスト細胞にin vitroまたはex vivo導入するステップ
(ii)得られたリコンビナントホスト細胞をin vitroまたはex vivoで培養するステップ、ならびに
(iii)場合により、前記抗体を発現および/または分泌する細胞を選択するステップ
を含む方法に関する。そのようなリコンビナントホスト細胞は、本発明の抗体を製造するために使用することができる。

0089

本発明の抗体の製造方法
本発明の抗体は、非限定的に、任意の化学的、生物学的、遺伝学的または酵素的技法などの当技術分野で公知の任意の技法を単独または組合せたものにより製造することができる。

0090

所望の配列のアミノ酸配列が分かっている場合、当業者は、ポリペプチド製造のための標準技法により前記抗体を容易に製造することができる。例えば、周知の固相法を用いて、好ましくは市販のペプチド合成装置(Applied Biosystems, FosterCity, California製など)を使用して製造業者説明書に従い、抗体を合成することができる。または、本発明の抗体は、当技術分野で周知のリコンビナントDNA技法により合成することができる。例えば、抗体をコードするDNA配列を発現ベクターに組入れ、そのようなベクターを適切な真核または原核ホストに導入した後に(そのホストは所望の抗体を発現する)、DNA発現産物として抗体を得ることができ、その後その産物から周知の技法を用いて抗体を単離することができる。

0091

特に本発明は、さらに、本発明の抗体を製造する方法であって:
(i)本発明によるトランスフォーメーションされたホスト細胞を、前記抗体を発現させるために適した条件で培養すること;および
(ii)発現された抗体を回収すること
から成るステップを含む方法に関する。

0092

別の特定の態様では、その方法は:
(i)抗体を発現させるために適した条件でCNCM I−4401、CNCM I−4402またはCNCM I−4403として寄託されたハイブリドーマを培養するステップ;および
(ii)発現された抗体を回収するステップ
を含む。

0093

本発明の抗体は、例えばプロテインAセファロースヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーゲル電気泳動透析またはアフィニティークロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順により培養液から適切に分離される。

0094

特定の一態様では、本発明のヒトキメラ抗体は、前記VLおよびVHドメインをコードする核酸配列を得ること、ヒト抗体CHおよびヒト抗体CLをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターにそれを挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築すること、ならびに動物細胞にその発現ベクターを導入することによりコード配列を発現させることによって製造することができる。ヒトキメラ抗体のCHドメインは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域であってよいが、IgGクラスの領域が適切であり、CHドメインとしてIgGl、IgG2、IgG3およびIgG4などの、IgGクラスに属するサブクラスの任意の一つも用いることができる。また、ヒトキメラ抗体のCLは、Igに属する任意の領域であってよく、CLとしてκクラスまたはλクラスの領域を用いることができる。従来のリコンビナントDNA技法および遺伝子トランスフェクション技法を伴う、キメラ抗体を製造するための方法は、当技術分野において周知である(特許文書である米国特許第5,202,238号;および米国特許第5,204,244号を参照されたい)。

0095

本発明のヒト化抗体は、前記CDRドメインをコードする核酸配列を得ること、(i)ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域および(ii)ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクターにその核酸配列を挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築すること、ならびにその発現ベクターを動物細胞に導入することにより遺伝子を発現させることによって製造することができる。

0096

ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子および抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクター上に存在するタイプ、または両方の遺伝子が同じベクター上に存在するタイプ(タンデムタイプ)のいずれかでありうる。ヒト化抗体発現ベクターを構築する容易さ、動物細胞に導入する容易さ、および動物細胞における抗体H鎖とL鎖の発現レベルの間のバランスに関して、タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデムタイプのヒト化抗体発現ベクターの例には、pKANTEX93(国際公開公報第97/10354号)、pEE18などが挙げられる。

0097

従来のリコンビナントDNA技法および遺伝子トランスフェクション技法に基づきヒト化抗体を製造するための方法は、当技術分野において周知である。抗体は、当技術分野で公知の多様な技法、例えば、CDRグラフティング(EP239,400;PCT公報である国際公開公報第91/09967号;米国特許第5,225,539号;第5,530,101号;および第5,585,089号)、ベニヤリング(veneering)またはリサーフシング(resurfacing)(EP592,106;EP519,596)、および鎖シャフリング(chain shuffling)(米国特許第5,565,332号)などを用いてヒト化することができる。そのような抗体を調製するための一般的なリコンビナントDNA技法も公知である(欧州特許出願EP125023および国際特許出願である国際公開公報第96/02576号を参照されたい)。

0098

本発明のFabは、CD277と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるパパインで処理することにより得ることができる。またFabは、抗体のFabをコードするDNAを、原核発現系用または真核発現系用のベクターに挿入すること、およびそのベクターを原核生物または真核生物(必要に応じて)に導入してFabを発現させることによって製造することができる。

0099

本発明のF(ab’)2は、CD277と特異的に反応する抗体をプロテアーゼであるペプシンで処理することにより得ることができる。またF(ab’)2は、下記Fab’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合を介して結合させることにより製造することができる。

0100

本発明のFab’は、ヒトCD277と特異的に反応するF(ab’)2を、還元剤であるジチオトレイトールで処理することにより得ることができる。またFab’は、抗体のFab’フラグメントをコードするDNAを原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターに挿入すること、およびそのベクターを原核生物または真核生物(必要に応じて)に導入してその発現を行うことにより製造することができる。

0101

本発明のscFvは、前記VHドメインおよびVLドメインをコードするcDNAを得ること、scFvをコードするDNAを構築すること、原核生物用発現ベクターまたは真核生物用発現ベクターにDNAを挿入すること、および次にその発現ベクターを原核生物または真核生物(必要に応じて)に導入してscFvを発現させることにより製造することができる。ヒト化scFvフラグメントを作製するために、CDRグラフティングと呼ばれる周知の技法を使用することができ、その技法は、ドナーscFvフラグメントから相補性決定領域(CDR)を選択すること、およびそれらを公知の三次元構造のヒトscFvフラグメントフレームワークにグラフトすることを伴う(例えば国際公開公報第98/45322号;国際公開公報第87/02671号;米国特許第5,859,205号;米国特許第5,585,089号;米国特許第4,816,567号;EP0173494を参照されたい)。

0102

本明細書に記載された抗体のアミノ酸配列の改変(一つまたは複数)が考慮されている。例えば、抗体の結合親和性および/または他の生物学的性質を改善することが望しい場合がある。非ヒト動物由来の抗体のVHおよびVL中のCDRを、ヒト抗体のVHおよびVLのFRに単にグラフトすることだけによりヒト化抗体を製造する場合、非ヒト動物由来の本来の抗体に比べて抗原結合活性が低下することが知られている。非ヒト抗体のVHおよびVLのCDR中だけでなくFR中のいくつかのアミノ酸残基も、抗原結合活性と直接的または間接的に関連していると見なされている。したがって、これらのアミノ酸残基を、ヒト抗体のVHおよびVLのFR由来の異なるアミノ酸残基に置換すると、結合活性が低下するであろう。

0103

この問題を解決するために、ヒトCDRをグラフトされた抗体において、ヒト抗体のVHおよびVLのFRのアミノ酸の配列の中で、抗体に対する結合に直接関連するアミノ酸残基、またはCDRのアミノ酸残基と相互作用するアミノ酸残基、または抗体の三次元構造を維持するアミノ酸残基、および抗原への結合に直接関連するアミノ酸残基を同定することを試みなければならない。低下した抗原結合活性は、同定されたアミノ酸を非ヒト動物由来の本来の抗体のアミノ酸残基と置換することにより増加させることができよう。

0104

本発明の抗体の構造およびそれをコードするDNA配列に改変および変更を加え、それでも所望の特徴を有する抗体をコードする機能的分子を得ることができる。アミノ配列に変更を加える場合、アミノ酸の疎水性指標(hydropathic index)を考慮することができる。タンパク質に相互作用的生物学的機能を付与することに果たす疎水性アミノ酸指標重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対疎水性が、結果として生じたタンパク質の二次構造に寄与し、それが今度はそのタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、レセプター、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。

0105

各アミノ酸には、それらの疎水性および電荷特性に基づき疎水性指標が割当てられており、これらは:イソロイシン(+4.5);バリン(+4.2);ロイシン(+3.8);フェニルアラニン(+2.8);システインシスチン(+2.5);メチオニン(+1.9);アラニン(+1.8);グリシン(−0.4);トレオニン(−0.7);セリン(−0.8);トリプトファン(−0.9);チロシン(−1.3);プロリン(−1.6);ヒスチジン(−3.2);グルタミン酸(−3.5);グルタミン(−3.5);アスパラギン酸(−3.5);アスパラギン(−3.5);リシン(−3.9);およびアルギニン(−4.5)である。

0106

本発明のさらなる一態様は、また、本発明の抗体の機能保存性変異体を考えている。

0107

「機能保存性変異体」は、非限定的に類似の性質(例えば極性水素結合ポテンシャル酸性塩基性、疎水性、芳香族アミノ酸など)を有するアミノ酸へのアミノ酸の交換などのように、ポリペプチドの全体的なコンフォメーションおよび機能を変えずにタンパク質または酵素中の所与のアミノ酸残基が変更された変異体である。

0108

保存されていると示されたアミノ酸以外のアミノ酸は、タンパク質中で異なる場合が有り、その結果、機能が類似する任意の2種のタンパク質間タンパク質類似率またはアミノ酸配列類似率が変動する場合があり、例えば、類似性がMEGALIGNアルゴリズムに基づくとき、クラスター法などのアライメントスキームにより決定された類似率は、70%〜99%でありうる。

