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技術 ウシ白血病ウイルス(BLV)検出用キットおよびその利用

出願人 国立研究開発法人理化学研究所
発明者 間陽子竹嶋伸之輔神馬繭子遠藤大二
出願日 2011年10月21日 (9年8ヶ月経過) 出願番号 2013-518618
公開日 2013年12月9日 (7年7ヶ月経過) 公開番号 2013-543720
状態 特許登録済
技術分野 突然変異または遺伝子工学 酵素、微生物を含む測定、試験 微生物、その培養処理
主要キーワード 滑面処理 検査用サンプル グラフィックソフトウェア EBL DNA吸着 希釈点 検査サンプル 集団発生
関連する未来課題
重要な関連分野

この項目の情報は公開日時点(2013年12月9日)のものです。
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図面 (9)

課題・解決手段

本発明に係るウシ白血病ウイルスBLV)検出用キットは、50塩基以下からなり、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドである第一のPCRプライマーと、50塩基以下からなり、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドである第二のPCRプライマーとを含む。

概要

背景

ウシ白血病ウイルスBLV)は、ヒトT細胞白血病ウイルス1型および2型HTLV−1および2)と密接に関連しており、最も多くみられるウシの腫瘍性疾患である地方性ウシ白血病EBL)の病因である(非特許文献9)。BLVによる感染は、無白血病状態のウシに臨床的無症状を維持させ得る。また、BLVによる感染は、Bリンパ球数の増大によって特徴づけられる持続性リンパ球増多症PL)、またはよりまれに長い潜伏期の後に、種々のリンパ節におけるB細胞リンパ腫として現われ得る(非特許文献9)。

構造タンパク質および酵素タンパク質であるGag、PolおよびEnvタンパク質に加えて、BLVは、env遺伝子および3’末端反復配列LTR)の間に位置しているpX領域に、少なくとも2つの制御タンパク質(すなわちTaxおよびRex)をコードしている(非特許文献9)。さらに、BLVは、env遺伝子およびpX領域におけるtax/rex遺伝子の間にある領域にいくつかの小さな他のオープンリーディングフレームを含んでいる。これらは、R3およびG4と命名されている産物をコードしている(非特許文献10)。BLVは、U3領域、非常に長いR領域およびU5領域を保有しているまったく同じ2つのLTRを有している。これらのLTRは、BLVによる増殖感染している細胞において、効率的な転写プロモータ活性を発揮するのみである(非特許文献9)。BLVは、宿主ゲノムの離れた部位に組み込まれ得(非特許文献11)、インビボにおいて転写を起こさないと思われる(非特許文献12)。実際に、感染個体からの新しい腫瘍細胞または末梢血単核細胞(PBMC)におけるBLVゲノムの転写は、従来技術によってほとんど検出不可能である(非特許文献12、13)。インシチュハイブリダイゼーションは、臨床的に正常なBLV感染した動物から新しく単離されたPBMCの集団において、多くの細胞における低レベルおよびわずかな細胞における高レベルウイルスRNAの発現を明らかにしている(非特許文献14)。検出可能なBLV抗体がない場合であっても、BLVプロウイルスは細胞のゲノムに組み込まれて残っていると思われる。したがって、従来の血清学的な手法(例えば、免疫拡散試験(非特許文献15〜18)および酵素結合免疫吸着検定ELISA)(非特許文献17〜20))を用いたBLV感染の定法の診断に加えて、宿主ゲノム内に組み込まれたBLVプロウイルスゲノムを検出することを目標にする診断的なBLVのPCR手法も一般に使用されている(非特許文献17〜19、21〜23)。

概要

本発明に係るウシ白血病ウイルス(BLV)検出用キットは、50塩基以下からなり、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドである第一のPCRプライマーと、50塩基以下からなり、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドである第二のPCRプライマーとを含む。

目的

本発明は上述の問題を解決するためになされ、本発明の目的は、BLVの多様性に十分に対応する新たなBLV検出用キットおよびその利用を提供する

効果

実績

技術文献被引用数
1件
牽制数
1件

この技術が所属する分野

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請求項1

50塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む第一のPCRプライマーと、50塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む第二のPCRプライマーとを含む、ウシ白血病ウイルスBLV)検出用キット

請求項2

40塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含む上記第一のPCRプライマーと、40塩基以下のオリゴヌクレオチドであって、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含む上記第二のPCRプライマーとを含む、請求項1に記載のウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキット。

請求項3

上記第一のPCRプライマーは、配列番号1で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含み、上記第二のPCRプライマーは、配列番号2で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含む、請求項1又は2に記載のウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキット。

請求項4

上記第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーがいずれも、取りうる全プライマーの混合物としての縮重プライマーとして構成される、請求項1から3の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキット。

請求項5

上記第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的にハイブリダイズするTaqMan(商標プローブをさらに含む、請求項1から4の何れか一項に記載のウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキット。

請求項6

上記TaqMan(商標)プローブは、配列番号3又は4で示す塩基配列を含む、請求項5に記載のウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキット。

請求項7

ウシ白血病ウイルス(BLV)の検出方法であって、請求項1〜6に記載のウシ白血病ウイルス検出用のキットを用いて、ウシから取得した検査用サンプルにおけるBLV由来の遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む、検出方法。

技術分野

0001

本発明は、ウシ白血病ウイルスBLV)検出用キットおよびその利用に関する。

背景技術

0002

ウシ白血病ウイルス(BLV)は、ヒトT細胞白血病ウイルス1型および2型HTLV−1および2)と密接に関連しており、最も多くみられるウシの腫瘍性疾患である地方性ウシ白血病EBL)の病因である(非特許文献9)。BLVによる感染は、無白血病状態のウシに臨床的無症状を維持させ得る。また、BLVによる感染は、Bリンパ球数の増大によって特徴づけられる持続性リンパ球増多症PL)、またはよりまれに長い潜伏期の後に、種々のリンパ節におけるB細胞リンパ腫として現われ得る(非特許文献9)。

0003

構造タンパク質および酵素タンパク質であるGag、PolおよびEnvタンパク質に加えて、BLVは、env遺伝子および3’末端反復配列LTR)の間に位置しているpX領域に、少なくとも2つの制御タンパク質(すなわちTaxおよびRex)をコードしている(非特許文献9)。さらに、BLVは、env遺伝子およびpX領域におけるtax/rex遺伝子の間にある領域にいくつかの小さな他のオープンリーディングフレームを含んでいる。これらは、R3およびG4と命名されている産物をコードしている(非特許文献10)。BLVは、U3領域、非常に長いR領域およびU5領域を保有しているまったく同じ2つのLTRを有している。これらのLTRは、BLVによる増殖感染している細胞において、効率的な転写プロモータ活性を発揮するのみである(非特許文献9)。BLVは、宿主ゲノムの離れた部位に組み込まれ得(非特許文献11)、インビボにおいて転写を起こさないと思われる(非特許文献12)。実際に、感染個体からの新しい腫瘍細胞または末梢血単核細胞(PBMC)におけるBLVゲノムの転写は、従来技術によってほとんど検出不可能である(非特許文献12、13)。インシチュハイブリダイゼーションは、臨床的に正常なBLV感染した動物から新しく単離されたPBMCの集団において、多くの細胞における低レベルおよびわずかな細胞における高レベルウイルスRNAの発現を明らかにしている(非特許文献14)。検出可能なBLV抗体がない場合であっても、BLVプロウイルスは細胞のゲノムに組み込まれて残っていると思われる。したがって、従来の血清学的な手法(例えば、免疫拡散試験(非特許文献15〜18)および酵素結合免疫吸着検定ELISA)(非特許文献17〜20))を用いたBLV感染の定法の診断に加えて、宿主ゲノム内に組み込まれたBLVプロウイルスゲノムを検出することを目標にする診断的なBLVのPCR手法も一般に使用されている(非特許文献17〜19、21〜23)。

先行技術

0004

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発明が解決しようとする課題

0005

BLVは、世界中のウシに感染しており、乳牛産業に対する経済的な影響を強いている(非特許文献16〜20、24〜26)。BLVのenv遺伝子の遺伝学多様性に関する最近の研究によれば、世界中の様々な場所のBLV分離株において遺伝的変異が示されている(非特許文献24、27)。さらに、上述のように、BLVは、感染後ただちに潜伏段階入り、BLV抗原およびmRNAはウシにおいてほとんど発現されない。したがって、BLV抗原の量、BLVのmRNAの発現レベルなどによって、BLVの正確な検出および定量を行うことは困難である。

0006

したがって、BLVに誘導された白血病の発生の機序を理解し、BLV感染した動物の選別を実施するために、BLV感染したウシにおける疾患の過程の全体を通じたプロウイルス量の変化の詳細な評価が求められている。

0007

しかし、BLVの多様性に対応するプライマーは、BLVの高い変異率に大きく起因して、開発されていない。また、BLVプロウイルス用のリアルタイム定量的PCRは、臨床サンプル間のDNA配列のばらつきによって引き起こされる増幅効率差異に大きく起因して、開発されていない。

