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課題

植物害虫蔓延を軽減する方法を提供する。

解決手段

生物中にdsRNAまたはdsRNAを産生できるDNAを導入する方法であって、適当な転写因子プロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にDNA配列二本鎖RNAへの転写が開始できるように該DNA配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクターを含む適当な微生物を該生物に与えるか、または該生物に直接、該発現ベクターを与えることを特徴とする方法。

概要

背景

最近、Nature Vol 391, pp 806-811, Februaray 98に、細胞への二本鎖RNAの導入が細胞内の内因性遺伝子発現の強力かつ特異的な妨害をもたらし、この妨害が、アンチセンス技術で提案されているような、どちらかのRNA鎖を個々に提供するよりも、実質的により効率的であることが記載されている。この遺伝子活性の特異的減少は、線虫カエノラブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)のゲノムまたは体腔にRNAを導入した場合も起こることが判明した。

概要

植物害虫蔓延を軽減する方法を提供する。生物中にdsRNAまたはdsRNAを産生できるDNAを導入する方法であって、適当な転写因子プロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にDNA配列の二本鎖RNAへの転写が開始できるように該DNA配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクターを含む適当な微生物を該生物に与えるか、または該生物に直接、該発現ベクターを与えることを特徴とする方法。なし

目的

最近、Nature Vol 391, pp 806-811, Februaray 98に、細胞への二本鎖RNAの導入が細胞内の内因性遺伝子発現の強力かつ特異的な妨害をもたらし、この妨害が、アンチセンス技術で提案されているような、どちらかのRNA鎖を個々に提供する

効果

実績

技術文献被引用数
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牽制数
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請求項1

生物中にdsRNAまたはdsRNAを産生できるDNAを導入する方法であって、適当な転写因子プロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にDNA配列二本鎖RNAへの転写が開始できるように該DNA配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクターを含む適当な微生物を該生物に与えるか、または該生物に直接、該発現ベクターを与えることを特徴とする方法。

請求項2

該発現ベクターが該DNA配列にフランキングな2つの同じプロモーターを含む請求項1記載の方法。

請求項3

該発現ベクターが該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向した該DNA配列を含む請求項1記載の方法。

請求項4

該発現ベクターがさらに、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む請求項1〜3のいずれか1項記載の方法。

請求項5

該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、該プロモーター(類)に適当な転写因子が結合した場合にヌクレオチド配列の二本鎖RNAへの転写が起こるように該プロモーター(類)に対して配向している請求項4記載の方法。

請求項6

該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のdsRNAへの転写が開始できるように、2つの同じプロモーターの間に提供される請求項5記載の方法。

請求項7

該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のdsRNAへの転写が起こるように、該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される請求項5記載の方法。

請求項8

該選択マーカーが、pha−1突然変異を有するシー・エレガンス中への導入のためのsup−35をコードするヌクレオチド配列を含む請求項4または5記載の方法。

請求項9

該微生物または生物を該転写因子の発現適応させる請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。

請求項10

該微生物または生物のいずれかが請求項5〜8のいずれか1項記載の発現ベクターを含む請求項9記載の方法。

請求項11

該生物がシー・エレガンスであり、該微生物がイー・コリである請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。

請求項12

該イー・コリ株が、RNAアーゼIII陰性株である請求項11記載の方法。

請求項13

該生物が、シー・エレガンスnuc−1突然変異体である請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。

請求項14

適当な転写因子がプロモーターまたはプロモーター類に結合した場合にDNA配列の二本鎖RNAへの転写が開始できるように該DNA配列に対して配向した該プロモーターまたはプロモーター類を含む発現ベクター。

請求項15

該DNA配列にフランキングな2つの同じプロモーターを含む請求項14記載の発現ベクター。

請求項16

該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向した該DNA配列を含む請求項14記載の発現ベクター。

請求項17

さらに、選択マーカーをコードするヌクレオチド配列を含む請求項14〜16のいずれか1項記載の発現ベクター。

請求項18

該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、該プロモーター(類)に適当な転写因子が結合した場合にヌクレオチド配列の二本鎖RNAへの転写が起こるように該プロモーター(類)に対して配向している請求項17記載の発現ベクター。

請求項19

該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のdsRNAへの転写が開始できるように、2つの同じプロモーターの間に提供される請求項18記載の発現ベクター。

請求項20

該選択マーカーをコードする該ヌクレオチド配列が、プロモーターへの転写因子の結合によりヌクレオチド配列のdsRNAへの転写が起こるように、該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される請求項18記載の発現ベクター。

請求項21

該選択マーカーが、pha−1突然変異を有するシー・エレガンス中への導入のためのsup−35をコードするヌクレオチド配列を含む請求項17または18記載の発現ベクター。

請求項22

列番号12または配列番号13として示されるヌクレオチド配列を含むプラスミド

請求項23

配列番号8または配列番号9として示されるヌクレオチド配列を含む酵母ハイブリッドベクタープラスミド。

請求項24

sup−35遺伝子のエクソン5がクローンされている請求項22記載のプラスミド。

請求項25

a)相互に対抗する2つのT7プロモーター、b)該2つのプロモーター間の制限部位または多クローニング部位、およびc)数個終止コドンを含むことによって完全長sup35タンパク質の発現を妨げるように操作された、シー・エレガンスsup35ゲノムDNAを含むプラスミド。

請求項26

請求項22〜25のいずれか1項記載のプラスミドで形質転換またはトランスフェクトされたか、または請求項14〜21のいずれか1項記載の発現ベクターで形質転換された細胞

請求項27

請求項22〜25のいずれか1項記載のプラスミドで形質転換またはトランスフェクトされたか、または請求項14〜21のいずれか1項記載の発現ベクターで形質転換された生物。

請求項28

微生物である請求項27記載の生物。

請求項29

細菌または酵母細胞である請求項28記載の微生物。

請求項30

線虫類の種である請求項27記載の生物。

請求項31

シー・エレガンスである請求項30記載の生物。

請求項32

植物害虫蔓延を軽減する方法であって、a)該害虫から、その生存生長、増殖に臨界的なDNA配列を同定し、b)工程a)からの配列またはそのフラグメントを適当なベクター中、プロモーター(類)に対して、該プロモーター(類)に適当な転写因子が結合すると、プロモーター(類)が該DNA配列のRNAまたはdsRNAへの転写を開始できるような配向にクローニングし、c)該ベクターを植物に導入することを特徴とする方法。

請求項33

プロモーターに転写因子が結合すると、DNAのdsRNAへの転写がもたらされるように2つのプロモーター間に該DNA配列が提供される請求項32記載の方法。

請求項34

プロモーターに転写因子が結合すると、DNAのdsRNAへの転写がもたらされるように該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で該DNA配列が提供される請求項33記載の方法。

請求項35

該害虫が線虫類である請求項32記載の方法。

請求項36

該線虫類がチレンクルス・エスピー(Tylenchulus ssp.)、ロドホルス・エスピー(Radopholus ssp.)、ラジナフェレンクス・エスピー(Rhadinaphelenchus ssp.)、ヘテロデラ・エスピー(Heterodera ssp.)、ロチレンクルス・エスピー(Rotylenchulus ssp.)、プラチレンクルス・エスピー(Pratylenchus ssp.)、ベロライムス・エスピー(Belonolaimus ssp.)、カンジャヌス・エスピー(Canjanus ssp.)、メロイドジン・エスピー(Meloidogyne ssp.)、グロボデラ・エスピー(Globodera ssp.)、ナコブス・エスピー(Nacobbus ssp.)、ジチレンクス・エスピー(Ditylenchus ssp.)、アフェレンコイデス・エスピー(Aphelenchoides ssp.)、ヒルシュメニエラ・エスピー(Hirschmenniella ssp.)、アンギナ・エスピー(Anguina ssp.)、ホプロライムス・エスピー(Hoplolaimus ssp.)、ヘリオチレンクス・エスピー(Heliotylenchus ssp.)、クリコネメラ・エスピー(Criconemella ssp.)、キシフィネマ・エスピー(Xiphinema ssp.)、ロンドルス・エスピー(Longidorus ssp.)、トリコドルス・エスピー(Trichodorus ssp.)、パラトリコドルス、エスピー(Paratrichodorus ssp.)、アフェレンチス・エスピー(Aphelenchs ssp.)のいずれかを含む請求項35記載の方法。

請求項37

該DNA配列またはそのフラグメントが2つの組織特異的、好ましくは根特異的プロモーターの間にクローンされる請求項33記載の方法。

技術分野

0001

本発明は、二本鎖RNA阻害dsRNAi)を用いる遺伝子機能の評価または同定、細胞において特定の表現型誘導する原因となるDNAの同定方法および公知の遺伝子配列に機能を割り当てる方法に関する。

背景技術

0002

最近、Nature Vol 391, pp 806-811, Februaray 98に、細胞への二本鎖RNAの導入が細胞内の内因性遺伝子発現の強力かつ特異的な妨害をもたらし、この妨害が、アンチセンス技術で提案されているような、どちらかのRNA鎖を個々に提供するよりも、実質的により効率的であることが記載されている。この遺伝子活性の特異的減少は、線虫カエノラブディティスエレガンス(Caenorhabditis elegans)のゲノムまたは体腔にRNAを導入した場合も起こることが判明した。