0109

「機能保存性変異体」には、また、BLASTまたはFASTAアルゴリズムにより決定したとき少なくとも60%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、なお好ましくは少なくとも90%、そしていっそうより好ましくは少なくとも95%のアミノ酸同一性を有するポリペプチドであって、それが比較されるネイティブなタンパク質または親タンパク質と同じまたは実質的に類似の性質または機能を有するポリペプチドが挙げられる。短い方の配列の全長に関してアミノ酸の80%超、好ましくは85%超、好ましくは90%超が同一であるか、または約90%超、好ましくは95%超が類似(機能的に同一)の場合に、2種のアミノ酸配列は「実質的に相同」または「実質的に類似」である。好ましくは、類似の配列または相同配列は、例えばGCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin)パイルアッププログラム、またはBLAST、FASTAなどの任意の配列比較アルゴリズムを用いたアライメントにより同定される。

0110

例えば、ある種のアミノ酸は、活性の認識可能な損失なしにタンパク質構造中の他のアミノ酸により置換することができる。タンパク質の相互作用能および性質がタンパク質の生物学的機能活性を規定するので、ある種のアミノ酸置換タンパク質配列中に、およびもちろんそのDNA性コード配列中に加えることができ、それでもなお類似の性質を有するタンパク質を得ることができる。したがって、本発明の抗体の生物学的活性の認識可能な損失なしに、本発明の抗体配列、または前記抗体をコードする対応するDNA配列に様々な変更を加えられることが考慮されている。

0111

ある種のアミノ酸を、類似の疎水性指標またはスコアを有する他のアミノ酸により置換することができ、なお類似の生物学的活性を有するタンパク質が生じること、すなわち生物機能的に等価のタンパク質が得られることが当技術分野において知られている。したがって上に概要したように、アミノ酸置換は、一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づく。

0112

いくつかの前記性質を考慮する例示的な置換が当業者に周知であり、それらには:アルギニンとリシン;グルタミン酸とアスパラギン酸;セリンとトレオニン;グルタミンとアスパラギン;ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが挙げられる。本発明の抗体の別のタイプのアミノ酸改変は、抗体の本来のグリコシル化パターンを変えるために有用でありうる。

0113

「変える」は、抗体中に見出される一つもしくは複数の糖質部分欠失させること、および/またはその抗体に存在しない一つもしくは複数のグリコシル化部位を付加することを意味する。

0114

抗体のグリコシル化は、典型的にはN結合型である。「N結合型」は、アスパラギン残基の側鎖に糖質部分を結合させることを表す。トリペプチド配列であるアスパラギン−X−セリンおよびアスパラギン−X−トレオニン(Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である)は、アスパラギン側鎖に糖質部分を酵素的に結合させるための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在することで、潜在的グリコシル化部位創出する。グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列が上記トリペプチドの一つまたは複数を含有するようにそのアミノ酸配列を変えることにより、好都合に達成される(N結合型グリコシル化部位について)。別のタイプの共有結合性改変は、抗体にグリコシドを化学的または酵素的にカップリングさせることを伴う。これらの手順は、NまたはO結合型グリコシル化についてのグリコシル化能を有するホスト細胞で抗体を産生させる必要がない点で有利である。使用するカップリング様式に応じて、糖(一つまたは複数)は、(a)アルギニンおよびヒスチジン、(b)遊離カルボキシル基、(c)システインなどの遊離スルフヒドリル基、(d)セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシル基、(e)フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンなどの芳香族残基、または(f)グルタミンのアミド基に結合させることができる。例えば、そのような方法は、国際公開公報第87/05330号に記載されている。

0115

抗体に存在する任意の糖質部分の除去は、化学的または酵素的に実施することができる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸、または等価の化合物に抗体を曝露する必要がある。この処理の結果、連結性の糖(linking sugar)(N−アセチルグルコサミンまたはN−アセチルガラクトサミン)以外の大部分または全ての糖が切断されるが、抗体はインタクトなまま残る。

0116

抗体の糖質部分の酵素的切断は、多様なエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼの使用により達成することができる。

0117

抗体の別のタイプの共有結合性改変は、抗体を、多様な非タンパク質性ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコールポリプロピレングリコール、またはポリオキシアルキレンと、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号または第4,179,337号に示される方法で連結することを含む。例えば抗体の抗原依存性細胞性細胞障害作用(ADCC)および/または補体依存性細胞傷害作用(CDC)を高めるように、本発明の抗体をエフェクター機能に関して改変することも望ましい場合がある。これは、抗体のFc領域に一つまたは複数のアミノ酸置換を導入することにより達成することができる。またはもしくは追加的に、Fc領域にシステイン残基(一つまたは複数)を導入することによりこの領域中に鎖間ジスルフィド結合を形成させてもよい。このように作製されたホモ二量体性抗体は、改善されたインターナリゼーション能および/または増加した補体介在性細胞殺滅作用および/または抗体依存性細胞性細胞傷害作用(ADCC)を有しうる(Caron PC. et al. J Exp Med. 1992 Oct 1;176(4):1191-5およびShopes B. J Immunol. 1992 May l;148(9):2918-22)。

0118

本発明の抗体の治療用途
本発明者らは、mAb20.1および7.2のようないくつかの抗体がVγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を活性化することにより、ガン患者においておよび慢性感染時に観察される免疫抑制メカニズムを克服するために使用することができることを実証した。いくつかの抗体は、CD3−TCRと一緒になってT細胞を共刺激するか、またはCD28−B7共刺激に加えてT細胞を共刺激し;前記抗体は、同じ治療応用に使用することができる。いくつかの抗体は、単球および樹状細胞の生存を増加させ;前記抗体は、同じ治療応用に使用することができる。

0119

本発明は、治療に使用するためのmAb20.1もしくは7.2またはその誘導体に関する。本発明は、ガンまたは慢性感染の処置に使用するためのmAb20.1もしくは7.2、またはその誘導体に関する。

0120

本発明は、また、ガンまたは慢性感染を処置するための方法であって、それを必要とする対象に治療上有効な量のmAb20.1もしくは7.2またはその誘導体を投与するステップを含む方法に関する。

0121

ガンの例には、非限定的に、B細胞リンパ系新生物、T細胞リンパ系新生物、非ホジキンリンパ腫(NHL)、B−NHL、T−NHL、慢性リンパ性白血病(CLL)、小リンパ球リンパ腫(SLL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、NK細胞リンパ系新生物および骨髄性細胞系新生物などの血液系腫瘍が挙げられる。

0122

血液系ガンの例には、非限定的に、結腸ガン、乳ガン、肺ガン、脳ガン、前立腺ガン、頭頸部ガン、ガン、膀胱ガン結腸直腸ガン骨ガン子宮頸ガン、肝ガン、口腔ガン、食道ガン、甲状腺ガン、腎ガン胃ガン精巣ガンおよび皮膚ガンが挙げられる。

0123

慢性感染の例には、非限定的に、慢性肝炎肺感染下気道感染、気管支炎インフルエンザ肺炎および性行為感染症などのウイルス、細菌、寄生虫または真菌感染が挙げられる。

0124

ウイルス感染の例には、非限定的に、肝炎HAVHBV、HCV)、単純ヘルペス(HSV)、帯状疱疹、HPV、インフルエンザ(Flu)、AIDSおよびAIDS関連症候群水痘(varicella)、普通感冒サイトメガロウイルス(CMV)感染、天然痘(variola)、コロラドダニ熱デング熱エボラ出血熱口蹄疫ラッサ熱麻疹マールブルグ出血熱伝染性単核球症ムンプスノロウイルス灰白髄炎進行性多巣性白質脳症(PML)、狂犬病風疹SARS、ウイルス性脳炎ウイルス性胃腸炎、ウイルス性髄膜炎ウイルス性肺炎ウエストナイル病および黄熱が挙げられる。

0127

mAb20.1もしくは7.2、またはその誘導体は、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンアジュバントとして使用することができる。

0128

本発明は、mAb20.1もしくは7.2、またはその誘導体を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンに関する。

0129

本発明は、
a)mAb20.1もしくは7.2またはその誘導体;および
b)ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチン
を含む、ガンまたは慢性感染を処置するためのキットに関する。

0130

キットの2要素は、同時にまたは時間を連続して投与してもよい。

0131

ガンまたは慢性感染を処置するためのワクチンの例には、非限定的に、HIVおよびHBVなどのウイルス、細菌、寄生虫または真菌感染に対するワクチン、ならびにウイルス関連ガン(例えばHPVもしくはHBV)に対するワクチン、または例えば黒色腫白血病、乳ガン、肺ガン患者を処置するために使用される抗ガンワクチンが挙げられる。

0132

さらに、本発明者らは、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗CD277抗体を作製した。これらの抗CD277抗体は、免疫抑制剤として使用することができる。

0133

さらなる一態様では、本発明は、治療に使用するための、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗CD277抗体に関する。特に本発明は、自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病を処置するための、抗CD277抗体、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖に関する。

0134

本発明は、また、自己免疫病、移植拒絶反応または移植片対宿主病を処置するための方法であって、それを必要とする対象に、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する治療上有効な量の抗CD277抗体を投与するステップを含む方法に関する。

0135

典型的には、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗CD277抗体は、mAb103.2またはその誘導体でありうる。

0137

典型的には、Vγ9/Vδ2T細胞の細胞溶解機能、サイトカイン産生および増殖を阻害する抗CD277抗体は、非限定的に、プレドニゾンアザチオプリンシクロスポリンメトトレキサート、およびシクロホスファミドなどの他の免疫抑制剤および化学療法剤と組合せて使用することができる。