0008

本発明は上述の問題を解決するためになされ、本発明の目的は、BLVの多様性に十分に対応する新たなBLV検出用キットおよびその利用を提供することである。

0009

さらに、本発明の他の目的は、ほぼすべてのBLVバリアントのプロウイルス量を測定するための新たな定量的リアルタイムPCR法を開発するために、上記キットを使用することである。

課題を解決するための手段

0010

上記課題を解決するために、本発明は、ウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキットであって、50塩基以下からなり、配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第一のPCRプライマーと、50塩基以下からなり、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含むオリゴヌクレオチドからなる第二のPCRプライマーとを含むものを提供する。また、第一のプライマーと第二のプライマーとは、縮重プライマーであることが好ましい。

図面の簡単な説明

0011

ウシ白血病ウイルス(BLV)−CoCoMo−qPCR法に使用されたプライマーおよびプローブの位置、長さおよび方向に関する図である。表示されている矢印は、各プライマーの方向および長さを示している。黒塗りの箱はプローブのアニーリング位置を示している。(A)BLV細胞株FLK−BLVのサブクローンpBLV913におけるBLVのプロウイルス構造、完全ゲノム(DDBJ: EF600696)。プロウイルス構造は、1〜531位および8190〜8720位のヌクレオチド位置に2つのLTR領域を含んでいる。ロアーケースの表示はこれらのLTR領域を示している。上段数字は5’LTRの位置を示しており、下段の数字は3’LTRの位置を示している。両方のLTRは、U3領域、R領域およびU5領域を含んでいる。Tax応答配列(TRE)として知られている3つ組の21bpのモチーフは5’LTRのU3領域に存在する。増幅にとっての標的はU3領域およびR領域にあり、PCR産物検出用のTaqMan(商標)プローブはR領域に基づいていた。(B)ウシの主要な組織適合性複合体(BoLA)−DRA遺伝子(上段)およびそのcDNAクローンMR1(DDBJ: D37956)(下段)。エキソンは白抜きの箱として示されている。数字はMR1のヌクレオチド配列の番号を示している。5’UT、5’−非翻訳領域;SP、シグナル配列;α1、第1ドメイン;α2、第2ドメイン;CP、連結ペプチド;TM、膜貫通ドメイン;CY、細胞質ドメイン;3’UT、3−非翻訳領域。増幅、およびPCR産物検出用のTaqMan(商標)プローブの結合にとっての標的領域はエキソン4にある。
BLV−LTR領域増幅用プライマーセットの選択に関する図である。(A)CoCoMoプログラムによって設計された、Table.1に示されているような42のプライマーを用いた72のプライマーセットを使用して、タッチダウンPCRを実施した。PCR産物を3%アガロースゲルに対する電気泳動によって検出した。レーン1〜72、1〜72のプライマーセットのID;+、PCR産物についてポジティブの結果;−、PCR産物についてネガティブの結果。*は、検出されたが、アンプリコンのサイズが予想されたサイズと異なっていたPCR産物を示している。(B)(A)に示されている結果のまとめ。プライマーセットのIDは、プライマーセットの縮重およびPCR産物のサイズにしたがって並べられている。(C)16のプライマーセットを用いた代表的な4つの融解曲線:(a)BLV感染したBLSC−KU−17細胞、(b)BLVなしの正常なウシの細胞、および(c)ネガティブコントロールとしての試薬のみ。選択された16のプライマーセットの特異性融解曲線分析によって確認された。各PCR増幅は、95℃以下における段階的な産物の融解にしたがった。(D)プライマーセットのID15(CoCoMo6および81)を用いたPCR増幅の最適化。(a)BLV感染したBLSC−KU−17細胞、(b)BLVなしの正常なウシNs118、および(c)ネガティブコントロールとしての試薬のみから得られたPCR産物の融解曲線。
52のBLV LTR配列における(A)CoCoMo6プライマー、(B)FAM−BLV−MGBプローブ、および(C)CoCoMo81プライマーのアニーリング位置における配列アラインメントに関する図である。配列アラインメントは、合計11の配列(CoCoMo6プライマーについて8の個々の配列およびCoCoMo81プライマーについて4の個々の配列を含んでいる)にまとめられたGenBankから得た52の配列を使用した。代表的な配列についての受託番号は左欄に示されている。番号は、FLK−BLVのサブクローンpBLV913(DDBJ: EF600696)のヌクレオチド配列の番号を示している。上段の番号は5’LTRの位置を示しており、下段の番号は3’LTRの位置を示している。
BLV−CoCoMo−qPCRプライマーの特異性の評価に関する図である。(A)BLV−CoCoMo−qPCRに基づくCoCoMo6およびCoCoMo81プライマーを用いたリアルタイムPCRを、0.3ngの以下の感染性分子クローンを用いて実施した:BLV(pBLV−IF、レーン2);HTLV−1(pK30、レーン3);HIV−1(pNL4−3、レーン4);SIV(pSIVmac239/WT、レーン5);MMTV(ハイブリッドMMTV、レーン6);M−MLV(pL−4、レーン7);およびプラスミド(pUC18(レーン8)、pUC19(レーン9)、pBR322(レーン10)、およびpBluescriptSK(+)(レーン11))。PCR産物を3%アガロースゲル電気泳動にかけた。レーン1、DNAマーカーФ×174-Hae III digest。168bp長のPCR産物は矢印によって示されている。(B)各DNAサンプルから得た1μgのDNAにおけるBLVプロウイルスのコピー数は、ロアーケースによって示されている。値は、3つの独立した実験の結果の平均値標準偏差(SD)を表している。
BLV−CoCoMo−qPCRおよびネステッドPCRの感度の比較に関する図である。0.7コピーのpBLV−LTR/SKを含有している10のサンプルを、(A)ネステッドPCR、ならびに(B)CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって増幅した。(A)BLV−LTRアンプリコンを検出するために、168bpのバンドを使用した。(B)チューブの違いの補正のために、カルボキシ−X−ローダミン(ROX)強度を使用し、BLVアンプリコンを検出するために、カルボキシフルオレセイン(FAM)強度を使用した。
BLV−CoCoMo−qPCRおよび段階希釈−ネステッドPCRよって算出されたプロウイルス量の間における相関に関する図である。(A)BLV感染した6頭のウシから得た1μgのゲノムDNAについてのBLVプロウイルスのコピー数を、BLV−CoCoMo−qPCRおよび段階希釈−ネステッドPCRによって決定した。段階希釈−ネステッドPCRのために、6のゲノムDNAを10倍段階希釈によって分析し、BLV−LTR遺伝子の検出のためにネステッドPCRにかけた。ネステッドPCR反応を10回にわたって繰り返し、プロウイルス量を、[方法]に示されているようにポアソン分布にしたがって算出した。値は、4つの独立した実験から得た結果の平均値+標準偏差(SD)を表している。(B)散布図は、BLV−CoCoMo−qPCRおよび段階希釈−ネステッドPCRによって決定されたBLVのコピー数の間における相関を示している。
BLV−CoCoMo−qPCRおよびシンチチウム形成よって算出されたプロウイルス量間の相関に関する図である。(A)BLV−CoCoMo−qPCRを用いて、BLV感染した5頭のウシから得たプロウイルス量を、算出し、1×105細胞ごとのプロウイルスのコピー数として示している。CC81指標細胞を用いたシンチチウムアッセイを、BLV感染した5頭のウシから得た1×105の末梢血単核細胞(PBMC)ごとのシンチチウムの数をカウントした。値は、3つの独立したサンプルから得た結果の平均値+標準偏差(SD)を表している。(B)散布図は、BLV−CoCoMo−qPCRによって決定されたBLVのコピー数およびシンチチウムの数の間における相関を示している。
BLV−CoCoMo−qPCRによってポジティブであり、ネステッドPCRによってネガティブであったサンプルにおけるBLVのLTRヌクレオチド配列のアラインメントに関する図である。BLV感染した9頭のウシから得たBLVのLTR配列を、3つのプライマー対(BLTR56FおよびCoCoMo81、BLTR134FおよびBLTR544R、ならびにCoCoMo6およびCoCoMo81)を用いたPCRによって増幅し、続いてPCR産物を配列決定した。塗りつぶしの矢印は、これらのプライマーの位置、方向および長さを示している。YA40、MO85およびYA35から得たヌクレオチド位置74〜283および154〜526におけるLTR配列は、BLTR56FおよびCoCoMo81、ならびにBLTR134FおよびBLTR544Rの2つのプライマー対のそれぞれによって増幅された。YA56由来のヌクレオチド位置74〜283および154〜526におけるLTR配列は、BLTR56FおよびCoCoMo81のプライマー対によって増幅された。HY2、Ns27、ME10およびC336から得たヌクレオチド位置166〜283におけるLTR配列は、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマー対によって増幅された。Ns29から得たヌクレオチド位置154〜526におけるLTR配列は、BLTR134FおよびBLTR544Rのプライマー対によって増幅された。白抜きの矢印は、ネステッドPCR用の第1プライマー対(BLTR−YRおよびBLTRR)および第2プライマー対(BLTR256およびBLTR453)の位置、方向および長さを示している。配列の上における番号は、FLK−BLVのサブクローンpBLV913(DDBJ: EF600696)のヌクレオチド配列にしたがった末端塩基を示している。保存配列ドット(.)によって示されており、欠失ハイフン(−)によって示されている。配列情報欠如記号(*)によって示されている。
BLVに誘導された地方性ウシ白血病(EBL)における疾患の進行と相関する増加したプロウイルス量に関する図である。BLV−CoCoMo−qPCRによって385頭のウシについて、プロウイルス量を算出した。ウシは、以前に確立された基準(非特許文献41)、BLVのゲノムへの組込み、およびBLVに対する抗体の検出に基づいて、4つの疾患段階に分類された。当該疾患段階は、BLVネガティブの117頭のウシ(BLV−);臨床的および血液学的に正常なBLV感染した163頭のウシ(aleukemic);持続性リンパ球増多症にかかっている臨床的に正常なBLV感染した16頭のウシ(PL);およびリンパ腫にかかっているBLV感染した89頭のウシである。円/点は、各段階において検出された平均のプロウイルス量を示しており、バーは標準偏差を示している。R version 2.10.1(R Foundation for Statistical Computing)を用いたペアt検定によって、p値を算出した。

