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図面 (7)

課題

クローン病潰瘍性大腸炎の様な炎症性腸疾患の予防及び/又は治療の為、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌を提供する。更に、該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物医薬組成物化粧品組成物、及び免疫賦形剤を提供する。

解決手段

ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキー(Lactobacillus kunkeei)に属する乳酸菌、並びに該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物、医薬組成物、化粧品組成物、気道又は食道粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤、及び食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤

概要

背景

潰瘍性大腸炎クローン病は、炎症性腸疾患(IBD)の中でも、病因が未だ明らかではなく、難治性である。炎症性腸疾患に関わる要因としては、腸内細菌叢の異常、腸上皮細胞分泌型IgA産生障害腸粘膜下のサイトカインなどの因子が関わっている。潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜下の非特異性慢性炎症を主たる病変とするが、種々の自己抗体を認めることから、自己免疫疾患としての性格を有すると考えられる。一方、クローン病は非乾酪肉芽腫性炎症性病変を病理学的特徴とし、病因の一つとして単球マクロファージ系細胞の機能異常が想定されている。わが国において、潰瘍性大腸炎とクローン病の患者数は年10%弱と増加しつづけ問題となっている。

IBDは、従来は自己免疫疾患と言われていたが、最近の研究の進歩により、その炎症は腸内細菌によって引き起こされていると考えられるようになってきた。IBDの患者の腸管粘膜内在性の腸内細菌叢に対して対照と比較して保護が弱く、管腔でのバクテリアの増加という結果になることが報告されている(GASTROENTEROLOGY 1999;117:1089-1097参照)。そして、プロバイオティクス腸炎を予防、改善することが報告されてから、治療法の一つとして、プロバイオティクスの有用性が注目されてきている。プロバイオティクスによるIBDの治療についての多くの報告が出されている(非特許文献1)。

乳酸菌は、発酵乳等の形で体内に摂取されることによって、整腸作用血清コレステロール低下作用等の乳酸菌の機能性に基づいた種々の生理効用を発揮することが知られている。乳酸菌の生理的効用として、慢性関節リウマチインスリン依存性糖尿病等の自己免疫疾患や、過敏性腸症候群や潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患に対する効能について注目され始めてきている。

特許文献1には、ラクトバチルス属ラクトコッカス属及びストレプトコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選択された1種類以上の乳酸菌の菌体破砕する工程を含む方法により製造して得られた破砕物は、インターロイキン10と12の産生調節能を有しており、これのクローン病や難治性炎症性腸疾患への適用について記載されている。

特許文献2には、粘膜付着性増殖性及び耐酸性の高いラクトバチルスサリバリウスに属する乳酸菌の潰瘍性大腸炎及びクローン病の予防及び/又は治療への適用が記載されている。

非特許文献2では、Lactobacillus casei strain GGが腸でのIgA免疫反応を増加させ、それにより腸の免疫学的バリアを増進する可能性を有することが実験結果により示され、Lactobacillus GGはクローン病への補助的な栄養療法を提供し得ることが報告されている。

非特許文献3では、クローン病の子供においてLactobacillus GGが腸のバリア機能臨床状態を改善するかもしれないことを示す研究結果が報告されている。

また、Lactobacillus rhamnosus GGの経鼻投与によって、呼吸器細胞媒介免疫反応が増強されることによりマウスインフルエンザウイルス感染から保護されることも報告されている(非特許文献4)。

ところで、クローン病の患者の粘膜では、IFN-γとIL-2のmRNAベルが対照と比べて有意に増加しており、クローン病の患者の慢性的な腸の炎症は、Th1様のサイトカインの増加によって特徴づけられるとの報告がある(非特許文献5)。

ラクトバチルス属の新種であるラクトバチルス・クンキーワインから単離したことが非特許文献6において報告されている。また、非特許文献7では、フルクトース豊富な場所(花)から好フルクト乳酸菌株を単離し、その菌株にはラクトバチルス・クンキーが含まれていたことが、特許文献3では、ラクトバチルス・クンキーをミツバチから単離したことが報告されている。

概要

クローン病や潰瘍性大腸炎の様な炎症性腸疾患の予防及び/又は治療の為、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌を提供する。更に、該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物医薬組成物化粧品組成物、及び免疫賦形剤を提供する。ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキー(Lactobacillus kunkeei)に属する乳酸菌、並びに該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物、医薬組成物、化粧品組成物、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤、及び食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤。なし

目的

特開2007-269737号公報
国際公開第02/016554号
特表2010-525809号公報




腸内細菌学雑誌2009;23:193-201
Annals of Nutrition and Metabolism 1996;40:137-145
Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2000;31:453-457
Letters in Applied Microbiology 2010;50:597-602
Clinical and Experimental Immunology 1995;101:428-435
Journal of Applied Microbiology 1998;84:698-702
Systematic and Applied Microbiology 2009;32:593-600






このようにIgA産生促進作用に優れ、且つ非特異的な細胞性免疫応答誘導しない乳酸菌は有用性が高く、その開発が望まれている

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgA産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキー(Lactobacillus kunkeei)に属する乳酸菌

請求項2

グルコースフルクトーススクローストレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すことを特徴とする、請求項1に記載の乳酸菌。

請求項3

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物

請求項4

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する医薬組成物

請求項5

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する化粧品組成物

請求項6

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、気道又は食道粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤

請求項7

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤

請求項8

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、整腸、美容、又はアンチエイジング用の組成物

請求項9

請求項1又は2に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、炎症性腸疾患の予防及び/又は治療用組成物

請求項10

前記炎症性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎である、請求項9に記載の組成物。

請求項11

食品又は医薬品である、請求項8〜10のいずれかに記載の組成物。

技術分野

0001

本発明は、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるラクトバチルス・クンキー(Lactobacillus kunkeei)に属する乳酸菌、並びに該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物医薬組成物化粧品組成物、及び免疫賦形剤に関する。

