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技術 乳酸菌の菌体等、並びにこれらを含有する口腔内疾患の予防材等及び食品

出願人 国立大学法人広島大学
発明者 二川浩樹
出願日 2013年7月3日 (6年4ヶ月経過) 出願番号 2013-139722
公開日 2014年11月20日 (4年11ヶ月経過) 公開番号 2014-218491
状態 特許登録済
技術分野 動物,微生物物質含有医薬 乳製品 非アルコール性飲料 食品の着色及び栄養改善 微生物、その培養処理 化粧料 化合物または医薬の治療活性
主要キーワード 改善材 発酵用原料 フォーサ 物質含有液 ヨーグルト状 ブロー液 治療材 発酵促進物質
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2014年11月20日)のものです。
また、この項目は機械的に抽出しているため、正しく解析できていない場合があります

図面 (5)

課題

口腔内疾患の予防や改善、治療などに有効な乳酸菌菌体等を提供する。

解決手段

本発明の一つは、ラクトバチルスラムノーサスOG4株(NITEP−1558)及びラクトバチルス・ラムノーサスOG5株(NITE P−1559)の乳酸菌のうち、少なくともいずれか1種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物である。

概要

背景

口腔内には、多種多様微生物によって構成された微生物叢が存在する。そこには、う蝕菌、歯周病菌カンジダ菌等も存在し、これらは、う蝕、歯周疾患舌炎鵞口瘡口腔カンジダ症等の疾患を引き起こす。

このような口腔内疾患を防ぐために、経口投与する様々な抗菌剤が使用されている。しかし、抗菌剤の場合、口腔内に投与しても、唾液飲食物によって容易に洗い流されてしまうため、その効果は一過性のものと言わざるを得なかった。

そこで、本発明者は、口腔内疾患に有効な乳酸菌を見出したことから、これを用いた治療剤等を先に提案している(特許文献1)。

更に、本発明者が研究を進めていたところ、先に提案した乳酸菌と同等、あるいはそれ以上に口腔内疾患に有効な乳酸菌株を新たに見出した。

概要

口腔内疾患の予防や改善、治療などに有効な乳酸菌の菌体等を提供する。本発明の一つは、ラクトバチルスラムノーサスOG4株(NITEP−1558)及びラクトバチルス・ラムノーサスOG5株(NITE P−1559)の乳酸菌のうち、少なくともいずれか1種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物である。無し

目的

本発明の目的は、口腔内疾患の予防や改善、治療などに有効な乳酸菌の菌体等を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
0件
牽制数
0件

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請求項1

ラクトバチルスラムノーサスOG4株(NITEP−1558)及びラクトバチルス・ラムノーサスOG5株(NITEP−1559)の乳酸菌のうち、少なくともいずれか1種の菌体菌体培養物、又はこれらの抽出物

請求項2

請求項1に記載の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を含有する口腔内疾患の予防材改善材又は治療材

請求項3

請求項1に記載の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を含有する食品

請求項4

請求項3に記載の食品において、前記食品が、発酵乳又は発酵飲料である食品。

請求項5

ラクトバチルス・ラムノーサスOG4株(NITEP−1558)。

請求項6

ラクトバチルス・ラムノーサスOG5株(NITEP−1559)。

技術分野

0001

本発明は、う蝕虫歯)や歯周病等の口腔内疾患に有効な乳酸菌に関する。

背景技術

0002

口腔内には、多種多様微生物によって構成された微生物叢が存在する。そこには、う蝕菌、歯周病菌カンジダ菌等も存在し、これらは、う蝕、歯周疾患舌炎鵞口瘡口腔カンジダ症等の疾患を引き起こす。

0003

このような口腔内疾患を防ぐために、経口投与する様々な抗菌剤が使用されている。しかし、抗菌剤の場合、口腔内に投与しても、唾液飲食物によって容易に洗い流されてしまうため、その効果は一過性のものと言わざるを得なかった。

