技術 エストロゲンの超高感度測定法

0001

本発明は、試料中に含まれるエストロゲンを液体クロマトグラフ−質量分析計（ＬＣ−ＭＳ）を用いて高感度に測定する方法に関する。本発明は、試料中に含まれる極めてわずかな量のエストロゲンを検出及び定量するのに有効な手法である。

0002

エストロゲンは、一般に卵胞ホルモンもしくは女性ホルモンとも言われ、乳癌、子宮体癌、消化器癌、心血管障害、性ホルモン代謝の先天性疾患、思春期早発、骨粗しょう症等、その他さまざまな疾患と密接な関係があると考えられている。その量をモニターすることは、疾患の解明や、薬理効果の判定等に有用である。作用の最も強いエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３，１７β−ジオール（エストラジオール：Ｅ２）は、１７β−水酸化ステロイド脱水素酵素２型（１７βＨＳＤ２）によって作用の弱いエストラ−１，３，５（１０）−トリエン−３−オール−１７−オン（エストロン：Ｅ１）へと変換され、Ｅ１は１７β−水酸化ステロイド脱水素酵素１型（１７βＨＳＤ１）によってＥ２へと再活性化される。妊娠していない成人閉経前女性の循環血中Ｅ２濃度はＥ１よりも１．５倍から４倍ほど高いが、男性や閉経後女性ではＥ１濃度のほうが高い。そのため、Ｅ２だけでなくＥ１も同時にモニターすることにより、代謝や疾患の状態を更に正確に把握することが可能となる。

0003

試料中Ｅ１及びＥ２の量と病態との関連を精査するには、微量なＥ１及びＥ２を正確に測定することが求められる。しかし、針生検組織や新生児、小児の血液等、多量に採取することが困難な試料では、測定に用いることができる検体に含まれるＥ１及びＥ２量は自ずと少なくなる。動物実験に多く用いられるラットやマウスの血液においても、オスのＥ１及びＥ２は顕著に少ない。また、ヒトの場合、唾液が非侵襲的且つ簡便に採取できる試料として用いられることが増えたが、唾液に含まれるホルモンは、血清に含まれるホルモンの１／２０から１／１００であるため、男性や閉経後女性の唾液に含まれるＥ１及びＥ２は極めて少量である。これらの試料に含まれるＥ１及びＥ２の量は、分析試料あたり０．１ｐｇよりも少ないことが予想される。よって、試料中のＥ１及びＥ２を正確に測定するには、定量下限値が０．１ｐｇ／ｔｕｂｅよりも低い測定法を開発することが課題となる。

0004

従来、エストロゲンの測定法はイムノアッセイが主流である。試料中には、Ｅ１やＥ２の構造類似化合物や性ホルモン結合グロブリンが共存しているため、交差反応によるバックグランドの上昇等により、測定値がキット間で変動し易い。現在Ｅ１では、定量下限が４．８ｐｇ／ｍＬと高感度の酵素免疫測定法によるキットが発売されている。また、Ｅ２においても、電気化学発光による測定では、定量下限が５ｐｇから１５ｐｇ／ｍＬが一般的であり、さらに、検出感度が１．４ｐｇ／ｍＬの高感度のＲＩＡ測定キットも発売されている。しかし、免疫法による測定は、低濃度域ほどばらつきが大きくなるため、１０ｐｇ／ｍＬ以下において測定の信頼性は低下する。

0005

ガスクロマトグラフ−質量分析計（ＧＣ−ＭＳ）で測定する方法も提案されている。ＧＣ−ＭＳにおいては、一般に、試料中エストロゲンに揮発性試薬を反応させ、その誘導体をＧＣ−ＭＳで測定する（非特許文献１、２）。しかし、これらの誘導体は不安定なため誘導体としての精製が困難であり、測定の際に資料中の不純物及び試薬の干渉を受けやすい。また、ＧＣ−ＭＳによる測定において、試料の注入量が全試料の５乃至１０％以下と少なくなりロスが多くなる。そのため、十分な感度が得られず、分析に長時間を要すること等も大きな欠点である。さらに、ＧＣ−ＭＳはＬＣ−ＭＳと比べてダイナミックレンジが狭いという欠点もある。それゆえ、微量の試料中のＥ１及びＥ２を測定するのは困難である。