0138

本発明は、また、本発明の抗体を含む薬学的組成物に関する。

0139

したがって、本発明の抗体を、薬学的に許容されうる添加剤、および場合により生分解性ポリマーなどの徐放性マトリックスと組合せて治療用組成物を形成させることができる。

0140

「薬学的な」または「薬学的に許容されうる」は、必要に応じて哺乳類に、特にヒトに投与した場合に、有害反応アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を表す。薬学的に許容されうる担体または添加剤は、無毒固体半固体または液体フィラー希釈剤封入物質または任意の種類の製剤佐剤を表す。

0141

薬学的組成物の剤形投与経路投薬量および投与方式は、もちろん処置される状態、病気重症度患者年齢、体重、および性別などに依存する。

0142

本発明の薬学的組成物は、局所、経口、非経口鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下または眼内投与などのために製剤化することができる。

0143

好ましくは、薬学的組成物は、注射可能な製剤にとって薬学的に許容されうるビヒクルを含有する。これらは、特に、等張無菌塩類溶液リン酸一ナトリウムもしくはリン酸二ナトリウム塩化ナトリウム塩化カリウム塩化カルシウムもしくは塩化ナトリウムなど、またはそのような塩の混合物)、または場合により無菌水または生理塩類溶液を添加すると注射液の構成が可能になる、乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物でありうる。

0144

投与のために使用される用量は、様々なパラメーター関数として、特に、用いられる投与方式の、関連病態の、またはその代わりに所望の処置期間の関数として、適合させることができる。薬学的組成物を調製するために、有効量の抗体を薬学的に許容されうる担体または水性媒質中に溶解または分散させてもよい。注射用途に適した薬学的剤形には、無菌水剤または無菌水性分散剤ゴマ油ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤;および無菌注射液または無菌注射用分散剤の即時調製用の無菌散剤が挙げられる。全ての場合で、剤形は無菌でなければならず、容易に注射器で取扱い可能な(syringability)ように液体でなければならない。その剤形は、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物汚染作用から保護されなければならない。

0145

遊離塩基または薬理学的に許容されうる塩としての活性化合物溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水に入れて調製することができる。分散液剤は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびその混合物に入れて、ならびに油に入れて調製することができる。通常の保存および使用条件下で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するための保存料を含有する。

0146

本発明の抗体は、中性形態または塩形態で製剤化して組成物にすることができる。薬学的に許容されうる塩には、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される)および例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸シュウ酸酒石酸マンデル酸などの有機酸と共に形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基と共に形成される塩は、また、例えば水酸化ナトリウム水酸化カリウム水酸化アンモニウム水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミントリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基から得ることができる。

0147

担体は、また、例えば、水、エタノールポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒であってもよい。

0148

妥当流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散剤の場合、必要な粒子径の維持により、および界面活性剤の使用により維持することができる。

0149

微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベンクロロブタノールフェノールソルビン酸チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合、等張化剤(isotonic agent)、例えば糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。

0150

注射用組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物に入れて使用することによりもたらすことができる。

0151

無菌注射用溶液は、適切な溶媒中に上に挙げた様々な他の成分と共に必要量の活性化合物を組入れ、続いて濾過滅菌することにより調製される。

0152

一般に分散剤は、塩基性分散媒および上に挙げた成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに様々な無菌活性成分を混込むことにより調製される。無菌注射液調製用の無菌散剤の場合、好ましい調製方法は、活性成分に加えて任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め無菌濾過されたその溶液からもたらす減圧乾燥技法および凍結乾燥技法である。

0153

溶媒としてのDMSOの使用が極めて迅速な透過を招き、小さな腫瘍領域高濃度の活性薬剤を送達する、より大きく濃縮または高濃縮された直接注射液を調製することも考慮されている。

0154

液剤は、製剤化されるとその投薬剤形に適合するように治療上有効な量で投与される。それらの製剤は、上記種類の注射液などの多様な剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。

0155

水溶液非経口投与するために、例えば、その液剤は必要に応じて適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤を最初に十分な塩類溶液またはグルコースで等張にすべきである。

0156

これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適している。これに関連して、採用できる無菌水性媒質は、本開示に照らして当業者に公知であろう。例えば、1回量を等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに加えるか、または提案された注入部位に注射することができよう(例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, p.1035-1038およびp.1570-1580参照)。処置される対象の状態に応じて、投薬量のいくらかの変更が必然的に起こる。いずれにせよ投与の責任者が、個別の対象に適した用量を決定する。

0157

本発明の抗体は、1回あたり約0.0001〜1.0ミリグラム、または約0.001〜0.1ミリグラム、または約0.1〜1.0もしくは約10ミリグラム程度を含むように治療用混合物内に製剤化することができる。複数回投与することもできる。静脈内注射または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された化合物に加えて、他の薬学的に許容されうる剤形には、例えば経口投与用錠剤または他の固形剤徐放カプセル(time release capsule);および現在使用されている任意の他の剤形が挙げられる。

0158

ある態様では、ホスト細胞に抗体を導入するために、リポソームおよび/またはナノパーティクルの使用が考えられている。リポソームおよび/またはナノパーティクルの形成および使用は、当業者に公知である。

0159

ナノカプセル剤は、一般に、安定で再現可能な方法で化合物を捕捉することができる。細胞内のポリマー過負荷による副作用を回避するために、そのような超微細粒子(粒子径約0.1μm)は、一般に、in vivoで分解可能なポリマーを使用して設計される。これらの要件合致する生分解性ポリアルキルシアノアクリレート性ナノパーティクルが、本発明での使用のために考えられており、そのような粒子は容易に製造することができる。

0160

水性媒質中に分散され、多重膜同心性二重層小胞多重膜小胞(MLV)とも呼ばれる)を自然に形成するリン脂質から、リポソームは形成される。MLVは、一般に直径25nm〜4μmを有する。MLVの超音波処理の結果、コアに水溶液を含有する直径200〜500Aの範囲の小型単膜小胞(SUV)が形成する。リポソームの物理的性質は、pH、イオン強度および二価陽イオンの存在に依存する。

0161

さらに、本発明を以下の図面および実施例の点から例示する。

図面の簡単な説明

0162

BT3レセプターが単球およびiDC表面上に構成的に発現されることを示す図である。新たに単離された単球およびiDC上での発現を、どちらにもクローン20.1抗BT3mAbを用いて示す。示した実験は、被験ドナー5人を代表するものである(5回の実験の間での蛍光変化の強度は<2%であった)。
BT3の結合は、単球およびiDCについて生存シグナルを与えることを示す図である。新鮮単離された単球(上の列)およびiDC(下の列)を、表示のようにプラスチックにコーティングされたmAb(抗CD19および抗BT3)または20ng/mlGMCSFで刺激した。72時間刺激後に、細胞を採集し、アポトーシス細胞マーカーとしてのアネキシンVの結合について分析した。隅の数字は、アネキシンV陽性細胞パーセンテージに対応する。示したデータは、5回の独立した実験を代表するものである。
BT3の結合は、単球表面上での共刺激分子の発現を増加させることを示す図である。
BT3の結合は、iDC表面上での共刺激分子の発現を増加させることを示す図である。
CD277活性化CD4+T細胞に関するAKTリン酸化およびERKリン酸化のレギュレーションを示す図である。健康なドナー4人からの解凍BMCから精製されたCD4+T細胞を、抗体をコーティングされたエポキシdynabeads(1μg/ml抗CD3および多様な濃度の抗CD277.20.1クローンまたはIgG1(アイソタイプ対照))で刺激する、または刺激しない。2、5、10および30分毎に、CD4+T細胞に関するAKTおよびB、ERKの細胞内リン酸化をフローサイトメトリーにより測定する。データは、4回の独立した試験を代表するものである。結果は、2〜30分間処理後の異なる時点でのCD4+T細胞上のMFI(平均蛍光強度発現)として表す。
CD277がCD4+T細胞の共刺激分子であることを示す図である。健康なドナー4人からのPBMCからCD4+T細胞を精製した。精製されたCD4+T細胞を、抗体をコーティングされたエポキシDynabeads(1μg/ml抗CD3および2μg/ml抗CD28ならびに多様な濃度の抗CD277(20.1)またはIgG1(アイソタイプ対照))で刺激した。培養2日目に上清収集し、ELISAによるサイトカインアッセイ、すなわちINFγ、IL−2およびIL−10産生アッセイに供した。
リンパ節におけるCD277の発現を示す図である。リンパ器官でのCD277およびPD1の発現プロファイルリンパ系組織からの生きたT細胞を、抗CD14(CD14陰性細胞)で鮮明に染色することにより識別する。濾胞性ヘルパーT細胞を、mAb CD4、mAb ICOSおよびmAb CXCR5で染色することを用いて、さらにゲートを通す。結果をMFI(平均蛍光強度)により表現する。データは、7回の独立した研究を代表するものである。T細胞サブセット上でのCD277またはPD1の発現の間の差を比較するために、対応のあるMann-Witney検定を用いてp値を計算した。*p<0.05;**0.001<p<0.01;***p<0.001。p>0.05は示さない。
抗CD277mAb20.1がVγ9Vδ2T細胞のエクスパンションを刺激することを示す図である。A:ex vivoエクスパンション(15日+IL−2):PBMCを20.1mAbおよびIL−2で刺激し、Vγ9Vδ2T細胞特異的mAbで染色することによりVγ9Vδ2T細胞をモニターした。
抗CD277mAb20.1がVγ9Vδ2T細胞のエクスパンションを刺激することを示す図である。B:CFSEアッセイ(4日+IL−2):PBMCを20.1mAbおよびIL−2で刺激し、Vγ9Vδ2T細胞の増殖をCFSE分析でモニターした。
Vγ9Vδ2細胞特異的mAbで染色することにより、Vγ9Vδ2T細胞をレギュレーションする活性化CD277mAb(20.1)および阻害性(103.2)CD277mAbをモニターした図である。A:アンタゴニストCD77mAb103.2は、Vγ9Vδ2のホスホ抗原介在性活性化を阻害する。
Vγ9Vδ2細胞特異的mAbで染色することにより、Vγ9Vδ2T細胞をレギュレーションする活性化CD277mAb(20.1)および阻害性(103.2)CD277mAbをモニターした図である。B:アンタゴニストCD77mAb103.2は、Vγ9Vδ2のCD3介在性活性化を阻害しない。
Vγ9Vδ2細胞特異的mAbで染色することにより、Vγ9Vδ2T細胞をレギュレーションする活性化CD277mAb(20.1)および阻害性(103.2)CD277mAbをモニターした図である。C:CD69の発現により判定されるように、103.2BTN3 mAbは、Jurkat TCR Vγ9/Vδ2T細胞のホスホ抗原誘導性活性化を阻害する。
CD277が、Vγ9Vδ2T細胞により仲介される抗腫瘍細胞溶解作用を強化することを示す図である。腫瘍細胞系を20.1アゴニストmAb存在下または不在下でVγ9Vδ2と共にインキュベーションした。Vγ9Vδ2の活性化をCD107a/b脱顆粒により評価した。