0004

そこで、本発明者は、口腔内疾患に有効な乳酸菌を見出したことから、これを用いた治療剤等を先に提案している(特許文献1)。

0005

更に、本発明者が研究を進めていたところ、先に提案した乳酸菌と同等、あるいはそれ以上に口腔内疾患に有効な乳酸菌株を新たに見出した。

先行技術

0006

公表特許2011−007584号公報

発明が解決しようとする課題

0007

すなわち、本発明の目的は、口腔内疾患の予防や改善、治療などに有効な乳酸菌の菌体等を提供することにある。

課題を解決するための手段

0008

本発明は、新たに見出した乳酸菌に基づくものである。

0009

すなわち、本発明は、ラクトバチルスラムノーサスOG4株(NITEP−1558)及びラクトバチルス・ラムノーサスOG5株(NITE P−1559)の乳酸菌のうち、少なくともいずれか1種の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物である。

0010

これら乳酸菌の菌体等は、単独あるいは混ざった状態で、口腔内疾患の予防材改善材又は治療材に含有させることができ、また、食品に含有させてもよい。

0011

食品の場合、特に発酵乳又は発酵飲料が好ましい。

発明の効果

0012

本発明によれば、口腔内疾患の予防等を促進できる。

図面の簡単な説明

0013

ストレプトコッカスミュータンスに対する発育阻害効果を示すグラフである。(b)は、コントロール以外を拡大して示したグラフである。
ポルフィロモナスジンジバリスに対する発育阻害効果を示すグラフである。(b)は、コントロール以外を拡大して示したグラフである。
カンジダアルビカンスに対する発育阻害効果を示すグラフである。(b)は、コントロール以外を拡大して示したグラフである。
パルスフィールド電気泳動による泳動結果を示す図である。
パルスフィールド電気泳動による解析結果を示す図である。

実施例

0014

以下、本発明の実施形態を図面に基づいて詳細に説明する。ただし、以下の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用物あるいはその用途を制限するものではない。

0015

<乳酸菌>
本発明に関する乳酸菌は、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)に属する乳酸菌であり、今回新たに見出された2種の菌株である。これら菌株は、本発明者によって、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。

0016

具体的には、NITEP−1558として寄託されたラクトバチルス・ラムノーサスOG4株と、NITE P−1559として寄託されたラクトバチルス・ラムノーサスOG5株である(それぞれ、OG4株、OG5株ともいう)。

0017

OG4株及びOG5株は、有意に健全口腔を有する被験者唾液中から単離された乳酸菌である。OG4株及びOG5株は、それぞれ別の被験者から単離されている。

0018

OG4株及びOG5株は、いずれもヒトの口腔内から採取された乳酸菌であるため、安全である。従って、食品や薬品等に容易に適用できる。

0019

OG4株及びOG5株は、いずれも、16SrRNA塩基配列がラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)strain IDCC3201の塩基配列と1485/1485の間で100%の相同性を示し、グラム染色後の顕鏡下においてクラム陽性桿菌様相を呈することから、ラクトバチルス・ラムノーサス(Lactobacillus rhamnosus)と同定された。

0020

OG4株及びOG5株は、後述するKO3株とは異なる、いずれもホモ型乳酸発酵を行うカタラーゼ陰性細菌であり、芽胞は形成しない。好気条件下でも培養可能であり、菌体外多糖類を産生する。

0021

OG4株及びOG5株は、常法によって得られるこれらの菌体のみならず、発酵液培養上清などのこれらの菌体培養物、菌体や菌体培養物を処理して得られる細胞質細胞壁画分などの抽出物も用いることができる。また、菌体は、生菌のみならず死菌であってもよい。

0022

OG4株及びOG5株を培養する培地には、果汁培地、野菜汁培地、牛乳培地、脱脂粉乳培地又は乳成分を含む培地、これを含まない半合成培地等種々の培地を用いることができる。具体的には、脱脂乳還元して加熱殺菌した還元脱脂乳培地酵母エキスを添加した脱脂粉乳培地、MRS培地、GAM培地等を例示することができる。