0006

また、化合物のフェノール性水酸基にペルフルオロアリールエーテルを反応させてＧＣ−ＭＳで検出する報告も散見される（特許文献３〜６）が、これらの文献には、Ｅ１及びＥ２の詳細な記載がされていない。また、固相カラム上でヒト男性尿中Ｅ２のフェノール性水酸基にペンタフルオロピリジンを反応させ、該反応物のテトラフルオロピリジン誘導体をＧＣ−ＭＳで測定している報告もある（非特許文献７）が、測定範囲が１〜４０ｎｇ／ｍＬであり、低濃度の試料中Ｅ２を測定するには感度が足りない。

0007

エストロゲンを誘導体化し測定する試みは、ＬＣ−ＭＳにおいても行われている。例えば、エストロゲンのフェノール性水酸基をダンシル化（５−ジメチルアミノナフタレン−１−イルスルホン化）し、正イオン検出エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）法を用いて二次元クロマトグラフィーで測定する方法が報告されている（非特許文献８）。しかし、この方法では化合物由来のプロダクトイオンが得られず特異性に欠けるという欠点がある。

0008

エストロンのカルボニル基をｐ−トルエンスルホニルヒドラジドで誘導体化して測定する方法も報告されている（非特許文献９）。この方法では、エストロンを１０ｐｇ／ｏｎ ｃｏｌｕｍｎから測定可能であるが、小児及び閉経後女性の血中Ｅ１を測定するには感度が不十分である。

0009

Ｅ２測定では、フェノール性水酸基をペンタフルオロベンジル誘導体化した後に、１７位水酸基を１−低級アルキル−２−ピリジニウム化してＬＣ−ＭＳで測定する方法も報告されている（特許文献１）。また、Ｅ１測定では、フェノール性水酸基をペンタフルオロベンジル誘導体化した後、１７位カルボニル基をヒドラジノ−１低級アルキルピリジン化してＬＣ−ＭＳで測定する方法が報告されている（特許文献２）。特許文献１の測定感度は０．１ｐｇ／ｔｕｂｅであり、特許文献２の測定感度は０．２５ｐｇ／ｔｕｂｅといずれも高感度であるが、これらの方法でも閉経後女性の唾液や、ラットやマウスのオス血清中のＥ１及びＥ２測定には感度が足りない。

0010

0011

特許第４６６７８３２号特開２０１１−１７４７１０号公報

0012

Ｓｔｅｒｏｉｄｓ，５７，３１９−３２４（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒ．Ｊ．，５０，７８３−７９２（２００３）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３２，３１６３−３１６８（１９６７）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１２５−１２７（１９８４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，９８４，２３７−２４３（２００３）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１０４２，１−７（２００４）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ａ，１２１８，９１３５−９１４１（２０１１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．，５４，８３０−８３７（２０１１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，７６，５８２９−５８３６（２００４）

0013

0014

本発明の課題は、試料中に存在する極めて微量のエストロゲンをＬＣ−ＭＳを用いて高感度に検出・定量する方法を提供することである。

0015

本発明者らは、鋭意検討した結果、誘導体化に用いる試薬と精製法の見直しによって、０．１ｐｇ／ｔｕｂｅよりも少量である極めて微量の試料中エストロゲンを高感度に測定できる方法を開発し、課題を克服した。本発明者らは、エストロゲンを微量測定するため、まず、アルカリ条件下でフェノール性水酸基を選択的にペンタフルオロピリジン化した後、該反応物のカルボニル基及びアルコール性水酸基を種々誘導体化して、その誘導体の測定感度を精査した。その結果、カルボニル基は１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾン化及びアルコール性水酸基は、ピリジンカルボン酸エステル誘導体化することにより、ＬＣ−ＭＳにおいて良好な感度で測定できることを見出し、本発明を完成させた。

0016

本発明は、試料中のエストロゲンのフェノール性水酸基にペンタフルオロピリジンを導入した後に、該反応物が有しているカルボニル基に１−低級アルキルヒドラジノピリジニウム塩（以下、ヒドラジノ−１低級アルキルピリジン）を反応させ、及び／又は該反応物が有しているアルコール性水酸基にピリジンカルボン酸を反応させ、ＬＣ−ＭＳで測定することを特徴とする。