先行技術

0003

Nature Vol 391, pp 806-811, Februaray 98

発明が解決しようとする課題

0004

本発明者らは、この技術を利用し、例えば、ヒトゲノムプロジェクトのような種々のプロジェクトで配列決定され、これから個々の機能を与えるべき遺伝子またはDNAフラグメントに機能を割り当てる、また個々の表現型付与の原因となるDNAを同定するために用いる新規発明的方法を案出するために適用した。

課題を解決するための手段

0005

したがって、本発明の第1の態様によれば、細胞における個々の表現型付与の原因となるDNAの同定方法であって、a)該細胞のDNAのcDNAまたはゲノム・ライブラリーを、適当なベクター中、プロモーター(類)に対し、該プロモーター(類)に適当な転写因子が結合すると、該cDNAまたはDNAの二本鎖(ds)RNAへの転写を開始できる配向構築し、b)該ライブラリーを該転写因子を含む1つ以上の該細胞に導入し、c)該ライブラリーを含む該細胞の個々の表現型を同定・単離し、該表現型の付与の原因となるライブラリーから該DNAまたはcDNAフラグメントを同定することを特徴とする方法を提供される。
本発明の好ましい具体例においては、以下の実施例でさらに詳細に記載するように、工程b)の前に、例えば、遺伝子ファミリー包含するような、該ライブラリーを階層的プール組織化してもよい。

0006

本発明のさらなる態様によれば、公知のDNA配列に機能を割り当てる方法であって、a)細胞における該DNA配列のホモログ(類)を同定し、b)該細胞から適当なDNAホモログ(類)またはそのフラグメントを単離し、c)該ホモログまたはそのフラグメントを、適当なベクター中、プロモーター(類)に対し、該プロモーター(類)に適当な転写因子が結合すると、該ホモログまたはそのフラグメントのdsRNAへの転写を開始できる配向にクローニングし、d)該ベクターを、該転写因子を含む工程a)からの該細胞に導入し、e)野生型と比較して該細胞の表現型を同定することを特徴とする方法も提供される。

0007

本発明の各態様において、塩基またはDNA配列は、上記した特性を有する単一のプロモーターに対して、センスおよびアンチセンス配向で提供されても、また、2つの同じプロモーターの間に提供されてもよい。両具体例において、dsRNAは、プロモーターが適当な転写因子と結合した後、プロモーターから開始された転写により提供される。
本発明における細胞は、生物から由来したものでも、生物に含まれるものでもよい。細胞が生物に含まれるものであるばあい、生物は該適当な転写因子を発現するように適応される。生物は、植物、動物真菌類または酵母のいずれでもよいが、好ましくは線虫類、シー・エレガンスで、その野生型のいずれか、シー・エレガンスのnuc−1またはpha−ts突然変異体シー・エレガンスまたはこれらの突然変異の組み合わせであってよい。別の具体例において、DNAまたはcDNAライブラリーあるいはDNAホモログまたはそのフラグメントは、有利には、細菌または酵母細胞のような微生物中にトランスフェクトまたは形質転換され、生物、好ましくは線虫シー・エレガンスに与えることができる。本発明のこの具体例において、微生物は適当な転写因子を発現するように適応させることができる。好ましくは、微生物は、イー・コリ(E. coli)である。
本発明の各態様において、DNAライブラリー、DNAホモログまたはDNAフラグメントは、該転写因子をコードする塩基配列を含む適当なDNAベクター中で構築できる。別法として、該転写因子はさらなるベクターによりコードされる。さらなる別法として、細胞または生物が該転写因子を発現できるか、発現に適応させることができる。好ましくは、本発明において用いるいずれものベクターは、例えば、sup−35またはそのフラグメントをコードする塩基配列でよい選択マーカーを含む。該塩基配列は、プロモーターに対し、プロモーターに転写因子が結合するとDNAの二本鎖RNAへの転写を開始するように配向している。図10に、ベクターおよび、シー・エレガンスにおいて二本鎖PNAを産生させることの出来るDNA配列の配向を示す。すなわち、1つの具体例において、DNAはベクターの2つのプロモーターの間に位置し、プロモーターに適当な転写因子が結合すると、dsRNAを発現できる。別法として、ベクターは、プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で組織化されたDNA配列の2つのコピーを含み、そのマーカーは、pha−1突然変異体シー・エレガンスに含まれると、選択できる。好ましくは、プロモーターはT7、T3またはSP6プロモーターのいずれかで、転写因子が適当なポリメラーゼを含む。

0008

好ましくは、選択マーカーは、該細胞中で、遺伝子の発現を阻害または防止できる塩基配列を含み、その遺伝子が公知の表現型付与の原因となるものである。この塩基配列は、該表現型を付与する遺伝子の一部の、または同じ配列でよく、その塩基配列それ自体が、プロモーター(類)に適当な転写因子が結合すると二本鎖RNAの転写を開始できるように、適当なプロモーター(類)に対して配向している。別法として、該塩基配列が、該表現型を付与する遺伝子の一部のまたは同じ配列でよく、その塩基配列がそのまま、該細胞のゲノムにおける相同的組換えにより、該適当な、またはさらなるベクターの組み込みを可能にし、該組み込み後、該塩基配列が該表現型を付与する遺伝子の発現を阻害できる。この具体例において、該塩基配列は、該ゲノムへの組み込み後、該核酸翻訳を防止するのに十分な終止コドンを含む。
有利には、上記方法において、例えば、化合物に対する耐性または感受性を野生型と比較するような、所望の表現型のスクリーニングのために化合物を該細胞または生物に加えることができる。プロモーターは、好ましくは誘導的である。転写因子は、幾つかの具体例では、例えば、ファージプロモーターによって作動されるT7ポリメラーゼのようなファージ誘導でよい。しかし、シー・エレガンスを利用する場合、例えば、let858,SERCA、UL6、myo−2またはmyo−3のような虫特異性または組織特異性プロモーターも使用できる。好ましくは、イー・コリ株はRNAアーゼIIIであり、さらに好ましくは、RNAアーゼ陰性株である。

0009

本発明のさらなる態様は、外来性転写因子を含み、導入遺伝子が、該転写因子の結合により発現されるDNAフラグメントに操作可能に結合したプロモーターを含むトランスジェニック非ヒト生物産生方法であって、a)外来転写因子をコードするDNAを取り込んだ第1の構築物を含む第1のトランスジェニック生物および、該第1のトランスジェニック生物の転写因子が結合すると発現する所望のDNA配列に操作可能に結合した少なくとも1つのプロモーターを含む第2の構築物を含む第2のトランスジェニック生物を用意し、b)該第1および第2のトランスジェニック生物を交差させ、該所望のDNA配列を発現する子孫を選択することを特徴とする方法を提供するものである。1つの具体例において、第1および第2の構築物を各微生物へ形質転換して第1および第2のトランスジェニック生物を産生し、後に各生物に攝食させる。好ましくは、該第2構築物は、該プロモーターに対して、該転写因子の結合により、該DNAのdsRNAへの転写が開始できるような配向で該所望のDNAを含む。この具体例において、該第2の構築物は、該転写因子のプロモーターへの結合により所望のDNA配列のdsRNAへの転写を開始できる、該DNA配列とフランキングな2つのプロモーターを含む。別法として、該DNA配列は、プロモーターに転写因子が結合するとdsRNAを産生するように該プロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される。これらの具体例の各々において、第1および/または第2構築物は、好ましくは、該転写因子の結合によりレポーターの転写を開始できるプロモーターに操作可能に結合したレポーター遺伝子を与えられてもよい。好ましくは、該レポーター遺伝子は、ルシフェラーゼグリーン蛍光タンパク質β−ガラクトシダーゼまたはβ‐ラクタマーゼのいずれかをコードする。

0010

本発明はまた、当業者によく知られている、タンパク質−タンパク質相互反応を検出するChien et al (1991)によって最初に提案された酵母2ハイブリッドベクター実験で同定されたクローンを確認する方法も包含する。この本発明の方法は、2ハイブリッドベクター実験で同定されたタンパク質をコードするDNAを含む構築物であって、該DNAが、適当な転写因子のプロモーターへの結合により該DNAのdsRNAへの転写を開始できるプロモーターに対して配向している構築物を用意し、該転写因子を含む、細菌細胞のような細胞を該構築物で形質転換し、または該転写因子を含む生物を該構築物で形質転換し、ついで、野生型と比較して、該細胞または、シー・エレガンス等であってよい生物における表現型の変化を同定することを特徴とする。好ましくは、転写因子は、細胞または生物で誘導的である。再度、上記のごとく、該DNA配列は、2つのプロモーターの間または単一のプロモーターに対してセンスおよびアンチセンス配向で提供される。好ましくは、該プロモーターはファージポリメラーゼプロモーターであり、該転写因子はRNAポリメラーゼで、好ましくはT7 ポリメラーゼである。また、本発明の範囲には該細胞または生物を形質転換するために使用するベクターおよび該細胞または生物自体も包含する。