0023

OG4株及びOG5株の培養方法は、静置培養又はpHを一定にした中和培養や、回分培養及び連続培養等、菌体が良好に生育する条件であれば、特に制限はない。

0024

菌体や菌体培養物の抽出物としては、菌体や菌体培養物を溶媒抽出して得られる抽出液、その希釈液、その濃縮液、その乾燥末などがある。

0025

その抽出に用いる溶剤は、極性溶剤非極性溶剤のいずれも使用でき、これらを混合したものであってもよい。例えば、水;メタノールエタノールプロパノールブタノール等のアルコール類プロピレングリコールブチレングリコール等の多価アルコール類アセトンメチルエチルケトン等のケトン類酢酸メチル酢酸エチル等のエステル類テトラヒドロフランジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類ポリエチレングリコール等のポリエーテル類ヘキサンシクロヘキサン石油エーテル等の炭化水素類ベンゼントルエン等の芳香族炭化水素類ピリジン類等が挙げられ、このうち、酢酸エチル等のエステル類、エタノール等のアルコール類が好ましい。

0026

抽出条件は、溶剤によっても異なるが、例えば、培養液1質量部に対して1〜10質量部の溶剤を用い、0〜50℃、好ましくは25〜37℃の温度で、0.5時間〜3時間抽出するのが好ましい。

0027

OG4株及びOG5株は、口腔内疾患の予防等に優れた効果を発揮する。

0028

口腔内疾患とは、う蝕菌、歯周病菌又はカンジダ菌に起因して口腔内で発症する疾患をいい、例えば、う蝕症、歯肉炎歯周炎等の歯周病、舌炎、鵞口瘡、口角炎等の口腔カンジダ症等が挙げられる。

0029

う蝕菌としては、例えば、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)、ストレプトコッカス・ソブリナス(Streptococcus sobrinus)等が挙げられる。

0030

歯周病菌としては、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、プレボテラインターメディア(Prevotella intermedia)、トレポネーマ・デンティコーラ(Treponema denticola)、タンネレラ・フォーサセンシス(Tannerella forsythensis)、アクチノバチルスアクチノミセテムコミタンス(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、フソバクテリウムヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum)等が挙げられる。

0031

カンジダ菌としては、例えば、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・グラブラータ(Candida glabrata)、カンジダ・トロピカリス(Candida tropicalis)等が挙げられる。

0032

<乳酸菌の発育阻害効果>
う蝕菌や歯周病菌、カンジダ菌に対するOG4株及びOG5株の発育阻害効果を、特許文献1に開示された乳酸菌と比較しながら詳細に説明する。

0033

比較対象とした乳酸菌は、KO3株(Lactobacillus rhamnosus,NITEBP−771)、YU3株(Lactobacillus casei,NITE BP−772)及びYU4株(Lactobacillus paracasei,NITE BP−775)である。

0034

(菌体の調製)
MRS培地(Difco社)を121℃で20分間滅菌した後、OG4株及びOG5株のそれぞれを接種し、37℃で、48時間大気下で培養した後、蒸留水等で洗浄し、菌体を得た。なお、比較対象であるKO3株、YU3株及びYU4株についても、OG4株等と同じ条件で菌体を調製し、−80℃で保存した。

0035

試験方法
各菌株の菌体を、常温解凍し、遠沈(3000rpm×5min)にて回収後、滅菌蒸留水で2回洗浄し、OD600で0.3とすることにより、所定の菌濃度(約1.0×109cfu/ml)に調整した。

0036

所定の菌濃度にした各菌株の懸濁液500μlを、15mlのMRS液体培地又はブレインハートインフュージョン液体培地(BHI液体培地:Difco)に接種した後、37℃で48時間、静置培養を行った。その後、3000rpm、5分間(室温)の遠沈を行い、その上清(培養上清)を回収した。後述する抗菌アッセイでは、この回収した各菌株の培養上清を用いた。