0012

以下、本発明の一実施形態について詳細に説明する。

0013

(1.BLV検出用キット)
(キットの基本構成
本発明に係るウシ白血病ウイルス(BLV)検出用のキットは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって、BLV由来のDNA断片を選択的に増幅可能なものである。ここで、「選択的に増幅可能」とは、ウシ由来検査サンプルに対して、当該キットを用いたPCRを行った場合に、BLV由来の断片が専ら増幅産物として得られるが、ウシ自身由来のDNA断片及びBLV以外のウイルス由来のDNA断片は増幅産物として相対的に少量しか得られない(又はウシ自身由来のDNA断片及びBLV以外のウイルス由来のDNA断片はほぼ得られない)ことを指す。

0014

本発明に係るキットは、具体的には以下の(1)又は(2)の何れかに示す、第一のPCRプライマーと第二のPCRプライマーとのプライマーセットを含む。
(1) 配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む、50塩基以下のオリゴヌクレオチドである第一のPCRプライマーと、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上の塩基を含む、50塩基以下のオリゴヌクレオチドである第二のPCRプライマーとの組合せ。なお、配列番号1で示す塩基配列は、表1中のprimer ID No. 6で示す塩基配列に相当する。また、配列番号2で示す塩基配列は、表1中のprimer ID No.81で示す塩基配列に相当する。
(2) 配列番号1で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含み、40塩基以下である第一のPCRプライマーと、配列番号2で示す塩基配列における連続する20以上で25以下の塩基を含み、40塩基以下である第二のPCRプライマーとの組合せ。

0015

なお、上記(1)又は(2)の何れの場合でも、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーの長さは35塩基以下であってもよく、30塩基以下であってもよい。第一のPCRプライマーは、好ましくは、配列番号1で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含む。第二のPCRプライマーは、好ましくは、配列番号2で示す塩基配列における連続する25の塩基を全て含む。

0016

第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーは、配列番号1又は2で規定されていない塩基配列を含みうる。例えば、第一のPCRプライマーが50塩基のオリゴヌクレオチドからなり、そのうち連続する20塩基のみが配列番号1で示されたものである場合は、残りの30塩基は配列番号1で規定されていないものである。このような場合でも、当業者であれば、公知になっている少なくとも一つのBLVの塩基配列を参照配列として、残りの30塩基を、当該参照配列にハイブリダイズする塩基配列として容易に決定することができる。

0017

また、本発明において、縮重塩基R(r)はA(アデニン)又はG(グアニン)を指す。縮重塩基Y(y)はC(シトシン)又はT(チミン)を指す。縮重塩基W(w)はA又はTを指す。縮重塩基S(s)はG又はCを指す。縮重塩基K(k)はG又はTを指す。縮重塩基M(m)はA又はCを指す。縮重塩基D(d)はA又はG又はTを指す。縮重塩基H(h)は、A又はC又はTを指す。縮重塩基N(n)はA又はC又はG又はTを指す。

0018

配列番号1で示す塩基配列、及び配列番号2で示す塩基配列は何れも上記した縮重塩基R、Y、W、S、K、M、D、H及びNの少なくとも一つを含む。そのため、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーはいずれも、いわゆる縮重プライマーでありうる。縮重プライマーは、少なくとも一つの塩基R、Y、W、S、K、M、D、H及びNの位置において異なる種類の複数の塩基が指定された複数種類のプライマーから構成される。より多種類のBLVを検出可能という観点では、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーは、取りうる全プライマーの混合物たる縮重プライマー(プライマーミックス)である。ただし、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーはそれぞれ、上記縮重プライマー(プライマーミックス)を構成するプライマーの一つであってもよい。

0019

上記第一のプライマー及び第二のプライマーは常法の核酸合成法に従って合成することができる。

0020

(キットに含まれうるその他の構成物
アッセイの特異性及び感度を増強するために、BLV検出用のキットはさらに、上記第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的に結合するTaqMan(商標)プローブを含んでいてもよい。上記TaqMan(商標)プローブは、例えば、配列番号3又は4に示す何れかの塩基配列を含むオリゴヌクレオチドでありえる。

0021

実施例において、CoCoMo−qPCRにおけるBLV−LTRのPCR産物を検出するためのTaqMan(商標)プローブとして、FAM−BLVプローブ(5‘−FAM−CTCAGCTCTCGGTCC−NFQ−MGB−3’)を用いた。さらに、他のTaqMan(商標)プローブ(5‘−FAM−CTCAGCTCTCGGTC−NFQ−MGB−3’)を、CoCoMo−qPCRのアンプリコンの検出に用いることもできる。しかし、感度の観点において、より長いプライマー(前者)が短いプライマーよりも好ましい。

0022

検査サンプル中に含まれる細胞数定量化して、検査サンプル中のゲノムDNA量ノーマライズするために、BLV検出用のキットはさらに、シングルコピーの宿主遺伝子であるBoLA−DRA遺伝子(bovine leukocyte antigen DRA gene)の断片を特異的に増幅するPCRプライマーセットを含んでいてもよい。

0023

BLV検出用のキットはさらに、必要に応じて、1)PCRに用いる各種試薬及び器具ポリメラーゼPCRバッファー、各dNTP、ピペット等)、2)PCRに供するDNAを含有する試料を調製するための各種試薬及び器具(試験管バッファー等)、3)PCR増幅断片解析するための各種試薬及び器具(電気泳動ゲル材料、ピペット等)、4)検出キット使用説明書、等の少なくとも1つを備えていてもよい。

0024

本発明に係るBLV検出用のキットは、BLVが存在するか否か、及び/又は、BLVの量(BLVの定量)を検出することができる。

0025

(2.BLVの検出方法
本発明に係るBLVの検出方法は、ウシ(例えば、ウシは一頭でも複数頭でもよい)から取得した検査用サンプルに対して、本発明に係るBLV検出用の上記キットを用いて、BLV由来の遺伝子断片を増幅する増幅工程を含む。

0026

より詳細には、本発明に係るBLVの検出方法は、以下の工程:
(a)DNAを含有する検査用サンプルをウシから調製するサンプル調製工程、
(b)上記検査用サンプルに対して、キットが含む第一のプライマー及び第二のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応を行う増幅工程、
(c)上記増幅工程で得られる増幅断片の有無、及び/又は当該増幅断片の量を検出する検出工程、を含む。

0027

以下、各工程を説明する。

0028

(1)調製工程
調製工程は、検査対象となるウシからDNAを含有する試料を調製する工程である。DNAを含有する試料とは、例えば、ウシの血液、血液以外の体液組織等である。なお、調製されたDNAを含有する試料には、DNAの他に、各種RNA、タンパク質細胞破砕物、等が含まれる。従って、該試料を常法に従って精製し、ゲノムDNAを抽出してもよい。

0029

(2)増幅工程
増幅工程は、上記試料に対して、本発明に係るキットが備える第一及び第二のプライマーのセットを用いたPCRを行う工程である。PCRは、PCR増幅装置を用い、常法に従って行うことができる。これにより、試料中にBLVが含まれている場合には、そのLTRに対応する増幅断片が得られる。より具体的には、検査対象となるウシのゲノムDNAに組み込まれた、プロウイルス化したBLVのLTRに対応する増幅断片が得られる。