0011

本発明のさらなる態様には、植物害虫蔓延を軽減する方法であって、a)該害虫から、その生存生長、増殖に臨界的なDNA配列を同定し、b)工程a)からの配列またはそのフラグメントを適当なベクター中、プロモーターに対して、該プロモーターに適当な転写因子が結合すると、プロモーターが該DNA配列のRNAまたはdsRNAへの転写を開始できるような配向にクローニングし、該ベクターを植物に導入することを特徴とする方法を提供する。
かくして、有利には、この本発明の方法は、植物害虫蔓延軽減のための特に選択的なメカニズムを提供し、植物害虫が植物をとするような、植物の寄生的蔓延のような場合には、その害虫がその植物を摂食すると、害虫は植物中で発現したdsRNAを消化し、害虫の生長、生存、増殖または再生に臨界的な害虫内のDNAの発現を阻害する。好ましい具体例のおいて、植物害虫は、チレンクルス・エスピー(Tylenchulus ssp.)、ロドホルス・エスピー(Radopholus ssp.)、ラジナフェレンクス・エスピー(Rhadinaphelenchus ssp.)、ヘテロデラ・エスピー(Heterodera ssp.)、ロチレンクルス・エスピー(Rotylenchulus ssp.)、プラチレンクルス・エスピー(Pratylenchus ssp.)、ベロライムス・エスピー(Belonolaimus ssp.)、カンジャヌス・エスピー(Canjanus ssp.)、メロイドジン・エスピー(Meloidogyne ssp.)、グロボデラ・エスピー(Globodera ssp.)、ナコブス・エスピー(Nacobbus ssp.)、ジチレンクス・エスピー(Ditylenchus ssp.)、アフェレンコイデス・エスピー(Aphelenchoides ssp.)、ヒルシュメニエラ・エスピー(Hirschmenniella ssp.)、アンギナ・エスピー(Anguina ssp.)、ホプロライムス・エスピー(Hoplolaimus ssp.)、ヘリオチレンクス・エスピー(Heliotylenchus ssp.)、クリコネメラ・エスピー(Criconemella ssp.)、キシフィネマ・エスピー(Xiphinema ssp.)、ロンドルス・エスピー(Longidorus ssp.)、トリコドルス・エスピー(Trichodorus ssp.)、パラトリコドルス、エスピー(Paratrichodorus ssp.)、アフェレンチス・エスピー(Aphelenchs ssp.)のいずれかとすることができる。本発明のこの態様のDNA配列またはそのフラグメントは、2つの根特異性プロモーターのような2つの組織特異性プロモーター間にクローンできる。

0012

本発明のさらなる態様は、適当な転写因子がプロモーターに結合した場合に2つのプロモーターの間に位置するDNA配列の二本鎖RNAへの転写が開始できるように配向した2つの同じプロモーターを含む本発明の各方法においてライブラリーを構築するために使用するベクターに関する。例えば、DNA配列は多クローニング部位を含むことができる。好ましくは、発現ベクターは選択マーカーをコードする塩基配列を含む。1つの具体例において、選択マーカーをコードする塩基配列は2つの同じプロモーターの間に位置させ、プロモーターへの転写因子の結合によりその間に位置する塩基配列のdsRNAへの転写が開始されるようにする。好ましくは、選択マーカーは、pha−1突然変異を有するシー・エレガンスへの導入用にsup−35をコードする塩基配列を含む。
好ましくは、転写因子は、対応するプロモーターまたはシー・エレガンス特異性プロモーターと結合するファージポリメラ−ゼ、より好ましくはT7 ポリメラ−ゼを含む。好ましくは、該同じプロモーターの間に多クローニング部位を含む。

0013

本発明のさらなる態様において、本発明の方法において使用するための適当な転写因子発現用の発現ベクターを提供する。該ベクターは、適当な発現制御配列と操作可能に結合した該転写因子をコードする塩基配列を含む。好ましくは、該発現制御配列は、誘導的、構造的、一般的または組織特異的プロモーターまたはそれらの組み合わせを含む。好ましくは、転写因子はファージポリメラ−ゼを含み、好ましくは、T7、T3またはSP6、RNAポリメラ−ゼである。
本発明のさらなる態様は、本発明のベクターによる細胞または生物の形質転換を同定するための選択システムを提供する。該システムは、本発明のベクターを含み、その選択マーカーが、該細胞または生物の、公知の表現型を付与する原因となる遺伝子の発現を阻害または防止することのできる塩基配列を含む。好ましくは、該塩基配列は、該公知の表現型を付与する遺伝子の一部または同じ配列に相当し、その塩基配列がそれ自体、プロモーターに適当な転写因子が結合すると、二本鎖RNAの転写を開始できる2つの同じプロモーターの間に位置する。別法として、該塩基配列は、該細胞または生物の公知の表現型を付与する遺伝子配列の一部または同じ配列を含み、該細胞または生物の染色体における相同的組換えにより該ベクターの組み込みを可能とし、組み込み後、該公知の表現型を付与する遺伝子配列の発現を阻害するものである。好ましくは、本発明のこの態様においては、該塩基配列が、ゲノムに組み込み後に該塩基配列の翻訳を防止するに十分な終止コドンを含む。好ましくは、該公知の遺伝子配列は、該ベクターをpha−1 et123ts突然変異体シー・エレガンス虫に組み込み後、25℃より高い温度における子孫の増殖の同定により選択できるsup−35遺伝子またはそのフラグメントを含む。

0014

本発明のさらなる態様は、該ベクターをpha−1 et123ts突然変異体シー・エレガンス虫に組み込み後、25℃より高い温度における子孫の増殖の同定により選択できるsup−35遺伝子またはそのフラグメントを含む該公知の遺伝子配列を提供する。本発明のもう1つさらなる態様は、多細胞生物のDNA配列に機能を割り当てる方法であって、a)プロモーターから転写開始することのできる多細胞生物に、i)該多細胞生物において転写をプロモートできる2つのプロモーターの間にクローンされた該DNAフラグメントを含む構築物を与え、b)野生型と比較して、該多細胞生物の表現型を同定することを特徴とする方法を提供する。

図面の簡単な説明

0015

本発明のプラスミドPGN1の塩基配列を示す。
本発明のプラスミドPGN1の塩基配列を示す。
本発明のプラスミドPGN100の塩基配列を示す。
本発明のプラスミドPGN100の塩基配列を示す。
本発明のプラスミドPGN100の塩基配列を示す。
本発明の方法で使用するベクターおよび形質転換型を示す図である。
本発明で使用する発現ベクターを示す。
シー・エレガンスの形質転換に用いるT7ポリメラ−ゼベクターを示す図である。
シー・エレガンスの形質転換に用いるT7 ポリメラ−ゼベクターを示す図である。
プラスミドPGN1を示す。
sup−35dsRNAをコードするdsRNA阻害用の促進ベクターを示す図である。
シー・エレガンスのゲノムに組み込むベクターを示す。
DNA配列からdsRNAの転写を開始するための適当なプロモーターに対するDNA配列の位置を示す。
プラスミドpGN108を示す。
プラスミドpGN105を示す。
プラスミドpGN400を示す。
プラスミドpGN401を示す。
プラスミドpGN110を示す。
前向きおよび逆向きT7/T3/SP6プロモーターを有するプラスミドpAS2を示す。
前向きおよび逆向きT7/T3/SP6プロモーターを有するプラスミドpGAD424を示す。
プラスミドpAS2−cyh2−HA+bothT7−ファイナルを示す。
プラスミドpGAD424−without−FULL−ICE−BOTH−T7を示す。
(a)はプラスミドpGN205および(b)はプラスミドpGN207を示す。

0016

本発明は、添付の図面を参照して、純粋に例示として挙げた以下の実施例によりさらに明確に理解できる。
実施例A:定序および階層的(ordered and hierarchical)プールされたcDNAライブラリーの構築およびその適用
ランダム定序およびプールされたライブラリー
ベクターは、2つのT7プロモーターを内蔵するイー・コリ・ベクターで、その間に多クローニング部位(MCS)を有する。2つのプロモーターは、相互の方向に、かつMCSの方向に配向している。T7RNAポリメラ−ゼの存在下、イー・コリ、シー・エレガンスまたは他の生物において発現され、該2つのT7プロモーターから始まり、RNAが産生される。これらが対向したセンスで配向しているので、T7RNAポリメラ−ゼの結合により、RNAの両方の鎖が、2つのプロモーターの間に挿入(クローン)されたMCSから産生され、二本鎖RNA(dsRNA)の生成をもたらす。
シー・エレガンスcDNAライブラリーは、標準的な分子生物学技術を使用してMCSから構築できる。このライブラリーをイー・コリに形質転換し、得られたイー・コリを培養して増殖させ、96マルチウエルプレートで保存する。この段階で、プラスミドDNAを単離し、これらのイー・コリのコロニーに対応させて96マルチウエル・プレートに保存することができる。約100,000コロニーを記録する。このようにして、ライブラリーは約5倍のシー・エレガンスの全発現されたcDNAバリエーションを内蔵し、これは低発現配列がライブラリーに存在する機会を与える。これは約1041個の96ウエルプレートをもたらす。このプレートを必要により階層的にプールする。現在、コロニーのプールは10〜100の階級に整理されている。階層的プールが8または12当たりの場合(96ウエルプレートが8〜12のグリッドを有しているので、これらの数値がより都合よい)、約87のマルチウエルプレート、約8352のウエルとなる。階層的プールが96ウエル当りの場合、すなわち1枚のプレート当たりの場合、約11プレート、約1041ウエルとなる。階層的プールのいずれの段階においても、プラスミドDNAを単離でき、少ないプレートを用いるので、労力も少なく、複雑性もなくなるが、12当たりのプールの場合は該当しない。DNAのプールはオリジナルのDNAを使用しても行うことができる。
以下の実験は、DNAおよびイー・コリ・ライブラリーの両方について、如何に階層的プールを行うべきかを記載する。