0037

被験菌株)
被験菌株には、う蝕菌(mutans streptococci)として、ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans Ingbritt)を、歯周病菌として、ポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis 381株)を、そして、カンジダ菌として、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans MYA274)を用いた。

0038

ストレプトコッカス・ミュータンスの場合、5%の酵母エキス(Difco)を添加したTryptic Soy Broth(TSBY液体培地:Difco)を用い、37℃、24時間培養を行った。その後、滅菌蒸留水で2回洗浄した後、OD600で0.3(約1.0×108cfu/ml)に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。

0039

ポルフィロモナス・ジンジバリスの場合、GAM培地(1%ヘミンおよび0.2%ビタミンKを添加)を用い、37℃で7日間、アネロパック(MCG)を入れた嫌気ジャー(10%CO2)中で前培養を行った。その後、リン酸緩衝液(pH7.4)で2回洗浄した後、OD600で0.3(約0.5×107cfu/ml)に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。

0040

カンジダ菌の場合、サブローデキストロース液体培地(Difco)を用いて37℃で24時間前培養し、滅菌蒸留水で2回洗浄した後、OD600で0.3(約1.0×107cfu/ml)に調整した菌懸濁液を抗菌アッセイに用いた。

0041

(抗菌アッセイ)
24穴プレートを用い、その各ウェルに、ストレプトコッカス・ミュータンスに対してはTSBY液体培地、ポルフィロモナス・ジンジバリスに対してはGAMまたはBHIの液体培地、カンジダに対してはサブロー液体培地のそれぞれを1ml添加した。
対応する各ウェルに、OG4株、OG5株、KO3株、YU3株及びYU4株の各培養上清1mlを個別に加え、対応する各被験菌株の菌懸濁液を個別に50μl接種し、テストサンプルとした。

0042

コントロールサンプルとして、TSBY液体培地又はサブロー液体培地の1mlを添加した各ウェルに、MRS液体培地又はBHI液体培地を1ml添加し、対応する各被験菌株の菌懸濁液を個別に50μl接種した。テストサンプル及びコントロールサンプルは、いずれも同じ操作で4つずつ作製した(N=4)。

0043

テストサンプル及びコントロールサンプルは、37℃で24時間培養した後、菌量の指標として、ATP量を測定した。ATP量の測定は、常法により、ルミノメーター(AB2200ルミネッセンサーPSN、ATTO、東京)を用いて行った。その結果を、グラフにしたものを図1図3に示す。

0044

図1は、ストレプトコッカス・ミュータンスの試験結果を示している。図2は、ポルフィロモナス・ジンジバリスの試験結果を示している。図3は、カンジダの試験結果を示している。各グラフは、各サンプルでのATP量(平均値)を表している。

0045

各図の(a)から明らかなように、OG4株、OG5株、KO3株、YU3株、YU4株は、いずれもコントロールと比べて明らかにATP量が少ない。すなわち、菌量が少ないことから、被験菌株の増殖が抑制されていることがわかる。従って、試験に供した各菌株の培養上清は、抗菌スペクトルが広く、各被験菌株に対して優れた発育阻害効果がある。

0046

更に、各図の(b)から明らかなように、OG4株及びOG5株は、KO3株、YU3株及びYU4株の各菌株と比べて、同等か、それ以上の発育阻害効果があることがわかる。

0047

このように、OG4株及びOG5株の培養上清に、口腔内疾患の主な原因菌に対して優れた発育阻害効果が認められたことから、これら菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物は、う蝕や歯周病等の口腔内疾患の予防、改善又は治療に対して有効である。

0048

<乳酸菌の利用>
OG4株及びOG5株の菌体、菌体培養物又はこれらの抽出物は、経口摂取する医薬品や食品などに利用できる。

0049

OG4株及びOG5株を医薬品に用いる場合には、例えば、液剤錠剤顆粒剤細粒剤粉剤タブレット等の固形剤カプセル剤口腔用スプレートローチ等にすることができる。

0050

これら医薬品には、賦形剤結合剤増量剤崩壊剤界面活性剤滑沢剤分散剤緩衝剤保存剤、嬌味剤、香料被膜剤担体希釈剤等を適宜配合してもよい。

0051

医薬品におけるOG4株及びOG5株の菌体、菌体培養物又はこれらの抽出物の含有量は、全組成中の1質量%〜50質量%が好ましく、10質量%〜20質量%がより好ましい。