0030

特に限定されないが、好ましいPCRの条件例を以下に示す。なお、条件1)〜5)は互いに組み合わせる事で相乗効果を奏する。
1)縮重プライマーとして用いる場合、第一のプライマーと第二のプライマーとの濃度比(PCRの反応液中)は、7:1〜13:1が好ましく、8:1〜12:1がより好ましく、9:1〜11:1がさらに好ましく、10:1が特に好ましい。
2) PCRの反応液に含まれるゲノムDNAの終濃度は、1ng/μl〜100ng/μlの範囲内が好ましく、1.5ng/μl〜20ng/μlの範囲内がより好ましい。このとき、縮重プライマーとして用いられる第一のプライマーの終濃度は、400〜600nMが好ましく、450〜550nMがより好ましい。また、縮重プライマーとして用いられる第二のプライマーの終濃度は、40〜60nMが好ましく、45〜55nMがより好ましい。
3) PCRのサイクル数は、30回〜100回程度が好ましく、60回〜90回程度がより好ましく、80回〜90回程度がさらに好ましい。
4) PCRのアニーリング温度は、55℃〜70℃が好ましく、55℃〜65℃がより好ましく、60℃程度がさらに好ましい。
5) PCRの反応液に含まれる塩化マグネシウムの濃度は、2.5mM〜3.5mMが好ましく、2.8mM〜3.2mMがより好ましく、約3mMがさらに好ましい。

0031

なお、本発明に係るキットがBoLA−DRA遺伝子(bovine leukocyte antigen DRA gene)の断片を特異的に増幅するPCRプライマーセットを含んでいる場合には、このPCRプライマーセットを用いたPCRも、第一及び第二のプライマーのセットと同一反応系で行うことができる。

0032

また、PCRによる増幅は、いわゆるリアルタイムPCRとして行うこともできる。

0033

(3)検出工程
検出工程は、増幅工程で得られるPCR増幅断片の有無、及び/又は当該PCR増幅断片の量を検出する工程である。PCR増幅断片(アンプリコン)の有無の確認は、常法に従って行うことができる。例えば、電気泳動によりPCR増幅断片の有無、量、及びサイズを確認することができる。

0034

また、本発明のキットが、第一のPCRプライマー及び第二のPCRプライマーにより増幅された遺伝子断片に特異的に結合するTaqMan(商標)プローブを含む場合には、PCR増幅断片の有無及び量を蛍光シグナルで検出することができる。

0035

PCR増幅断片の有無の確認の結果、PCR増幅断片が存在する場合には、試料にBLVが存在すると判別することができる。また、PCR増幅断片の有無の確認の結果、PCR増幅断片が実質的に存在しない場合には、試料にBLVが存在していないと判別することができる。すなわち、検出工程を通じて、ウシがBLVを保有しているか否かの診断を行うことができる。

0036

実施例に示すように、このアッセイは、特異性が高く、高感度で、高定量性で、かつ再現性が高い、そして、従来確立されていたnested-PCRアッセイを用いてもネガティブであった沢山の試料においてBLVの検出ができた。このアッセイはまた、国際的なロケーションの範囲内からのウシにおけるBLVの検出に非常に効果的であった。

0037

後述する実施例、比較例などを参照して、以下に本発明をさらに詳細に説明する。しかし、本発明はこれらに限定されない。

0038

[結果]
〔BLVプロウイルスのコピー数決定用の絶対定量原理
BLVプロウイルスの絶対的なコピー数を決定するために、PCR増幅用の標的配列としてLTR領域を選択した(図1における(A))。アッセイの設計において、2つのLTRが個々のBLVゲノムのそれぞれについて検出されることを考慮した(以下の式を参照すればよい)。また、ゲノムDNAの投入量を標準化するために、アッセイに、1コピーのBoLA−DRA遺伝子の平行した増幅を組み入れた(図1における(B))。100000細胞ごとのプロウイルスのコピー数は、以下の式:
BLVプロウイルス量
=BLVプロウイルスのコピー数/二倍体細胞数×100000細胞
=(BLT−LTRのコピー数/2)/(BoLA−DRAのコピー数/2)×100000細胞 (A)
にしたがって算出された。

0039

〔すべてのBLV株を増幅させる能力を有しているプライマーセットを構築するためのCoCoMoアルゴリズムの使用〕
すべてのBLVバリアントを増幅するために、複数のウイルス株を増幅可能なPCRプライマーを設計するために開発されたCoCoMoアルゴリズムを改変して用いて、BLVのLTRを標的化するプライマーを構築した。356のBLVヌクレオチド配列をGenBankから収集した(2009年4月30日に)。これらのBLV配列から、102のLTR配列をGenBankのannotaitionにしたがって選択した。上記LTR配列から、相同性を決定するために十分に大きい85の配列を選択し、当該配列を、Pajekグラフィックソフトウェアを用いた相同性に基づいて、主要なBLV−LTR群に指定した。これらの配列のうちの52をプライマー設計用に選択した。標的配列を、複数のウイルス株を検出する縮重プライマーを設計するために開発されたCoCoMoアルゴリズムのBLV−LTR用に改変したバージョンにかけた。これらの配列をテンプレートとして用いて、49の候補プライマー(Table.1)を有している合計72のプライマーセット(図2における(B))を設計した。

0040

〔BLV−LTR領域増幅用のプライマーセットおよびプローブの選択〕
CoCoMoプライマーセットがBLVのLTR領域を増幅したか否かを判定するために、72の候補プライマーセット(図2における(B))を用いたタッチダウンPCRを、BLV感染したBLSC−KU−17細胞から抽出されたゲノムDNAを用いて行った。図2における(A)に示されているように、BLVのLTR領域を巧く増幅した16組のプライマー(1〜6、9、15〜17、20、21、24、33、43および46)を同定した。

0041

16の選択されたプライマーの特異性を、増幅の融解曲線分析によって評価した。増幅には、BLVなしの正常なウシNs118に由来するBLSC−KU−17細胞およびPBMCから抽出されたゲノムDNAを、ネガティブコントロールとしての試薬のみとともに用いた。図2における(C)は、代表的な4つの融解曲線を示している。単一の融解温度を有している単一のPCR産物からなるアンプリコンは、単一のピークを示し、2以上の産物からなるアンプリコンは複数のピークを示した。CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットID15を用いて生成されたアンプリコンは、BLSC−KU−17細胞によって単一の融解温度を有していた。これらのプライマーを用いて、BLVなしの正常なウシNs118から得られたゲノムDNA、または試薬のみのコントロールによってアンプリコンは生成されなかった。一方で、他のプライマーセット(例えば、ID3、ID16およびID17)は、BLVなしの正常なウシNs118から抽出されたゲノムDNAからか、または試薬のみにおいてか、ならびにBLSC−KU−17細胞から抽出されたゲノムDNAからアンプリコンを生成した。このため、BLV−LTR領域の検出にとって最良のペアであった(図2における(D))CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いた増幅の最適化を続けて行った。これらの最適化された条件下において、BLVに感染した56頭のウシおよびBLVなしの正常な3頭のウシから抽出されたゲノムDNAを用いた増幅融解曲線は、BLSC−KU−17細胞およびBLVなしの正常なウシNs118に見られたパターンと同じパターンを示した(データを示さず)。

0042

BLVゲノムのLTR領域におけるCoCoMo6およびCoCoMo81と対応する位置の間にある変異性の低い領域(図1)から、BLV内部のTaqMan(商標)プローブを構築し、カルボキシフルオレセイン(FAM)色素、無蛍光クエンチャー(NFQ)および副溝結合剤(MGB)を用いて、プローブの融解温度を高めるために標識した。プローブをFAM−BLVと命名した。

0043

GenBankから入手した52のBLVのLTR配列に基づく、プライマーおよびプローブの領域と対応する配列のアラインメントを図3に示す。この比較に基づいて、52の配列のうちから、CoCoMo6プライマーと対応する8つの個々の配列、およびCoCoMo81プライマーと対応する4つの個々の配列が、整列され得た。このアラインメントによって、プローブ領域における配列は、BLVバリアントのアラインメントを可能にするほどに十分に保存されていたが、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーと対応する配列は、程度の低い類似性を示すことが証明された。

0044

〔BoLA−DRA遺伝子定量用のプライマーセットおよびプローブの構築〕
PCRテンプレートとして使用されたゲノムDNAの標準化のために、BoLA−DRA遺伝子の定量用のプライマーおよびプローブを設計した(図1)。MR1のcDNAクローン(DDJB: No. D37956)から配列を入手し、増幅用の標的としてBoLA−DRA遺伝子のエキソン4領域を選択した。増幅プライマーDRA643およびDRA734、ならびにBoLA−DRA内部のTaqMan(商標)プローブを、Primer Express 3.0(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)を用いて設計した。プローブの融解温度を高めるためにVIC色素、NFQおよびMGBプローブを用いて、プローブを標識し、VIC−DRAと命名した。