0017

RNAi技術用の、シー・エレガンス・ゲノムの各遺伝子を内蔵する定序ライブラリー、その応用
ゲノム配列決定プロジェクトが終わりに近づき、この情報がT7RNA阻害技術への応用に使用できる。シー・エレガンス・ゲノムの各遺伝子はPCR技術を用いてクローンできる。好ましくは、エクソンを最小長さ500bpでクローンする。エクソンが小さすぎる場合、PCRでより小さいフラグメントを単離するか、イントロンおよび隣接するエクソンの一部をPCR技術で単離し、遺伝子の翻訳領域の少なくとも一部をクローンする。このために、少なくとも17000PCR反応を行うことが必要である。このPCR産物コレクションを、記載したようにT7ベクターにクローンする(相互に対向して配向し、多クローニング部位をその間に有する2つのT7プロモーター)。各PCR産物は独立してクローンするか、記載したcDNAライブラリーと同様に、ランダムライブラリーの形成に使用できる。各PCR産物を独立してクローンする場合、得られた細菌およびプラスミドDNAは種々の方法でプールできる。まず、T7RNAiベクター中で独立してクローンしたPCR産物のコレクションはランダムライブラリーで記載したと同様にランダムにプールできる。このプールはまた、より合理的な方法で行うこともできる。例えば、シー・エレガンス・ゲノムの遺伝子はバイオインフォマティックな道具(in silico biology)を用いて分析できる。ゲノムの種々の遺伝子は遺伝子ファミリーに属し、またはゲノム中にホモログを有する。これらの遺伝子ファミリーのメンバーをプールするか、ホモログであるメンバーをプールする。このようにして約17000クローンの全メンバーを、より便利に使える量に減少させる。このライブラリーは、本発明の方法において表現型のスクリーニングに使用することができる。得られた表現型は、シー・エレガンスゲノムの遺伝子、遺伝子ファミリーまた遺伝子ホモログに機能的な記述を与える。ライブラリーは、ゲノムの各遺伝子の一部からなるので、この方法は完全ゲノムの機能−表現型用語での記載を可能とする。このために、二本鎖RNA(dsRNA)を該虫に導入する必要がある。クローン単独または、ランダムにもしくは合理的にプールしたクローンの導入は記載するように幾つかの方法で行うことができる。

0018

二本鎖RNAiの発現用ベクターの例
T7プロモーターを含むいずれかのベクターを使用でき、これは多クローニング部位を含んでいる(これらは商業的に入手可能である)。共に適宜の末端を有する、T7プロモーターを含むプライマーと、逆相補鎖を有するプライマーを設計する。これのプライマーはハイブリダイズでき、よく設計されている場合は、選択したベクター中にクローンできる。T7プロモーターの最小配列は、TAATACGACTCACTATAGGGCGAである。T7発現ベクターの構築にはいずれのベクターも使用できるが、以下は、pGEM−3zf(−)ベクターを用いて如何にこれを行うかを示す例である。
ベクターpGEM−3zf(+)(PROMEGA)をHindIIIおよびSal1で消化した。
プライマーoGN1およびoGN2を、最終濃度1μg/30μlで混合し、沸騰させ、ゆっくりと室温まで冷却した。
プライマーを、標準的連結方法でベクターに連結した。得られたベクターはpGN1であり(図1に示す)、相互に対向して配向する2つのT7プロモーターを含み、その間に多クローニング部位を内蔵している。oGN1およびoGN2の配列は、
oGN1: AGCTGTAAT ACG ACT CAC TAT AGG GCG AGA AGC TT
oGN2: TCGAAA GCT TCT CGC ATA ATAGTG AGT CGT ATT AC
である。

0019

ライブラリー構築の例
RNAはRNAiに感受性の各生物から単離できる。一般に、単離したRNAを二本鎖cDNAにコピーし、ついで、適当なクローニングベクター中に調製する。幾つかの方法が存在し、PROMEGA、CLONTECH、BOEHRINGE MENNHEIMBRL等を含む種々の会社から分子生物学キット購入でき、以下のことが行える。
RNAの単離、
最終的にポリA RNAが単離できる(幾つかの技術およびキットが入手できる)、
AMV逆転写、ランダム・ヘキサメリック・プライマーおよび/またはオリゴ(dT)プライマーによる第1鎖の合成、
RNaseH、DNAポリメラ−ゼIによる第2鎖の合成、
T4DNAポリメラ−ゼによる平滑末端
T4DNAリガーゼによるアダプターの付加、
T4ポリヌクレオチドキナーゼよる最終的処理、
cDNAのベクターへのクローニング。
得られた連結混合物はcDNAライブラリーと考えることができる。この連結は、目的とするベクターに連結した全てのcDNAを含んでいる。ライブラリーを整理するために、連結をイー・コリ株に形質転換する必要がある。

0020

イー・コリまたはDNAライブラリーの適応
T7RNA産生株
標準的な株はBL21(DE3):F−omoT[lon]hsds(r−m−;およびE. coli B株)λ(DE3)である。最終的に、BL21(DE3)の変異体が使用できるが、BL21(DE3)pLysSを使用する。
他のいずれかのT7RNAポリメラ−ゼ産生イー・コリも、入手できれば、構築する必要がある。これは、商業的に入手できるファージを用いて容易に形成でき、この場合は、λCE6ベクター(PROMEGAより提供される)を用いる。ほとんど全てのイー・コリ株が、このファージでトランスフェクトでき、T7RNA
ポリメラ−ゼを産生する。
RNAseIII突然変異体イー・コリ:
種々の株が原理的に入手でき、我々は、第1の実験に使用するため、AB301−105株:rna−19、suc−11、bio−3、gdhA2、his95、rnc−105、relA1、spoT1、metB1(Kinder et al. 1973, Mol. Gen. Genet, 126:53)を選択した。しかし、他の株もより適当でありうる。この株をλCE6で感染し、T7産生変異体を構築する。
野生型シー・エレガンス虫は細菌プールで生長できる。細菌はT7RNAポリメラ−ゼを発現している。これにより、シー・エレガンスの内臓に大量のdsRNAをもたらし、該生物中に拡散し、発現の阻害をする。このライブラリーを幾つかの表現型のスクリーニングに用いることができる。この技術は、ある経路における適切な遺伝子を、公知のシー・エレガンス技術より、より迅速に検出できる利点を有する。さらに、興味ある表現型を見出したら、原因する遺伝子を容易にクローンすることができる。
階層的プールを使用することにより、プールの適切なクローンを第2のスクリーニングにおいて容易に見出すことができる。このクローンに挿入したDNAを、ついで、配列決定できる。この実験は、1工程で遺伝的および生化学的データをもたらす。
野生型シー・エレガンスは、表現型、薬物耐性および薬物感受性をスクリーニングするために化合物と組み合わせることができる。シー・エレガンス株は、突然変異株でよく、増強された表現型、減少した表現型または新しい表現型についてスクリーニングされる。シー・エレガンス株は突然変異株でよく、ライブラリースクリーニングを化合物と組み合わせることができる。したがって、薬剤耐性薬剤定性、増強された表現型、減少した表現型または新しい表現型についてスクリーニングできる。イー・コリ株はBL21(DE3)のようなT7RNAポリメラーゼ発現株のいずれでもよいが、例えば、RNAseIII陰性のうような特別なイー・コリ株を使用することにより、二本鎖RNAの形成が促進されうる。RNAseIIIはdsRNAの特異的なループを認識する。結局、RNAseIII以外のRNAseを欠失したイー・コリまたは1つ以上のRNAseを欠失したイー・コリを使用できる。T7RNAポリメラーゼ産生イー・コリ株に利用できる大部分の公知のイー・コリ株および構築物は、一般に、誘導的プロモーターを含む。このようにして、T7RNAポリメラーゼの産生、すなわち、dsRNAの産生が調節される。有利には、この特徴は生長の特定の段階でシー・エレガンス虫に「パルス」摂取させるために使用できる。これらの虫は非誘導イー・コリ株で生長する。虫が目的の段階に達したら、該細菌におけるT7RNA産生が誘導される。これにより該動物のライフサイクルのいずれか点におけるいずれの遺伝子の機能も研究できる。