背景技術

0002

潰瘍性大腸炎クローン病は、炎症性腸疾患(IBD)の中でも、病因が未だ明らかではなく、難治性である。炎症性腸疾患に関わる要因としては、腸内細菌叢の異常、腸上皮細胞分泌型IgA産生障害腸粘膜下のサイトカインなどの因子が関わっている。潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜下の非特異性慢性炎症を主たる病変とするが、種々の自己抗体を認めることから、自己免疫疾患としての性格を有すると考えられる。一方、クローン病は非乾酪肉芽腫性炎症性病変を病理学的特徴とし、病因の一つとして単球マクロファージ系細胞の機能異常が想定されている。わが国において、潰瘍性大腸炎とクローン病の患者数は年10%弱と増加しつづけ問題となっている。

0003

IBDは、従来は自己免疫疾患と言われていたが、最近の研究の進歩により、その炎症は腸内細菌によって引き起こされていると考えられるようになってきた。IBDの患者の腸管粘膜内在性の腸内細菌叢に対して対照と比較して保護が弱く、管腔でのバクテリアの増加という結果になることが報告されている(GASTROENTEROLOGY 1999;117:1089-1097参照)。そして、プロバイオティクス腸炎を予防、改善することが報告されてから、治療法の一つとして、プロバイオティクスの有用性が注目されてきている。プロバイオティクスによるIBDの治療についての多くの報告が出されている(非特許文献1)。

0004

乳酸菌は、発酵乳等の形で体内に摂取されることによって、整腸作用血清コレステロール低下作用等の乳酸菌の機能性に基づいた種々の生理効用を発揮することが知られている。乳酸菌の生理的効用として、慢性関節リウマチインスリン依存性糖尿病等の自己免疫疾患や、過敏性腸症候群や潰瘍性大腸炎、クローン病等の炎症性腸疾患に対する効能について注目され始めてきている。

0005

特許文献1には、ラクトバチルス属ラクトコッカス属及びストレプトコッカス属に属する乳酸菌からなる群より選択された1種類以上の乳酸菌の菌体破砕する工程を含む方法により製造して得られた破砕物は、インターロイキン10と12の産生調節能を有しており、これのクローン病や難治性炎症性腸疾患への適用について記載されている。

0006

特許文献2には、粘膜付着性増殖性及び耐酸性の高いラクトバチルス・サリバリウスに属する乳酸菌の潰瘍性大腸炎及びクローン病の予防及び/又は治療への適用が記載されている。

0007

非特許文献2では、Lactobacillus casei strain GGが腸でのIgA免疫反応を増加させ、それにより腸の免疫学的バリアを増進する可能性を有することが実験結果により示され、Lactobacillus GGはクローン病への補助的な栄養療法を提供し得ることが報告されている。

0008

非特許文献3では、クローン病の子供においてLactobacillus GGが腸のバリア機能臨床状態を改善するかもしれないことを示す研究結果が報告されている。

0009

また、Lactobacillus rhamnosus GGの経鼻投与によって、呼吸器細胞媒介免疫反応が増強されることによりマウスインフルエンザウイルス感染から保護されることも報告されている(非特許文献4)。

0010

ところで、クローン病の患者の粘膜では、IFN-γとIL-2のmRNAベルが対照と比べて有意に増加しており、クローン病の患者の慢性的な腸の炎症は、Th1様のサイトカインの増加によって特徴づけられるとの報告がある(非特許文献5)。

0011

ラクトバチルス属の新種であるラクトバチルス・クンキーをワインから単離したことが非特許文献6において報告されている。また、非特許文献7では、フルクトース豊富な場所(花)から好フルクト乳酸菌株を単離し、その菌株にはラクトバチルス・クンキーが含まれていたことが、特許文献3では、ラクトバチルス・クンキーをミツバチから単離したことが報告されている。

0012

特開2007-269737号公報
国際公開第02/016554号
特表2010-525809号公報

先行技術

0013

腸内細菌学雑誌2009;23:193-201
Annals of Nutrition and Metabolism 1996;40:137-145
Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 2000;31:453-457
Letters in Applied Microbiology 2010;50:597-602
Clinical and Experimental Immunology 1995;101:428-435
Journal of Applied Microbiology 1998;84:698-702
Systematic and Applied Microbiology 2009;32:593-600

発明が解決しようとする課題

0014

このようにIgA産生促進作用に優れ、且つ非特異的な細胞性免疫応答誘導しない乳酸菌は有用性が高く、その開発が望まれている。

0015

そこで、本発明は、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌を提供することを目的とする。更に、本発明は、該乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物、医薬組成物、化粧品組成物、及び免疫賦形剤を提供することを目的とする。

課題を解決するための手段

0016

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、蜜蜂が作る花粉荷から分離及び同定したラクトバチラス・クンキーに属する乳酸菌が、ラクトバチルスGG株(ATCC534103)よりIgAの産生促進作用が有意に高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が有意に低いことを見出した。なお、当該乳酸菌のマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用は、無刺激と同程度であって、Listeria死菌と比較しても極めて低いため、非特異的に細胞性免疫を誘導する能力はないと考えられる。すなわち、免疫学的に安全な物質であると思われる。

0017

本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、以下の乳酸菌及び該乳酸菌等を含有する組成物等を提供するものである。

0018

(I)乳酸菌
(I-1)ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低い、ラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌。
(I-2)グルコース、フルクトース、スクローストレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示すことを特徴とする、(I-1)に記載の乳酸菌。
(I-3) 分離源がミツバチ又は養蜂産品である、(I-1)又は(I-2)に記載の乳酸菌。
(I-4) ラクトバチルス・クンキーBPS402(FERM BP-11439)又はラクトバチルス・クンキーBPS104(FERM BP-11438)である、(I-1)〜(I-3)のいずれか一項に記載の乳酸菌。

0019

(II)組成物1
(II-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する食品組成物。
(II-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する医薬組成物。
(II-3) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する化粧品組成物。

0020

(III)免疫賦活剤
(III-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤。
(III-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、食中毒の予防又は緩和用の腸管免疫賦活剤

0021

(IV)組成物2
(IV-1) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、整腸、美容、又はアンチエイジング用の組成物。
(IV-2) (I-1)〜(I-4)のいずれか一項に記載の乳酸菌又はその菌体処理物を含有する、炎症性腸疾患の予防及び/又は治療用組成物
(IV-3) 前記炎症性腸疾患がクローン病又は潰瘍性大腸炎である、(IV-2)に記載の組成物。
(IV-4)食品又は医薬品である、(IV-1)〜(IV-3)のいずれか一項に記載の組成物。