0163

実施例1
材料および方法
細胞培養
血液試料を、職員の中から登録された5人の健康志願者からインフォームドコンセント後に得た。単球を末梢血単核球から分離し、MACS CD14単離キット(Miltenyi Biotech, Auburn, CA USA)を使用して単離した。単球を200ng/mlリコンビナントヒトGM−CSFおよび10ng/mlリコンビナントヒトIL−4(Schering-Plough Research Institute)と共に5日間培養した。これらの細胞を未熟樹状細胞(iDC)と名付けた。刺激を達成するために、単球およびiDをTLR4リガンドである10ng/mlLPS、TLR7/8リガンドである30μg/ml R848(Sigma-Aldrich, Milano, Italy)、およびTLR3リガンドである2.5mg/mlポリ(I:C)(Sigma-Aldrich)と共に培養し、48時間後に採集した。10%熱不活化FCS、5mM L−グルタミンおよび50IU/mlペニシリンストレプトマイシンを補充されたRPMI1640(以降は完全培地と呼ぶ)中で細胞を培養した。

0164

フローサイトメトリーおよび抗体
刺激前後の単球およびiDCを免疫蛍光フローサイトメトリー(FACScalibur Becton Dickinson, Milano, Italy)により分析して、その活性化状態を検証した。このために、CD80、CD86、HLA−DR、CD1a、CD14(BD Becton Dickinson)、BT3に特異的なmAb(クローン20.1、IgG1)およびBT3Fab2を予め選択し、精製し、特徴づけ(Bensussan and Olive, 2005, Compte et al., 2004)、または無関係の分子(抗CD19(Becton Dickinson)およびF. Malavasiによって提供された抗CD31、クローンMoon−1(両方ともIgG1))を使用した。全ての利用可能な抗BT3 mAbは、おそらくその高い配列相同性が原因で、このファミリーの3メンバー(BT3.1、BT3.2、またはBT3.3)を識別することができない(Compte et al., 2004, BensussanおよびOlive, 2005)。痕跡量エンドトキシンが作用する可能性を遮断するために、細胞を添加する前にさらなる対照としてポリミキシンB(10μg/ml、Sigma-Aldrich)を抗BT3 mAb20.1に添加した。

0165

ウエスタンブロット分析用ローディング対照として、抗チューブリンmAb(クローン:6−11B−1、IgG1(Invitrogen, Milano, Italy))を使用した。

0166

アポトーシスの検出
単球およびiDCを、抗BT3 mAb(クローン20.1)またはアイソタイプがマッチする無関係のmAbをコーティングされたプラスチック上で培養した。対照として、20ng/mlリコンビナントヒトGM−CSF(Schering-Plough Research Institute)で細胞を刺激した。3日後に、細胞を採集し、アネキシンV−FITC(Bender MedSystems, Wien, Austria)で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。

0167

定量RTPCR
Taqman検出を用いたApplied Biosystems 7900HTFast Real-time PCRシステムでqRT−PCR分析を行った。簡潔には、標準TRIzol試薬プロトコール(Invitrogen Life Technologies)を使用して、THP−1細胞から総RNAを単離した。得られたRNA 2μgを、オリゴ(dT)を用いて逆転写した。各PCRアッセイを、2×TaqManユニバーサルミックス(Applied Biosystems)試薬、20×プライマーおよび2μlcDNA(総RNA40ngに相当)を含有する反応液25μl中で行った。熱サイクル条件は、95℃を15秒、および60℃を60秒であった(40サイクル)。蛍光の捕捉をABIPrism 7900HTスキャナーで記録し、Ct(閾値サイクル)を各アッセイについて計算した(Sequence Detection System Software 2.3, Applied Biosystems)。内部対照としてGAPDHを使用してデータを基準化する(ΔCt=Ct(ターゲット遺伝子)−Ct(GAPDH))。より高いΔCtは、被分析遺伝子のより低い発現に対応する。BT3.1、BT3.2、BT3.3およびGAPDH TaqMan Gene Expressionアッセイは、Applied Biosystemsから購入した。

0168

統計解析
Studentのt検定を用いてGraphPad Prism4ソフトウェア4.0(GraphPad Software Inc., CA, USA)により統計解析を行った。サイトカイン産生を評価するために、一元配置分散分析ANOVA)でデータを解析した。アポトーシス誘導を評価するために、ノンパラメトリック検定でデータを解析した。有意水準をP<0.05に設定した。

0169

結果
BT3レセプターは単球およびiDCの表面上に構成性発現される。
BT3の発現を検討するために、本発明者らは、健康なドナーのパネルを選択して単球およびiDCを得る。新鮮単離された単球およびiDC上のBT3発現を、クローン20.1抗BT3 mAbを用いて評価した(図1A)。図1Aに、新鮮単離された単球およびiDC上のBT3発現を、クローン20.1抗BT3mAbを用いて示す。単球からDCへの分化は、細胞表面マーカーの発現により検証した。未熟および成熟DCの両方でCD14はダウンレギュレーションされ、低いままであり、一方でCD1aおよびHLA−DRはアップレギュレーションされた(データは示さず)。示した実験は、異なるドナーに関する5回を代表するものである。BT3の発現レベルは、単球の方がわずかに高かった。加えて本発明者らは、それぞれTLR4、TLR3およびTLR7/8のリガンドであるLPS、ポリ(I:C)およびR848でこれらの細胞を刺激した後のBT3の発現を分析した。TLR(Toll様レセプター)を介した活性化は、BT3の表面発現を有意には変えなかった(データは示さず)。本発明者らは、BT3レセプターが単球およびiDCの活性化状態に依存せずにそれらの細胞の表面に構成性発現されると導き出すことができる。

0170

最終的に、qRT−PCR分析から、BT3ファミリーの三つのレセプター全てがTHP−1細胞により発現されることを示す免疫表現型の結果を確認した。詳細には、本発明者らは、最も代表的なBT3としてBT3.2を見出した(BT3.1およびBT3.3の10倍のBT3.2)(データは示さず)。

0171

BT3の結合は培養された単球およびiDCに対する生存シグナルを与える。
BT3は安定発現されるレセプターファミリーであるので、本発明者らは、BT3の結合が、生存因子(すなわち血清を有する完全培地)の不在下で72時間培養されたex vivo単球およびiDCの寿命を改変する能力について検討した。mAbでコーティングされたプラスチックによる細胞刺激を用いて、単球およびiDCの表面のBT3を結合させた。BT3特異的mAbで処理された単球の約77.98%が内因性生存因子の不在下で3日間生存した(51.13〜77.98%の範囲、p=0.0040)(図1B上列に、5回からの代表となる一実験を示す)。この作用は、GM−CSF処理により得られた効果よりもやや低かった(81.22%、60.41〜83%の範囲、p=0.0278)。対照培養では、すなわちプラスチックにコーティングされた無関係のmAb(抗CD19mAb)の存在下で、生存効果は最小限であり、非常に高い比率のアポトーシス単球(アネキシンV陽性細胞)が観察された(培地単独中に約95.48%、無関係のmAbがコーティングされたプラスチック条件で約88.79%のアポトーシス細胞が測定され、生存範囲は、それぞれ0.8〜11.74%および1.08〜11.21%であった。pは特定せず(N.S.))。iDCの生存に対する作用を分析することにより類似の結果を得た(図1B下列に、5回からの代表となる一実験を示す)。BT3によるiDCの活性化は、72時間の培養時間中にiDCのアポトーシスを部分的に阻害することができた(健康な生きた細胞56.75%に対して生存GM−CSF処理では85.97%、それぞれ範囲53.13〜60.71%、p=0.00044、および71.01〜85.97%、p=0.0040)。無関係な、アイソタイプがマッチしたmAbは、DCの自然アポトーシスを変化させなかった(5回からの代表となる一実験の培地単独と抗CD19mAb条件を比較すると、生存細胞の範囲はそれぞれ0.8〜24.12%および0.9〜26.97%、p=0.3452)。全体として、これらの結果から、BT3レセプターが、アポトーシスを軽減することにより単球およびiDCの生存を促進することができ、細胞応答の持続時間を延長することができることが示唆される。両方の細胞タイプについて、抗BT3mAb後と、アイソタイプがマッチする対照mAb後の生存の差は、統計的に有意であった(GM−CSF処理と同様)。加えて、単球およびiDCの両方の生存に対する抗BT3 mAbの用量反応作用が明らかである(データは示さず)。良好な生存能を促進できる最低濃度の抗BT mAb希釈は10μg/mlであった。