0021

推定的目的ヒト遺伝子のホモログについてのライブラリーのスクリーニングおよびこれらの遺伝子の機能割り当て
ゲノムプロジェクト、差次的(differential)発現アレーハイブリダイゼーション研究等の種々のプロジェクトで数百の遺伝子が単離されている。記載されたcDNAライブラリーは迅速かつ効率的な方法でこれらの遺伝子の機能確認および/または割り当てする方法を提供できる。まず、全ての虫ホモログ、ホモログ類または遺伝子をバイオインフォマティックな道具(in silico biology)で同定する必要がある。PCRプライマーを開発し、PCR技術を用いてcDNAフラグメントを単離する。PCRは階層的プールについて行なうことができる。適当なcDNAを有する陽性プールまたは細菌を内蔵する個々のウエルをシー・エレガンスに与え、表現型を記録する。
PCRはシー・エレガンスから単離したcDNAで行なうことができる。得られたDNAは、T7ベクター中にクローンでき、該シー・エレガンス虫が与えられるdsRNA産生イー・コリに形質転換できる。どちらの方法がより迅速で、信頼性があるかにより、選択する必要がある。
遺伝子が遺伝子ファミリーに属している場合、虫に細菌の混合物を与える必要がありうる。これらの各々が遺伝子ファミリーのメンバーの一部を内蔵している。イー・コリ株、生長条件、化合物との組み合わせを、上記したごとく行なうことができる。
全てのシー・エレガンスの遺伝子が組織化され、構造的にクローンされている合理的なライブラリーを使用する場合、シー・エレガンス・ホモログ、そして結局、他のホモログ、オルトログ(orthologue)および遺伝子ファミリーのメンバーは、silico biologyを使用して容易にライブラリー中にさかのぼることができる。この工程にはPCRは関与せず、虫が生長する細菌および/またはDNAを単離する。

0022

実施例
一連の実験の考え方は、構築したRNAiベクターおよびイー・コリ株をテストすることであった。
1)テストプラスミドの構築
ノックアウトまたはRNAi実験に使用した場合に虫において明確な表現型を与えるcDNAのいずれかを使用できる。unc−22がよい候補であることが知られているが、他の遺伝子も可能である。我々は、後の段階で使用できる感受性系を選択した。この系をpha−1バックグラウンド中、sup−35でテストした。sup−35のエクソン5をPCRで単離し、T7プロモーターベクターpGN1にクローンした。調節ベクターをpGN2と称した。pha−1(e2123)突然変異体虫は25℃より高い温度で子孫を産出できない。これは胚形成における発生の問題のためである。sup−35がノックアウトまたはこの株で阻害されている場合、この温度で子孫は発育し得る。pha−1突然変異虫およびsup−35RNAiの組み合わせは種々の選択を確認するためのよい系である。

0023

2)dsRNAを産生するイー・コリ株を用いるRNAiのテスト
pGN2をイー・コリ株BL212(DE3)に導入し、T7RNAポリメラーゼをIPTGで誘導した。シー・エレガンス虫(pha−1(e2123))をこの細菌に接種し、25℃の制限された温度で生長させた。この突然変異体は胎児突然変異体であり、この温度で何ら子孫は見られない。イー・コリ中のdsRNAがsup−35遺伝子を効率的に阻害する場合、子孫が見られる。
pGN2をイー・コリ株AB301−105(DE3)に導入し、T7RNAポリメラーゼをIPTGで誘導した。シー・エレガンス虫(pha−1(e2123))をこの細菌に接種し、25℃の制限された温度で生長させた。この突然変異体は胎児突然変異体であり、この温度で何ら子孫は見られない。イー・コリ中のdsRNAがsup−35遺伝子を効率的に阻害する場合、子孫が見られる。

0024

3)よりよいdsRNA摂取のための虫株の改良
pha−1シー・エレガンスを二本鎖sup−35RNAを産生するイー・コリ株上で培養する前に、虫をEMS(メタンスルホン酸メチル)で突然変異誘発した。この突然変異誘発虫の子孫を細菌の上で培養した。虫をこの細菌で飼育し、より大量の子孫を得た。子孫は、dsDNA摂取の向上をもたらす突然変異を有し、さらなる実験に使用できる。

0025

dsRNA産生ベクターのT7RNAポリメラーゼ産生虫のゲノムへの安定な組み込み
以下の特徴を内蔵するイー・コリベクターを構築できる:相互に対抗する2つのT7プロモーターと、その間にクローンされた制限部位または多クローニング部位。さらに、このベクターは、シー・エレガンスsup35ゲノムDNAを含むことができ、図8に示すごとく、種々の間隔で幾つかの終止コドンを含み、該sup35ゲノムDNAフラグメントから完全長のタンパク質が発現できないように操作することができる。いずれのcDNAまたはDNAフラグメントも2つのT7プロモーター間の多クローニング部位にクローンすることができる。このベクターを、T7RNAポリメラーゼを発現するシー・エレガンス株に導入すると、2つのT7プロモーターの間にクローンされたcDNAまたはDNAフラグメントが転写され、クローンされたフラグメントからdsRNAが生成する。
このベクターは、pha−1(e2123)突然変異体虫においてT7RNAポリメラーゼの発現に使用するために設計されている。T7RNポリメラーゼの発現は構造的または調節され、全体的または組織特異的である。これらのpha−1(e2123)虫は25℃より高い温度で子孫を作れず、これは胚形成の発生の問題によるものである。この株において、sup−35が阻害またはノックアウトされると、この温度で子孫が生長できる。
このベクターを虫に導入すると、相同的組換えによりベクターを組み込むことができる(キャンベル様組み込み)。低い頻度ではあるが、相同的組換えがシー・エレガンスで起こることが示されている(PlasterkおよびGroenen,EMBO J., 11:287-290, 1992)。sup35遺伝子における相同的組換えは、2つの生じたsup−35遺伝子が終止コドンを内蔵しているので遺伝子のノックアウトをもたらす。得られた虫およびその子孫は、この組換えで起これば、ゲノムに組み込まれたベクターのコピーを有する。これは、sup−35がノックアウトされた虫だけが25℃より高い温度で子孫を持てることから選択できる。さらにまた、得られた虫は、2つのプロモーターの間にクローンされたDNAフラグメントから二本鎖RNAを安定に産生することができる。この虫は、遺伝子の機能の減少した、2つのT7プロモーターの間にフラグメントがクローンされた安定なトランスジェニク虫系統と考えることができる。
DNAは、注射、衝撃(ballistic)形質転換、DNA溶液への浸漬、細菌での飼育を含む幾つかの技術によって虫にデリバリー(delivery)できる。形質転換効率を増大させる新しい他の方法を考えることができる。
標的シー・エレガンス株は、さらにpha−1(e2123)突然変異以外の他の突然変異を有していてもよく、T7RNAポリメラーゼ以外の遺伝子を発現してもよい。

0026

実施例B:酵母2−ハイブリッド−RNAiベクター
2つのT7プロモーターを内蔵する酵母2ハイブリッドベクターを構築できる。このベクターは酵母およびイー・コリの両方で複製するように設計できる。一般に、酵母2ハイブリッド系様のcDNAライブラリーは、Gal4またはLexAベクターで作成される。該ライブラリーは、これらの遺伝子の1つの活性化ドメインを有するベクター中で構築される。ベクターは依然として酵母ハイブリッド・スクリーニングで使用できるが、相互に対向した2つのT7プロモーターを含み、その間にクローニング部位を含む。プラスミド中の配列の順序は、「プラスミド主鎖、(GAL4−T7)、MCS、主鎖」である。このベクター中で構築されたシー・エレガンスcDNAライブラリーは、与えられたタンパク質と相互反応するタンパク質を単離する実験において標準的な酵母2ハイブリッドライブラリーとして使用できる。一端クローンを単離したら、プラスミドをT7RNAポリメラーゼを発現するイー・コリ株に導入でき、かくして、クローンしたフラグメントのdsRNAを産生できる。このdsRNAを産生する細菌を虫に与えることができ、表現型を記録できる。前の実施例と同様に、新たに単離した酵母2ハイブリッドクローンについてのこの確認操作は、PCRおよび/またはクローニング工程、RNA実験および/またはノックアウト実験を要求する標準的な操作と比べて著しく短い。大抵の場合、単離したクローンをまず配列決定し、その配列に基づいて、さらに実験を続けるか否か決定する。本発明において、各単離されたクローンは、容易に適当なイー・コリに導入し、虫に与えることができる。ついで、表現型を分析して確認を行なう。
この操作を適用するため、公知の遺伝子を餌とし、新たに構築したライブラリーを標的として、酵母2ハイブリッドを行なう。餌のタンパク質と相互作用する標的中のクローンによってコードされるタンパク質は、X−galでのLacZ染色で見られるようなレポーター分子を発現する陽性酵母クローンをもたらす。標的タンパク質をコードするプラスミドを酵母株から直接単離し、イー・コリに導入する。このイー・コリはT7RNAポリメラーゼ産生イー・コリである。この場合、二本鎖RNAは、ベクターの多クローニング部位にクローンされたDNAから産生される。このdsRNAを上記した方法で虫に与えると、遺伝子は虫の中で阻害され、個々の表現型をもたらす。
この酵母2ハイブリッドベクターは、有利には、前記した実施例におけるように、定序および階層的にプールしたライブラリー構築のために使用できる。
酵母株も条件付きでT7RNAポリメラーゼを産生できる。酵母2ハイブリッド実験の後、T7ポリメラーゼの発現を誘導でき、酵母細胞中でdsRNAの産生をもたらすことができる。その結果、酵母を虫に与えることができる。シー・エレガンス虫が酵母で飼育できることを示す証拠が入手できる。