0045

〔絶対定量的PCR用の標準曲線を作成するためのプラスミドDNAコピー数の定量〕
BLVプロウイルスDNAおよび細胞性DNAの定量用の標準物質を得るために、BLVの全長LTRを含んでいるpBLV−LTR/SK、およびウシのDRA遺伝子の全長を含んでいるpBoLA−DRA/SKを、それぞれ103.1ng/μl(pBLV−LTRconc)および125.0ng/μl(pBoLA−DRAconc)において調製した。これらのプラスミドのコピー数を段階希釈法によって算出した。各プラスミドを10倍に希釈し、標的DNAをネステッドPCRによって検出した。例えば、pBLV−LTRconcの10−11希釈において、PCR増幅は、PCR産物(BLVのLTRが挙げられる)をまったく検出できなかった。それから、10−11希釈において10回にわたってPCR反応を繰り返し、成功率は5/10と分かった。10のうち5のPCR溶液はLTR遺伝子を含有しておらず、f(x=0)=5/10として方程式に表されることをこの結果は示していた。標的遺伝子の平均コピー数(λ)は、−loge(5/10)=0.231と算出され、2.31×1010/μlのpBLV−LTRconcについてのコピー数と一致していた。また、見積もられたコピー数の信頼性を確認するために、DNA質量に基づく試算の(draft)コピー数を算出し、ほぼ同じ結果(pBLV−LTRconcについて2.35×1010およびpBoLA−DRAconcについて2.85×1010)を得た。

0046

〔BLV−CoCoMo−qPCRの最適化にとっての最後の手順〕
標準曲線を作成するために、pBLV−LTRconc)および125.0ng/μl(pBoLA−DRAconcの以下の希釈物:0.1コピー/μl、1000コピー/μlおよび1000000コピー/μlを作った。500nMのCoCoMo6プライマー、50nMのCoCoMo81プライマー、150nMのFAM−BLVプローブ(5’−FAM−CTCAGCTCTCGGTCC−NFQ−MGB−3’)、および30ngのテンプレートDNAを含有している1×TaqMan Gene Expression Master Mixの総量20μlにおいて、BLV−LTRから得られた168bpのアンプリコンを増幅させた。50nMのDRA643プライマー(5’−CCCAGAGACCACAGAGAATGC−3’)、50nMのDRA734プライマー(5’−CCCACCAGAGCCACAATCA−3’)、150nMのVIC−DRAプローブ(5’−VIC−TGTGTGCCCTGGGC−NFQ−MGB 3’)、および30ngのテンプレートDNAを含有している1×TaqMan Gene Expression Master Mixの総量20μlにおいて、BoLA−DRA領域の57bpのアンプリコンを増幅させた。以下のプログラムにしたがってABI7500 Fast Real-time PCRシステムを用いて、PCR増幅を行った:ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)酵素の2分にわたる50℃における活性化、AmpliTaq Gold Ultra Pure(UP)の10分にわたる95℃における活性化、および95℃における15秒および60℃における1分の85サイクル。BLV−LTRおよびBoLA−DRAについて得られたコピー数を用いて、式(A)に示されるように、100000細胞ごとのBLVプロウイルス量を算出した。

0047

〔BLV−CoCoMo−qPCRの再現性〕
BLVプロウイルスのコピー数決定用のBLV−CoCoMo−qPCRの、アッセイ内再現性およびアッセイ間再現性を、BLV感染した7頭のウシから得られた血液サンプルから抽出されたゲノムDNAの分取物を用いて評価した(Table.2)。アッセイ内信頼性の決定のために、アッセイを3回にわたって繰り返して、各サンプルからの3組のPCR増幅物を調べた。合計21の試験を行い、アッセイ内の変動係数CV)は0%〜20.5%(平均8.6%)の範囲であった。アッセイ間信頼性の決定のために、各サンプルについて独立した3つの実験を行った。100000細胞ごとのBLVプロウイルスのコピー数についてのアッセイ間CVに関する値は、5.5%〜19.8%(平均12.7%)の範囲であった。これらの結果は、このアッセイが良好なアッセイ内信頼性およびアッセイ間信頼性を有していることを明らかに証明している。

0048

〔種々のレトロウイルスを用いたBLV−CoCoMo−qPCRプライマーの特異性の評価〕
BLV−CoCoMo−qPCRプライマーの特異性を、種々のレトロウイルス分子クローンおよび種々のプラスミドを用いて試験した。当該レトロウイルス分子クローンとしては、BLV、HTLV−1、ヒト免疫不全ウイルス1型(HIV−1)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、マウス乳がんウイルス(MMTV)、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)が挙げられる。当該プラスミドとしては、pUC18、pUC19、pBR322、およびpBluescript IISK(+)が挙げられる。リアルタイムPCRのために、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーを0.3ngの各プラスミドとともに使用し、産物を3%アガロース電気泳動によって分析した。168bp長の単一のPCR産物は、7.9×1010/μg+4.3×1010/μgのコピー数を有して(図4における(B))、BLV感染性の分子クローンについてのみ観察された(図4における(A))。アンプリコンは、他のプラスミドのいずれについても検出されなかった。これらの結果は、他のレトロウイルスのLTRを増幅させずに、BLV−CoCoMo−qPCRプライマーがBLVのLTRを特異的に増幅させることを強く示している。

0049

〔ネステッドPCRと比較された、BLV−CoCoMo−qPCRの感度の評価〕
BLV−CoCoMo−qPCRの感度を決定するために、それぞれ0.7コピーのpBLV−LTR/SKを含有している20の溶液を、ネステッドPCR、ならびにCoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって増幅させた(図5)。ネステッドPCR増幅の3/10がポジティブであり、コピー数は0.36と見積もられた。CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRについて、PCR増幅の5/10がポジティブであり、コピー数は0.69と見積もられた。この結果は、BLV−CoCoMo−qPCRの感度がネステッドPCRより1.9倍高いことを示していた。

0050

〔BLV−CoCoMo−qPCRおよび段階希釈−ネステッドPCRの比較〕
段階希釈法は、標的遺伝子のコピー数を定量化するために有効である。段階希釈−ネステッドPCR、ならびにCoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRによって、1μgのゲノムDNAごとのBLVプロウイルスのコピー数を、BLV感染した5頭のウシについて算出した(図6における(A))。両方の方法によって得られたBLVプロウイルスのコピー数を、回帰分析によって確認した。相関係数平方(R2)は、0.8806であり(図6における(B))、CoCoMoプライマーを用いたリアルタイムPCRによって得られたコピー数が、段階希釈−ネステッドPCRによって得られたコピー数と相関することを示していた。したがって、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーセットを用いたリアルタイムPCRは、臨床サンプルからのBLVプロウイルスのコピー数を得るために使用され得ると考えられる。

0051

〔BLV−CoCoMo−qPCRおよびシンチチウム形成アッセイの相関〕
BLVプロウイルスのコピー数がBLVによる感染能と相関しているか否かを調べるために、BLV−CoCoMo−qPCRおよびシンチチウム形成アッセイを、BLV感染した5頭のウシから得られたサンプルに対して行った。BLV感染した5頭のウシから得られた1×105のPBMCを、誘導因子CC81とともに3日にわたって共培養し、同じウシから得られた1×105の細胞とプロウイルスのコピー数を比較することによって、BLVの感染能を評価した(図7における(A))。プロウイルスのコピー数は105細胞につき113〜63098コピーの範囲であり、シンチチウムの数は105PBMCにつき36〜12737の範囲であった。これらのサンプルについての回帰分析によって、プロウイルス量のレベルは、図7における(B)に示されているように、シンチチウムの数と正に相関していた(R2=0.9658)。

0052

〔BLV−CoCoMo−qPCRおよびネステッドPCRによる、異なる地域からの畜牛におけるBLVプロウイルスの検出〕
縮重プライマーは高度に縮重している配列を検出可能なので、BLV−CoCoMo−qPCRは、既知および未知の両方の種々のBLV株を検出する潜在能を有している。上述の実験において、BLV−CoCoMo−qPCRの感度は、ネステッドPCRより優れていることを見出した。このため、BLV−CoCoMo−qPCRは、世界中の異なる地域からのウシにおけるBLVプロウイルスを検出し得るか否かを調べた。日本における1つの飼育場からの54頭のウシ、ペルーにおける2つの飼育場からの15頭のウシ、ボリビアにおける4つの飼育場からの60頭のウシ、チリにおける3つの飼育場からの32頭のウシ、およびアメリカにおける1つの飼育場からの5頭のウシを試験し、BLV−CoCoMo−qPCRによって得られた結果を、ネステッドPCRによって得られた結果と比較した(Table.3)。2つの方法によるBLVのLTRの増幅は、166頭のウシを3つのグループに分けた。第1グループのウシ(n=107)は、両方の方法によってBLVのLTRについてポジティブであった(日本における50頭、ペルーにおける7頭、ボリビアにおける27頭、チリにおける18頭、およびアメリカにおける5頭)。第2グループのウシ(n=50)は、両方の方法によってBLVのLTRについてネガティブであった(日本における2頭、ペルーにおける7頭、ボリビアにおける28頭、およびチリにおける13頭)。第3グループのウシ(n=9)は、BLV−CoCoMo−qPCRによってポジティブであったが、ネステッドPCRによってネガティブであった(日本における2頭、ペルーにおける1頭、ボリビアにおける5頭、およびチリにおける1頭)。興味深いことに、BLV−CoCoMo−qPCRによってネガティブであったが、ネステッドPCRによってポジティブであったウシはいなかった。したがって、ネステッドPCR法およびBLV−CoCoMo−qPCR法は、試験したウシの94.6%について同じ結果を示したが、5.4%のウシについて、BLV−CoCoMo−qPCRのみがBLVプロウイルスを検出可能であった。これらの結果は、BLV−CoCoMo−qPCRの感度がネステッドPCRより高いことを明らかに示している。