0017

すなわち、本発明は、エストロゲンをＬＣ−ＭＳで測定する方法であって、
１．試料中に存在する該化合物にペンタフルオロピリジンをアルカリ条件化で反応させる工程、及び
２．上記１の反応物であるテトラフルオロピリジルエーテル誘導体が有するカルボニル基にヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンを酸性条件化で反応させる工程、及び／又は
３．上記１で得られたテトラフルオロピリジルエーテル誘導体が有するアルコール性水酸基に下記式（Ｉ）で示される化合物を反応させる工程、

（式中、Ｒは水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、ＣＯＸはカルボン酸又はその反応性官能基を表す。）
を含む測定方法に関する。

0018

本発明のエストロゲンの測定方法は、安全且つ簡便な操作であり、試料中のエストロゲン、例えば、Ｅ１は０．０５ｐｇ／ｔｕｂｅ、Ｅ２は０．０１ｐｇ／ｔｕｂｅから検出できるという利点がある。本発明は、カルボニル基を有するエストロゲンと、水酸基を有するエストロゲンの両方を一連の操作で処理を行い、測定することが可能であるため、少量の試料であっても、Ｅ１とＥ２を高感度に測定することができる。

0019

0020

図１はＥ１−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−（１´−メチルピリジニウム−２´）−ヒドラゾン誘導体のマススペクトルである。図２はＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−フザリン酸誘導体のマススペクトルである。図３はＥ１−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−（１´−メチルピリジニウム−２´）−ヒドラゾン誘導体の０．０５ｐｇ〜１００ｐｇ／ｔｕｂｅの検量線である。図４はＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−フザリン酸誘導体の０．０１〜１００ｐｇ／ｔｕｂｅの検量線である。

0021

本発明において、「エストロゲン」とは、フェノール性水酸基を有するステロイド化合物を意味する。例えば、エストロン、エストラジオール、２−ヒドロキシエストロン、４−ヒドロキシエストロン、２−ヒドロキシエストロン３−メチルエーテル、４−ヒドロキシエストロン３−メチルエーテル、２−メトキシエストロン、４−メトキシエストロン、１６α−ヒドロキシエストロン、１６−オキソエストラジオール、２−ヒドロキシエストラジオール、４−ヒドロキシエストラジオール等の生体内又は自然界に存在するエストロゲンを挙げることができる。

0022

本明細書において、「固相抽出カラム」とは、一般的なカートリッジカラムを表し、本発明においては、市販されているものを使用することができる。充填剤の分離モードには、順相、逆相、分配、イオン交換、分子ふるい、アフィニティー等が挙げられるが、中でも、逆相、順相及びイオン交換が好適である。

0023

本明細書において、「ＬＣ−ＭＳ」とは、液体クロマトグラフと質量分析計とを組み合わせた装置を用いて行う分析方法を表すが、その中でも、質量分析部が複数結合したタンデム型の質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いることが好ましい。ＬＣ−ＭＳにおけるイオン化は、例えば、大気圧化学イオン化法、ＥＳＩ、大気圧光イオン化法等が挙げられるが、中でも正イオン検出ＥＳＩを用いることが望ましい。

0024

また質量分析部には、例えば、磁場型、四重極型、飛行時間型等が挙げられるが、定量性が良く、ダイナミックレンジが広く直線性が良好な四重極型を使用することが好ましい。

0025

さらに、定量におけるイオンの検出は、目的とするイオンのみを選択的に検出する、選択イオンモニタリングや、１つ目の質量分析部で精製したイオン種のうち１つを前駆イオンとして選択し、２つ目の質量分析部で、その前駆イオンの開裂によって生じるプロダクトイオンを検出する、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）等が挙げられる。本発明では、選択性が増し、ノイズが減ることによってシグナル／ノイズ比が向上するＳＲＭによる測定が好ましい。