0052

OG4株及びOG5株を食品に用いる場合には、例えば、果汁又は野菜汁飲料炭酸飲料茶系飲料乳飲料、発酵乳、発酵果汁発酵野菜汁アルコール飲料清涼飲料等の飲料に使用できる。ゼリー状食品や各種スナック類焼き菓子ケーキ類チョコレートジャムパンガム、飴、スープ類漬物佃煮等の各種食品の他、サプリメント等の健康食品や特定保健用食品等の機能性食品にも使用できる。

0053

OG4株及びOG5株は乳酸菌であるため、その培養物は、ヨーグルトチーズ味噌醤油、漬物等の発酵食品に好適である。その発酵乳やチーズを用いてパンやスナック菓子、ケーキ等にしてもよい。

0054

OG4株及びOG5株の発酵は、予めスターターを用意し、これを発酵用原料物質に接種して行うのが好ましい。スターターとしては、例えば、通常の殺菌処理を行った発酵用原料物質(例えば酵母エキスを添加した10%脱脂粉乳など)に、OG4株及びOG5株を接種して培養したものを挙げることができる。

0055

発酵用原料物質には、必要に応じて発酵促進物質、例えばグルコース澱粉蔗糖乳糖デキストリンソルビトールフラクトースなどの炭素源、酵母エキス、ペプトンなどの窒素源ビタミン類ミネラル類などを加えてもよい。

0056

OG4株及びOG5株の接種量は、例えば、発酵用原料物質含有液1mL中に菌体が約1×106cells以上、好ましくは1×107cells前後である。OG4株及びOG5株の発酵温度は、例えば、20℃〜42℃、好ましくは25℃〜37℃である。OG4株及びOG5株の発酵時間は、例えば5時間〜72時間である。

0057

OG4株及びOG5株を発酵して得られる乳酸発酵物は、凝固したカード状(ヨーグルト状)の形態を有しており、そのままで固形食品として利用できる。その乳酸発酵物を粉砕して均質化すれば、飲料として利用できる。

0058

OG4株及びOG5株の生菌としての添加量は、仕様に応じて適宜調整すればよい。例えば、液状の場合は、その菌体濃度を1×106cells/ml〜1×108cells/mlとするのが好ましい。固形の場合は、1×107cells/g〜1×1010cells/gとするのが好ましい。

0059

OG4株及びOG5株の成人一人当たりの摂取量(生菌)は、例えば、1×108〜5×1010cells/日である。

0060

このように、OG4株及びOG5株の菌体、菌体培養物、又はこれらの抽出物を、医薬品や食品などに含ませて経口摂取すれば、う蝕菌等の原因菌の発育阻害できるので、口腔内疾患の予防、改善又は治療に役立つ。

0061

特に、ヨーグルト等の発酵乳又は発酵飲料のように、生菌を含む形態で摂食するとよい。OG4株及びOG5株の生菌が口腔内に定着して、口腔内に常在するようになれば、その効果が継続して得られるため、きわめて有効である。

0062

<OG4株、OG5株、及びKO3株の比較>
OG4株、OG5株、及びKO3株が、それぞれ異なる菌株であること確認するために試験を行った。

0063

試験では、OG4株、OG5株、及びKO3株の各菌株からDNAを抽出し、抽出した各DNAを制限酵素(Spel,Smal,Apal)で切断した後、パルスフィールド電気泳動(PFGE)を行った。

0064

その結果を図4及び図5に示す。なお、図4の「M」はマーカーである。

0065

これら結果より、OG4株、OG5株、KO3株で、それぞれ異なるパターンが認められ、OG4株、OG5株、及びKO3株は、それぞれ異なる菌株であることが確認された。

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