0053

Table.3に示されているように、BLV−CoCoMo−qPCRによってポジティブであったが、ネステッドPCRによってネガティブであったいくつかのサンプルを検出した。これらのサンプルがBLVに感染していたことを確認し、これらのサンプルがネステッドPCRによって検出されなかった理由を調べるために、このグループから得られた9つのサンプル:ボリビアからのYA40、MO85、YA35、YA56およびME10、ペルーからのHY2、チリからのC336、ならびに日本からのNs27およびNs29のLTR領域を配列決定した。9つのサンプルのすべてにおいてBLV−LTR配列を検出可能であり(図8)、したがって、BLV−CoCoMo−qPCRの高い特異性を確認した。2/9のサンプルにおいて、ネステッドPCRにおけるLTRの増幅のために使用されたプライマーBLTR453にとってのアニーリング領域ミスマッチ配列を同定した。これは、ネステッドPCRがBLVプロウイルスを検出できなかった理由についての考えられる解釈である。

0054

〔疾患の進行およびBLVプロウイルス量の相関分析
疾患の初期および後期におけるBLVプロウイルスの量における差異を特徴づけるために、EBLの進行の異なる段階において、BLV感染した268頭のウシについてBLVプロウイルスのコピー数を算出した。BLVポジティブの健常な163頭のウシ、PLにかかっているBLV感染した16頭のウシ、リンパ腫にかかっているBLV感染した89頭のウシ、およびBLVなしの正常な117頭のウシにおいて、BLV−CoCoMo−qPCRによってプロウイルス量を測定した(図9)。プロウイルス量は、無白血病段階と比べてPL段階において有意に増加しており(p=0.0052)、リンパ腫段階においてさらに増加していた(p=0.0052)。BLVなしの正常な117頭のウシにおいてBLVは検出されなかった。したがって、BLVプロウイルスのコピー数は疾患の重篤度の増大にともなって増加することを証明できた。

0055

[考察]
この研究において、われわれは、感染動物からのBLVプロウイルス量の定量にとっての非常に特異的かつ正確な高感度の方法の開発に成功したことを説明している。

0056

BLV−CoCoMo−qPCRシステムは、広い地理的由来(日本、ペルー、ボリビア、チリおよびアメリカが挙げられる)からの種々のBLV株を検出可能である。BLVのenv遺伝子の遺伝的な変異性についての初期の研究では、単離物のなかに極わずかな変異が同定されたが(非特許文献28)、制限断片長多型の分析および全長のBLVのenv遺伝子の分析に基づく最近の研究によって、少なくとも7つの異なるBLV遺伝子型が世界中に流布していることが明らかになっている(非特許文献24、27、29)。この新規な分類は、BLVの相違が世界中において拡大していることを示唆している。GenBankにおける合計356のBLV配列から、異なる52のBLVのLTRヌクレオチド配列を入手した。これは、多くのBLVバリアントが存在することを示しており、われわれの結果は、これらのバリアントのすべての検出がBLV−CoCoMo−qPCRを用いて可能であることを示唆している。したがって、CoCoMoアルゴリズムが複数のBLVバリアントに対応する縮重プライマーを設計するための有用なツールであることを、われわれは明らかに証明している。実際に、Tong et al.(非特許文献30)は、コンセンサス−縮重ハイブリッドオリゴヌクレオチドプライマーを用いたセミネステッドPCRまたはネステッドPCRのアッセイが、非常に特異的またはより広く包括的になり得、亜科または属のレベルを標的化可能であることを示した。この種の手法を用いると、CoCoMoプライマーの縮重度が高くなり過ぎ、これによって標的配列に対して特異的なプライマーの濃度およびアッセイの感度を低下させるリスクがある。BLV−CoCoMo−qPCRは非常に高感度であり、ネステッドPCR増幅に対して優れた結果を示していた(図6)ので、この問題はわれわれの研究では生じなかった。さらに、BLV−CoCoMo−qPCRシステムは、種々の地域からのBLV感染したウシにおけるウイルスの検出に非常に有効であった(Table.3)。TaqMan(商標)プローブは、感度および特異性を向上させるために使用され、高い縮重と関連する任意の欠点に対抗するために作用している。CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーに対応する位置の間に配置されているBLVのTaqMan(商標)プローブの配列は、52のBLVバリアントのなかで完全に保存されていたことに注目することが重要である。また、ウシにおけるBLVにとってのELISA法および免疫拡散スクリーニング法は、非常に高感度であるが、PCRによる完全なプロウイルスの直接的な検出と異なり、BLVに対する抗原を検出することによって作用する(非特許文献17)。ELISA法および免疫拡散スクリーニング法は、高効率の偽陽性に陥り、また、BLV感染した母獣からの母性の抗体がアッセイを妨げ得るので、子ウシが感染しているか否かの決定に有効ではない。したがって、ウシにおけるBLV感染の確実な検出は、プロウイルスの検出のための高感度な方法を必要とする。この目的のために、BLV−CoCoMo−qPCRを開発した。

0057

CoCoMoプライマーを用いたBLV定量の高い特異性を確認するために、いくつかの手法を使用した。第1に、CoCoMo6およびCoCoMo81のプライマーは、BLVに感染した細胞における融解曲線分析によって単一のピークを生じたが、未感染細胞または試薬のみのネガティブコントロールにおいて、産物を増幅しなかった。第2に、PCR増幅は、BLVポジティブのウシにおいて検出されたが、BLVネガティブの試験された120頭のウシのすべてにおいてネガティブであった。第3に、いくつかの非BLTのレトロウイルスLTRを含んでいる感染性分子のクローンは、われわれのシステムにおいて増幅されなかった。

0058

これまでの研究(非特許文献31)において、リアルタイムPCRを用いてBLVプロウイルスを定量するための方法が報告されている。この方法は、プロウイルスごとに1コピーのみ存在しているBLVのenvおよびpol遺伝子を標的にしており、プライマーのアニーリング領域は潜在的に変異を受け易かった。CoCoMo−qPCRのBLV−LTR標的は、プロウイルスごとに2コピー存在しており、われわれのアッセインの感度の向上に寄与している。実際に、Lew at el.(非特許文献31)によって説明されているqPCR法を用いた場合、CoCoMo−qPCRによって容易に検出可能な濃度である18コピー/105細胞未満においてプロウイルスを検出できなかった(データを示さず)。また、われわれの方法は、縮重プライマーの使用がBLV配列バリアント(変異から生じるバリアントが挙げられる)の検出を可能にするという利点を有している。

0059

また、BLV−CoCoMo−qPCRは正確であった。CoCoMoプライマーによるリアルタイムPCRを用いて得られたプロウイルスのコピー数は、段階希釈−ネステッドPCRの結果と密接に相関していた。細胞内のBLVプロウイルスを定量するためにBLV−CoCoMo−qPCRを使用することを目的にしていたので、単コピーの細胞性の遺伝子BoLA−DRAの平行した定量を実施した。この測定は、サンプル間の増幅効率における変動についての調整を可能にした。この方策を用いて、感染動物の診断にとって十分なアッセイ内信頼性およびアッセイ間信頼性を実測した。アッセイのCV範囲は、HTLV−1プロウイルス量の定量について報告されている範囲(8.2%〜31.4%(非特許文献32)または49%〜55%(非特許文献33))より顕著に良好な、0.0%〜20.5%であった。われわれのアッセイの高い信頼性は、疾患の進行の間におけるプロウイルス量の定量のための使用を可能にした。また、CoCoMo−qPCRの精度を配列決定分析によって確認した。BLVプロウイルスが、CoCoMo−qPCRによって検出され得たが、ネステッドPCRによって検出されなかった9つのサンプルを選択し、アンプリコンを配列決定した。この方策を用いて、9つのサンプルはBLVによって感染していたことを確認し、ネステッドPCRによってネガティブだったサンプルにおけるプロウイルスを検出するCoCoMo−qPCR法の能力を強調した。2/9のサンプルにおいて、ネステッドPCRプライマーにとってのアニーリング領域に配列ミスマッチを検出し、これによって、これらのサンプルにおけるネステッドPCRによるBLV検出の失敗の解釈を示唆している。

0060

シンチチウムアッセイは、存続可能な(viable)BLVウイルス粒子を検出するための通常の方法である(非特許文献34)。しかし、この方法は、時間のかかるしばしば困難な細胞培養を必要とし、低い感度を有している。われわれのアッセイを用いて得られたプロウイルスのコピー数がシンチチウム形成アッセイと相関するか否かを試験した。これは、われわれのアッセイがBLV感染の段階における診断に使用され得ることを示唆しているためである。シンチチウム形成は、BLV−CoCoMo−qPCRによって算出された通りの10000コピー/105細胞を超えるプロウイルス量と強く相関していた。BLV−CoCoMo−qPCRによって検出された低いプロウイルス量を有しているBLV感染したウシにおいて、シンチチウム形成はほとんど検出され得なかった。したがって、BLV−CoCoMo−qPCRは、低いウイルス量を有している動物におけるBLV感染のレベルを正確に決定可能であると考えられる。