0026

さらに、本明細書において、「試料」とは、特に限定はなく、生物、環境又は工業製品いずれの由来のものであってもよい。生物由来の試料としては、例えば、ヒトを含む動物の血液、唾液、涙液、汗、尿、糞、胆汁、組織、生体細胞、組織又は細胞培養液又は臓器から得られる調製物、あるいは植物からの抽出物等を挙げることができる。また、環境由来の試料としては、例えば、土壌、汚水、廃水、河川水、海水等が挙げられる。さらに、工業製品由来の試料としては、食料品、医薬品等が挙げられる。中でも、生体由来試料として、ヒトを含む動物の血液、唾液、尿、組織及び生体細胞等が、環境由来試料としては、廃水、河川水等が、工業製品由来試料としては、医薬品が好ましい。

0027

本発明において、「ペンタフルオロピリジン」とは、ＣＡＳ登録番号７００−１６−３の下記式（ＩＩ）に示す化合物のことを表す。

0028

本明細書において、「低級アルキル」は炭素数１〜６、好ましくは炭素数１〜３の直鎖状又は分枝鎖状のアルキル基を意味する。このような低級アルキル基としては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチル等を挙げることができる。好適には、メチル、エチル、ｎ−ブチル、ｎ−プロピルを挙げることができる。

0029

また、本発明において使用することのできる、「ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジン」としては、例えば、ジラード試薬Ｐ及び２−ヒドラジノ−１−メチルピリジン等が挙げられ、この中でも、反応性が優れ、感度が良い２−ヒドラジノ−１−メチルピリジンを用いた誘導体化が好ましい。このヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンも、公知化合物であるか、公知化合物から公知の方法で合成することができる。

0030

さらに本発明において使用することのできる、下記式（Ｉ）

で示される化合物におけるＣＯＸは、カルボン酸又はカルボン酸の反応性官能基を表す場合が好ましい。「カルボン酸」としては、ピコリン酸、ニコチン酸、イソニコチン酸、６−メチルピコリン酸、フザリン酸、キナルジン酸等が挙げられるが、この中でも、特にピコリン酸、フザリン酸が好ましい。「反応性官能基」としては、例えば、酸ハライド、酸無水物、混合酸無水物、活性アミド、活性エステル等を挙げることができる。この中、ＣＯＸが酸ハライドを表す場合が好ましく、特にＣＯＸが酸クロライドを表す場合が好適である。

0031

また、上記式（Ｉ）で示される化合物におけるＲがハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基又はジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基を表す場合が好ましく、中でもＲがＣ１−４アルキル基を表す場合が好適である。

0032

さらに、本発明の測定方法において、前記式（Ｉ）で示される化合物における−ＣＯＸの置換位置は特に制限されることはないが、好ましくはピリジン環の２位である。

0033

なお、前記式（Ｉ）の化合物はその殆どが既知であり、たとえ新規であったとしても、既知化合物から既知の方法により容易に合成することができる。

0034

本発明の測定方法について、以下に具体的に説明する。

0035

１．ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンの調製
ヒドラジノ−１−低級アルキルピリジンの調製方法については、特開２０１０−３６８１０にて開示されているが、簡単に述べると、ヒドラジンと２−ハロゲノ−１−低級アルキルピリジニウムｐ−トルエンスルホン酸塩等の一般的な市販合成原料をアセトニトリル等の不活性溶媒に溶解して反応させることにより得ることができる。この反応は、−１０℃乃至５０℃の範囲で行うことができるが、反応開始から５分から１５分の間は、−５℃乃至５℃の範囲内の温度で行うことが望ましい。その後は、１０℃乃至４０℃の範囲内が適している。また、反応溶媒としては、一般的な不活性有機溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン等を使用することができる。

0036

２．試料の調製
血清、血漿、廃水、唾液、尿、培養細胞及びヒトを含む動物の組織ホモジネート液等ら得られる試料からのエストロゲンの調製は、有機溶媒による抽出や固相抽出による簡易カラムクロマトグラフィーにより分離精製する一般的調製方法を適宜選択して用いることができる。有機溶媒は、一般に市販されている有機溶媒、例えば、酢酸エチル、アセトニトリル、ジエチルエーテル等を用いることができる。また、一般に使用されている固相抽出カラム、例えば、ウォーターズ社製のＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸや資生堂社製のａｄａｎｄｅ：ｌＰＡＸ（登録商標）を用いてエストロゲンのみを選択的に分離することも必要に応じて行うことができる。なお、各試料の性質、採取量等から各々調整、抽出の条件を適宜変更しても差し支えない。