0027

T7RNAポリメラーゼ産生株の構築およびその適応
T7RNAポリメラーゼを発現するシー・エレガンス株を構築できる。発現は全体的、構造的であるが、組織特異的プロモーター、誘導的プロモーターあるいは一時的プロモーターまたはこれらの特徴または特徴の組み合わせを内蔵するプロモーターによって調節することもできる。DNAをこのシー・エレガンスに導入できる。これは注射、粒子の発射、エレクトロポーレーションまたは前記のような飼育によって行なうことができる。DNAが前記の実施例で記載したようなプラスミド、すなわち、クローンしたcDNAフラグメントまたはPCRフラグメントを2つのフランキングT7プロモーターの間に内蔵するプラスミドである場合、このcDNAまたはPCRフラグメントのdsRNAを細胞または生物全体に形成させ、対応する遺伝子のダウンレギュレーションをもたらす。導入したDNAは、効率的な一時的ダウンレギュレーションを有することができる。導入したDNAは染色体外アレイを形成でき、このアレイは、より接触的ノックアウトまたは機能表現型の減少をもたらし得る。プラスミドも、同じような接触ノックアウトまたは機能表現型の減少をもたらしうるが、安定に遺伝できる。

0028

実施例AおよびBで記載した2つのT7プロモーターの間にクローンされたシー・エレガンスのcDNAまたはcDNAの一部あるいはESTまたはPCRフラグメントを内蔵するプラスミドDNAを、標準的な技術でT7RNAポリメラーゼ虫に導入する。表現型は標準的技術(注射、発射)で分析できる‐実施例Aにおける定序およびプールしたライブラリーからのDNAをT7RNAポリメラーゼ虫に導入できる。表現型を分析できる。階層的プールを用いて、元のクローンを容易に見出すことができる。
同じ操作を、T7RNAポリメラーゼを発現する突然変異体虫を用いて行なうことができる。増強された、減少された、または新しい表現型をスクリーニングする。
この操作を用いて、化合物をスクリーニングできる。スクリーニングは野生型、突然変異体株を用いて増強された、または新しい表現型について行なうことができる。
新しい方法でDNAを虫に導入できる。その1つは、イー・コリによるDNAのデリバリーである。この場合、階層的にプールされたライブラリーを動物に与える。線虫の内臓におけるイー・コリDNAの消化を防止するため、好ましくは、nuc−1(e1392)のようなDNAse欠損シー・エレガンスを使用する。この操作は、他の技術の形質転換効率と独立しており、一般に、より迅速で手間がかからないので、最も好ましいものの1つである。

0029

2)当該方法の推定されている増強
ベクターを、2つのT7プロモーターの間にクローンされたsup−35cDNAまたはこのcDNAの一部を内臓するように設計する。ベクターの残部は、実施例AおよびBに記載のとおりである。このベクターは、pha−1ts突然変異体シー・エレガンスに導入することができる。この場合、温度選択システムが存在し、DNAを摂取し、二本鎖sup−35RNAを発現した虫のみが制限された温度で生存できる。階層的にプールされたライブラリーが上記したいずれかの方法でデリバリーできる。
ベクターは、T7RNAポリメラーゼ発現イー・コリに導入するライブラリーの構築に使用できる。この場合、我々は、sup−35のdsRNAが活性な虫のスクリーニングに加えて、A)のような類似のスクリーニングを有している。
sup−35のDNAおよび/またはdsRNAを異なるプラスミドにデリバリーできる。DNA飼育(実施例C)または実施例AおよびBのdsRNA飼育の両方の飼育について、これは、2つのプラスミドが1つの細菌に存在できるか、虫が細菌の混合物で、そのうちの1つがsup−35構築物を内蔵している混合物で飼育できることを意味する。

0030

T7RNA産生シー・エレガンスの構築例
虫の中でT7RNAポリメラーゼを産生させるため、幾つかの可能性がある。T7ポリメラーゼは、誘導的プロモーター、構造的プロモーター、一般的(general)プロモーターまたは組織(細胞)特異性プロモーターmまたはこれらの組み合わせの種々のプロモーターの下で発現できる。これらのプロモーターの例は、ヒートストック・プロモーターhsp−16、内臓(gut)プロモーターges1、cet858からのプロモーターであり、dpy7のプロモーターおよびプロモーター・エレメントGATA1も例示できる。この例では、pPD49.78ベクター中で利用できるhsp−16プロモーターの制御下にT7RNAポリメラーゼを発現させる。T7RNAポリメラーゼを、プライマーGN3およびGN4を用いてPCR産物として単離する。
我々のクローンしたいベクターがFireベクターpPD49.78であるので、得られたPCR産物をNheIおよびNcoIを用いて設計する。得られたベクターは図2に示すpGN100である。oGN3:CATGGCAGG ATG AACACGATT AACATCGC、oGN4:ATG GCC CCA TGG TTACGG GAA CGC GAAGTC CG pGN100が包含される。
このベクターを、例えば、マイクロインジェクションのような標準的な技術を用いて虫に導入する。
以下の株を構築した。
野生型(pGN100)
nuc−1(pGN100)
pha−1(pGN100)
pha−1;nuc−1(pGN100)
これらの株の全てが、温度での誘導または重カドミウムまたは水銀の適用のような金属によりT7RNAポリメラーゼを産生できる。温度誘導操作は、動物を30〜33℃に少なくとも1時間移すことであり、ついで常温(15〜25℃)に戻すことができる。
T7RNAポリメラーゼ産生野生型株は、虫におけるいずれのRNA産生にも使用できる。さらに詳しくは、記載したライブラリーからのプラスミドをこれらの虫に導入し、表現型を記録できる。
nuc−1突然変異体虫は、虫を飼育する細菌を介してDNAを導入するために使用できる。nuc−1虫はDNAを消化しないので、プラスミドDNAは内臓壁を横切ることができる。T7RNAポリメラーゼを産生する細胞に取り込まれると、dsRNAが産生され、遺伝子のRNA転写を阻害する。
T7RNAポリメラーゼを産生するpha−1突然変異体虫株は上記した操作を促進するために使用できる。DNAは、発射(shooting)、マイクロインジェクションまたは飼育により導入できる。さらに詳しくは、この株は、sup−35および目的とする遺伝子からdsRNAを産生するベクターとして使用でき、後者はPCR産物、cDNAまたは上記したライブラリーとすることができる。

T7RNAポリメラーゼを産生するpha−1;nuc−1突然変異体は、DNAの細菌デリバリーに使用できる。DNAは、好ましくは、sup−35および目的とする遺伝子両方からdsRNAを産生できるプラスミドである。この虫株は、好ましくは、内臓においてT7RNAポリメラーゼを産生する。好ましくは、デリバリーは、プラスミドを内蔵する細菌で虫を飼育することにより起こる。

0031

RNAi技術の植物における適応
線虫類は、植物、特に農業で使用する植物に打撃を与える損傷の大きな部分の原因である。本発明のRNAi操作は、これらの寄生線虫類のより長い攝食から植物を守るために使用できる。第1の工程において、線虫が生存または生長するために、あるいは攝食または増殖するために臨界的なDNAフラグメントを寄生性植物線虫から単離する。発現が必須であるいずれもの遺伝子がこの目的に適している。
これらの遺伝子の一部、エクソンまたはcDNAをクローンする。このDNAフラグメントは、組織特異的プロモーター、好ましくは、根特異的プロモーターの影響下、さらに好ましくは2つの根特異的プロモーターの間にクローンすることができる。根特異的プロモーターの制御下のクローン遺伝子のDNAは、植物トランスジェニック技術を用いて目的とする植物に導入できる。各寄生線虫類について、別々のDNA片が必要とされ得、同様に、各植物の種族によって、別々のプロモーターが必要となる。
根は、根特異的プロモーターを利用する場合、導入されたDNA片からRNAまたはdsRNAを産生する。線虫は根を攝食するので、該RNAおよび/またはdsRNAは該線虫により消費または摂取される。RNAおよび/またはdsRNAは線虫の細胞に入ることができ、標的DNAに対してその阻害作用を実行する。虫のクローンしたDNA片の性質により、線虫は、生存、攝食、増殖等ができなくなり、いずれの場合も、該動物は植物をもはや攝食できなくなり、かくして植物が保護される。

0032

シー・エレガンス産生T7RNAポリメラーゼの構築
動物、さらに具体的には線虫類、よりさらに具体的にはシー・エレガンスにおけるT7RNAポリメラーゼまたは他のRNAポリメラーゼを産生させるため、幾つかの可能性を考えることができる。T7RNAポリメラーゼは種々のプロモーターの下に発現できる。これらのプロモーターは、誘導的プロモーター、構造的プロモーター、一般的プロモーター、組織特異的プロモーターまたはこれらの組み合わせでよい。