発明の効果

0022

本発明のラクトバチラス・クンキーに属する乳酸菌は、高いIgA産生促進作用を有し、且つ免疫学的に安全であるという優れた特性を有している。それ故、当該乳酸菌は、食品、医薬、化粧料などの分野において有用である。

0023

本発明の乳酸菌は上記特性を有していることから、気道又は食道の粘膜から侵入してくる病原体又はウイルスに対する感染予防のための免疫賦活化、食中毒の予防又は緩和のための腸管免疫賦活化、整腸、美容又はアンチエイジング、クローン病又は潰瘍性大腸炎等の炎症性腸疾患の予防又は治療などの効果が期待される。

図面の簡単な説明

0024

ラクトバチルス・クンキーBPS402株、BPS104株及びJCM16173株のRAPDPCRアガロースゲル電気泳動の結果を示す図である。1%アガロースゲル、50V、1h30min、EtBr染色
ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のIgA産生能を示すグラフである。*: p<0.05 (vs. L. rhamnosas GG :ATCC53103, Dunnetの多重比較検定)
ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のマイトジェン活性(S.I.値)を示すグラフである。*: p<0.01 (vs. Listeria monocytogenes : EGD, Dunnetの多重比較検定) S.I.値 : stimulation index脾臓由来リンパ球のBrdU-Thymidine取込量(無刺激を1.0とした時の値)
ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のIL2産生能(S.I.値)を示すグラフである。*: p<0.01 (vs. Listeria monocytogenes : EGD, Dunnetの多重比較検定) S.I.値 : stimulation index CTLL-2細胞のBrdU-Thymidine取込量(無刺激を1.0とした時の値)
インフルエンザウイルス(A/PR/8/34株)感染後のBALB/cマウスにおける生存率推移の比較(生食投与群vs 1 mg/kg投与群)を示すグラフである(**:生理食塩水投与群との比較によりp<0.05にて有意差あり)。
インフルエンザウイルス感染後の生理食塩水投与マウスとBPS402投与マウスにおける肺臓ウイルスゲノム量の比較を示すグラフである。図には、各サンプルにおける肺臓内ウイルスゲノム量の相対値標準偏差とともに示している(**: p<0.05にて有意差あり)。
インフルエンザウイルス感染後の生理食塩水投与マウスとBPS402投与マウスにおける肺胞-気管支洗浄液(BALF)でのウイルス特異的IgAの比較を示すグラフである。図には、各サンプルにおける測定結果平均値を、標準偏差とともに示している(**: p<0.05にて有意差あり)。

0025

以下、本発明を詳細に説明する。

0026

乳酸菌
本発明のラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌は、ラクトバチルスGG株(ATCC53103)よりIgAの産生促進作用が高く、且つリステリアEGD株よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低いことを特徴とする。

0027

本発明の乳酸菌は、好ましくは、グルコース、フルクトース、スクロース、トレハロース及びグルコン酸塩に対する資化性を示す乳酸菌である。また、本発明の乳酸菌は、好ましくは、分離源がミツバチ又は養蜂産品(ミツバチ産品)である乳酸菌である。本発明において養蜂産品とは、蜜蜂を飼育することにより得られる生産品を意味し、そのようなものとしては、例えば、蜂蜜ローヤルゼリープロポリスミツロウ、蜂パン、花粉荷、蜂の子、それらの加工品(例えば抽出エキスなど)などが挙げられるが、本発明の乳酸菌としては、花粉荷を分離源とするものが特に好ましい。

0028

ラクトバチルスGG株(ATCC53103)は、クローン病の患者などが経口摂取することにより優れたIgA産生能が得られることについての多くの報告がある(Annals of Nutrition and Metabolism 1996;40:137-145、Pediatric Research 1992;32:141-144、Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition 1995;20:333-338、FEMS Immunology and Medical Microbiology 2000;29:47-52)。そのため、当該ラクトバチルスGG株よりIgA産生促進作用が高ければ、IgA産生促進作用が顕著に優れると考えられる。

0029

また、リステリア(Listeria monocytogenes)はリステリア症の原因細菌となるグラム陽性桿菌であり、細胞性感染防御免疫生菌でしか誘導されず、死菌免疫では容易に成立させることはできない(日本細菌学雑誌、64(4):365-376、2009)。

0030

一方、生菌程ではないが、リステリアEGD株の死菌も、マイトジェン活性やIL-2誘導能を有している(Immunology 1987;62:241-248)。しかしながら、実際、加熱殺菌は多くの食中毒菌と同様にリステリアに有効で、食中毒予防の手段として広く知られている。そのため、リステリアEGD株の死菌よりマイトジェン活性及びIL-2産生促進作用が低ければ、免疫学的に安全な物質であると考えられる。

0031

本発明のラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌の具体例は、本発明者らが花粉荷から単離及び同定したラクトバチルス・クンキーBPS402株又はラクトバチルス・クンキーBPS104株である(以下、単にBPS402株、BPS104株と記載することもある)。これらの乳酸菌の菌株は、2011年10月3日に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(日本国県つくば市東1丁目1番地1中央第6(郵便番号305-8566))に、それぞれ受託番号FERM P-22177、FERM P-22176として寄託されている。また、これらの菌株は、現在国際寄託に移管されており、それぞれの受託番号はFERM BP-11439、FERM BP-11438である。