0037

３．ペンタフルオロピリジン誘導体の調製
上記で調製した試料をアセトニトリル等の不活性溶媒に溶解し、アルカリ条件下でペンタフルオロピリジンを反応させることにより、上記で調製した試料中のエストロゲンをペンタフルオロピリジン誘導体化する。この反応は、−１０℃乃至８０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは５℃乃至４０℃の範囲内の温度が適している。ペンタフルオロピリジンの使用割合は特に制限されるものではないが、一般に試験管あたり０．０１乃至０．５ｍＬとすることができ、好ましくは、０．０２５乃至０．０７５ｍＬが適している。さらに、アルカリ条件下とは、反応液のｐＨを１０乃至１４、好ましくは１２乃至１４の範囲とすることを意味し、水酸化カリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、トリエチルアミン、トリエタノールアミン、ジエチルアミン等の塩基の中から、反応液を上記ｐＨの範囲にするのに十分な種類及び量を適宜選択して用いることができる。

0038

４．１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンの調製
上記３の方法より調製したエストロゲンのペンタフルオロピリジン誘導体の内、エストロンその他のカルボニル基を有するエストロゲンのカルボニル基は、アセトニトリル等の不活性溶媒に溶解した後、トリフルオロ酢酸等の酸性下で１−低級アルキルピリジニウムヒドラゾンへと変換することができる。

0039

この反応は、−１０℃乃至６０℃の範囲内の温度で行うことができ、好ましくは、１５℃乃至４０℃の範囲内の温度が適している。また、反応溶媒としては一般的な不活性溶媒、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、アセトニトリル、酢酸エチル、テトラヒドロフラン等を使用することができる。また、カルボニル基を有するエストロゲンのペンタフルオロピリジン誘導体に対するヒドラジノ−１低級アルキルピリジンの使用割合は、特に制限されるものではないが、一般に試験管あたり０．１μｇ乃至５００μｇとすることができ、好ましくは１μｇ乃至５０μｇが適している。

0040

５．ピリジンカルボン酸エステル誘導体の調製
上記３の方法より調製したエストロゲンのペンタフルオロピリジン誘導体の内、エストラジオールその他のアルコール性水酸基を有するエストロゲンのアルコール性水酸基に、下記式（Ｉ）

（式中、Ｒは水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１−４アルキル基、Ｃ１−４アルコキシ基、アリルＣ１−４アルコキシ基、Ｃ１−４アルキルアミノ基、ジ（Ｃ１−４アルキル）アミノ基、ニトロ基又はシアノ基を表し、Ｘはヒドロキシ基又は脱離基を表す。）
で示される化合物を反応させ、ピリジンカルボン酸エステル誘導体にすることで検出感度が上昇する。

0041

この反応は、アセトニトリル等の不活性溶媒、例えば、ジオキサン、テトラヒドロフラン及びジメトキシエタン等のエーテル類、ベンゼン、トルエン及びキシレン等の芳香族炭化水素類、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド等のアミド類、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド等の不活性有機溶媒に溶解又は懸濁した状態にて、適当な塩基、例えば、トリエチルアミン、ピリジン等の存在下にて行うことができる。反応温度は、通常−５℃乃至８０℃の範囲内の温度とすることができ、好ましくは１０℃乃至６０℃の範囲内の温度が適している。また、反応時間は通常５乃至２４０分の範囲内の時間とすることができ、好ましくは、１０乃至９０分の範囲内の時間が適している。

0042

上記反応及びその他の本発明における反応後の試薬等との分離、精製には、一般的な固相抽出カラム、例えば、Ｏａｓｉｓ ＷＣＸ（登録商標・ウォーターズ）、ＩｎｅｒｔＳｅｐ Ｐｈａｒｍａ（登録商標・ジーエルサイエンス）、Ｂｏｎｄ Ｅｌｕｔ Ｃ１８（登録商標・バリアン）等を用いることができる。