0172

BT3の結合は、単球およびiDCの表面上の共刺激分子発現を増加させる。
一次炎症応答に果たすBT3の役割を検討するために、新鮮単離された血液単球および単球由来樹状細胞を、組織培養プレート上にコーティングされたmAbにより、または単球および樹状細胞を刺激することが知られているTLRリガンド(LPS)により刺激した。24時間刺激後に、細胞表面共刺激分子CD86のアップレギュレーションにより示されるように、コーティングされた抗BT3mAbは、単球の活性化をトリガーすることができた(図1C)。アイソタイプがマッチする対照mAb(その抗原はこれらの細胞上には発現されない)は、有意な作用を有さなかった。したがって、抗BT3.1mAbを使用して観察された活性化は特異的であり、FcRの結合が原因ではなかった。未コーティングの(可溶性)抗BT3mAbでは作用が観察されなかったので、細胞活性化にクロスリンクが必要であった(データは示さず)。加えて、抗BT3mAbの活性化作用が、ポリミキシンB存在下で保たれたことから、痕跡レベルのエンドトキシンの役割は除外された。

0173

興味深いことに、BT3刺激時のCD86のアップレギュレーションは、TLRリガンドであるLPSを用いて観察されたものに類似していた。BT3の刺激は、単球表面でのCD80およびHLA−DR分子のアップレギュレーションもトリガーした(図1C)。これに一致して、本発明者らはiDC上でのCD80、CD86およびHLA−DRの発現増加を見出した(図1D)。加えて、抗BT3FabmAbを用いて類似の結果が得られた(それぞれ単球およびDCに関する図1Cおよび1Dから示すことができる)。これらの結果から、本発明者らは、FcRを介したシグナルが細胞活性化の原因となり得ないということを除外することができる。無関係のmAb(抗CD19)は陰性対照であり、一方でTLR4リガンドであるLPSを介した刺激は陽性対照であった。

0174

実施例2
材料および方法
細胞の調製
末梢血単核球(PBMC)を、「Etablissement Francais du Sang」(EFS-Marseille-France)により提供された健康志願者ドナーから得て、Lymphoprep(著作権)(Abcys)の密度勾配による分画により単離した。Miltenyi Biotec(登録商標)製のT細胞単離キットIIを使用して磁気ビーズで非CD4+T細胞を枯渇させることにより、単離されたPBMCからヒトCD4+T細胞を負選択した。純度が90%を上回った場合、単離されたCD4細胞をさらなる実験に使用した。

0175

モノクローナル抗体(mAb)の作製
マウス抗ヒトPD−1(programmed death-1)mAbおよびマウス抗ヒトCD277の三つの異なるクローンを本発明者らの研究室腹水から精製した:抗PD−1(IgG1アイソタイプのクローンPD1 3.1)(ghiotto et al. Int Immunol., 2010)、抗CD277(IgG2aアイソタイプのクローン103.2、共にIgG1アイソタイプのクローン20.1および7.2)(compte et al.)。市販のキット(Invitrogen, Eugene, OR)を使用して、抗CD277(クローン20.1)mAbをAlexa Fluor 647でラベル化した。

0176

T細胞亜集団上のCD277の発現プロファイル
4人の健康なドナーからの解凍ヒトPBMCを細胞百万個につき以下のマウス抗ヒトモノクローナル抗体5μlで染色した:ECD結合型抗CD3、PC5結合型抗CD14、PC5結合型CD19(CD3+CD14−CD19−細胞を選択するため)(全てBeckman Coulter, Marseilles, France製)、パシフィックブルー結合型抗CD4、Alexa700結合型抗CD8(全てBD Pharmingen(San Diego, USA)製)、APC−Alexa750結合型抗CD27(Caltag, Invitrogen, USA製)、PC7結合型抗CD45RA(BD Biosciences製)、Alexa647結合型抗CD277(クローン20.1、自家製)。APC結合型IgG1(Beckman Coulter)を対照として使用し、LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kitを生存率のために使用した。細胞を4℃で20分間インキュベーションし、次にリン酸緩衝塩類液PBS、Lonza)中で2回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、FACSAriaフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。FlowJoソフトウェア(TreeStar, Ashland, OR)を用いてデータを解析した。

0177

ナイーブCD4+T細胞上でのCD277の発現プロファイルの動態
予めマウス抗ヒトCD3/CD28がプレート固定化されているか、または固定化されていない(未刺激)平底96ウェルプレート(Microtest(商標)96, Becton Dickinson)に入れたRPMI1640 10%FBS中で、解凍ヒトPBMCから精製したCD4+T細胞(細胞200×103個/ウェル)を96時間培養した。抗CD3(クローンOKT3)および抗CD28(クローンCD28.2、自家製)をそれぞれ0.3μg/mlおよび10μg/mlで使用した。細胞を加湿インキュベーター内で37℃にて5%CO2雰囲気中に置いた。24時間毎に細胞を円錐底96ウェルプレート(Nunc(商標), Denmark)に移し、以下のmAb、すなわち精製抗PD−1(クローンPD−1 3.1、自家製)(giotto et al, int immunol. 2010)3μlを用いて4℃で30分間染色した。PBS−0.2%FBS−0.02%アジド中で3回洗浄し、次にPE結合ヤギ抗マウス(1/80、Beckman Coulter)で染色し、洗浄し、以下のmAb、すなわちPC7結合型抗CD4、FITC結合型抗CD3(全てBD Biosciences製)、Alexa647結合型抗CD277各3μlおよび7−AAD(BD Biosciences)6μlで4℃にて30分間染色した。精製IgG1またはAPC結合型IgG1を対照として使用した。免疫染色された細胞試料を2%パラホルムアルデヒドで固定したものをBDFACSCanto(BD Bioscience)で分析した。FlowJoソフトウェア(TreeStar, Ashland, OR)を使用してデータを解析した。

0178

リンパ節でのCD277発現
インフォームドコンセントを行った7人の患者から、リンパ節から掻き裂いた細胞を収集した。RPMI1640 10%FBS中で新鮮組織試料を押しつぶすことにより単核球を得た。濾胞性ヘルパーT細胞(TFH)の検出は、PE結合型抗ICOS、ビオチン化抗CXCR5(全てBD Biosciences製)、PC5結合型抗CD14、パシフィックブルー結合型抗CD4(全てBeckman Coulter製)およびLIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit(著作権)と共に4℃で20分間インキュベーションすることにより行った。次に、細胞をPBS中で洗浄し、抗ビオチンアロフィコシアニン−Alexa Fluor750(Invitrogen, Carlsbad, CA)と共に4℃で20分間インキュベーションした。染色後、各細胞調製物をPBS中で2回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、FACSAriaフローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。FlowJoソフトウェア(TreeStar, Ashland, OR)を使用してデータを解析した。

0179

NK細胞上のCD277の発現プロファイル
健康なヒトPBMCから解凍生存NK細胞(Live dead(著作権)陰性細胞)を、抗CD277−Alexa647(クローン20.1)と共に4℃で20分間インキュベーション後に、CD56+CD3−の発現に基づき選択した。さらに、細胞をPBS(PBS、Lonza)中で2回洗浄し、次に2%ホルムアルデヒドで固定し、FACSAria(著作権)フローサイトメーター(BD Biosciences)で分析した。FlowJoソフトウェア(TreeStar, Ashland)を使用してデータを解析した。

0180

プレートに固定化されたmAbを用いたCD4+T細胞に関する機能アッセイ
解凍されたヒトPBMCから精製されたCD4+T細胞(細胞200×103個/ウェル)を、予めプレートに固定化されたマウス抗ヒトCD3(クローンKT3)/CD28(クローンCD28.2)または抗CD3/抗CD277(クローン20.1)または抗CD3/アイソタイプ対照(IgG1)と共に、平底96ウェルプレート(Microtest(商標)96, BD)に入れたRPMI1640 10%FBS中で培養した。精製された抗CD3を0.3μg/mlで使用した。抗CD28、抗CD277およびアイソタイプ対照を10μg/mlで使用した。細胞を加湿インキュベーター内で37℃にて5%CO2雰囲気中に置いた。2日間培養後に、サイトカイン産生(インターロイキン−2、IL−2およびインターフェロンγ、IFN−γ)を、製造業者のプロトコールに従いELISAアッセイ(OptEIA、ヒトIFN−γまたはIL−2セット、BD Pharmingen)により測定した。5日後に、PE結合型抗CD25(BD Biosciences)3μl、および7−AAD 5μlを用いて細胞を4℃で30分間染色し、次にPBS中で2回洗浄し、2%パラホルムアルデヒドで固定し、BDFACSCanto(BD Bioscience)で分析した。FlowJoソフトウェア(TreeStar, Ashland, OR)を使用してデータを解析した。

0181

aAPCおよびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルジエステル(CFSE)ラベル化を用いたCD4+T細胞に関する機能アッセイ
ヒトCD4+T細胞を、磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)を使用してPBMCからの負選択により、製造業者のプロトコールに従って精製した。CD4+T細胞は日常的に97%を超える純度であった。