0032

BPS402株、BPS104株の菌学的性質及び遺伝学的性質は以下の通りである。

0033

・ラクトバチルス・クンキーBPS402株
<菌学的性質>
A.形態的性状
細胞形態:桿菌(0.7-0.8×1.5-2.0μm)
グラム染色陽性
コロニー色調クリーム色
MRS寒天平板培地による48時間培養(30℃)
B.糖類発酵性(api 50CHを使用) 48時間培養後に判定(陽性:+、陰性:−)
0コントロール
1グリセロール
2エリスリトール
3 D-アラビノース
4 L-アラビノース −
5 D-リボース
6D-キシロース
7 L-キシロース
8 D-アドニトール
9メチル-β-D-キシロピラノシド
10 D-ガラクトース
11 D-グルコース+
12 D-フルクトース+
13 D-マンノース
14L-ソルボース
15L-ラムノース
16ズルシトール
17イノシトール
18 D-マンニトール
19D-ソルビトール
20 メチル-α-D-マンノピラノシド
21 メチル-α-D-グルコピラノシド
22N-アセチルグルコサミン
23アミグダリン
24アルブチン
25エスクリンクエン酸第二鉄
26サリシン
27 D-セロビオース
28 D-マルトース
29 D-ラクトース
30 D-メリビオース
31 D-スクロース+
32 D-トレハロース+
33イヌリン
34 D-メレジトース
35 D-ラフィノース
36スターチ
37グリコーゲン
38キシリトール
39ゲンチオビオース
40 D-ツラノース
41 D-リキソース
42 D-タガトース
43 D-フコース
44L-フコース
45 D-アラビトール
46 L-アラビトール −
47グルコネート +
48 2-ケト-グルコネート −
49 5-ケト-グルコネート −

0034

<遺伝学的性質>
BPS402株の16S rDNAの塩基配列配列表の配列番号1に示す。BPS402株の16S rDNAの配列は、既知種の基準株であるラクトバチルス・クンキーYH-15(JCM16173)株と100%の同一性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ラクトバチルス・クンキーとクラスターを形成し、両者は同一の分子系統学的位置を示した。これらの結果から、BPS402株はラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌であると判断された。

0035

・ラクトバチルス・クンキーBPS104株
<菌学的性質>
A.形態的性状
細胞形態:桿菌(0.6-0.7×1.2-1.5μm)
グラム染色:陽性
コロニー色調:乳白
MRS寒天平板培地による72時間培養(30℃)
B.糖類発酵性(api 50CHを使用) 48時間培養後に判定(陽性:+、陰性:−)
0コントロール−
1グリセロール−
2エリスリトール−
3 D-アラビノース−
4 L-アラビノース −
5 D-リボース−
6D-キシロース−
7 L-キシロース−
8 D-アドニトール−
9メチル-β-D-キシロピラノシド−
10 D-ガラクトース−
11 D-グルコース+
12 D-フルクトース+
13 D-マンノース−
14L-ソルボース−
15L-ラムノース−
16ズルシトール−
17イノシトール−
18 D-マンニトール?
19D-ソルビトール−
20 メチル-α-D-マンノピラノシド−
21 メチル-α-D-グルコピラノシド−
22N-アセチルグルコサミン−
23アミグダリン−
24アルブチン−
25エスクリンクエン酸第二鉄−
26サリシン−
27 D-セロビオース−
28 D-マルトース−
29 D-ラクトース−
30 D-メリビオース−
31 D-スクロース+
32 D-トレハロース+
33イヌリン−
34 D-メレジトース−
35 D-ラフィノース−
36スターチ−
37グリコーゲン−
38キシリトール−
39ゲンチオビオース−
40 D-ツラノース−
41 D-リキソース−
42 D-タガトース−
43 D-フコース−
44L-フコース−
45 D-アラビトール−
46 L-アラビトール −
47グルコネート +
48 2-ケト-グルコネート −
49 5-ケト-グルコネート −

0036

<遺伝学的性質>
BPS104株の16S rDNAの塩基配列を配列表の配列番号2に示す。BPS104株の16S rDNAの配列は、既知種の基準株であるラクトバチルス・クンキーYH-15(JCM16173)株と99.9%の同一性を示した。また、簡易分子系統解析の結果、ラクトバチルス・クンキーとクラスターを形成し、両者は同一の分子系統学的位置を示した。これらの結果から、BPS104株はラクトバチルス・クンキーに属する乳酸菌であると判断された。

0037

上記のBPS402株、BPS104株とラクトバチルス・クンキー(JCM16173)の糖類発酵性試験のデータをまとめたものを以下の表1に示す。表1からBPS402株とBPS104株の糖類発酵性は既知の菌株のものと相違していることが分かる。

0038

0039

ランダム増幅多型DNA(RAPD)分析を、プライマー5'-CCGCAGCCAA-3'を使用して次の反応条件で行った。プリインキュベーション:94℃2分間、増幅:94℃1分間、30℃1分間、72℃1.5分(40サイクル)、プライマー伸張:74℃5分間(1サイクル)

0040

結果を図1に示す。図1の結果から、BPS402株及びBPS104株のRAPDパターンが、既知のラクトバチルス・クンキーの菌株とは異なることが分かる。

0041

これらの結果から、BPS402株とBPS104株は新規なラクトバチルス・クンキーの菌株であると判断される。

0042

これら菌株の培養方法は常法に従って行うことができる。培地は、これらの菌株が培養できるものであれば特に制限はなく、天然培地合成培地半合成培地などの培地を使用することができるし、牛乳やローヤルゼリーなどを培地として使用することもできる。培地としては、窒素源及び炭素源を含有するものを使用することができ、窒素源としては、肉エキスペプトンカゼイン酵母エキスグルテン大豆粉大豆加水分解物アミノ酸等が挙げられ、炭素源としては、グルコース、ラクトース、フラクトース、イノシトール、ソルビトール水飴澱粉、麹フスマ、バカス糖蜜等が挙げられる。その他、無機質(例えば、硫酸アンモニウムリン酸カリウム塩化マグネシウム食塩炭酸カルシウム、鉄、マンガンモリブデン)、各種ビタミン類などを添加することができる。

0043

培養温度は通常4〜45℃、好ましくは30〜37℃であり、培養時間は通常8〜72時間程度であり、通気振盪又は通気撹拌してもよく、培地のpHは通常4.0〜9.0、好ましくは6.0〜8.0である。

0044

培養方法としては、例えば、MRS培地に1%の菌体を植菌し、37℃で24時間培養することが挙げられる。

0045

食品組成物
本発明の食品組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。当該食品組成物には、動物(ヒトを含む)が摂取できるあらゆる食品組成物が含まれる。

0046

本発明の食品組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体のいずれの状態でも使用することができる。乳酸菌としては、単離した菌体を用いてもよいし、菌体の培養物及び発酵物を用いてもよい。