0061

PLと呼ばれるBLV感染の前白血病段階は、複数の部位にプロウイルス挿入を有している感染した表面免疫グロブリン陽性B細胞の増大によって特徴づけられる。一方で、特異な組込み部位は、顕性の白血病/リンパ腫の発症後におけるBLVに感染した個体に認められる悪性B細胞悪性指標である(非特許文献13、23、35)。このモデルにしたがえば、プロウイルス量は疾患の進行の間に増加するはずであるが、これは正式には証明されていなかった。BLV−CoCoMo−qPCRを用いて、われわれは、疾患の進行の間におけるプロウイルス量の増加を検出し得た。この結果は、プロウイルス量が、疾患の進行を監視するための優れた指標であるが、BLV伝染を最小化するための隔離計画の実施にも有用もあり得ることを強く示唆している。また、プロウイルス実験によって、疾患の進行と相関する宿主因子または遺伝的背景が同定された。例えば、腫瘍関連c143抗原は、EBLにかかっているウシにおいて特異的にセリンリン酸化されていると同定された。そして、がん関連遺伝子(例えば、p53および腫瘍壊死因子(TNF))は、EBLと関連している(非特許文献35〜41)。また、プロウイルス量は、リンパ腫段階への進行に影響するマーカーを同定するための有用な手段であり得る。われわれのアッセイは、ワクチン接種の有効性を評価するために有用であり得、また、BLVに誘導されるリンパ腫に対する耐性または感受性とあらかじめ関連しているTNFおよびBoLA対立遺伝子を有しているBLV感染したウシにおけるプロウイルス量の変化を検出するために有用であり得る。最後に、われわれのアッセイはすべてのBLVバリアントを検出したので、CoCoMoアルゴリズムは、他のレトロウイルス(HTLVおよびHIV−1が挙げられる)のプロウイルス量を定量するための縮重プライマーの設計に有用なツールと考えられる。

0062

結論
CoCoMoを用いて、既知または新規のBLVバリアントのプロウイルス量を測定するための新たな定量的リアルタイムPCR法を開発した。われわれの方法は、感染動物におけるBLVのLTR領域の検出のために、非常に特異的、高感度、定量的かつ再現可能である。上記方法は、種々の地理的位置からのウシにおけるBLVの検出に有効であり、以前に開発されたネステッドPCRより幅広いサンプルにおけるBLVを検出した。最後に、われわれは、プロウイルス量が疾患の進行の段階と非常に相関していることを初めて示している。

0063

[方法]
〔臨床サンプル、細胞株およびDNA抽出物
血液サンプルを、血清学的にBLVネガティブの正常な117頭のウシ、臨床的および血液学的に正常な163頭のBLV感染したウシ、PLにかかっている臨床的に正常な16頭のBLV感染したウシ、およびEBLにかかっている89頭のBLV感染したウシから入手した。これらのウシを日本において飼った。ボリビア、ペルー、チリおよび米国において飼われたさらなる116頭のウシを本研究に組み入れた。BLV感染したウシを、以前に確立された基準(非特許文献42)およびBLVプロウイルスのゲノムへの組込みにしたがって分類した。PBMCを、Miyasaka and Trnka(非特許文献43)の方法によって血液から分離した。

0064

BLV感染したBリンパ腫細胞株BLSC−KU−17(非特許文献44)を、10%の熱非働化ウシ胎児血清FCS)(Life Technologies Japan, Tokyo, Japan)、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったダルベッコ改変イーグル培地(Sigma Aldrich Chemie Gmbh, Steinem, Germany)において維持した。マウス肉腫ウイルスによってがん化されたネコの細胞株CC81を、10%の熱非働化FCS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを補ったRPMI1640培地(Sigma-Aldrich Co. Ltd. , Ayrshire, UK)において維持した。

0065

ゲノムDNAを、(a)DNA Wizard Genomic DNA purification Kit(Promega, Madison, WI)によって全血、(b)Hughes et al.(非特許文献45)によって説明されている手法によってPBMC、および(c)標準的な手法を用いてFTAelute cards(Whatman, Tokyo, Japan)上にスポットした40μlの全血から抽出した。

0066

〔プライマーおよびプローブの設計〕
個々のBLVのLTR配列のうち52のバリアントを、GenBankにおける356のBLV配列から選択した。標的配列を、複数のウイルス株を検出する縮重プライマーを設計するために開発されたCoCoMo-primer-designアルゴリズム(http://www.geneknot.jp/cocomo; Endoh D, Mizutani T, Morikawa S Hamaguchi I, Sakai K, Takizawa K, Osa Y, Asakawa M, Kon Y, Hayashi M,: CoCoMo-Primers: a web server for designing degenerate primers for virus research. Submitted)のBLV−LTR用に改変したバージョンにかけた。なお、LTRが公式に報告されていないBLV配列を利用するために、個々のBLVのLTR配列のうち52のバリアントを、公知のLTR配列に基づくBLASTプログラムおよびクラスター選択法を組み合わせることによって抽出した。さらに、CoCoMo-primer-designアルゴリズムが使用される場合に、標的配列に多く見られる4塩基(一致する2塩基−自由な1塩基−一致する1塩基)が、一般的に検索される。しかし、ここでは多く見られる5塩基をBLVにおいて検索した。

0067

特異的なPCR産物を検出するために、Primer Express software, version 2.0(Applied Biosystems)を用いて設計したプローブ配列とともに、TaqMan(商標)プローブシステム(Applied Biosystems, Tokyo, Japan)を用いた。

0068

(CoCoMoアルゴリズムについての詳細)
多くのウイルスは進化の間に変異しており、病原性および集団発生における変化を導き得る(非特許文献1、2)。分子技術(特にポリメラーゼ連鎖反応(PCR)に基づくこれらの用途)の開発は、ウイルス感染症の診断を激変させている(非特許文献3、4)。遺伝子のいくつかの起こり得る変異したバージョンの増幅を可能にする縮重オリゴヌクレオチドプライマーは、cDNAクローニング用、および高い割合の変異に起因して変異性の高い配列の検出用に首尾よく使用されている(非特許文献5)。縮重プライマーは、未知の遺伝子の増幅だけでなく、類似しているが、同一ではない遺伝子の同時の増幅に有用である(非特許文献6)。縮重プライマーは、ウイルス検出に対する費用の大幅な削減および所要時間の大幅な短縮を可能にする。“Coordination of Common Motifs”(CoCoMo)アルゴリズムは、複数のウイルスの種を検出するために特に開発されている(Endoh D, Mizutani T, Morikawa S, Hamaguchi I, Sakai K, Takizawa K, Osa Y, Asakawa M, Kon Y, Hayashi M: CoCoMo-Primers: a web server for designing degenerate primers for virus research, submitted)。このプログラムは、MAFFTを用いた複数のDNA配列のアラインメント(非特許文献8)に基づく、COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primer(CodeHop)技術(非特許文献7)の拡張を利用している。CoCoMoは、標的配列から得られた複数のコドンを含んでいる多く見られるギャップテトラヌクレオチドモチーフ(GTNM)を選択する。それから、CoCoMoは、データベースに基づく方法を用いて共通のGTNMの増幅可能な組を選択し、多く見られる増幅可能なGTNMのそれぞれの5’末端においてコンセンサスヌクレオチドを構築する。それから、コンセンサス縮重配列を、設計した縮重プライマーに結合させる。したがって、CoCoMoアルゴリズムは、高度に縮重した配列にとっての縮重プライマーの設計において有用である。

0069

〔プラスミド〕
BLV由来の全長LTRを含んだpBLV−LTR/SKを得るために、プライマー(LTR/XhoI(5’−CCCGCTCGAGTGTATGAAAGATCATGCCGA−3’;1位〜20位)およびBLV−LTRR/BamHI(5’−CGGGATCCTGTTTGCCGGTCTCTCCTGG−3’;510位〜530位)、およびKU−17細胞から抽出された、テンプレートとしてのゲノムDNAを用いたPCRを使用した。ウシDRA遺伝子の全長を含んだpBoLA−DRA/SKを生成するために、哺乳類発現ベクターpCDM8(非特許文献47)から、Xba Iを用いてMR1を消化した。それから、MR1配列を含んでいるXba I−Xba I断片を、pBluescript II SK (+)(Stratagene)にサブクローニングした。使用されたさらなるクローンは、BLV感染性クローンpBLV−IF(非特許文献34);HTLV−1感染性クローンpK30(非特許文献48);HIV−1感染性クローンpNL4−3(非特許文献49);SIV感染性クローンSIVmac239/WT(非特許文献50);ハイブリッドMMTVプロウイルスプラスミド(非特許文献51);M−MLV感染性クローンpL−4(非特許文献51);およびプラスミド(pUC18(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)、pUC19(Takara Bio Inc.)およびpBR322(Promega)が挙げられる)を含んでいた。