0182

CD4+T細胞を0.5μM CFSE(Invitrogen)で37℃にて10分間ラベル化し、洗浄し、磁気ビーズから成るaAPCで、1:1(細胞対ビーズ)の比で、96ウェル丸底プレート(Falcon;BD Biosciences)中で三つ組にして刺激した(細胞1.5×105個/ウェル)。培養物を37℃、5%CO2で5日間インキュベーションし、次にCFSEラベル化CD4+T細胞の増殖をフローサイトメトリー(FACSCanto, Beckman Coulter)により測定した。

0183

NK細胞の細胞溶解活性に関する機能アッセイ
新鮮なNKをEasy Sep(登録商標)負選択キット分取し、最適以下の濃度のIL−2(100U/ml)およびIL−15(10ng/ml)を加えて完全培地中で一晩インキュベーションした。NK細胞レセプターの機能を、FcγR陽性P815肥満細胞腫マウス細胞系での再方向付け(re-directed)細胞溶解実験で試験した。簡潔には、関心が持たれるmAb(無関係なマウスIgG1:11μg/ml、抗NKp46:1μg/ml、抗DNAM:5μg/ml、抗CD277 20.1:10μg/ml)を30分間予備コーティングされたP815細胞と共にエフェクター細胞を1:1のエフェクター:ターゲット(E/T)比でインキュベーションした。細胞毒性試験は、GolgiStop(登録商標)および可溶性CD107(aおよびb)−FITC(両方ともBD Biosciences製)の存在下の4時間アッセイで行った。その後、細胞を表面マーカー(CD56−PeCy7(Beckman Coulter, Immunotech))について染色し、固定し、透過性にし(Cytofix/Cytoperm(登録商標))、次に細胞内mAb(IFN−γ(Beckman Coulter, Immunotech))で染色した。細胞を最終的にPBS−2%パラホルムアルデヒド中に再懸濁し、BDFACSCanto(登録商標)(BD Biosciences, San Jose, CA)で即座に分析した。NK細胞の活性化度は、CD107aおよびCD107bについて陽性の細胞(脱顆粒)のパーセンテージならびに/または炎症性サイトカイン(IFN−γ)の産生に基づき測定した。

0184

人工APC(aAPC)
Serriariら(serriari, ji 2010)に記載されたように、以下のmAbを磁気ビーズ(DynabeadsM-450 Epoxy, Dynal Biotech)にコーティングした:抗CD3(OKT3)、抗ヒトCD28(CD28.2)、および/または多様な濃度の抗ヒトCD277(CD277、20.1)もしくはIgG1もしくは抗MHCクラスI(MHCI)(YJ4)もしくはIgG1。これらのaAPCに、最適以下の抗CD3Ab(5%)、最適以下のレベルの抗CD28Ab(10%)と、ビーズに添加されたタンパク質の残りの85%を構成するIgG1Ab(CD3/CD28/IgG1)、抗CD277Ab(CD3/CD28/CD277+IgG1)または抗MHCクラスI(CD3/28/抗MHCクラスI+IgG1)のいずれかとをコーティングした。対照IgG1の添加によりタンパク質の量を20mg/mlに一定に保った。

0185

サイトカイン分析用のELISA
サイトカインの産生を判定するために、無細胞上清を48時間目に収集し、OptEIAキット(BD Pharmingen)を製造業者の説明書に従って使用するELISAによりIL−2、IL−10およびIFN−γについてアッセイした。

0186

免疫組織化学
CD277の免疫染色は、前記のように反応性リンパ節の全凍結切片に関して行った(25)。CD277.20.1mAbについての最終希釈は1/800であった。陰性対照試料は、一次mAbを取り除くことにより調製した。

0187

健康対象からのPBMCにおける異なるbnt3aアイソフォーム転写物スクリーニング
精製されたCD8細胞、CD4細胞、γδ細胞およびNK細胞の公的および私的Affymetrix U133+2データセットを収集した。CD8およびCD4のデータを公的GEOデータセットから検索し(Sharp et al.)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)、NKおよびγδセットは私的であった。本発明者らは、正規化パラメーターとしてノンパラメトリックオンタイルアルゴリズムを備えるRobust Multichip Average(RMA)を使用した。様々なシリーズから収集した生データにRMAを適用した。Bioconductorおよび関連パッケージを使用して、クオンタイル正規化およびLoess補正をRで行った。三つのアイソフォームのBTN3Aに対応するプローブセット正規化データセットから検索し、対応する対数値グラフ表示用に線形化した。本発明者らは、BTN3A1、BTN3A2およびBTN3A3アイソフォームに対応するそれぞれのAffymetrixプローブセット201623_s_at、213282_at、204171_atを使用した。

0188

刺激、ホスホフロー(phosphoflow)およびFACS染色
ヒトCD4+T細胞を、磁気ビーズ(Miltenyi Biotec)を製造業者のプロトコールに従って使用してPBMCからの負選択により精製した。CD4 T細胞は日常的に97%を超える純度であった。細胞をRPMI1640 10%FBS中で37℃にて24時間インキュベーションした。

0189

CD4+T細胞を洗浄し、以下のmAbで、すなわち抗CD3(OKT3)、抗ヒトCD28(CD28.2)、および/または様々な濃度の抗ヒトCD277(CD277.20.1クローン)またはアイソタイプ対照IgG1でコーティングされた磁気ビーズ(DynabeadsM-450 Epoxy, Dynal Biotech)から構成されるaAPCで、それらの細胞を異なる時点(2、5、10および30分)に1:3(細胞対ビーズ)の比で刺激した。これらのaAPCには、最適以下の抗CD3Ab(5%)、最適以下のレベルの抗CD28Ab(10%)と、ビーズに加えられたタンパク質の残りの85%を構成するIgG1Ab(CD3/CD28/IgG1)、抗CD277.20.1Ab(CD3/CD28/CD277.20.1+IgG1)のいずれかとがコーティングされていた。タンパク質の量は、対照IgG1の添加により20mg/mlに一定に保った。

0190

本発明者らは、状態特異的抗体を使用し、蛍光活性セルソーティング(FACS)により標的リン酸化タンパク質を検出する。ホスホフロープロテオミック法[27]によるCD4+T細胞におけるAKTおよびERKリン酸化に対するmAb CD27クローンの関与の効果を試験した。本発明者らは、細胞をビーズの刺激に曝露した後にシグナル伝達経路の活性を評定した。本発明者らは、ビオチン結合型二次抗体の適用に続いて蛍光結合型ストレプトアビジンを用いた検出を伴うサンドイッチラベル化法を適用する。本発明者らは、異なる用量のCD277mAbを有するビーズを用いて異なる4時点(2、5、10および30分)に刺激後に、SER473でのAKTおよびp44/42MAPKのT(202/y204)でのERKのリン酸化を測定することにより、PI3K経路の活性を実証した。細胞を透過性にし、固定し、ターゲットリンタンパク質(AKTおよびERK)の細胞内染色後に、cytofix/cytopermキットおよびperm/wash緩衝液(BD Biosciences)を使用して分析した。

0191

FACSのデータは、Divaソフトウェアを用いてFACSCantoフローサイトメーター(BD Biosciences)で取得した。FACSのデータは、Flowjoソフトウェア(TreeStar, Ashland, OR)を使用して分析した。

0192

統計解析
全てのデータは、GraphPad Prismバージョン5.00(GraphPad, San Diego, CA)およびマイクロソフト社エクセル(microsoft office)を使用して解析した。Mann-Whitney検定マッチドノンパラメトリック検定を用いて、リンパ系組織由来の生存Tリンパ球サブセット上のCD277およびPD−1発現の変動(図3)、CD277を刺激されたTリンパ細胞上のAKTおよびERKのリン酸化の変動(図4〜5)、ならびにT細胞でのサイトカイン分泌の差(図6)を検討した。異なる刺激条件の間で比較を行った。対応のあるWilcoxon検定を用いて、NK細胞への異なる刺激条件の間で比較した(図7)。p<0.05の場合に差を統計的に有意と見なした。

0193

結果
T細胞亜集団およびNK細胞上のCD277の発現プロファイル
本発明者らは、以前に、CD277がT細胞およびNK細胞上に発現されることを報告した(compte et al)。本発明者らは、健康なドナー(n=4)からの公知の末梢リンパ球亜集団上でのCD277の発現を検討することを決意した。したがって、本発明者らは、多パラメーター−フローサイトメトリーを使用して、CD3+CD4+亜集団およびCD3+CD8+亜集団を分析した(データは示さず)。モノクローナル抗CD277を用いた染色(データは示さず)から、CD4+ヘルパーT細胞上および細胞傷害性CD8+T細胞上の両方でCD277の強い発現が明らかとなった(データは示さず)。本発明者らは、CD27およびCD45RAの発現のディファレンシャルな発現に基づき、Tリンパ球のメモリー集団およびナイーブ集団上でのCD277の発現も調べた(データは示さず)。ここでもまた、本発明者らは、サブセット間に有意差を全く検出しなかった(データは示さず)。

0194

同時に本発明者らは、自然免疫系に属する別のリンパ球集団であるNK上でのCD277の発現をモニターした(データは示さず)。本発明者らは、NK細胞の100%が、そのCD56Bright(ヘルパー)表現型またはCD56Dim(細胞傷害性)表現型とは無関係に高レベルのCD277も発現したことを見出したが、これはB7/CD28ファミリーに関連する分子がNK細胞の二つの主要亜集団上に同様に見出されることを示している。