0047

乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥(凍結乾燥真空乾燥噴霧乾燥など)、凍結溶菌、破砕、抽出等されたものが挙げられる。更に、菌体処理物としては、超音波などにより破砕処理を行った菌体破砕物除タンパクを行った後の上清菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。

0048

上記乳酸菌は単体で使用することもできるが、他の微生物と混合して使用してもよい。

0049

本発明の食品組成物には、上記乳酸菌又は菌体処理物をそのまま使用することもできるが、必要に応じて、ミネラル類、ビタミン類、フラボノイド類キノン類ポリフェノール類、アミノ酸、核酸必須脂肪酸清涼剤結合剤甘味料崩壊剤滑沢剤着色料香料安定化剤防腐剤徐放調整剤、界面活性剤溶解剤湿潤剤等を配合することができる。

0050

本発明の食品組成物の種類は、特に限定されず、例えば、乳製品発酵食品(ヨーグルト、ローヤルゼリー等);飲料類(コーヒージュース茶飲料のような清涼飲料乳飲料乳酸菌飲料、乳酸菌入り飲料、ヨーグルト飲料炭酸飲料日本酒、洋酒、果実酒のような酒等);スプレッド類(カスタードクリーム等);ペースト類(フルーツペースト等);洋菓子類(チョコレートドーナツパイシュークリームガムゼリーキャンデークッキー、ケーキ、プリン等);和菓子類(大福、餅、饅頭カステラ、あんみつ羊羹等);氷菓類(アイスクリームアイスキャンデーシャーベット等);食品類(カレー丼、雑炊味噌汁スープミートソースパスタ漬物ジャム、ローヤルゼリー等);調味料類(ドレッシング、ふりかけ、旨味調味料、スープの素等)などが挙げられる。

0051

本発明の食品組成物の製法も特に限定されず、適宜公知の方法に従うことができる。例えば、前記のような食品組成物の製造工程における中間製品、又は最終製品に、上記乳酸菌又は菌体処理物を混合又は噴霧等することにより食品を得ることができる。また、上記乳酸菌を用いて牛乳などの獣乳乳原料等の発酵を行うことにより発酵製品、乳酸菌飲料、及び乳酸菌入り飲料を製造することができる。また、上記乳酸菌によりローヤルゼリーの発酵を行うことで、ローヤルゼリーの発酵食品も製造することができる。

0052

また、本発明の食品組成物は、健康食品、機能性食品栄養補助食品サプリメント保健用食品、特定保健用食品又はプロバイオティック製品としても使用できる。サプリメントとして使用する際の投与単位形態については特に限定されず適宜選択できるが、例えば錠剤カプセル剤顆粒剤液剤散剤等が挙げられる。

0053

本発明の食品組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含量は、食品組成物全量中1×10-7〜100重量%、好ましくは1×10-5〜100重量%、より好ましくは1〜100重量%の範囲から適宜選択することが可能である。

0054

本発明の食品組成物の摂取量は、摂取者の体重、年齢性別、症状などの種々の条件に応じて適宜設定することができるが、例えば、乳酸菌の菌数で表すと、一日当たりの摂取量としては1×106個以上、好ましくは1×109個以上、より好ましくは1×1012個以上を挙げることができる。

0055

医薬組成物
本発明の医薬組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。本発明の医薬組成物は、乳酸菌製剤と称することができる。

0056

本発明の医薬組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体のいずれの状態でも使用することができる。乳酸菌としては、単離した菌体を用いてもよいし、菌体の培養物及び発酵物を用いてもよい。

0057

乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥(凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥など)、凍結、溶菌等されたものが挙げられる。更に、菌体処理物としては、超音波などにより破砕処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。

0058

また、上記乳酸菌は単体で使用することもできるが、他の微生物と混合して使用してもよい。

0059

医薬組成物として調製する場合、上記乳酸菌又は菌体処理物をそのまま使用するか、又は医薬品において許容される無毒性担体希釈剤若しくは賦形剤とともに、タブレット(素錠糖衣錠発泡錠フィルムコート錠チュアブル錠トローチ剤などを含む)、カプセル剤、丸剤粉末剤(散剤)、細粒剤、顆粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液シロップ、ペースト、注射剤(使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液電解輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む)などの形態に調製して、医薬用の製剤にすることが可能である。

0060

本発明の医薬組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含量は、医薬組成物全量中1×10-7〜100重量%、好ましくは1×10-5〜100重量%、より好ましくは1〜100重量%の範囲から適宜選択することが可能である。

0061

本発明の医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができるが、例えば、乳酸菌の菌数で表すと、一日当たりの服用量としては1×1010個以上、好ましくは1×1011個以上、より好ましくは1×1012個以上を挙げることができる。

0062

本発明の乳酸菌又は菌体処理物は、気道若しくは食道の粘膜から侵入してくる病原体若しくはウイルスに対する感染予防用の免疫賦活剤、又は食中毒の予防若しくは緩和用の腸管免疫賦活剤として使用することもできる。気道若しくは食道の粘膜から侵入してくるウイルスとしては、これに限定されるものではないが、インフルエンザウイルス等が挙げられる。

0063

本発明の食品又は医薬組成物は、整腸、美容、又はアンチエイジング、並びに炎症性腸疾患(好ましくは、クローン病又は潰瘍性大腸炎)の予防及び/又は治療に有用である。

0064

化粧品組成物
本発明の化粧品組成物は、上記乳酸菌又は菌体処理物を必須成分として含有する。

0065

本発明の化粧品組成物において乳酸菌は、生菌体又は死菌体のいずれの状態でも使用することができる。乳酸菌としては、単離した菌体を用いてもよいし、菌体の培養物及び発酵物を用いてもよい。

0066

乳酸菌の菌体処理物としては、乳酸菌が、例えば、加熱、ペースト化、乾燥(凍結乾燥、真空乾燥、噴霧乾燥など)、凍結、溶菌等されたものが挙げられる。さらに、菌体処理物としては、超音波などにより破砕処理を行った菌体破砕物に除タンパクを行った後の上清、菌体培養物及び発酵物の固形分を除去した上清等も含まれる。