0033

シー・エレガンスにおけるT7ポリメラーゼ発現用の基本ベクターの構築
λ CE6(Novagen, Madison, USA)から、標準的操作(PCR, A practical A practical approach, 1993, Ed. J. McPherson, et al, IPLPress)により、プライマー、oGN26(ATGGAATTCTTACGCGAACGCGAAGTCCG)およびoGN46(CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC)を用い、T7ポリメラーゼをコードする配列をPCR増幅した。得られたT7RNAポリメラーゼをコードするDNAフラグメントをAgeIおよびEcoRIで消化し、AgeIおよびEcoRIで消化したFireベクターpPD97.82に挿入した。得られた構築物は、アミノ酸配列MTAPKKKRKVPVを有するSV40ラージT抗原核局在化シグナルNLS)と融合したT7RNAポリメラーゼのオープンリーディングフレームをコードする。この核局在化シグナル配列は、T7RNAポリメラーゼを細胞質から核へ転位させるために必要であり、核において、T7プロモーターと称するその特異的プロモーターと結合できる。T7ポリメラーゼ融合タンパク質配列のコード配列上流は、幾つかのシー・エレガンス・プロモーターを挿入できる多クローニング部位(MCS)によって先行されている最小プロモーター(myo−2)である。このプラスミド(図11に示すpGN105)は、シー・エレガンスにおいてT7ポリメラーゼを発現できる基本的なT7RNAポリメラーゼプラスミドである。多クローニング部位にプロモーターがクローンされた、このプラスミドの誘導体は、多クローニング部位にクローンされたプロモーターにより発現が調節されるので、シー・エレガンスにおいてT7RNAポリメラーゼの誘導的、構造的、一般的および組織特異的発現を可能にする。
これらの例に限定するももではないば、以下のプロモーターが以下の組織における発現を誘導することが知られている。
let−858(遍在発現)、myo−2(咽頭発現)、myo−3(体壁筋肉)、egl−15(陰門筋肉)、unc−119(全ニューロン

0034

シー・エレガンス筋肉組織におけるT7RNAポリメラーゼ発現用ベクターの構築
λ CE6から、プライマーoGN43(GCCACCGGTGCGAGCTCATGAACACGATTAACATCGC)およびoGN44(CACTAGTGGGCCCTTACGCGAACGCGAAGTCCG)を用いてT7RNAポリメラーゼコード配列をPCR増幅し、AgeI/SpeIで消化し、AgeI/SpeIで消化したpGK13ベクターに挿入した。(このベクターは、咽頭、陰門筋肉、尾および体壁筋肉で発現を起こさせる強力なSERCAプロモーターを含んでいる。)SacI/AgeI制限部位に2つのオーバーラップ・オリゴoGN45(CCGGATGACTGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAGCT)およびoGN46(CTCACCGGTAATGAACACGATTAACATCGC)を挿入することにより、該T7ポリメラーゼコード配列の前にSV40ラージT抗原の核局在化シグナル(NLS)を挿入した。得られた構築物を図10に示すごとくpGN108と命名した。このプラスミドをシー・エレガンスに導入すると、咽頭、陰門筋肉、尾および体壁筋肉におけるT7RNAポリメラーゼの発現をもたらす。
SERCAプロモーターの調節下のシー・エレガンスにおけるT7RNAポリメラーゼの発現および機能をテストするため、SERCAプロモーターの制御下でT7RNAポリメラーゼをコードするpGN108をシー・エレガンスに注射した。テストベクターを共注射した。このテストベクターは、T7プロモーターの制御下、GFPをコードする(図13のpGN401)。プラスミドpGN401は、T7プロモーターを生成するSacI/AgeI開裂FireベクターpPD97.82に2つのオーバーラップ・オリゴoGN41(CCCGGGATTAATACGACTCACTATA)およびoCN42(CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT)を挿入することにより構築した。さらに、選択マーカーを共注射して形質転換体を選択した(rol6、pRF4)。後者の選択ベクターpRF4は当業者によく知られている。トランスジェニックF1はrol6表現型を示すので、容易に単離できた。これらのトランスジェニック・シー・エレガンスは全て、咽頭、陰門筋肉、尾および体壁筋肉でGFPを発現した。このデータは、明らかに、T7RNAポリメラーゼがSERCAプロモーターの調節下で機能的に発現され、発現されたT7RNAポリメラーゼがpGN401に存在するT7プロモーターに結合し、GFP遺伝子の転写を開始し、ついで、機能的に発現し、SERCがT7RNAポリメラーゼの発現を誘導した筋肉組織に蛍光をもたらすことを示す。

0035

シー・エレガンスにおけるT7ポリメラーゼの遍在発現用ベクターの構築
NLS−T7RNAポリメラーゼ融合遺伝子をXmaI/Bsp1201を有するpGN108から単離し、XmaI/Bsp120Iで消化したFireベクターpPD103.5にクローンした。これは、T7RNAポリメラーゼがlet858プロモーターの調節下にクローンされているベクターをもたらす。この特異的プロモーターは全ての組織においてT7RNAポリメラーゼを発現することができる。得られたプラスミドをpGN110と命名した(図14)。

0036

T7プロモーターの制御下にDNAフラグメント、遺伝子およびcDNAの発現に介在するT7RNAポリメラーゼ用のベクターの構築
FireベクターpPD97.82をSAcI/AgeIで消化し、SacI/AgeI制限エンドヌクレアーゼ部位に2つのオーバーラップ・オリゴpGN41(CCCGGGATTAATACGACTCACTATA)およびoGN42(CCGGTATAGTGAGTCGTATTAATCCCGGGAGCT)を挿入し、T7プロモーター部位を生じさせた。この構築物(pGN400、図12)はT7プロモーターの調節下にSacIおよびEcoRI制限エンドヌクレアーゼ部位の間にクローンされたGFPオープンリーディングフレームを含む。いずれの遺伝子、cDNAまたはDNAフラグメントも、AgeI/SacIフラグメントとしてGFP遺伝子を欠失させ、ベクター中にDNAフラグメントをクローンすることにより、このベクターにクローンできる。好ましくは、目的とするDNAフラグメントをPCR増幅で得、プライマーのSacI/AgeI部位に挿入する。PCR増幅後、得られたDNAフラグメントを消化し、pGN400中のGFP遺伝子を、この増幅したDNAフラグメントで置き換える。商業的に入手できるpGEMベクター類やpBluescriptベクター類のような、T7プロモーターを含むいずれのベクターも、シー・エレガンスにおけるT7RNAポリメラーゼの誘導発現のために使用できる。これは、T7RNAポリメラーゼを発現するトランスジェニックシー・エレガンスにおけるT7プロモーターの調節下にGFPを発現するpGN401ベクターによって明らかに示される。
pGN400の使用は、ベクターが、RNAの転写または安定性を促進するunc−54からの3’UTRフラグメントを含む利点を有する。

0037

恒久的な、組織特異的「シウド(pseudo)ノックアウト」RNAiシー・エレガンス系統の発生
現在、シー・エレガンスにおける遺伝子ノックアウトは、ランダム、大規模突然変異誘発およびPCRベースsib−選択によって得られる。この方法は、嵩張り、非常に時間がかかり、単調で退屈なものである。細胞への二本鎖RNAの導入が、内因性遺伝子発現の強力な、特異的妨害をもたらすことが記載されている。シー・エレガンスにおいて、虫の体腔へのRNA注射、虫を、dsRNAを含有する溶液に浸漬すること、または目的とする遺伝子に相当するdsRNAを発現するイー・コリでのしいくにより、遺伝子発現をダウンレギュレーションできる。シー・エレガンス細胞は、それらの細胞外環境からdsRNAを取り込むことができる。mRNAが、このdsRNA介在遺伝子妨害の標的となることが報告されている(MontogemeryおよびFire, 1998)。また、標的RNAが、転写が起きる前に核中で分解されることも示唆されている。RNAi介在遺伝子発現の減少は次世代に継代されが、遺伝性は乏しく、その効果はさらなる子孫の誕生の間に急速に失われる。これは、多分、dsRNAプールの継続的減少による。我々は、ここに、恒久的な、遺伝するRNAi表現型を有するシー・エレガンス系統の構築法を提案する。この方法は、虫プロモーターの制御下にセンスおよびアンチセンス配向に、または単一構築物からのcDNAの逆繰返しの転写により、標的遺伝子のcDNAフラグメントを含むプラスミドを導入することによるトランスジェニック・シー・エレガンス系統の発生を含む。別法として、dsRNAは、T7ポリメラーゼを発現するシー・エレガンス株における2つのT7プロモーターとフランキングなcDNAを内蔵するベクターから転写できる。結果は、遺伝する安定な「シウド・ノックアウト」表現型を有するトランスジェニック虫である。cDNAまたはT7ポリメラーゼの発現は、一般的および構造的とすることができるが、組織特異的プロモーターの下でも調節できる。外部dsRNAi(注射、浸漬または飼育)によって誘導されるRNAiとは反対に、この方法は、遺伝子発現の条件付き、組織特異的阻害を得ることができる。