0195

活性化T細胞およびNK細胞上のCD277のモデュレーション
共レギュレーション分子であるPD1の誘導のように、いくつかのT細胞共シグナル伝達分子の発現が、T細胞レセプター(TCR)活性化後にレギュレーションされうることから、本発明者らは、CD277も活性化条件下でモデュレーションされる可能性があるか疑問に思っていた。この仮説を検証するために、本発明者らは、CD4+T細胞のCD3/CD28活性化条件下でCD277およびPD1の発現プロファイルを比較した。

0196

したがって、4人の健康なドナー由来の精製CD4+T細胞を、CD3およびCD28に対するモノクローナル抗体と共に、またはそれぞれの対照アイソタイプと共に24〜96時間インキュベーションした。予想通り、CD3/CD28処理の結果、培養72時間後にPD1の発現が7倍に増加したが、CD277の発現はどの時点でも変化しなかった(データは示さず)。CD8 T細胞でも同様の結果を得た(データは示さず)。

0197

同時に、本発明者らは、CD277の発現がNK細胞上でモデュレーションされる可能性があるか疑問に思っていた。したがって、本発明者らは、通常のNK細胞刺激サイトカイン(IL−2およびIL−15)でNK細胞を刺激した。本発明者らは、CD277およびHVEMの発現プロファイルを比較した。HVEMは、NK細胞上に高度に発現され、NK細胞を刺激すると減少した。本発明者らの結果から、陽性対照であるHVEMとは逆に、CD277の発現がNK細胞活性化後にモデュレーションされなかったことが示された(データは示さず)。

0198

まとめると、これらの結果から、T細胞およびNK細胞がCD277を構成性発現するが、その発現はT細胞またはNK細胞の共刺激後にin vitroでモデュレーションされないことが実証された。

0199

リンパ節におけるCD4 TFH細胞上のCD277の発現プロファイル
複数の免疫T細胞集団がリンパ器官から見出され、それらは専門化された機能を果たす。それらのうち、濾胞性ヘルパーT細胞(TFH)は胚中心に存在し、B細胞の分化に重要な役割を果たす。これらの細胞は、ケモカインレセプターCXCR5および高レベルの共シグナル伝達分子ICSOだけでなく、PD−1およびBTLAも発現する。CD277の発現は、リンパ節においてディファレンシャルにレギュレーションされている可能性がある(図4)。

0200

反応性リンパ節の総凍結切片もCD277について免疫染色した。免疫組織化学分析の結果から、濾胞内T細胞領域およびマントルゾーンB細胞の両方に強い陽性が示され、これはT細胞およびB細胞上で結果が陽性であったことを示している。驚くことに、染色パターンは胚中心で全く異なった。GCの大部分は陰性であり、分化過程の間にB細胞がCD277の発現を失ったことを示していた。しかし、少数の分散した細胞はTFH染色に類似した染色性であった。本発明者らは、フローサイトメトリー分析を行った後にこのことを確認した。TFH細胞(CXCR5+ICOS+PD−1+)はCD277について陽性であって、加えてCD277は、CXCR5−従来型T細胞上に等しく存在したが、胚中心(GC)B細胞または細胞に有意な染色は存在しない(データは示さず)。

0201

この研究第一部の結論は、CD277が末梢血およびリンパ節中のTリンパ球の全てのサブタイプならびにNK細胞上に発現しているが、B7/CD28ファミリーの分子、またはリンパ球のレギュレーションに関与する他の任意の分子の場合でしばしば見られるように、その発現は刺激条件下でモデュレーションされないということである。

0202

AKTおよびERKのリン酸化は、CD4+T細胞上へのCD277結合後に増強する
リンパ球の機能に及ぼすCD277の共刺激的な役割を検討するために、本発明者らは、CD277のトリガリングが、リンパ球シグナル伝達経路の二つの最も重要なキナーゼであるマイトジェン活性化プロテインキナーゼERKおよびセリントレオニンキナーゼAKTのリン酸化を誘導できるかどうかを調査した。AktおよびERKのシグナル伝達が増殖、タンパク質合成およびアポトーシスのレギュレーションなどのT細胞機能に中心的な役割を果たすことが分かっている。

0203

第一に、本発明者らは、CD277 20.1のトリガーがAKTおよびERKのリン酸化を誘導したことを示し(図2)、CD277の刺激がT細胞活性化のレギュレーションに関与することを実証した(精製CD4+T細胞を、mAb抗CD3およびmAb抗CD277.20.1を用いる抗体コーティング済みエポキシdynabeadsで刺激した)。

0204

第二に、TCRシグナル伝達経路の共モデュレーターとしてのCD277の意味を明らかにするために、本発明者らは、異なる時点(2、5、10および30分)で抗CD3および抗CD28と一緒に、様々な濃度のCD277.20.1クローンに対するmAbまたはアイソタイプ対照IgG1で精製CD4+T細胞を刺激した。本発明者らは、CD277とmAb CD277.20.1クローンとのクロスリンクが、CD3+CD28の刺激により誘導されるAKTおよびERKのリン酸化を強力にアップレギュレーションしたことを観察した。この作用は、用量および時間に依存した(データは示さず)。

0205

したがって、本発明者らは、本出願のこの部分においてCD277のトリガーがTCRシグナルを強化することを実証した。本発明者らは、次に、このシグナル伝達経路活性化の機能的帰結を検討することを決意した。

0206

CD277はCD3シグナルを共刺激する
本発明者らは、次に、CD277の結合がCD3介在性シグナルにより仲介されるサイトカイン産生および活性化マーカーのレギュレーションに及ぼす作用を検討した。少なくとも4人の健康なドナー由来の精製CD4+T細胞を、抗CD3/抗CD28または抗CD3/抗CD277(クローン20.1)または抗CD3/IgG1(対照条件)と共に24〜72時間培養した。24時間培養後に、CD4+T細胞によるIL−2およびIFN−γ産生をELISAにより測定した。予想通り、これらの二つのサイトカインは、対照条件との比較によりCD3/CD28刺激後に大量に産生された(p=0.0079、p=0.0317、データは示さず)。CD3/CD277で共活性化されたCD4+T細胞により産生されたIL−2レベルは、CD3/CD28共刺激で得られたレベルよりも低かったが、それにもかかわらずCD3/CD277共活性化により誘導されたIL−2の量は、IgG対照での量よりも有意に高かった(p=0.0159、データは示さず)。さらに、IFN−γの分泌は、対照刺激よりもCD3/CD277共活性化により強く高まり、驚くことにその産生は、CD3/CD28共活性化後に得られた産生よりもなお大きかった(データは示さず)。さらに、3日間培養後に、CD3/CD277共刺激後の活性化マーカーCD25の発現プロファイルに関して類似の作用が得られた。このCD4+T細胞の共刺激は、CD25活性化陽性細胞が45%に有意に増加することを誘導したが、CD3/CD28の共活性化は、対照条件に比べて活性化CD25陽性細胞が25%に増加することを誘導しただけであった(データは示さず)。

0207

全体的に、これらの結果は、CD277がTリンパ球の活性化シグナルの共刺激分子であることを強く示唆している。

0208

CD277は、さらにCD3−CD28共刺激を高め、T細胞増殖およびサイトカイン産生を高める第三のシグナルとして作用することができる
次に、本発明者らは、CD3+CD28シグナルにより誘導されるT細胞増殖およびサイトカイン産生に与えるCD277共シグナルの帰結を検討した。本発明者らは、抗CD3および抗CD28と一緒に、様々な濃度のCD277に対するmAbで精製CD4+T細胞を刺激した。本発明者らは、アイソタイプ対照IgG1および抗MHCクラスI(MHCI)を添加することによりビーズ上の抗体量を一定に保った。本発明者らは、CD4+T細胞上へのCD277のクロスリンクが、抗CD3および抗CD28により仲介されるCD4+T細胞の増殖を用量依存的に強く活性化したことを実証した。実際に本発明者らは、サイトソル色素CFSEの希釈を測定することによりCD4細胞の増殖を測定した(データは示さず)。本発明者らは、抗CD3に加えて抗CD28およびIgG1で刺激された細胞の60%が5日目までに分裂状態に入ったことを見出した。CD277(17μg/ml)のクロスリンクは、抗CD3および抗CD28によりすでに誘導されたCD4+T細胞の分裂を用量依存的に強く高め、例えば90%の細胞が分裂状態に入った(データは示さず)。

0209

同時に、本発明者らの結果から、CD277の結合が、抗CD3および抗CD28の刺激により誘導される増殖(データは示さず)およびサイトカイン分泌を用量依存的に増加させたことも示された(図3)。

0210

まとめるとこれらのデータは、CD28により提供される最適な共刺激後であってもCD277が共刺激分子の役割を果たすことを支持するものである。

0211

CD277はNK細胞の共刺激分子でもあるか?
同時に、本発明者らは、NK細胞において類似の共刺激作用が得られるかどうかを検討した。したがって本発明者らは、アイソタイプ対照またはCD277モノクローナル抗体(20.1)または抗DNAM(活性化レセプターの共刺激の陽性対照)または抗NKG2A(活性化レセプターの共阻害の陽性対照)の存在下で、最も重要なNK細胞レセプターの二つを(抗NKp46または抗CD16で)刺激した。第一に、CD277単独はNK細胞の刺激に全く作用を及ぼさなかった。第二に、CD277分子に対するモノクローナルmAb20.1は、DNAMまたはNKG2AのようなNK細胞活性化に対するどの作用も強化することができなかった。一次刺激(primo-stimulation)がNKp46またはCD16を用いて行われようと、細胞傷害性(データは示さず)およびIFN−γ分泌(データは示さず)のどちらも影響されなかった。この結果は全く驚くことであったが、T細胞で観察されたものとは逆に、明らかにCD277はNK細胞活性化のレギュレーションに関与しない。