0067

また、上記乳酸菌は単体で使用することもできるが、他の微生物と混合して使用してもよい。

0068

本発明の化粧品組成物には、動物(ヒトを含む)の皮膚、粘膜、体毛頭髪頭皮、爪、歯、顔皮、口唇等に適用されるあらゆる化粧品組成物が含まれる。

0069

本発明の化粧品組成物における上記乳酸菌又は菌体処理物の含量は、化粧品組成物全量中1×10-10〜100重量%、好ましくは1×10-6〜50重量%、より好ましくは1×10-2〜10重量%の範囲から適宜選択することが可能である。

0070

本発明の化粧料には、上記乳酸菌又は菌体処理物以外に、通常化粧品に用いられる成分、例えば、美白剤保湿剤酸化防止剤、油性成分、紫外線吸収剤、界面活性剤、増粘剤アルコール類粉末成分色材水性成分、水、各種皮栄養剤等を必要に応じて適宜配合することができる。

0071

本発明の化粧品組成物の剤型は、水溶液系可溶化系乳化系粉末系、油液系、ゲル系軟膏系、エアゾール系、水−油2層系、水−油−粉末3層系等、幅広い剤型を採り得る。

0073

本発明の化粧品組成物は、美白効果保湿効果などのアンチエイジング効果などが期待できる。

0074

以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。

0075

ラクトバチルス・クンキーBPS402株とBPS104株のスクリーニング
菌の分離に用いた培地は、MRS培地(又はROGOSA培地)であり、必要に応じてリンゴジュースオレンジジューストマトジュース又はグレープジュースのいずれかを最終濃度25%となるように混ぜ、酢酸水酸化ナトリウムを用いてpH4.5に調整した。調製した培地に、花粉荷を適宜希釈し、インキュベータ内にて、25〜37℃で培養を開始した。2〜3日間培養後、炭酸カルシウム入りのMRS寒天培地画線法にて広げ、更に、同様の温度にて2〜3日間培養し、乳酸産生によりクリアゾーンを有するシングルコロニー複数株得た。得られたコロニーを、MRSにて培養後、10%グリセロールストックとして、-80℃にて凍結保存した。

0076

特に、今回の試験例では、IgA産生量がO.D.=0.2以上であり、且つマイトジェン活性とIL-2産生がSI値で1.2以下をスクリーニングの指標とした。なお、マイトジェン活性とIL-2産生については、無刺激のSI値を1.0とした。

0077

試験例
試験例1
実験方法
・動物の飼育・飼養
検疫検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢のBALB/c雌マウスを使用した。試験に用いる動物は、ほぼ同体重又は予備飼育期間中の体重変動がほぼ同様の動きを示した個体を選択した。

0078

・細胞の調製
実験動物の飼育と飼養に関する法律に則り、麻酔処理した動物より採血を行い、放血させた。放血後、脾臓及び小腸(盲腸回盲部を含む)を摘出し、1%BSA含有Hank's液の入ったシャーレに移し、氷冷保存した。脾臓より脾臓由来リンパ球(SPL)、小腸よりパイエル氏板由来リンパ球(PPL)を回収し、各細胞を1×106/mL となるように10%RPMI-1640培地に再懸濁した。

0079

・細菌の調製
細菌株ミューラーヒントン寒天培地に画線し、37℃孵卵器で16時間培養した。寒天培地上発育した単一の細菌集落より白金線にて釣菌し、新たなミューラーヒントン寒天培地に画線し、37℃孵卵器で16時間培養した。マクファーランド濁度(McFarland;MCF) 3.0を目安にTS液体培地中に細菌集落を溶解し、細菌懸濁液を調製した。菌液の一部は、10倍階段希釈法にて菌数を測定した。調製した細菌懸濁液を100℃、30分間加熱処理を行い、次項に示す被験物質とした。対照細菌株にはListeria monocyotogenes (EGD株)を使用し、上述した画線培養と同様の操作を行い、MCF3.0を目安に細菌懸濁液を調製した。さらに、調製した細菌懸濁液を100℃、30分間加熱処理を行い、次項に示す対照株とした。

0080

・IgA産生能測定試験
回収したPPLに対して被験物質による抗原刺激を行い、刺激後48時間後に培養上清の回収を行った。回収した培養上清中のIgAをELISA法にて測定した。

0081

リンパ球幼若化試験
回収したSPLをBrdU-Thymidine存在下でマイトゲン刺激(PWM終濃度5μg/mL)又は被験物質による抗原刺激を行い、BrdU-Thymidineの取込量を測定した。また、同様の系にて培養上清を回収し、CTLL-2細胞による細胞増殖能試験を行った。

0082

<結果および考察>
(IgA抗体産生能)
被験物質を用いてパイエル氏板細胞への刺激を行った。48時間刺激後の培養上清をIgA抗体測定用ELISAプレートに添加し、IgA抗体産生能を評価した。なお、パイエル氏板細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照のO.D.値を基準に被験物質毎のO.D.値を評価した。結果を図2に示す。

0083

BPS402株とBPS104株のO.D.値は、0.243、0.242であり、対照株であるListeria monocyotogenesを用いた場合のO.D.値は0.107であった。

0084

(リンパ球幼若化反応)
・BrdU取込を指標とした脾臓細胞増殖反応
被験物質を用いて脾臓細胞への刺激を行った。蛍光標識したBrdU-Thymidineの取込量をフローサイトメータによる蛍光強度により評価した。なお、脾臓細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照の蛍光強度を基準に被験物質毎の蛍光強度を評価した。結果を図3に示す。

0085

BPS402株とBPS104株のS.I.値は、1.2、0.9であり、対照株であるListeria monocyotogenesを用いた幼若化反応のS.I.値は2.1であった。

0086

・CTLL-2細胞増殖反応を指標とした被験物質の評価
上記の試験で得られた培養上清中のIL-2測定をCTLL-2細胞を指標に行った。測定に関しては、CTLL-2細胞のBrdU-Thymidineの取込量をフローサイトメータによる蛍光強度により評価した。なお、脾臓細胞無刺激の状態を陰性対照とし、陰性対照の蛍光強度を基準に被験物質毎の蛍光強度を評価した。結果を図4に示す。