0043

なお、本発明の測定方法におけるＬＣ−ＭＳ測定は、当業者に一般的な方法により行うことができる。

0044

以下の実施例は、本発明をより詳細に説明するものであるが、本発明はこれに限定されるものではない。

0045

エストロン及びエストラジオールの同時定量の再現性
１−１．検量線及びＱＣ試料の作製
検量線試料として、試験管にＥ１及びＥ２のメタノール溶液（それぞれ、０．０５、０．１、０．２５、１、１０、１００ｐｇ／５０μＬ、０．０１、０．０５、０．１、１、１０、１００ｐｇ／５０μＬ）を５０μＬ添加し、精製水で１ｍＬにした。ＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ）試料として、試験管にエストロン及びエストラジオールのメタノール溶液（それぞれ、０．０５、０．０７５、０．１ｐｇ／５０μＬ、０．０１、０．０２、０．０３ｐｇ／５０μＬ）を５０μＬ添加し、精製水で１ｍＬにした。
次いで、内標準（Ｅ１−１３Ｃ４及びＥ２−１３Ｃ４各１０ｐｇ／５０μＬ）、酢酸エチル３ｍＬを加え、５分振とう後、水層を凍結分離し得られた溶媒を留去した。残渣をメタノール０．５ｍＬで溶解した後、精製水１ｍＬを加え、あらかじめメタノール３ｍＬ、精製水３ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓ（登録商標）ＭＡＸカートリッジ（ウォーターズ社）に負荷した。１％酢酸１ｍＬ、３０％アセトニトリル１ｍＬ、１Ｍ水酸化ナトリウム１ｍＬ、メタノール３ｍＬ、１％酢酸１ｍＬ、ピリジン／６０％メタノール（１：１００）１ｍＬで洗浄後、ピリジン／９０％メタノール（１：１００）１ｍＬでＥ１及びＥ２を溶出し、溶出液を遠心エバポレーターで留去した。

0046

２−２．Ｅ１−３−テトラフルオロピリジルエーテル及びＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテルの作製
前項１−１で得られたＥ１及びＥ２を含む残留物に、ペンタフルオロピリジン０．０５ｍＬ、アセトニトリル０．１ｍＬ、１Ｍ水酸化ナトリウム０．０４ｍＬ、エタノール０．０１５ｍＬを加え、よく振り混ぜた後、室温で２０分放置した。反応後、反応試薬を減圧下で留去した後、精製水０．５ｍＬ、ヘキサン２ｍＬを加え、５分間振とう後、水層を凍結分離し得られた溶媒を減圧下で留去した。

0047

２−３．Ｅ１−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−（１´−メチルピリジニウム−２´）−ヒドラゾン誘導体の作製
上記２−２で得られたＥ１−３−テトラフルオロピリジルエーテル及びＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテルを含む残留物に２−ヒドラジノ−１−メチルピリジン１ｍｇを１％トリフルオロ酢酸−アセトニトリル（１：１４００）で溶解したものを０．１４ｍＬ加え、室温で１時間放置した。２−ヒドラジノ−１−メチルピリジンの作製法は、特開２０１０−３６８１０に記載されているので、省略する。反応後、溶媒を減圧下で留去した。その残留物をメタノール０．５ｍＬで溶解後、精製水０．５ｍＬを加え、あらかじめメタノール３ｍＬ、精製水３ｍＬでコンディショニングしたＯａｓｉｓ ＷＣＸカートリッジに負荷した。０．１Ｍリン酸二水素カリウム１ｍＬ、４０％アセトニトリル１ｍＬでカートリッジカラムを洗浄後、メタノール１ｍＬでＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテルを溶出し、減圧下で溶媒を留去した。次いで、アセトニトリル２ｍＬ、精製水０．５ｍＬ、ギ酸／６５％メタノール（１：５０）１ｍＬでカートリッジカラムを洗浄後、ギ酸／メタノール（１：５０）１ｍＬでＥ１−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−（１´−メチルピリジニウム−２´）−ヒドラゾン誘導体（Ｅ１−ＴｆｐｙＨＭＰ）を溶出した。溶出液は、減圧下で溶媒を留去した。残留物は、７０％アセトニトリル０．１ｍＬで溶解し、Ｅ１−ＴｆｐｙＨＭＰ溶液とした。