0038

RNA妨害によるunc−22発現の阻害は「ひきつり(twitching)」表現型をもたらす。
unc22cDNA(エクソン22)を、全ての組織でRNA配列を発現できるlet858プロモーターを含むpPD103.05(Fire nrL2865)中にセンスおよびアンチセンス配向にクローンした。得られたプラスミドをpGN205(図19a)oyobipGN207(図19b)と命名した。これらの構築物を選択マーカー(rol−6、GFP)と共にシー・エレガンスに導入した。トランスジェニックF1個体(rol−6またはGFPを発現)は「ひきつり」表現型を示し、RNAiがトランスジェニックDNAからのRNAの内因性転写によって介在できることが示された。このRNAi表現型は選択マーカーと共にさらなる子孫に共に分離した。これは、恒久的RNAi表現型を有するシー・エレガンス系統をもたらした。

0039

T7RNAポリメラーゼ系統の安定系統の発生およびデュアル・トランスジェニック虫の発生
外来性RNAポリメラーゼに基づくシー・エレガンスにおける発現系は2つのプラスミドを必要とする。1つは特異的なプロモーターの制御下でRNAポリメラーゼをコードするものであり、他のプラスミドは、T7プロモーターの調節下で発現させるべきDNAフラグメントをコードするものである。シウド安定ノックアウトと命名するセミ安定RNAiの場合、dsRNAが産生できるように、目的とするDNAを2つのT7プロモーターの間にクローンする。
T7RNAポリメラーゼ発現系は高発現系であることが知られており、これは、2つのトランスジェニック動物を生じさせる問題がある。シー・エレガンス線虫において発現させるべき遺伝子が毒性の場合、これは致死効果をもたらし、目的とする遺伝子の高度に調節された安定な発現無しにシー・エレガンスの構築をもたらす。目的とする遺伝子が生物の生存に必須の場合、この遺伝子からのDNAフラグメントを用いるRNAiも、致死効果をもたらし、シウド安定ノックアルトは可能ではない。
この問題を克服するため、本発明者らは2トランスジェニック動物を含む系を設計した。第1の動物は、T7RNAポリメラーゼについてのトランスジェニックである。このT7RNAポリメラーゼは上記実施例で示した全ての細胞または特異的な細胞または組織で発現できる。第2のトランスジェニック動物は、目的とするDNAフラグメントについてトランスジェニックである。これはT7プロモーターと連結する遺伝子またはcDNAとすることができ、あるいはRNAiを望む場合は、そのような遺伝子のDNAフラグメントを2つのT7プロモーターの間にクローンできる。
両方のトランスジェニック動物は、生存能力があり、なんらの常軌を脱した表現型を示すものでもない。これは、第1のトランスジェニック生物で発現されるT7RNAポリメラーゼが、たとえ比較的高いレベルで発現されても、当該生物にとって毒性でないからである。第2のトランスジェニック生物において、これらの生物がT7RNAポリメラーゼを含まないので、目的とする遺伝子は発現されず、またはdsRNAは産生されない。
2つのトランスジェニック動物をかけ合わせることにより、遺伝子または目的とするcDNAの発現あるいはDNAフラグメントでのRNAiが得られる。これらの子孫はデュアル・トランスジェニックであり、目的とする遺伝子を発現するか、M的のDNAフラグメントのdsRNAを発現する。そのようなかけ合わせで十分な雄を発生させるため、トランスジェニック動物の一方を、雄性世代を助長する表現型を有するシー・エレガンス突然変異体とすることができる。優先的には、そのような突然変異体を使用してT7RNAポリメラーゼ用のシー・エレガンス・トランスジェニックを作成し、一方、両性個体はT7プロモーターの調節下のDNAフラグメントを内蔵する。
デュアル・トランスジェニック子孫を効率的に選択するため、第2トランス遺伝子を第2トランスジェニック動物に誘導する。このトランス遺伝子はT7プロモーターの調節下のレポーター遺伝子を含む。レポーター遺伝子はGFP、ルシフェラーゼ、β‐ガルクトシダーゼ(galmactosidase)またはβ‐ラクタマーゼとすることができ、そのようなトランス遺伝子の例としてはベクターpGN400およびpGN401が挙げられる。
シー・エレガンスにおけるトランス遺伝子の誘導的、組織特異的発現のため、我々は、組織特異的発現のできる別々のシー・エレガンス・プロモーターで制御されるT7ポリメラーゼ構築物を持つ雄性ストック(すなわち、him−5)を作成できる。この雄はT7プロモーターの制御下、目的とする遺伝子を担持する両性個体と交差できる。
さらに、トランス遺伝子は動物のゲノムにも組み込める。該動物のゲノムへのプラスミドの安定な組み込みを生じさせる方法は記載されており(EpsteinおよびShakes編, Academic Press Mehtods in cell biology, Vol. 48, 1995)、動物の照射を含む。これは両方の動物に対して行なうことができるが、好ましくは、T7RNAポリメラーゼを発現する動物をそのような処置に付す。これにより、種々のプロモーターの制御下にT7RNAポリメラーゼを安定に発現するシー・エレガンス線虫のコレクションがもたらされ、そのような例は、myo−2(咽頭発現)、myo−3(体壁筋肉)、egl−15(陰門筋肉)、unc−19(全ニューロン)、SERCA(筋肉)、let858(全細胞)、ges−1(内臓)である。

0040

RNAiT7プロモーター酵母2ハイブリッドベクターの構築
前向きおよび逆向きT7/T3および/またはSP6を有するpGAD424
多くの2ハイブリッド実験において、cDNAライブラリーを、Ncol部位(Clontech)のようなポリリンカーにおけるさらなる制限部位で操作されたプラスミドpGAD424(図16)にクローンする。このライブラリーは、酵母2ハイブリッド実験における結合タンパク質のスクリーニングを可能とする。我々は、酵母2ハイブリッドを行なう同じ可能性を有するが、2つのさらなるT7プロモーターを含む新しい酵母2ハイブリッドベクターを構築した。これはT7RNAポリメラーゼ誘導シウド安定ノックアウトに使用できる。このために、我々は、T7−リンカー(以下のプライマーaattcttaatacgactcactatagggccおよびcatgggccctatagtgagtcgtattaagからなる)を用いてpGAD424のEcoRI−Ncol部位に挿入した。得られたベクターをpGAD424−without-FULL−both−T7と命名した。終止コドンの削除に注意し、最大のポリリンカー適合性アミノ酸を使用した。我々は、BamH1およびPst1を用いて同様な方法を逆T7(両プライマーgatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgcaおよびgtaatacgactcactatagggagatctgtcgacgからなる)にも適用した。SalIの損失をさけるため、我々はこの部位をプライマーに含めた。
SalI部位は、大部分のライブラリーがこの部位にクローンされ、アダプターが利用できるので重要である。これにより、存在するベクターに匹敵する新たに構築されたベクターを作成する。

0041

前向きおよび逆向きT7/T3および/またはSP6を有するpAS2
pAS2(Clontech)を基にして類似の酵母2ハイブリッドベクターを構築した。部分EcoRV消化により、我々はcyh2遺伝子の有意な部分を除去することができた。正しい構築物はを単離し、BalIIで制限部位を消化することにより、チェックした。この制限部位は除去すべきpAS2noEcoRVフラグメントに存在する。これは、わずかに毒性で、生長の妨害に関与するcyh2遺伝子を除去する。この遺伝子はRNAiおよび酵母2ハイブリッド実験の実行に非必須的である。EcoRVフラグメントの除去の後、GAL4DBおよびHA(エピトープ)をコードするDNA配列の間に位置するEcoRI制限部位はプラスミドにユニークとなり、T7プロモーター含有リンカーでのHAの置換に使用できる。これにより、全ての制限部位の持続性保証し、フレームクローニングを可能とし、前のベクターとpGAD424とを適合させる。我々は以下ののリンカー(プライマー:aattcttaatacgactcactatagggcaおよびtatgccctatagtgagtcgtattaag)を使用し、EcorIおよびNde1クローニング部位を使用した。我々は同じ方法を逆T7にも採用し、BamH1およびPst1と共に(プライマー:gatccgtcgacagatctccctatagtgagtcgtattactgca catgggccctatagtgagtcgtattaagおよびgtaatacgactcactatagggagatctgtcgacg)を用いた。Sal1の損失をさけるため、我々はこれをプライマーに含めた。得られたベクターをpAS2−cyh2−HA+bothT7finalと命名した。

実施例

0042

pGAD424中のT7プロモーター(または別法としてT3またはSP6プロモーター)により、タンパク質との相互反応からRNAiへ迅速に進めることができ、単離したDNAフラグメントに機能を割り当てることができる。さらなる利点は、in vitro転写と結合したin vitro翻訳(GAL4DBまたはGAL4ADと共にフレーム中にATGがある)による、実際のタンパク質‐タンパク質相互反応のin vitro制御(例、プルダウンアッセイ)に使用できるラベルされたタンパク質の作成能力である。
作成されたプラスミドの配列およびSP6およびT3ポリメラーゼは以下の配列表に示す。

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