0087

BPS402株とBPS104株のS.I.値は、1.1、1.0であり、対照株であるListeria monocyotogenesを用いた幼若化反応のS.I.値は1.4であった。

0088

BPS402株とBPS104株について、乳酸菌加熱死菌体では、T細胞の免疫応答を誘導する強力なマイトジェン活性は認められなかった。細胞内寄生性細菌であるListeria死菌と比較しても、細胞増殖反応及びIL-2産生能は極めて低く、非特異的に細胞性免疫を誘導する能力はない。すなわち、宿主における免疫活性を常に向上させるものではなく、免疫学的に安全な物質であると思われる。

0089

乳酸菌加熱死菌体では、パイエル氏板細胞のIgA産生を誘導する可能性が示唆された。そのため、気道粘膜や食道粘膜などの粘膜上皮にIgA抗体をより多く配備させる可能性が考えられ、経口・経鼻侵入してくる病原体(ウイルスなど)に対して、感染を防御するのに有効であると考えられる。

0090

試験例2
試験方法
1.ウイルスの調製
超低温冷凍庫に凍結保存してあるインフルエンザウイルス(IFVA, PR/8/34(H1N1)株)を細胞増殖培地で培養したMDCK細胞にM.O.I. (Multiplicity of infection) 0.01で感染させ、37℃, 5% CO2存在下で72時間培養した(1継代)。連続して5代継代したものを大量培養し、蔗糖密度勾配超高速遠心法によりウイルス液を分離精製した後、使用時まで超低温冷凍庫にて保存した。ウイルス液の一部は10倍階段希釈法にて細胞変性効果を確認し、ウイルス感染力価(TCID50)並びにプラーク形成単位(pfu:plaque forming unit)を測定した。

0091

2.生存率解析
a被験物質の経口投与
検疫及び検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢の雌性BALB/cマウスに、被験物質をマウス1匹当たり0.2 mLずつ1回強制経口投与した。被験物質の濃度は1 mg/kgに設定し、被験物質の強制経口投与は試験期間を通じて1日1回行い、これをIFVA感染後の試験期間終了時まで継続した。なお、陰性対照には生理食塩水を用い、被験物質と同様の経口投与を行った。

0092

b 群分け
試験群は、2群にて構成し、詳細は下表の通りとした。2群には調製したIFVAを経鼻接種し、ウイルス接種が確実に行われた動物を各群に20 匹ずつ割り付けた。なお、群分けの指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時層別無作為に割り付けた。

0093

0094

c IFVA の接種
被験物質を3週間連続強制経口投与した9週齢の雌性BALB/cマウスを使用し、動物番号順に生理食塩水にて希釈したペントバルビタールナトリウム(5.0 mg/mL;共立製薬株式会社(商品名;ソムノペンチル麻酔用注射液))を50 mg/kg にて腹腔内に注射し、全身麻酔を施した。麻酔下において、調製したIFVA をマウスの右鼻腔に103 pfu/20μLずつ経鼻的に接種した。

0095

d生存率の測定
生存率の測定には、IFVA接種後3週間の経過観察を行った。経過観察中生存した個体数を群当たりの総数で除した値に100を乗じた値を生存率とした。

0096

3.免疫学的解析
a被験物質の経口投与
検疫・検収の終了後、1週間予備飼育を行った6週齢の雌性BALB/cマウスに、被験物質をマウス1匹当たり0.2 mLずつ1回強制経口投与した。被験物質の濃度は100 mg/kg のみとし、被験物質の強制経口投与は試験期間を通じて1日1回行い、これをIFVA感染後の試験期間終了時まで継続した。なお、陰性対照には生理食塩水を用い、被験物質と同様の経口投与を行った。

0097

b 群分け
試験群は、ウイルス接種群2群およびウイルス非接種群2群の計4群にて構成し、詳細は下表の通りとした。ウイルス接種群の2群には調製したIFVAを経鼻接種し、ウイルス接種が確実に行われた動物を各群に50匹ずつ割り付けた。ウイルス非接種群の動物数は各群10匹とした。なお、群分けの指標には動物番号を用い、被験物質投与開始時に層別無作為に割り付けた。

0098

0099

c IFVA の接種
被験物質を3週間連続強制経口投与した9週齢の雌性BALB/cマウスを使用し、動物番号順に生理食塩水にて希釈したペントバルビタールナトリウム(5.0 mg/mL;共立製薬株式会社(商品名;ソムノペンチル麻酔用注射液))を50 mg/kgにて腹腔内に注射し、全身麻酔を施した。麻酔下において、調製したIFVAをマウスの右鼻腔に102 pfu/20μLずつ経鼻的に接種した。なお、ウイルス非接種群には、生理食塩水を同様に20μLずつ経鼻的に注入した。

0100

d組織サンプルの回収
IFVA 感染0日後(d0)及び14日後(d14)に各群8匹ずつ動物を屠殺した。各群5匹からは、肺胞-気管支洗浄液(BALF)を回収した。各群3匹からは、無処置のまま肺臓を摘出して10%(v/v)ホルマリン液にて保存した。

0101

e肺臓ウイルスゲノムRNA量の測定
各群5匹より処置後の肺臓を摘出し、gentleMACS dissociator (Miltenyi Biotec)を用いて細胞懸濁液を作成した。調製した細胞懸濁液からISOGEN IIを用いて、肺臓由来全RNAを抽出した。抽出したRNAについてはUni12 primer (Hoffmann E. et al. Arch Virol. 2001.)を用いた逆転写反応を行い、ウイルスゲノムRNAを選択的に増幅した後、ウイルスNP遺伝子に対する特異的プライマーを用いたリアルタイムPCR法により、肺臓におけるウイルスゲノムRNA量を測定した。

0102

f 抗体測定
回収したBALFについては遠心操作を実施し、上清と細胞成分に分離した。上清については解析実施時まで超低温冷凍庫にて保存した。BALF上清の抗体について、ELISA法にて測定した。測定項目は、抗インフルエンザウイルス特異的IgAとした。

0103

4.統計処理について
生存率解析における群間の比較はLogrank検定にて実施し、有意水準は両側5%とした。その他の試験における群間の有意差はStudentのt検定にて行い、有意水準は両側5%とした。