0048

２−４．Ｅ２−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−フザリン酸誘導体の作製
上記２−３で得られたＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテルを含む残留物を３０分以上減圧下で乾燥させた後、誘導体化試薬（フザリン酸４０ｍｇ、２−メチル−６ニトロ安息香酸無水物４０ｍｇ、４−ジメチルアミノピリジン２０ｍｇ／アセトニトリル１ｍＬ）０．０５ｍＬ、トリエチルアミン０．０１ｍＬを添加し、室温で３０分放置した。反応後、反応液にヘキサン／酢酸（５０：１）を０．５ｍＬ加え、よく振り混ぜた後に、あらかじめ酢酸エチル３ｍＬ、ヘキサン３ｍＬでコンディショニングしたＩｎｅｒｔＳｅｐ（登録商標）ＳＩカートリッジへ負荷した。カートリッジカラムを、ヘキサン１ｍＬ、酢酸エチル／ヘキサン（１５：８５）２ｍＬで洗浄した後、酢酸エチル／ヘキサン（４５：５５）でＥ２−３−テトラフルオロピリジルエーテル−１７−フザリン酸誘導体（Ｅ２−ＴｆｐｙＦＵ）を溶出し、溶出液を減圧下で留去した。残留物は、８０％アセトニトリル０．１ｍＬで溶解し、Ｅ２−ＴｆｐｙＦＵ溶液とした。

0049

２−５．Ｅ１−ＴｆｐｙＨＭＰのＬＣ−ＭＳ測定
上記２−３で得られたＥ１−ＴｆｐｙＨＭＰ溶液０．０２ｍＬをＬＣ−ＭＳに注入して測定を行った。質量分析計でＥ１−ＴｆｐｙＨＭＰを測定したときのＥＳＩマススペクトルは、ｍ／ｚ５２５にインタクトプロトン付加イオンが検出された（図１）。また、ｍ／ｚ５２５をプレカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ測定を行った結果、ｍ／ｚ３０８が最も特異性の高いプロダクトイオンであったため、これらのイオンを用いてＳＲＭ測定を行った。測定条件を下記表１に示す。

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２−６．Ｅ２−ＴｆｐｙＦＵのＬＣ−ＭＳ測定
上記２−４で得られたＥ２−ＴｆｐｙＦＵ溶液０．０２ｍＬをＬＣ−ＭＳに注入して測定を行った。質量分析計でＥ２−ＴｆｐｙＦＵを測定したときのＥＳＩマススペクトルは、ｍ／ｚ５８３にインタクトプロトン付加イオンが検出された（図２）。また、ｍ／ｚ５８３をプレカーサーイオンとしてＭＳ／ＭＳ測定を行った結果、ｍ／ｚ３０８が最も特異性の高いプロダクトイオンであったため、これらのイオンを用いてＳＲＭ測定を行った。測定条件を下記表２に示す。

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上記２−５及び２−６で得られたＥ１の再現性試験の結果を下記表３に、Ｅ２の再現性試験の結果を表４に示す。

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上記表３及び４の結果より、本発明の方法を用いると、Ｅ１は０．０５ｐｇ／ｔｕｂｅ、Ｅ２は０．０１ｐｇ／ｔｕｂｅの濃度から定量できることが示された。

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実施例１と同様にして同一血清中Ｅ１及びＥ２の定量をそれぞれ５回行い、再現性を確認した。その結果を下記表５及び６に示す。

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上記表５及び６の結果より、血清中のＥ１及びＥ２を再現性良く定量できることが示された。

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本発明は、試料中に含まれる極めてわずかな量のエストロゲンを分離し、非常に高感度に定量することができる。反応も、いずれも室温で１０分から６０分以内であり、簡便で迅速である。生成した誘導体は、極めて安定である。本発明を用いることにより、極少量の試料や、閉経後女性や小児等含まれるエストロゲン量が非常に少ない試料からも、エストロゲンを検出することが可能となる。本発明は、薬物による疾病の治療効果や、病態の評価に非常に有効な手段である。