0212

リンパ球により発現されるBtnaアイソフォーム
CD277がB30.2ドメインを有する(btn3a1およびbtn3a3)または有さない(btn3a2)三つのアイソフォームbtn3a1、btn3a2およびbtn3a3を有することを考慮して、本発明者らは、Tリンパ球上での各アイソフォームのmRNA発現を調べて、各アイソフォームが等モル発現パターンを有するかどうか決定しようと決意した。GEO omnibusから利用可能なデータを用い、それをさらにQ−PCRにより確認して、本発明者らは、btn3a1がTリンパ球により発現される主要形態であるが、デコイ形態(btn3a2)がNK細胞上に最も多く発現されることを見出した(データは示さず)。この結果は、4人の健康なドナーに関する定量PCRで検証した。したがって本発明者らは、NK細胞のCD277刺激に応答した共刺激が不在であることが、この形態のBTN3Aに起因しうるという仮説を発表する。

0213

実施例3
材料および方法
抗体およびFab断片
抗CD277:抗BT3−20.1および103.2mAbを、以前に記載されたように作製および検証した[10]。抗BT3−20.1のFabフラグメントを作製し、ImmunopureFabPreparation Kit(Pierce)を用い製造業者の推奨に従って精製した。タンパク質の純度は非還元SDS−PAGEにより評定した。

0214

系統樹の構築
配列およびアライメントを検索し、系統発生学再構築を行うために自動ゲノムアノテーションプラットフォームFIGENIX(FIGENIX Annotation Platform: [http://figenix2.up.univmrs.fr/Figenix/index.jsp])を使用して系統発生解析を行った。使用されたパイプラインに三つの異なる方法の系統樹再構築、すなわち最節約法[38]、最尤法[39]および近隣結合法[40]を適用し、中点を根とする合意樹を構築した。1000個の複製からブートストラップ法を実施した。各方法についてブートストラップ値を報告する(使用されたパイプラインおよびモデルの詳細な説明については[41]を参照されたい)。

0215

細胞系およびγδT細胞のエクスパンション
P815(マウス肥満細胞腫細胞系)、K562(慢性骨髄性白血病細胞系)、RajiおよびDaudi(バーキットリンパ腫細胞系)をRPMI1640培地(Invitrogen)および10%ウシ胎児血清(FCS)(Eurobio)中で培養した。健康なドナーからのPBMCを、RPMI1640培地+10%FCSに入れて、5%CO2中で37℃にて24ウェル培養プレート中に106個/mlとなるように配分した。ポリクローナルVγ9Vδ2T細胞を3μmol/l Phosphostim(BrHPP分子、Innate Pharma, Marseille, France)および100U/mlIL−2(Chiron, Basel, Switzerland)と共に12日間特異的にエクスパンションさせた。Phosphostimは培養の開始時に1回添加した。2日毎に、培地体積の2分の1を、100U/ml IL−2を含有する新鮮培地に交換した。

0216

終日に、γδT細胞のパーセンテージを、抗Vd2FITCおよび抗CD3−Cy7を使用して評価した。γδT細胞が90%超に達した細胞培養物だけを選択して機能試験に使用した。

0217

フローサイトメトリー
エクスパンション後の純度試験におけるγδT細胞ラベル化のために、本発明者らは抗CD3 PE−Cy7および抗Vδ2FITCmAb(BD Pharmingen)を使用した。異なるサブセットにおいてCD277を特徴づけのために、PBMCを以下の抗体および分子と共にインキュベーションした:抗CD3 PE−Cy5(BD Pharmingen)、抗CD4 PB(BD Pharmingen)、抗CD8 PB(BD Pharmingen)、抗Vδ2 FITC(BD Pharmingen)、抗CD27APC−Alexa Fluor750(CALTAG Laboratory)、抗CCR7 PECy7(BD Pharmingen)、抗CD28 PE(Beckman Coulter)、抗CD45RA ECD(Beckman Coulter)、LIVE/DEAD(登録商標)Fixable Dead Cell Stain Kit(L34957、Invitrogen)およびAlexa Fluor647でラベル化された抗CD277(Protein labelling Kit Alexa Fluor 647、Molecular Probes, Invitrogen)。CD107aおよびCD107bの発現を分析するために、γδT細胞およびターゲット細胞をモネンシン(10μM, GoligiStop, BD Bioscience)存在下で抗CD107a FITCおよび抗CD107b FITCと共に37℃で共インキュベーションした。インキュベーションの4時間後に細胞を収集し、PBSで洗浄した。γδT細胞を抗汎γδTCR PE mAbおよび抗CD3 PECy7 mAb(BD Pharmingen)でラベル化した。FACSCantoまたはFACSAriaフローサイトメーター(BD Biosciences)でFACSDivaソフトウェアを使用して全試料を測定した。FlowJoソフトウェア(Tree Star)を用いて解析を行った。

0218

補足的な材料:
細胞内染色は、BD Pharmingen Fix and Perm Kit(BD Biosciences)による推奨に従って行った。2×106個/mlのγδT細胞100μlを96ウェルプレートに蒔いた。それらを3μM BrHPPの存在下または不在下で、10μg/mlの抗CD277または対照アイソタイプと共に4℃で30分間インキュベーションした。細胞を異なる時点に37℃で刺激した。Cytofix/Cytoper溶液100μlを37℃で10分間添加することにより刺激を止めた。精製ウサギモノクローナル抗体(抗pZap70、抗pAKTおよび抗pErk、Cell Signaling Technology(Danvers, USA)製)を用いて細胞内リン酸化タンパク質を染色し、ビオチン−SP結合型F(ab’)2ロバ抗ウサギ抗体(Jackson)でラベル化し、ストレプトアビジン−PE(Beckman Coulter)を用いて顕示させた。

0219

刺激およびエクスパンションアッセイ
PBMCをプレートに蒔き、細胞系およびγδT細胞のエクスパンションの節に記載したように刺激したが、但し、抗CD277mAb(10μg/ml)または対照アイソタイプ(10μg/ml)で、異なる濃度のBrHPPの存在下または不在下で細胞を刺激した。9日後に培養を止めた。Vγ9Vδ2のパーセンテージを培養初日および最終日に上記のように測定した。エクスパンションしたγδT細胞エフェクターは、10μg/ml抗CD277mAb中に添加された異なる用量のBrHPPの存在下もしくは不在下で、または異なる濃度の抗BT3 19.5mAbと結合したOKT3(4ng/ml)存在下で刺激した。脱顆粒の活性化は、上記のようにCD107ラベル化アッセイにより測定した。

0220

再方向付けした活性化アッセイ
P815肥満細胞腫マウス細胞2×105個を、マウス対照アイソタイプmAbもしくは抗CD277mAb(10μg/ml)および/または抗CD3(OKT3、4ng/ml)と共に30分間インキュベーションした。洗浄後、P815を同濃度のエクスパンションしたVγ9Vδ2Tエフェクター細胞と共に37℃で4時間インキュベーションした。フローベースのCD107a脱顆粒アッセイを上記のように行った。

0221

ELISA
再方向付けした活性化アッセイからの上清を4時間の共培養後に収集した。IFNγ、TNFαおよびIL−17の放出をELISAキットにより検査した(BD Pharmingen製IFNγおよびTNFα用OptEIAキット)。サイトカインはプレートリーダーMultiskan RC(Labsystems)で検出した。リコンビナント標準を用いて確立した標準曲線からサイトカイン濃度を決定した。

0222

直接細胞傷害性アッセイによるVγ9Vδ2T細胞応答の分析:
ターゲット細胞を20μCiの51Cr(PerkinElmer)で37℃にて1時間ラベル化した。ターゲット細胞を洗浄後に、エフェクターVγ9Vδ2T細胞と共に異なる比率で37℃にて4時間インキュベーションした。特異的またはアイソタイプ対照のmAbまたはFabフラグメントの存在下でインキュベーションを行った。4時間後にターゲット細胞により放出された放射能をβプレートカウンターで測定した。51Cr比溶解パーセンテージは、以下の式を用いて計算した:
比溶解パーセント=100×[(検査での放出)−(自然放出)]/[(最大放出)−(自然放出)]

0223

統計解析:
Cytelにより製造されたStatXactソフトウェア(バージョン8 PC)を全ての統計解析のために使用した。群間比較のための有意値は、ノンパラメトリックMann-Whitney解析により決定した。95%信頼レベル不等分散を仮定して、p値<0.05を有意と見なした。

ページトップへ

この技術を出願した法人

この技術を発明した人物

ページトップへ

関連する挑戦したい社会課題

関連する公募課題

該当するデータがありません

ページトップへ

技術視点だけで見ていませんか?

この技術の活用可能性がある分野

分野別動向を把握したい方- 事業化視点で見る -

(分野番号表示ON)※整理標準化データをもとに当社作成

ページトップへ

おススメ サービス

おススメ astavisionコンテンツ

新着 最近 公開された関連が強い技術

この 技術と関連性が強い技術

関連性が強い 技術一覧

この 技術と関連性が強い人物

関連性が強い人物一覧

この 技術と関連する社会課題

関連する挑戦したい社会課題一覧

この 技術と関連する公募課題

該当するデータがありません

astavision 新着記事

サイト情報について

本サービスは、国が公開している情報(公開特許公報、特許整理標準化データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。また一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。

主たる情報の出典

特許情報…特許整理標準化データ(XML編)、公開特許公報、特許公報、審決公報、Patent Map Guidance System データ