0104

<結果及び考察>
1.生存率解析(図5)
実験対照群である生理食塩水投与群については、試験終了時の生存率は25.0%であった。被験物質(乳酸菌末BPS402;以下BPS402) 1 mg/kg投与群については、試験終了時の生存率は55.0%であった。BPS402 1 mg/kg投与群ではLogrank検定(p=0.0465)にて、実験対照群との比較により有意差が認められた。

0105

以上の結果から、BPS402投与群では実験対照群に比較して、IFVA感染抵抗性を示す傾向が認められた。また、非特許文献4(Letters in Applied Microbiology 2010;50:597-602)では、LGGの200μg/mouseの投与によりインフルエンザウイルスの予防効果が得られているのに対して、BPS402では20μg/mouse (マウス体重20 gとして)で予防効果が得られていることから、BPS402はLGGの10分の1の用量で効果が認められた。

0106

2.免疫学的解析
a肺臓ウイルスゲノムRNA量の測定(図6)
BPS402投与群におけるウイルス量の推移は、感染14日後について有意な減少が認められた。

0107

b 抗体測定(図7)
IFVA感染マウスのBALFに関して、感染14日後のインフルエンザウイルス特異的IgAについては、BPS402投与群で有意に増加していた。

0108

BPS402投与マウスを用いたin vivoでの免疫学的な解析の結果、BPS402投与群では、感染後期における肺胞-気管支におけるインフルエンザウイルス特異的分泌型IgAの上昇、感染後期における排ウイルス作用の促進の現象が認められた。BPS402は特にB細胞系列形質細胞に強く作用し、インフルエンザウイルス特異的IgAを効率良く分泌させることにより、速やかな感染の収束を担っている可能性が示唆された。

0109

試験例3
本試験ではラクトバチルス・クンキーBPS402のヒトにおける有効性及び安全性の確認を行った。

0110

便秘傾向であること以外は健常である一般有ボランティアを対象とし、二重盲検法によるプラセボ比較対照試験を実施した。被験者は40以上の有償ボランティアとし、この被験者を各項目がなるべく均等になるように2群に割付け、BPS402群7名、プラセボ群7名とした。摂取量はいずれも1日5錠(1,000 mg)、摂取期間は4週間とした。

0111

<有効性>
BPS402摂取前後において唾液中sIgA(μg/min)が有意に上昇していた。sIgAは粘膜系における重要な免疫機能を持つ免疫グロブリンとして広く知られており、上気道感染症においてその感染リスクを低減しうると考えられている。

0112

また、VAS (Visual Analog Scale)法により、肌の乾燥について、その程度を0〜100 mmの直線状に示した結果を解析したところ、BPS402摂取前後で有意に肌の乾燥が改善し、保湿作用が確認された。

0113

<安全性>
BPS402の摂取により安全性について特すべき問題は生じなかった。

0114

製造例
以下、本発明の組成物の製造例を示す。

0115

(乳酸菌末の製造例)
グルコースを2%、酵母エキスを5%含む1,000Lの培地をpH6.5に調整し、既に前培養しておいたBPS104培養液を1%植菌した。適宜、途中でpHを調整しながら、30〜37℃にて、24〜48時間培養したものを菌体培養液とした。その菌体培養液を遠心分離し、菌体1重量部に対して1重量部の水を加えた後、凍結乾燥し、固形物粉砕機によって粉砕することで、BPS104菌体末1 kgを得た。

0116

(乳酸菌カプセルの製造例)
乳酸菌BPS104粉末400 gとショ糖脂肪酸エステル20 gを混合し、充填機にてハードカプセル充填し、2,000粒の乳酸菌BPS104カプセルを得た。

0117

(乳酸菌発酵エキスの製造例)
実施例1
ローヤルゼリーを終濃度5%に希釈した希釈液1,000 mLを、pH6.5に調整した後、既に前培養しておいたBPS402培養液を1%植菌した。30℃にて、48時間培養後、遠心分離によって残渣を除き、ローヤルゼリー発酵エキス800 mLを得た。

0118

実施例2
実施例1と同様に、酵素処理ローヤルゼリーを終濃度5%に希釈した希釈液1,000 mLから、酵素処理ローヤルゼリー発酵エキス800 mLを得た。

0119

実施例1及び2で得られた発酵エキスについて以下5項目の試験を行った。効果がない場合を−とし、わずかな効果しかない場合を−/+、また、効果がある場合を低い効果から順に+〜+++の3段階で評価し、その結果を表4に示した。

0120

<pH低減>
48時間後の発酵エキスを、pHメーターにて評価した。

0121

<残渣抑制>
48時間後の培養液を、発酵前と比較し、評価した。

0122

<生菌維持>
48時間後の培養液を懸濁後、適宜希釈し、MRS寒天培地に塗り広げ、評価した。

0123

メラニン産生抑制
(i)PBS20 mlとポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル(Triton X-100) 0.2 mlを混合し撹拌した。
(ii) PBS 10 mlとL-DOPA19.7 mlを混合しアルミホイルで巻き攪拌した。
(iii)発酵エキスと2日間培養したB16メラノーマ細胞(3000 cells/well)に、(i)を90μl, (ii)を10μl添加し、マイクロプレートリーダーで0, 60分の吸光度(490 nm)を測定し、評価した。

0124

酸化抑制
メラニン産生抑制試験から5日後の培地の色を目視にて確認し、DOPAの酸化を評価した。

0125

実施例

0126

(乳酸菌発酵エキス化粧水の製造例)
クエン酸ナトリウム0.1%、ピロリドンカルボン酸ナトリウム1.0%、1,3-ブチレングリコール5.0%となるように、精製水にそれぞれを50℃で混合した溶液1000 mLに、POE(30)POP(6)デシルテトラデシルエーテル(NIKKOL PEN-4630)を0.6%配合して100 mLとしたエタノールを、撹拌しながら徐々に加えて可溶化した。撹拌しながら冷却し30℃まで下げ、最後に0.5%となるよう、実施例2の乳酸菌発酵エキスを加え、1000 mLの乳酸菌発酵エキス化粧水を得た。

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