0070

〔段階希釈法によるコピー数の算出〕
pBLV−LTR/SKおよびpBoLA−DRA/SKを、Sca Iを用いて消化し、Sephadex G-50カラム(GE Healthcare Japan, Tokyo, Japan)を用いて精製した。ゲノムDNAを、5mMのスペルミジンの存在下において24時間にわたってXho Iを用いて消化した。サンプルを、TE緩衝液(1mMのエチレンジアミンテトラ酢酸EDTA)を有している10mMのTris−HCl(pH8.0))を用いて、上において10倍段階希釈物に希釈した。マイクロチューブに対するDNA吸着を避けるために、超滑面処理されたチューブ(BM4015 Platinum super polypropylene; BM bio, Tokyo, Japan)を、標準曲線にとってのテンプレートの調製に使用した。

0071

直鎖化されたpBLV−LTR/SK、pBoLA−DRA/SKおよびゲノムDNAのために、限界希釈を実施した。プラスミドDNAからのBLV−LTR遺伝子およびBoLA−DRA遺伝子の検出を、CoCoMoプライマー6および8、またはプライマーDRA643およびDRA734をそれぞれ用いたリアルタイムPCRによって実施した。また、BLT−LTR遺伝子を、ネステッドPCRを用いてゲノムDNAにおいて検出した。増幅産物が検出不可能であった希釈点において、PCRを10回にわたって繰り返し、ネガティブな結果の頻度を算出した(f(x=0))。標的遺伝子のコピー数を、ポアソン分布モデル:λ=−loge(f(x=0))(λ=標的遺伝子の平均コピー数)にしたがって算出した。

0072

〔BLV−LTR増幅用の候補CoCoMoプライマーセットにとってのPCR条件〕
1.0ユニットのrTaq、0.2mMのdNTP、1.0mMのMgCl2、500nMのフォワードプライマーおよびリバースプライマー、ならびにネステッドPCRによってゲノムDNAから増幅されている1:1000倍希釈したBLV−LTRアンプリコンを含有している、rTaqDNAポリメラーゼ用の1×緩衝液(TOYOBO, Tokyo, Japan)の20μl量において、タッチダウンPCR増幅を実施した。PCR増幅を、TGRADIENTサーモサイクラー(Biometra, Gottingen, Germany)を用いて以下のプログラムにしたがって実施した:10分における95℃における開始の変性、95℃における15秒、60℃〜52℃における10秒(アニーリング温度は、3サイクルごとに0.2℃だけ60℃から52℃まで段階的に低下させた)および72℃における10秒の、続く40サイクル。2%アガロースゲル電気泳動のために5μlのPCR産物を使用し、増幅産物をエチジウムブロマイド染色によって検出した。

0073

〔PCR特異性を評価するための融解曲線分析〕
500nMのCoCoMoプライマーのそれぞれ、3mMのMgCl2、および30ngのゲノムDNAを含有している、1×LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(Roche Diagnostics GmbH, Basel, Switzerland)の総量20μlにおいて、PCR増幅を実施した。PCR増幅を、Light Cycler 2.0(Roche Diagnostics GmbH)を用いて以下のプログラムにしたがって実施した:10分間にわたる95℃における開始の変性、95℃における15秒、65℃における5秒および72℃における9秒の、続く75サイクル。融解過程を、二本鎖化したDNAの検出用の、DNAと結合しているSYBR Green I色素の蛍光によってモニターした。

0074

〔ネステッドPCRによるBLV−LTRの検出〕
プライマーBLTRF−YR(5’−TGTATGAAAGATCATGYCGRC−3’ LTR 1−21)およびBLTRR(5’−AATTGTTTGCCGGTCTCTC−3’ LTR 515−533)を用いて、最初のPCRを実施した。250nMのBLTRF−YRプライマーおよびBLTRRプライマー、0.5ユニットのrTaqポリメラーゼ、0.2mMのdNTP、2.5mMのMgCl2、ならびに30ngのテンプレートDNAを含有している、rTaqDNAポリメラーゼ用の1×緩衝液(TOYOBO)の総量20μlにおいて、増幅を実施した。PCR増幅を、TGRADIENTサーモサイクラー(Biometra)を用いて以下のプログラムにしたがって実施した:2分にわたる94℃における開始の変性、94℃における30秒、58℃における30秒、および72℃における30秒の、続く35サイクル、ならびに72℃における5分の最後のサイクル。

0075

250nMの256プライマーおよび453プライマー(以下を参照)、0.5ユニットのrTaqポリメラーゼ、0.2mMのdNTP、2.5mMのMgCl2、ならびに1μlの1回目のPCR産物を含有している、rTaqDNAポリメラーゼ用の1×緩衝液(TOYOBO)の総量20μlにおいて、第2組のPCRを実施した。第2のPCRに使用されたオリゴヌクレオチド配列は、256(5’−GAGCTCTCTTGCTCCCGAGAC−3’、LTR256−276)および453(5’−GAAACAAACGCGGGTGCAAGCCAG−3’、LTR 429−453)であり、以前に説明されている(非特許文献23)。PCR増幅を、TGRADIENTサーモサイクラー(Biometra)を用いて以下のプログラムにしたがって実施した:2分にわたる94℃における開始の変性、94℃における30秒、58℃における30秒、および72℃における30秒の、続く35サイクル、ならびに72℃における5分の最後のサイクル。2%アガロースゲル電気泳動のために、5μlのPCR産物を使用し、PCR産物をエチジウムブロマイド染色によって検出した。

0076

〔BLV−LTR領域の増幅、クローニングおよびDNA配列決定〕
BLV−CoCoMo−qPCRによってポジティブであったが、ネステッドPCRによってネガティブであったサンプルのヌクレオチド配列を分析するために、BLV感染したウシからのゲノムDNAを、MightyAmp DNA polymerase Ver.2(TAKARA)、KODplus Neo(TOYOBO)、およびTaqMan Universal Master Mix IIシステム(AB)を用いたPCRによる増幅にかけた。BLV−LTR特異的なオリゴヌクレオチドプライマーBLTR56F(5’−AACGTCAGCTGCCAGAAA−3’)、BLTR134F(5’−AAAATCCACACCCTGAGCTG−3’)、CoCoMo6、CoCoMo81、およびBLTR544R(5’−ACCGAGCCCCCAATTGTTT−3’)を、BLVプロウイルス配列のLTR領域を参照することによって設計した。PCR産物をTAクローニングによってpGEM-T Easyベクター(Promega)によってサブクローニングし、ヌクレオチド配列を、標準的な手法を用いたサイクル配列決定によって決定した。

0077

〔シンチチウム形成アッセイ〕
以前に説明されている手法(非特許文献15、22)にしたがってアッセイを実施した。CC81細胞を、直径6cmのディッシュにおいて72時間にわたって成長させ、1×105のBLV感染したPBMCとともにRPMI1640培地においてインキュベートした。細胞を、May-Grunwald溶液において10分にわたって固定し、Giemsa溶液を用いて10分にわたって染色した。水を用いた洗浄後に、細胞を光学顕微鏡のもとに調べた。5を超える核を含んでいる細胞をシンチチウムとしてカウントした。

0078

統計分析
R 2.10.1統計演算ソフトウェアを用いて、統計分析を実施した。複数の試験について、補正をともなった群のレベル間の対比較を算出するために、ペアt検定を使用した。0.05未満のP値を有意であるとみなした。回帰分析を用いて、段階希釈法およびBLV−CoCoMo−qPCR法の間、ならびにシンチチウムカウントおよびプロウイルスのコピー数の間における相関を調べた。

0079

〔Table〕

0080

0081

0082

実施例

0083

本発明は、上述の実施形態および実施例の記載に限定されず、特許請求の範囲の範囲内において当業者によって変更され得る。異なる実施形態に開示されている技術的手段の適切な組合せに基づく実施形態は、本発明の技術的範囲に包含されている。

0084

本発明は、ウシ白血病ウイルス(BLV)検出用キット;およびその利用を提供する。

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    【課題】過敏性腸症候群の検査法の提供。【解決手段】被験者個人又は被験者集団(ユーザ)から得られた試料が過敏性腸症候群(IBS)と関連するか否かの情報を提供する方法であって、以下の工程:(a)前記ユーザ... 詳細

  • フルハシEPO株式会社の「 植物栽培用養液の製造方法及び植物栽培方法」が 公開されました。( 2021/04/30)

    【課題】水中で有機物を分解させて硝酸イオンを得る反応を同一の系(槽)で行う植物栽培用養液の製造方法において、有機物分解菌と硝化細菌の添加を個別に制御でき、製造される養液に有害菌が混入する可能性を低くす... 詳細

  • 新和環境株式会社の「 微生物担持炭の評価方法及び微生物担持炭」が 公開されました。( 2021/04/30)

    【課題】微生物担持炭の製造品質、製造後の在庫品質等を簡易に評価すること【解決手段】微生物担持炭を100倍の重量の水と混合、振盪、ろ過して得たろ液について、ATP濃度が1.9×10−9ppm以上、である... 詳細

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